DE60122067T2

DE60122067T2 - Vervielfältigung und Detektion von Legionella pneumophila Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE60122067T2
Application number: DE60122067T
Authority: DE
Inventors: Thomas L. York Brink; Tobin J. Owings Mills Hellyer
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2000-07-27
Filing date: 2001-06-18
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2021-06-19
Also published as: EP1176213A2; EP1176213B1; DE60122067D1; JP2002320486A; EP1176213A3; US6251609B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens von Legionella pneumophila in Atemproben oder anderen Patientenproben, Kulturen und Umweltproben. Das Verfahren umfasst die Verwendung von Nucleinsäureprimern, um spezifisch eine Zielsequenz innerhalb des mip-Gens zu amplifizieren, vorzugsweise unter Anwendung einer der Techniken der Strangverdrängungsamplifikation (SDA), der thermophilen Strangverdrängungsamplifikation (tSDA) oder der Fluoreszenz-Echtzeit-tSDA.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
L. pneumophila verursacht beim Menschen die Legionärskrankheit und das Pontiac-Fieber. Das Potential von L. pneumophila zur Verursachung einer Erkrankung wurde teilweise dem Vorhandensein des Macrophage-Infectivity-Potentiators (mip) bei dieser Spezies zugeschrieben, wie von Riffard, et al. (1996. Epidemiol. Infect., 117 (3):501-506) beschrieben. Das mip-Protein ist ein 24 kDa-Oberflächenprotein, das für eine optimale intrazelluläre Infektion sowohl von Protozoen als auch von menschlichen Makrophagen erforderlich ist, wie von Engleberg, et al. (1989, Infect. Immun., 57 (4):1263-1270) besprochen. Die Sequenz des mip-Gens scheint genetisch stabil und auf eine bestimmte Spezies von Legionella, wie z.B. L. pneumophila, beschränkt zu sein. Weiters wurde das mip-Gen von Ratcliff, et al. (1998, J. Clin. Microbiol., 36 (6):1560-1567) erfolgreich als Modell für ein Klassifizierungsschema bei der Gattung Legionella verwendet.
Die Nucleinsäureamplifikation ist eine leistungsfähige Technologie, welche die rasche Detektion spezifischer Zielsequenzen ermöglicht. Sie stellt daher eine vielversprechende Technologie für die rasche Detektion und Identifikation von L. pneumophila dar. Die PCR-Identifikation von L. pneumophila unter Verwendung von Sequenzen innerhalb des mip-Gens wurde von Ramirez, et al. (1996, Clin. Infect. Dis., 24:7-14), Miller, et al. (1993, J. Infect. Dis., 168:769-772), Weir, et al. (1998, Am. J. Clin. Pathol., 110:295-300), Bej, et al. (1991, Appl. Environ. Microbiol., 57 (2):597-600) und Koide, et al. (1995, Clin. Infect. Dis., 21:199-201) beschrieben. Die Oligonucleotidprimer der vorliegenden Erfindung sind auf die Nucleinsäureamplifikation und Detektion von L. pneumophila anwendbar.
Die folgenden Begriffe sind hier wie folgt definiert:
Ein Amplifikationsprimer ist ein Primer für die Amplifikation einer Zielsequenz durch Verlängerung des Primers nach der Hybridisierung mit der Zielsequenz. Amplifikationsprimer sind typischerweise etwa 10–75 Nucleotide lang, vorzugsweise etwa 15–50 Nucleotide lang. Die Gesamtlänge eines Amplifikationsprimers für eine SDA beträgt typischerweise etwa 25–50 Nucleotide. Das 3'-Ende eines SDA-Amplifikationsprimers (die Zielbindesequenz) hybridisiert am 3'-Ende der Zielsequenz. Die Zielbindesequenz ist etwa 10–25 Nucleotide lang und verleiht dem Amplifikationsprimer eine Hybridisierungsspezifität. Der SDA-Amplifikationsprimer umfasst weiters eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease 5' zur Zielbindesequenz. Die Erkenungsstelle besteht für eine Restriktionsendonuclease, die einen Strang einer DNA-Duplex mit Einzelstrangbrüchen versieht, wenn die Erkennungsstelle hemimodifiziert wird, wie von G. Walker, et al. (1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396 und 1992 Nucl. Acids Res. 20:1691-1696) beschrieben. Die Nucleotide 5' zur Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle (der "Schwanz") wirken als Polymerase-Reprimierungsstelle, wenn der Rest des Amplifikationsprimers während der SDA mit Einzelstrangbrüchen versehen und verdrängt wird. Die Reprimierungsfunktion der Schwanznucleotide erhält die SDA-Reaktion aufrecht und ermöglicht eine Synthese multipler Amplikone aus einem einzigen Zielmolekül. Der Schwanz ist typischerweise etwa 10–25 Nucleotide lang. Seine Länge und seine Sequenz sind im Allgemeinen nicht entscheidend und können routinemäßig ausgewählt und modifiziert werden. Da die Zielbindesequenz jener Teil eines Primers ist, welcher dessen Zielspezifität bestimmt, besteht im Allgemeinen der Amplifikationsprimer für Amplifikationsverfahren, die keine spezialisierten Sequenzen an den Enden des Ziels erfordern, im Wesentlichen nur aus der Zielbindesequenz. Beispielsweise werden bei einer unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) erfolgenden Amplifikation einer Zielsequenz gemäß der Erfindung Amplifikationsprimer verwendet, welche aus den Zielbindesequenzen der hier beschriebenen Amplifikationsprimer bestehen. Für Amplifikationsverfahren, die andere an das Ziel angehängte spezialisierte Sequenzen erfordern als die mit Einzelstrangbrüchen versehbare Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle und den Schwanz einer SDA (z.B. ein RNA-Polymerase-Promotor für die sich selbst erhaltende Sequenzreplikation (3SR), die auf Nucleinsäuresequenzen basierende Amplifikation (NASBA) oder das Amplifikationssystem auf Transcriptionsbasis (TAS)), kann die erforderliche spezialisierte Sequenz unter Verwendung von Routinemethoden zur Herstellung von Oligonucleotiden ohne Änderung der Hybridisierungsspezifität des Primers an die Zielbindesequenz gebunden werden.
Ein Bumperprimer oder äußerer Primer ist ein Primer, der zur Verdrängung von Primerverlängerungsprodukten in isothermen Amplifikationsreaktionen verwendet wird. Der Bumperprimer verbindet sich mit einer Zielsequenz stromaufwärts vom Amplifikationsprimer, so dass eine Verlängerung des Bumperprimers den stromabwärts gelegenen Amplifikationsprimer und sein Verlängerungsprodukt verdrängt.
Die Begriffe Ziel oder Zielsequenz beziehen sich auf zu amplifizierende Nucleinsäuresequenzen. Diese umfassen die ursprüngliche, zu amplifizierende Nucleinsäuresequenz, den komplementären zweiten Strang der ursprünglichen, zu amplifizierenden Nucleinsäuresequenz und beide Stränge einer Kopie der ursprünglichen Sequenz, die durch die Amplifikationsreaktion hergestellt wird. Diese Kopien dienen als amplifizierbare Ziele, und zwar aufgrund der Tatsache, dass sie Kopien der Sequenz, mit welcher die Amplifikationsprimer hybridisieren, enthalten.
Kopien der Zielsequenz, welche während der Amplifikationsreaktion erzeugt werden, werden als Amplifikationsprodukte, Amplimere oder Amplikone bezeichnet.
Der Begriff Verlängerungsprodukt bezieht sich auf die Kopie einer Zielsequenz, welche durch Hybridisierung eines Primers und Verlängerung des Primers durch Polymerase hergestellt wird, wobei die Zielsequenz als Matrize verwendet wird.
Der Begriff artspezifisch bezieht sich auf die Detektion, Amplifikation oder Oligonucleotidhybridisierung bei einer Spezies eines Organismus oder einer Gruppe von verwandten Spezien ohne wesentliche Detektion, Amplifikation oder Oligonucleotidhybridisierung bei anderen Spezien derselben Gattung oder Spezien einer anderen Gattung.
Der Begriff Analysesonde bezieht sich auf jedes Oligonucleotid, das zur Ermöglichung der Detektion oder Identifikation einer Nucleinsäure verwendet wird. Detektorsonden, Detektorprimer, Einfangsonden, Signalprimer und Reportersonden, wie untenstehend beschrieben, sind Beispiele für Analysesonden.
Ein Signalprimer umfasst eine 3'-Zielbindesequenz, die mit einer komplementären Sequenz im Ziel hybridisiert, und umfasst weiters eine 5'-Schwanzsequenz, die zum Ziel nicht komplementär ist (die Adaptorsequenz). Die Adaptorsequenz ist ein indirekt nachweisbarer Marker, der solcherart ausgewählt wird, dass seine komplementäre Sequenz mit dem 3'-Ende der untenstehend beschriebenen Reportersonde hybridisiert. Der Signalprimer hybridisiert mit der Zielsequenz zumindest teilweise stromabwärts von der Hybridisierungsstelle eines Amplifikationsprimers. Der Signalprimer wird durch die Polymerase in einer der Verlängerung der Amplifikationsprimer ähnlichen Weise verlängert. Die Verlängerung des Amplifikationsprimers verdrängt das Verlängerungsprodukt des Signalprimers in einer zielamplifikationsabhängigen Weise, wobei ein einzelsträngiges Produkt erzeugt wird, welches eine 5'-Adaptorsequenz, eine stromabwärts gelegene Zielbindesequenz und eine für die Hybridisierung mit einem flankierenden SDA-Amplifikationsprimer spezifische 3'-Bindesequenz umfasst. Die Hybridisierung und Verlängerung dieses flankierenden Amplifikationsprimers und sein anschließendes Versehen mit Einzelstrangbrüchen sowie seine Verlängerung schaffen Amplifikationsprodukte, die das Komplement der Adaptorsequenz enthalten, welches als Hinweis auf eine Zielamplifikation nachgewiesen werden kann.
Eine erfindungsgemäße Reportersonde wirkt als Detektor-Oligonucleotid und umfasst eine Markierung, die vorzugsweise zumindest ein Donor/Quencher-Farbstoffpaar, d.h. ein fluoreszierender Donor-Farbstoff und ein Quencher für das Donor-Fluorophor, ist. Die Markierung ist mit einer Sequenz oder Struktur in der Reportersonde (der Reporterkomponente) verbunden, welche nicht direkt mit der Zielsequenz hybridisiert. Die Sequenz der Reportersonde 3' zur Reporterkomponente wird dahingehend ausgewählt, um mit dem Komplement der Signalprimer-Adaptorsequenz zu hybridisieren. Im Allgemeinen enthält das 3'-Ende der Reportersonde keinerlei Sequenzen mit signifikanter Komplementarität zur Zielsequenz. Wenn die Amplifikationsprodukte, die das Komplement der obenstehend beschriebenen Adaptorsequenz enthalten, vorhanden sind, können sie mit dem 3'-Ende der Reportersonde hybridisieren. Das Primen und Verlängern aus dem 3'-Ende der Adaptorkomplementsequenz ermöglicht die Bildung des Komplements der Reporterkomponente. Diese Bildung macht die Reporterkomponente doppelsträngig und ermöglicht dabei das Nachweisen der Markierung der Reportersonde und den Hinweis auf das Vorhandensein oder die Amplifikation des Ziels.
Der Begriff Amplikon bezieht sich auf das Produkt der Amplifikationsreaktion, welches durch Verlängerung eines oder beider Primer eines Amplifikationsprimerpaars hergestellt wird. Ein Amplikon kann exponentiell amplifizierte Nucleinsäuren enthalten, wenn beide Primer, die verwendet werden, mit einer Zielsequenz hybridisieren. Alternativ können Amplikone durch eine lineare Amplifikation hergestellt werden, wenn einer der verwendeten Primer nicht mit der Zielsequenz hybridisiert. Somit wird dieser Begriff hier gattungsmäßig verwendet und impliziert nicht die Gegenwart exponentiell amplifizierter Nucleinsäuren.
KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Oligonucleotidprimer bereit, die für die Amplifikation einer in L. pneumophila vorgefundenen Zielsequenz verwendet werden können. Genauer gesagt umfasst die Zielsequenz Segmente des mip-Gens. Die Amplifikationsprimer wurden für eine hocheffiziente, hochspezifische Amplifikation bei erhöhten Temperaturen, wie z.B. bei der tSDA und der PCR, entworfen, allerdings sind sie auch bei Amplifikationsreaktionen mit niedrigeren Temperaturen, wie z.B. der herkömmlichen SDA, 3SR, TAS oder NASBA, nützlich. Eine Oligonucleotid-Reportersonde, die mit zielspezifischen Signalprimern hybridisiert, wird zum indirekten Nachweisen der Amplifikationsprodukte eingesetzt.
Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können nach einer Kultivierung als Mittel zum Bestätigen der Identität des kultivierten Organismus eingesetzt werden. Alternativ können sie bei klinischen Proben des Menschen, wie z.B. Atemproben, oder bei Umweltproben, wie z.B. verseuchtem Wasser, für die Detektion und Identifikation der Nucleinsäure von L. pneumophila-Organismen verwendet werden, wobei bekannte Amplifikations verfahren zur Anwendung kommen. In jedem Fall schaffen die erfindungsgemäßen Oligonucleotide und Analyseverfahren ein Mittel zum raschen Unterscheiden zwischen L. pneumophila und anderen Mikroorganismen, wodurch dem praktischen Anwender die rasche Identifizierung dieses Mikroorganismus ohne Zurückgreifen auf die traditionelleren Verfahrensweisen, auf die man gewöhnlich angewiesen ist, ermöglicht wird. Eine derartige rasche Identifizierung des an einer Infektion beteiligten, spezifischen ätiologischen Mittels liefert Informationen, welche zur Festlegung einer geeigneten Maßnahme innerhalb eines kurzen Zeitraums verwendet werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER SEQUENZEN
SEQ ID NO: 1 ist die Sequenz eines Oligonucleotids, das als stromaufwärtiger Primer für die Amplifikation des mip-Gens verwendet wird. SEQ ID NO: 2 ist die Sequenz eines Oligonucleotids, das als stromabwärtiger Primer für die Amplifikation des mip-Gens verwendet wird. SEQ ID NO: 3 ist die Sequenz eines Oligonucleotids, das als stromaufwärtiger Bumper für eine SDA-Amplifikation verwendet wird. SEQ ID NOs: 4–5 sind die Sequenzen von Oligonucleotiden, die als stromabwärtige Bumper für eine SDA-Amplifikation verwendet werden. SEQ ID NO: 6 ist die Sequenz eines Signalprimers für die Amplifikation und Detektion einer Sequenz innerhalb des mip-Gens. SEQ ID NO: 7 ist eine Sequenz für eine Reportersonde, die bei Verwendung in Verbindung mit dem zuvor erwähnten Signalprimer zur Detektion einer Sequenz innerhalb des mip-Gens ausgelegt ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die verschiedenen Aufgaben, Vorteile und neuen Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung leicht verständlich, wenn diese in Zusammenhang mit den angeschlossenen Zeichnungen gelesen wird, in denen:
1 die Detektion einer L. pneumophila-Nucleinsäure-mip-Zielsequenz in einer Strangverdrängungsamplifikations (SDA)-Reaktion gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren darstellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Oligonucleotide, Amplifikationsprimer und einen Signalprimer, die bei Nucleinsäure-Amplifikationsreaktionen eine Spezifität hinsichtlich Legionella pneumophila aufweisen. Ebenso werden Verfahren zum Nachweisen und Identifizieren der Nucleinsäuren von Legionella pneumophila-Organismen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Oligonucleotide bereitgestellt. Die bevorzugten Verfahren bestehen darin, eine SDA, eine tSDA oder eine homogene Echtzeit-Fluoreszenz-tSDA einzusetzen. Diese Verfahren sind dem Fachmann aus Referenzen wie dem U.S.- Patent Nr. 5,547,861, dem U.S.-Patent Nr. 5,648,211, dem U.S.-Patent Nr. 5,846,726, dem U.S.-Patent Nr. 5,928,869, dem U.S.-Patent Nr. 5,958,700, dem U.S.-Patent Nr. 5,935,791, dem U.S.-Patent Nr. 6,054,279, der US 6,316,200 und der US 6,258,546 bekannt.
Die erfindungsgemäßen Primer wurden auf Basis einer Analyse von mip-Gensequenzdaten aus mehreren, auf das Identifizieren von mip-spezifischen Bereichen ausgerichteten Quellen entworfen. Primer, die für die Verwendung bei der tSDA entwickelt wurden, werden in Tabelle 1 gezeigt. Ebenso werden ein Signalprimer und eine Reportersonde für die Amplifikation und Detektion der resultierenden Amplikone gezeigt. Die beispielhaften Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen (BsoBI) in den Amplifikationsprimern sind fettgedruckt dargestellt, und die Zielbindesequenzen sind kursiv. Die Zielbindesequenz eines Amplifikationsprimers bestimmt dessen Zielspezifität.
TABELLE 1
Amplifikations-Oligonucleotide

Stromaufwärtiger Primer LEGL44: 5'-ACCGATCGAATGACTGTTCTCGGGGGTACCGTTTTTGAC (SEQ ID 1)
Stromabwärtiger Primer LEGR52: 5'-CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGATAACTTGTGAAACCT (SEQ ID 2)
Stromaufwärtiger Bumper LBUM44: 5'-TGGTCGTCTGATTGA (SEQ ID 3)
Stromabwärtige Bumper RT2BM52: 5'-ACATAAATTTCCCAAGTTGA (SEQ ID 4) RBUM52: 5'-CATAAATTTCCCAAGTTGAT (SEQ ID 5)
Signalprimer LEGD62: 5'-ACGTTAGCCACCATACGGATACAGTACCCAAAAAACTGGTAAG (SEQ ID 6)
Reportersonde TBD10: 5'-(Fluorescein)TAGTGCCCGAGCACT(dabcyl)ACGTTAGCCACCATACGGAT (SEQ ID NO: 7)

Da Nucleinsäuren zum Hybridisieren keine vollständige Komplementarität benötigen, ist zu verstehen, dass die Sonde und die Primersequenzen, welche hier geoffen bart sind, in einem gewissen Ausmaß ohne Verlust an Nützlichkeit als mip-spezifische Sonden und Primer modifiziert werden können. Wie im Stand der Technik bekannt, kann die Hybridisierung komplementärer und teilweise komplementärer Nucleinsäuresequenzen durch Anpassung der Hybridisierungsbedingungen zur Steigerung oder Verringerung der Stringenz (d.h. Anpassung von Hybridisierungs-pH, Temperatur oder Salzgehalt des Puffers) erzielt werden. Derartige geringfügige Modifikationen der geoffenbarten Sequenzen und alle notwendigen Anpassungen der Hybridisierungsbedingungen zur Bewahrung einer L. pneumophila-Organismus-Spezifität erfordern nur routinemäßiges Experimentieren und liegen innerhalb durchschnittlicher Fachkenntnisse.
Die Amplifikationsprodukte, welche unter Verwendung der hier geoffenbarten Primer hergestellt werden, können anhand einer charakteristischen Größe, beispielsweise auf mit Ethidiumbromid gefärbten Polyacrylamid- oder Agarosegels, nachgewiesen werden. Alternativ können amplifizierte Zielsequenzen mittels einer Analysesonde, die ein mit einer nachweisbaren Markierung versehenes Oligonucleotid ist, nachgewiesen werden. Bei einer Ausführungsform kann zumindest eine markierte Analysesonde zum Detektieren amplifizierter Zielsequenzen durch Hybridisierung (eine Detektorsonde), durch Hybridisierung und Verlängerung, wie von Walker et al. (1992, Nucl. Acids Res. 20:1691-1696) beschrieben (ein Detektor-Primer), oder durch Hybridisierung, Verlängerung und Umwandlung in die doppelsträngige Form, wie in der EP 0 678 582 beschrieben (ein Signalprimer), eingesetzt werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform zum Nachweisen eines amplifizierten Ziels ist in 1 schematisch dargestellt. Bei dieser Ausführungsform besteht die 5'-Schwanzsequenz des Signalprimers aus einer Sequenz, die nicht mit dem Ziel hybridisiert (der Adaptorsequenz). Die Adaptorsequenz ist ein indirekt nachweisbarer Marker, der solcherart ausgewählt sein kann, dass er bei einer Vielzahl von Signalprimern, die unterschiedliche 3'-Zielbindesequenzen (d.h. eine „universelle" 5'-Schwanzsequenz) aufweisen, derselbe ist. SEQ ID NO: 6 ist als Signalprimer besonders nützlich, und zwar in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Amplifikationsprimern zur Detektion von L. pneumophila-Organismen. Eine Analysesonde ist vorzugsweise eine einzelne Reportersondensequenz, welche mit dem Adaptorsequenz-Komplement der erfindungsgemäßen Signalprimer hybridisiert. SEQ ID NO: 7 ist als Reportersonde besonders nützlich, wenn sie in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Signalprimern zur Detektion von L. pneumophila verwendet wird. Alternativ kann eine Analysesonde dazu ausgewählt werden, mit einer Sequenz im Ziel, welche sich zwischen den Amplifikationsprimern befindet, zu hybridisieren. Bei einer weiteren Ausführungsform kann ein Amplifikationsprimer oder die Zielbindesequenz davon als Analysesonde eingesetzt werden.
Die nachweisbare Markierung der Analysesonde ist ein Rest, der als Hinweis auf die Gegenwart der Zielnucleinsäure entweder direkt oder indirekt detektiert werden kann. Für die direkte Detektion der Markierung können die Analysesonden mit einem Radioisotop gekennzeichnet und mittels Autoradiographie detektiert oder mit einem fluoreszierenden Rest gekennzeichnet und mittels Fluoreszenz-detektiert werden, wie im Stand der Technik bekannt. Alternativ können die Analysesonden indirekt-detektiert werden, indem sie mit einer Markierung versehen werden, die, um nachweisbar gemacht zu werden, zusätzliche Reagenzien benötigt. Indirekt nachweisbare Markierungen umfassen beispielsweise chemilumineszierende Mittel, Enzyme, die sichtbare Reaktionsprodukte produzieren, und Liganden (z.B. Haptene, Antikörper oder Antigene), die durch Bindung an markierte spezifische Bindungspartner (z.B. Antikörper oder Antigene/Haptene) detektiert werden können. Liganden sind auch nützlich für die Immobilisierung des Ligand-markierten Oligonucleotids (der Einfangsonde) auf einer festen Phase, um dessen Detektion zu ermöglichen. Besonders nützliche Markierungen umfassen Biotin (nachweisbar durch Bindung an markiertes Avidin oder Streptavidin) und Enzyme, wie z.B. Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase (nachweisbar durch Zugabe von Enzymsubstraten zwecks Herstellung gefärbter Reaktionsprodukte). Verfahren zum Hinzufügen solcher Markierungen zu oder zum Einschließen solcher Markierungen in Oligonucleotiden sind im Stand der Technik wohlbekannt, und jedes dieser Verfahren ist zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet.
Beispiele für spezifische Detektionsverfahren, die angewandt werden können, umfassen ein Chemilumineszenzverfahren, bei dem amplifizierte Produkte unter Verwendung einer biotinylierten Einfangsonde und einer Enzym-konjugierten Detektorsonde detektiert werden, wie im U.S.-Patent Nr. 5,470,723 beschrieben. Nach der Hybridisierung dieser beiden Analysesonden mit verschiedenen Stellen im Analysebereich der Zielsequenz (zwischen den Bindungsstellen der beiden Amplifikationsprimer) wird der Komplex mittels der Einfangsonde auf einer Streptavidin-beschichteten Mikrotiter-Platte eingefangen und wird das chemilumineszierende Signal entwickelt und in einem Luminometer gelesen. Als weitere Alternative für die Detektion von Amplifikationsprodukten kann ein Signalprimer, wie in der EP 0 678 582 beschrieben, in die SDA-Reaktion einbezogen werden. Bei wiederum einer weiteren Alternative für die Detektion von Amplifikationsprodukten kann der Signalprimer Sequenzen enthalten, die nicht mit der Zielsequenz, d.h. der Adaptorsequenz, hybridisieren. Bei dieser in 1 dargestellten Ausführungsform kann eine Reportersonde mit dazugehöriger Markierung mit dem Komplement der Adaptorsequenz hybridisieren. Bei beiden Ausführungsformen des Signalprimers werden während der SDA sekundäre Amplifikationsprodukte in zielamplifikationsabhängiger Weise hergestellt und können als Hinweis auf eine Zielamplifikation nachgewiesen werden.
Aus Gründen der geschäftlichen Praktikabilität können die Amplifikationsprimer für die spezifische Detektion und Identifikation von Nucleinsäuren in Form einer Ausstattung verpackt sein. Typischerweise enthält eine solche Ausstattung zumindest ein Paar von Amplifikationsprimern. Reagenzien zum Durchführen einer Nucleinsäure-Amplifikationsreaktion können bei den zielspezifischen Amplifikationsprimern ebenfalls inkludiert sein, beispielsweise Puffer, zusätzliche Primer, Nucleotidtriphosphate, Enzyme etc.. Die Bestandteile der Ausstattung sind in einem gemeinsamen Behälter zusammengepackt, wobei gegebenenfalls Instruktionen zur Durchführung einer spezifischen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Methoden inbegriffen sind. Andere nicht vorgeschriebene Bestandteile können ebenfalls in der Ausstattung enthalten sein, z.B. ein Oligonucleotid, das mit einer Markierung versehen ist, welche für die Verwendung als Analysesonde geeignet ist, und/oder Reagenzien oder Mittel zum Detektieren der Markierung.
Bei der vorliegenden Erfindung kann eine solche Ausstattung dazu ausgelegt sein, die notwendigen Bestandteile für ein respiratorisches Panel von Organismen bereitzustellen. Ein solches respiratorisches Panel kann L. pneumophila, Bordetella pertussis, Mycoplasma pneumoniae und Chlamydienorganismen neben anderen Mikroorganismen, die zur Verursachung einer Atemwegsinfektion in der Lage sind, umfassen. Somit würde eine derartige respiratorische Ausstattung die Primer für die Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz umfassen, welche für jeden Organismus des respiratorischen Panels spezifisch ist. Nützliche Primer, Bumper, Signalprimer und Reportersonden zum Amplifizieren und Nachweisen von B. pertussis und M. pneumoniae sind in der gleichzeitig anhängigen US 6,261,785 bzw. in der gleichzeitig anhängigen US 6,277,582 beschrieben. Bei Verwendung kann eine derartige Ausstattung für ein respiratorisches Panel getrennte Amplifikationsreaktionen für jeden Organismus oder eine oder mehrere Multiplex-Amplifikationsreaktionen gestatten, um Resultate zu liefern, die auf das Vorhandensein oder Fehlen eines jeden Organismus des Panels hinweisen.
Die Zielbindesequenzen der Amplifikationsprimer verleihen den Oligonucleotiden eine Spezies-Hybridisierungsspezifität und bringen daher eine Artspezifität in die Amplifikationsreaktion ein. Somit sind die Zielbindesequenzen der Amplifikationsprimer der Erfindung auch in anderen Nucleinsäureamplifikationsprotokollen, wie z.B. der PCR, einer herkömmlichen SDA (ein Reaktionsschema, das im Wesentlichen dasselbe ist wie jenes einer tSDA, jedoch bei niedrigeren Temperaturen unter Verwendung mesophiler Enzyme durchgeführt wird), einer 3SR, NASBA und TAS, nützlich. Im Spezifischen können bei jeglichem Amplifikationsprotokoll, das eine cyclische, spezifische Hybridisierung von Primern mit der Zielsequenz, eine Verlängerung der Primer unter Verwendung der Zielsequenz als Matrize und eine Trennung oder Verdrängung der Verlängerungsprodukte von bzw. aus der Zielsequenz einsetzt, die erfindungsgemäßen Zielbindesequenzen zur Anwendung kommen. Für Amplifikationsverfahren, die keine spezialisierten Nichtzielbindenden Sequenzen benötigen (z.B. PCR), können die Amplifikationsprimer nur aus den Zielbindesequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Amplifikationsprimer bestehen.
Andere Sequenzen, die für die Durchführung einer ausgewählten Amplifikationsreaktion benötigt werden, können gegebenenfalls zu den hier geoffenbarten Zielbindesequenzen hinzugefügt werden, ohne die Artspezifität des Oligonucleotids zu verändern. Als Beispiel können die spezifischen Amplifikationsprimer eine Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease BsoBI enthalten, an welcher während der SDA-Reaktion Einzelstrangbrüche eingeführt werden. Dem Fachmann ist offensichtlich, dass die BsoBI-Erkennungsstelle durch andere Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen, an denen Einzelstrangbrüche eingeführt werden können, ersetzt werden kann, und zwar einschließlich jener Erkennungsstellen, die in der EP 0 684 315 geoffenbart sind, ohne auf diese beschränkt zu sein. Vorzugsweise besteht die Erkennungsstelle für eine thermophile Restriktionsendonuclease, so dass die Amplifikationsreaktion unter den Bedingungen einer tSDA durchgeführt werden kann. Gleichermaßen ist die Schwanzsequenz des Amplifikationsprimers (5' zur Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle) im Allgemeinen nicht entscheidend, obwohl die für eine SDA verwendete Restriktions-Schnittstelle und Sequenzen, welche entweder mit ihrer eigenen Zielbindesequenz oder mit den anderen Primern hybridisieren, vermieden werden sollten. Manche Amplifikationsprimer für die SDA bestehen daher aus 3'-Zielbindesequenzen, einer Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle 5' zur Zielbindesequenz, an der Einzelstrangbrüche eingeführt werden können, und einer etwa 10–25 Nucleotide langen Schwanzsequenz 5' zur Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle. Die Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle, an der Einzelstrangbrüche eingeführt werden können, und die Schwanzsequenz sind Sequenzen, welche für die SDA-Reaktion erforderlich sind. Manche Amplifikationsprimer für eine SDA können aus zielspezifischen Sequenzen sowohl 5' als auch 3' zur Restriktionsenzym-Erkennungsstelle bestehen. Mit diesem Design kann eine Steigerung der Effizienz einer zielspezifischen Hybridisierung erzielt werden. Für andere Amplifikationsreaktionen (z.B. 3SR, NASBA und TAS) können die Amplifikationsprimer aus der Zielbindesequenz und zusätzlichen Sequenzen bestehen, welche für die ausgewählte Amplifikationsreaktion erforderlich sind (z.B. für die SDA benötigte Sequenzen, wie obenstehend beschrieben, oder ein von RNA-Polymerase erkannter Promotor für die 3SR). Bei der Anpassung der erfindungsgemäßen Zielbindesequenzen an andere Amplifikationsverfahren als die SDA werden Routineverfahren zur Herstellung von Amplifikationsprimern, wie z.B. eine chemische Synthese, sowie die wohlbekannten strukturellen Anforderungen für die Primer der ausgewählten Amplifikationsreaktion eingesetzt. Die erfindungsgemäßen Zielbindesequenzen können daher bei einer Vielfalt von Amplifikationsreaktionen leicht an eine L. pneumophila-Organismus-spezifische Zielamplifikation und Detektion angepasst werden, wobei für Produktion, Screening und Optimierung nur Routineverfahren eingesetzt werden.
Bei einer SDA sind die Bumperprimer für die Artspezifität nicht wesentlich, da sie dahingehend funktionieren, die stromabwärtigen artspezifischen Amplifikationsprimer zu verdrängen. Es ist nur erforderlich, dass die Bumperprimer mit dem Ziel stromaufwärts von den Amplifikationsprimern hybridisieren, so dass sie, wenn sie verlängert werden, den Amplifikationsprimer und sein Verlängerungsprodukt verdrängen. Die bestimmte Sequenz des Bumperprimers ist daher im Allgemeinen nicht entscheidend und kann von jeglicher stromaufwärtiger Zielsequenz abgeleitet werden, welche ausreichend nahe an der Bindungsstelle des Amplifikationsprimers liegt, um eine Verdrängung des Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukts nach der Verlängerung des Bumperprimers zu ermöglichen. Gelegentliche Fehlpaarungen mit dem Ziel in der Bumperprimersequenz oder eine gewisse Kreuzhybridisierung mit Nichtzielsequenzen beeinflussen die Amplifikationseffizienz im Allgemeinen nicht negativ, so lange der Bumperprimer in der Lage bleibt, mit der spezifischen Zielsequenz zu hybridisieren.
Amplifikationsreaktionen, bei denen die erfindungsgemäßen Primer eingesetzt werden, können Thymin umfassen, wie von Walker et al. (1992, Nucl. Acids Res. 20:1691-1696) gelehrt, oder können in der Reaktion 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat ganz oder teilweise durch TTP ersetzen, um eine Querkontamination nachfolgender Amplifikationsreaktionen zu verringern, wie z.B. in der EP 0 624 643 gelehrt. dU (Uridin) wird in Amplifikationsprodukte eingebaut und kann durch eine Behandlung mit Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) herausgeschnitten werden. Diese abasischen Stellen machen das Amplifikationsprodukt in nachfolgenden Amplifikationsreaktionen unamplifizierbar. UDG kann vor der Durchführung der nachfolgenden Amplifikation durch einen Uracil-DNA-Glycosylase-Inhibitor (UGI) inaktiviert werden, um das Herausschneiden von dU in den neu gebildeten Amplifikationsprodukten zu verhindern.
Die SDA ist ein isothermes Verfahren der Nucleinsäureamplifikation, bei dem die Verlängerung von Primern, das Einführen von Einzelstrangbrüchen an einer hemimodifizierten Restriktionsendonuclease-Erkennungs-/Spaltstelle, das Verdrängen einzelsträngiger Verlängerungsprodukte, das Reassoziieren von Primern mit den Verlängerungsprodukten (oder der ursprünglichen Zielsequenz) und die nachfolgende Verlängerung der Primer gleichzeitig im Reaktionsgemisch stattfinden. Dies steht im Gegensatz zur PCR, bei der die Reaktionsschritte als Ergebnis des für die Reaktion charakteristischen Temperaturwechsels in getrennten Phasen oder Zyklen stattfinden. Eine SDA beruht auf 1) der Fähigkeit einer Restriktionsendonuclease, am unmodifizierten Strang einer Hemiphosphorthioat-Form ihrer doppelsträngigen Erkennungs-/Spaltstelle Einzelstrangbrüche einzuführen, und 2) der Fähigkeit bestimmter Polymerasen, eine Replikation am Einzelstrangbruch zu initiieren und den stromabwärtigen Nicht-Matrizen-Strang zu verdrängen. Nach einer anfänglichen Inkubation bei erhöhter Temperatur (etwa 95°C), um die doppelsträngigen Zielsequenzen zwecks Reassoziierung der Primer zu denaturieren, finden die anschließende Polymerisation und Verdrängung neu synthetisierter Stränge bei konstanter Temperatur statt. Die Herstellung jeder neuen Kopie der Zielsequenz besteht aus fünf Stufen: 1) das Binden von Amplifikationsprimern an eine ursprüngliche Zielsequenz oder ein zuvor polymerisiertes, verdrängtes, einzelsträngiges Verlängerungsprodukt, 2) die Verlängerung der Primer durch eine 5'-3'-Exonuclease-defiziente Polymerase, die ein α-Thiodesoxynucleosidtriphosphat (α-thio dNTP) enthält, 3) das Einführen von Einzelstrangbrüchen an einer hemimodifizierten doppelsträngigen Restriktions-Schnittstelle, 4) die Dissoziation des Restriktionsenzyms von der Einzelstrangbruchstelle und 5) die Verlängerung vom 3'-Ende des Einzelstrangbruchs weg durch die 5'-3'-Exonuclease-defiziente Polymerase mit einer Verdrängung des stromabwärts gelegenen, neu synthetisierten Strangs. Das Einführen von Einzelstrangbrüchen, die Polymerisation und die Verdrängung finden gleichzeitig und kontinuierlich bei konstanter Temperatur statt, da die Verlängerung vom Einzelstrangbruch weg eine weitere Restriktions-Schnittstelle, an der Einzelstrangbrüche eingeführt werden können, neu bildet. Wenn ein Paar von Amplifikationsprimern verwendet wird, von denen jeder mit einem der zwei Stränge einer doppelsträngigen Zielsequenz hybridisiert, so ist die Amplifikation exponentiell. Und zwar deshalb, weil die Sinn- und Antisinn-Stränge in anschließenden Amplifikationsdurchgängen als Matrizen für den entgegengesetzten Primer dienen. Bei Verwendung eines einzelnen Amplifikationsprimers ist die Amplifikation linear, da nur ein Strang als Matrize für die Primerverlängerung dient. Beispiele für Restriktionsendonucleasen, die an ihren doppelsträngigen Erkennungs-/Spaltstellen Einzelstrangbrüche einführen, wenn ein α-thio dNTP eingebaut ist, sind HincII, HindII, AvaI, NciI und Fnu4HI. All diese Restriktionsendonucleasen und andere, welche die erforderliche Aktivität des Einzelstrangbrüche-Einführens zeigen, sind für eine Verwendung bei der herkömmlichen SDA geeignet. Sie sind jedoch relativ thermolabil und verlieren bei über etwa 40°C an Aktivität.
Ziele für eine Amplifikation mittels SDA können durch die Fragmentierung größerer Nucleinsäuren mittels Restriktion mit einer Endonuclease, welche die Zielsequenz nicht schneidet, vorbereitet werden. Es wird jedoch im Allgemeinen bevorzugt, dass die Zielnucleinsäuren, welche ausgewählte Restriktionsendonuclease-Erkennungs-/Spaltstellen zum Einführen von Einzelstrangbrüchen in der SDA-Reaktion aufweisen, erzeugt werden, wie es bei Walker et al. (1992, Nucl. Acids Res. 20:1691-1696) und im U.S. Patent Nr. 5,270,184 beschrieben ist. Kurz gesagt, wenn die Zielsequenz doppelsträngig ist, werden vier Primer mit ihr hybridisiert. Zwei der Primer (S₁ und S₂) sind SDA-Amplifikationsprimer und zwei (B₁ und B₂) sind externe oder Bumperprimer. S₁ und S₂ binden an entgegengesetzte Stränge von die Zielsequenz flankierenden, doppelsträngigen Nucleinsäuren. B₁ und B₂ binden an die Zielsequenz 5' (d.h. stromaufwärts) von S₁ bzw. S₂. Die Exonuclease-defiziente Polymerase wird dann dazu verwendet, alle vier Primer in Gegenwart dreier Desoxynucleosidtriphosphate und mindestens eines modifizierten Desoxynucleosidtriphosphats (z.B. 2'-Desoxyadenosin-5'-O-(1-thiotriphosphat), „dATPαS") gleichzeitig zu verlängern. Die Verlängerungsprodukte von S₁ und S₂ werden dabei durch Verlängerung von B₁ und B₂ von der ursprünglichen Zielsequenzmatrize verdrängt. Die verdrängten, einzelsträngigen Verlängerungsprodukte der Amplifikationsprimer dienen als Ziele für die Bindung des entgegengesetzten Amplifikations- und Bumperprimers (z.B. bindet das Verlängerungsprodukt von S₁ S₂ und B₂). Der nächste Zyklus von Verlängerung und Verdrängung führt zu zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten mit hemimodifizierten Restriktionsendonuclease-Erkennungs-/Spaltstellen an jedem Ende. Diese sind geeignete Substrate für eine Amplifikation mittels SDA. Wie bei der SDA finden die einzelnen Schritte der Zielbildungsreaktion gleichzeitig und kontinuierlich statt, wobei Zielsequenzen mit den Erkennungs-/Spaltsequenzen an den Enden erzeugt werden, welche für das Einführen von Einzelstrangbrüchen durch das Restriktionsenzym bei der SDA erforderlich sind. Da alle Komponenten der SDA-Reaktion bereits bei der Zielbildungsreaktion vorhanden sind, treten erzeugte Zielsequenzen automatisch und kontinuierlich in den SDA-Zyklus ein und werden amplifiziert.
Um eine Querkontamination einer SDA-Reaktion durch die Amplifikationsprodukte einer anderen zu verhindern, kann dUTP anstelle von dTTP in die SDA-amplifizierte DNA ohne Hemmung der Amplifikationsreaktion eingebaut werden. Die Uracil-modifizierten Nucleinsäuren können dann spezifisch erkannt und durch Behandlung mit Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) inaktiviert werden. Wenn daher dUTP in einer früheren Reaktion in SDA-amplifizierte DNA eingebaut wird, kann jede anschließende SDA-Reaktion vor der Amplifikation doppelsträngiger Ziele mit UDG behandelt und jede dU-haltige DNA aus vorher amplifizierten Reaktionen nicht amplifizierbar gemacht werden. Die Ziel-DNA, die in der anschließenden Reaktion amplifiziert werden soll, enthält kein dU und wird durch die UDG-Behandlung nicht beeinflusst. UDG kann dann vor der Amplifikation des Ziels durch eine Behandlung mit UGI gehemmt werden. Alternativ kann UDG hitzeinaktiviert werden. Bei einer tSDA kann die höhere Reaktionstemperatur selbst (≥ 50°C) zur gleichzeitigen UDG-Inaktivierung und Amplifikation des Ziels verwendet werden.
Die SDA verlangt eine Polymerase, die keine 5'-3'-Exonucleaseaktivität aufweist, in doppelsträngigen Nucleinsäuren eine Polymerisation an einem Einzelstrangbruch initiiert und den stromabwärts vom Einzelstrangbruch gelegenen Strang verdrängt, während unter Verwendung desjenigen Stranges als Matrize, in dem keine Einzelstrangbrüche eingeführt wurden, ein neuer komplementärer Strang gebildet wird. Die Polymerase muss durch das Hinzufügen von Nucleotiden zu einem freien 3'-OH verlängern. Um die SDA-Reaktion zu optimieren, ist es auch wünschenswert, dass die Polymerase hoch arbeitsprogressiv ist, um die Länge der Zielsequenz, die amplifiziert werden kann, zu maximieren. Hoch arbeitsprogressive Polymerasen können neue Stränge von bedeutender Länge vor dem Dissoziieren und dem Beenden einer Synthese des Verlängerungsprodukts polymerisieren. Die Verdrängungsaktivität ist für die Amplifikationsreaktion wesentlich, da sie das Ziel für die Synthese zusätzlicher Kopien verfügbar macht und das einzelsträngige Verlängerungsprodukt erzeugt, mit dem ein zweiter Amplifikationsprimer in exponentiellen Amplifikationsreaktionen hybridisieren kann. Die Aktivität des Einzelstrangbrüche-Einführens des Restriktionsenzyms ist ebenfalls von großer Bedeutung, da es das Einführen von Einzelstrangbrüchen ist, das die Reaktion aufrechterhält und anschließenden Zielamplifikationsdurchgängen erlaubt zu starten.
Die tSDA wird im Wesentlichen wie die von Walker et al. beschriebene herkömmliche SDA (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396 und 1992 Nucl. Acids Res., 20:1691-1696) durchgeführt, mit einer Substitution der erwünschten thermostabilen Polymerase und thermostabilen Restriktionsendonuclease. Natürlich wird die Temperatur der Reaktion an die für die substituierten Enzyme geeignete, höhere Temperatur angepasst und wird die HincII-Restriktionsendonuclease-Erkennungs-/Spaltstelle durch die für die ausgewählte thermostabile Endonuclease passende Restriktionsendonuclease-Erkennungs-/Spaltstelle ersetzt. Ebenfalls im Gegensatz zu Walker et al. kann der praktische Anwender die Enzyme vor dem anfänglichen Denaturierungsschritt in das Reaktionsgemisch einbringen, wenn diese bei der Denaturierungstemperatur ausreichend stabil sind. Bevorzugte Restriktionsendonucleasen zur Verwendung bei der tSDA sind BsrI, BstNI, BsmAI, BslI und BsoBI (New England BioLabs) sowie BstOI (Promega). Die bevorzugten thermophilen Polymerasen sind Bca (Panvera) und Bst (New England Biolabs).
Die homogene Echtzeit-Fluoreszenz-tSDA ist eine Modifikation der tSDA. Bei ihr werden Detektor-Oligonucleotide eingesetzt, um eine reduzierte Fluoreszenzlöschung in zielabhängiger Weise hervorzurufen. Die Detektor-Oligonucleotide enthalten ein Donor/Akzeptor-Farbstoffpaar, das solcherart gekoppelt ist, dass bei Fehlen eines Ziels eine Fluoreszenzlöschung auftritt. Ein Entfalten oder eine Linearisierung einer sekundären Struktur mit intramolekular gepaarten Basen im Detektor-Oligonucleotid bei Vorhandensein des Ziels vergrößert den Abstand zwischen den Farbstoffen und verringert die Fluoreszenzlöschung. Ein Entfalten der sekundären Struktur mit gepaarten Basen umfasst typischerweise eine intermolekulare Basenpaarung zwischen der Sequenz der sekundären Struktur und einem komplementären Strang, so dass die sekundäre Struktur zumindest teilweise gestört wird. Sie kann bei Vorhandensein eines komplementären Strangs von ausreichender Länge vollständig linearisiert werden. Bei einer bevorzugten Ausführungs-form ist zwischen den beiden Farbstoffen eine Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle (RERS) vorhanden, so dass eine intermolekulare Basenpaarung zwischen der sekundären Struktur und einem komplementären Strang die RERS auch doppelsträngig und durch eine Restriktionsendonuclease spaltbar macht. Eine Furchungsteilung durch die Restriktionsendonuclease teilt den Donor- und den Akzeptor-Farbstoff auf getrennte Nucleinsäurefragmente auf, wodurch weiter zu einer verringerten Löschung beigetragen wird. Bei beiden Ausführungsformen wird eine damit verbundene Veränderung eines Fluoreszenzparameters (z.B. ein Anstieg der Donor-Fluoreszenzintensität, eine Abnahme der Akzeptor-Fluoreszenzintensität oder ein Verhältnis der Fluoreszenz vor und nach der Entfaltung) als Hinweis auf das Vorhandensein der Zielsequenz überwacht. Das Überwachen einer Veränderung der Donor-Fluoreszenzintensität wird bevorzugt, da diese Veränderung typischerweise größer als die Veränderung der Akzeptor-Fluoreszenzintensität ist. Andere Fluoreszenzparameter wie z.B. eine Veränderung der Fluoreszenzlebensdauer können ebenfalls überwacht werden. Die Furchungsteilung eines Oligonucleotids bezieht sich auf das Zerbrechen der Phosphodiesterbindungen beider Stränge einer DNA-Duplex oder auf das Zerbrechen der Phosphodiesterbindung von einzelsträngiger DNA. Dies steht im Gegensatz zum Einführen von Einzelstrangbrüchen, das sich auf das Zerbrechen der Phosphodiesterbindung nur eines der beiden Stränge in einer DNA-Duplex bezieht.
Ein Detektor-Oligonucleotid für eine homogene Echtzeit-Fluoreszenz-tSDA kann ein Oligonucleotid sein, das sowohl einen einzelsträngigen 5'- oder 3'-Abschnitt, der mit der Zielsequenz (der Zielbindesequenz) hybridisiert, als auch eine sekundäre Struktur mit intramolekular gepaarten Basen, die der Zielbindesequenz benachbart ist, umfasst. Bei einer in 1 dargestellten bevorzugten Ausführungsform ist das Detektor-Oligonucleotide eine Reporter-sonde, die einen einzelsträngigen 5'- oder 3'-Abschnitt, der nicht mit der Zielsequenz hybridisiert, umfasst. Der einzelsträngige 5'- oder 3'-Abschnitt hybridisiert vielmehr mit dem Komplement der Signalprimer-Adaptorsequenz (der Adaptor-Komplement-Bindesequenz). Eine weitere charakteristische Eigenschaft der Reportersonde besteht darin, dass dieser hybridisierende Abschnitt einer sekundären Struktur mit intramolekular gepaarten Basen benachbart ist. Die erfindungsgemäßen Detektor-Oligonucleotide umfassen weiters ein Donor/Akzeptor-Farbstoffpaar, das solcherart an das Detektor-Oligonucleotid gekoppelt ist, dass die Donor-Fluoreszenz gelöscht wird, wenn die sekundäre Struktur intramolekular gepaarte Basen aufweist, und eine Entfaltung oder Linearisierung der sekundären Struktur zu einer Verringerung der Fluoreszenzlöschung führt.
Die erfindungsgemäßen Detektor-Oligonucleotide für eine homogene Echtzeit-Fluoreszenz-tSDA umfassen eine Sequenz, die unter den für eine Primerverlängerung oder -hybridisierung ausgewählten Reaktionsbedingungen eine sekundäre Struktur mit intramolekular gepaarten Basen bildet. Bei einer Ausführungsform kann die sekundäre Struktur angrenzend an die Zielbindesequenz des Detektor-Oligonucleotids positioniert sein, so dass zumindest ein Teil der Zielbindesequenz einen einzelsträngigen 3'- oder 5'-Schwanz bildet. Bei einer in 1 dargestellten bevorzugten Ausführungsform ist die sekundäre Struktur angrenzend an die Adaptor-Komplement-Bindesequenz des Reportersonden-Detektor-Oligonucleotids positioniert, so dass zumindest ein Teil der Adaptor-Komplement-Bindesequenz einen einzelsträngigen 3'- oder 5'-Schwanz bildet. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "angrenzend an die Zielbindesequenz " oder „angrenzend an die Adaptor-Komplement-Bindesequenz", dass die gesamte Ziel/Adaptor-Komplement-Bindesequenz oder ein Teil davon in einem für die Hybridisierung mit dem Ziel/Adaptor-Komplement verfügbaren 5'- oder 3'-Schwanz einzelsträngig gelassen wird. Das heißt, die sekundäre Struktur umfasst nicht die gesamte Ziel/Adaptor-Komplement-Bindesequenz. Ein Teil der Ziel/Adaptor-Komplement-Bindesequenz kann an der intramolekularen Basenpaarung in der sekundären Struktur beteiligt sein, kann die gesamte erste Sequenz, die an der intramolekularen Basenpaarung in der sekundären Struktur beteiligt ist, oder einen Teil davon umfassen, erstreckt sich vorzugsweise allerdings nicht in ihre komplementäre Sequenz. Beispielsweise kann sich die Ziel/Adaptor-Komplement-Bindesequenz, wenn die sekundäre Struktur eine Stamm-Schleifen-Struktur (z.B. eine "Haarnadel") ist und die Ziel/Adaptor-Komplement-Bindesequenz des Detektor-Oligonucleotids als einzelsträngiger 3'-Schwanz vorhanden ist, auch durch den gesamten ersten Arm des Stamms oder einen Teil davon und gegebenenfalls durch die gesamte Schleife oder einen Teil davon erstrecken. Vorzugsweise erstreckt sich die Ziel/Adaptor-Komplement-Bindesequenz jedoch nicht in den zweiten Arm der an einer intramolekularen Stammbasenpaarung beteiligten Sequenz. Das heißt, es ist wünschenswert zu vermeiden, dass beide Sequenzen, die an einer intramolekularen Basenpaarung in einer sekundären Struktur beteiligt sind, zur Hybridisierung mit dem Ziel/Adaptor-Komplement in der Lage sind. Fehlpaarungen in jenem Teil der sekundären Struktur des Detektor-Oligonucleotids, der intramolekular gepaarte Basen aufweist, können den Umfang der Veränderung der Fluoreszenz bei Vorhandensein eines Ziels zwar verringern, sind jedoch akzeptabel, wenn die Analyseempfindlichkeit keine Rolle spielt. Fehlpaarungen bei der Ziel/Adaptor-Komplement-Bindesequenz des einzelsträngigen Schwanzes sind ebenfalls akzeptabel, können jedoch die Analyseempfindlichkeit und/oder -spezifität gleichermaßen reduzieren. Es ist jedoch ein Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass eine perfekte Basenpaarung sowohl bei der sekundären Struktur als auch bei der Ziel/Adaptor-Komplement-Bindesequenz die Reaktion nicht gefährdet. Perfekte Paarungen bei den an der Hybridisierung beteiligten Sequenzen verbessern die Analysespezifität ohne negative Auswirkungen auf die Reaktionskinetik.
Bei Hinzufügung zur Amplifikationsreaktion wird die erfindungsgemäßen Detektor-Oligonucleotid-Reportersonde durch Hybridisierung und Verlängerung in eine doppelsträngige Form umgewandelt, wie in 1 dargestellt. Eine Strangverdrängung durch die Polymerase entfaltet oder linearisiert auch die sekundäre Struktur und wandelt sie durch Synthese eines komplementären Strangs in eine doppelsträngige Form um. Die RERS wird, falls vorhanden, ebenfalls doppelsträngig und aufgrund der Restriktionsendonuclease spaltbar. Wenn die sekundäre Struktur durch die Strangverdrängungsaktivität der Polymerase entfaltet oder linearisiert wird, so wird der Abstand zwischen dem Donor- und dem Akzeptor-Farbstoff vergrößert, wodurch die Löschung der Donor-Fluoreszenz verringert wird. Die damit verbundene Veränderung der Fluoreszenz entweder des Donor- oder des Akzeptor-Farbstoffs kann als Hinweis auf die Amplifikation der Zielsequenz überwacht oder detektiert werden. Eine Furchungsteilung der RERS erhöht den Umfang der Fluoreszenzveränderung im Allgemeinen weiter, indem zwei getrennte Fragmente des doppelsträngigen sekundären Amplifikationsprodukts hergestellt werden, wobei jedes einen der beiden Farbstoffe angekoppelt hat. Diese Fragmente können sich frei in der Reaktionslösung verbreiten, wodurch der Abstand zwischen den Farbstoffen des Donor/Akzeptor-Paars weiter vergrößert wird. Ein Anstieg der Donor-Fluoreszenzintensität oder eine Abnahme der Akzeptor-Fluoreszenzintensität kann als Hinweis detektiert und/oder überwacht werden, dass eine Zielamplifikation stattfindet oder stattgefunden hat, andere Fluoreszenzparameter, die durch die Nähe des Donor-/Akzeptor-Farbstoffpaars beeinflusst werden, können allerdings ebenfalls überwacht werden. Eine Veränderung der Fluoreszenzintensität des Donors oder Akzeptors kann auch als Veränderung im Verhältnis von Donor- und/oder Akzeptor-Fluoreszenzintensität detektiert werden. Beispielsweise kann eine Veränderung der Fluoreszenzintensität als a) Anstieg im Verhältnis der Donor-Fluorophor-Fluoreszenz nach der Linearisierung oder Entfaltung der sekundären Struktur und der Donor-Fluorophor-Fluoreszenz im Detektor-Oligonucleotid vor der Linearisierung oder Entfaltung oder b) als Abnahme im Verhältnis der Akzeptor-Farbstoff Fluoreszenz nach der Linearisierung oder Entfaltung und der Akzeptor-Farbstoff-Fluoreszenz im Detektor-Oligonucleotid vor der Linearisierung oder Entfaltung detektiert werden.
Es ist zu erkennen, dass die erfindungsgemäßen Detektor-Oligonucleotide zusätzlich zur SDA für die Verwendung bei der Detektion von Amplikonen bei anderen Primer-Verlängerungsamplifikationsverfahren (z.B. PCR, 3SR, TAS oder NASBA) angepasst werden können. Beispielsweise können die Verfahren für die Verwendung in einer PCR angepasst werden, indem in der PCR PCR-Amplifikationsprimer und eine Strangverdrängungs-DNA-Polymerase, die keine 5'→3'-Exonucleaseaktivität aufweist, verwendet werden (z.B. Sequencing Grade Taq von Promega oder exo ^–Vent oder exo ^–Deep Vent von New England BioLabs). Die Signalprimer hybridisieren mit dem Ziel, das zumindest teilweise stromabwärts von den PCR-Amplifikationsprimern gelegen ist, werden verdrängt und nach einer Hybridisierung mit der Detektor-Oligonucleotid-Reportersonde und einer anschließenden Verlängerung doppelsträngig gemacht. In einer PCR kann jede RERS gegebenenfalls für die Verwendung im Detektor-Oligonucleotid ausgewählt werden, da typischerweise keine modifizierten Desoxynucleosidtriphosphate vorhanden sind, die eher als eine Furchungsteilung der RERS eine Einführung von Einzelstrangbrüchen auslösen könnten. Da der Temperaturwechsel ein Merkmal einer Amplifikation durch PCR ist, wird die Restriktionsendonuclease vorzugsweise bei niedriger Temperatur hinzugegeben, und zwar nach dem letzten Zyklus einer Primer-Reassoziierung und Verlängerung für die Endpunkt-Detektion einer Amplifikation. Eine thermophile Restriktionsendonuclease, die während der Hochtemperaturphasen der PCR-Reaktion aktiv bleibt, könnte jedoch während der Amplifikation vorhanden sein, um eine Echtzeit-Analyse zu bieten. Wie in SDA-Systemen verringert eine Trennung des Farbstoffpaars die Fluoreszenzlöschung, wobei eine Veränderung eines Fluoreszenzparameters, wie z.B. der Intensität, als Hinweis auf eine Zielamplifikation dient.
Die Veränderung der Fluoreszenz, die aus der Entfaltung oder Linearisierung der Detektor-Oligonucleotide resultiert, kann an einem ausgewählten Endpunkt in der Reaktion detektiert werden. Da linearisierte sekundäre Strukturen gleichzeitig mit einer. Hybridisierung oder Primerverlängerung hergestellt werden, kann die Veränderung der Fluoreszenz jedoch auch bei Stattfinden der Reaktion, d.h. in "Echtzeit", überwacht werden. Dieses homogene Echtzeitanalyse-Format kann zur Bereitstellung semiquantitativer oder quantitativer Informationen über die anfänglich vorhandene Menge an Ziel eingesetzt werden. Beispielsweise ist die Geschwindigkeit, in der sich die Fluoreszenzintensität während der Entfaltungs- oder Linearisierungsreaktion (entweder als Teil einer Zielamplifikation oder in Nichtamplifikations-Detektionsverfahren) ändert, ein Hinweis auf anfängliche Zielpegel. Als Ergebnis erreicht die Donor-Fluoreszenz rascher einen ausgewählten Schwellenwert (d.h. in kürzerer Zeit zur Positivität), wenn mehr Anfangskopien der Zielsequenz vorhanden sind. Die Verringerung der Akzeptor-Fluoreszenz weist gleichermaßen eine kürzere Zeit zur Positivität auf, welche als jene Zeit, die zur Erreichung eines ausgewählten Mindestwerts erforderlich ist, detektiert wird. Außerdem ist die Geschwindigkeit der Veränderung von Fluoreszenzparametern während des Ablaufs der Reaktion in Proben, die größere anfängliche Zielmengen enthalten, höher als in Proben, die geringere anfängliche Zielmengen enthalten (d.h. erhöhter Anstieg der Fluoreszenzkurve). Diese oder andere Messungen, die im Stand der Technik bekannt sind (z.B. U.S.-Patent Nr. 5,928,907, U.S.-Patent Nr. 6,216,049), können als Hinweis auf das Vorhandensein eines Ziels oder als Hinweis auf eine Zielamplifikation vorgenommen werden. Die anfängliche Zielmenge wird typischerweise durch einen Vergleich der Versuchsergebnisse mit Ergebnissen hinsichtlich bekannter Zielmengen bestimmt.
Analysen hinsichtlich des Vorhandenseins einer ausgewählten Zielsequenz können gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren in einer Lösung oder auf einer festen Phase durchgeführt werden. Homogene Echtzeit- oder Endpunktanalysen, bei denen das Detektor-Oligonucleotid als Primer wirkt, werden typischerweise in einer Lösung durchgeführt. Hybridisierungsassays unter Verwendung der erfindungsgemäßen Detektor-Oligonucleotide können ebenfalls in einer Lösung vorgenommen werden (z.B. als homogene Echtzeitanalysen), sind jedoch auch besonders gut für Festphasenanalysen für eine Echtzeit- oder Endpunktdetektion eines Ziels geeignet. Bei einer Festphasenanalyse können Detektor-Oligonucleotide über interne oder terminale Markierungen auf der Festphase (z.B. Perlen, Membranen oder dem Reaktionsgefäß) immobilisiert werden, wobei im Stand der Technik bekannte Verfahren angewandt werden. Beispielsweise kann ein Biotin-markiertes Detektor-Oligonucleotid auf einer Avidin-modifizierten Festphase immobilisiert werden, wo es eine Veränderung der Fluoreszenz erzeugt, wenn es unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen dem Ziel ausgesetzt wird. Ein Einfangen des Ziels in dieser Weise ermöglicht die Trennung des Ziels von der Probe und erlaubt die Entfernung von Substanzen in der Probe, welche die Detektion des Signals oder andere Aspekte der Analyse stören könnten. Ein Beispiel für ein Festphasensystem, das verwendet werden kann, ist ein Array-Format, wie z.B. jene, die im Stand der Technik bekannt sind.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele veranschaulichen spezifische Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung. Wie dem Fachmann offensichtlich wäre, sind verschiedene Veränderungen und Modifikationen möglich und werden innerhalb des beschriebenen Umfangs der Erfindung in Erwägung gezogen.
BEISPIEL 1
Analytische Empfindlichkeit
Die in Tabelle 1 gezeigten Amplifikationsoligonucleotide wurden hinsichtlich einer Amplifikation und Detektion des mip-Ziels getestet. Die Amplifikationsreaktionen wurden bei 0, 10, 20, 30, 50 und 100 Kopien eines klonierten Plasmids pro Reaktion, das ein teilweises L. pneumophila-mip-Zielinsert enthielt, durchgeführt. Die Amplifikationsreaktionen wurden bei 52°C in einem Puffer durchgeführt, der Endkonzentrationen der folgenden Komponenten enthielt: 45 mM Kaliumphosphat (pH 7,6), 100 mM Bicin, 35 mM Kaliumhydroxid, 6% Glycerin, 6% Dimethylsulfoxid (DMSO), 5 mM Magnesiumacetat, 700 ng DNA der menschlichen Plazenta, 10 μg acetyliertes Rinderserumalbumin, 100 nM stromaufwärtiger Primer (SEQ ID NO: 1), 500 nM stromabwärtiger Primer (SEQ ID NO: 2), 50 nM Bumperprimer (SEQ ID NOs: 3–4), 250 nM Signalprimer (SEQ ID NO: 6), 500 nM Reportersonde (SEQ ID NO: 7), 0,1 mM dATP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dTTP, 0,5 mM 2'-Desoxycytidin-5'-O-(1-thiotriphosphat)-s-isomer und ungefähr 20 Einheiten BsoBI und 10 Einheiten Bst-Polymerase.
In Kurzfassung, die Ziel-DNA wurde 5 Minuten lang bei 95°C denaturiert und vor der Hinzugabe zu einem Puffer, welcher die Primer und Bumper enthielt, auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Inkubation wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten lang fortgesetzt, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 72°C, um ein mögliches falsches Bereitmachen minimal zu halten. Die Amplifikation wurde daraufhin bei 52°C durch Übertragung eines feststehenden Volumens an Startmischung in Mikrotitermulden, welche die Amplifikationsenzyme enthielten, ausgelöst. Die Amplifikation und die Echtzeitdetektion wurden 1 Stunde lang bei einer konstanten Temperatur von 52°C durchgeführt. Spezifische Amplifikationsprodukte wurden durch Überwachung der Veränderung der Fluoreszenzintensität, die mit der Hybridisierung einer Reportersonde (SEQ ID NO: 7) mit dem Komplement des Signalprimers SEQ ID NO: 6, der anschließenden Verlängerung des Signalprimer-Komplements und der Furchungsteilung des resultierenden doppelsträngigen Produkts zusammenhing, nachgewiesen. Es stellte sich heraus, dass die Nachweisgrenze (berechnet als jener Zielpegel, der eine Positivitätsrate von 95% vorhersagt) bei ungefähr 40 Kopien pro Reaktion lag.
BEISPIEL 2
Bewertung der Primerspezifität
Die Primerspezifität wurde unter Verwendung von SEQ ID NO: 1, SEQ ID: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID: 6 und SEQ ID NO: 7 und der obenstehend in Beispiel 1 beschriebenen Reaktionsbedingungen bewertet. Die Primerspezifität wurde unter Verwendung von sechzehn verschiedenen Stämmen von L. pneumophila bewertet, welche mit 500 genomischen Äquivalenten pro Reaktion getestet wurden (Tabelle 2). Bei allen Stämmen war der Test hinsichtlich einer berechneten Spezifität von 100% positiv.
TABELLE 2 Tafel der L. pneumophila-Spezifität
BEISPIEL 3
Bewertung der Kreuzreaktivität

Die Kreuzreaktivität wurde unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Primer und Reaktionsbedingungen bewertet. Zelllysate von fünfundfünfzig Organismen wurden mit 10⁶ genomischen Äquivalenten pro Reaktion getestet. Parallele Reaktionen wurden mit 250 Kopien eines klonierten Plasmids durchgeführt, das ein teilweises L. pneumophila-mip-Zielinsert enthielt, welcher der Probe zugesetzt wurde, um sicherzustellen, dass die Amplifikation nicht unterdrückt wurde. Ein Beweis für eine Kreuzreaktivität wurde bei keinem der 55 untersuchten Organismen erhalten (Tabelle 3). TABELLE 3 Tafel der L. pneumophila-Kreuzreaktivität

Organismus	ATCC#
Acinetobacter calcoaceticus	13339
Aeromonas hydrophila	7966
Branhamella catarrhalis	25285
Candida albicans	44808
Citrobacter freundii	8090
Enterobacter aerogenes	13048
Enterobacter cloacae	13047
Enterococcus faecalis	29212
Enterococcus faecium	19434
Escherichia coli	11775
Gruppe B-Streptococcus	12386

Haemophilus influenzae	33533
Haemophilus parainfluenzae	7901
Klebsiella pneumoniae ssp. pneumoniae	13883
Moraxella osloensis	19976
Neisseria gonorrhoeae	19424
Neisseria meningitidis	13077
Neisseria mucosa	19696
Pseudomonas aeruginosa	27853
Salmonella choleraesuis Serotyp enteritidis	13076
Salmonella choleraesuis Serotyp typhi	19430
Serratia marcescens	8100
Staphylococcus aureus, Protein A produzierend	12598
Staphylococcus aureus, kein Protein A produzierend	25923
Staphylococcus epidermidis	E155
Strenotrophomonas maltophilia	13637
Streptococcus mutans	25175
Streptococcus pneumoniae	6303
Streptococcus pyogenes	19615
Bordetella bronchiseptica	10580
Bordetella pertussis	9797
Corynebacterium diphtheriae	11913
Corynebacterium jeikeium	43734
Cryptococcus neoformans	36556
Eikenella corrodens	23834
Klebsiella pneumoniae ssp. ozaenae Typ 4	11296
Legionella bozemanii	33217
Legionella dumoffii	33279
Legionella feeleii	700514
Legionella longbeachae	33462
Legionella micdadei	33204
Legionella anisa	35292
Legionella cherrii	35252
Legionella cincinnatiensis	43753
Legionella erythra	35303
Legionella fairfieldensis	49588
Legionella gormanii	33297
Legionella hackeliae	35250

Legionella jordanis	33623
Legionella maceachernii	35300
Legionella oakridgensis	33761
Legionella spiritensis	35249
Legionella worsleiensis	49508
Lactobacillus acidophilus	4356
Veillonella parvula	10790

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Oligonucleotid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, einer zu SEQ ID NO: 6 komplementären Nucleinsäure und einem Oligonucleotid, bestehend aus einer Zielbindesequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Zielbindesequenzen von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 und gegebenenfalls einer für eine Amplifikationsreaktion erforderlichen Sequenz.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 1, wobei die für die Amplifikationsreaktion erforderliche Sequenz eine Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle ist, an der durch eine Restriktionsendonuclease Einzelstrangbrüche eingeführt werden können.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 1, welches aus SEQ ID NO: 6 und einer zu SEQ ID NO: 6 komplementären Nucleinsäure ausgewählt ist und weiters einen indirekt nachweisbaren Marker umfasst.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 3, wobei der indirekt nachweisbare Marker eine Adaptorsequenz ist.
Ausstattung umfassend: a) einen Primer, bestehend aus SEQ ID NO: 1, b) einen Primer, bestehend aus SEQ ID NO: 2, c) einen oder mehrere Bumper, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5, und d) einen oder mehrere Signalprimer, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 6 und einer zu SEQ ID NO: 6 komplementären Nucleinsäure.
Ausstattung gemäß Anspruch 5, umfassend eine Reportersonde von SEQ ID NO: 7.
Ausstattung gemäß Anspruch 5, weiters umfassend: e) ein Paar von Primern, die für die Amplifikation einer für Bordetella pertussis spezifischen Nucleinsäuresequenz spezifisch sind; f) ein Paar von Primern, die für die Amplifikation einer für Mycoplasma pneumoniae spezifischen Nucleinsäuresequenz spezifisch sind; und g) ein Paar von Primern, die für die Amplifikation einer auf eine Chlamydien-Infektion hinweisenden Nucleinsäuresequenz spezifisch sind.
Verfahren zum Amplifizieren einer Zielnucleinsäuresequenz eines Legionella pneumophila-Organismus, umfassend: a) das Hybridisieren i) eines ersten Amplifikationsprimers, bestehend aus einer Zielbindesequenz von SEQ ID NO: 1 und gegebenenfalls einer für eine Amplifikationsreaktion erforderlichen Sequenz, und ii) eines zweiten Amplifikationsprimers, bestehend aus einer Zielbindesequenz von SEQ ID NO: 2 und gegebenenfalls einer für die Amplifikationsreaktion erforderlichen Sequenz, mit der Nucleinsäure, und; b) das Verlängern des ersten und des zweiten hybridisierten Amplifikationsprimers an der Zielnucleinsäuresequenz, wodurch die Zielnucleinsäuresequenz amplifiziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, weiters umfassend das indirekte Nachweisen der amplifizierten Zielnucleinsäure durch Hybridisierung mit einem Signalprimer.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei der Signalprimer aus SEQ ID NO: 6 besteht.