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DE69409225T2 - Verbindungen für zielrichtung - Google Patents

Verbindungen für zielrichtung

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DE69409225T2
DE69409225T2 DE69409225T DE69409225T DE69409225T2 DE 69409225 T2 DE69409225 T2 DE 69409225T2 DE 69409225 T DE69409225 T DE 69409225T DE 69409225 T DE69409225 T DE 69409225T DE 69409225 T2 DE69409225 T2 DE 69409225T2
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target cell
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cells
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Mahendra Icrf Oncology Group London W12 0Hs Deonarain
Agamemnon Antoniou Icrf Oncology Group London W12 0Hs Epenetos
Robert Anthony Icrf Oncology Group London W12 0Hs Spooner
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Imperial Cancer Research Technology Ltd
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, wobei einige dieser Verbindungen direkt oder indirekt cytotoxische Kombinationen von Verbindungen darstellen, die eine hohe Avidität zu ausgewählten Zellen aufweisen und auf diese gerichtet werden können.
    • Hintergrund und Stand der Technik
  • Das zelispezifische Ansteuern (targeting) von Verbindungen, die direkt oder indirekt cytotoxisch sind, wurde als Weg zur Bekämpfung von Krankheiten, wie Krebs, vorgeschlagen. Bagshawe und Mitarbeiter beschrieben (Bagshawe (1987), Br. J. Cancer 56, 531; Bagshawe et al. (1988) Br. J. Cancer 58, 700; WO 88/07378) einen Antikörper oder einen Teil hiervon und ein Enzym umfassende konjugierte Verbindungen, wobei der Antikörper für Tumorzellenantigene spezifisch war und das Enzym die Umwandlung einer unschädlichen Prodrug in eine cytotoxische Verbindung bewirkte. Bei den cytotoxischen Verbindungen handelte es sich um Alkylierungsmittel, z.B. einen durch die Wirkung des Pseudomonas-sp.-CPG2-Enzyms aus p-N-Bis(2-chlorethyl)aminobenzoylglutaminsäure freigesetzten Benzoesäuresenf.
  • Ein alternatives System unter Verwendung verschiedener Prodrugs wurde von Epenetos und Mitarbeitern (WO 91/11201) beschrieben. Bei den cytotoxischen Verbindungen handelte es sich um cyanogene Monosaccharide oder Disaccharide, wie die Pflanzenverbindung Amygdalin, die unter der Wirkung einer β-Glucosidase und Hydroxynitrillyase Cyanid freisetzen.
  • In einem weiteren alternativen System wurde die Verwendung von Antikörper/Enzym-Konjugaten, die das Enzym Alkaliphosphatase in Verbindung mit der Prodrug Etoposid-4'-phosphat oder 7-(2'-Aminoethylphosphat)mitomycin oder eine Kombination hiervon enthalten, beschrieben (EP 0 302 473; Senter et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4842).
  • Rybak und Mitarbeiter beschrieben (Rybak et al. (1991), J. Biol. Chem. 266, 21202; WO 91/16069) das cytotoxische Potential einer monomeren Pankreasribonudease bei direkter Injektion in Xenopus-Oocyten und das cytotoxische Potential monomerer Rnase bei Kopplung an humanes Transferrin oder an gegen den Transferrin-Rezeptor gerichtete Antikörper. Die monomeren Rnase-Hybridproteine waren gegenüber humanen Erythroleukämiezellen in vitro cytotoxisch.
  • Andere Ansätze stellen die in-vivo-Applikation von konjugierten Streptavidin-Antikörpern und anschließend, nach einem entsprechenden Zeitraum, von radioaktivem Biotin (Hnatowich et al. (1988), J. Nucl. Med. 29, 1428-1434) oder die Injektion von einem biotinylierten mab und anschließend von radioaktivem Streptavidin (Paganelli et al. (1990), Int. J. Cancer 45, 1184-1189) dar. Ein Pilotversuch zur Radioimmunlokalisation in nichtkleinzelligen Lungenkarzinomen wurde mit ermutigenden Ergebnissen durchgeführt (Kalofonos et al. (1990), J. Nucl. Med. 31, 1791-1796).
  • Abgesehen von diesen Beispielen sind üblicherweise vielmehr biotinylierte Antikörper und Streptavidin/Enzymkonjugate bei der Verwendung in ELISA-Bestimmungen zu sehen.
  • In diesen früheren Systemen wurden relativ große Antikörper/Enzym- oder Antikörper/Streptavidin- oder Antikörper/ Biotin-Konjugate verwendet. Sie können von Nicht-Säugetieren stammende Bereiche umfassen, die hoch immunreaktiv sind.
  • Eine rasche Penetranz (Yokota et al. (1992), Cancer Res. 52, 3402-3408) und eine rasche Clearance (Colcher et al. (1990), J. Natl. Cancer Inst. 82, 1191-1197) zeigte sich bei Einzelketten-Fv-Antikörperfragmenten (ScFv).
  • Bei Rybak et al. (1993), Cell Biophysics 21, 121-138, wird das cytotoxische Potential von Rnasen diskutiert.
  • In WO 91/16069 wird an Human-Transferrin gekoppelte Pankreasribonuclease A und die Cytotoxizität des hierbei erhaltenen Hybridproteins gegenüber Säugetierzellen diskutiert.
  • Bei Weichert und Ambrosius (1991), Immunobiology 138, 153, werden Immunokonjugate von Glucoseoxidase und Ribonuclease T&sub1; diskutiert.
  • In EP-0 251 494 werden Systeme zur Verabreichung therapeutischer oder radiodiagnostischer Verbindungen beschrieben.
  • In EP-0 496 074 wird der Einsatz biotinylierter monoklonaler Antikörper zu Diagnose und Therapie diskutiert.
  • In EP-0 263 046 werden immunologische Reagenzien zum Nachweis und Abtten spezifischer Targetzellen diskutiert.
  • In EP-0 479 600 wird der Einsatz von Antikörpern mit einem weiteren daran hängenden Peptid diskutiert.
  • In EP-0 140 728 werden Konjugate aus der Ricin-A-Kette und Antikörpern diskutiert.
  • Bei Verwendung der genannten zellspezifischen Reagenzien in einer zur Therapie geeigneten Situation besteht eine der Forderungen, die erfüllt werden müssen, darin, daß sich das zellspezifische Reagenz an der Target- bzw. Zielzelle in einer gegenüber anderen Zellen ausreichend höheren Konzentration ansammelt. Eine weitere Forderung besteht darin, daß zur Zielzelle ein direkt oder indirekt cytotoxisches Reagenz befördert wird und dieses cytotoxische Reagenz vorzugsweise eine hohe Wirksamkeit aufweist.
  • Wir dachten uns nun verbesserte Systeme aus, von denen mindestens einige gegenüber den ausgewählten Target- bzw. Zielzellen höhere Avidität aufweisen und neue, wirksame, direkt oder indirekt cytotoxische Mittel verwenden.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • In einer ersten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Verbindung, umfassend einen zielzellenspezifischen Bereich und einen cytotoxischen Bereich, die dadurch gekennzeichnet ist, daß der cytotoxische Bereich eine DNA-endonucleolytische Aktivität aufweist, bereitgestellt.
  • Der Ausdruck "zielzellenspezifischer" Bereich bedeutet den Bereich der Verbindung, der eine oder mehrere Bindungsstelle(n), die Einheiten auf der Zielzelle erkennt (erkennen) und an diese bindet (binden), umfaßt. Diese Einheiten werden in vorherrschender Weise und vorzugsweise ausschließlich auf der Zielzelle exprimiert. Der zielzellenspezifische Bereich kann eine oder mehrere Bindungsstelle(n) für verschiedene, auf der gleichen Zielzellenart exprimierte Einheiten oder eine oder mehrere Bindungsstelle(n) für verschiedene auf zwei oder mehr verschiedenen Zielzellenarten exprimierte Einheiten enthalten.
  • Bei der Einheit, die erkannt wird, kann es sich um eine beliebige geeignete Einheit, die durch Tumorzellen, virusinfizierte Zellen, pathogene Mikroorganismen, als Teil einer Gentherapie eingeführte Zellen oder selbst normale Körperzellen, auf die man, aus welchem Grund auch immer, abzielt, exprimiert wird, jedoch in Zellen, auf die man nicht abzielt, nicht oder zumindest nicht mit dieser Frequenz exprimiert wird, handeln. Die einheit, die erkannt wird, ist oft ein Antigen. Beispiele für Antigene sind die in der folgenden Tabelle 1 angegebenen. Monoklonale Antikörper, die an viele dieser Antigene binden können, sind bereits bekannt (beispielsweise die in der Tabelle angegebenen). Mit den heutigen Techniken bezüglich der Technologie monoklonaler Antikörper können jedoch in jedem Fall Antikörper zu den meisten Antigene hergestellt werden. Der antigenspezifische Bereich kann Teil eines Antikörpers (beispielsweise ein Fab-Fragment) oder ein synthetisches Antikörperfragment (beispielsweise ein Einzelketten-Fv-Fragment [ScFv]) sein. Geeignete monoklonale Antikörper zu ausgewählten Antigenen können nach bekannten Techniken, z.B. den in "Monodonal Antibodies: A manual of techniques", H. Zola (CRC Press, 1988) und in "Monodonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J.G.R. Hurrell (CRC Press, 1982) beschriebenen, hergestellt werden.
  • Die variablen schweren (VH) und variablen leichten (VL) Domänen des Antikörpers sind an der Antigenerkennung beteiligt, wobei diese Tatsache zuerst durch frühe Proteaseverdauungsexperimente erkannt wurde. Eine weitere Bestätigung erfolgte im Rahmen der "Humanisierung" von Nagetierantikörpern. Von Nagetieren stammende variable Domänen können mit konstan ten Domänen humaner Herkunft verschmolzen bzw. fusioniert werden, so daß der hierbei entstehende Antikörper die Antigenspezifität des von Nagetieren stammenden Antikörpers behält (Morrison et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci." USA 81, 6851-6855).
  • Die Tatsache, daß Antigenspezifität durch variable Domänen verliehen wird und unabhängig von den konstanten Domänen ist, ist aus Experimenten, die sich mit der Bakterienexpression von Antikörperfragmenten, die alle eine oder mehrere variable Domäne(n) enthalten, befassen, bekannt. Diese Mole küle umfassen Fab-ähnliche Moleküle (Better et al. (1988), Science 240, 1041); Fv-Moleküle (Skerra et al. (1988), Science 240, 1038); einkettige-Fv (ScFv)-Moleküle, in denen die VH- und VL-Partnerdomänen über ein flexibles Oligopeptid verbunden sind (Bird et al. (1988), Science 242, 423; Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) und Einzeldomänenantikörper (dAbs), die isolierte V-Domänen umfassen (Ward et al. (1989), Nature 341, 544). Eine allgemeine Übersicht über die an der Synthese von Antikörperfragmenten, die ihre spezifischen Bindestellen behalten, beteiligten Techniken findet sich bei Winter & Milstein (1991), Nature 349, 293-299.
  • Der Ausdruck "Scfv-Moleküle" bedeutet Moleküle, in denen die VH- und VL-Partnerdomänen über ein flexibles Oligopeptid verbunden sind.
  • Chimäre Antikörper werden von Neuberger et al. (1988, 8th International Biotechnology Symposium, Teil 2, 792-799) diskutiert.
  • In geeigneter Weise hergestellte nichthumane Antikörper können auf bekannte Weise, beispielsweise durch Insertion der CDR-Regionen von Mäuseantikörpern in das Gerüst humaner Antikörper, "humanisiert" werden.
  • Die Vorteile einer Verwendung von Antikörperfragmenten gegenüber der Verwendung von ganzen Antikörpern sind vielfach. Die geringere Größe der Fragmente ermöglicht eine rasche Clearance und kann zu einem verbesserten Verhältnis Tumor/Nichttumor führen. Fab-, Fv-, Scfv- und dab-Antikörperfragmente können alle in E. coli exprimiert und von diesem sezerniert werden, wodurch die Produktion von großen Mengen der Fragmente ohne Schwierigkeiten möglich wird.
  • Ganze Antikörper und F(ab')&sub2;-Fragmente sind "bivalent". Der Ausdruck "bivalent" bedeutet, daß die Antikörper und F(ab')&sub2;-Fragmente zwei Antigen-Kombinationsstellen aufweisen. Im Gegensatz hierzu sind die nur eine Antigen-Kombinationsstelle aufweisenden Fab-, Fv-, ScFv- und dab-Fragmente mono valent.
  • Alternativ kann die zu erkennende Einheit antigen sein oder auch nicht; sie kann jedoch auch auf andere Weise erkannt werden und eine selektive Bindung eingehen. Beispielsweise kann sie aus einem charakteristischen Zelloberflächen rezeptor, wie dem Rezeptor für Melanocyten stimulierendes Hormon (MSH), der in hoher Zahl in Melanomzellen exprimiert wird, bestehen. Bei dem zelispezifischen Bereich kann es sich dann um eine Verbindung oder einen Teil einer Verbindung mit spezifischer Bindung an die Einheit in nichtimmunologischem Sinne, z.B. als Substrat oder Substratanaloges für ein Zelloberflächenenzym oder als Botenstoff, handeln.
  • Vorzugsweise umfaßt der zellspezifische Bereich mit hoher Avidität zwei oder mehr verschiedene Bindestellen für die Target- bzw. Zielzelle.
  • Die verschiedenen Bindestellen für die Zielzelle können aus zwei oder mehr verschiedenen Antikörpern oder Antikörperfragmenten&sub1; die gegen verschiedene auf der Zielzelle exprimierte Einheiten gerichtet sind, bestehen oder auch nicht. Alternativ können die verschiedenen Bindestellen für die Zielzelle die Zelle in einem anderen, nichtimmunologischen Sinne erkennen und selektiv binden.
  • Eine weitere Alternative besteht darin, daß eine oder mehrere der Bindestellen aus einem Antikörper oder einem Teil eines Antikörpers bestehen und daß eine oder mehrere der Bindestellen für die Zielzelle die Zelle in einem anderen, nichtimmunologischen Sinne erkennen und selektiv binden.
  • Eine Verbindung, die Bindestellen für zwei oder mehr zielzellenspezifische Einheiten aufweist, kann die Zielzelle spezifischer binden, und eine Verbindung, die mehr als eine der einzelnen verschiedenen Bindestellen aufweist, kann sich an die Zielzelle mit größerer Avidität binden. Durch Kombination von zwei oder mehr Bindestellen, die in sich von hoher Spezifität, jedoch geringer Affinität sein können, ist in der erfindungsgemäßen Verbindung die Erzeugung einer höheren Affinität zur Zielzelle unter Erhalt der Spezifität der Bindestellen möglich. TABELLE 1
  • Vorzugsweise werden die beiden Bereiche der erfindungsgemäßen Verbindung als Fusionsverbindung mittels DNA- Rekominations-Techniken erzeugt, wobei ein Stück DNA entsprechende Regionen mit Codierung für die beiden Bereiche der erfindungsgemäßen Verbindung entweder einander benachbart oder durch eine Region mit Codierung für ein Linkerpeptid, das die gewünschten Eigenschaften der Verbindung nicht zerstört, getrennt umfaßt. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung unter Verwendung von DNA-Rekombinations-Techniken bietet mehrere Vorteile. Zunächst ergibt sich ein hoher Präzisionsgrad für die Verknüpfung der beiden Bereiche der Verbindung. Zweitens läßt sich der Aufbau der "heterooligomeren" Verbindungen durch die Expression der verschiedenen rekombinanten DNA-Moleküle mit Codierung für jeweils unterschiedliche Arten von Untereinheiten des "Heterooligomers" in der gleichen Wirtszelle steuern.
  • Mit dem Ausdruck "Heterooligomer" bezeichnen wir Verbindungen, in denen zwei oder mehr unterschiedliche zellspezifische Bereiche entweder an die gleichen oder unterschiedliche oligomerisierbaren(n) Untereinheiten gebunden sind. Die Expression zweier Verbindungen, A und B, mit jeweils unterschiedlichen zielzellenspezifischen Bereichen, jedoch einem zur Oligomerisierung fähigen gemeinsamen zweiten Bereich in der gleichen Wirtszelle ergibt eine Mischpopulation der Verbindungen. Weist beispielsweise der gemeinsame zweite Bereich die Fähigkeit zur Dimerisierung auf, werden drei mögliche Verbindungen erzeugt: A&sub2;, AB und B&sub2; im Verhältnis 1:2:1.
  • Die Abtrennung der gewünschten Verbindung mit allen un terschiedlichen zellspezifischen Bereichen, d.h. AB, kann durch zweistufige Affinitätschromatographie erfolgen.
  • Die Applikation des Gemischs der Verbindungen auf eine für A spezifische Aff initätskolonne ergibt die Bindung von A&sub2; und AB. Diese Verbindungen werden aus dieser ersten Säule eluiert und anschließend auf eine für B spezifische Affinitätssäule appliziert. Dies führt dazu, daß AB, jedoch nicht A&sub2;, an die Säule gebunden wird. Schließlich kann das gewünschte Produkt AB eluiert werden.
  • Natürlich ist die Reihenfolge, in der die Affinitätssäulen verwendet werden, ohne Bedeutung.
  • Das gleiche Prinzip der Abtrennung dieser Verbindungen mit zwei oder mehr unterschiedlichen Bindestellen kann auf die Reinigung der gewünschten Verbindungen aus Gemischen anderer Heterooligomere angewandt werden.
  • Begreiflicherweise können sich die beiden Bereiche der Verbindung insgesamt oder teilweise überlappen.
  • Die DNA wird anschließend zur Erzeugung eines die erfindungsgemäße Verbindung umfassenden Polypeptids in einem geeigneten Wirt exprimiert. Die DNA mit Codierung für das die erfindungsgemäße Verbindung darstellende Polypeptid kann daher gemäß bekannter Techniken mit entsprechender Modifikation im Hinblick auf die hier angegebene Lehre zur Konstruktion eines Expressionsvektors verwendet werden. Dieser Expressionsvektor wird anschließend zur Transformation einer ge eigneten Wirtszelle zur Expression und Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids verwendet. Solche Techniken umfassen die in US-A-4 440 859, von Rutter et al., erteilt am 3. April 1984, 4 530 901 von Weissman, erteilt am 23. Juli 1985, 4 582 800 von Crowl, erteilt am 15. April 1986, 4 677 063 von Mark et al., erteilt am 30. Juni 1987, 4 678 751 von Goeddel, erteilt am 7. Juli 1987, 4 704 362 von Itakura et al., erteilt am 3. November 1987, 4 710 463 von Murray, erteilt am 1. Dezember 1987, 4 757 006 von Toole, Jr. et al., erteilt am 12. Juli 1988, 4 766 075 von Goeddel et al., erteilt am 23. August 1988 und 4 810 648 von Stalker, erteilt am 7. März 1989, beschriebenen Techniken, auf die hier sämtlich Bezug genommen wird.
  • Die DNA mit Codierung für das die erfindungsgemäße Verbindung darstellende Polypeptid kann an eine große Vielzahl anderer DNA-Sequenzen zur Einführung in einen geeigneten Wirt gebunden werden. Die Begleit-DNA hängt von der Natur des Wirts, der Art der Einführung der DNA in den Wirt und dem Wunsch nach Episomerhaltung oder Integration ab. Im allgemeinen wird die DNA in einen Expressionsvektor, z.B. ein Plasmid, in richtiger Orientierung und mit korrektem Leseraster zur Expression insertiert. Bei Bedarf kann die DNA mit durch den gewünschten Wirt erkannten geeigneten die Transkription und Translation regulierenden Nucleotidsteuersequenzen verbunden werden, obwohl derartige Steuerungen im Expressions vektor im allgemeinen verfügbar sind. Der Vektor wird anschließend durch Standardtechniken in den Wirt eingeführt. Im allgemeinen werden nicht alle Wirte durch den Vektor transformiert. Daher ist eine Selektion bezüglich transformierter Wirtszellen nötig. Eine Selektionstechnik beinhaltet den Einbau einer DNA-Sequenz (mit beliebigen notwendigen Kontrollelementen) mit Codierung für eine selektierbare Eigenschaft in der transformierten Zelle, wie Antibiotikaresistenz, in den Expressionsvektor. Alternativ kann das Gen für eine solche selektierbare Eigenschaft auf einem anderen Vektor, der zur Cotransformation der gewünschten Wirtszelle verwendet wird, sein.
  • Die durch die erfindungsgemäße rekombinante DNA transformierten Wirtszellen werden anschließend während einer ausreichenden Zeitspanne und unter geeigneten Bedingungen, die Fachleuten auf dem einschlägigen Fachgebiet im Hinblick auf die hier offenbarte Lehre bekannt sind, zur Expression des Polypeptids kultiviert, welches anschließend gewonnen wird.
  • Es sind viele Expressionssysteme, umfassend Bakterien (beispielsweise E. coli und Bacillus subtilis), Hefen (beispielsweise Saccharomyces cerevisiae), Fadenpilze (beispielsweise Aspergillus), Pflanzenzellen, Tierzellen und Insektenzellen, bekannt.
  • Vektoren, die ein Replikon, z.B. ein prokaryotisches Replikon, umfassen, können ferner einen geeigneten Promotor, z.B. einen prokaryotischen Promotor, der die Expression (Transkription und Translation) der Gene in einer Bakterienwirtszelle, z.B. E. coli, die mit diesen transformiert wurde, steuert, umfassen.
  • Ein Promotor ist ein aus einer DNA-Sequenz gebildetes Expressionssteuerungselement, das das Binden von RNA-Polymerase und Ablaufen der Transkription gewährleisten kann. Mit beispielhaften bakteriellen Wirten kompatible Promotorsequenzen werden typischerweise in Plasmidvektoren, die geeignete Restriktionsstelle zur Insertion eines erfindungsgemäßen DNA- Segments enthalten, bereitgestellt.
  • Typische prokaryotische Vektorplasmide sind pUC18, puclg, pBR322 und pBR329, erhältlich bei Biorad Laboratories (Richmond, CA, USA) und pTrc99A und pKK223-3, erhältlich bei Pharmacia, Piscataway, NJ, USA.
  • Ein typisches Säugetierzellenvektorplasmid ist pSVL, erhältlich bei Pharmacia, Piscataway, NJ, USA. Dieser Vektor verwendet den SV40-late-Promotor zur Steuerung der Expression geklonter Gene, wobei sich der höchste Expressionsgrad in T- Antigen produzierenden Zellen, wie COS-1-Zellen, findet.
  • Ein Beispiel für einen induzierbaren Säugetierexpressionsvektor ist pMSG, das auch bei Pharmacia erhältlich ist. Dieser Vektor verwendet den Glucocorticoid-induzierbaren Promotor aus dem langen terminalen Repeat des Mäusemammatumorvirus zur Steuerung der Expression des geklonten Gens.
  • Geeignete Hefeplasmidvektoren sind pRS403-406 und pRS413-416, die im allgemeinen bei Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA, erhältlich sind. Die Plasmide pRS403, pRS404, pRS405 und pRS406 sind Hefeintegrationsplasmide (YIps) und enthalten die selektierbaren Hefemarker his3, trp1, leu2 und ura3. Die Plasmide pRS413-416 sind Hefecentromerplasmide (YCps).
  • Eine Vielzahl von Verfahren wurden zur operativen Verknüpfung von DNA mit Vektoren über komplementäre cohäsive Enden entwickelt. Beispielsweise können dem DNA-Segment komplementäre homopolymere Strangteile zur Insertion in die Vektor-DNA zugesetzt werden. Der Vektor und das DNA-Segment werden anschließend durch Wasserstoffbrückenbindung zwischen den komplementären homopolymeren Schwänzen unter Bildung rekombinanter DNA-Moleküle verbunden.
  • Synthetische Linker, die eine oder mehrere Restriktionsstelle(n) enthalten, liefern ein alternatives Verfahren zur Verbindung der DNA-Segmente mit Vektoren. Das DNA-Segment, das wie bereits beschrieben durch Endonucleaserestriktionsverdauung erzeugt wurde, wird mit Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase oder E. coli-DNA-Polymerase I, Enzymen, die aufgrund ihrer 3'-5'-exonucleolytischen Aktivitäten überhängende einzelsträngige 3'-Enden entfernen und zurückgesetzte 3'-Enden aufgrund ihrer Polymerisationsaktivitäten auffüllen, behandelt.
  • Durch die Kombination dieser Aktivitäten werden daher DNA-Segmente mit glatten Enden erzeugt. Die glattendigen Segmente werden anschließend mit einem großen molaren Überschuß von Linkermolekülen in Gegenwart eines Enzyms, das die Ligation glattendiger DNA-Moleküle katalysieren kann, wie Bakteriophagen-T4-DNA-Ligase, inkubiert. Die Reaktionsprodukte sind daher DNA-Segmente, die an den Enden polymere Linkersequenzen tragen. Diese DNA-Segmente werden anschließend mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten und an einen Expressionsvektor, der zuvor mit einem Enzym, das mit den Enden des DNA-Segments kompatible Enden erzeugt, gespalten worden war, ligiert.
  • Eine Vielzahl von Restriktionsendonucleasestellen enthaltende synthetische Linker sind im Handel bei einer Zahl von Quellen einschließlich International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, USA, erhältlich.
  • Ein günstiger Weg zur Modifizierung der DNA mit Codierung für das erfindungsgemäße Polypeptid besteht in der Verwendung der Polymerasekettenreaktion wie von Saiki et al. (1988), in Science 239, 487-491, beschrieben.
  • Bei diesem Verfahren wird die enzymatisch zu amplifizierende DNA durch zwei spezifische Oligonucleotidprimer, die selbst in die amplifizierte DNA eingebaut werden, flankiert. Diese spezifischen Primer können Restriktionsendonucleaseer kennungsstellen, die zur Klonierung in Expressionsvektoren unter Verwendung von auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannten Verfahren verwendet werden können, enthalten.
  • Beispiele für Hefegattungen, die bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung als geeignet angesehen werden, sind Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Hansenula, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis u.dgl.. Bevorzugte Gattungen sind die aus der Gruppe Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia und Hansenula ausgewählten. Beispiele für Saccharomyces sind Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces italicus und Saccharomyces rouxii. Beispiele für Kluyveromyces sind Kluyveromyces fragilis und Kluyveromyces lactis. Beispiele für Hansenula sind Hansenula polymorpha, Hansenula anomala und Hansenula capsulata. Yarrowia lipolytica stellt ein Beispiel für eine geeignete Yarrowia-Spezies dar.
  • Verfahren zur Transformation von 5. cerevisiae sind allgemein in EP 251 744, EP 258 067 und WO 90/01063 dargelegt. Auf alle diese Literaturstellen wird hier Bezug genommen.
  • Geeignete Promotoren für S. cerevisiae umfassen Promotoren, die mit dem PGK1-Gen, GAL1- oder GAL10-Gen, CYC1, PHO5, TRP1, ADH1, ADH2, den Genen für Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase, Glucokinase, α-Matingfactorpheromon oder a-Matingfactorpheromon assoziiert sind, den PRB1-Promotor, den GUT2-Promotor und Hybridpromotoren, die Hybride von Teilen der 5'-Regulatorregionen mit Teilen der 5'-Regulatorregionen anderer Promotoren oder mit stromaufwärts gelegenen Aktivierungsstellen umnfassen (z.B. den Promotor von EP-A-258 067).
  • Das Transkriptionsterminationssignal ist vorzugsweise die 3'-flankierende Sequenz eines eukaryotischen Gens, die geeignete Signale zur Transkriptionstermination und Polyadenylierung enthält. Geeignete 3'-flankierende Sequenzen können beispielsweise die Sequenzen des Gens, die natürlicherweise an die verwendete Expressionssteuersequenz gebunden sind, sein, d.h. sie können dem Promotor entsprechen. Alternativ können sie hiervon verschieden sein, wobei in diesem Fall das Terminationssignal des S. cerevisiae-AHD1-Gens bevorzugt ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine mit einem erfindungsgemäßen Polynucleotidvektorkonstrukt transformierte Wirtszelle. Die Wirtszelle kann entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Bakterienzellen sind bevorzugte prokaryotische Wirtszellen. Sie sind typischerweise vom Stamm E. coli, beispielsweise die E. coli-Stämme DH5, erhältlich bei Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA, und RRL, erhältlich bei der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, MD, USA (Nr. ATCC 31343). Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen umfassen Hefe- und Säugetierzellen, vorzugsweise Wirbeltierzellen, wie die von Maus, Ratte, Affe, oder eine Humanfibroblastenzellinie. Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen umfassen Chinese-Hamster-Ovarial (CHO)-Zellen, erhältlich bei der ATCC als CCL61, NIH-Schweizer Mäuseembryozellen NIH/3T3, erhältlich bei der ATCC als CRL 1658 und von Affennieren stammende COS-1-Zellen, erhältlich bei der ATCC als CRL 1650.
  • Die Transformation geeigneter Zellwirte mit einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt erfolgt nach wohlbekannten Verfahren, die typischerweise von der Art des verwendeten Vektors abhängen. Im Hinblick auf die Transformation prokaryotischer Wirtszellen siehe beispielsweise Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972) und Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). Die Transformation von Hefezellen wird in Sherman et al., Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1986), beschrieben. Das Verfahren von Beggs, Nature, 275: 104-109 (1978), ist ebenfalls verwendbar. Im Hinblick auf Wirbeltierzellen sind zur Transfektion dieser Zellen verwendbare Reagenzien, z.B. Calciumphosphat und DEAE-Dextran oder Liposomzubereitungen, bei Stratagene Cloning Systems oder Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD 20877, USA, erhältlich.
  • Erfolgreich transformierte Zellen, d.h. Zellen, die ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthalten, können nach bekannten Verfahren identifiziert werden. Beispielsweise können Zellen, die sich bei der Einführung eines erfindungsgemäßen Expressionskonstrukts ergeben, zur Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids gezüchtet werden. Die Zellen können geerntet und lysiert und ihr DNA-Gehalt kann auf das Vorhandensein der DNA unter Verwendung eines Verfahrens gemäß Southern, J. Mol. Biol., 98, 503 (1975), oder Berent et al., Biotech. 3: 208 (1985), geprüft werden. Alternativ kann das Vorhandensein des Proteins im Überstand unter Verwendung von Antikörpern gemäß der folgenden Beschreibung nachgewiesen werden.
  • Zusätzlich zum direkten Testen auf das Vorhandensein von rekombinanter DNA kann eine erfolgreiche Transformation für den Fall, daß die rekombinante DNA die Expression des Proteins steuern kann, durch wohlbekannte immunologische Verfahren bestätigt werden. Beispielsweise erzeugen erfolgreich mit einem Expressionsvektor transformierte Zellen Proteine, die eine entsprechende Antigenität aufweisen. Proben von vermutlich transformierten Zellen werden geerntet und unter Verwendung geeigneter Antikörper in bezug auf das Protein getestet.
  • Die vorliegenden Erfindung betrifft daher zusätzlich zu den transformierten Zellen selbst auch eine Kultur dieser Zellen, vorzugsweise eine monoklonale (klonal homogene) Kultur oder eine von einer monoklonalen Kultur abgeleitete Kultur in einem Nährmedium. Vorzugsweise enthält die Kultur auch das Protein.
  • Zur Züchtung transformierter Wirtszellen geeignete Nährmedien sind auf dem einschlagigen Fachgebiet bekannt und bei mehreren Handelsquellen erhältlich.
  • Alternativ werden der zielzellenspezifische und der zweite Bereich der erfindungsgemäßen Verbindung auf einem der üblichen Wege zur Querverbindung von Polypeptiden, vgl. die allgemeine Beschreibung bei O'Sullivan et al., Anal. Biochem. (1979), 100, 100-108, miteinander verbunden. Beispielsweise kann der Antikörperbereich mit Thiolgruppen angereichert und der Enzymbereich mit einer bifunktionellen Verbindung, die mit diesen Thiolgruppen reagieren kann, z.B. dem N-Hydroxysuccinimidester von lodessigsäure (NHIA) oder N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) umgesetzt werden. Amidund Thioetherbindungen, die z.B. mit m-Maleimidobenzoyl-N- hydroxysuccinimidester erhalten werden, sind im allgemeinen in vivo stabiler als Disulfidbindungen.
  • Es können beliebige Verbindungen mit DNA-endonucleolytischer Aktivität, z.B. Kupfer-Phenanthrolinaddukte, verwendet werden. Vorzugsweise handelt es sich bei der Verbindung um eine DNA-Endonuclease, z.B. Desoxyribonuclease-I (DNase-1), eine Endonudease, die unter Bildung von 5'-phosphorylierten Polynualeotiden doppelsträngige DNA spaltet. Sie schneidet nicht alle DNA-Stellen mit der gleichen Häufigkeit, da sie durch die lokale Struktur der DNA (insbesondere die Größe der kleinen Furche) beeinflußt wird.
  • Alternativ könnte die DNA-Endonuclease eine Restriktionsendonudease vom Typ II sein. Restriktionsendonucleasen vom Typ II sind aus Mikroorganismen, gewöhnlich Bakterien, isolierte Enzyme, die doppelsträngige DNA bei speziellen Sequenzen spalten. Typischerweise erkennen die Restriktionsendonudeasen vom Typ II palindromische Sequenzen in DNA und sie spalten beide Stränge der DNA innerhalb oder anschließend an die Erkennungsstelle. Die Restriktionsenzyme vom Typ II sind Dimere aus identischen Untereinheiten. Beispielsweise ist EcoRI ein Homodimer aus 31 kDa-Untereinheiten, das die Sequenz 5'-GAATTC-3' erkennt.
  • Andere Restriktionsenzyme vom Typ II erkennen unter schiedliche Hexanucleotidsequenzen. Beispielsweise erkennt BamHI 5'-GGATCC-3' und HindIII 5'-AAGCTT-3'. Darüber hinaus sind Restriktionsenzyme vom Typ II, die eine unterschiedliche Anzahl von Basen erkennen, bekannt. Beispielsweise erkennt MspI 5'-CCGG-3', Sau3AI 5'-GATC-3', HinfI 5'-GANTC-3' und NotI 5'-GCGGCCGC-3'. Natürlich wird ein beliebiges DNA-Molekül durch die verwandte Endonudease vom Typ II umso wahrscheinlicher gespalten, je weniger spezifische Basen sich in der Erkennungssequenz befinden.
  • Das Gen für die Rinder-Dnase I wurde auf chemischem Wege synthetisiert und in E. coli exprimiert (Worrall & Connolly (1990), J. Biol. Chem. 265, 21889-21895). Das Gen für das Humanenzym wurde aus einer in λgt10 konstruierten Humanpankreas-cDNA-Bibliothek kloniert. Das Enzym wurde in einer Humanzellkultur exprimiert und zur Linderung der Symptome von cystischer Fibrose durch Verringern der Viskosität von Sputum durch Abbau der Viskositäts-DNA verwendet (Shak et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 9188-9192; Hubbard et al. (1992), N. Engl. J. Med. 326, 812-815). Alle Enzyme stellen kompakte monomere Proteine von etwa 29 kDa (260 Aminosäuren) dar; nach Glycosylierung weist das Humanenzym etwa 35 kDa auf. Bezüglich seiner Aktivität ist es von zweiwertigen Kationen (Ca²&spplus;, Mg²&spplus;) abhängig. Das Humanenzym ist auf der Ebene der Aminosäuresequenz zu etwa 75% mit dem Rinderenzym identisch. Das synthetische Gen mit Codierung für die Rinder- Dnase-I kann unter Verwendung der bei Worrall & Connolly (1990) aaO beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
  • Das Enzym aus Rinderpankreas wurde gereinigt und kristallisiert und strukturmäßig mit einer hohen Auflösung von 2 Å bestimmt (Suck & Oefner (1986), J. Mol. Biol. 192, 605- 632).
  • Eine erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Einführung des DNAse-I-Enzyms in die angesteuerte bzw. Ziel-Zelle. Während der Mitosestadien, bei denen die Zellmembran aufgelöst ist, ist die chromosomale DNA der angesteuerten Zelle gegenüber einem Nucleaseangriff empfänglich. In dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform ist DNAse I besonders cytotoxisch gegenüber sich schnell teilenden Zellen, wie Tumorzellen.
  • Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist der Einbau einer Kernlokalisationssequenz aus dem großen T-Antigen von SV40 in die erfindungsgemäße Verbindung (Kalderon et al. (1984), Cell 39, 499-509). Diese Kernlokalisationssequenz kann PKKKRKV (SEQ ID No 1) oder Analoga hiervon sein. Ein DNA-Fragment mit Codierung für diese Sequenz oder ein Anabgon hiervon kann gegebenenfalls in das Gen, das die DNAse I als zweiten Bereich enthaltende erfindungsgemäße Verbindung exprimiert, eingebaut werden.
  • Der Einbau der Kernlokalisationssequenz ermöglicht der erfindungsgemäßen Verbindung, zur chromosomalen DNA während der Perioden des Zellzyklus, in denen die Kernmembran intakt ist, Zugang zu erhalten, da die Kemporen für große Makromoleküle, in die die Kernlokalisationssequenz oder Analoga hiervon eingebaut sind, durchdringbar sind.
  • Zum Funktionieren der Erfindung kann die Verbindung mit DNA-endonucleolytischer Aktivität natürlich ein Fragment von DNA-Endonuclease, das die enzymatische Aktivität beibehält, z.B. die aktive Stelle, und im Falle einer dimeren Restriktionsendonuclease, deren Bindestellenuntereinheit, umfassen.
  • Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform besteht darin, daß die Dnase von Säugetieren, vorzugsweise vom Menschen, stammt. Die Verwendung der Säugetierproteine als zweitem funktionellem Bereich der erfindungsgemäßen Verbindung ist vorteilhaft, da solche Verbindungen mit geringerer Wahrscheinlichkeit unerwünschte Immunreaktionen ergeben.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden auf geeignete Weise, üblicherweise parenteral, beispielsweise intravenös, intraperitoneal oder vorzugsweise (bei Blasenkrebs) intravesikal (d.h. in die Blase) in sterilen, nichtpyrogenen Standardzubereitungen mit Verdünnungsmitteln und Trägern, z.B. isotonischer Kochsalzlösung (bei intravenöser Verabreichung), verabreicht.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind im Prinzip zur Zerstörung von Zellen in einem beliebigen Tumor oder einer anderen definierten Klasse von Zellen, die selektiv eine erkennbare (Oberflächen)einheit aufweisen, geeignet. Die Verbindungen sollen prinzipiell dem Einsatz beim Menschen dienen, können jedoch zur Behandlung anderer Säugetiere, umfassend Hunde, Katzen, Rinder, Pferde, Schweine und Schafe, verwendet werden.
  • Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren und Beispiele detailliert beschrieben. Für die Figuren gilt:
  • Fig. 1 zeigt die Konstruktion von Plasmiden, die ScFvNP exprimieren.
  • Fig. 2 zeigt Oligonucleotidprimer, die in der Polymerasekettenreaktion zur Amplifikation verschiedener Fragmente der Region mit Codierung für ScFv verwendet werden.
  • Fig. 3 zeigt die Nucleotidsequenz (SEQ ID No 2) (und die Sequenz des codierten Proteins (SEQ ID No 3)) zwischen den HindIII- und EcoRI-Stellen von pRAS107 und pRAS111.
  • Fig. 4 zeigt die Bindung eines von praslll exprimierten löslichen Proteins an NIP&sub1;&sub5;-BSA.
  • Fig. 5 zeigt, daß ein von praslll exprimiertes und an NIP&sub1;&sub5;-BSA bindendes lösliches Protein durch NIP&sub1;&sub5;-BSA eine Konkurrenz erfahren kann.
  • Fig. 6 zeigt die Konstruktion von Plasmiden, die ScFv- DNAseI-Fusionsmoleküle exprimieren.
  • Fig. 7 zeigt die Reinigung von pRAS111-ScFvNP-Protein.
  • Fig. 8 zeigt die Nucleotidsequenz (SEQ ID No 13) der ScFv-Dnasei-Fusion (Anti-4-OH-nitrophenacetyl-Antikörper), die zwischen die HindIII- und die BglI-Stelle des Plasmids pSP71 insertiert wurde.
  • Fig. 9 zeigt die Nucleotidsequenz (SEQ ID No 14) der ScFv-Dnasei-Fusion (Anti-Humanplacentaalkaliphosphatase-Antikörper; H17E2), die zwischen die Hindill- und die BglI-Stelle des Plasmids pSP71 insertiert wurde.
  • Fig. 10 zeigt die Nucleotidsequenz (SEQ ID No 15) der ScFv-Dnasei-Fusion (Anti-Lysozym-Antikörper), die zwischen die HindIII- und die Bgli-Stelle des Plasmids pUC18 insertiert wurde.
    • Beispiel 1:
  • Konstruktion eines gegenübe dem Hapten NP (4-OH-Nitrophenacetyl) reaktiven einzelkettigen Fv (ScFv)
    • Plasmidkonstruktionen
  • Die Plasmide sind in Fig. 1 angegeben. Die gefüllten Kreise stellen Promotoren dar: Plac, lac-Promotor von pUC- Plasmiden; PSP6, SP6-Promotor; PT7, T7-Promotor. Die leeren Kästchen stellen fusionierte Genbereiche dar: pelB, die aus dem Pectatlyase-B-Gen von Erwinia caratovora stammende Signalsequenz; (G&sub4;S)&sub3;, ein drei Tandemrepeats von N-Glyglyglyglyser-C umfassender flexibler Oligopeptidlinker (SEQ ID No 16); myc, ein von c-myc stammender kleiner immunogener Anhänger. Restriktionsenzymstellen: B, BamHI; Bs, BstEII; b, BglII; C, ClaI; E, EcoRI; H, HindIII; K KpnI; P, PstI; Sp, SphI; Ss, SstI; X, XhoI.
  • Das Plasmid pSWsFvD1.3myc (McCafferty et al. (1990), Nature 348, 552-554) codiert für ein gegenüber Hühnereilysozym reaktives einzelkettiges Fv, umfassend die durch ein flexibles Oligopeptid, (G&sub4;S)&sub3;, verbundenen Domänen VHD1.3 und VKD1.3 unter der Transkriptionskontrolle des lac-Promotors von E. coli. Die Region mit Codierung für VKD1.3 wurde durch eine Region mit Codierung für Vλ auffolgende Weise ersetzt. Das Segment mit Codierung für VHD1.3(G&sub4;S)&sub3; wurde unter Verwendung der Oligonucleotidprimer VHBACK2 (SEQ ID No 17) und BAMLINKERFOR (SEQ ID No 18) (Fig. 2) einer durch Polymerasekettenreaktion (PCR) vermittelten Amplifikation unterworfen. Der Primer BAMLINKERFOR steuert den Einbau einer BamHI-Stelle, die auch für die beiden carboxyterminalen Aminosäuren des die beiden V-Domänen verbindenden flexiblen Oligopeptids codiert.
  • Ein Vλ-Gensegment wurde unter Verwendung des Primerpaars BAMVλBACK (SEQ ID No 19) und ECOVλFOR (SEQ ID No 20) aus chromosomaler DNA aus Plasmacytom J558L amplifiziert. Der erste Primer steuert den Einbau einer BamHI-Stelle am 5'-Ende des Gens; der letztere den Einbau von zwei Stoppcodons und XhoI- und EcoRI-Stellen am 3'-Ende des Gens.
  • Die beiden amplifizierten Produkte wurden zum Ersetzen des Psti-EcoRI-Fragments von Plasmid pRAS103 zur Erzeugung des Plasmids pRAS106 mit Codierung für ein Scfv-Protein, wobei das Plasmid VHD1.3(G&sub4;S)&sub3;VλJ558L unter der Transkriptionskontrolle des SP6-Promotors umfaßt, verwendet.
  • Das PstI-BstEII-Fragment von pRAS106 wurde zur Erzeugung des Plasmids pRAS107 durch ein Psti-BstEII-Fragment mit Codierung für VHNP, das unter Verwendung der Primer VHBACK3 (SEQ ID No 21) und VH1FOR-2 (SEQ ID No 22) aus dem Plasmid pRAS49 (Spooner und Lord (1991) aaO) amplifiziert wurde, ersetzt. Dieses Plasmid trägt ein VHNP(G&sub4;S)&sub3;VλJ558L-ScFv unter der Transkriptionskontrolle des 5P6-Promotors und soll allein zur Expression in in-vitro-Systemen dienen. Das Plasmid praslll trägt das Scfv von pRAS107, jedoch unter der Kontrolle des T7-Promotors, und ist zur Expression in sowohl in-vitro-Systemen als auch Bakteriensystemen geeignet.
  • Die Nucleotidsequenz (und die abgeleitete Aminosäuresequenz) zwischen der Hindill- und der EcoRI-Stellen der Plasmide pRAS107 und pRAS111 sind in Fig. 3 angegeben. TABELLE 3: Verwendete Plasmide
    • Wachsen von Plasmacytoiu J558L und DNA-Präparation
  • Mäuseplasmacytom-J558L-Zellen wurden in mit 10% Kalbfötusserum ergänztem, nach Dulbecco modifiziertem Eagle'- Medium wachsengelassen. Die Zellen wurden zweimal in phosphatgepufferter Standardkochsalzlösung eines pH-Werts von 7,4 (PBS) gewaschen. DNA mit hohem Molekulargewicht wurde durch Zugabe von 10&sup6; in 100 ul PBS suspendierten Zellen zu 2,5 ml 0,02% (g/v) SDS enthaltendem 10 mM Tris-HCl/1 mM EDTA (pH- Wert: 8,0) unter leichtem Verwirbeln hergestellt. Nach Zugabe von Proteinase K bis zu 1 mg ml&supmin;¹, Inkubation (3 h, 50ºC) und zwei Extraktionen mit Phenol/Chloroform wurde die DNA mit Ethanol ausgefällt und über Nacht bei 4ºC in 1 ml 10 mM Tris- HCl/1 mM EDTA (pH-Wert: 8) gelöst.
    • Polymerasekettenreaktion
  • Plasmid- oder chromosomale DNA (100 ng) wurde 24 Runden einer PCR-vermittelten Amplifikation (94ºC, 1 min; 65ºC, 1,5 min und 72ºC, 2 min) in 50-ul-Reaktionsvolumina, die 25 pmol der einzelnen geeigneten Oligonucleotidprimer, 250 uM der einzelnen dNTPs, 67 mM Tris-HCl (pH-Wert: 8,8), 17 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1,5-6 mM MgCl&sub2;, 200 mg ml&supmin;¹ Gelatine und 5 Einheiten Taq-Polymerase (Cetus), überschichtet mit 25 ul Paraffinöl, enthielten, unterzogen. Die amplifizierte DNA wurde einmal mit Phenol/Chloroform extrahiert und vor Gebrauch mit Ethanol ausgefällt.
    • Bakterielle Expression des pRAS111-Proteins
  • E. coli K12 JM109(DE3), ein JM109-Derivat mit chromosomaler Insertion von T7-Polymerase unter lac-Transkriptionskontrolle, wurde mit dem Plasmid pRAS111 transformiert. Die Zellen wurden bis zu einer Dichte von 10&sup7; ml&supmin;¹ wachsengelassen. Die Expression des pRAS111-Proteins wurde durch Induktion von T7-Polymerase mit 100 nM IPTG induziert. Ein 31-kDa- Protein sammelt sich in den Zellen in ausreichender Menge zur vorläufigen Identifizierung durch Coomassie-Anfärben der Zellextrakte an. Die Identität wird durch Western Blotting bestätigt, wobei biotinyliertes Ziegen-Antimaus-Lambda (Gαmλ)-Antiserum als Sonde verwendet wird.
  • Des weiteren wurde E. coli K12 BL21 (DE3), ein Derivat von BL21 mit einer einzelnen chromosomalen Kopie von T7-RNA- Polymerase unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors (Studier und Moffatt (1986), J. Mol. Biol. 189, 113-130), mit dem Plasmid pRAS111 transformiert. Die Kulturen (400 ml) wurden bei 37ºC oder bei Raumtemperatur in mit 100 ug ml&supmin;¹ Ampicillin und 1% Glucose ergänztem Minimalsalzmedium oder in mit 100 ug ml&supmin;¹ Ampicillin ergänzter L-Nährbrühe bis zu einer Dichte von 10&sup7; Zellen/ml wachsen gelassen. Die Expression des pRAS111-ScFv-Proteins wurde durch Induktion von T7-Polymerase mit 100 nM IPTG erreicht. Nach der Induktion wurden die Zellen 24 h wachsengelassen, um die Ansammlung von prRAS111-ScFv- Protein im Wachsmedium zu ermöglichen.
    • Biologische Aktivität und Affinitätsreiniqung des pRAS111- Proteins
  • Gefilterte Bakterienüberstände wurden in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen, auf die zuvor 10 mg ml&supmin;¹ NIP&sub1;&sub5;-BSA oder 300 mg ml&supmin;¹ Hühnereilysozym aufgetragen worden war, appliziert. GebundeneS Protein wurde durch aufeinanderfolgende Inkubation mit biotinyliertem Gαm -Antiserum und HRPO-Streptavidinkonjugat nachgewiesen. Farbveränderungen wurden durch Inkubation mit ABTS erzeugt und bei 405 nm registriert.
  • Ein im Wachsmedium von JM109 (DE3)/pRAS11-Kulturen, jedoch nicht in Kulturen von JM109 (DE3) vorhandenes lösliches Protein bindet NIP&sub1;&sub5;-BSA, jedoch nicht Lysozym (Fig. 4). Nach der Induktion von pRAS111-Protein zurückgewonnenes filtriertes Bakterienwachsmedium wurde auf Vertiefungen einer ELISA- Platte, auf die 10 ug ml&supmin;¹ NIP&sub1;&sub5;-BSA ( ) oder 300 ug ml&supmin;¹ Hühnereilysozym ( ) aufgetragen war, appliziert. Gebundenes Protein wurde durch aufeinanderfolgende Inkubation mit biotinylierten Gamλ (Ziegen-Antimaus-Lambda-leichte-Kette)-Antiseren und mit Meerettichperoxidase konjugiertem Streptavidin, das in Blockierungspuffer verdünnt war, nachgewiesen. Die durch Zugabe von ABTS erzeugten Farbveränderungen wurden bei 405 nm registriert. Ein in den Wachsmedien von JM109(DE3)/ pRAS111-Kulturen, jedoch nicht in Kulturen von JM109(DE3) vorhandenes lösliches Protein bindet NIP&sub1;&sub5;-BSA, wobei NIP&sub1;&sub5;- BSA konkurrierend wirken kann (Fig. 5). Das ScFv-Protein wurde an ELISA-Vertiefungen, auf die 10 ug ml&supmin;¹ NIP&sub1;&sub5;-BSA aufgetragen war, bei Abwesenheit von konkurrierendem Hapten oder in Gegenwart von 0,010 ug ml&supmin;¹ ( ) 0,019 ug ml&supmin;¹ (X), 0,039 ug ml&supmin;¹ (-), 0,078 ug ml&supmin;¹ (+), 0,156 ug ml&supmin;¹ ( ), 0,313 ug ml&supmin;¹ ( ), 0,625 ug ml&supmin;¹ (Δ), 1,25 ug ml&supmin;¹ ( ), 2,5 ug ml&supmin;¹ ( ), 5 ug ml&supmin;¹ ( ) oder 10 ug ml&supmin;¹ (o) konkurrierendem Hapten binden gelassen. Gebundenes Protein wurde durch aufeinanderfolgende Inkubation mit biotinylierten Gam -Antiseren und mit Meerettichperoxidase konjugiertem Streptavidin nachgewiesen. Die durch Zugabe von ABTS erzeugten Farbveränderungen wurden bei 405 nm registriert. Es zeigte sich, daß das durch praslll codierte ScFc gegenüber NP eine Bindungsaffinität von Kd = 4 × 10&supmin;&sup9; M aufwies. Da die Bivalenz eines Antikörpers im allgemeinen eine um drei Größenordnungen höhere Bindungsfähigkeit liefert, sollten von ScFvNP abgeleitete bivalente Moleküle eine Avidität von mindestens 10&supmin;¹² M zeigen.
  • Als Alternative wurde ein zur Entfernung von Zellen und Teilchen durch 0,2-um-Nitrocellulosefilter gefiltertes Wachsmedium mit festem Ammoniumsulfat bei 4ºC auf 80%ige Sättigung eingestellt. Nach Inkubation (4º0, 1 h) wurde das behandelte Medium zentrifugiert, um unlösliche Proteine zu pelletisieren (10 000 x g, 30 min). Die Pellets wurden in 20 ml PBS aufgenommen und erschöpfend gegen PBS bei 4ºC dialysiert. Die nach der Dialyse unlöslichen Stoffe wurden durch kurze Zentrifugation entfernt. Das Zentrifugat wurde mit PBS auf ein Endvolumen von 40 ml, mit Natriumazid auf 0,02% eingestellt und langsam (2 ml h&supmin;¹) auf eine 2-ml-NP-Sepharose-Säule bei Raumtemperatur appliziert. Nach dem Waschen mit 50 Säulenvolumina von 0,02% Natriumazid (PBS/Azid) enthaltendem PBS wurden die gebundenen Proteine mit 50 mM Glycin-HCL (pH-Wert: 2,2) eluiert und die Fraktionen (2 ml) unmittelbar darauf durch Zugabe von 200 pl nicht gepufferter 2 M Tris-Base eingestellt. Die das ScFv-Protein enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt, gegen PBS dialysiert und unter Verwendung von Macrosep (Amicon)-Konzentratoren unter Abschneiden bei 10 kDa konzentriert. Die Ausbeuten wurden mittels eines Bio-Rad-Pro teintests unter Verwendung von Kaninchen-IGG als Referenz und durch die Extinktion bei 280 nm, wobei A&sub2;&sub8;&sub0; = 1 für eine Lösung mit 1,4 ug ml&supmin;¹ angenommen wurde, bestimmt.
  • Die NIP-Bindungsaktivität in Lösung wurde über ELISA- Analyse von Bakterienwachsmedium nach der Induktion nachgewiesen. Durch Ammoniumsulfatfällung wurde eine Konzentration und durch Affinitätschromatographie auf NP-Sepharose (Fig. 6) eine Reinigung erreicht. Daher wurde kein Versuch unternommen, das in Zellpellets vorhandene praslll-Scfv-Protein zu gewinnen. Die Ausbeuten des pRAS111-ScFv aus dem Wachstumsmedium waren bei Induktion bei Raumtemperatur oder 37ºC nicht sehr unterschiedlich. Eine Induktion der Expression war in Minimalsalzmedium effizient und in reicher Brühe hiervon nicht erkennbar; bei den Endausbeuten war jedoch wenig Unterschied festzustellen. Als wichtigster Faktor hierbei erwies sich der Bakterienstamm, wobei die Ausbeute des aus Kulturen von BL21 (DE3)/pRAS111 gewonnenen pRAS111-ScFv-Proteins etwa 1,3 mg 1-1, ein etwa 10fach größerer Wert als die aus Kulturen von JM109(DE3)/pRAS111 erhaltenen Ausbeuten betrugen.
    • Spezifität des pRAS111-Proteins
  • Das hier verwendete Screeningmittel, biotinyliertes Gαmλ-Antiserum, detektiert auch die leichte Kette λ1 von Anti-NP/NIP-Antikörpern. Es ist daher nicht möglich, die Spezifität von praslll-ScFv-Protein für NP oder NIP durch die Konkurrenz mit Anti-NP/NIP-Antikörpern, sondern nur durch seine Fähigkeit zum Erkennen von NP/NIP aufzuzeigen. Ein in Zuchtmedium von JM109(DE3)/pRAS111-Kulturen, jedoch nicht in nichttransformierten Kulturen von JM109(DE3) vorhandenes lösliches Protein bindet N1P&sub1;&sub6;-BSA, jedoch nicht Lysozym, wobei NIP&sub1;&sub6;-BSA konkurrierend wirken kann (Fig. 4). Diese Aktivität kann auf NP-Sepharose-Säulen, von denen sie (dann) eluiert werden kann, zurückgehalten werden. Darüber hinaus zeigen Zielrichtungsuntersuchungen keine Kreuzreaktion mit BSA, PEPY2-BSA, Antikörper oder Säugetierzellen.
    • Affinitätsbestimmungen
  • Die Ergebnisse der Affinitätsbestimmungen unter Verwendung von auf ELISA basierenden Techniken sind in Tabelle 4 angegeben. Die Affinität von pRAS111-ScFv gegenüber NIP wurde zuerst durch Übernahme des Verfahrens von Mariani et al. (1987), Molec. Immunol. 24, 297-303, bei dem die Konzentration des insgesamt zugesetzten Antikörpers, die die Hälfte der maximalen Bindung (Ct&sub5;&sub0;) ergab, bestimmt wurde, bestimmt, wobei Ct50 = 1/Kapp mit Kapp gleich der scheinbaren Affinitätskonstante angenommen wurde. Diese Näherung trifft nur zu, wenn die Zahl der verfügbaren Bindungsstellen pro Vertiefung ausreichend gering ist, so daß deren Beitrag nicht signifikant ist. Die Bestimmungen von Kapp sollten sich Ktatsächlich annähern, wenn die Menge an Antigen pro Vertiefung verringert wird. Die Tabelle 4 zeigt, daß sich ein Punkt erreichen läßt, in dem ähnliche Werte von Kapp abgeleitet werden (K = 2-3 × 10&sup8; M&supmin;¹). Dies ist die beste Näherung, die bei Verwendung dieses Verfahrens gemacht werden kann.
  • Zur Bestimmung der Genauigkeit dieses Verfahrens wurden ähnliche Bestimmungen von K unter Verwendung des Verfahrens von Hogg et al. (1987), Molec. Immunol. 24, 797-801, bei Abwesenheit eines konkurrierenden Antigens durch Berechnung der Steigung des linearen Bereichs einer Auftragung A&sub4;&sub5;&sub0;/[ScFvNP] gegen A&sub4;&sub5;&sub0;, wobei A&sub4;&sub5;&sub0;/[SvFvNP] = fKn - fK(A&sub4;&sub5;&sub0;), A&sub4;&sub5;&sub0; die Extinktion bei 450 nm, [ScFvNP] die Konzentration des zugesetzten ScFvNP, n die Konzentration der verfügbaren Bindungsstellen und f die Valenz von ScFvNP gegenüber NIP ist, durchgeführt. f wurde ein Wert von 1 zugeordnet. TABELLE 4: Affinitätsbestimmungen des pRAS111-ScFvNP-Proteins
    • Herstellung von NP-Sepharose
  • Der Sepharoseträger (20 ml) mit einer Aminfunktion (Affigel 102, Biorad) wurde gewaschen und unter Zusatz von n20 ml 40 mM Triethylamin suspendiert. Das Ganze wurde mit in 1 ml Dimethylformamid (DMF) gelösten 430 mg NP-cap-OSu (Cambridge Research Biochemicals) versetzt. Nach Mischen durch sanftes Drehen (2 h, Raumtemperatur) und intensives Waschen in Wasser und anschließend PBS wurde NP-Sepharose in PBS/Azid ins Gleichgewicht setzen gelassen und im Dunkeln bei 4ºC aufbewahrt.
    • Western Blots zur Identifizierung des pRAS111-Proteins
  • Western Blots wurden gemäß einer früheren Beschreibung (Spooner und Lord (1991), S. 65-77 in Monodonal Antibodies; Applications in Clinical Oncology (A.A. Epenetos, Hrsg.) Chapman und Hall) durchgeführt. Das pRAS111-ScFv-Protein wurde durch aufeinanderfolgende Inkubation in PBS/5% -Milchpulver/0,1% Tween 20 (Blockierlösung), biotinylierten Gαmλ- Antiseren und Streptavidin-HRPO, die in Blockierlösungen auf die von den Lieferanten empfohlenen Konzentrationen verdünnt waren, identifiziert. Nach jeder Inkubation wurden die Blots 5mal in PBS/0,1% Tween 20 gewaschen. Die durch biotinylierte Gαmλ-Antiseren und Streptavidin-HRPO gebundenen Proteine wurden durch Inkubation mit DAB aufgezeigt.
    • Beispiel 2 Konstruktion von ScFv-DNAseI-Fusionsmolekülen ohne ein kernblokalisationssignal
  • Die Plasmide zur Expression der ScFv-DNAseI-Fusionen sind in Fig. 7 angegeben. Das Plasmid praslll ist in Beispiel 1 und M13mp19DNAseRec5 ist in Worrall und Connolly, aaO, beschrieben.
  • Fig. 8 zeigt die zwischen die HindIII- und die BglII- Stelle des Plasmids pSP81 insertierte Sequenz der ScFv- DNaseI-Fusion (4-OH-Nitrophenacetylantikörper), wobei sich das in Fig. 7 angegebene Plasmid pSPNPDN1 ergibt.
  • Fig. 9 zeigt die zwischen die Hindill- und die BglII- Stelle des Plasmids pSP71 insertierte Sequenz der ScFv- DNaseI-Fusion (Anti-Humanplazentaalkaliphosphatase- Antikörper; H17E2), wobei das in Fig. 7 angegebene Plasmid pSPH17ΔXDN1 erhalten wird.
  • Fig. 10 zeigt die zwischen die HindIII- und die BglII- Stelle des Plasmids pUC18 insertierte Sequenz der ScFv-Dnase- Fusion (Anti-Lysozym-Antikörper), wobei das in Fig. 7 angegebene pUCD1.3DN1 erhalten wird.
  • Die Plasmide wurden unter Verwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie gemäß der Beschreibung in Sambrook et al. (1989) in Molecular Cloning, a laboratory manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA, hergestellt.
  • Das Plasmid pSPNPDN1 codiert für ein Protein, das DNaseI zu einem mit NP oder NIP derivatisierten zielzellenspezifischen Molekül leitet.
  • Das Plasmid pSPH17ΔXDN1 codiert für ein Protein, das DNaseI zu das Humanplazentaalkaliphosphatase-Antigen exprimierenden Zellen leitet. Das durch dieses Plasmid codierte ScFv ist aus dem monoklonalen Antikörper H17E2 (s. Tabelle 1) abgeleitet.
  • Die ScFv-DNase-I-Fusion wurde unter zu den RNase-Fusionen identischen Bedingungen exprimiert und rückgefaltet. Die rohe rückgefaltete Präparation des ScFv-Dnasei-Fusionsproteins zeigt in einem ELISA-System ähnlich dem Stammantikörper H17E2- PLAP-Antigenbindungsaktivität. Die Nachweisschichten sind Anti-Rinder-DNaseI (von Kaninchen) und Anti-Kaninchen (von Ziegen). Das Dnase-I-Fusionsprotein zeigt ferner in einem ähnlichen System wie beim Rnase-Test, wobei jedoch 2 ug DNA inkubiert werden, eine DNA-abbauende Aktivität. Die Aktivität ist nur bei Zugabe von 10 mM CaCl&sub2; und 4 mM MgCl&sub2; vorhanden. Diese findet man auch bei natürlich vorkommender Rinder-Dnasei, wodurch nahegelegt wird, daß funktionelle ScFv- DNase-Fusionsmoleküle von E. coli exprimiert und rückgefaltet wurden.

Claims (13)

1. Verbindung mit einem für eine Targetzelle spezifischen Bereich und einem cytotoxischen Bereich, dadurch gekennzeichnet, daß der cytotoxische Bereich eine DNA-endonucleolytische Aktivität aufweist.
2. Verbindung nach Anspruch 2, wobei der cytotoxische Bereich zumindest aus dem katalytisch aktiven Bereich einer DNA-Endonuclease besteht.
3. Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Endonudease aus einer Säugetier-Desoxyribonuclease I besteht.
4. Verbindung nach Anspruch 3, wobei ein Kernlokalisierungssignal eingebaut ist.
5. Verbindung nach Anspruch 4, wobei das Kernlokalisierungssignal die Sequenz PKKKRKV umfaßt.
6. Verbindung nach Anspruch 2, wobei es sich bei der DNA- Endonuclease um eine Restriktionsendonuclease handelt.
7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der für die Targetzelle spezifische Bereich ein ScFv umfaßt.
8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der für die Targetzelle spezifische Bereich und der cytotoxische Bereich miteinander zu einem Polypeptid verschmolzen sind.
9. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der für die Targetzelle spezifische Berech eine selektive Bindung an eine Tumorzelle eingeht.
10. Nucleinsäure mit Codierung für eine Verbindung nach einem der Ansprüche 8 oder 9.
11. Arzneimittelzubereitung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und einen pharmazeutischen Träger.
12. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung in der Medizin.
13. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetiers mit den zu zerstörenden Targetzellen.
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