[go: up one dir, main page]

DE69406423T2 - Methode zum überbringen von agenzien an zielzellen - Google Patents

Methode zum überbringen von agenzien an zielzellen

Info

Publication number
DE69406423T2
DE69406423T2 DE69406423T DE69406423T DE69406423T2 DE 69406423 T2 DE69406423 T2 DE 69406423T2 DE 69406423 T DE69406423 T DE 69406423T DE 69406423 T DE69406423 T DE 69406423T DE 69406423 T2 DE69406423 T2 DE 69406423T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
agent
binding protein
reactive
chemical moiety
target cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69406423T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69406423D1 (de
Inventor
Andrew J T Glendale Hou George
James S Huston
David M Segal
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Creative Biomolecules Inc
US Department of Health and Human Services
Original Assignee
Creative Biomolecules Inc
US Department of Health and Human Services
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Creative Biomolecules Inc, US Department of Health and Human Services filed Critical Creative Biomolecules Inc
Application granted granted Critical
Publication of DE69406423D1 publication Critical patent/DE69406423D1/de
Publication of DE69406423T2 publication Critical patent/DE69406423T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Cytotoxische Zellen exprimieren auf ihren Oberflächen spezifische Rezeptoren, durch die sie veränderte oder fremde Zellen von normalen autologen Zellen unterscheiden. Diese Rezeptoren bilden multiple Verbindungen zu Strukturen auf Zielzelloberflächen, was zu stabilen Konjugaten zwischen cytotoxischen und Zielzellen führt. Jede cytotoxische Zelle überbringt dann einen "tödlichen Treffer" an seine konjugierte Zielzelle und löst sich von ihr ab&sub1; und hinterläßt eine sterbende Zielzelle und eine cytotoxische Zelle, die frei ist, um ein anderes Ziel zu orten und zu zerstören. (Segal, D.M: et al., Cancer Invest. 6(1): 83-92 (1988); Segal, D.M. et al., Mol. Immunol. 25: 1099-1103 (1988)).
  • Vor kurzem ist eine Methode entwickelt worden, mit dessen Hilfe das natürliche Erkennungssystem der cytotoxischen Zellen künstlich manipuliert werden kann, wodurch cytotoxische Zellen beliebig gewünschter Spezifitat, einschließlich der Spezifität gegen Tumorzellen, hervorgehen (Segal, D.M., et al., U.S. Patent No. 4,676,980, Karpovsky, B., et al., J. Exp. Med., 160: 1686-1701 (1984); Perez, P., et al., Nature, 316: 354-356 (1985)). Diese Methode des Neuausrichtens cytotoxischer Zellen verwendet vernetzte heterobispezifische Antikörper, - wobei ein Antikörper gegen den Rezeptor auf der cytotoxischen Zelle, die in die Lyse involviert ist, gerichtet ist, während der zweite Antikörper gegen eine Zielzellenstruktur, zum Beispiel ein Tumorantigen, gerichtet ist. Durch direktes Verknüpfen des relevanten Rezeptors auf der cytotoxischen Zelle an die Zielzelle, fördern die vernetzten heterobispezifischen Antikörper die Bildung eines Effektors: das Ziel konjugiert und signalisiert der cytotoxischen Zelle, einen "tödlichen Treffer" zu überbringen. Antikörper- Heteroaggregate können durch chemische Vernetzung oder durch Fusion zweier Hybridomazellen hergestellt werden. (Segal, D.M., et al., in: Biological Therapy of Cancer Updates Vol 2, V.T. DeVita, S. Hellman, und S.A. Rosenberg, eds. J.B. Lippincott Co., Philadelphia pp. 1- 12 (1992)).
  • In den letzten Jahren wurde ein großer Teil des Interesses auf das Neuausrichten cytotoxischer Zellen ungewollte neoplastische oder viral infizierte Zellen zu töten, gelenkt. Ein gewöhnlicher Weg dies zu tun, ist die Verwendung eines bispezifischen Antikörpers mit dualer Spezifität für ein Antigen auf der Zielzelle und einem Auslöser-Molekül auf der Effektorzelle (wie zum Beispiel CD3 auf T-Zellen). Solche bispezifischen Antikörper werden in einer Reihe von klinischen Anwendungen zum Zielen von T-Zellen gegen Tumore verwendet. (Segal, D.M. und Wunderlich, J.R., Cancer Investigation 6: 83-92 (1988)).
  • Das Konzept der neu ausgerichteten Effektorzellen zur Behandlung von pathologischen Zuständen, wie zum Beispiel Krebs, bietet einige Vorteile gegenüber herkmmlicher, nicht-gezielten Immuntherapie. Trotzallem ist die immune Selektion von gezielten Zellen gegenüber normalen Zellen immer noch problematisch.
  • Erhöhte Selektivität kann durch Kombinieren von Therapieformen erreicht werden, wie zum Beispiel Bestrahlung und/oder Chemotherapie in Verbindung mit Immuntherapie. Trotzallem werden diese zusätzlichen Therapien oftmals von ernsten Nebenwirkungen begleidet. Um diese gezielten Krebszellen zu erreichen, müssen außerdem diese großen vernetzten Antikörper ausreichend in solides Tumorgewebe penetrieren, um an die gezielte Tumorzelle zu binden.
  • Zustzlich sind Immunantworten des Wirts gegen Xenoantikörper (d.h. Antikörper, die in anderen Arten als der der Behandlung unterworfenen Wirts, hergestellt wurden) in klinischen Anwendungen beobachtet worden. Diese Antworten könnten die Antitumor-Spezifität der neu ausgerichteten Effektorzellen zerstören. Weiterhin ist die Beseitigung ungebundener vernetzter Antikörpern dieser Größe, als auch die Beseitigung der Antikörper nach der Bindung, ein Problem.
  • Letztendlich können neu ausgerichtete Effektorzellen ihre künstlich erworbenen Tumorrezeptoren (die heterobispezifischen Antikörper) durch Interaktion mit Tumorzellen, durch Effektorzellteilung, durch Endocytose, durch proteolytische extrazelluläre Enzyme oder durch natürliches Shedding verlieren. Antitumoraktivität im Wirt kann durch wiederholte Behandlungen mit Effektorzellen und zielenden Antikörpern beibehalten werden. Trotzallem ist es teuer und zeitaufwendig große Mengen an heterobispezifischen Antikörpern mit der nötigen Spezifität herzustellen, die mit dem beabsichtigten Ziel, wie zum Beispiel Zelloberflächen-Tumorantigene interagieren. Somit wäre es vorteilhaft in der Lage zu sein, große Mengen der bispezifischen Antikörper mit klinischer Qualität herstellen zu können, zum Gebrauch mit vielen verschiedenen Tumorantigenen oder Zelloberflächenmarkern für eine wiederholte Behandlung.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf den Inhalt der Ansprüche. Beschrieben hierin sind Methoden zum überbringen von Agenzien an Zielzellen. Die Zielzellen sind durch ein oder mehrere monospezifisch bindende Proteine modifiziert, die mit einem oder mehreren natürlich vorkommenden Zielzelloberflächenmarker reaktiv sind. Das monospezifisch bindende Protein, das mit dem Zelloberflächenmarker reaktiv ist, ist gekoppelt an, fusioniert mit, oder markiert mit einer chemischen Komponente, die von einem multivalenten Antikörper erkannt wird und an eine Stelle am multivalenten Antikörper bindet, der ebenso an das zu überbringende Agens bindet. Das Agens ist an den multivalenten Antikörper gebunden, der wiederum ist an ein gekoppeltes monospezifisch bindendes Protein gebunden, welches an einen Zelloberflächenmarker auf einer Zielzelle gebunden ist. Somit wird das Agens an die Zielzellen überbracht oder gelenkt.
  • Die hierin verwendete chemische Komponente beinhaltet ein genetisch fusioniertes oder anders gekoppeltes Peptid, ein oder mehrere Peptide innerhalb der Sequenz eines mono- oder bispezifisch bindenden Proteins, ein posttranskriptional oder chemisch modifiziertes Peptid, einen chemischen Substituent wie zum Beispiel Biotin, eingebaut in das Protein, oder jegliche nicht-natürliche Aminosäure eingebaut in das bindende Protein. Die chemische Komponente beinhaltet ebenfalls beliebiges Protein oder Teile davon, oder Peptide, die eine Aminosäure-Sequenz umfassen, die reaktiv mit einer Erkennungsstelle ist, einschließlich eines Linkers, der die variablen Regionen eines einzelkettigen Fv (sFv) oder sFv Fusionsproteins verbindet, oder ein Epitop des monospezifisch bindenden Proteins.
  • Die hierin verwendete Selektivität bezieht sich auf die Erkennung von gezielten Zellen, entgegengesetzt zu nicht gezielten, oder normalen Zellen. Die hierin verwendete Spezifität bezieht sich auf die Erkennung einzigartiger Zelloberflächenkomponenten, wie zum Beispiel Antigene oder Rezeptoren durch ein bindendes Molekül. Die Erkennungsstelle bezieht sich auf den Teil eines bindenden Moleküls, das reaktiv ist mit, assoziiert ist mit, oder bindet an eine chemische Komponente. Die erkannte Stelle kann eine bindende Stelle auf einem Protein, ein kontinuierliches oder diskontinuierliches Epitop auf einem Protein, oder ein Peptide oder ein chemisch oder biochemisch hinzugefügter chemischer Substituent sein.
  • Der Wirt kann ein Säuger-Wirt, einschließlich des Menschens, domestizierte Tiere (z.B. Hunde, Katzen, Pferde), Mäuse oder Ratten sein. Der Begriff monospezifisch bindendes Protein beabsichtigt bindende Proteinfragmente wie zum Beispiel Fab und F(ab) 2 Fragmente, Fab Fusionsproteine (Better, M. und Horwitz, A.H., Meth. Enzymol. 178: 476-496 (1989), einzelkettige Fv (sFv) Proteine (hierin ebenfalls als einzelkettige Antikörper bezeichnet), einzelkettige Fv Fusionsproteine, chimäre Antikörperproteine (z.B. aus Transfektoma-Zellen stammende rekombinante Antikörperproteine (Shin, S.-U. und Morrison, S.L., Meth. Enzymol. 178: 459-476 (1989); Love, T.W., et al., Meth. Enzymol. 178: 515-527 (1989)), chimäre einzelkettige Proteine und andere einzelkettige Fusions-Fv-analoge Proteine, wie zum Beispiel einzelkettige T-Zell-Rezeptoren einzuschließen. Das bevorzugte monospezifisch bindende Protein ist ein einzelkettiger Antikörper. Der Begriff monospezifisch bindendes Protein beabsichtigt ebenfalls Gemische von mehr als einem monospezifisch bindenden Protein, das mit natürlich vorkommenden Zelloberflächenkomponenten reaktiv ist, zu umfassen (z.B. ein Cocktail aus verschiedenen Typen monospezifisch bindender Proteine, die mit einer Reihe verschiedener Zelloberflächenepitope reaktiv sind).
  • Der Begriff multivalenter Antiköper beabsichtigt beliebige multivalente Antikörper einschließlich polyklonaler oder monoklonaler Antikörper (z.B. IgG oder IgM), vernetzte heterobispezifische ganze Antikörper (polyklonal oder monoklonal), vernetzte biologisch funktionelle Fragmente davon (z.B. Fab Fragmente), Proteine von mehr als einer Spezies umfassende chimäre Antikörper, bispezifische einzelkettige Antikörper, chimäre einzelkettige Antikörperanaloge und homodimere IgG-Moleküle zu umfassen. Diese multivalenten Antikörper- Proteine können mit Hilfe der bekannten Labormethoden hergestellt werden.
  • In einer bevorzugten Anwendung ist das monospezifisch bindende Protein, das an den Zielzellober flächenmarker bindet, ein einzelkettiger Antikörper (sFv); die chemische Komponente ist ein Peptid-Tag (z.B. eine Aminosäure-Sequenz); und der multivalente Antikörper ist ein heterobispezifischer Antikörper, der an das Peptid-Tag des sFv bindet und ebenso an das Agens bindet, das an die Zielzelle zum Beispiel eine Effektorzelle überbracht werden soll.
  • In einer anderen Anwendung, werden im Verfahren zur Überbringung oder Lenkung von Agenzien an eine Zielzelle ein Gemisch oder Cocktail monospezifisch bindender Proteine verwendet. Dieser Cocktail enthält eine Reihe verschiedener Typen monospezifisch bindender Proteine, wobei jeder Typ eines bindenden Proteins spezifisch für einen anderen Zelloberflächenmarker, Epitop oder Antigen auf der Zielzelle ist. Somit, da jede Klasse von Zielzelle ihr eigenes, einzigartiges Zelloberflächenkomponenten-Profil hat, kann die Zielzelle mit höherer Spezifität als mit an eine einzelne Oberflächkomponente allein monospezifisch bindenden Proteinen modifiziert werden.
  • Die vorliegende Erfindung findet ihre Verwendung in einer Methode der Immuntherapie in einem Wirt, wobei Zielzellen mit einer verstärkten Selektivität unter Verwendung von Zielzell-gerichteten cytotoxischen Agenzien zerstört werden. Die Methode der Immuntherapie schließt zwei Konzepte ein: die spezifische Modifikation der Zielzelle mit chemisch Komponenten-markierten monospezifisch bindenden Proteinen und das Zielen cytotoxischer Agenzien an die modifizierten Zielzellen.
  • Die hierin beschriebene Methode der Immuntherapie umfaßt die Verabreichung eines monospezifisch bindenden Proteins an einen Wirt, wobei dies an einen oder mehrere natürlich vorkommende Zelloberflächmarker bindet und somit die Zielzelle "modifiziert". Das monospezifisch bindende Protein ist gekoppelt mit einer chemischen Komponente, wie zum Beispiel einem Peptid. Anschließend nach der Modifikation der Zielzelle wird dem Wirt ein multivalenter Antikörper, der an die mit der chemisch Komponente gekoppelten Zielzelle bindet und auch ein cytotoxisches Agens bindet, verabreicht. Alternativ können cytotoxische Agenzien wie zum Beispiel cytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) in vitro mit multivalenten Antikörpern gekoppelt werden, und die neu ausgerichteten (d.h. gerichtet auf die Zielzelle zum Überbringen) CTL's können nach dem ersten Schritt der Zielzellmodifikation verabreicht werden. Da das gekoppelte monospezifisch bindende Protein kleiner ist als ein ganzer, intakter, heterobispezifischer Antikörper, wird das ungebundene Tag aus dem Kreislauf viel schneller beseitigt, als der größere bispezifische Antikörper. Dies verringert sehr den Hintergrund, nichtspezifisches Binden und Serumgehalte des gekoppelten monospezifisch bindenden Proteins. Somit zerstört das cytotoxische Agens die Zielzelle mit verstärkter Selektivität, basierend auf der einzigartigen Modifikation der Zielzelle durch das gekoppelte monospezifisch bindende Protein.
  • In einer anderen Anwendung wird die Bindungsaffinität zwischen Peptid-gekoppelten (oder Komponentenmarkierten) monospezifisch bindenden Protein und dem multivalenten Antikörper erhöht oder erniedrigt (d.h. verringert auf niedriger als die normale Bindungs affinität). Effektives Zielen mit dieser verringerten Bindungsaffinität nutzt den multi-seitigen Kontakt zwischen CTL-gebundenen multivalenten Antikörpern und der modifizierten Zielzelle aus, und resultiert somit in spezifischeren Interaktionen zwischen dem zu überbringenden Agens und der Zielzelle. Zum Beispiel, schließt die verringerte Bindungsaffinität zwischen modifizierter Zielzelle und multivalentem Antikörper schwaches einseitiges Zielen aus und begünstigt stark das Binden des cytotoxischen Agens an die Zielzelle mit der verstärkten Selektivität einer multi-seitigen Interaktion. Die verringerte Bindungsaffinität kann durch Mutation der Aminosäure-sequenz des Peptid-Tags (oder Struktur der chemischen Komponente) oder der Sequenz des multivalenten Antikörpers erreicht werden, so daß die Affinität des multivalenten Antikörpers für das Peptid-Tag verringert wird.
  • Die Nützlichkeit bindender Proteine, die zwei unabhängige Bindungsstellen mit unterschiedlicher Selektivität für die Behandlung oder Kontrolle von Tumoren, viral infizierten Zellen, Bakterien und anderen pathogenen Zuständen, ist erkannt worden. (Segal, D.M. und Snider, D.P., Chem. Immunol. 47: 179-213 (1989); Segal, D.M. et al., in: Biological Therapy of Cancer Updates Vol. 2, V.T. Devita, S. Hellman, und S.A. Rosenberg, eds. J.B. Lippincott Co., Philadelphia pp. 1- 12 (1992)).
  • Trotzallem sind herkömmliche bispezifische Antikörper (z.B. vernetzte Antikörper) zu groß, um einfach in solide Tumore zu penetrieren. Somit hat ein Immuntherapie-Versuch, der ein monospezifisch bindendes Protein mit einem multivalenten Antikörper verwendet, eine Reihe von Vorteilen.
  • Zusätzlicher Nutzen stammt von der Inkorporation standardisierter Epitope auf Antigen-bindenden Regionen, die gegen spezifische Oberflächenkomponenten auf Zielzellen gezielt sind. Diese getrennt zielenden Regionen sind vorteilhaft, da sie typischer Weise von geringere Größe als der heterobispezifische Antikörper sind, und deren Bindung dazu dienen wird, die Antigen-bindenden Regionen in situ zu lokalisieren oder "fixieren", um die Lokalisation des Ziels zu verstärken.
  • Das monospezifisch bindende Protein hat eine einzigartige Fähigkeit in solide Tumore zu penetrieren und schnell aus dem Blutkreislauf beseitigt zu werden, falls es nicht an einer Zielstelle lokalisiert ist. Somit sind diese Proteine extrem geeignet für Tumorimmuntherapie. Das monospezifisch bindende Protein zeigt ebenfalls geringfügiges nicht-selektives Binden und ungewollte Ablagerung in Organen, wie zum Beispiel der Niere (Yakota, T., et al., Cancer Res. 52: 3402-3408 (1992). Aufgrund seiner geringen Größe von gewöhnlich weniger als 52.000 mol. wt. und vorzugsweise weniger als 30.000 mol. wt., ist das monospezifisch bindende Protein weniger immunogen, und es ist somit weniger wahrscheinlich, das eine Immunreaktion des Wirts während dem Verfauf der Therapie ausgelöst wird. Auch ist das monospezifisch bindende Protein aufgrund seiner geringen Größe weniger empfänglich für Proteolyse. Somit ist das monospezifisch bindende Protein vernunftgemäß ein stabileres Reagenz.
  • Desweiteren kann jegliches monospezifisch bindendes Protein mit einer distinktiven chemischen Komponente hergestellt werden, die von dem multivalenten Antikörper erkannt wird. Somit kann ein allgemeiner multivalenter Antikörper hergestellt werden, der ein distinktives Peptid-Tag an einer Bindungsstelle bindet und ein zu überbringendes Agens an der zweiten Bindungsstelle bindet, für den universellen Gebrauch in einer beliebigen Anzahl immuntherapeutischer Situationen. Zusätzlich können die hierin beschriebenen immuntherapeutischen Methoden auf beliebiges zielen, das durch nicht-Peptide multivalente Bindungsstellen erkannt wird. Somit kann man einen cytotoxischen Lymphozyten, ein Radioisotop, ein bilderzeugendes Agens oder einen tödlichen Stoff zielen, um die Zielzelle zu zerstören. Das selbe Peptidegekoppelte monospezifisch bindende Protein kann für unterschiedliche Systeme oder Therapien getestet oder verwendet werden, ohne die Struktur des monospezifisch bindenden Proteins oder das Herstellungsprotokoll neu zu bearbeiten. Außerdem, da das Peptid-gekoppelte monospezifisch bindende Protein nicht von selbst toxisch ist, sollte das therapeutische Fenster fur eine Kombination, zwei-stufige Immuntherapie wesentlich größer sein, als es möglich wäre bei einer einzelnen Verabreichung eines toxischen Immunkonjugates. (Bosslet, P., et al., Cancer Treat. Rev. 17: 355-356 (1990); Bosslet, P., et al., Br. J. Cancer, 63: 681-686 (1991).
  • Weiterhin ist es ein einzigartiger Vorteil dieser Methode der Immuntherapie, daß es multi-seitiges Zielen aufgrund von Komponenten-gekoppelten monospezifisch bindenden Protein-Cocktails erlaubt. Zum Beispiel kann ein Cocktail ein Gemisch aus sFv Proteinen umfassen, wobei jedes sFv eine standardisierte chemische Komponente gemein mit dem Gemisch an sFv Proteinen besitzt, außerdem können verschiedene sFv Proteine an unterschiedliche Antigene auf dem Tumor oder anderen Zielzellen binden. Multi-seitige Interaktionen würden notwendig sein, falls Antikörper mit geringer Bindungskonstante zur Assoziation mit der chemischen Komponente gewählt werden. Alternativ kann eine geringere als normale Bindungskonstante durch die Verwendung einer verkürzten, oder sonstig, mutierten Peptid-Tag-Sequenz, erlangt werden. Unter einer Schwelle der Affinität, z.B. Ks,intrinsic = 10³M&supmin;¹, wäre das zellgerichtete cytotoxische Agens unfähig wirkungsvoll durch einen oder sogar zwei Kontakte zu binden, aber mit höherer Anzahl an Interaktionen kann multi-seitiges Binden sehr eng sein. Somit wird ein sehr stabiles Ziel:Effektor-Konjugat gebildet.
  • Weiterhin wird die Selektivität des Zellgerichteten cytotoxischen Agens durch multi-seitiges Zielen verstärkt. Ein Hauptproblem der Krebs-Immuntherapie ist der Verlust von Varianten, oder der Verlust von Oberflächenepitopen auf den Krebszellen, aufgrund von Mutationen. George, A.J.T., et al., International Rev. Immunol. 4: 271-310 (1989). Das Problem wird durch den hierin beschriebenen Gebrauch der multi-seitig zielenden Immuntherapie minimiert. Zum Beispiel, wenn eine Tumorzelle vier einzigartige Epitope als Ziele besitzt, aber es wird nur auf ein Epitop gezielt, und dieses eine Epitop geht durch Mutation verloren, ist die erfolgreiche Behandlung unter Verwendung einer ein-Ziel Immuntherapie, die auf das verlorene Epitop zielt, ausgeschlossen. Trotzallem, mit multi-seitigem Zielen, bei dem auf alle vier Epitope gezielt würde, kann die Behandlung, auch wenn ein Epitop verloren geht, immer noch erfolgreich sein, da die drei verbleibenden Epitope zum Zielen des therapeutischen Agens zur Verfügung stehen.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Abbildung 1 ist eine schematische Darstellung einer Methode der Immuntherapie unter Verwendung monospezifisch bindender Proteine und multivalenten Antikörpern.
  • Abbildung 2 ist eine schematische Darstellung der Methode zur Herstellung von U7.6 sFv. Schritt (1) zeigt das Verknüpfen von VH und VL PCR Produkten, um das U7.6 sFv-Gen zu erhalten, und Schritt (2) zeigt die Kombination des U7.6 sFv Gens und pHEN1 Expressionsvektors, um das pHEN-U7.6 Plasmid zu erhalten.
  • Abbildung 3A ist die DNS-Sequenz (SEQ ID NO:1) der VH-Region von U7.6 sFv mit dessen vorhergesagter Aminosäure-Sequenz (SEQ ID NO:2).
  • Abbildung 3B ist die DNS-Sequenz (SEQ ID NO:3) der VL-Region von U7.6 sFv mit dessen vorhergesagter Aminosäure-Sequenz (SEQ ID NO:4).
  • Abbildung 4 stellt die Ergebnisse der SDS- Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western Blots des U7.6 sFv während Herstellung und Reinigung dar.
  • Abbildung 5 ist eine graphische Darstellung der Größenanalyse von renaturiertem U7.6 sFv (oberes Profil) und Dot-Blot Daten, die die spezifische Absorption an DNP-Lysin-Sepharose zeigen (untere Reihen).
  • Abbildung 6 beschreibt die Ergebnisse der Bindung von U7.6 sFv an TNP-modifizierte Zellen gemessen durch Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren (FACS).
  • Abbildung 7 zeigt die Ergebnisse der relativen Bindung von U7.6 sFv und Fab an TNP-gekoppelte B6MC1- Zellen.
  • Abbildung 8 zeigt die Ergebnisse der Inhibition von U7.6 Fab und U7.6 sFv Bindung an TNP-modifizierte Zellen durch freies DNP-Hapten.
  • Abbildung 9 zeigt die Ergebnisse der Inhibition von U7.6 Fab Bindung an TNP-modifizierte Zellen durch U7.6 sFv ( =U7.6 bei 125nm, =U7.6 bei 41,7nm, =U7.6 bei 13,9nm).
  • Abbildung 10 zeigt die Ergebnisse der Bindung von OKT9 sFv an K562-Zellen.
  • Abbildung 11 zeigt die Ergebnisse des Zielens von Lyse unter Verwendung von U7.6 sFv.
  • Abbildung 12 zeigt die Ergebnisse der Lyse von TNP- TFR-transfizierten L-Zellen durch aktivierte humane T- Zellen.
  • Abbildung 13 ist eine schematische Darstellung der multi-seitigen Bindung cytotoxischer T-Lymphocyten an Zielzellen, die mehrfach mit einzelkettigen Fv- Fusionsproteinen modifiziert sind.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Hierin beschrieben sind Methoden zum Überbringen oder Steuern von Agenzien an Zielzellen. Die Zielzelle ist durch ein oder mehrere monospezifisch bindende Proteine modifiziert, die mit einem oder mehreren natürlich vorkommenden Oberflächenmarker der Zielzelle reaktiv sind. Das monospezifisch bindende Protein, das mit dem Zelloberflächenmarker reaktiv ist, ist verknüpft, fusioniert mit, oder markiert mit einer chemischen Komponente, die erkannt wird von und bindet an eine Stelle auf einem multivalenten Antikörper, der ebenfalls an ein Agens bindet, das überbracht werden soll. Somit wird das Agens an die Zielzelle überbracht oder gesteuert.
  • Genauer, an einen Zelloberflächenmarker gebundenes monospezifisch bindendes Protein wird verknüpft oder markiert mit einer chemischen Komponente, die als Kontakt oder Signal zur Assoziation mit einer Erkennungsstelle auf einem multivalenten Antikörper dient. Dieser multivalente Antikörper bindet an einer anderen Bindungsstelle auch ein Agenz, das an die Zielzelle überbracht oder gesteuert werden soll. Somit wird das Agens an die Zielzelle überbracht durch die Assoziation der Erkennungsstelle auf dem multivalenten Antikörper und der chemischen Komponente der modifizierten Zielzelle.
  • Die Zielzellen der vorliegenden Erfindung schließt jegliche Zelle in einem Säugerwirt ein, die unerwünscht ist und eliminiert, kontrolliert, angegriffen und/oder funktionell zersttrt oder sonstiges werden muß. Insbesondere können Zielzellen Tumorzellen, bakteriellinfizierte Zellen, Virus-infizierte Zellen oder autoimmune Zellen sein.
  • Die Zielzellen haben natürlich-vorkommende Zelloberflächen-Komponenten, oder Marker. Diese Oberflächenmarker beinhalten spezifische Rezeptoren, wie zum Beispiel den Melanocyten-stimulierende-Hormon (MSH)- Rezeptor, der auf Melanomzellen exprimiert wird, oder selektive Antigene, wie zum Beispiel das humane Krebs- Antigen CA 125, das auf Carcinomazellen des Ovars exprimiert wird. Zelloberflächenmarker schließen auch die Haupthistokompatibilitätskomplex-Moleküle (MHC I oder MHC II) ein, und Virus-infizierte Zellen exprimieren oftmals virale Antigene auf ihren Oberfächen.
  • Zusammengefaßt stellen die Oberfächenkomponenten einer Zelle ein Oberflächenmarker-Profil dar, das einzigartig für diesen speziellen Zelltyp ist.
  • Die Oberflächenmarker der Zelle können verwendet werden, um Agenzien zu steuern, wie zum Beispiel bilderzeugende Agenzien, andere Antikörper und cytotoxische Agenzien, wie zum Beispiel Stoffe oder cytotoxische Effektorzellen, die an die Zelle überbracht werden sollen. Cytotoxische Agenzien können cytotoxische Stoffe und Radionukleotide umfassen, die wirksam in der chemischen- oder Bestrahlungstherapie sind. Zum Beispiel kann ein Stoff dazu vorgesehen sein, an einen Zelloberflächenrezeptor zu binden, und Ligandenbindung zu blockieren, oder ein Antikörper kann spezifisch an eine Zielzelle über einen Zelloberflächenmarker gebunden sein, und somit die Zielzelle für Zell-vermittelte Antikörperabhängige zelluläre Cytotoxizität markieren. Trotzallem, Stoffe und Antikörper, die gegen natürlich vorkommende Zelloberflächenmarker gerichtet sind, können nicht vollständig selektiv für die Zielzelle sein, was in der Zerstörung von sowohl normalen als auch malignen Zellen resultiert.
  • Wie hierin beschrieben, wird eine Zielzelle modifiziert, um die selektive Bindung eines Zielzellgerichteten cytotoxischen Agens an die Zielzelle zu verstärken. Eine Zielzelle wird modifiziert durch ein oder mehrere monospezifisch bindende Proteine, die mit einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Zelloberflächenmarker reaktiv (gebunden) sind. Das monospezifisch bindende Protein kann ein bindendes Proteinfragment wie zum Beispiel ein Fab, Fab oder ein F(ab) '2 Antikörperfragment sein, das mit Hilfe der herkömmlichen Labormethoden hergestellt wird. Monospezifisch bindende Proteine können ebenfalls einzelkettige Fv Fusionsproteine (sFv), einzelkettige Antikörper, chimäre einzelkettige Proteinanalogons und andere einzelkettige Fusionsproteine, wie zum Beispiel einzelkettige T- Zellrezeptoren sein. In einer bevorzugten Anwendung ist das monospezifisch bindende Protein, das mit dem Oberflächenmarker der Zielzelle reaktiv ist, ein einzelkettiger Antikörper. Die Abbildung 1 ist eine schematische Darstellung einer Zielzelle, die durch Peptid-verknüpfte einzelkettige Antikörper modifiziert ist. An das Peptid-Tag ist ein heterobispezifischer Antikörper gebunden, der auch einen cytotoxischen T- Lymphozyten bindet.
  • Ein sFv ist ein genetisch konstruiertes einzelkettiges Konstrukt mit dem Fv-Teil eines Antikörpermoleküls oder anderer Rezeptormoleküle der Ig, Superfamilie. Herstellung einzelkettiger Antikörpermoleküle wird beschrieben in Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988) und Huston, J.S. et al., Meth. Enzymol. 203: 46-88 (1991), und Huston, et al., U.S. Patent No.5,091,513. Das sFv enthält zwei variable Region-Domänen, die durch einen flexiblen Peptid-Spacer miteinander verknüpft sind. Diese sFv- Moleküle enthalten alle Information, die zur Bestimmung der Antigenspezifität benötigt wird, mit keiner der konstanten Regionen, die die Effektorfunktionen definiert, wie zum Beispiel Interaktionen mit dem Fcg- Rezeptor, der die cytotoxischen Effektorzellen bindet.
  • Die geringe Größe dieser Moleküle (25-30 kD) verbessert viele ihrer pharmokinetischen Eigenschaften, durch Steigerung der Penetration in solide Gewebe, Verringerung der Halbwertszeit im Blutkreislauf und Reduktion der Immunogenität. (Yakota, T., et al., Cancer Res. 52:3402- 3408 (1991); Milenic, D.E., et al., Cancer Res. 51: 6363- 6371 (1991)). Der einzelkettige Antikörper, der an den Zelloberflächenmarker gebunden ist, ist gekoppelt, oder markiert mit einer chemischen Komponente, die als Kontakt, oder Signal zur Assoziation mit einer Erkennungsstelle auf einem multivalenten Antikörper dient, und somit den multivalenten Antikörper zum Binden an die Zielzelle steuert. In einer bevorzugten Anwendung ist die chemische Komponente ein Peptid-Tag, das eine kurze Aminosäure-Sequenz umfaßt, wie zum Beispiel die 11 Aminosäure-Reste umfassende myc-Tag Peptid-Sequenz EQKLISEEDLN (SEQ ID NO: 5) auf einem einzelkettigen Fv- Protein.
  • Einzelkettige Fv-Proteine sind mit Hifle von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen und in zellfreien Lysaten hergestellt worden. Prokaryotische Expressionssysteme bieten viele Vorteile hinsichtlich der Einfachkeit der Manipulation, der hohen Erträge und der geringeren Kosten. Trotzallem die Mehrzahl der bakteriellen Expressionssysteme stellt die rekombinanten Proteine in unlöslichen, Einschlußkörperchen her, die komplizierte Wiederfaltungsprotokolle notwendig machen, um aktives Protein zu erhalten. Ein alternativer Versuch ist es, das Protein in den periplasmatischen Raum von Gram-negativen Bakterien zu lenken, wo eine Reihe von bakteriellen Proteinen bei der Faltung und Oxidation des neu synthetisierten Proteins helfen können. Solche periplasmatischen Expressionssysteme sind zur Herstellung von sFv-Proteinen verwendet worden (Glockshuber, et al., Biochemistry 29: 1362-1367 (1990)).
  • In manchen Fällen werden die sFv-Proteine aus dem periplasmatischen Material isoliert, während in anderen Fällen lösliches Material im Wachstumsmedium gefunden werden kann, was vermutlich durch die Befreiung des sFv aus dem Periplasma als Folge des Zerfalls der bakteriellen äußeren Zellwand, verursacht wird.
  • Beispiele 1 und 2 unten beschreiben im Detail die Herstellung von zwei Peptid-gekoppelten sFv-Proteinen im bakteriellen Periplasma, eins gegen das Hapten Dinitrophenol (DNP) und das andere gegen den Transferrinrezeptor gerichtet. Unter Verwendung des anti-DNP sFv als Modelsystem können zusätzliche einzelkettige Fusions proteine mit Spezifität für andere Zelloberflächen- Komponenten hergestellt werden. Also, wie in Beispiel 1 beschrieben, können diese sFv-Proteine in einer aktiven Form gereinigt werden, ohne den Bedarf an großen Antigenmengen zur Affinitätsreinigung. Beispiele 3 und 4 unten zeigen, daß das sFv spezifisch an Zielzellen bindet und nützlich ist, wenn es an einen anti-CD3 Antikörper gekoppelt ist, um cytotoxische T-Zellen auf das Töten von Zielzellen neu auszurichten.
  • Ein Peptid-gekoppeltes sFv, U7.6 sFv, spezifisch für das Hapten DNP, wurde, wie in Detail in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Eine schematische Darstellung der PCR und Klonierungsschritte wird in Abbildung 2 gezeigt. Kurz zusammengefaßt, wurden die V-Regionen des anti-DNP Antikörpers U7.6 durch PCR amplifiziert und ursprünglich als sFv kloniert. Sequenzanalyse der V- Regionen zeigte, daß die VL und VH Domänen entsprechend zu den VKVI und VHII Regionfamilien gehörten. Abbildung 3A beschreibt die DNS-Sequenz der VH-Domäne (SEQ ID NO: 1), mit dessen abgeleiteter Aminosäure-Sequenz (SEQ ID NO: 2) und Abbildung 38 beschreibt die DNS-Sequenz der VL-Domäne (SEQ ID NO: 3) und dessen abgeleiteter Aminosäure-Sequenz (SEQ ID NO: 4). Die Primer, die ursprünglich verwendet wurden, um die V-Regionen aus der cDNS zu amplifizieren, wurden so konstruiert, daß sie an V-Regionen der VK IV oder VI und der VH I ünd II Familien annelieren. Primer, die für andere V-Region-Familien entworfen waren, amplifizierten die U7.6 cDNS nicht (mit der Ausnahme eines Primers, basierend auf der VK Vb Familie, der eine abweichend rearrangierte kappa-Kette amplifizieren kann, die von dem von MOPC 21 stammenden Fusionspartner hergestellt wird, der bei der Herstellung des Hybridomas verwendet wurde).
  • Um die Möglichkeit der Verwendung von Gen-Spleißens durch Überlappung-Erweiterungs-Verfahren zu testen, um ein Peptid-gekoppeltes sFv zu konstruieren, wurde das Konstrukt vor der Klonierung in den Expressionsvektor pHEN 1 wiederhergestellt. Diese Methode erlaubt es, ein komplettes sFv schnell durch zwei aufeinanderfolgende Runden der Polymerase Kettenreaktion (PCR) Amplifikation (Abbildung 2, Schritt 1) herzustellen, gefolgt von direkter Klonierung in den Expressionsvektor (Abbildung 2, Schritt 2). Diese Methode hat einen zusätzlichen Vorteil dadurch, daß es nicht notwendig ist, irgendwelche Restriktionsschnittstellen zwischen den zwei V-Region- Domänen einzuführen. Das neue U7.6 sFv Konstrukt wurde dann in pHEN 1 zwischen der Pe1b Leader-Sequenz und einem Peptid-Tag kloniert.
  • Zur Herstellung von sFv wurden pHEN 1 U7.6 beherbergende Bakterien angezüchtet und mit IPTG induziert. Einiges aktives sFv (100-500 ug/Liter) konnte direkt aus dem Kulturüberstand durch Adsorption an DNP- Sepharose-Kügelchen und Elution mit Hapten isoliert werden (Abbildung 4, Spur 5). Trotzallem wurde das meiste des sFv Materials assoziiert mit Bakterien in unlöslicher Form gefunden. Um den Ertrag an sFv zu erhöhen, wurden die Bakterien lysiert, das Protein solubilisiert und dann durch Dialyse gegen einen Puffer erlaubt zu renaturieren (Abbildung 4, Spur 3). Der sFv Antikörper wurde dann Affinitäts-gereinigt (Abbildung 4, Spur 4). Dieses Verfahren, das darauf beruht, daß die Bakterien Disulfidbrücken im periplasmatischen Raum bilden, erbrachte reproduzierbar hohe Erträge an sFv. In einem typischen Experiment wurden insgesammt 4,5 mg aktives sFv per Liter Kultur erhalten.
  • Das DNP-bindende sFv wurde durch Affinitäts- und Größenausschluß-Chromatographie wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliert. Um die Aktivität der verschiedenen aus der Säule gesammelten Fraktionen zu bestimmen, wurden Aliquots mit DNP-Kügelchen in Gegenwart oder Abwesenheit freien DNP-Haptens, wie auch in Beispiel 1 beschrieben, inkubiert. Die Kügelchen wurden dann durch Zentrifugation entfernt und die Überstände wurden bezüglich der Gegenwart von sFv durch Dot Blots mit dem anti-Peptid- Antikörper untersucht. Wie in Abbildung 5 gezeigt, entfernten die DNP-Sepharose-Kügelchen selektiv das monomere Protein (Spur B). Das Entfernen wurde durch 1 mM DNP-Hapten blockiert (Spur c), was zeigte, daß es spezifisch war. Wie in Abbildung 5 gezeigt, verbleibt die Mehrheit an aktiven und adsorbierbaren U7.6 sFv in dem monomeren Peak und das meiste, wenn nicht jegliches des monomeren Proteins ist aktiv. Somit stellt die Größenausschluß-Chromatographie eine relativ einfache Methode zur Trennung des aktiven vom inaktiven sFv dar.
  • Die Fähigkeit des U7.6 sFv an Zelloberflächen zu binden wurde durch FACS-Analysen, wie in Beispiel 3 beschrieben, unter Verwendung von FITC-markierten Myc1 9E10.2, untersucht, um das sFv nachzuweisen. Wie in Abbildung 6 gezeigt, bindet U7.6 sFv an TNP-gekoppelte B6MC1-Zellen, aber nicht an B6MC1-Zellen alleine. Zusätzlich banden sowohl U7.6 sFv als auch ein von U7.6 stammendes Fab an TNP-B6MC1 Zellen bei ähnlichen Konzentrationen, wie in Abbildung 7 gezeigt.
  • Um die relative Bindungs-Effizienz von U7.6 sFv und U7.6 Fab zu vergleichen, wurde die Fähigkeit von DNP- Hapten die Bindung der zwei Moleküle zu inhibieren, verglichen. Wie in Abbildung 8 gezeigt, wurde die Bindung von sowohl Fab als auch sFv durch DNP-Hapten in vergleichbarem Ausmaß inhibiert, wobei der Inhibitionspunkt von 50% bei ungefähr 10&supmin;&sup8; M Hapten eintrat.
  • Die Bindung von U7.6 konnte durch die Anwesenheit von U7.6 sFv inhibiert werden (Abbildung 9). Wenn die Konzentrationen der beiden Spezies aquimolar waren, war die Bindung von U7.6 Fab ungefähr halbmaximal, was vermuten läßt, daß sFv und Fab ähnliche Affinitäten für TNP auf der Zelloberfläche aufweisen.
  • Um zu zeigen, daß die Methode der Herstellung von sFv weit anwendbar ist, wurde in pHEN 1 ein Konstrukt hergestellt, das eine sFv-Version des OKT9 Antikörpers enthielt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Dieser Antikörper reagiert mit dem humanen Transferrinrezeptor. Zusätzlich zu den VL- und VH-Domänen, die durch den gleichen wie auch in U7.6 sFv verwendeten ((Gly)4Ser)3 Linker verbunden sind, wurde eine Hexahistidin-Sequenz zwischen der VH-Domäne und dem Peptid-Tag eingefügt, um die Reinigung durch Metall-Affinitäts-Chromatographie zu erlauben. Das OKT9 sFv, wie auch U7.6 sFv, wurde induziert und in Guanidin gereinigt, und das sFv wurde auf Ni²&spplus;-NTA-Kügelchen adsorbiert, gefolgt von Elution durch Imidazol. Das gereinigte Material wurde dann durch Dialyse wiedergefaltet und auf einer Superdex 75 Säule fraktioniert. Dem monomeren Peak entsprechende Fraktionen wurden gesammelt und durch FACS-Analyse bezüglich der Bindung an K562-Zellen untersucht. Wie in Abbildung 10 gezeigt, band OKT9 sFv stark an K562-Zellen, die große Mengen des Transferrinrezeptors exprimieren, und diese Bindung konnte durch OKT9 IgG inhibiert werden. Diese Ergebnisse wurden durch FACS-Analyse muriner L-Zellen, die mit dem Gen für humanen Transferrinrezeptor transfiziert waren, bestätigt. Im Gegensatz zu U7.6 sFv konnte kein OKT9 sFv in dem Kulturmedium nach Induktion nachgewiesen werden.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf eine Methode der Immuntherapie in einem Wirt, wobei Zielzellen mit verstärkter Selektivität unter Verwendung von Zielzell-gerichteten cytotoxischen Agenzien, zerstört werden. Diese Methode der Immuntherapie schließt zwei Konzepte ein: die spezifische Modifikation der Zielzelle mit monospezifisch bindenden Proteinen, die mit einer chemischen Komponente gekoppelt sind, und das Zielen cytotoxischer Agenzien auf modifizierte Zielzellen mit verstärkter Selektivität.
  • Die hierin beschriebene Methode der Immuntherapie umfaßt Verabreichung eines monospezifisch bindenden Proteins an einen Wirt, welches an ein oder mehrere natürlich vorkommende Zelloberflächenmarker bindet, und somit die Zielzelle modifiziert. Der Modifikation der Zielzelle nachfolgend wird dem Wirt ein multivalenter Antikörper, der an die modifizierte Zielzelle und an ein cytotoxisches Agens bindet, verabreicht. Alternativ kann das Agens mit dem multivalenten Antikörper vor Verabreichung zum Wirt komplexiert werden. Somit wird das cytotoxische Agens an die Zielzelle überbracht und zerstört die Zielzelle mit verstärkter Selektivität.
  • In einer bevorzugten Anwendung verwendet diese Methode des Immunzielens eine Kombination einzelkettiger Antikörpers und heterovernetzter bispezifischer Antikörper, wobei die Zielzelle durch ein oder mehrere Typen einzelkettiger Antikörper modifiziert ist, die spezifisch für ein oder mehrere Zelloberflächenmarker sind. Diese einzelkettigen Antikörper sind mit einem Peptid-Tag oder einer chemischen Komponente gekoppelt, die von einem heterobispezifischen Antikörper erkannt werden, der auch ein cytotoxisches Agens bindet. Somit werden die cytotoxischen Agenzien zur Zielzelle durch heterobispezifische Antikörper überbracht; die an den Peptid-gekoppelten (oder mit einer chemischen Komponenten-gekoppelten) einzelkettigen Antikörper in einer selektiven Weise binden.
  • In anderen Anwendungen ist der multivalente Antikörper ein Fab, Fab oder bispezifisches sFv. Der multivalente Antikörper kann auch ein heterobispezifisches (Fab')&sub2;-Fragment, oder ein homodimeres (IgG)&sub2;-Molekül (Caron, P.C., et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)) oder ein IgM -Antikörper sein. Umgekehrt kann die Zielzelle mit einem bispezifisch bindenden Protein modifiziert sein, wie zum Beispiel ein bispezifisches sFv, oder ein chimäres einzelkettiges Proteinanalogon, und ein multivalenter Antikörper kann mit einer chemischen Komponente modifiziert sein. Somit wird das cytotoxische Agens gesteuert, um an die Zielzelle durch die Assoziation der Erkennungsstelle auf dem bispezifisch bindenden Protein, das die Zielzelle modifiziert, und der chemischen Komponente des multivalenten Antikörpers, der das cytotoxische Agens bindet, zu binden.
  • Zum Beispiel kann die Zielzelle mit einem chimären einzelkettigen Proteinanalogon (U.S. Patent Application No. 07/881,109) modifiziert sein. Das chimäre Proteinanalogon kann eine Bindungsstelle haben, die die natürlich vorkommenden Zelloberflächenmarker auf der Zielzelle erkennt und eine zweite Bindungsstelle haben, die eine chemische Komponente, assoziiert mit einem zweiten multivalenten Antikörper, wie zum Beispiel ein heterobispezifischer Antikörper, der einen cytotoxischen Lymphocyten bindet, erkennt. Somit wird der cytotoxische Lymphocyt an die Zielzelle überbracht.
  • Alternativ kann das chemische Komponenten-Tag des monospezifisch bindenden Proteins Biotin sein, das mit einem Streptavidin gekoppelten anti-CD3 Antikörper reaktiv ist, der ebenso einen cytotoxischen Lymphocyten bindet. Somit wird der CTL durch die Biotin-Streptavidin- Assoziation zur Zielzelle überbracht.
  • Die komplette Antigenbindungsstelle kann durch rekombinante Methoden aus monoklonalen Antikörpern oder kombinatorischen Bibliotheken erhalten werden, und kann dem zweikettigen 50 kD Fab oder verwandten Fab' Fragmenten, dem zweikettigen 25 kD Fv Fragment oder dem 26-27 kD einzelkettigen Fv entsprechen. In manchen Fällen können die zweikettigen Fragmente (z.B. Fab Fragment) durch enzymatischen Verdau einer monoklonalen oder polyklonalen Antikörperpräparation isoliert werden, aber das einzelkettige Fv (sFv) kommt nicht natürlich vor und kann nur durch Verfahren der Proteintechnik hergestellt werden. Alle diese Arten sind kleiner und wesentlich schneller in der Bioverteilung als IgG Monomere oder Dimere, mit typischen Halbwertszeiten der Beseitigung von einigen Tagen für IgG. Pharmakokinetische Eigenschaften variieren in Bezug zur molekularen Größe, zum Beispiel können Halbwertszeiten der Verteilung dieser monovalent bindenden Proteine einen Bereich von Minuten bis zu mehreren Stunden für ein Fab, und bis zu weniger als eine Stunde für ein einzelkettiges Fv, abdecken. Weiterhin ist ungemein verbessertes Penetration in den Tumor fur ein einzelkettiges Fv gezeigt worden, verglichen mit der Penetration des entsprechenden ganzen IgG. (Yakota, T. et al., Cancer Res. 52: 3402-3408 (1992).
  • Somit nutzt, wie hierin beschrieben, diese Methode der Immuntherapie bindende Proteine verringerter Größe fur primäres Zielen auf Zielzelle aus, z.B. auf maligne Zellen innerhalb eines soliden Tumors. Fusioniert mit oder konjugiert mit, oder das Wesentliche dieser bindenden Proteine sind sekundäre Ziele (z.B. eine Peptidsequenz oder eine andere chemische Komponente), so daß die sekundären Ziele oder Tags von einem multivalenten Antikörper (z.B. ein heterobispezifischer Antikörper) erkannt werden. Der multivalente Antikörper erkennt ebenfalls spezifisch und bindet eng an Epitope eines cytotoxischen Agens oder Teile davon, oder an Zelloberflächenmarker von besonderen Zellen, wie zum Beispiel cytotoxische Lymphocyten.
  • In einer Anwendung ist das cytotoxische Agens eine Effektorzelle, wie zum Beispiel ein cytotoxischer T- Lymphocyt (CTL), der an den multivalenten Antikörper bindet. Diese Bindung kann durch "Lyse steigernde" Rezeptoren stattfinden, die auf der Oberfläche des CTL vorliegen, wie zum Beispiel der CD3 Rezeptor. (Segal, D.M., et al., Mol. Immunol. 25: 1099-1103 (1988)). Alternativ können Oberflächenmarker für Effektorzellen CD16, CD32, CD44 und andere für das Zielen geeignete Zelloberflächenmarker einschließen. Somit wird ein stabiles Konjugat zwischen der Zielzelle und der CTL gebildet, und Signale werden transduziert, die die CTL dazu veranlassen, einen "tödlichen Treffer" an die gebundene Zielzelle zu überbringen. Durch direktes Vernetzen der CTL an die gekoppelte Zielzelle, fördert der multivalente Antikörper die Bildung eines Effektor : Ziel-Konjugats,und steuert oder signalisiert der CTL einen tödlichen Treffer zu überbringen.
  • Um zu zeigen, daß ein monospezifisch bindendes Protein fähig ist, gezielt Cytotoxizität zu vermitteln, wurde ein Heterokonjugat zwischen OKT3 (anti-CD3) und Myc1 9E10.2 (anti-Tag Peptid), in Kombination mit U7.6 sFv verwendet, um cytotoxische T-Zellen gegen TNP- gekoppelte B6MC1-Zielzellen zu zielen. Wie in Detail in Beispiel 4 beschrieben und in Abbildung 11 gezeigt, steuerte diese Kombination von Immunmolekülen T-Zellen TNP-modifizierte B6MC1-Zellen zu lysiern. Weder sFv noch Heterokonjugate konnten selbständig Lyse steuern. Auch konnte, wie in Beispiel 4 beschrieben, das Zielen durch freies Hapten inhibiert werden. B6MC1-Zellen, die nicht mit TNP gekoppelt waren, wurden nicht lysiert. Die durch anti-DNP U7.6 sFv-Tag und anti-Peptid x anti-CD3 bispezifischen Antikörper gesteuerte Lyse war vergleichbar, jedoch leicht niedriger, als die, die bei einem direkten anti-DNP x anti-CD3 Heterokonjugat beobachtet wurde. Damit Lyse geschah, mußte die Kombination U7.6 sFv-Tag und heterobispezifischer Antikörper auf der Zielzelle und CD3 Epitop auf der cytotoxi schen Zelle durch die Tag-Peptid:anti-Tag Antikörper Interaktion überbrückt werden.
  • Die Fähigkeit von sFv an solch neu gesteuerter Lyse teilzunehmen, wurde mit OKT9 sFv wie in Abbildung 12 gezeigt, bestätigt. In Kombination mit dem anti-Peptid x anti-CD3 Heterokonjugat war OKT9 sFv in der Lage, die Lyse von sowohl einer murinen L-Zelle transfiziert mit dem humanen Transferrinrezeptor und HUT 102-Zellen zu steuern, jedoch nicht die der B6MC1-Zellen, die den humanen Tranferrinrezeptor nicht exprimieren. Wiederum mußten sowohl sFv und das Heterokonjugat anwesend sein, um Cytotoxizität hervorzurufen, und die Lyse wurde auch mit U7.6 sFv beobachtet, wenn die Ziele mit TNP modifiziert waren.
  • Die hierin beschriebene Methode der Immuntherapie kann selektiv beliebiges Agens, das von der nicht-Tag bindenden Stelle des Bispezifischen erkannt wird, überbringen. Somit kann man polymeres Gadolinium zur MRI- Bilderzeugung, Radioisotop-Komplexe oder verkapselte Stoffe an die gezielte Zelle steuern.
  • In einer hierin beschriebenen Anwendung der Immuntherapie kann die Zielzelle durch multi-seitige Bindung der Peptid-gekoppelten monospezifisch bindenden Proteine modifiziert werden. Zum Beispiel kann ein Gemisch oder Cocktail der einzelkettigen Antikörper dem Wirt verabreicht werden. Dieser Cocktail enthält eine Reihe von verschiedenen einzelkettigen Antikörpern, von denen jeder spezifisch für einen anderen Zelloberflächenmarker oder Epitop auf der Zielzelle ist. Da jede Zielzell-Klasse ihr eigenes einzigartiges Epitop-Profil hat, kann somit die Zielzelle mit Peptid-gekoppelten sFv mit höherer Spezifität als mit einem Antikörper gegen ein einzelnes Epitop alleine, markiert werden.
  • Neben der verstärkten Spezifität kann multiseitiges Zielen, basierend auf monospezifisch bindenden Protein-Cocktails die selektive Bindung der multivalenten Antikörper an die gezielte Zelle sogar mehr verstärken, als mit ein-seitiger Bindung. Diese Methode ist analog zum selektiven Entfernen von Immunkomplexen aus Blut unter Verwendung von verkürzten bindenden Proteinen auf unlöslichen Matrizen. (Huston, J.S., Biophysical J. 62:87-91 (1992); U.S. Patent No. 5,084,398) Ein gemeinsames Ziel der Proteintechniken ist es, die rekombinante Bindung an eine Zelle oder an ein anderes Protein zu verstärken. Eine typische Strategie beinhaltet die Modifizierung individueller Proteinbindungsstellen, um Ihre Affinität für Zielmoleküle zu erhöhen. Trotzallem steigert eine Erhöhung der Bindungsaffinität nicht immer einfach die Spezifität der Bindung. Signifikant erhöhte Bindungsselektivität kann aus viel-seitigen Bindungs-Interaktionen von geringer individueller Affinität hervorgehen.
  • Multivalente Antikörper können mit niedriger Bindungskonstante (d.h. niedrige Affinität) zur Bindung an den Peptidsequenz (oder chemische Komponente)-Tag ausgewählt werden. Alternativ kann eine niedrigere Bindungskonstante durch die Verwendung einer verkürzten oder veränderten Peptidsequenz (oder Analogons der chemischen Komponente) erreicht werden. Somit wird die Affinität des bispezifischen Antikörpers oder anderer bindender Proteine für das Peptid-Tag erhöht. Durch die Herstellung ein-seitiger Kontakte von so geringer Affinität, daß sich keine eins-zu-eins Komplexe unter experimentellen oder klinischen Bedingungen bilden, das die Bindungsaffinität verringert, werden multi-seitige Kontakte zwischen multivalenten Antikörpern und der modifizierten Zielzelle stark begünstigt, und resultiert somit in einer starken Interaktion verstärkter Spezifität zwischen (d.h. Assoziation oder Komplexation von) cytotoxischen Agens an die Zielzelle. Wie in Abbildung 13 gezeigt, zielt ein Gemisch von Peptid-gekoppelten einzelkettigen Antikörpern die cytotoxischen Lymphozyten auf verschiedene Epitope (C, D, E, F und G) auf der Zielzelle durch multi-seitige Interaktionen zwischen der chemischen Komponente (Tag-Peptid) und der Erken nungsstelle (Teil eines heterobispezifischen Antikörpers, der Tag-Peptid bindet). Die Erniedrigung der eigentlichen Assoziationskonstante zwischen anti-Tag Bindungsstellen und Tag-Peptid begünstigt schließlich multi-seitige Bindung für die Vermittlung gezielter Cytotoxizität. Diese multi-seitige Interaktion vereinfacht ebenfalls die Komplexbildung zwischen dem multivalenten Antikörper und der Zielzelle. Somit begünstigt die Erniedrigung der Bindungsaffinität eines multivalenten Antikörpers für die chemische Komponente multi-seitige Kontakte als die Basis für Komplexbildung zwischen dem multivalenten Antikörper und der Zielzelle.
  • Zum Beispiel bei einem gewissen Schwellenwert, wie zum Beispiel unter Ks, intrinsic = 10³ wäre das gezielte cytotoxische Agens (z.B. ein CTL) unfähig produktiv durch eine, oder sogar zwei Kontakte unter den Proteinkonzentrations-Bedingungen und dem Zielzellengehalt, der in vivo in einem Wirt vorliegt, zu binden. Trotzallen kann Bindung mit multi-seitigen Interaktionen sehr eng sein.
  • Solche multi-seitigen Kontakte werden mit einem geeigneten Cocktail monospezifisch bindender Proteine erreicht, die an Antigen bei ausreichender Lokalisationsdichte binden, um multiple Kontakte zu erlauben. Verstärkte Selektivität kann auf zwei Effekte zurückgeführt werden. Erstens, der Effekt der Bindung eines gekoppelten monospezifisch bindenden Protein- Cocktails multipler, unterschiedlicher Antigene auf der Zielzelle. Dieser Effekt ist Folge des besonderes Profils multipler Epitope auf der Zielzelle, das die Zielzelle spezifischer definiert, als ein einzelnes Epitop, das auf anderen nicht-Zielzellen vorkommen könnte. Multi-seitige Interaktionen als Basis der Komplexbildung für effektives Zielen cytotoxischer Agenzien nützt somit das Antigenprofil der Zielzelle aus. Zweitens, der Effekt der Oberflächendichte eines gegebenen Antigens auf der Zielzelle kann die Spezifität der Bindung, sogar für ein einziges Epitop, verstärken. Somit könnte zum Beipiel ein Zelltyp mit sehr geringer Oberflächenexpression eines gegebenen Antigens von einer malignen Zelle mit sehr hoher Oberflächenexpression des gleichen Antigens unterschieden werden, da multivalente Bindung eine Interaktion mit der malignen Zelle mit hoher Antigendichte sehr stark begünstigen würde.
  • In den letzten Jahren ist ein großer Teil des Interesses auf das Zielrichten cytotoxischer Zellen, ungewollte neoplasmatische oder viral infizierte Zellen zu töten, gelenkt worden. Ein allgemeiner Weg dies zu tun, ist es, einen bispezifischen Antikörper mit dualer Spezifität für ein Antigen auf der Zielzelle und einem Auslösermolekül auf der Effektorzelle (wie zum Beispiel CD3 auf T-Zellen) zu verwenden.
  • Die hierin beschriebene Methode der Immuntherapie hat eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen Formen der Immuntherapie. Erstens, kann sie verwendet werden, um schnell monospezifisch bindende Antikörper zu identifizieren, wie zum Beispiel sFv Proteine, die nützlich beim Entwurf und Konstruktion rekombinanter bispezifischer Antikörper sein können. Die Verwendung eines Peptid-Tags zusammen mit einem universalen bispezifischen Antikörper, der in der Lage ist, cytotoxische Agenzien zum Zerstören der sFv gekoppelten Zielzellen zu steuern, erlaubt es, auf das sFv mit den besten Ziel-Fähigkeiten zu durchmustern.
  • Zweitens, in einer Reihe von klinischen Anwendungen ist eine indirekte Annäherung, um Effektorzellen zu zielen, vorteilhaft. Es erlaubt den Gebrauch eines einzigen sFv oder eines sFv-Cocktails, die gegen eine Reihe von Epitopen auf Zielzellen gerichtet sind, zusammen mit nur einem universalen bispezifischen Antikörper, um die Affinität und Spezifität des Ziel- Effektorzell-Komplexes zu verstärken.
  • Weiterhin könnte, wenn man ein monovalent bindendes Protein, wie zum Beispiel ein Fab oder sFv Fusionsprotein gekoppelt mit einer chemischen Komponente verwendet, das Fusionsprotein in einem geeigneten Intervall folgen mit dem heterobispezifischen oder tetravalenten (IgG)&sub2; Dimer- Antikörper, der die gekoppelten bindenden Proteine erkennt und zwei oder mehrere Proteine zusammen auf der Zelloberfläche vernetzt. Dies verstärkt effektiv Ziellokalisation und verbessert endgültig die Fähigkeit des Zielens auf Tumore.
  • Letztendlich, falls die Oberflächenkomponente einer Zielzelle verdeckt oder geheim ist, die von einem bispezifischen Antikörper erkannt werden würde, dann kann er an Effektorzellen, die mit einem bispezifischen Antikörper gekoppelt sind, an Stellen entfernt des Tumors binden, und bei den Zellen die Ausschüttung toxischer Faktoren ungeeigneter Weise auslösen. Dies kann in der hierin beschriebenen Methode der Immuntherapie umgangen werden, da es möglich ist, erst ein monospezifisch bindendes Protein gegen die Zelloberflächenkomponente der Zielzelle, zu verabreichen, und dann jeglichen vorkommenden löslichen Antigen-bindenden Protein-Komplexen zu erlauben, sich zu entfernen, vor der Verabreichung des universal bispezifischen Antikörpers. Dies würde sicherstellen, daß die Effektorzellen nur gegen Zielzelloberflächen-gebundene monospezifisch bindende Proteine gerichtet sind und somit die Effektorzelle zur Zielzelle mit verstärkter Selektivität überbracht wird.
  • Die Erfindung wird näher und spezifischer durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
    • BEISPIELE Beispiel 1: Konstruktion des Peptid-markierten einzelkettigen Fusionsproteins U7.6 sFv Zellinien und Vektoren
  • Die folgenden E. coli Stämme und Vektoren wurden eingesetzt: XL1 blue (Stratagene, La Jolla, CA), TG1 und HB2151 (zur Verfügung gestellt von Dr. G. Winter, LMB, Cambridge, UK); pBluescript (Stratagene) und pHEN1 (zur Verfügung gestellt von Dr. G. Winter).
    • Oligonucleotide
  • In dieser Untersuchung eingesetzte oligonucleotide wurden mit einem automatischen DNS Synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA) und unter Verwendung von "Oligonucleotide Purification Cartridges" (Applied Biosystems) hergestellt. Die Sequenz der oligonucleotide, die bei Polymerkettenreaktionen (PCR) eingesetzt wurden, sind in der Tabelle (SEQ ID NR: 6-20) angegeben. Tabelle In dieser Untersuchung eingesetzte oligonucleotid-Primer
    • PCR Amplifikation von V Regionen und Konstruktion von U7.6 sFv
  • mRNS von U7.6, einem murinen Hybridom, das einen IgG anti-Dinitrophenol (DNP) Antikörper sezerniert (zur Verfügung gestellt von Dr. Z. Escher, Weizmann Institute, Rehovot, Isreal), wurde aus den Zellen mit Hilfe eines Fast Track mRNS Isolierungsset (Invitrogen, San Diego, CA) präpariert. cDNS wurde aus der mRNS unter Verwendung von MoMuLV reverser Transcriptase (BRL/Life Technologies, Gaithersburg, MD) und den CH1-Xba und CKN1 Primern für die schwere beziehungsweise leichte Kette präpariert. Primer wurden konstruiert und verwendet, um die V Region- Domänen zur Klonierung in pBluescript zu amplifizieren, wobei die Primer aus VKS' exp und VK3'AL2 (VL Domäne) und VH Not und CH Xbas (VH Domäne), definiert in Tabelle 1, bestehen. Der VK3'AL2 enthält die Sequenz, die den ((Gly)4Ser)3 Peptid-Linker codiert. Die V Region-Domänen wurden mit 25 PCR-Zyklen (1 min 95 ºC, 1 min 50ºC, 1 min 72ºC) mit Hilfe der geeigneten Primer und des GeneAmp Set (Perkin Elmer Cetus Norwalk, CT) amplifiziert. Die resultierende DNS wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt, mit den geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten, durch ein 2% niedrig schmelzender Agarosegel (NuSieve, FMC Bioproducts, Rockland, ME) elektrophoresiert und mit Geneclean (Bio 101, La Jolla, CA) gereinigt.
  • Die VL Domäne wurde zuerst in pBluescript an die SacI und NotI Stellen ligiert und die VH Domäne wurde später in NotI und XbaI Stellen inseriert. Das Insert aus dem resultierenden Plasmid (pBluescript U7.6) wurde dann unter Verwendung des Sequenase Set (US Biochemical Corporation, Cleveland, OH) sequenziert.
    • Klonieren des U7.6 sFv Konstrukts in pHEN 1
  • U7.6 sFv wurde in pHEN 1 kloniert, einen bakteriellen Expressionsvektor, der die pelb Leader-Sequenz benutzt, um die Sekretion von Proteinen in den periplasmatischen Raum zu steuern (Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)). Um die Durchführbarkeit der Verwendung des Genspleißens mit eines Überlappung- Erweiterungsverfahren zur Herstellung von sFv zu testen, stellten wir das Konstrukt unter Verwendung von vier Primern erneut her, um die U7.6 Regionen zu amplifizieren. Die beiden "äußeren" Primer (U7.6 L5' Sfi und U7.6 H3' Not) enthielten geeignete Restriktionsstellen zur Insertion in den pHEN 1 Expressionsvektor. Die "überlappenden" Primer (U7.6 L3' Verbindung und U7.6 H5' Verbindung) enthielten Sequenzen, die von dem Linker- Peptid abstammten. Diese waren so konstruiert, daß sie komplementär zueinander waren, um eine spätere Anneherung zu erlauben. Da das Taq Enzym eine 3' terminale Adenylierungsaktivität besitzt, waren zusätzlich die inneren Primer so konstruiert, daß ein zum terminalen A, das von den meisten PCR Produkten getragen. wurde, komplementärer T-Rest vorhanden sein würde. Diese Primer wurden zur Amplifizierung der V Regionen verwendet, unter Verwendung von pBluescript U7.6 als eine Matrize, und dann wurde 0,1-1 ul des Produkts gemischt und unter Verwendung nur der äußeren Primer reamplifiziert. Das resultierende PCR Produkt, das das ganze sFv Konstrukt enthielt, wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt, bevor es mit SfiI und NotI Restriktionsenzymen geschnitten werden sollte.
  • Das geschnittene Produkt wurde über ein 2% Agarosegel elektophoresiert, mit Genedean gereinigt und in pHEN 1 ligiert. Der als pHEN-U7.6 bezeichnete Vektor wurde dann in E. coli, die auf 50 ug/ml Ampicillin und 1% Glucose haltigen 2xTY Platten wuchsen, mittels Elektroporation transformiert.
    • Herstellung des sFv Proteins
  • Zur Herstellung des sFv Proteins (VL-Linker-VH) ist es notwendig, das Plasmid in den E. coli Stamm HB2151 zu transferrieren. Der Phagen-Replikationsursprung in pHEN 1 wurde zur Herstellung eines Phagen, der eine einzelsträngige, von dem pHEN 1 U7.6 Plasmid stammende DNS enthält, verwendet. TG1 Zellen, die pHEN 1 U7.6 tragen, wurden in Ampicillin und Glucose haltigem 2xTY Medium wachsen gelassen. Sie wurden mit dem VCS M13 Helferphagen (Stratagene) infiziert und übernacht in Ampicillin, Kanamycin und Glucose haltigem 2xTY Medium wachsen gelassen. Der Phage wurde dann aus dem Überstand mit 1/5 Volumen 20% Polyethylenglycol 6000 und 2,5 M NaCl gefällt und zur Infektion von HB2151 Zellen, die auf 2xTY Platten + Ampicillin + Glucose gewachsen waren, verwendet. Kolonien, die in der Lage waren, Proteine zu produzieren, wurden mittels Induktion von kleinen Kulturen mit IPTG identifiziert, Elektrophorese des Zellpellets auf SDS- PAGE und das Protein wurde durch Sondierung eines Western Blot mit anti-myc Peptid-Antikörper, wie unten beschrieben, identifiziert.
    • Western Blot
  • Proteine wurden mittels SDS-PAGE auf 12,5% Gelen unter Verwendung des Phastgel-Systems (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ), wie vom Hersteller beschrieben, aufgetrennt. Die Proteine wurden auf Nitrocellulose unter Verwendung der Phastgel Western Blot Vorrichtung geblottet. Die Blots wurden dann in 1% BSA haltigem PBS 30 min bei Raumtemperatur blockiert, fünfmal in PBS-Tween gewaschen und 1 h bei Raumtemperatur mit PBS-Tween, was 2-7 ug/ml anti-Peptid-Antikörper (Mycl 9E10.2) enthielt, inkubiert. Nach 5 weiteren Waschgängen mit PBS-Tween wurden die Blots weitere 30-60 min mit 0,2 ug/ml alkaline Phosphatase konjugiertem anti-Maus IgG (Southern Biotechnology Associates) inkubiert, vor 5 letzten Waschgängen mit PBS-Tween. Die Blots wurden mit 0,5 mg/ml Nitroblau-Tetrazolium und 0,25 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3- indolylphosphat (Sigma) in 0,1 M NaHCO&sub3; 1 mM MgCl&sub2;, pH 9,8, entwickelt.
    • Induktion und Herstellung von sFv in pHEN U7.6
  • HB2151 Zellen, die pHEN1 U7.6 enthielten, wurden in Ampicillin und Glucose haltigem 2xTY Medium wachsen gelassen. Wenn die Zellen in der mittleren log-Phase waren, wurden sie abzentrifugiert, in LB Broth gewaschen und in Ampicillin und 1 mM IPTG haltigem 2xTY Medium resuspendiert. Die Zellen wurden dann unter Schütteln bei Raumtemperatur übernacht unter Bedingungen inkubiert, die in ersten Untersuchungen erhalten wurden, wie oben beschrieben, die die höchste Zellausbeute ergaben. Die Zellen wurden pelletiert und bei -20ºC aufbewahrt und der Überstand durch einen 0,45 um Filter filtriert.
    • Präparation von U7.6 sFv aus Zellpellet
  • Das Zellpellet wurde aufgetaut und in kaltem 50 mM Tris, 1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0,1 mM pH 8,0, resuspendiert und mit einem Bead Beater (Biospec Products, Bartlesville, OK) zerstört. 0,1 mm Glasperlen wurden zugegeben und die Zellen 3x1 min, mit einminütigen Kühlungsphasen, gepulst. Im Anschluß an die Lyse wurde das sFv Protein in der unlöslichen Fraktion gefunden. Nach Zentrifugation wurde diese in 7,5 M Guanidin-HCl aufgenommen, die Lösung durch eine 20 minütige 25000 g Zentrifugation gereinigt. Das Material wurde dann bei 40ºC gegen 0,1 M Tris, 2 mM EDTA, 0,4 M Arginin, pH 8,0, dialysiert und das aktive sFv mittels Affinitätschromatographie wiedergewonnen.
  • Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse der SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) des U7.6 sFv während Herstellung und Reinigung. Proben wurden für eine SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen prapariert und liefen auf einem 12,5% Gel. Die Gele wurden entweder mit Coomassieblau gefärbt oder auf Nitrocellulose geblottet und mit dem anti-myc Peptid-Antikörper sondiert. Spur 1 ist ein nicht-induziertes Zellpellet; Spur 2 ist ein induziertes Zellpellet; Spur 3 ist Material nach Lösen und Dialyse gegen Arginin; Spur 4 ist U7.6, das aus wiedergefaltetem Material affinitätsgereinigt wurde; Spur 5 ist U7.6 sFv, das aus Kulturüberstand affinitätsgereinigt wurde.
    • Auftrennung nach Größe und Affinitätsreinigung von aktivem U7.6 sFv
  • Wiedergefaltetes sFv Material wurde über eine 1,6x50 cm Superdex 75 Säule (Pharmacia) unter Verwendung eines Pharmacia FPLC Systems in 0,1 Tris, 2 mM EDTA, 0,4 Arginin, pH 8,0, mit einer Flußrate von 2 ml/min gegeben.
  • Das Elutionsprofil von wiedergefaltetem sFv und Elutionsvolumina von drei Eichproteinen, Cytochrom C (13 kD), menschliche Carbonatdehydrase (29,5 kD) und bovines Serumalbumin (67 kD) sind in Abbildung 5 gezeigt. Vier ml Fraktionen wurden gesammelt und die Aktivität wurde mittels Inkubation von 750 ul Proben mit DNP-Sepharose- Kügelchen in Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 mM DNP Hapten bestimmt. Die Kügelchen wurden pelletiert und 1 ul Proben des Überstand wurden tüpfelweise auf Nitrocellulose geblottet und auf Vorhandensein von U7.6 sFv unter Verwendung von Mycl 9E10.2 Antikörper getestet. Der untere Teil von Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse der Dot- Blots von Fraktionen, die ohne Adsorption (Spur A), nach Adsorption mit DNP-Sepharose-Kügelchen (Reihe B) oder nach Adsorption mit DNP-Sepharose-Kügelchen in Anwesenheit von 1mM DNP Hapten (Reihe C) getestet wurden. Die relative Intensität der Dot-Blots ist mit dem Symbol in jedem Kästchen (+++, intensiv; ++, stark; +, schwach; +/-, latent; leer, negativ) angegeben.
  • Wie in Abbildung 5 gezeigt, entfernten die DNP Sepharose-Kügelchen das monomere Protein selektiv (Spur B). Dieses Entfernen wurde durch 1 mM DNP-Hapten blockiert (Spur C), was zeigt, daß es spezifisch war. Der große Hauptanteil von aktivem U7.6 sFv, der an DNP Sepharose bindet, befindet sich deshalb im Monomer-Peak und der größte Teil, wenn nicht gar alles, des monomeren Proteins ist aktiv. Folglich liefert die Größenausschluß- Chromatographie ein relativ einfaches Verfahren zur Trennung von aktivem monomeren sFv von inaktivem sFv.
  • U7.6 wurde auch mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung von DNP-Lysin-Sepharose isoliert. Das sFv wurde mit 1 mM DNP ε-Aminocapronsäure eluiert, und das freie Hapten anschließend mittels Dialyse gegen einen geeigneten Puffer, der Dowex AG 1-X8 Kügelchen (BioRad, Richmond, CA) enthielt, entfernt. Wenn affinitätsgereinigtes sFv auf eine Superdex 75 Säule aufgetragen wurde, eluierte dieses bei einem leicht größeren Volumen als mit Größenstandards vorhergesagt wurde, was vermuten läßt, daß das Protein in einer kompakten Form gefaltet ist, aber eine leichte Tendenz zur Selbstassoziation zeigen kann. Vor der Affinitätsreinigung eluierte allerdings der größte Teil des wiedergefalteten U7.6 sFv mit einem Ausschlußvolumen, wie mittels Dot-Blot der verschiedenen Fraktionen aus der Säule und Sondierung mit anti-myc Peptid-Antikörper gezeigt wurde (Abbildung 5, oben beschrieben), was mit einem beträchtlichen Ausmaß an Aggregatbildung unter Wiederfaltungsbedingeungen bei diesem Versuch übereinstimmt, was das aktive monomere sFv, das vorhanden ist, maskiert.
    • Beispiel 2: Klonierung von OKT9 sFv in pHEN 1
  • Das OKT9 sFv Konstrukt besteht aus der VL und VH Domäne, die mit dem gleichen ((Gly)4Ser)3 Linker, der in dem U7.6 sFv verwendet wurde, verbunden sind. Das OKT9 sFv Konstrukt wurde mit PCR unter Verwendung von OKT9 5'SFI und OKT9 3'his NOT Oligonucleotid-Primern, die die fur eine Klonierung in pHEN 1 notwendigen SfiI und NotI Schnittstellen enthalten, amplifiziert. Zusätzlich enthielt der OKT9 3'his NOT Primer eine für sechs Histidine codierende Sequenz. Das PCR Produkt wurde mit den geeigneten Enzymen geschnitten und in pHEN 1, wie für U7.6 sFv beschrieben, ligiert.
    • Expression und Reinigung von OKT9 sFv
  • Das OKT9 sFv wurde in gleicher Weise wie U7.6 sFv exprimiert. Das induzierte Zellpellet wurde lysiert und das unlösliche Material wurde in 6 M Guanidin, 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;, 10 mM Tris, pH 8,0, gelöst. Dieses wurde dann mit Ni²&spplus;-NTA-Agarose-Kügelchen (Quiagen, Chatsworth, CA), das den His6 Schwanz bindet, 2 h bei 4ºC gemischt. Die Kügelchen wurden eingehend mit dem 6 M Guanidin-HCl Puffer gewaschen und das sFv Material wurde mit 100 mM Imidazol eluiert. Das sFv durfte mittels Dialyse gegen 0,1 M Tris, 2 mM EDTA, 0,4 M Arginin, pH 8,0, renaturieren und passierte eine Superdex 75 Säule, wie für das U7.6 sFv beschrieben. Das Material, das als monomeres sFv eluierte, wurde dann auf Vorhandensein von aktivem OKT9 sFv getestet.
    • Beispiel 3: oberflächenbindung von sFv
  • Die Bindung von U7.6 und OKT9 sFv an Zellen wurde mittels Durchflußcytometrie unter Verwendung von TNP modifizierten B6MC1 Zellen und K562 Zellen, die den von OKT9 erkannten menschlichen Transferrinrezeptoreptor exprimieren, getestet. Die Zellen wurden mit sFv inkubiert, gewaschen und gefärbt mit FITC markiertem Mycl 9E10.2 (anti-Tag-Peptid) Antikörper vor der Analyse mit einem FACScan Durchflußcytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA) mit C30 Software. Die Zellen wurden auf Lebensfähigkeit sowohl über Vorwärtsstreuung als auch Seitenstreuung eingegrenzt, und die Fluoreszenz wurde bei 488 nm gemessen. Bei U7.6 wurde die Spezifität durch Verwendung von DNP Hapten oder U7.6 Fab, um die Bindung von dem sFv zu hemmen, gezeigt.
  • Abbildung 6, Bild B zeigt das Binden von U7.6 sFv an TNP-beschichtete MC-1 Zellen. Die punktierte Linie bezieht sich auf Zellen, die nur mit FITC-anti-Peptid- Antikörper gefärbt wurden; die durchgezogene Linie bezieht sich auf Zellen, die mit 125 nM U7.6 sFv vorinkubiert wurden und dann mit dem FITC anti-Peptid gefärbt wurden. Im Vergleich dazu zeigt Bild A nur mit FITC anti-Maus IgG gefärbte Zellen (punktierte Linie) oder mit U7.6 Fab, und anschließend mit FITC-anti-Maus IgG gefärbt. Bild C zeigt, daß das U7.6 sFv nicht an MC-1 Zellen bindet, die nicht mit TNP markiert waren. (Punktierte und durchgezogene Linie wie in Bild B). Bild D zeigt, daß sowohl U7.6 sFv als auch Fab das Binden von FITC-U7.6 intaktem IgG Antikörper an TNP-MC-1 Zellen hemmt. Weitpunktierte und durchgezogene Linien repräsentieren nichtgefärbte beziehungsweise gefärbte TNP-MC-1 Zellen. Gestrichelte Linien repräsentieren eine Färbung von TNP-MC-1 Zellen durch FITC-U7.6 bei Anwesenheit von nM U7.6 Fab und engpunktierte sind bei Anwesenheit von 125 nM U7.6 sFv.
  • Abbildung 7 zeigt das relative Binden von U7.6 sFv und Fab an TNP-beschichtete B6MC1 Zellen. TNP modifizierte Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen entweder von U7.6 sFv oder U7.6 Fab (schwarze Quadrate), anschließend entweder mit FITC Mycl 9E10.2 Antikörper oder FITC-Ziege anti-Maus Antikörper (schwarze Dreiecke) inkubiert. Die Zellen wurden dann mittels FACS analysiert und die mittlere Fluoreszenz-Intensität (MFI) der Zellpopulationen errechnet.
  • Abbildung 8 zeigt die Hemmung des Bindens von U7.6 Fab an TPN modifizierte B6MC1 Zellen durch DNP-Amino capronsäure. TNP modifizierte B6MC1 Zellen wurden mit U7.6 sFv (schwarze Dreiecke) oder U7.6 (schwarze Quadrate) in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen an DNP Hapten inkubiert. Die Zellen wurden mit einem FITC- markierten zweiten Antikörper gefärbt und die mittlere Fluoreszenz-Intensität (MFI) jeder Zellpopulation wurde mittels FACS Analyse bestimmt.
  • Abbildung 9 zeigt die Hemmung des Bindens von U7.6 Fab an TNP modifizierte Zellen durch U7.6 sFv. TNP modifizierte B6MC1 Zellen wurden mit 125 nM, 41,7 nM oder 13,9 nM U7.6 Fab in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen an U7.6 sFv inkubiert. Die Zellen wurden mit FITC Ziege anti-Maus IgG gefärbt und die mittlere Fluoreszenz-Intensität (MFI) mittels FACS Analyse bestimmt. Die Hintergrund-MFI in Abwesenheit jeglichen U7.6 Fab war 40.
  • Abbildung 10 zeigt das Binden von OKT9 sFv an K562 Zellen. Die weitpunktierte Linie bezieht sich auf K562 Zellen, die mit FITC-anti-Peptid gefärbt wurden; die durchgezogene Linie bezieht sich auf OKT9-sFv plus FITC- anti-Peptid. Die dichtpunktierte Linie bezieht sich auf OKT9-sFv plus FITC-anti-Peptid, ist aber mit einem Überschuß OKT9 Antikörper inhibiert.
    • Beispiel 4: Neuausrichtungsversuche
  • Trinitrophenol (TNP)-modifizierte B6MC1 Zellen oder nichtmodifizierte Zellen wurden in einem &sup5;¹Cr Freisetzung- Standardtest zusammen mit menschlichen cytotoxischen T Zellen als Effektoren verwendet, um die Fähigkeit des U7.6 sFv zu zeigen, eine Lyse erneut zu erzielen. T- Zellen von menschlichem peripheren Blut wurden mit einem bispezifischen Heterokonjugat-Antikörper (0,31 ug/ml anti-CD3 x anti-Tag-Peptid oder 0,8 ug/ml anti-CD3 x anti-DNP) beschichtet, hergestellt wie in Perez, P. et al., Nature 316: 354-356 (1985) beschrieben. Zielzellen (entweder TNP modifiziert oder nicht-modifizierte B6MC1 Zellen, Transferrinrezeptoreptor transfi zierte L-Zellen oder HUT 102 Zellen) wurden mit &sup5;¹Cr markiert und als Zielzellen eingesetzt. Die Zellen (1x10&sup6;) wurden entweder mit U7C6 oder OKT sFv 30 min bei 4ºC inkubiert. 10&supmin;&sup4; Zielzellen wurden dann zu den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben, die eine geeignete Anzahl an Effektorzellen und, in manchen Fällen, freies DNP Hapten mit einer Endkonzentration von 2,5x10&supmin;&sup4; M enthielten. Die Platten wurden dann 3-4 h bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert und die spezifische Lyse wie in Perez, P., et al., Nature 316: 354-356 (1985); Segal, D.M., In: Fc Receptors and the Action of Antibodies, H. Metzger (ed.) American Society for Mikrobiology, Washington, D.C. pp. 291-301 (1990) beschrieben, bestimmt.
  • Wie in Abbildung 11 Bild A gezeigt, erfolgte eine signifikante Lyse, wenn sowohl U7.6 sFv und ein bispezifischer Antikörper (anti-CD3 x anti-myc) vorhanden waren (schwarze Dreiecke, durchgezogene Linie), eine viel geringere Lyse wurde in Kontrollen beobachtet, die ausschließlich bispezifischen Antikörper (weiße Dreiecke), ausschließlich U7.6 sFv (schwarze Quadrate) oder U7.6 sFv, bispezifischen Antikörper plus 1 mM DNP Hapten (schwarze Dreiecke, gestrichelte Linie) enthielten. Als eine positive Kontrolle (Bild B) wurden TNP Zielzellen von menschlichen T-Zellen bei Vorhandensein von anti-CD3 x anti-DNP bispezifischen Antikörper (weiße Kreise), aber nicht bei Fehlen eines Antikörpers (weiße Dreiecke) oder wenn 1 mM DNP-Hapten vorhanden war (weiße Kreise, gestrichelte Linie) lysiert. Schließlich wurde keine Lyse beobachtet, wenn Zielzellen nicht mit TNP beschichtet waren (Bild C), weder ohne Antikörper (weiße Quadrate), noch mit anti-CD3 x anti-DNP (weiße Kreise) oder anti-CD4 x anti-myc (schwarze Dreiecke).
  • Abbildung 12 zeigt die Daten, die sich aus einer Lyse von TNP-TFR-transfizierten L-Zellen durch aktivierte menschliche T-Zellen ergeben. Die schwarzen Kreise und gestrichelte Linie beziehen sich auf Effektorzellen und Zielzellen ohne Antikörper. Die schwarzen Dreiecke beziehen sich auf Zellen plus anti-CD3 x anti-Peptid bispezifischen Antiktrper. Die weißen Quadrate beziehen sich auf OKT9-sFv plus Zellen und bispezifischen Antikörper. Die schwarzen Kreise, durchgezogene Linie beziehen sich auf U7.6-sFv plus Zellen und bispezifischen Antikörper. Die X-Achse zeigt das Effektor : Zielzelle- Verhältnis. Die Y-Achse zeigt die spezifische Lyse in Prozent, wie es durch &sup5;¹Cr Freisetzung gemessen wurde.
    • Sequenz-Liste
  • Hiermit wird, wie erforderlich, eine Kopie der "Sequenz-Liste" in Computer-lesbarer Form übermittelt. Der Patentanwalt des Anmelders erklärt, daß der Inhalt der "Sequenz-Liste" in Papierform und die Computerlesbare Form der "Sequenz-Liste" gleich ist.
    • Entsprechungen
  • Der Fachmann erkennt oder kann mit Hilfe üblicher Versuche zahlreiche Entsprechungen zu den spezifischen Anwendungen der hier beschriebenen Erfindung feststellen.
    • SEQUENZ-LISTE
  • (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
  • (1) ANMELDER:
  • (A) ADRESSAT: creative Biomolecules
  • (B) STRASSE: 35 South Street
  • (C) STADT: Hopkington
  • (D) BUNDESSTAAT: MA
  • (C) STAAT: USA
  • (F) PLZ: 01748
  • (A) ADRESSAT: National Institute of Health
  • (C) STRASSE: Office of Technology
  • (C) STADT: Bethesda
  • (D) BUNDESSTAAT: MD
  • (E) STAAT: USA
  • (F) PLZ: 20892
    • (ii) TITEL DER ERFINDUNG: METHODE ZUM ÜBERBRINGEN VON AGENZIEN AN ZIELZELLEN
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 20
  • (iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
  • (A) ADRESSAT: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P.C.
  • (B) STRASSE: Two Militia Drive
  • (C) STADT: Lexington
  • (D) BUNDESSTAAT: MA
  • (E) STAAT: USA
  • (F) PLZ: 02173
  • (v) COMPUTER-LESBARE FORM:
  • (A) MEDIUMTYP: Floppy disk
  • (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Version 1.25
  • (vi) AKTUELLE ANMELDEDATEN
  • (A) ANMELDUNGSNUMMER:
  • (B) EINREICHUNG:
  • (C) KLASSE:
  • (viii) PATENTANWALT:
  • (A) NAME: Brook, David E.
  • (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 22.592
  • (C) REFERENZILISTENNUMMER: CBM92-02. PCT
  • (ix) TELEKOMMUNIKATION:
  • (A) TELEFON: (617) 981-6240
  • (B) TELEFAX: (6179 981-9540
  • (1) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 1:
  • (i) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 120 Babenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelsträngig
  • (D) Topologie: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
  • (xi) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
  • (B) POSITION: 1..360
  • (Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:1:
  • (2) INFORMATION FUR SEQ ID NR: 2:
  • (i) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 120 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (D) Topologie: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:2:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 3:
  • (i) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 327 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelsträngig
  • (D) Topologie: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
  • (xi) MERKMAL:
  • (A) MANEE/SCHLÜSSEL: CDS
  • (B) POSITION: 1..327
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:3:
  • (2) INFORMATION FUR SEQ ID NR: 4:
  • (i) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 120 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (D) Topologie: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:4:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 5:
  • (1) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
  • (B) TYP: Aminosäure
  • (D) Topologle: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:5:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 6:
  • (i) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 32 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelsträngig
  • (D) Topologie: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:6:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 7:
  • (i) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 35 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelsträngig
  • (D) Topologle: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DMS (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:7:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 8:
  • (1) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 35 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelsträngig
  • (D) Topologle: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:8:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 9:
  • (i) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelsträngig
  • (D) Topologie: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:9:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 10:
  • (i) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelsträngig
  • (D) Topologle: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DMS (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:10:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 11:
  • (1) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 42 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelsträngig
  • (D) Topologle: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:8:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 12:
  • (i) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 83 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelsträngig
  • (D) Topologie: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:12:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 13:
  • (i) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 35 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelsträngig
  • (D) Topologle: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DMS (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:13:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 14:
  • (1) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 38 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelsträngig
  • (D) Topologle: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:14:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 15:
  • (i) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 56 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelsträngig
  • (D) Topologie: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:9:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 16:
  • (i) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelsträngig
  • (D) Topologle: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DMS (genomisch)
  • (xi) SEQUENZEESCHREIBUNG: SEQ ID NR:16:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 17:
  • (1) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 59 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelsträngig
  • (D) Topologle: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:17:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 18:
  • (i) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 62 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelsträngig
  • (D) Topologie: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:18:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 19:
  • (i) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 58 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelsträngig
  • (D) Topologle: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DMS (genomisch)
  • (XI) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:19:
  • (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 20:
  • (1) SEQUENZMERKMALE:
  • (A) LÄNGE: 57 Basenpaare
  • (B) TYP: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelsträngig
  • (D) Topologle: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DMS (genomisch)
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR:20:

Claims (1)

1. Verwendung eines monospezifisch bindenden Proteins, das mit einer chemischen Komponente markiert ist und mit einem oder mehreren natürlich vorkommenden Zelloberflächenmarkern auf einer Zielzelle reaktiv ist, und eines multivalenten Antikörpers mit einer Bindungsstelle, die mit der chemischen Komponente reaktiv ist, und einer anderen Bindungsstelle, die mit einem an die Zielzelle zu überbringenden Agens reaktiv ist, zur Herstellung eines Medikaments oder von Medikamenten zur Verwendung in Therapie oder Diagnose, die das Überbringen eines Agens an Zielzellen in einem Wirt einschließt und die Schritte umfaßt:
(a) Verabreichen des monospezifisch bindenden Proteins an den Wirt unter Bedingungen, bei denen das monospezifisch bindende Protein an die Zelloberflächenmarker bindet; und
(b) Verabreichen des multivalenten Antikörpers an den Wirt unter Bedingungen, wobei der multivalente Antikörper die mit einer chemischen Komponente markierte Zielzelle und das Agens bindet und dadurch das Agens an die Zielzellen überbringt.
2. Verwendung nach Anspruch 1, worin eine Bindungsstelle des Antikörpers mit einem bilderzeugenden Agens reaktiv ist.
3. Verwendung eines monospezifisch bindenden Proteins, das mit einer chemischen Komponente markiert ist und mit einem oder mehreren natürlich vorkommenden Zelloberflächenmarkern auf einer Zielzelle reaktiv ist, und eines multivalenten Antikörpers mit einer Bindungsstelle, die mit der chemischen Komponente reaktiv ist, und einer anderen Bindungsstelle, die mit einem cytotoxischen Agens reaktiv ist, zur Herstellung eines Medikaments oder von Medikamenten zur Verwendung in Therapie oder Diagnose, die das Überbringen eines cytotoxischen Agens an Zielzellen in einem Wirt einschließt und die Schritte umfaßt:
(a) Verabreichen des monospezifisch biildenden Proteins an den Wirt unter Bedingungen, bei denen das monospezifisch bindende Protein an die Zell oberflächenmarker bindet; und
(b) Verabreichen des multivalenten Antikörpers an den Wirt unter Bedingungen, wobei der multivalente Antikörper an die mit einer chemischen Komponente markierte Zielzelle und das cytotoxische Agens bindet und dadurch das cytotoxische Agens an die Ziel zeilen überbringt.
.4. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, worin:
(a) das monospezifisch bindende Protein ein Antikörper-Fragment, z.B. ein Fab, ist; oder
(b) das monospezifisch bindende Protein ein einzelkettiges Fusionsprotein, z.B. ein Single-chain Antikörper, ist; oder
(c) die markierende chemische Komponente der Linker ist, der variable Regionen eines einzelkettigen Fusionsproteins verbindet; oder
(d) die markierende chemische Komponente ein Epitop des monospezifisch bindenden Proteins ist, das an die Zielzelle gebunden ist.
5. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, worin die markierende chemische Komponente ein Peptid-Tag ist, das z.B. die Aminosäure-Sequenz (SEQ ID Nr. 5) umfaßt
6. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, worin die Struktur der chemischen Komponente derart verändert ist, so daß die Bindungsaffinität eines multivalenten Antikörpers für die chemische Komponente verringert ist.
7. Verwendung nach Anspruch 5, worin das Peptid-Tag eine Aminosäure-Sequenz umfaßt, die derart verändert ist, so daß die Bindungsaffinität eines multivalenten Antikörpers für das Peptid-Tag verringert ist.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3, worin der multivalente Antikörper ein heterobispezifischer Antikörper, zum Beispiel ein vernetztes Antikörper- Fragment, z.B. ein Fab Fragment, ist.
9. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, worin der multivalente Antikörper ein homodimeres IgG Molekül ist.
10. Verwendung nach Anspruch 8, worin (a) eine Bindungsstelle des heterobispezifischen Antikörpers mit einem Zelloberflächenmarker auf einem cytotokischen Lymphocyten reaktiv ist, und zum Beispiel worin eine Bindungsstelle mit dem Zelloberflächenmarker CD3 reaktiv ist; oder (b) eine Bindungsstelle des Antikörpers mit einer cytotoxischen Chemikahe reaktiv ist.
11. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 31 worin das monospezifisch bindende Protein eine Mischung aus mehr als einem Typ monospezifisch bindenden Proteins umfaßt, wobei jeder bindende Protein-Typ mit einem unterschiedlichen Zelloberflächenmarker auf der Zielzelle reaktiv ist.
12. Verwendung eines monospezifisch bindenden Proteins, das mit einer chemischen Komponente markiert ist und mit einem oder mehreren natürlich vorkommenden Zelloberflächenmarkern auf einer Zielzelle reaktiv ist, und eines multivalenten Antikörpers mit einer Bindungsstelle, die mit der chemischen Komponente re aktiv ist, und einer anderen Bindungsstelle, die mit einem bilderzeugenden Agens reaktiv ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in Therapie oder Diagnose, die eine bildliche Darstellung spezi fischen Gewebes in einem Wirt einschließt und die Schritte umfaßt:
(a) Verabreichen des monospezifisch bindenden Proteins, das mit einem oder mehreren Zelloberflächenmarkern auf einer Zielzelle reaktiv ist, an den Wirt unter Bedingungen, bei denen das monospezifisch bindende Protein an den Zelloberflächenmarker bindet, wobei das monospezifisch bindende Protein mit einer chemischen Komponente markiert ist; und
(b) Verabreichen des multivalenten Antikörpers an den Wirt unter Bedingungen, bei denen der multivalente Antikörper an die mit einer chemischen Komponente markierte Zielzelle und das bilderzeugende Agens bindet, und dadurch das bilderzeugende Agens an die Zielzelle überbringt.
13. Verwendung eines bispezifisch bindenden Proteins, das eine Bindungsstelle besitzt, die mit einer chemischen Komponente reaktiv ist, und mit einem oder mehreren natürlich vorkommenden Zelloberflächenmarkern äuf einer Zielzelle reaktiv ist, und eines multivalenten Antikörpers mit einer Bindungsstelle, die mit der chemischen Komponente markiert ist, und einer anderen Bindungsstelle, die mit einem Agens reaktiv ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in Therapie oder Diagnose, die das Überbringen eines Agens an Zielzellen in einem Wirt einschließt und umfaßt:
(a) Verabreichen des bispezifisch bindenden Proteins an den Wirt; und
(b) Verabreichen des multivalenten Antikörpers an den Wirt unter Bedingungen, bei denen der markierte multivalente Antikörper an das bispezifisch bindende Protein und das Agens bindet, und dadurch das Agens an die Zielzelle überbringt.
14. Verwendung nach Anspruch 13, worin das bispezifisch bindende Protein ein bispezifisches einzelkettiges Fusionsprotein, z.B. ein chimäres Single-chain Fv Protein-Analogon, ist.
15. Verwendung eines monospezifisch bindenden Proteins, das mit einer chemischen Komponente markiert ist und mit einem oder mehreren natürlich vorkommenden Zelloberflächenmarkern auf einer Zielzelle reaktiv ist, und eines multivalenten Antikörpers mit einer Bindungsstelle, die mit einem Agens reaktiv ist, und einer anderen Bindungsstelle, die mit der chemischen Komponente reaktiv ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in Therapie oder Diagnose, die das Überbringen eines Agens an Zielzellen in einem Wirt einschließt und die Schritte umfaßt:
(a) Verabreichen des monospezifisch bindenden Proteins an den Wirt;
(b) Bereitstellen des multivalenten Antikörpers;
(c) In-Kontakt-Bringen besagten multivalenten Antikörpers mit dem Agens unter Bedingungen, bei denen das Agens an den multivalenten Antikörper bindet und zu einem Agens-gebundenen multivalenten Antikörper führt; und
(d) Verabreichen des Agens-gebundenen multivalenten Antikörpers an den Wirt unter Bedingungen&sub1; bei denen der multivalente Antikörper an die mit einer chemischen Komponente markierte Zielzelle bindet, und dadurch das Agens an die Zielzelle überbringt.
16. Material zur Verwendung in Therapie oder Diagnöse, das umfaßt:
(a) ein Agens zum Überbringen an Zielzellen in einem Wirt;
(b) ein monospezifisch bindendes Protein, das mit einem oder mehreren natürlich vorkommenden Zelloberflächenmarkern auf den Zielzellen reaktiv ist, unter Bedingungen, bei denen das monospezifisch bindende Protein an die Zelloberflächenmarker bindet, wobei das monospezifisch bindende Protein mit einer chemischen Komponente markiert ist; und
(c) einen multivalenten Antikörper mit einer Bindungsstelle, die mit der chemischen Komponente reaktiv ist, und einer anderen Bindungsstelle, die mit besagtem Agens reaktiv ist, unter Bedingungen, bei denen der multivalente Antikörper an die mit einer chemischen Komponente markierte Zielzelle und das Agens bindet, und dadurch das Agens an die Zielzellen überbringt.
17. Material nach Anspruch 16, worin eine Bindungsstelle des Antikörpers mit einem bilderzeugenden Agens reaktiv ist.
18. Material zur Verwendung in einer cytotoxischen Therapie, das umfaßt:
(a) ein cytotoxisches Agens zum Überbringen an Zielzellen in einem Wirt;
(b) ein monospezifisch bindendes Protein, das mit einem oder mehreren natürlich vorkommenden Zelloberflächenmarkern auf einer Zielzelle reaktiv ist, unter Bedingungen, bei denen das monospezifisch bindende Protein an die Zelloberflächenmarker bindet, wobei das monospezifisch bindende Protein mit einer chemischen Komponente markiert ist; und
(c) einen multivalenten Antikörper mit einer Bindungsstelle, die mit einer chemischen Komponente reaktiv ist, und einer anderen Bindungsstelle, die mit einem cytotoxischen Agens reaktiv ist, unter Bedingungen, bei denen der multivalente Antikörper an die mit einer chemischen Komponente markierte Zielzelle und das cytotoxische Agens bindet, und dadurch das cytotoxische Agens an die Zielzelle überbringt.
19. Material nach einem der Ansprüche 16, 17 und 18, das die zusätzlichen Merkmale nach einem der Ansprüche 4 bis 11 besitzt.
20. Material zur Verwendung in einer Immuntherapie, das umfaßt:
(a) ein monospezifisch bindendes Protein, das mit einem oder mehreren natürlich vorkommenden Zelloberflächenmarkern auf einer Zielzelle reaktiv ist&sub1; unter Bedingungen, bei denen das monospezifisch bindende Protein an die Zelloberflächenmarker bindet, wobei das monospezifisch bindende Protein mit einer chemischen Komponente markiert ist; und
(b) einen multivalenten Antikörper mit einer Bindungsstelle, die mit einer chemischen Komponente reaktiv ist, und einer anderen Bindungsstelle, die mit einem cytotoxischen Lymphocyten reaktiv ist, unter Bedingungen, bei denen der multivalente Antikörper an die mit einer chemischen Komponente markierte Zielzelle und den cytotoxischen Lymphocyten bindet, und dadurch den cytotoxischen Lymphocyten an die Zielzelle überbringt.
21. Material zur Verwendung bei einer bildlichen Darstellung spezifischen Gewebes in einem Wirt, das umfaßt:
(a) ein monospezifisch bindendes Protein, das mit einem oder mehreren natürlich vorkommenden Zelloberflächenmarkern auf einer Zielzelle reaktiv ist, unter Bedingungen, bei denen das monospezifisch bindende Protein an den Zelloberflächenmarker bindet, wobei das monospezifisch bindende Protein mit einer chemischen Komponente markiert ist; und
(b) einen multivalenten Antikörper mit einer Bindungsstelle, die mit einer chemischen Komponente reaktiv ist, und einer anderen Bindungsstelle, die mit einem bilderzeugenden Agens reaktiv ist, unter Bedingungen, bei denen der multivalente Antikörper an die mit einer chemischen Komponente markierte Zielzelle und das bilderzeugende Agens bindet, und dadurch das bilderzeugende Agens an die Zielzelle überbringt.
22. Material zur Verwendung in Therapie oder Diagnose, das umfaßt:
(a) ein Agens zum Überbringen an Zielzellen in einem Wirt;
(b) ein bispezifisch bindendes Protein, das mit einem oder mehreren natürlich vorkommenden Zelloberflächenmarkern auf einer Zielzelle reaktiv ist, unter Bedingungen, bei denen das bispezifisch bindende Protein an den Zelloberflächenmarker bindet, wobei das bispezifisch bindende Protein eine mit einer chemischen Komponente reaktive Bindungsstelle besitzt; und
(c) einen multivalenten Antikörper, der eine mit einer chemischen Komponente markierte Bindungsstelle und eine andere mit einem Agens reaktive Bindungsstelle besitzt, unter Bedingungen, bei denen der markierte multivalente Antikörper an das bispezifisch bindende Protein und das Agens bindet, und dadurch das Agens an die Zielzelle überbringt.
23. Material nach Anspruch 22, worin das bispezifisch bindende Protein ein bispezifisches einzelkettiges Fusionsprotein, z.B. ein chimäres Single-chain Fv Protein-Analogon, ist.
24. Material zur Verwendung in Therapie und Diagnose, das umfaßt:
(a) ein Agens zum Überbringen an Zielzellen in einem Wirt;
(b) ein monospezifisch bindendes Protein, das mit einem oder mehreren natürlich vorkommenden Zelloberflächenmarkern auf einer Zielzelle reaktiv ist, unter Bedingungen, bei denen das monospezifisch bindende Protein an den Zelloberflächenmarker bindet, wobei das monospezifisch bindende Protein mit einer chemischen Komponente markiert ist; und
(c) einen multivalenten Antikörper, der an das Agens über eine Bindungsstelle gebunden istund eine andere Bindungsstelle besitzt, die mit einer chemischen Komponente reaktiv ist, unter Bedingungen, bei denen der multivalente Antikörper an die mit einer chemischen Komponente markierte Zielzelle bindet, und dadurch das Agens an die Zielzelle überbringt.
DE69406423T 1993-01-08 1994-01-07 Methode zum überbringen von agenzien an zielzellen Expired - Fee Related DE69406423T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/002,324 US5861156A (en) 1993-01-08 1993-01-08 Methods of delivering agents to target cells
PCT/US1994/000261 WO1994015642A1 (en) 1993-01-08 1994-01-07 Methods of delivering agents to target cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69406423D1 DE69406423D1 (de) 1997-11-27
DE69406423T2 true DE69406423T2 (de) 1998-09-03

Family

ID=21700250

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69406423T Expired - Fee Related DE69406423T2 (de) 1993-01-08 1994-01-07 Methode zum überbringen von agenzien an zielzellen

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5861156A (de)
EP (1) EP0679093B1 (de)
JP (1) JPH08505623A (de)
AT (1) ATE159429T1 (de)
AU (1) AU673581B2 (de)
CA (1) CA2153568A1 (de)
DE (1) DE69406423T2 (de)
ES (1) ES2113088T3 (de)
WO (1) WO1994015642A1 (de)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5888773A (en) * 1994-08-17 1999-03-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing single-chain Fv molecules
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
US6696251B1 (en) 1996-05-31 2004-02-24 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
WO1998008875A1 (de) * 1996-08-28 1998-03-05 Viva Diagnostika Diagnostische Produkte Gmbh Kombinationspräparationen und ihre verwendung in der immundiagnostik und immuntherapie
FR2766826B1 (fr) * 1997-08-04 2001-05-18 Pasteur Institut Vecteurs derives d'anticorps pour le transfert de substances dans les cellules
CN1276830A (zh) * 1997-09-02 2000-12-13 住友制药株式会社 抗乙型肝炎病毒核心蛋白的单链抗体及其基因和含有它们的乙型肝炎治疗药物
US6958148B1 (en) 1998-01-20 2005-10-25 Pericor Science, Inc. Linkage of agents to body tissue using microparticles and transglutaminase
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
US6919076B1 (en) 1998-01-20 2005-07-19 Pericor Science, Inc. Conjugates of agents and transglutaminase substrate linking molecules
KR100425965B1 (ko) * 1998-02-20 2004-04-06 타녹스 인코퍼레이티드 보체 활성화의 억제물질
US6956107B2 (en) * 1998-02-20 2005-10-18 Tanox, Inc. Inhibitors of complement activation
US7112327B2 (en) * 1998-02-20 2006-09-26 Tanox, Inc. Inhibition of complement activation
CA2322969A1 (en) * 1998-03-20 1999-09-23 Genzyme Corporation Methods to provoke anti-cancer immune responses
AU5076301A (en) * 1999-12-06 2001-07-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois, The High affinity tcr proteins and methods
PT1265929E (pt) * 2000-03-23 2009-10-15 Genentech Inc Inibidores anti-c2/c2a de activação complementar
DK2857516T3 (en) 2000-04-11 2017-08-07 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses thereof
AU2002220275A1 (en) * 2000-12-08 2002-06-18 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Mutated class ii major histocompatibility proteins
US7445802B2 (en) * 2000-12-26 2008-11-04 Yeda Research And Development Co. Ltd Site-specific in situ generation of allicin using a targeted alliinase delivery system for the treatment of cancers, tumors, infectious diseases and other allicin-sensitive diseases
JP2005507659A (ja) * 2001-10-15 2005-03-24 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 直接ターゲッティング結合タンパク質
AU2003223775A1 (en) * 2002-04-30 2003-11-17 Duke University Adeno-associated viral vectors and methods for their production from hybrid adenovirus and for their use
AU2003280429A1 (en) * 2002-06-26 2004-01-19 The Trustees Of Columbia Uninersity In The City Of New York Use of streptavidin to inhibit transplant rejection
AU2003256446A1 (en) * 2002-07-05 2004-01-23 Roger Williams Medical Center Targeting and tracking of cells to specific organs and tissues in vivo
US9701754B1 (en) 2002-10-23 2017-07-11 City Of Hope Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof
WO2004050023A2 (en) 2002-11-27 2004-06-17 Dmi Biosciences, Inc. Treatment of diseases and conditions mediated by increased phosphorylation
GB2408507B (en) * 2003-10-06 2005-12-14 Proimmune Ltd Chimeric MHC protein and oligomer thereof for specific targeting
US9493538B2 (en) * 2004-05-28 2016-11-15 University Of Massachusetts Snares for pathogenic or infectious agents and uses related thereto
US7423128B2 (en) * 2004-11-03 2008-09-09 Amgen Fremont Inc. Anti-properdin antibodies, and methods for making and using same
MX337061B (es) * 2005-11-04 2016-02-11 Genentech Inc Uso de inhibidores de la via del complemento para tratar enfermedades oculares.
JP2009531324A (ja) * 2006-03-20 2009-09-03 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 癌標的化のための操作された抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体
GB2442048B (en) * 2006-07-25 2009-09-30 Proimmune Ltd Biotinylated MHC complexes and their uses
MY157948A (en) 2006-11-02 2016-08-30 Genentech Inc Humanized anti-factor d antibodies
JP6126773B2 (ja) 2007-09-04 2017-05-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 癌のターゲッティングおよび検出のための高親和性抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体
JP5951929B2 (ja) * 2007-10-03 2016-07-13 コーネル ユニヴァーシティー Ｐｓｍａ抗体を用いる増殖性障害の治療
CR20170001A (es) 2008-04-28 2017-08-10 Genentech Inc Anticuerpos anti factor d humanizados
US20100016782A1 (en) * 2008-07-16 2010-01-21 John Erich Oblong Method of Regulating Hair Growth
US20100069616A1 (en) * 2008-08-06 2010-03-18 The Regents Of The University Of California Engineered antibody-nanoparticle conjugates
US10517969B2 (en) * 2009-02-17 2019-12-31 Cornell University Methods and kits for diagnosis of cancer and prediction of therapeutic value
JP6251477B2 (ja) 2009-12-02 2017-12-20 イマジナブ・インコーポレーテッド ヒト前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）をターゲッティングするｊ５９１ミニボディおよびｃｙｓダイアボディならびにこれらを使用するための方法
CN107011311A (zh) * 2010-10-22 2017-08-04 斯特拉斯堡大学 用于治疗HSP90相关病状的Pochoxime缀合物
CA2821080C (en) 2010-12-14 2021-02-02 University Of Maryland, Baltimore Universal anti-tag chimeric antigen receptor-expressing t cells and methods of treating cancer
WO2014100615A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Purdue Research Foundation Chimeric antigen receptor-expressing t cells as anti-cancer therapeutics
CR20160132A (es) 2013-08-12 2016-08-25 Genentech Inc Composiciones y método para tratar condiciones asociadas con el complemento
CN105829349B (zh) 2013-10-15 2023-02-03 斯克利普斯研究所 肽嵌合抗原受体t细胞开关和其用途
MX2016014160A (es) 2014-05-01 2017-02-16 Genentech Inc Variantes del anticuerpo anti-factor d y sus usos.
WO2016154621A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 The California Institute For Biomedical Research SWITCHABLE NON-scFv CHIMERIC RECEPTORS, SWITCHES, AND USES THEREOF
EP3283113A4 (de) 2015-04-15 2018-12-05 The California Institute for Biomedical Research Optimierte pne-basierte chimäre t-zell-rezeptor-schalter und verwendungen davon
JP7026613B2 (ja) 2015-08-07 2022-02-28 イマジナブ・インコーポレーテッド 標的分子に対する抗原結合コンストラクト
CN108472382A (zh) 2015-10-30 2018-08-31 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-因子d抗体变体缀合物及其用途
WO2017075173A2 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Genentech, Inc. Anti-factor d antibodies and conjugates
EP3439675A4 (de) 2016-04-08 2019-12-18 Purdue Research Foundation Verfahren und zusammensetzungen für car-t-zelltherapie
KR102613430B1 (ko) 2016-10-19 2023-12-18 더 스크립스 리서치 인스티튜트 인간화된 표적화 모이어티 및/또는 최적화된 키메라 항원 수용체-상호작용 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 효과기 세포 스위치 및 이의 용도
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
US11850262B2 (en) 2017-02-28 2023-12-26 Purdue Research Foundation Compositions and methods for CAR T cell therapy
US11311576B2 (en) 2018-01-22 2022-04-26 Seattle Children's Hospital Methods of use for CAR T cells
AU2019225174B2 (en) 2018-02-23 2025-11-20 Endocyte, Inc. Sequencing method for CAR T cell therapy
WO2023179370A1 (en) * 2022-03-21 2023-09-28 The Hong Kong Polytechnic University Peptidic bispecific antibody, methods for preparation and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4676980A (en) * 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5091513A (en) * 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5084398A (en) * 1987-11-20 1992-01-28 Creative Biomolecules Selective removal of immune complexes

Also Published As

Publication number Publication date
ATE159429T1 (de) 1997-11-15
EP0679093A1 (de) 1995-11-02
CA2153568A1 (en) 1994-07-21
AU673581B2 (en) 1996-11-14
WO1994015642A1 (en) 1994-07-21
EP0679093B1 (de) 1997-10-22
DE69406423D1 (de) 1997-11-27
JPH08505623A (ja) 1996-06-18
ES2113088T3 (es) 1998-04-16
AU6084694A (en) 1994-08-15
US5861156A (en) 1999-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69406423T2 (de) Methode zum überbringen von agenzien an zielzellen
AU664992B2 (en) Tetravalent bispecific receptors, the preparation and use thereof
DE69309472T2 (de) Fusionsproteine von monomeren und dimeren von antikörperfragmenten
EP0404097B1 (de) Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente Rezeptoren, ihre Herstellung und Verwendung
DE3853515T2 (de) Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
DE69633175T2 (de) Multimere proteine
DE69327229T2 (de) Multivalente einkettige Antikörper
EP1444268B1 (de) Bispezifisches anti-cd28 antikörper-molekül
DE69719529T2 (de) Nichtantigenes toxinkonjugat und fusionsprotein eines internalisierendes rezeptorsystems
DE69531148T2 (de) Bibliotheken aus polyklonalen antikörpern
DE68913658T3 (de) Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
DE69129421T3 (de) Interleukin 2 enthaltende rekombinante Immunkonjugate für die Therapie
DE69414870T2 (de) Antikoerper mit geaenderter zielrichtung
EP3505536A1 (de) Antikörper gegen das prostata-spezifische stammzellantigen und dessen verwendung
EP1206555B1 (de) Fv-antikörper-konstrukte mit bindungsstellen für einen cd16-rezeptor und ein cd30-oberflächenprotein
EP1141271B1 (de) Selektion von monoklonalen antikörpern
EP1287036A1 (de) Trivalente antikörperkonstrukte mit disulfid-brücken stabilisierten variablen regionen
EP1090927A1 (de) Polypeptide (scFv) zur Detektion und Elimination CA19-9 antigen positiver Zellen
EP1315760A2 (de) Endoglin spezifisches polypeptid, seine herstellung und verwendung
DE10019967A1 (de) Antikörper gegen natives gp96, deren Herstellung und Verwendung
DE69133287T2 (de) An tag-72 bindende zusammengesetzte antikörper mit der humanen leichten kette der untergruppe-iv
DE10060140A1 (de) Multimerer mehrfach-antigenbindender einzelkettiger Antikörper
DE10020034A1 (de) Mittel zur Diagnose und Therapie von Karzinomen

Legal Events

Date Code Title Description
8332 No legal effect for de
8370 Indication related to discontinuation of the patent is to be deleted
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee