[go: up one dir, main page]

WO1998008875A1 - Kombinationspräparationen und ihre verwendung in der immundiagnostik und immuntherapie - Google Patents

Kombinationspräparationen und ihre verwendung in der immundiagnostik und immuntherapie Download PDF

Info

Publication number
WO1998008875A1
WO1998008875A1 PCT/EP1997/004493 EP9704493W WO9808875A1 WO 1998008875 A1 WO1998008875 A1 WO 1998008875A1 EP 9704493 W EP9704493 W EP 9704493W WO 9808875 A1 WO9808875 A1 WO 9808875A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
component
biological
agent
antibody
combination preparations
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP1997/004493
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Heribert Bohlen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
VIVA DIAGNOSTIKA DIAGNOSTISCHE PRODUKTE GmbH
Original Assignee
VIVA DIAGNOSTIKA DIAGNOSTISCHE PRODUKTE GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19634730A external-priority patent/DE19634730A1/de
Priority claimed from DE1997103699 external-priority patent/DE19703699A1/de
Application filed by VIVA DIAGNOSTIKA DIAGNOSTISCHE PRODUKTE GmbH filed Critical VIVA DIAGNOSTIKA DIAGNOSTISCHE PRODUKTE GmbH
Priority to AU41193/97A priority Critical patent/AU4119397A/en
Publication of WO1998008875A1 publication Critical patent/WO1998008875A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific

Definitions

  • the present invention relates to a combination of three preparations or formulations (components) that can be used in immunology, consisting of at least one first component equipped or connected with a defined specific, immunologically reactive determinant Ha-], an at least bispecific second component with binding specificity for Ha -
  • components that can be used in immunology, consisting of at least one first component equipped or connected with a defined specific, immunologically reactive determinant Ha-], an at least bispecific second component with binding specificity for Ha -
  • the combination according to the invention is generally used in immunology, both in immunodiagnostics and as a prophylactic and therapeutic agent.
  • Body area for example topically, can be applied.
  • this method has the disadvantages that only parts of the body can be reached which are directly accessible and that the substance in question, due to diffusion processes, does not only act at the desired location and there with rapidly decreasing intensity.
  • bispecific antibodies have been developed which have two different antigen-specific binding sites: one for tumor-associated antigen, also called “target binding arm”, and another for the effector molecule (“effector binding arm”).
  • effector binding arm Such bispecific antibodies have a spectrum of potential uses both in immunodiagnostics, immunohistochemistry, immunohistology, immunocytology and in immunotherapy for the targeted application of cytotoxic, cytocidal or cytostatic substances.
  • bispecific antibodies have various advantages over the immunoconjugates: cytotoxic substances can be released at the desired target sites without prior cleavage of the covalent bond and non-specific toxic effects can be reduced.
  • Bispecific m antibodies for example of the IgG class
  • IgM immunoglobulin-like molecules
  • bispecific antibodies with dual specificity in immunoassays, in tumor “targeting”, for cross-linking ("cross-linking") cellular antigens and in "targeting" effector cells, for the specific release of active substances to target cells or for triggering effector cells which mediate cellular cytotoxicity after stimulation (for example phagocytic cells, natural killer cells [NK cells] or T-lymphocytes).
  • cross-linking cross-linking
  • effector cells for the specific release of active substances to target cells or for triggering effector cells which mediate cellular cytotoxicity after stimulation (for example phagocytic cells, natural killer cells [NK cells] or T-lymphocytes).
  • Bispecific antibodies are known which have been produced via hybrid hybridomas, which on the one hand have specificity against the CD3 protein (T-cell receptor complex) on the effector cell and on the other hand are specific against the IgK-1 b chain of the immunoglobulin of the rat (GILLILAND, LK et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7719-7723, 1 988).
  • This bispecific antibody was able to lyse the target cell in vitro in cooperation with T cells (mouse thymon).
  • BERG J. et al., Proc. Natl. Acad. Be.
  • Antibody fragments of the IgG2a type (Fab and F (ab ') 2> which react specifically with target cells (melanoma) and against CD3 and CD28, respectively.
  • Fab and F (ab ') 2> which react specifically with target cells (melanoma) and against CD3 and CD28, respectively.
  • These anti-melanoma x anti-CD3 and anti-melanoma x anti-CD28 conjugates destroyed the Target cells in vitro and open a systematic application in vivo for tumor therapy via T-cell stimulation.
  • a bispecific antibody was produced via chemical coupling ("cross-linking"), which was directed both against an epitope of the ⁇ chain of fibrin and against urokinase (scuPA).
  • This bispecific construct was able to increase both the fibrinolytic efficiency and the fibrin specificity of scuPA by significantly increasing fibrin monomers and plasma clumping with this antibody compared to the sole action of scuPA (CHARPIE, JR et al., Biochemistry 29, 6374-6378, 1990 ).
  • heteroconjugated bispecific antibodies An antiviral effect of heteroconjugated bispecific antibodies is described by STAERZ, UD et al., Eur. J. Immunol. 17, 571-574, 1 987.
  • the antibodies used were specific against T cell antigen receptor and specific against hemagututinin (HA) or against nucleoprotein of an influenza virus. As a result, the cells infected by the virus could be lysed.
  • hybrid-specific bispecific antibodies with dual specificity for TCR x HA influenza A fusion between IgG2b specifically against influenza virus HA and IgG2a specifically against Vß8 of TCR were successfully used to inhibit influenza virus replication.
  • CD4 + helper / killer cells by an anti-CD3 x anti-glioma bispecific antibody together with IL-2 activated CD4 + helper / killer cells caused an increase in cytotoxicity against glioma cells in vitro, so that an adoptive tumor immunotherapy was hereby proposed. It was also possible to inhibit colon tumor growth with a bispecific antibody of the specificity ant-c-erb-B2: ant-CD3 plus CD4 + positive cells (NISHIMURA, T. et al., J. Immunol. 148, 285-291, 1 992).
  • TNP 2,4,6 -Trinitrophenyl
  • activated macrophages have also been proposed as effector cells in conjunction with bispecific antibodies.
  • Initial clinical trials with such triggered macrophages are said to have confirmed increased tumor lysis (BAUER, T. & DRAKEMAN, DL, Vox Sang 61, 1 56 - 1 57, 1 991).
  • Peripheral mononuclear blood cells (PBMCs) as effector cells are described by MENARD, S. et al., Int. J. Biol. Markers 4 (3), 1 31 - 1 34, 1 989, wherein an anti-CD3 x anti-ovarian cancer antibody was used as the bispecific reagent for the lysis of the target cells (ovarian cancer).
  • bispecific antibodies are suitable for use in immunodiagnostic assays (ELISA) and in immunohistochemistry.
  • ELISA immunodiagnostic assays
  • An example of this application is described by MILSTEIN, C. & CUELLO, AL, Nature 305, 537-540, 1983.
  • bispecific antibodies could be immunohistochemically treated with an anti-matostatin x anti-peroxidase antibody in certain pituitary regions be detected.
  • MICHAELSEN TE, Eur. J. Immunol. 21, 1 1 - 1 6, 1991, produced chimeric anti- (4-hydroxy-3-nitrophenyl) acetyl (NP) antibodies which also reacted with the hapten p-nitrophenyl phosphate (NIP) to provide complement-mediated lytic properties of IgG isotypes.
  • NIP hapten p-nitrophenyl phosphate
  • bispecific antibodies In addition to the aforementioned uses, specific, dual bonds to CD3 and CD25 (p55 chain of the IL-2 receptor) have been described for bispecific antibodies.
  • anti-CD3: anti-CD25 bispecific antibody was able to selectively bind to activated CD25-expressing T cells and lymphoma, both antigens CD3 and CD25 being recognized and being co-expressed by activated T cells.
  • T cells are the main mediators in ?
  • ant ⁇ -CD3 ant ⁇ -CD25 bispecific monoclonal antibodies cause cytolysis of CD25-bearing alloreactive T cells and in cytotoxic T lymphocytes (CTL) with undefined specificity.
  • an effective CTL stimulation could be achieved by the anti-CD3: anti-IL-2 receptor (anti-CD25) bispecific antibody in order to stimulate T-cells stimulated by CDA antigen-bearing PHA (phytohemagglutinin) and IL-2 receptor positive tumor cells lyse.
  • CD3 CD19 bispecific antibody T cells from patients with chronic lymphocytic leukemia, in combination with monospecific, bivalent anti-CD28 antibodies, could be activated.
  • CD4 "1" T cells were activated and stimulated to proliferate. It was clearly possible to achieve a sharp decrease in the number of CD19 + malignant B cells, whereas both with anti-CD3: anti-CD1 9 bispecific antibodies on their own and with the individual antibodies anti-CD3 plus anti-CD19 plus anti -CD28 no such decrease could be achieved, but also no stimulation of CD2 +, CD4 + and CD25 + T lymphocytes.
  • only the combination anti-CD3: anti-CD19 plus anti-CD28 could achieve cytotoxicity against autologous malignant B cells.
  • T cell activation was obtained even with very low doses of the antibodies used (1 ng / ml).
  • Stimulation of T cells with the combination of bispecific and monospecific, bivalent antibodies mentioned was associated with a sharp increase in IL-2, IL-6 and interferon- ⁇ secretion of the T cells in question.
  • Such a procedure is proposed for the therapy of chronic lymphocytic leukemia (BOHLEN, H. et al., Blood 82, 1 803 - 1 81 2, 1 993). 2
  • bispecific antibodies also in combination with other anti-CD antibodies, are described in the diverse literature and are known to the person skilled in the art. Inter alia, the corresponding review articles and the others in the publication by BOHLEN, H. et al. , 1 993, loc cit., Literature cited.
  • an antigen e.g. epitope, target cell, surface receptor
  • the production of a completely new bispecific antibody is necessary.
  • large molecules e.g.
  • bispecific antibody the binding properties of the bispecific antibody in question can be changed or deteriorated, which leads to problems with, for example, immunohistochemical or immunocytological labels with dyes and enzymes or with diagnostic Test systems, but can also lead to immunotherapy measures.
  • the number of conjugates to be synthesized is the same is the number of molecules selected per antibody.
  • a large number of end products result. For example, for 100 antibodies with different specificity and for example 5 different reporter or effector molecules, 500 different products would have to be produced in order to bring the desired reporter or effector molecules to the desired location (for example for test purposes).
  • the object of the present invention was to provide means and new methods which overcome the disadvantages of the prior art.
  • a combination preparation consisting of at least one with a defined specific, immunologically reactive determinant Ha -
  • Ha2 or is or are connected with several such determinants Ha n , where Ha -
  • the first binding-specific component 1 associated with a determinant Ha-] comprises a reagent with specific binding properties which enables it to bind to cells, tissues or specific structures of the animal and human body in vitro and in vivo.
  • the reagent comprises a protein, preferably an immunoglobulin or antibody or a fragment or derivative thereof or any ligand with the above-mentioned binding properties or specificities for an antigenic binding site, for example a lectin, or adhesion molecules, cytokines or chemokines, which are known, that they recognize receptors and other binding sites of tissues, cells or structures of the body and can attach them there specifically and specifically.
  • An antibody is preferred for this first component.
  • the second, at least bispecific component 2 comprises an agent or reagent with at least bispecific properties, for example an inert particle or a protein with specificity for at least two determinants, it being possible for the protein to be a ligand, for example an immunoglobulin or antibody or a lectin, or from any linker molecule which has binding specificity for the desired determinants Ha-], Ha2 or Ha n , where at least one determinant recognition site is complementary for Ha i ( another for Ha2 or one or more others for Ha n is preferred a bispecific antibody with anti-Ha-] and anti-Ha2 specificity, which can react with at least two different determinants, one reaction partner being the determinant Ha-] and the other Ha2, with Hai and Ha2 being different.
  • an agent or reagent with at least bispecific properties for example an inert particle or a protein with specificity for at least two determinants, it being possible for the protein to be a ligand, for example an immunoglobulin or antibody or a
  • the third component 3 of the combination according to the invention is an effector molecule or a reporter molecule associated with a determinant Ha2, preferably an antibody, any marker substance, an enzyme, a radioactive substance, a contrast agent, biologically active substances, a cytostatic, cytocidal or cytotoxic effect Agents or any substances and antigens, as well as adhesion molecules, cytokines or chemokines, which are known to recognize specific binding sites on cells or structures of the body of a mammal and to attach them there specifically and in a targeted manner. //
  • the combination preparations according to the invention find broad, universal use in immunology, in particular in the field of immunodiagnostics, immunohistochemistry or immunohistology, immunocytology and immunotherapy.
  • the area of application also includes the prognosis and determination of disease states in which the combination preparations according to the invention have an effect, but also the prophylactic use, for example for preventing the outbreak or the development of a disease state or for preventing an exacerbation of a disease state.
  • combination preparations according to the invention are broad and universally usable in the therapeutic treatment of diseases which are known to be accessible to immunological, therapeutic methods. This applies in particular to infectious diseases and diseases that are based on a tumor.
  • the combinations according to the invention are equally outstanding in the case of immunization or for vaccination, in particular with tumor proteins.
  • the present invention consists of three components or formulations, the core of the combination according to the invention being the use of an at least bispecific agent or reagent which has specificity for at least two mutually different determinants Ha-] and Ha2 or Ha n .
  • the present invention does not only include the combination of the three preparations mentioned.
  • Another object of the invention is therefore the use of an agent or immunolinker in vivo and in vitro with binding specificity for at least two different determinants for connecting at least two agents or reagents equipped with different determinants both in diagnostics, in therapy and in immunotherapy or for immunization purposes.
  • the principle on which the invention is based is that those with at least one determinant Ha-
  • Adhesion molecule binding site or with a sugar residue specifically reacts and binds to them via their determinant Ha -j or determinants Ha n with the corresponding anti-Ha -] or ant ⁇ -Ha n specificity of an at least bispecific component 2 (with anti-Ha -
  • the individual components are to be understood as a functional unit, according to which both a common targeted use of these three individual components and the spatial juxtaposition of these individual means (as kit-of-parts) are included.
  • component 2 per se for immunological purposes is also included in the manufacture of a preparation for connecting at least two different agents or molecules or reagents each equipped with at least two mutually different determinants.
  • , Ha2 or Ha n are, according to the invention, haptens, specific, couplable antigenic structures, epitopes, paratopes, idiotopes. Haptens are included as preferred determinants Ha-, Ha2 and Ha n .
  • Component 1 (T): X— Ha -]
  • Component 2 anti-Ha -
  • Component 3 Ha2 - Z or Ha n - Z
  • (T) a target or a "target", in particular a specific, biological binding structure or binding site, for example on the surface of a cell or a membrane or a part thereof, for example an antigen, an allergen, an epitope, a receptor, a Adscosionsmolekülbindu ⁇ gsstelle, a sugar residue, a drug, a toxin, what, without the involvement of a determinant Ha j, X - Ha
  • X is a reagent equipped or linked with a determinant Ha -], which can be m ⁇ nospecific with regard to its target location (T), for example comprising a protein, an immunoglobulin or an antibody or a derivative or fragment thereof, a ligand, a lectin, a receptor binding molecule, an adhesion molecule, a cytokine, a chemokine, a lymphokine,
  • T target location
  • Ha-j a defined specific, immunologically reactive determinant, for example comprising a hapten, a specific couplable antigenic structure, an epitope, a paratope, an idiotope, Y an at least for at least two determinants Ha-
  • the reagent X can bind to a specific biological binding structure or to parts thereof, for example comprising a cell surface structure , an antigen, an allergen, an epitope, a receptor, an adhesion molecule binding site or parts of the structures mentioned, or a sugar residue, a drug, a toxin.
  • Such a specific, biological binding structure or parts thereof can be of natural origin or can be produced synthetically or semi-synthetically via DNA recombination, or, in particular with regard to antigens and epitopes, can originate from or be contained in biological and non-biological liquids.
  • component 2 is to be understood as a universally applicable "immunolinker” or immunological linker module, which has the function of being equipped, for example, with at least one determinant (Ha2 or H a n) haptenized, component 3, as defined above via a determinant Ha- with a certain determinant different from Ha2 or Ha n ] equipped or connected, for example haptenized, monospecific component 1, as defined above, to a targeted location (T), as defined above.
  • determinant Ha2 or H a n
  • component 3 determinant haptenized, component 3, as defined above via a determinant Ha- with a certain determinant different from Ha2 or Ha n ] equipped or connected, for example haptenized, monospecific component 1, as defined above, to a targeted location (T), as defined above.
  • component 1 which has specificity for the relevant target location at which an effect is desired.
  • Component 3 is therefore to be understood in the narrower sense as a carrier which enables the desired effect.
  • any determinants Ha2 or Ha n which are different, for example different haptens among themselves, are coupled to Z and any at least bispecific reagents Y with corresponding anti-Ha2 or anti-Ha n specificities can bind non-covalently with each other. It is crucial here that the individual determinants are chosen so that they are different from one another.
  • a combination preparation is preferred in which X and Z are reagents or agents equipped or linked with haptens, in which Y is an at least bispecific antibody which has anti-Ha - and anti-Ha2 or anti-Ha n specificities and where Z is a biologically, chemically or physically active or detectable agent equipped or connected with at least one hapten Ha2.
  • a binding-specific component 1 connected to a hapten Ha-] comprises a reagent with specific binding properties which enables it to bind to cells, tissues or specific structures of the animal and human body.
  • the reagent comprises a protein, preferably an immunoglobulin or antibody or a fragment or derivative thereof or any ligand with the above-mentioned binding properties or specificities for an antigenic binding site, for example a lectin, or adhesive molecules, cytokines or chemokines, which are known, that they recognize receptors and other binding sites of tissues, cells or structures of the body and can attach them there specifically and specifically.
  • the second, at least bispecific component 2 preferably comprises an agent or reagent with at least bispecific properties, in particular an inert particle or a protein with specificity for at least two haptens, it being possible for the protein to be a ligand, for example an immunoglobulin or Antibodies or a lectin, or from any linker molecule which has binding specificity for the desired haptens Ha -], Ha2 or Ha n , where at least one hapten recognition site is complementary for Ha- ] another for Ha2 or another for Ha n .
  • an agent or reagent with at least bispecific properties in particular an inert particle or a protein with specificity for at least two haptens, it being possible for the protein to be a ligand, for example an immunoglobulin or Antibodies or a lectin, or from any linker molecule which has binding specificity for the desired haptens Ha -], Ha2 or Ha n , where at least one hapten recognition site is complementary for Ha-
  • the third component 3 of the combination according to the invention is preferably an effector molecule or a reporter molecule connected to a hapten Ha2, preferably an antibody, any marker substance, an enzyme, a radioactive substance, a contrast medium, biologically active substances cytostatic, cytocidal or cytotoxic agent or any substances and antigens, as well as adhesion molecules, cytokines or chemokines, which are known, for example, to recognize specific binding sites on cells 5 or structures of the body of a mammal and to attach them there specifically and in a targeted manner.
  • a hapten Ha2 preferably an antibody, any marker substance, an enzyme, a radioactive substance, a contrast medium, biologically active substances cytostatic, cytocidal or cytotoxic agent or any substances and antigens, as well as adhesion molecules, cytokines or chemokines, which are known, for example, to recognize specific binding sites on cells 5 or structures of the body of a mammal and to attach them there specifically and in a targeted manner.
  • a combination preparation in which X is a protein equipped or linked with a hapten Ha -], in which Y is an at least 0 bispecific antibody which has anti-Ha-] and anti-Ha2 or anti-Ha n specificities is particularly preferred and in which Z is a biologically, chemically or physically active or detectable agent equipped or connected with at least one hapten Ha2 or Ha n .
  • a combination preparation is very preferred, in which X is an antibody linked to a hapten Ha -], which reacts with an antigen as a specific binding structure, in which Y is a bispecific antibody, the anti-Ha -
  • a combination preparation as mentioned above is preferred,
  • Z is an effector molecule linked to a hapten, an antibody, a radioactive substance, a biologically active one Substance, a cytotoxic, cytocidal, cytostatic or cytolytic agent, if the combination preparation, preferably in vivo, for immunotherapeutic or prophylactic purposes or in the prognosis and
  • a very particularly preferred combination preparation is that X is a with a hapten Ha-
  • a special, exemplary embodiment of the combination preparation according to the invention can then exist that Ha-
  • NP nitrophenylde ⁇ vat
  • DNP 2,4-d ⁇ n ⁇ trophenol
  • Z is a steroid hapten, for example digoxigenin ( ⁇ 20:22 -3 / ?, 1 2 / 914,21 - tetrahydroxy
  • a further exemplary embodiment of the combination preparations according to the invention can be that X is a protein, for example KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) or OKT3 antibody, which with DNP as hapten Ha -
  • KLH Keyhole Limpet Hemocyanin
  • OKT3 antibody which with DNP as hapten Ha -
  • Y is a bispecific, monoclonal antibody which has anti-DNP: anti-DIG specificities and where Z is an enzyme, a dye or a T cell which are conjugated or linked to DIG.
  • the invention also encompasses the use of an agent provided with at least bispecific specificity for at least two different haptens, according to the definition for Y given in Table or according to claim 2 and the dependent claims dependent thereon, for producing a combination preparation for use in immunology for diagnostic purposes , prophylactic, therapeutic purposes and for immunizations.
  • a still further aspect of the present invention is the use of the combination preparations for the production of an agent for immunodiagnostic purposes.
  • An additional aspect of the present invention is the use of the combination preparations for the preparation of agents for immunohistochemical, immuncytochemical, immunohistological purposes and for immunoassays.
  • a further additional aspect is the use of the combination preparations according to the invention for "imaging”. i.e. for the detection and localization of cells and / or tissues in vitro and in vivo, which can be both in normal, non-pathological form and may be degenerate or can be specifically changed by other pathological events and processes.
  • Another aspect of the present invention is the use of the combination preparations for the production of an agent or a pharmaceutical composition, optionally together with physiologically compatible carriers and additives, for the prognosis and determination in vitro and in vivo of disease states in or outside a mammalian organism.
  • Another aspect of the present invention is the use of the combination preparations for producing a pharmaceutical composition, optionally together with physiologically compatible carriers and additives, for the immunotherapy of malignant tumors.
  • a still further aspect of the present invention is the use of the combination preparations for the production of a pharmaceutical composition, optionally together with physiologically compatible carriers and additives, for the therapy of infectious diseases caused by viruses, bacteria, fungi or parasites.
  • An additional aspect of the present invention is the use of the combination preparations for the production of a pharmaceutical composition, optionally together with physiologically compatible carriers and additives, for the therapy of inflammatory diseases.
  • Another additional aspect of the present invention is the use of the combination preparations for the production of a pharmaceutical composition, optionally together with physiological Q compatible carriers and additives, for the therapy of
  • a still further aspect of the present invention is the use of the combination preparations for the production of a pharmaceutical composition, optionally together with physiologically compatible carriers and additives, for the acute treatment of rejection reactions.
  • An additional aspect of the present invention is the use of the combination preparations for the production of a pharmaceutical composition, optionally together with physiologically compatible carriers and additives, for the prophylactic treatment of tumor, inflammatory, infectious or autoimmune diseases or
  • combination preparations according to the invention for the production of a pharmaceutical composition, optionally together with physiologically compatible carriers and additives, for the therapy and prophylaxis of diseases which are associated with blood coagulation disorders (pathological blood clots within a mammalian organism) and which support or increase fibrinolysis.
  • blood coagulation disorders pathological blood clots within a mammalian organism
  • a further aspect of the present invention is the use of the combination preparations for the production of a pharmaceutical composition, optionally together with physiologically compatible carriers and additives for the immunization or vaccination of animals and humans, with, for example, tumor proteins by means of modulating antigens, for example those on ARC (antigen Presenting Cells).
  • ARC antigen Presenting Cells
  • the invention also includes the use of a component with at least bispecific specificities as defined in Table 1 (anti-Ha-] - Y - anti-Ha2 or anti-Ha-] - Y - anti-Ha2). for the production of an agent which can be used in immunodiagnostics and immunotherapy or a pharmaceutical preparation with the functional property of an immunolinker, in particular in immunohistochemistry, immunocytology, the 2o immunohistology, in immunoassays as well as in prognosis, prophylaxis and
  • Rejection reactions to achieve immunosuppression, to prevent disease exacerbation, to predict or to determine
  • the invention accordingly includes pharmaceutical formulations and their uses, as described above, which consist of components 1, 2 and 3 or of components 1 and 2 or which consist only of component 2.
  • Further aspects of the present invention include methods for determining whether agents with biological, chemical or physical properties in in vitro or in vivo diagnostics or immunodiagnostics, in immunotherapy (including prophylactic treatments) or in immunizations, in the sense of the uses indicated above, can develop or show suitable biological, chemical or physical effects that are considered as potential candidates, but of which the desired effect is not known a priori.
  • Yet further aspects of the present invention include methods for screening (searching, testing) a plurality of agents with biological, chemical or physical properties for the purposes of in vitro or in vivo diagnostics or immunodiagnostics, for immunotherapy (including prophylactic treatments) or for Immunizations, in the sense of the above-mentioned possible uses, which can develop or show suitable biological, chemical or physical effects, which are considered as potential candidates, but of which the desired effect is not known a priori.
  • inventions relate to the use of an agent consisting of a combination preparation comprising components 1, 2 and 3 or comprising components 1 and 2 or comprising component 2 in one of the abovementioned determination or screening methods.
  • the invention encompasses methods for producing in-vitro and in-vivo immunodiagnostics, for immunoprophylaxis, for immunotherapy or for immunization, usable agents or pharmaceutical preparations, after which the provision of new diagnostics, immunotherapeutics or immunoprophylactics or Vaccine is made possible.
  • kits-of-parts consisting of components 1, 2 and 3 or of components 1 and 2 or in which component 1 is a component according to the claims or according to the definition for X, Y and Z in Table 1.
  • component 1 for example a monospecific reagent suitable for targeting (for example a specific antibody) with only one determinant Ha-], for example with a hapten, has to be coupled (haptenized), its binding properties do not change, whereas the direct coupling of macromolecules to antibodies according to the prior art, the binding of a relevant antibody to the target site (for example a cell surface structure or an epitope of a surface receptor of a cell) adversely affected.
  • the binding properties of the central, at least bispecific reagent of component 2 (anti-Ha-] - Y - anti-Ha2 according to Table 1) always remain constant for defined combinations of determinants, for example a hapten combination (coupled to X and Z according to Table 1) , it suffices to use the same binding-specific component 2 for binding mediation between all possible reagents equipped with defined determinants, for example with defined haptenized reagents (for example a protein, an antibody) as target object (X-Ha-], according to Table 1) and all with defined ones
  • determinants e.g. defined haptenized antigens
  • marker or reporter function Ha2 - Z or Ha n - Z, according to Table 1).
  • the required number of end products is drastically reduced and they additionally bring the advantage of a hitherto nonexistent flexibility for the use of immune reagents in in vitro and in vivo diagnostics as well as for the use of immune agents in prophylaxis, therapy and Immunizations.
  • the determinants Hai and Ha2 or Ha n are, for example, haptens
  • a user is enabled to use the at least two specific haptens component 2 (for example an anti-Ha-: anti-Ha2 bispecific antibody) a variety of different combinations on the one hand targeted reagents of component 1 (e.g.
  • compositions or substances which are known to have biological, chemical or physical properties or effects can be determined or identified in a simple manner with the combination preparations according to the invention, which are then used in in vitro and in vivo diagnostics immunotherapy or immunoprophylaxis or in immunizations can be used advantageously.
  • the combination preparations in question are outstandingly suitable for screening in order to detect from a multiplicity of potential candidates or agents, which are known to have biological, chemical or physical properties or effects, those which are suitable for the purposes according to the invention seem suitable. Such potential candidates are described in more detail below.
  • binding-specific component e.g. an antibody
  • the combination preparations according to the invention can be used for apparently very different areas of application. It should be emphasized at this point, however, that the various described application aspects in vitro and in vivo in immunodiagnostics, immunohistochemistry, immunohistology, immunocytology, immunotherapy including the prognosis and determination of disease states of a mammalian organism, immunization or vaccination and the prophylactic use are connected by a single, unified inventive concept in that the combination preparations according to the invention can be used universally in the entire field relating to immunology and therefore the inventive principle of these uses must be considered as such.
  • agent encompasses compounds or substances which enter into a preferably non-covalent bond with a partner.
  • components 1, 2 and 3 can be regarded as reagents that react with one another non-covalently.
  • “defined specific, immunologically reactive determinants” are to be understood as meaning specific biological structures recognizable for a reagent (component 2), to which this reagent can bind non-covalently due to its specificities, and with which the corresponding reaction partners , for example a protein, or to which they are bound.
  • Such structures include, for example, surface-specific antigenic structures (antigenic determinants) of cells or components thereof, particulate antigens, epitopes, paratopes, idiotopes or haptens.
  • the term "agent” is understood to mean an active ingredient compound which has a therapeutic or prophylactic (preventive) or inhibitory effect in vivo or in vitro (effector function), or has a marker or reporter function.
  • an agent as defined for Z in Table 1.
  • hapten subsumes low molecular weight substances which do not cause antibody reactions in themselves, but which, after binding to an immunogen, can trigger an immune reaction, with antibodies directed against them being formed.
  • the term “monospecific reagent” or “binding-specific component” does not include an agent as defined for X in Table 1, which is capable of being targeted to a defined location or to a “target structure” or to “target cells” bind covalently (known as "targeting"), where the defined location can be a target cell or a part thereof, a particulate antigen or an immunogen.
  • targeting any means, for example proteins (for example keyhole limpet hempcyanin, KLH), are encompassed to which a certain determinant of the definition given above is bound.
  • bispecific component or “at least bispecific reagent” encompasses reagents and agents which have binding specificities against various defined, specific, immunologically reactive determinants (Y in Table 1), for example with anti-hapten specificities.
  • Binding-specific structures of the animal and human body encompass those structures within and on the surface of cells, tissues and organs which are referred to in the immunological sense as antigens, epitopes or antigenic determinants or receptor binding sites or Binding sites for adhesion molecules include and to which specific antibodies, receptor binding substances, adhesion molecules etc. as well as derivatives and fragments thereof or antibody-like substances (such as lectins, inert particles equipped with specific structures) are able to bind.
  • binding-specific structures of the animal and human body or “specific biological binding structures” as a generic term summarizes defined cell surface structures, antigens, epitopes, receptors, adhesion molecule binding sites or parts of the structures mentioned, and also sugar residues, drugs or toxins 2g
  • Antibodies or immunoglobulins are bound non-covalently. Antigens with
  • Immune system activating properties which induce the antibody synthesis, are called "immunogenes”.
  • epitope encompasses discrete areas on a macromolecule (for
  • Example a protein which trigger the antibody synthesis and are synthesized against the specific antibodies or with which antibodies can react specifically, whereby these bind non-covalently to the epitope in question (or the antigenic determinant).
  • Lectins the person skilled in the art understands proteins or ligands with two or more binding sites for very specific sugar residues on glycoproteins and glycolipids on cell surfaces, as a result of which, like antibodies, these can cross-link the corresponding molecules and also on correspondingly equipped or linked with a determinant , for example haptenized, are able to bind binding partners.
  • “Inert particles” include those particles which do not contain any of the body's own
  • Linker molecules mean chemically synthesized connecting molecules which can covalently or non-covalently connect two proteins, in particular antibodies, derivatives or fragments thereof, to form hetero aggregates. In particular, this encompasses hetero- and / or homobifunctional compounds, for example those which react with ⁇ -amino groups or with SH groups (for example the "hinge” region) of antibodies, or which activate thiols on Fab fragments.
  • linker molecules are also included that can combine biomolecules with other substances, for example the avidin-biotin system or the streptavidin-biotin system.
  • Effective molecules include those known agents, molecules, compounds or particles of biological or non-biological origin which develop or mediate action, in particular therapeutic action, at the target site, such as, for example, lytic, cytostatic, cytocidal, cytotoxic, fibrinolytic, immunosuppressive, anti-inflammatory , anti-infectious or immunizing effects. In particular mediated through biologically active sg •
  • Substances such as, for example, antigens (for example hormones, enzymes, cytokines or modulating antigens on antigen-presenting cells, for example HLA class II) or effector cells (for example T cells, NK cells, macrophages) or by means of suitable radioactive substances or Isotopes in particular [3- and ⁇ emitters, for example 99m Tc, l 1 1 ln, 1 3 1 J, 1 23 J, 90 Y, 1 86 Re
  • reporter olekul encompasses such known agents which are suitable for triggering a detectable signal on organic or biological structures (cells and tissues and components thereof, toxins, antigens, etc.) or parts thereof, or for causing such a signal, e.g. by marker substances such as dyes, fluorescent substances (e.g. fluorescein isothiocyanate), enzyme (e.g. luciferase), contrast agents (e.g. a paramagnetic contrast agent), radioisotopes e.g. of halogens, technetium, lead, thalliums, indiums or mercury, such as e.g. el 25
  • marker substances such as dyes, fluorescent substances (e.g. fluorescein isothiocyanate), enzyme (e.g. lucifera
  • immunoglobulins or synonymously “antibodies” means at least bispecific bivalent or polyvalent, monoclonal antibodies, in particular the isotypes IgG, IgM, IgA, IgE and IgD and its subclasses and derivatives thereof, but also those which are fragments thereof and derivatives thereof, including those which contain the idiotypic region of the antibody molecule, in particular those which contain the Fv region, for example the F (ab> 2 and Fab Fragments, but also a priori chimeric antibodies or hybrid antibodies with at least two antigen or epitope binding sites, or bispecific recombinant antibodies (for example "double-single-chain” antibodies, diabodies), anti-idiotypic antibodies and those thereof that have been chemically modified and are to be understood as derivatives of these antibodies and are either via DNA recombination, mi by means of hybridoma technology or antibody engineering or synthetically or semi-s
  • Monoclonal antibodies which can very preferably contain the combination preparations according to the invention, can be obtained by any known technique which is available for the production of antibodies by culturing cell lines.
  • Such known techniques include, for example, those of K ⁇ HLER, G. & MILSTEIN C, 1975,
  • a suitable or desired antigen which is of natural origin, via DNA Recombination or synthetic or semi-synthetic, or parts thereof, can be immunized and the desired polyclonal antibodies can be obtained and purified from the sera or blood samples obtained thereafter according to methods known per se.
  • Preferred antigens are those derived from or representing prokaryotes and eukaryotes from viruses.
  • the methods of producing polyclonal antibodies, for example via immunization of an animal are known to the person skilled in the art and are described, for example, in "Practicai Immunology", Hudson, L. & Hay FC (eds.), Third Edition, Blackwell Scientific Publications, 1989.
  • adjuvants to increase the desired immune response to the antigen exposure can also be used, depending on the animal selected for the immunization - for example complete Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, surface-active substances such as polyanions, peptides, olemulsions, hemocyanins, dinitrophenol or Lysolecthin.
  • antibodies in particular monoclonal antibodies, fragments or derivatives thereof, are preferred.
  • Bispecific antibodies can be produced in principle using three different processes.
  • a bispecific antibody can accordingly be produced, for example, by a suitable number of parental hybridoma cells (approx. 10 ⁇ to 10 ⁇ ), which are made sensitive, for example for hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT), by corresponding selection for a hypoxanthine phosphoryl transferase negative Variant. These are fused to the second parental hybridoma cells in a suitable ratio (for example 1: 1 to 10: 1).
  • the second parental hybridoma cells are preferably pretreated beforehand with a lethal amount of a suitable cytocidal reagent (for example 10 mM Iodoacetamide).
  • a suitable cytocidal reagent for example 10 mM Iodoacetamide.
  • the fusion itself can take place in the presence of a polyfunctional alcohol, for example in a solution of polyethylene glycol (PEG, approx. 50% w / v).
  • PEG polyethylene glycol
  • the excess PEG is removed and the cells are plated as usual in a concentration of approximately 10 ⁇ to 10 'cells / ml in a suitable, buffered medium 34 ⁇
  • the hybridomas can be selected in a suitable medium.
  • the fusion of two hybridoma cells leads to tetradomes (so-called due to the lineage of a total of four original cells), which leads to antibody-producing cells that secrete bispecific molecules that are comparable in structure and size to the naturally occurring immunoglobulins.
  • the procedure is similar to that for the production of hybridomas.
  • one of the hybridoma cells to be hybridized is selected for sensitivity, for example for HAT sensitivity.
  • tetradomes Another possibility for the production of tetradomes is the possibility of surface marking the cells to be fused with different fluorescent dyes, and sorting double-stained cells after hybridization using flow cytometry (FACSort, "fluorescent activated cell sorting").
  • the resulting tetradome cell thus contains the genetic material of both original hybridoma cells and thus the information for the formation of the four parental heavy or light antibody chains.
  • the heavy and light chains After stochastic reassociation, there are a total of ten possible combinations of the heavy and light chains. Of these, however, only three are functionally correct antibody molecules in which the binding sites of the two halves of the molecule Heavy and light chain originate from the same parental hybridoma. These are the two parental (monospecific) antibodies, as well as the newly formed bispecific antibody, the halves of which come from a heavy and light chain each from a parental hybridoma.
  • the proportion of correctly secreted bispecific antibodies in the tetradome product can vary between 5% and 50% of the total immunoglobulins produced in the different cell lines. Since the later purification of the bispecific antibody fraction usually results in a differentiation via the protein-chemical properties of the constant parts of the heavy chain, care must be taken during the fusion that hybridomas are combined with one another, which preferably secrete immunoglobulins of different isotypes.
  • Component 2 can be considered for the above-described methods known from the prior art for the preparation of bispecific antibodies, as well as the other preparation methods which lead to bispecific molecules.
  • antibodies produced by recombinant DNA are also included in the scope of the present invention, for example those which are obtained by the described methods according to COLOMA, MJ et al. , J. Immunol. Methods 152, 89-104, 1992; "Methods in Enzymoiogy” 1 78, 1 989 or EP A 0 1 25 023 can be produced.
  • a bispecific antibody can be obtained by this method in that single-chain proteins from V, _ and V ⁇ domains of the antibodies (Fv) are linked to the C-terminus of one domain and the N-terminus of the other domain (BIRD, RE & WALKER, BW, Trends in Biotechnol. 9 (4), 132, 1991).
  • the method of TRAUNECKER, A. et al., EM.BO J. 10 (1 2), 3655, 1991 and of BRYN, RA leads to a comparable fusion protein with bispecific properties (for example CD4: Fc ⁇ or CD4: CD3) et al., Nature 344, 667-670, 1990).
  • bispecific (fusion) antibody can be genetically engineered according to ASHKENAZI, A. et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA 88 (23), 10535-10539, 1 991.
  • the fusion protein concerned an immunoglobulin (immunoadhesion) which inhibits inflammation by interfering with another adhesion molecule.
  • gene transfer via retroviral shuttle vectors for the production of bispecific antibodies is proposed.
  • bispecific antibodies Another method of producing bispecific antibodies is that certain transcription factors (Jun and Fos) are genetically fused with anti-Tac or anti-CD3 Fab2 'regions via a "leucine zipper" ("leucine zipper").
  • the bispecific antibodies are then formed by mixing the two constructs together (KOSTELNY, S.A. et al., J. Immunol. 148, 1 547-1 553, 1992).
  • diabodies Small antibody fragments with two antigenic binding sites, so-called “diabodies”, which can also be considered for the combination preparations according to the invention, can also be produced by genetic engineering methods.
  • Such fragments which consist of a variable domain of the heavy chain (V ⁇ ), which are connected to a variable domain of the light chain (M) on the same protein chain (-J ⁇ ⁇ - V [ _) can for example according to HOLLIGER, P . et al. Proc. Natl. Acad. Be. USA 90, 6444-6448, 1993.
  • diabodies represent genetically engineered proteins using known methods.
  • the binding sequences of the heavy and the Light chains of the (mouse) immunolglobulins can be expressed according to known methods in bacterial systems, the variable part of the heavy chain (V ⁇ l) of one antibody being linked to the light chain sequence (V [_2) of the other antibody and vice versa (Vn2 / V
  • the bacterial product can then fold in such a way that the binding sites V j _ ] 1 and V
  • antibody fragments in bacteria belongs to the prior art, so that such recombinant antibody fragment hybridomas are advantageously considered as the main source of bispecific antibodies for medical (prophylaxis, therapy, immunizations) and diagnostic applications in the sense of the present invention.
  • Antibody fragments have advantages over complete antibodies, for example that of cheaper production in microorganisms or cell cultures (for example bacteria, mammalian cells) and, because of their lower molecular weight, better penetration of, for example, body tissues and tumors.
  • diabodies can be bispecific, they can advantageously be used as component 2 (Y). Accordingly, such a component 2 can have two binding sites (anti-Ha-
  • a target antigen for example a tumor marker
  • an effector cell of the immune system for example, so that the latter is transported to the target tissue (for example a tumor).
  • the combination preparation according to the invention using diabodies can be used, for example, to kill killer T cells-activated tumor cells.
  • Diabodies can not only activate killer T cells: by varying the effector binding site, a whole range of immune effector functions, such as complement activation or antibody-activated cell lysis, can be activated.
  • the advantage of using diabodies is that they can be cleaned in a single chromatography step.
  • diabodies can be used advantageously for the purpose of the combination preparations according to the invention, in particular for component 2.
  • bispecific antibodies can also be produced by chemical means, various methods being known. For example, according to KARPOVSKY, B. et al. , J. exp. Med. 160, 1 686, 1984, heteroconjugates (“heterocross-linked aggregates”) or it can be prepared by the method according to GLENNIE, MJ et al., J. Immunol. 139, 2367 - 2375, 1987, according to which bispecific F (ab' ⁇ ) 2 antibodies are constructed via thioether-linked Fab' ⁇ fragments using o-phenylenedimaleimide. Bispecific antibodies can also be prepared by chemical recombination of fragments of monoclonal antibodies (BRENNAN, M.
  • the Fc 'portions of the antibody in question for example IgG
  • pepsin hydrolysis for example 2% w / w pepsin in 0.1 M sodium acetate, pH 4.2, 18 hours, 37 ° C.
  • F from '> 2 parts obtained.
  • crosslinkers or “cross-linking reagents” is understood to mean those molecules with the properties mentioned which contain functional groups which bind to amino acid residues in proteins and peptides. Accordingly, in the context of the present invention, all crosslinkers or cross-linking reagents are included which can produce intermolecular covalent bonds between two proteins or parts thereof. Therefore, only "binding molecules” are referred to below when referring to such crosslinkers or crosslinking reagents.
  • heterobifunctional compound molecules which have at least two different reactive groups
  • those are particularly suitable which have an amino-reactive functional group at one end and a sulfhydryl-reactive group at the other end, for example those which, as a first group, are an N-hydroxysuccinimide ester group and as a second functional group has a maleimide group.
  • heterobifunctional compound molecules which react with carboxyl groups, for example with glutamic acid or aspartic acid residues as reactants, are also suitable.
  • examples include carbodiimides.
  • the known photoreactive compound molecules are also suitable which have a functional photoaffine group which only become reactive through exposure to UV light or other visible radiation (photons), for example aromatic azides (arylazides) or benzophenones which are reacted with amines, sulfhydryls, Carbohydrates and carbonyls react.
  • heterobifunctional compound molecules which are used for the production of at least bispecific reagents, especially antibodies
  • the following compounds can be considered, although this list is not exhaustive and the person skilled in the art can see further compounds suitable to him from the prior art: 4-succinimidyloxycarbonyl- ⁇ -methyl- (2-pyridyldithioo) toluene fSMPT], ⁇ / -succ ⁇ nim ⁇ yi 3- (2-py ⁇ dyldithio) prop ⁇ onate [SPDPj, sulfosuccmimidyl 6- [3- (2-pyridyldithio) prop ⁇ onam ⁇ do] hexanoate, sulfosuccinimidyl 4- ( ⁇ -maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate 4 - succinimidyl -maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate [SMCC], ⁇ /
  • DTSSP 3,3'-dithio ⁇ / s (sulfosuccinimidyl propionate) [DTSSP], bis (sulfosuccinimidyl) suberate,
  • Radio markings with radioactive isotopes for example, via corresponding Iodation of, for example, l - (p-azidosalycylamido) -4- (iodoacetamido) butane or, for example, fluorescent labels by using suitable connecting molecules, for example sulfosuccinimidyl7-azido-4-methylcoumarin-3-acetate.
  • the named and the other connecting molecules known to the person skilled in the art can be produced by methods known per se or they are commercially available (e.g. Pierce Europe B.V., Oud-Beijerland, Holland).
  • the named and other homo- and heterobifunctional connecting molecules suitable and to be used for the present invention and their applications and reactions with the reactive groups of the proteins or immunoglobulins in question are also described individually by BRINKLEY, M., Bioconjugate Chem., 3, 2- 13, 1992 and by MATTSON, G. et al. , Mol. Biol. Rep. 17, 167-183, 1993.
  • Further connecting molecules suitable for the purpose of producing bispecific antibodies are described individually by SCHEIDTMANN; K.H.
  • the antibodies covalently linked via the connecting molecules described above can be prepared by methods known from the literature, such as are described, for example, in the publications on the connecting molecules already mentioned, including the further literature cited therein (for example BRINKLEY, M., 1992, loc. Cit .; MATTSON, G. et al., 1993, loc.cit .; Pierce catalog).
  • an at least bispecific reagent if Y according to Table 1 is a protein, in particular an immunoglobulin or an antibody, can be produced by covalent binding in that suitable immunoglobulins are obtained and purified by a method known per se.
  • suitable immunoglobulins for example an IgG
  • a suitable connecting molecule for example a homobifunctional connecting molecule, for example an imidoester, under suitable conditions.
  • the reaction products can then according to known Processes are separated from the other components of the reaction solution and purified, for example by dialysis, centrifugation and / or chromatography.
  • a bispecific reagent Y to be used advantageously for component 2 (for example a bispecific antibody)
  • one of the antibodies to be coupled is labeled with biotin and the other antibody with streptavidin according to known methods.
  • a bispecific reagent of high stability results via the avidin (streptav ⁇ din) -B ⁇ ot ⁇ n coupling.
  • An advantage of this method is that the easy interchangeability of the respective partners (anti-Ha-] and anti-Ha2 or anti-Ha n ) enables a wide range of different bispecific reagents Y to be produced.
  • a streptavidin-labeled antibody with specificity for a specific determinant Ha-j can be coupled with a large number of biotin-labeled antibodies that recognize different determinants (Ha n ).
  • Bispecific antibodies produced by hybrid hybridoma fusion have certain advantages over those heteroconjugates generated by chemical cross-linking.
  • Antibodies chemically generated via, for example, heterobifunctional linkers are dimeric or multiaggregated molecules which are removed much more quickly via the reticuloidal dothelial system and thus have a much shorter half-life in the bloodstream than those which are produced via hybrid hybridomas.
  • Such large heteroconjugates produced via chemical linkers can also have the disadvantage that they are more difficult to penetrate into the extravascular tissue. Because of their bi- or multivalency, they can more easily induce modulations on the target antigen.
  • bispecific antibodies produced via hybrid hybridoma fusions for example in the case of lymphomas, are regarded as preferred component 2 (Y).
  • bispecific antibodies can also be used chemically, for example via hetero- or homobifunctional linkers or via avidin (streptavidin) biotin.
  • a bispecific antibody to be used according to the present invention as defined in Table (component 2) can, for example, be such that an antibody is bispecific for 2,4-dinitrophenol (DNP) and for digoxigenin (DIG).
  • DNP 2,4-dinitrophenol
  • DIG digoxigenin
  • Such an anti-DNP: anti-DIG antibody can be produced, for example, by immunizing mice with suitable DNP and DIG conjugates by known methods, fusing the spleen cells of the immunized mice with myeloma cells, for example with a polyfunctional alcohol (PEG ) or via electrofusion (for example according to VIENKEN, J., ZIMMERMANN, U. FEBS Letters 182: 278-280, 1985), and the resulting hybridomas are selected according to the methods described and fused to tetradomes, for example via PEG fusion.
  • PEG polyfunctional alcohol
  • electrofusion for example according to VIENKEN, J., ZIMMERMANN, U
  • the antibodies required for the combination preparations according to the invention and which can be prepared by the known processes can be purified by known methods, for example by precipitation, gel filtration, ion exchange chromatography, immunoabsorption chromatography,
  • Antibody fragments containing the idiotype of the molecule can also be produced by known methods.
  • F (ab '> 2 fragments can be obtained by pepsin digestion of the complete poly- or monoclonal antibody.
  • Fab fragments can be obtained, for example, by reducing the disulfide bridges of the relevant F (ab') 2 fragment and Fab fragments can be obtained, for example by treating the antibody molecules with papain and, if appropriate, a reducing agent, such methods are known to the person skilled in the art and belong to the prior art.
  • a purification can be carried out, for example, in that the antibodies obtained by the methods described above are stored in a buffer (for example Tris
  • HCI, 20mM, pH 8.0 are diluted to 3 times the volume, then filtered (Filter pores approx. 0.2 ⁇ m) and cleaned using a Q-Sepharose Fast Flow column.
  • the antibody fraction can be eluted, for example, using a NaCl gradient.
  • the collected fractions can then be diluted in, for example, NH. (S04) 2 (2 M) and further purified on a suitable column, for example on a phenyl-Superose column, using a linear gradient of, for example, 0.8 M NH4 as the eluent (S ⁇ 4> 2 / 0.1 M Na2HP ⁇ 4 (pH 7.2).
  • the fractions obtained can then be tested using conventional assays.
  • Any known method can be used to identify and select antibodies, fragments or derivatives thereof which react with at least one epitope of the corresponding antigen. For example, that these can be detected after appropriate labeling, if they have bound to isolated or purified antigen or by immunoprecipitation of the antigen which has been purified, for example by gel filtration, chromatography or polyacrylamide gels, or by the fact that antibodies against a corresponding antigen bind with other antibodies compete the same antigen.
  • the choice, type, source and method of production of the antibodies for the combination preparations according to the invention are not critical for the implementation of the present invention. They can be selected and produced from any class or subclass and by any known method, depending on which one is preferred by the person skilled in the art. In the event that the combination preparations according to the invention are to be used for therapeutic use and for "targeting" cells or tissues to be treated, the antibodies used for them should be selected with regard to their toxicity.
  • An antibody Z conjugated, for example, with an effector molecule (according to Table 1) together with the other two components 1 and 2, which contain X and Y according to Table 1, can initially be tested for cytotoxicity in vitro if a combination preparation for preferably immunotherapeutic purposes on mammalian organisms , especially on people.
  • the corresponding combination preparation can be further investigated with regard to its effectiveness in vivo.
  • an antibody with the function X according to Table 1 preferably a monoclonal antibody, against all those which occur select antigenic determinants and antigens, make them, and test and study them as outlined above.
  • antigens are tumor, bacterial, virus, parasite, fungal, mycoptasm, histocompatibility, cell surface, cell receptor antigens or antigens based on toxins, enzymes, allergens or other physiologically relevant substances including plant antigens.
  • the combination preparations according to the invention can be used in all known serological-immunological diagnostic methods.
  • the combination preparations according to the invention are suitable for immunofluorescence tests, for example direct (IFT) or indirect immunofluorescence tests (IIFT); Enzyme immunoassays (EIA); Agglutination tests, such as, for example, agglutination inhibition test, immunosorbent agglutination assay (ISAGA); Radioimmunoassays (RIA); Immunoradiometric Assay (IRMA), Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), ⁇ -capture assay; Enzyme membrane immunoassay (EMIA); fmmuno Enzymo-Metric Assay (IEMA); Double Antibody Liquid Phase Assay (DALP technique); Fluorescence immunoassay (FIA), for example homogeneous fluorescence immunoassay, fluorescence polarization immunoassay, fluorescence enhancement immunoassay, fluorescence quenching immunoassay, fluorescence excitation transfer immunoassay (FETIA), substrate labeled fluorescent
  • IFMA Immunofluorometric Assay
  • TR-FIA Time Resolved Fluorescence Immunoassay
  • Luminescence immunoassay for example chemiluminescence immunoassay (CELIA), solid phase antigen luminescence technique (SPALT), immunoluminometric assay (ILMA), immunoluminal labeled second antibody assay (ILSA); Immunoblot or Western blotting or dot blot techniques.
  • CELIA chemiluminescence immunoassay
  • SPALT solid phase antigen luminescence technique
  • ILMA immunoluminometric assay
  • ILSA immunoluminal labeled second antibody assay
  • immunoassays that can deliver the desired data within a short time can be preferred.
  • those immunoassays come into consideration which are based on a sandwich test, competitive test, colorimetric test (such as, for example, the CEDIA TM test according to HENDERSON, DR, et al, Clin. Chem. 23 (9): 1 637-1 641, 1986) and are applicable as rapid tests and are known to the person skilled in the art.
  • component 1 can consist of a protein associated with a determinant Ha-], which can be a monoclonal or polyclonal antibody recognizing, for example, an antigen contained in a test sample, in particular a monoclonal antibody which is linked to an anti-Ha - Binding site (of component 2) can bind and on the other hand can recognize a capture antibody immobilized on a carrier material, for example a microtiter plate.
  • component 2 can then bind to component 1 via its anti-Ha-] site.
  • an agent equipped with a determinant Ha2 for example an enzyme (for example horseradish peroxidase), which can preferably react with a detectable agent, that is to say a labeling or indicator molecule, for example 2,2'-azino-ö / s (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate (ABTS).
  • a detectable agent for example 2,2'-azino-ö / s (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate (ABTS).
  • ABTS 2,2'-azino-ö / s (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate
  • the color reaction can be carried out in the presence of a suitable, detectable agent (for example 2,2'-azino-o / s (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) be measured spectrophotometrically by known methods.
  • a suitable, detectable agent for example 2,2'-azino-o / s (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) be measured spectrophotometrically by known methods.
  • the combination preparations according to the invention can advantageously also be used for a method based on an immunoassay, in which, for example, a first one with a determinant Ha -
  • a corresponding agent equipped with a determinant Ha2 for example a second antibody, which can bind to an antigen in a sample, can advantageously be labeled with an indicator molecule.
  • a protein with binding protein binding properties can be bound to a carrier material.
  • binding protein is biotin, avidin or streptavidin or a functional derivative thereof can be used.
  • All known labeling or indicator molecules for example horseradish peroxidase, can be used as the indicator molecule with which the second antibody which is not linked to a binding protein but is labeled with Ha2 is labeled.
  • the immune complex formed in this way can be visualized using known methods. In principle, such an immunoassay based on streptavidin-biotin binding is described, for example, by MÜLLER-BARDORFF, M. et al., Circulation 92 (10): 2869-2875, 1995, which is readily advantageous for those according to the invention
  • Combination preparations can be transferred and used.
  • a carrier material for example conventional microtiter plates
  • a suitable buffer Is brought into contact With the appropriate component 2 added beforehand, a suitable component can then be added tl
  • equipped reagent for example an antibody
  • a suitable buffer system an IgG-peroxidase conjugate equipped with a determinant Ha2 and a suitable reagent (for example o ⁇ phenylenediamine)
  • a suitable reagent for example o ⁇ phenylenediamine
  • the absorption can then be measured using customary methods. For example, by TSUBOUCHI, H. et al. , Hepatology 1_3 (1): 1-5, 1991, the method described can readily be applied to the use of the combination preparations according to the invention.
  • carrier material which is suitable for the method according to the invention and which can be coated with corresponding binding proteins according to the present description or on which the
  • Suitable reagents, proteins or specifically antibodies can be immobilized, all known materials that can be used for an immunoassay are suitable.
  • any water-insoluble material is known which the person skilled in the art knows that it can bind or adsorb proteins or polypeptides on its surface, preferably those made of plastics, such as, for example, polyvinyls, polystyrenes, acrylates, polypropylenes, polycarbonates, silicones.
  • plastics such as, for example, polyvinyls, polystyrenes, acrylates, polypropylenes, polycarbonates, silicones.
  • Such support materials consisting of such substances can be of different shape and size, depending on the individual needs of the person skilled in the art who uses the assay.
  • the carrier material can be made with a hollow body (for example, tubes, tubes, cuvettes) or with at least
  • a depression or trough which can be rounded or angular, provided molded body, which can preferably be flat (for example plates, disks, plates, strips, slides, microtiter plates).
  • marking or indicator molecules for the method according to the invention are proteins equipped with determinants Ha2 or Ha n , for example antibodies, enzymes (for example peroxidases, ⁇ -35 galactosidases, alkaline phosphatase), and dyes coupled thereto (in particular fluorescent dyes, for example fluorescein isothiocyanate), paramagnetic atoms, chromogenic substrates (for example o phenylenediamine or 2,2'aziono-d ⁇ [3-ethylbenzth ⁇ azol ⁇ n sulfonate (6)], radioisotopes (for example halogens, technetium, lead, thallium, indium or mercury) metals (For example, gold or gold particles or silver) Processes for carrying out such markings are known to the
  • the gold with a protein with binding protein-binding properties can be used according to the known immune gold technique , for example coated with biotin-binding proteins (for example avidin or streptavidin).
  • the optical detection takes place in interaction with, for example, correspondingly biotinylated antibodies.
  • Such a signal on which the optical detection is based can be additionally amplified by utilizing the ability of the gold particles to presently kind of a suitable reducing agent (for example hydroquinone) to reduce silver ions.
  • a subsequent contrast is achieved with this immunegold-silver coloration in that silver is deposited on the gold particles, so that a dark brown to deep black coloration is produced.
  • This advantageously increases the sensitivity of the relevant immunoassay for the detection of antigens in an examination sample
  • Biotinylation via biotin can be carried out via biotinylation using known methods, for example by binding an antigen to biotin in a known manner using N-hydroxysuccinimide biotin (for example in dimethyl sulfoxide).
  • biotmylated antigens or the corresponding antibody complexes can be identified, for example, using avidin-conjugated alkaline phosphatase (ExtrAvidin, Sigma, Deisendorf, Germany).
  • an application in an immunoassay can take place in that component 1 is an antibody (X in Ha-) which is directed against a certain antigen, for example a tumor antigen, and which is associated with an hapten Ha-], for example 2,4-diminrophenyl (DNP). ] - X), preferably a haptenized monoclonal antibody.
  • Component 3 is, for example, a fluorescent dye (Z in Ha2 - Z) associated with a hapten Ha2 (for example digoxigenin (DIG)), for example fluorescein isothiocyanate.
  • DIG digoxigenin
  • a bispecific reagent which can be used as an immunolinker (component 2) Ha-] (ant ⁇ -DNP): ant ⁇ -Ha2 (anti-DIG) has specificities.
  • the immunolinker is preferably a bispecific monocoloma antibody with the corresponding specificities.
  • Components 1 and 2 are either brought into contact with component 3 with the sample to be examined (body fluids, cells, tissue or organ parts) by known methods, or component 3 can be added after the reaction of components 1 and 2, after a time delay .
  • component 3 can be added after the reaction of components 1 and 2, after a time delay .
  • a further meaning in the use of the combination preparations according to the invention is that they are suitable for "imagining".
  • Pathologically modified cells and tissues can be malignant cells or tissues, for example.
  • imaging can be carried out by defining X and Z according to Table 1 with two different determinants Ha-
  • Z can be a carrier molecule labeled with a radioactive substance, with a fluorescent dye or with a contrast agent, for example a protein provided with a determinant, for example an enzyme.
  • a radioactive isotope all known ⁇ and ⁇ emitters can be used, but preferably those with a short half-life.
  • radioactive agents known to the person skilled in the art are available, for example, 1 25, 1 23
  • s Fluorescent dye is, for example, a fluorescein (for example fluorescein isothiocyanate) and a contrast agent, for example a paramagnetic contrast agent.
  • a combination preparation can easily detect and localize cell and tissue types and parts thereof.
  • the determinants for example haptens
  • component 3 for example conjugated to an isotope, can be given with a time delay, combined with the advantage of a lower radioactive load in in vivo imaging.
  • Z for example an antibody or another protein or fragment thereof, can be labeled directly with a radioisotope by known methods, or the labeling is carried out by coupling the corresponding isotope to a selected determinant Ha2, for example
  • hapten 20 is a hapten, or n to selected haptens determinants and Ha, which is or which is bound to a carrier (Z).
  • Z a carrier
  • a hapten this can consist of a monovalent hapten or a bivalent hapten, which can be hydrophobic or hydrophilic. Dinitrophenyl, for example, comes in as a monovalent, hydrophilic hapten
  • binding acid amide preferably to peptides or proteins (Z).
  • Z can preferably be a radioisotope chelated via a bivalent, hydrophilic hapten, for example 1 2 5, oc j er 1 1 1 In, which can be obtained, for example, by reaction with the cyclic anhydride
  • diethylenetaminopentaacetic acid can be obtained, for example according to LE DOUSSAL, J.-M. et al., Cancer Res. 50, 3445-3452, 1990. For such one So
  • bivalent haptens in particular hydrophilic in nature, preferred over monovalent, hydrophobic haptens.
  • divalent haptens in question would be dinitrophenyl derivatives or derivatives of Nt-dinitrophenylaminocaproic acid, which with 125
  • Such haptens are commercially available
  • mono- and bivalent haptens which can be labeled with, for example, ⁇ 25, 0 ( -
  • n and which are linked to amino acids and thus to peptides and proteins via acid amide formations may be covalently bound, and which are known to be suitable for tumor imaging but also for therapeutic purposes within the meaning of the present invention
  • radioisotopes can be transported directly to the desired location with the combination preparations according to the invention.
  • a chelator it is clear to the person skilled in the art that not only the chelators mentioned by way of example come into consideration and not only the radioisotopes mentioned by way of example, but that all known chelators can stand for a large number of detectable markers, in particular radiometals or magnetic resonance-enhancing metal ions.
  • suitable chelators are ethylenediaminetetraacetic acid or bisthiosemicarbazones of 1, 2- or 1, 3-dicarbonyl compounds.
  • a step-by-step procedure can be advantageous, however, by first giving component 1 (X) in order to bind at the target site, together or at different times with the immunolinker component (Y), and only then delaying it by minutes, hours or days (depending on Purpose of investigation and Sl ⁇ the location, size and type of the target site or tumor), component 3 (Z).
  • this step-by-step process can also take place in that the time interval of the application lies between components 1 and 2 (X or Y) and component 2 (Y) is given together with component 3 (Z).
  • a “pre-targeting” mediated by component 1 (or components 1 and 2) can be achieved, as a result of which effective radioactive determinants, for example hapten (s), or radioactive Z are taken up can.
  • a faster clearance of the determinant or the hapten or the component 3 from the plasma is to be expected, which can lead to an improved tumor / non-tumor contrast. It is also possible to apply all three components 1, 2 and 3 with a time delay.
  • An application mode in which component 3 is given last, delayed by minutes, hours or days, can be used advantageously.
  • the time intervals of the delayed applications between the components 1 and 2 and component 3 is particularly dependent on the selected radioisotope or its half-life (which is between 1, 2 minutes at 1 1 m A g and 121 days can be at ⁇ Se) and the type of material to be examined.
  • All routes known to the person skilled in the art can be considered as application routes, in particular iV, im, sc, ip, ia, ie
  • a typical use of the combination preparations according to the invention for imaging consists, for example, in that a monospecific reagent according to component 1, which is prepared by known methods and is linked to a hapten Ha ⁇ , in which X is preferably an antibody, is administered, for example iv, to a mammalian organism, so that it is administered binds specifically to a corresponding binding site (for example an antigen or epitope or a "target structure"), for example a tumor cell. Subsequently or simultaneously, component 2 is given (for example iv), which binds to the determinant (Ha-]) via its anti-Ha • ] specificity.
  • a monospecific reagent according to component 1 which is prepared by known methods and is linked to a hapten Ha ⁇ , in which X is preferably an antibody
  • a mammalian organism so that it is administered binds specifically to a corresponding binding site (for example an antigen or epitope or a "target structure"), for example
  • Component 3 which is labeled with a suitable radioisotope and linked to a suitable determinant Ha2 or suitable determinants Ha n , is then preferably administered with a time delay (in this case likewise iv), which contains the anti-Ha2 site of component 2 (Y - anti-Ha2 ) reacts.
  • a time delay in this case likewise iv
  • Y - anti-Ha2 anti-Ha2 site of component 2
  • Radioactivity can be measured in plasma.
  • the organs and tumors removed are usually broken down into correspondingly large sections and their radioactivity measured analogously or the decay of the radionuclide in question is counted using a counter.
  • the behavior of component 3 in a mammalian organism can be predetermined and the modes of administration (amount,
  • the mammal to be examined or the patient can first be injected with component 1 (in the case of an antibody, preferably a humanized antibody if a person is to be examined) (systemically or topically, for example IV, im or sc, into the Proximity, to or in the material to be examined). Subsequently or simultaneously with component 1, component 2 and, preferably with a time delay, the radioactively marked component 3 associated with a suitable determinant Ha2 is applied via the corresponding same route.
  • component 1 in the case of an antibody, preferably a humanized antibody if a person is to be examined
  • component 2 systemically or topically, for example IV, im or sc, into the Proximity, to or in the material to be examined.
  • component 2 and, preferably with a time delay
  • the radioactively marked component 3 associated with a suitable determinant Ha2 is applied via the corresponding same route.
  • radioisotopes examples include 1 5
  • a monoclonal antibody with anti-tumor properties and with a hapten Ha-] which can be, for example, a dinitrophenyl derivative, for example 2,4-dinitrophenol (DNP) (component 1), coupled with a bispecific monoclonal antibody with anti-Ha-]: anti-Ha2 properties (for example anti-DNP: anti-DIG, if Ha2 is a digoxigenin [DIG]) is given intravenously into a mammalian organism in the usual way.
  • DNP 2,4-dinitrophenol
  • anti-Ha2 properties for example anti-DNP: anti-DIG, if Ha2 is a digoxigenin [DIG]
  • component 3 for example a " * ⁇ unmarked or 123
  • an d en previously with component 1 or component 2 "pre-marked” tumor can be transported specifically and in a targeted manner and exert the desired effect.
  • pre-targeting can also be used in vitro for the other immunodiagnostic methods described, for which the sample to be examined first with component 1, then either simultaneously or delayed with component 2 and after one minute or hourly delay is brought into contact with component 3.
  • a further advantageous use of the combination preparations according to the invention consists in a method for determining whether an agent with biological, chemical or physical properties comprising an effector molecule, a receptor binding molecule, an immunoglobulin or antibody, a marker substance, an enzyme, a radioactive substance, or a radioactively labeled one Substance, a contrast agent, a biologically active substance, a cytotoxic, cytocidal, cytostatic or cytolytic agent or any antigen with an effector-marker or reporter function, a prodrug, an adhesion molecule, a cytokm, a lymphokine, a chemokine, a ligand, a biological, chemical or physical effect suitable in vitro and in vivo diagnostics, in immunotherapy or in immunizations or in vivo or in vivo, which is characterized in that a) a first combination preparation ation consisting of components 1, 2 and 3 according to Table 1, with the definitions given in the present description for X, Y, Z, Ha
  • the combination preparations according to the invention provide a variant of the method described above, which is also advantageously suitable for determining whether an agent with biological, chemical or physical properties comprising an effector molecule, a receptor binding molecule, an immunoglobulin or antibody, a marker substance, an enzyme, a radioactive substance, a radioactively labeled substance, a contrast agent, a biologically active substance, a cytotoxic, cytocidal, cytostatic or cytolytic agent or any antigen with effector-marker or reporter function, an active substance precursor (prodrug), an adhesion molecule , a cytokine, a lymphokine, a chemokine, a ligand, a biological, chemical or physical effect in vitro or in vivo which is suitable in in vitro and in vivo diagnostics, in immunotherapy or in immunizations develops or shows, characterized thereby eichnet that a) a combination preparation consisting of component 1 and component 2 according to Table 1, with the definitions for a)
  • the combination preparations according to the invention advantageously provide a method for screening a plurality of agents with biological, chemical or physical properties selected from effector molecules, a receptor binding molecule, immunoglobulins or antibodies, marker substances, enzymes, radioactive substances, radioactively labeled substances, contrast agents, biologically active substances, cytotoxic, cytocidal, cytostatic or cytolytic agents or any antigens with effector-marker or reporter function, active substance precursors (prodrugs), adhesion molecules, cytokines, lymphokines, chemokines, ligands, which are used in in vitro and in vivo diagnostics, in immunotherapy or in immunizations should develop or show suitable biological, chemical or physical effects in vitro or in vivo, which is characterized in that a) a first combination preparation ion consisting of components 1, 2 and 3 according to Table 1, with the definitions given in the present description for X, Y, Z, Ha-, and Ha2 or Ha n , with a first agent to be
  • Developing or showing biological, chemical or physical effects in vitro or in vivo is characterized in that a) a combination preparation consisting of component 1 and component 2 according to Table 1, with those in the present B Description given definitions for X, Y, Ha-
  • agents with biological, chemical or physical properties are also known to the person skilled in the art or can be found in the diverse literature. Accordingly, the person skilled in the art is able to recognize the suitable biological, chemical or physical effects of the potentially suitable agents.
  • Such effects or measurement parameters can include, for example: extent of cytolysis, cell death or cytotoxicity, occurrence of specific and non-specific reactions of the immune system, degree, type and expression of radioactive labels or radioactive signals or of binding of radioactive substances at target locations, course of tumor growth, degree stimulation reactions, for example by means of adhesion molecules, degree of activation and accumulation of effector cells, type and degree of binding of effector molecules to a target site, course of autoimmune diseases, rejection reactions, infectious diseases or diseases of the coagulation system, extent and efficiency of a "drug targeting" or a "cell targeting” ", Measurement of fibrinolytic potency of fibrinolytically active agents (for example urokinase, streptokinase, tissue plasminogen activators (tPA), measurement of the inhibition of replication or multiplication of viruses, onset of immunizations, M eating of dye reactions, radioactivities, immune reactions (e.g. turbidity, agglutinations) or bindings to target sites (e.g
  • the combination preparations according to the invention advantageously enable a method for producing an agent which can be used in in vitro and in vivo immunodiagnostics, which comprises the steps a) providing at least one combination preparation consisting of components 1, 2 and 3 according to Table 1, with those in the present description Definitions given for X, Y, Z, Ha- and Ha2 or Ha n , or b) providing at least one combination preparation consisting of components 1 and 2 according to Table 1, with the definitions for X, Y, Ha given in the present description -] and Ha2 or Ha n , c) identifying an agent which is biologically, chemically or physically active with regard to its immunodiagnostic properties by means of the combination preparations provided in a) and b) via the determination and screening methods disclosed above d) formulation of the from c) agent obtained in the form of a combination preparation according to Table 1, with the definitions given in the present description for X, Y, Z, Ha-j and Ha2 or Ha n with the known auxiliaries and excipients
  • an agent which consists of a combination preparation, comprising components 1, 2 and 3 according to Table 1, with the definitions given in the present description for is very particularly advantageous for the processes mentioned X, Y, Z, Ha-
  • Z can be, for example, a lytically active or a cytocidal or cytotoxic active substance (for example a toxin, an enzyme, another biologically active protein or an effector molecule or a radioisotope), which in particular inhibits the multiplication and proliferation rate of malignant tumor cells , suppressed or reduced.
  • a lytically active or a cytocidal or cytotoxic active substance for example a toxin, an enzyme, another biologically active protein or an effector molecule or a radioisotope
  • Z in the combination preparation in question can be an enzyme which is provided with a determinant Ha2, for example haptenized, (for example alkaline phosphatase), a cytokine (for example interferon ⁇ , ⁇ or ⁇ or derivatives thereof, an interleukin such as IL-2) , with a determinant, for example a hapten, effector cells or trigger molecules (for example cytotoxic T-lymphocytes, monocytes, macrophages, NK cells, granulocytes [polymorphonuclear neutrophils, eosinophils], Fc receptors for IgG, CD2, CD3) a cytotoxic toxin or a radioisotope.
  • a determinant Ha2 for example haptenized, (for example alkaline phosphatase), a cytokine (for example interferon ⁇ , ⁇ or ⁇ or derivatives thereof, an interleukin such as IL-2)
  • a determinant for example
  • the radioimmunoconjugates which can be prepared by known methods are suitable for this purpose.
  • Z is to be selected according to Table 1 as a radioactively labeled molecule which is provided with at least one determinant, for example a hapten, or the determinant itself can be a carrier of radioisotopes, for example a hapten according to the present description and the known literature.
  • Both ß- and ⁇ -emitters are particularly suitable as radioisotopes, for example 1 5 ,, 1 23 ,, 1 3 1 l, 1 l 1
  • radioisotopes for example 1 5 ,, 1 23 ,, 1 3 1 l, 1 l 1
  • radioisotopes for example 1 5 ,, 1 23 ,, 1 3 1 l, 1 l 1
  • Such therapeutic applications are on the "Fourth International Conference of Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer", San Diego, California, 30.3. - April 1, 1989 (GOLDENBERG, DM, Immunology Today 10 (9), 286-288, 1989).
  • Ha2 means an exerting agent (for example an enzyme, a cytokine, a T-lymphocyte, an adhesion molecule, etc.).
  • an exerting agent for example an enzyme, a cytokine, a T-lymphocyte, an adhesion molecule, etc.
  • Combination preparations are therefore used appropriately for clinical use. It may also be advantageous if multiple injections of component 3, whether a radioisotope or another cytocidal, cytotoxic or cytostatic agent, or one Marker substance is connected, to be applied especially when it appears necessary to treat over a longer period of time. In this way, higher concentrations of active substance or radioactivity can be achieved at the site of action.In the event that tumor cells respond to treatment within a short time ('1 day) and can only be killed or are only to be marked or detected, a bolus injection would be carried out one or more times in succession can be given, preferably in the manner described above over two steps, advantageous. Such a single use is certainly also suitable for the aforementioned purpose of imaging, since the organ or tissue to be localized only has to emit a signal for a short time.
  • the size and type are important for the treatment of a tumor by means of the combination preparations according to the invention, regardless of which antitumor agent is associated with it can.
  • the combination preparations according to the invention regardless of which antitumor agent is associated with it can.
  • multiple, systemic applications, preferably iv injections, of component 3 are advantageous.
  • localizable tumors for example the lymph nodes or the peritoneum, will require local application, possibly several times.
  • the period of administration of component 3 depends on which binding affinity component 1 (for example consisting of a haptenized monoclonal antibody with specific reactivity for a specific tumor antigen) for the antigen in question.
  • binding affinity component 1 for example consisting of a haptenized monoclonal antibody with specific reactivity for a specific tumor antigen
  • the time interval can be from one day to several days.
  • the dose of the active ingredient to be used (Z) advantageously follows stoichiometrically the amount of components 1 and 2 previously applied.
  • component 1 is ultimately the factor which determines the effect of the active ingredient used (Z in component 3 ) influenced and conditional - provided that all three components are used in a stoichiometric ratio to each other, which of course is basically assumed here, and which also represents one of the advantages on which the invention is based.
  • a high tumor concentration or a high concentration on the target organ or on the target tissue is to be aimed for with regard to component 1, so that the choice of a suitable component 1 as a binding-specific reagent is clearly based on its binding affinity at the target site or target antigen.
  • prodrug that is to say a drug or active substance precursor
  • a prodrug can be equipped with a determinant, for example a hapten.
  • An example of converting or activating a relatively non-toxic prodrug at the target site (e.g. a tumor) into a cytotoxic agent is the conversion of etoposide phosphate to etoposide. This can be achieved by targeting or pre-targeting with the combination preparations according to the invention with the proviso that component 3 is an alkaline phosphatase provided with a determinant Ha2 and components 1 and 2 have the corresponding described or corresponding properties .
  • etoposide phosphate is applied in the usual way (i.v., i.m., i.p., i.e., s.c.) in a dose in which this substance is not toxic.
  • the toxicity of etoposide phosphate: etoposide is approx. 1: 100.
  • the relatively non-toxic etoposide phosphate is converted enzymatically into the cytotoxic etoposide by the alkaline phosphatase (component 3) and only develops the cytotoxic effect on the tumor.
  • cytotoxic active ingredients can be administered to a mammal in a non-toxic precursor as a prodrug for therapeutic purposes by using the combination preparations according to the invention while largely avoiding undesirable side effects.
  • the two-step process is an advantageous and therefore preferred process for using the combination preparations according to the invention.
  • Z according to Table 1 can be a CD3 haptenized with Ha2 and X can be an anti-tumor antibody haptenized with Ha, where Y has the bispecific property anti-Ha -]: anti-Ha2.
  • Z in Ha2 - Z can be another trigger molecule (e.g. CD4, CD8, CD1 5, CD1 6, CD1 9, CD25, CD28, CD30, CD32, CD58, CD59, CD64) and combinations thereof (e.g.
  • CD3 / CD30, CD3 / CD 19 any enzyme (for example urokinase, tPA, alkaline phosphatase), any effector cell (CTL, NK cell), any cytokine (interleukins, interferons), an antibody directed against pathogenic pathogens (for example anti-nucleoprotein , anti-hemagglutinin from influenza viruses, anti-HIV antigens).
  • pathogenic pathogens for example anti-nucleoprotein , anti-hemagglutinin from influenza viruses, anti-HIV antigens.
  • X stands for any diagnostically and therapeutically relevant antigen, regardless of whether it is a tumor-associated antigen (TAA) or an antigen produced by microorganisms, viruses, plants, or by these and other biological systems (e.g. bacterial, plant or fungi originating toxi) or antigens occurring in non-biological systems.
  • TAA tumor-associated antigen
  • any effector molecules or trigger or activator molecules can be combined, in particular for tumor immunotherapy, and simultaneously, sequentially or consecutively or, in particular with regard to component 3, applied at any delay.
  • malignant tumors such as B-cell lymphomas or chronic lymphocytic leukaemias, melanomas, oval carcinomas
  • activated autologous T cells can be caused to lyse these malignant cells.
  • "Dormant" T cells can be activated, for example, by choosing an ant-CD3 antibody for X in component 1, which antibody has a suitable determinant Ha-, for example a hapten, for example 2,4-din ⁇ trophenyl (DNP) or 2-nitrophenyl (NP) was equipped or haptenized.
  • An anti-CD19 antibody can be selected for Z, which is, for example, haptenized with a hapten Ha2, which is different from 61,
  • Ha- for example with digoxigenin (DIG) or any other hapten other than Ha-.
  • DIG digoxigenin
  • Y is an anti-Ha,: anti-Ha2 (anti-DNP: anti-DIG or anti-NP: anti-DIG) bispecific antibody.
  • Component 1 can be administered systemically together with component 2 or separately, as already described, preference being given to application of component 3 which is delayed by the administration of components 1 and 2. According to BOHLEN, H.
  • the T cells are co-stimulated, in particular by an additional, in particular systemic administration of a corresponding antibody against a cell surface antigen, for example a monospecific anti-CD28 antibody.
  • a corresponding antibody against a cell surface antigen for example a monospecific anti-CD28 antibody.
  • the dose required for a T cell activation can be between 1 ng / ml and 1000 ng / ml of the corresponding antibodies (components 1 and 3 and the additional antibody, here anti-CD28), in particular around 100 ng / ml .
  • the combination CD3 x CD28 or CD3 x CD19 for X and Z in Ha-j - X or Ha2 - Z, optionally in a further combination with CD19 or CD28, must have a particularly advantageous effect in the immunotherapy of tumors, in particular of B-cell tumors.
  • a combination preparation according to the invention which is preferred in this way consists, for example, in that X in Ha -] - X an anti-CD3 antibody and Z in Ha2 - Z an anti bs
  • Is CD28 or an anti-CD 19 antibody with a corresponding bispecific reagent according to anti-Ha -, - Y - anti-Ha2 being selected for component 2.
  • a monovalent and a bivalent hapten are suitable for Ha2.
  • Preferred reagents for X and Y are monoclonal antibodies or bispecific monoclonal antibodies with the respective specific activities.
  • epithelial tumors of the ectoderm and endoderm carcinomas, mesenchymal tumors of the mesoderm, sarcomas, embryonic tumors from undifferentiated tissue such as, for example, nephroblastoma, neuroblastoma, medulloblastoma, retinoblastoma, embryonic rhabdomyosarcoma, human tumor, endocrine formation, and endocrine formation , HCG), intercranial, neuroepithelial, spinal tumors, melanomas, gliomas, tumors of the lymphatic system (lymphomas), tumors of the blood tissue (leukaemias).
  • undifferentiated tissue such as, for example, nephroblastoma, neuroblastoma, medulloblastoma, retinoblastoma, embryonic rhabdomyosarcoma, human tumor, endocrine formation, and endocrine formation , HCG
  • combination preparations according to the invention is not limited to the examples and literature citations selected in the present description, but of course and without exception include all targeting systems known and described to the person skilled in the art, insofar as these are associated with antibody / antigen interactions.
  • component 2 can be a bispecific antibody with anti-Ha-
  • component 1 an idiotype endowed with a determinant Ha-, preferably a hapten, for example antigen-presenting cells, for example dendritic cells
  • component 3 one with a determinant Ha2 or more determinants Ha n , preferably Haptens, equipped antibodies, for example an antibody directed against "human ⁇ heavy chain”.
  • Ha- and Ha2 can be DNP and DIG, for example.
  • Equimolar amounts of the three components can be mixed in vitro and the resulting complex (X-Ha- ⁇ anti-Ha-, - Y - anti- Ha2: Ha2 "Z) for immunization in a mammalian organism via the known routes, for example iv or ip.
  • Combination preparations can be easily applied to these indication areas and transferred analogously.
  • the combination preparations according to the invention are also advantageously suitable for the purpose of determining all possible antibodies in known antigens and vice versa also for determining antigens in known antibodies, for example in the form of the neutralization or agglutination inhibition test.
  • the use of the combination preparations according to the invention is therefore not limited to the field of diagnosis of pathological conditions in the narrower sense, but generally includes searching, recognizing and Determination of any antigen (antigen screening and antigen diagnostics) for the detection or diagnosis of a physiological state of biological systems, for example a mammal or human (for example proof of pregnancy), an irregular state of a biological system, for example a pathological physical state or a disease of a mammal or human (e.g.
  • a sample to be examined can be a non-biological liquid medium if it contains agglutinable, markable or detectable antigens and / or antibodies.
  • the monospecific reagent can advantageously be a protein, an immunoglobulin or an antibody or a derivative or fragment thereof, a ligand, a lectin, a receptor binding molecule, an adhesion molecule, a cytokine, a chemokine, a lymphokine.
  • the named biological binding structure is defined as disclosed in the description or in the patent claims.
  • an agent which is advantageously recognized for a specific therapeutic or diagnostic purpose for example a cytotoxic or cytolytic agent (for example a Antibodies or an antibody heteroconjugate) or a labeled antigen can be taken up or dissolved in PBS (phosphate buffered saline), for example in a concentration range from 1 to 1000 ⁇ g / ml, or it can be lyophilized, the lyophilisate being prepared by known methods in physiological saline, PBS or can be reconstituted in sterile water.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the agent recognized as being advantageous is a protein (for example an antibody) or is present as a constituent in this agent, it is used in the amount range between 1 and 1000 ⁇ g.
  • the agents identified according to the invention or the agents provided via the manufacturing methods according to the invention can furthermore be characterized further by suitable assays with regard to their effects and properties, any in vitro or in vivo immunoassay being considered. Examples of this would be an in vitro cytotoxicity assay (for example the "51 Cr release assay"), for example according to RAMMENSEE; H.-G. et al., Eur. J. Immunol. V ⁇ 33 - 436, 1 987, or according to JUNG, G.
  • kits are also made available for the above-mentioned determination, screening and production methods for the advantageous implementation of these methods, the term “kit” also comprising “kit of parts”, and these kits can contain the following constituents: a ) Components 1, 2 and 3 according to Table 1 with the definitions given in the present description for X, Y, Z, Ha-] and Ha2 or Ha n , or b) Components 1 and 2 according to Table 1 with the in definitions given for X, Y, Ha-] and Ha2 or Ha n in the present description, or c) component 2 according to Table 1 with the definition given in the present description for Y, or d) components 1, 2 and 3 or 1 and 2 or 2, as defined above, together with at least one further different component 3, optionally together with auxiliaries and carriers.
  • inert particles these are particularly suitable for diagnostic purposes (eg immunoassays) and include all the particles known to the person skilled in the art on which proteins or protein fragments can be adsorbed. If proteins are selected as antibodies, these inert particles can be loaded in such a way that they assume bispecific or multispecific properties and can be regarded as particular forms of a bispecific or multispecific antibody. The use of such particles has the advantage that complex chemical or genetic engineering processes for the construction of antibody heteroaggregates, chimeric antibodies or "cross-linked antibodies” can be avoided.
  • Such inert particles loaded with immunoreagents or antibodies (“coated”) adsorbed thereon are known to the person skilled in the art and are described in the prior art
  • int particles are understood to be particles to which
  • erythrocytes such as Toxocell IHA 0 from Red ⁇ test, SA »Barcelona, or Mast Serodia-Anti HBs FD 41 1 from Mast Diagnostica, Hamburg, or according to BIRD, T. & STEPHENSON, JH, J. clin. Path.
  • cellulose such as cellulose (CAMPBELL, DH et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 37, 575, 1 951; WELIKY, N. & WEETALL, HH, Immunochemistry_9, 967, 1 972), Sepharose (WILCHEK, M . et al., Biochemistry 10, 2828, 1971), glass beads (WEETALL, HH, J. Biochem. 1 17, 257, 1970), styrenes and derivatives thereof (EP-A 04661 70), liposomes, metal oxide particles, charcoal particles, gelatin (For example Serodia's TM HIV from Fujirebio Inc., Tokyo, Japan). ? /
  • Proteins for example antibodies or fragments thereof, can be attached to the
  • Inert particles known to the person skilled in the art for example polystyrene balls, are bound in a manner known to the person skilled in the art in that a suitable antibody known to the person skilled in the art, for example from the American Type Culture Collection. Rockville, Maryland, USA, (ATCC), from Linscott's Directory of Immunological and Biological Reagents, 40 Glen Drive, Mill Valley, California, USA, 94941, or from other known commercial sources of publicly available antibodies (e.g.
  • OKT3 [ATCC, Hybridoma CRL8001 ], OKT4 [ATCC, Hybridom CRL8002] or described in EP A 0468 637) in a suitable solution and under suitable conditions, for example NaHCO 3, at room temperature with polystyrene balls, followed by a physiological solution (for example phosphate-buffered saline, PBS) washed with an inert protein (e.g. cattle serum albumin, BSA).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • an inert protein e.g. cattle serum albumin, BSA.
  • the size of the polystyrene balls is not critical. A diameter of these polystyrene spheres in the ⁇ range or from approx. 1 ⁇ to 20 ⁇ can be regarded as a standard approximate value.
  • Suitable polystyrene balls are available, for example, from Polysciences, Warrington, PA, USA.
  • An inert particle coated in this way with, for example, a bispecific antibody or derivative or fragment thereof thus receives the properties of a bispecific particulate antibody and can be used according to the description and the examples according to the invention.
  • inert particles produced analogously as part of Y in component 2 of the combination preparations according to the invention are also included in the invention.
  • immunogen or antigen on which the present invention is based all those substances are encompassed which can induce an immune response in a mammalian organism and thus an immunoglobulin (antibody synthesis).
  • an antigen can be of natural origin, via DNA recombination or synthetic or have been made or are part of these, such antigens may occur extracellularly, intracellularly, transcellularly (third space) or interstitially, such as blood, serum and fractions thereof, excrement (such as urine, etc.) in biological fluids of a mammalian organism including humans.
  • tear fluid saliva, amniotic fluid, tissue fluid, ascites, seminal fluid, pleural fluid, cyst fluid, Cerebral fluid, pus, secretions of the gastrointestinal tract, cerebrospinal fluid, eye chamber fluid, edema fluid, pathologically occurring fluids in, for example, hay or peritonitis, secretions, cerebrospinal fluid.
  • Antigens which are associated with a cell occurring in the mammalian organism, a tissue, an organ or a synthesis product thereof or which can be assigned to a disease state for example immunoglobulins or antibodies in the sense of the definition given above, proteins, are particularly suitable.
  • polypeptides for example, steroid hormones such as estrogens, progestins, androgens, glucocorticoids, mineralocorticoids, cholecalciferols, proteohormones, biogenic amines, oxytocin, vasopressin (ADH), insulin, glucagon, parathyroid hormone, calcitonin, erythropoietin, prostaglandins, gonadotropins such as luteinizing Hormone (LH), chorionic gonadotropin (HCG or ß-HCG), follicle stimulating hormone (FSH), prolactin and other placenta hormones, serotonin, histamine, bradykinin, kallikrein, gastrointestinal hormones, thyroid hormones, catecholamines, enzyme, tumorylcholine) Tumor antigens (such as carcinoembryonic antig en (CEA), Re ⁇ al Cell Carcinoma Anti
  • antigens which originate from, or are part of, viruses, prokaryotes and eukaryotes which are not assigned to a mammal are also suitable.
  • microorganisms such as Gram-negative and Gram-positive bacteria (for example the families or orders Enterobacteriaceae [for example the genera Escherichia, Salmonella, Shigella, Yersinia], Corynebacteriaceae, Spirochetales [for example the genera Treponema, Leptospira, Borrelia], Pseudomonadaceae [Mycoplasmat for example the genus Mycoplasma], Mikrococcaceae [for example the genus Staphylococcus], Chlamydiae, Bacillaceae [for example the genera Bacillus, Clostridium], Lactobacillaceae [for example the genus Streptococcus], Neisseriaceae [for example] the Genusillissea for example the Vibrio genus], Brucel
  • antigens produced using the known methods of DNA recombination for example as described for Toxoplasma gondii in EP-A 0431541, and antigens which can be prepared using the known synthetic and semisynthetic processes.
  • allergens are also included since, like the antigens described, they initiate antibody synthesis, in particular IgE, for example mites or house dust.
  • Antigens based on drugs and medicaments and metabolites thereof for example opiates and opioids, cocaine, diazepines, barbiturates, paracetamol, theophylline
  • chemically produced toxins are also included.
  • antigens of plant origin are also included by definition, for example pollen-associated antigens or antigenic substances dissolved in plant juices.
  • non-biological systems or test samples can contain waste water
  • the invention also includes a priori soluble antigens which can be made insoluble by the known methods, for example by polymerization with ethyl chlorocarbonic acid ester according to AVRAMEAS, S. & TERNYNCK, T., J. Biol. Chem. 242, 1,651-1,659, 1967, or by using glutaraldehyde according to AVRAMEAS, S. & TERNYNCK, T., Immunochemistry 6, 53, 1 969, or from ethylienmaleanhydride according to CENTENO, ER & SEHON, A.H., Immunochemistry 8, 887, 1971.
  • the use of the combination preparations according to the invention can be used not only for a priori particulate antigens or for corpuscular antigens bound to inert particles, but also for a priori soluble antigens.
  • hapten is understood by the person skilled in the art to mean low-molecular compounds which do not in themselves produce antibody production and generally have a molecular weight of less than 1000 daitons. If such haptens are bound to a substance which triggers an immunological reaction (for example a protein), antibodies can be obtained which are directed specifically against the hapten or haptens in question.
  • a substance which triggers an immunological reaction for example a protein
  • haptens which according to the invention for Hapte ⁇ leiter the respective components of theticianspraparationen are, 2-nitrophenyl, nitrophenyl, digitoxigenin, digoxigenin, choline chloride, Aminophenylphosphochloride, glycerophosphocholine, nitrophenyl acetate, Trinitrophe ⁇ yl, Trinitrophenylglycin, dimethylsulfoxide, guanidine hydrochloride, 4-hydroxy-nitrophenylacetate 3, 2 , 4-dinitrophenyl, benzyl-EDTA, to name but a few.
  • X and Z can be haptenized by all known methods which are known to the person skilled in the art or can be found in the literature.
  • a haptenization with, for example, a nitrophenyl derivative (for example p-nitrophenyl phosphate) of X and Z can take place, for example, by the agent in question, for example a protein (for example an antibody or a fragment or a derivative thereof) in NaHCÜ3 (for example 0.1 M) , pH 8.5) in the presence of NaCl (for example 0.1 5 M).
  • a volume of approximately 1 ml thereof is added in 10 to 100 ⁇ l of, for example, p-nitrophenylphosphate caproic acid o-succinimide ester (in an aprotic solvent, for example dimethylformamide, for example 20 mg / ml).
  • an aprotic solvent for example dimethylformamide, for example 20 mg / ml.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • a haptenization of the relevant protein to be haptenized can be carried out in the corresponding activated ester, for example nitrophenylphosphate caproic acid o-succinimide ester, which is dissolved in an aprotic solvent, for example dimethylformamide, and in 0.1 M NaHCO 3, pH 8.5 (in the presence of 0.1 5 M NaCl) is carried out.
  • an aprotic solvent for example dimethylformamide
  • pH 8.5 in the presence of 0.1 5 M NaCl
  • Cellular adhesion molecules are to be understood as surface molecules of leukocytes which mediate the adsorption or docking on cellular structures (cells, tissues, for example endothelial cells) in order to co-stimulate them against foreign substances and particles (for example bacteria, viruses, fungi, modified cells) Interaction with other factors (such as CD8 + lymphocytes) to act by lysing the cell in question.
  • cellular structures for example bacteria, viruses, fungi, modified cells
  • CD8 + lymphocytes CD8 + lymphocytes
  • Such surface molecules of T cells. are known.
  • Such surface molecules have a crucial function in cell adhesion and belong to the family of certain glycoproteins (KEIZER, G., et al., Eur. J. Immunol. 15, 1 142 - 1 147, 1 985) with a chain and a ⁇ - Chain (SANCHEZ-MADRID, F. et al., J. Exp. Med. 1 58. 1785 - 1803, 1983), the latter also known as CD18.
  • KEIZER G., et al., Eur. J. Immunol. 15, 1 142 - 1 147, 1 985
  • SANCHEZ-MADRID F. et al., J. Exp. Med. 1 58. 1785 - 1803, 1983
  • adhesion molecules are included in the invention (component 1) according to the definition of the scheme shown in Table 1 (component 1) - but also ligands that bind to LFA-1, such as intercellular adhesion molecules ICAM-1 (CD54) or ICAM-2, which as Members of the immunoglobulin superfamily are included, as well as derivatives and fragments thereof.
  • ICAM-1 is known to be localized on the surface of endothelial cells.
  • Y is a bispecific reagent with anti-Ha-
  • Z a reporter molecule linked to a hapten Ha2 for example an enzyme, dye molecule, radioisotope
  • targeted targeting can thus be carried out to localize infection sites and inflammation sites, since it is known that such ligands (for example ICAM-1) be expressed at such locations.
  • CD28 is only expressed by about half of all CD8 + lymphocytes, in contrast, practically all CD4 + lymphocytes express CD28 (LINDSLEY, PS & LEDBETTER, JA, Annu. Rev. Immunol. H, 1 91 - 21 2, 1 993). It was found that the cytotoxicity caused by bispecific monoclonal antibodies is mainly mediated by CD8 + lymphocytes and effector cells and that blocking the LFA-1 / ICAM-1 or CD2 / LFA-3 pathway reduces this cytotoxicity. Therefore, adhesion molecules have a crucial function as co-stimulators in T-lymphocytes activated by bispecific monoclonal antibodies, whereby the signal transmission is enhanced by the CD3 / TCR and CD28 pathways.
  • the combination preparations according to the invention can be in liquid or solid form and can be filled and packaged in bottles, ampoules or other containers equivalent thereto, preferably in glass or plastic containers.
  • the buffers and media known to the person skilled in the art can be used, if appropriate together with a stabilizing agent.
  • a stabilizing agent for example, tris, phosphate (for example phosphate buffered saline, PBS) or carbonate buffer, sterile water, single or double distilled water or physiological saline are suitable.
  • the known and customary additives such as, for example, albumins or serum albumin (bovine serum albumin [RSA], human serum albumin [HSA]) or other inert proteins, but also biocides, are suitable as stabilizing agents.
  • the combination preparations according to the invention or the parts thereof can also be in lyophilized form if they exist as a product in solid form.
  • the techniques known to those skilled in the art of lyophilization and the reconstitution to be carried out before using the corresponding antibodies can be used.
  • the lyophilized form is preferred if these are present as substances accessible for lyophilization.
  • components 1, 2 and 3 are a protein or a protein associated with a coloring and / or an effector substance (for example a radioisotope, a reporter molecule, a contrast agent).
  • the reconstitution can preferably be carried out using sterile water for injections or using PBS, for example pH 7.0 - 7.2.
  • the individual components can be formulated without restrictions according to the known methods as are used and known in pharmaceutical chemistry.
  • the individual components can be dissolved or suspended in all known physiologically harmless, preferably sterile, liquids, insofar as they are suitable for parenteral administration, such as, for example, physiological saline (PBS), water for injection purposes.
  • PBS physiological saline
  • HSA human serum albumin
  • compositions according to the invention can also be used to control the duration of the effect of the combination preparations according to the invention.
  • Preparations for the controlled or controlled release of the combination preparations according to the invention can be obtained by using polymers to which the combination preparations according to the invention (for example the corresponding proteins or antibodies or parts thereof) can adsorb or complex.
  • the controlled release can then be selected by selecting the available polymers or macromolecules, for example polyester, polyvinyl, polyamino acids, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, pyrrolidone,
  • the combination preparations according to the invention can be incorporated into particles, as a result of which a controlled release or release of active substance can also be achieved.
  • the particles in question are to be selected from polymeric materials, for example polyesters, hydrogels, polyamino acids, polylactic acid.
  • microencapsulation of the combination preparations according to the invention it is also possible to achieve such effects by microencapsulation of the combination preparations according to the invention.
  • the known methods for example coacervation
  • hydroxymethyl cellulose or microencapsulations in gelatin capsule or methyl methacrylate or polymethyl methacrylate or colloidal systems, for example liposomes, microspheres (for example albumin), emulsions are available.
  • Such methods are known to the person skilled in the art and can be found in Remington's Phramaceutical Sciences, 1980. ⁇ 9
  • the ready-to-use formulations are preferably used when the combination preparations according to the invention are to be used for in vivo purposes.
  • the same or equivalent formulations are suitable for in vitro purposes, the physiological safety being of no importance here.
  • a ready-to-use formulation can consist of 10 mg of each component 1, 2 or 3, or equimolar amounts thereof, preferably when X, Y or Z is a protein, dissolved in 1 to 10 ml of PBS, pH 7.2 become; or 5 mg per component, or equimolar amounts thereof, can be dissolved in 0.5 to 5 ml sterile water for injections.
  • the combination preparations according to the invention are either in ready-to-use dilution or concentration or they can be further diluted or concentrated as desired, the person skilled in the art knowing which individual concentration or dilution he would like to use depending on his intended use.
  • X, Y or Z according to Table 1 in particular if these components are proteins, for example antibodies, in a titer range from 1: 1 to 1: 10,000, for example 1:10 to 1: 1000, in particular around the range of 1: 100 available.
  • Dosages of 0.1 to 200 mg, in particular 1 to 50 mg come into consideration depending on the purpose of use and the application methods known to the person skilled in the art.
  • the above-mentioned buffers and media or sterile aqueous solutions for example PBS, saline solutions or water, can be used to dilute the antibody concentration.
  • the entire spectrum known to the person skilled in the art can be considered for administration without restrictions.
  • the administration of components 1, 2 or 3 of the combination preparations according to the invention according to Table 1 can be intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intrapleural, intrathecal, subcutaneous, by perfusion, for example via a catheter, or by injection, for example by means of a syringe, systemically or locally, for example by direct intralesional injection or by injection into the vicinity of the organ or tissue to be treated.
  • the application is carried out in the form of a sterile aqueous solution, as described above.
  • amounts in the ng, ⁇ g or mg range can be used, depending on the type of disease to be treated.
  • the doses can be in the ng and ⁇ g range, whereas for in vivo applications doses in the ⁇ g and mg range can be considered depending on the response rate or effect, the disease and the reactions of the treated Patients on the administrations. Based on these parameters, the person skilled in the art knows when the dosages are to be reduced or when they have to be increased.
  • doses between 0.5 and 200 mg, in particular between 5.0 and 100 mg can be assumed for the individual components in these cases.
  • the application routes also depend on the type, location and degree of the disease.
  • intravenous, intraarterial or intrapleural administration should preferably be used.
  • Intraperitoneal administration is preferred for ovarian tumors or for diseases of the peritoneum.
  • intrathecal and intravenous administration can be considered in particular.
  • Subcutaneous doses will be used, for example, for skin lesions, Hodgkin's disease or lymphomas.
  • Perfusions by means of a catheter can preferably be considered if metastatic tumors, for example the lungs, the breast or to be treated by the liver.
  • metastatic tumors for example the lungs, the breast or to be treated by the liver.
  • isolated perfusion can be carried out according to known methods
  • Methods are more promising than, for example, systemic intravenous administration.
  • Components 1, 2 and 3 of the combination preparations according to the invention can be present as spatially separate components in the form of a packaging unit, in particular as a kit or kit-of-parts, or components 1 and 2 can be present spatially separated from component 3 in a packaging unit.
  • Fig.1 Basic schematic representation of the combination preparations according to the invention.
  • Determinant Ha-] equipped reagent R ( ⁇ ) binds specifically to a target site (T).
  • one anti-Ha 1 part of the bispecific reagent (BiAb ( ⁇ j) the other anti-Ha2 part reacts with an effective or detectable agent, for example an effector molecule EM (z), which carries a determinant Ha2, where Ha-
  • Ha2 is and Ha-]
  • Ha2, T, R ( ⁇ ) BiAb ( ⁇ ) and EM () are defined according to Ha-]
  • Ha2, T, X, Y and Z as in Table 1.
  • Fig. 2 ELISA representation according to Example 7. The graphic shows the absorption spectrum at 405 nm after 30 minutes of incubation
  • Fig. 3 Flow cytometric analysis.
  • the B cells were incubated with haptenized CD 19 antibodies. After washing, the lines were incubated with the anti-DNP: anti-DIG bispecific antibody and, after washing twice, stained with haptenized FITC.
  • a dialysis tube with a length of 1 5 cm, a size of 3-20 / 32 "and a diameter of 1 5.9 mm (company Faust, Cologne, Germany) was placed in 1 liter of distilled water (dH2 ⁇ ) (Fresenius, Germany) for 1 5 minutes. with 2 mM EDTA (Sigma, Deisenhofen, Germany), this solution was poured off and the dialysis tube slowly stirred for a further 15 minutes in 1 liter of dH2 ⁇ , 1 mM EDTA, then the dialysis tube was rinsed with dH2 ⁇ and in an aqueous sodium azide solution (0.02% sodium azide (Sigma) in dH2 ⁇ ) at 4 ° C.
  • dH2 ⁇ distilled water
  • 2 mM EDTA Sigma, Deisenhofen, Germany
  • KLH was concentrated in a concentration of 10 mg / ml in a dialysis volume of 15 ml 3 times against 0.1 M sodium hydrogen carbonate, pH 8.0 (Merck, Darmstadt, Germany ) dialyzed for 1 hour at room temperature for 1 hour at room temperature and then 1 time overnight at room temperature. 1 .2. Haptenization of KLH with 2,4-dinitrophenol (DNP)
  • reaction solution was then dialyzed 3 times against 1 liter of phosphate buffered saline, pH 7.0 (PBS) for 2 hours each at room temperature in order to remove residues of DMF and uncoupled nip-cap-OSuc. The coupling was then verified with an ELISA.
  • the KLH-DNP conjugate was sterile filtered (filter: 3 ⁇ , Millipore) and briefly at 4 ° C, for longer storage at -20 ° C.
  • Dialysis of the OKT3 antibody (anti CD3, ATCC CRL 8001, Proc.Nat.Acad.Sci., USA 77: 4914-4917, 1980, U.S. Patent 4,361, 549) was carried out according to Example 1.1.
  • the haptenization of OKT3 with DNP was also carried out here by esterification with an activated succinimide ester, whereby according to Example 1 .2. was proceeded.
  • the according to Example 2.1. dialyzed antibody solution (1 mg / ml) with NIP-cap-OSuc in a concentration ratio of 10: 1 8t, (corresponding to a molecular ratio of 40: 1) combined and as in
  • Example 1 described further procedure.
  • a polyclonal goat anti-mouse IgG (Southern Biotechnology Association, Ine (SBA)., Birmingham, USA) with H and L chains was used as the uncoupled capture antibody.
  • This antibody was on a 96-well plate (Immuno Maxisorp F96, Nunc GmbH, Wiesbaden, Germany) by binding to the plastic surface with a concentration of 5 ⁇ g antibody per ml PBS (Gibco BRL, Gaithersburg, USA) and 50 ⁇ l per hole at 4 ° C immobilized overnight.
  • the free binding sites on the plastic surface were saturated with 100 ⁇ l PBS with 10% cattle serum albumin (BSA, Sigma, Deisendorf, Germany) per hole at an incubation time of 30 minutes and room temperature to prevent non-specific binding of further reagents.
  • the OKT3-DNP antibody was not diluted at 1, 0.5, 0.2, 0.1, 0.05 and 0.01 mg / ml in PBS / 1% BSA and the corresponding positive controls (same isotype, DNP-coupled) and negative controls (different isotype) DNP coupled) pipetted onto the plate.
  • the volume was 50 ⁇ l per well and the incubation time was 30 minutes at room temperature. It was then washed 3 times with 250 ⁇ l PBS / 1% BSA per hole.
  • mice For the immunization of Balb / c mice, the two haptens 2,4-dinitrophenol (DNP) and digoxigenin (DIG) (Sigma, Deisenhofen, Germany) were used using glutaraldehyde (Merck, Darmstadt, Germany) to form KLH conjugates with keyhole limpet hemocyanin (KLH) (Boehringer Mannheim, Germany) cross-linked.
  • DNP 2,4-dinitrophenol
  • DIG digoxigenin
  • 1.0 mg DNP and 1.0 mg DIG with 5.0 mg KLH in a molar ratio of 1: 3 were dissolved in O.1 M a2HP ⁇ 4, pH 8.3, and together with 0.05% glutaraldehyde incubated on a shaker (DPC® Micromix 5, Gwynedd, Wales, UK) for 30 minutes at 21 ° C (room temperature).
  • a volume of 2.0 ml of this solution was placed in a dialysis tube (1 5 cm long, size 3-20 / 32 ", diameter 1 5.9 mm, from Faust, Cologne, Germany) and at 4 ° C for 1 hour dialyzed against 0.5 liters of 0.1 M NH4CI, the reaction being stopped, the corresponding DNP or DIG conjugates were dialyzed against 2.0 liters of PBS at 4 ° C.
  • mice Three days after the last immunization according to example 3.1. myeloma cells (Sp2 / 0, ATCC CRL 1 581) and spleen cells of the mice immunized with both DNP and DIG in a ratio of 1: 2 by polyethylene glycol (PEG) fusion (PEG 4000, Boehringer Mannheim, Germany) in RPMI 1 640 medium (Gibco BRL) fused according to known methods as follows: 50 x 10 6 Sp2 / 0 myeloma cells and 10 x 10 7 spleen cells, the latter having been mechanically homogenized beforehand, were combined.
  • PEG polyethylene glycol
  • RPMI 1 640 medium Gibco BRL
  • the mixture was then washed twice in RPMI 1640 medium to remove protein complexes (400 ⁇ g, 5 minutes, then 200 ⁇ g, 5 minutes, each at 21 ° C.).
  • On the & Loose cell pellet obtained was pipetted in with gentle shaking at 37 ° C. warm PEG (PEG 4000, Boehringer Mannheim, Germany) (1.0 ml).
  • the fusion batch was then slowly made up to 50 ml with RPMI 1 640 and centrifuged at 200 ⁇ g at room temperature for 5 minutes.
  • This washing step was repeated once more before the fusion mixture was decomplemented in 36 ml of selection medium or HAT medium (RPMI 1640 with Glutamax KGibco BRL), 10% fetal calf serum (FCS) for 30 minutes at 56 ° C. (Gibco BRL), 0 , 1% ciprofloxacin (Bayer AG, Germany), 5x10 '3 M hypoxanthine, 2x10 5 M aminopterin, 8x10 " 4 M thymidine) was added.
  • selection medium or HAT medium RPMI 1640 with Glutamax KGibco BRL
  • FCS fetal calf serum
  • FCS fetal calf serum
  • HGPRT defect hyperxanthine-guanine phosphoribosyl transferase
  • Hybridomas were checked in the ELISA and then subcloned.
  • Defect mutants of the DIG hybridomas were isolated in analogy to the DNP hybridomas.
  • the anti-DNP and the anti-DIG antibodies were in the same dilutions as in Example 2.3.
  • the cell number of the respective hybridomas was determined and dilution series (10.3, 1 and 0.3 cells per 0.1 ml and per well) in cell culture medium (RPMI 1640 (GIBCO BRL), 5% fetal beetle serum (GIBCO BRL) 100 lU / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml Streptomyci ⁇ and 0.3 mg / ml glutamine) performed.
  • cell culture medium RPMI 1640 (GIBCO BRL), 5% fetal beetle serum (GIBCO BRL) 100 lU / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml Streptomyci ⁇ and 0.3 mg / ml glutamine
  • 100 ⁇ l of the cell suspension dilutions were plated onto the 96-well round-bottom culture plates (Costar, Cambridge, USA) and cultured at 37 ° C., 7% CÜ2 for one week.
  • the respective DNP and DIG hybridoma cells (2 ⁇ 10 7 cells each) were mixed, washed twice in 50 ml of RPMI 1 640 (1400 rpm or 300 ⁇ g, 5 minutes, room temperature), according to Example 3.2. merged and processed analogously.
  • DNP and DIG hybridomas were taken up 2x10 7 cells in 50 ml RPMI 1 640 medium and washed 3 times (400 xg, 5 minutes, room temperature). The cell pellets were then resuspended with gentle shaking in PEG 4000 (1 ml) (Boehringer Mannheim, Germany) at 37 ° C., made up to 50 ml with RPMI 1640 medium and centrifuged at 200 ⁇ g at room temperature for 5 minutes.
  • the fusion mixture was then dissolved in 8.0 ml selection medium (RPMI 1 640 with Glutamax KGibco BRL), 10% fetal calf serum (FCS), decomplemented for 30 minutes at 56 ° C (Gibco BRL), 0.1% ciprofloxacin (Bayer AG, Germany), 5x10 -3 M hypoxanthine, 2x10 -5 M aminopterin, 8x10 " 4 M thymidine, 100 IU IL-6 / ml (Sigma)) and placed in 24 perforated plates (Costar, Cambridge, USA) with 5 x 10 ⁇ cells / ml and 1, 0 ml / hole under sterile conditions in an incubator (Tecnomara, Heraeus, Osterode, Germany) in a moisture-saturated atmosphere pipetted with a CO2 content of 7% and at a constant temperature of 37 ° C.
  • RPMI 1 640 with Glutamax KGibco BRL 10% fetal calf serum
  • hybrid hybridomas tetradomes
  • BSA bovine serum albumin
  • FCS fetal calf serum
  • DIG-conjugated peroxidase which was prepared analogously to Examples 1.1. And 1 .2., was diluted 1: 2000 from a stock solution (1 mg / ml) pipetted in per hole (100 ⁇ l per hole) and incubated for 30 minutes at room temperature After washing three times (PBS / 10% FCS, 200 ⁇ l per hole), ABTS was added in accordance with Example 2.3 and then analyzed as in Example 2.3 .
  • Tetradome cultures in which the desired bispecific anti-DNP: anti-DIG antibodies could be detected were then subcloned up to 20 times.
  • the antibodies produced were washed 3 times with Tris buffer (20 mM, pH
  • the antibody fraction was eluted by a step gradient against NaCl (0.01-0.5 M NaCl). Those fractions in which antibodies could be detected were further diluted with 2 M NH4 ⁇ S0> 2 to a final concentration of 0.85 M (NH4 (S ⁇ > 2). The bispecific antibodies were further purified on a
  • Phenyl-Superose column (Pharmacia) from which it is continuous
  • Example 5 Production of cytotoxic T cells (effector cells)
  • PBMC Human mononuclear blood cells
  • EBV immortalized B cells were obtained by the method of STUART, A.D. et al., Oncogene H (9): 1 71 1 -1 719, 1995. This
  • the fluorescence was then evaluated in a DELFIA fluorometer (Wallac, Turku, Finland) using a 613 nm filter for the determination of europium. Background fluorescence was obtained from three extra holes, which
  • Example 7 Use of the anti-DNP: anti-DIG bispecific antibodies in an enzyme-linked immunosorbent test (ELISA)
  • the principle of the ELISA is the specific antigen determination with antibodies.
  • the test is used to detect immunoglobulin G4 (human).
  • the structure of this test system is based on the sandwich principle. So-called trap antibodies are coupled to a plastic surface, which recognize the antibody to be tested. The supernatant to be tested is then added.
  • a second, hapten (DNP) - coupled antibody is added, which in turn specifically binds to the test antibody.
  • the bispecific anti-DNP: anti-DIG antibody is added and then washed.
  • hapten (DIG) labeled enzyme is added and visualized or detected through substrate after incubation and washing.
  • the detection antibody can also be labeled with the enzyme before the ELISA by equimolar mixing of hapten-labeled detection antibodies with anti-DNP: anti-DIG bispecific antibodies and hapten (DIG) -labeled enzyme.
  • anti-DNP anti-DIG - (component 2) bispecific antibody
  • the unconjugated antibody Human IgG (Reagent 1) (LD Laboratory Diagnostics, Heiden, Germany) was immobilized on the 96-well plate by binding to the plastic with a concentration of 5 ⁇ g antibody / ml PBS and 50 ⁇ l / hole at 4 ° C. overnight.
  • the free binding sites on the plastic surface were saturated with 100 ⁇ l PBS with 1% BSA / hole at an incubation time of 30 minutes and room temperature (RT) in order to prevent non-specific binding of further reagents.
  • the solution to be tested (reagent 2) was pipetted onto the plate in various dilution series (1, 0.5, 0.2, 0.1, 0.05 and 0.01 mg / ml in PBS / 1% BSA) and the corresponding positive and negative controls.
  • the volume was 50 ⁇ l / well and the incubation time was 30 minutes at RT. It was then washed 3 times with 250 ⁇ l PBS / well.
  • the bispecific anti-DNP: anti-DIG antibody (reagent 3 or component 2) was then added at a dilution of 0.1 ⁇ g / ml and incubated for one hour at RT. After washing three times, 100 ⁇ l of DIG-conjugated HRP (reagent 4 or component 3) were added.
  • Substrate buffers 200 ⁇ l / well were added after 1 hour of incubation and three washes and incubated for at least 5 minutes at RT. The incubation period was chosen so that the OD value of approx. 1.0 was not exceeded.
  • the 9 * • Enzymatic color reaction (ABTS) was measured in the ELISA reader at 405 nm. The result, which demonstrates the functionality of the combination preparations according to the invention using this example, is shown in FIG. 2.
  • Example 8 Surface staining of PBMC with fluorescein isothiocyanate
  • Anti-DNP anti-DIG bispecific antibody (as component 2)
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Example 9 Immunization with tumor proteins by focusing tumor antigens on dendritic cells
  • Idiotype 38 CB (described in BERGMAN, Y. & HAIMOVICH J., Europ. J. Immunol. 7: 413-41 7, 1977 and ESHAR, Z. et al., J. Immunol. 122: 2430-2434, 1979) haptenized with DNP (as component 1), • anti-DNP: anti-DIG bispecific antibody (as component 2). anti-class II antibody (ATCC, HB42) haptenized with DIG (as component 3)
  • the combination preparations according to the invention are eminently suitable for immunization with tumor proteins.
  • Example 10 Formulation of a combination preparation
  • Component 1 Anti-human-cytomegalovirus immediate early antigen (IEA) monoclonal antibody, mouse IgG-] (IEA E13, Argene
  • Component 2 Bispecific anti-DNP: anti-DIG antibody.
  • Component 2 horseradish peroxidase (HRPO), haptenized with DIG.
  • HRPO horseradish peroxidase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Kombinationspräparationen, bestehend aus drei Komponenten, welche für die zielgerichtete Verwendung in der Immunologie sowohl in der Diagnostik als auch in der Therapie Anwendungen findet. Die Kombination beruht auf der universellen Verwendung eines Immunolinkers als Bestandteil der Kombinationspräparationen, welcher zwei weitere verschiedene mit unterschiedlichen Determinanten ausgestattete Komponenten binden kann.

Description

KO BINATIONSP ÄPΛRATIONEN UND IHRE VERWENDUNG IN DER IMMUNDIAGNOSTIK UND IMMUNTHERAPIE
Beschreibung
Technisches Gebiet
in Die vorliegende Erfindung betrifft eine Kombination aus drei in der Immunologie verwendbaren Präparationen oder Formulierungen (Komponenten), bestehend aus mindestens einer mit einer definierten spezifischen, immunologisch reaktiven Determinante Ha-] ausgestatteten bzw. verbundenen ersten Komponente, einer mindestens bispezifischen zweiten Komponente mit Bindungsspezifität für Ha -|
15 (anti-Ha -] ) und für mindestens eine weitere Bindungsspezifität für eine definierte spezifische, immunologisch reaktive Determinante Ha2 (anti-Ha2) oder mit weiteren Bindungsspezifitäten für mehrere solcher Determiaπten Han (anti-Haπ), welche untereinander verschieden sind, und einer dritten Komponente, welche mit mindestens einer definierten spezifischen, immunologisch reaktiven Determinante « Ha2 oder mit mehreren solcher Determinanten Han ausgestattet bzw. verbunden ist oder sind, wobei Ha-j , Ha2 und Han untereinander verschieden sind.
Die erfindungsgemäße Kombination findet allgemein Anwendung in der Immunologie, sowohl in der Immundiagnostik als auch als prophylaktisches und ^ therapeutisches wertvolles Mittel.
Stand der Technik
0 Der zielgerichteten Verwendung von Stoffen für diagnostische oder immunhistochemische und therapeutische Zwecke, um bestimmte Gewebe und Zellen des tierischen Körpers, insbesonders des Menschen, spezifisch und effizient zu erreichen ("Targeting"), liegt der Gedanke zugrunde, geeignete Mittel oder Wirkstoffe an gewünschte, spezifische Orte außerhalb (in vitro) oder innerhalb (in 5 vivo) des Körpers zu transportieren und dort binden zu lassen und andere Gewebe und Zellen in vitro oder in vivo von diesem "Targeting" auszuschließen. Zum Erreichen dieses Ziels stehen im Prinzip drei Methoden zur Verfügung. Zum einem kann ein eine gewünschte Wirkung entfaltender Stoff lokal an eine l
Körperstelle, beispielweise topisch, appliziert werden. Dieses Verfahren besitzt jedoch die Nachteile, daß nur Stellen des Körpers erreicht werden können, die direkt zugänglich sind und daß der betreffende Stoff aufgrund von Diffusionsvorgängen nicht nur am gewünschten Ort und dort mit rasch abnehmender Intensität seine Wirkung entfaltet.
Zum anderen besteht die Möglichkeit anhand der bestimmten chemischen und physiologischen Eigenschaften bestimmter Agentien, diese Stoffe durch ihre Bioverteiiung in bestimmten Körperbereichen (Organen, Geweben) anreichern zu lassen. Der Nachteil dieser Verfahren besteht insbesondere darin, daß die Verwendung dieser Stoffe eng begrenzt wird durch ihre chemische Beschaffenheit, sodaß Bioverteilung und ortspezifische Wirkung oft nicht in der erhofften Weise in Einklang gebracht werden können.
Als dritte und modernste Möglichkeit wird seit ca. zwei Jahrzehnten versucht, bestimmte Proteine, insbesondere Antikörper, als Vehikel für ein zielgerichtetes Transportieren von Wirksubstanzen zu verwenden, um derartige Stoffe an gewünschte Stellen in vitro oder in vivo für immundiagnostische oder immunhistochemische und immuntherapeutische Zwecke zu bringen. Durch die Verfügbarkeit von monoklonalen Antikörpern seit Mitte der siebziger Jahre (KÖHLER, G. & MILSTEIN, C, Nature 256, 495 - 497, 1 975) wurden Mittel in die Hand gegeben, intensive diagnostische, immunhistochemische und therapeutische Untersuchungen und Prüfungen mit entsprechend modifizierten monoklonalen Antikörpern (Mabs) durchzuführen.
Aufgrund der unzureichenden Fähigkeit der monoklonalen Antikörper per se therapeutisch oder diagnostisch Effizient zu sein, sind gerade in letzter Zeit Bemühungen unternommen worden, diese Effizienz dadurch zu erhöhen, daß verschiedene Agenzien oder Effektormoleküle, z.B. bakterielle oder pflanzliche Toxine, Radionuklide oder cytotoxische Substanzen mit Mabs konjugiert bzw. kovaleπt verbunden wurden. Derartige Immunokonjugate werden seither in der Diagnose und Therapie verwendet (GOLDENBERG, D. M. , Immunol. Today 10, 286 - 288, 1989).
Nicht zuletzt wegen verschiedener Nachteile dieser Immunokonjugate wurden alternative Moleküle für das "Targeting" hergestellt. Bispezifische Antikörper wurden entwickelt, welche zwei verschiedene antigen-spezifische Bindungsstellen besitzen: eine für Tumor assoziiertes Antigen, auch als "target binding arm" bezeichnet, und eine andere für das Effektormolekül ("effector binding arm"). Derartige bispezifische Antikörper haben ein Spektrum an potentiellen Verwendungsmöglichkeiten sowohl in der Immundiagnostik, Immunhistochemie, Immuπhistologie, Immuncytologie als auch bei der Immuntherapie zur zielgerichteten Applikation cytotoxischer, cytocidaler oder cytostatischer - Substanzen.
Gegenüber den Immunokonjugaten besitzen die bispezifischen Antikörper verschiedene Vorteile: cytotoxische Substanzen können ohne vorherige Spaltung der kovalenten Bindung an den gewünschten Zielorten freigesetzt werden und unspezifische toxische Wirkungen können verringert werden. Bispezifische m Antikörper (beispielsweise der IgG Klasse) sind strukturell bivalent oder multivalent (insbesondere IgM) aber funktioπell monovalent für jede Antigenbindungsstelle.
Eine Übersicht über die Herstellung und Verwendung bispezifischer Antikörper in der Diagnostik und Therapie geben beispielsweise die Artikel von SONGSIVILAI, S.
15 & LACHMANN P. J., Clin exp. Immunol. 79, 31 5 - 321 , 1990; RENNER, C. & PFREUNDSCHUH, M. , Immunol. Rev. 5, 1 79 - 209, 1995; HAMILTON, R. G. , Clin. Chem. 39 (9), 1988 - 1997, 1 993; FANGER, M. W. & GUYRE, P. M., Tibtech 6, 375 - 380, 1 991 ; Fanger, M. et al., Crit. Rev. Immunol. 12 (3,4), 101 - 1 24, 1992; FANGER, W. M. et al. , Immunomethods 4, 72 - 81 , 1994, und BRISSINCK, 0 J. et al., Drugs of the Future 12 (1 1 ), 1003 - 1010, 1992.
Bekannt ist die Verwendung von bispezifischen Antikörpern mit dualer Spezifität bei Immunoassays, beim Tumor "Targeting", zum Kreuzverbinden ("cross-linking") zellulärer Aπtigene und "Targeting" von Effektorzellen, zur spezifischen Freisetzung 5 von Wirkstoffen an Zielzellen oder zum Triggern von Effektorzellen, welche nach Stimulation zelluläre Zytotoxizität vermitteln (beispielsweise phagozytische Zellen, natürliche Killerzellen [NK-Zellen] oder T-Lymphocyten).
Bekannt sind bispezifische Antikörper, welche über Hybridhybridoma hergestellt 0 wurden, die einerseits eine Spezifität gegen das CD3 Protein (T-Zell Rezeptor Komplex) auf der Effektorzelle aufweisen und andererseits spezifisch gegen die lgκ- 1 b Kette des Immunoglobulins der Ratte sind (GILLILAND, L. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 7719 - 7723, 1 988). Dieser bispezifische Antikörper war in der Lage, in vitro die Zielzelle in Kooperation mit T-Zellen (Thymon der Maus) zu 5 lysieren. BERG, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88- 4723 - 4727, 1 991 , beschreiben einen bispezifischen Antikörper, dessen einer Arm aus dem Fusionsprotein CD4 γ1 /κ(L)Kette und dessen anderer Arm aus einem CD3 γ 1 /κ Paar bestand. Der Arm mit dem Fusionsprotein band HIV gp1 20, der gegenüberliegende Arm reagierte mit CD3 (T-Zell Rezeptor) und aktivierte die zytotoxische T-Zelle. Es konnte gezeigt werden, daß dieser Antikörper HIV infizierte Zellen lysierte. Weitere bispezifische Antikörper mit Tumor zerstörenden Eigenschaften bzw. Triggerfunktion zellulärer Cytotoxizität sind bekannt von beispielsweise BRISSINCK, J. et al., J. Immunol. 147, 4019 - 4026, 1 991 . In der Publikation von JUNG, G. et al., Eur. J. Immunol. 21, 2431 2435, 1 991 , werden bispezifische
Antikörperfragmente vom lgG2a Typ (Fab und F(ab')2> beschrieben, die spezifisch mit Zielzellen (Melanoma) und gegen CD3 bzw. CD28 reagieren. Diese anti- Melanoma x anti-CD3 und anti-Melanoma x anti -CD28 Konjugate zerstörten die Zielzellen in vitro und eröffnen eine sytemische Anwendung in vivo für die Tumortherapie über T-Zell Stimulierung.
Ein bispezifischer Antikörper wurde über chemische Kopplung ("cross-linking") hergestellt, der sowohl gegen ein Epitop der ß-Kette von Fibrin als auch gegen Urokiπase (scuPA) gerichtet war. Dieses bispezifische Konstrukt vermochte sowohl die fibrinolytische Effizienz als auch die Fibrinspezifität von scuPA zu erhöhen, indem Fibrinmonomere und Plasmaverklumpungen mit diesem Antikörper gegenüber der alleinigen Wirkung von scuPA signifikant erhöht werden konnte (CHARPIE, J. R. et al., Biochemistry 29, 6374 - 6378, 1990). In einem anderen Fall konnte gezeigt werden, daß ein über "cross-linking" konstruierter bispezifischer Antikörper, der einerseits spezifisch war für tPA (tissue plasminogen activator) andererseits für Fibrin, die fibrinolytische Aktivität von tPA erhöhen konnte (BODA, C. et al. , J. Biol. Chem. 264, 944 - 948, 1 989).
Eine antivirale Wirkung von heterokonjugierten bispezifischen Antikörpern wird von STAERZ, U. D. et al., Eur. J. Immunol. 17, 571 - 574, 1 987, beschrieben. Die hierbei verwendeten Antikörper waren spezifisch gegen T-Zell Antigen Rezeptor und spezifisch gegen Hämaggtutinin (HA) oder gegen Nukleoprotein eines Influenza Virus. Hierdurch konnte eine Lyse der durch das Virus infizierten Zellen erreicht werden. In einem anderen Fall wurden über Hybridhybridoma hergestellte bispezifische Antikörper mit dualer Spezifität für TCR x HA Influenza A (Fusion zwischen lgG2b spezifisch gegen Influenza Virus HA und lgG2a spezifisch gegen V ß8 von TCR) erfolgreich zur Inhibition der Influenza Virus Replikation verwendet. Eine Zellyse von mit HIV infizierten Zellen durch bispezifische Antikorperkonjugate (antι-HIV- 1 gp1 10:antι-CD3/TCR Komplex oder antι-gp1 1 0:antι-CD1 6Fcγ-R) wurde beschrieben von ZARLING, J. M. et al., J. Immunol. 140, 2609 261 3, 1 988. Bispezifische Antikorperheterokonjugate mit den Spezifitäten antι-CD3:antι-HSV- 1 gpC oder antι-FcγRIII:antι-HSV- 1 gpD erhöhten die Immunitat gegen Herpes Simplex Virus (HSV) Infektionen bzw. zerstörten HSV infizierte Zellen (PAYA, C. V. et al., J. Immunol. 142, 666 - 671 , 1 989).
Targeting von CD4 + Helfer/Killer Zellen durch einen antι-CD3 x anti-Glioma bispezifischen Antikörper verursachte zusammen mit IL-2 aktivierten CD4 + - Helfer/Killer Zellen einen Anstieg an Zytotoxizität gegen Gliomazellen in vitro, sodaß hiermit eine adoptive Tumorimmuntherapie vorgeschlagen wurde. Auch eine Inhibition von Colontumorwachstum konnte mit einem bispezifischen Antikörper der Spezifität antι-c-erb-B2:antι-CD3 plus CD4 + positiven Zellen erreicht werden (NISHIMURA, T. et al., J. Immunol. 148. 285 - 291 , 1 992) . An 10 Patienten konnte in vivo die Wirkung gegen malignes Gliom mit einer derartigen adoptiven Immuntherapie unter Verwendung eines chemisch konjugierten anti-CD3 monoklonalen Antikörpers plus anti-Glioma Antikörper mit Lymphokin (rekombinantes IL-2) aktivierten Killerzellen gezeigt werden (NITTA, T. et al. , The Lancet 335, 368 - 371 , 1 990). Von DONOHUE, J. H. et al., Cancer Research 50, 6508 - 6514, 1990, wird in ähnlicher Weise beschrieben, daß ein bispezifisches Reagenz (Immunheteroaggregat) mit der Spezifität anti-CD3 x anti-Tumorantigen durch in vitro aktivierte periphere Blutlymphocyten (PBLs) Ovarialkarzinomzellen in vitro lysierte. In einer früheren Arbeit (RAMMENSEE, H.-G. et al., Eur. J. Immunol. 17, 433 - 436, 1987) wurden Antikörper, die spezifisch waren für Vß8 + T-Zell Rezeptoren, mit 2,4,6-Trinitrophenyl (TNP) haptenisiert und mit Rezeptoren von TNP- spezifischen B-Zellen verbunden. Dieses Konstrukt lysierte TNP-spezifische B- Hybridome und Blastzellen von Mäusen, die transgeπ waren hinsichtlich μ, eines TNP-spezifischen Antikörpers. Ein targeting der Effektorfunktionen von zytotoxischen T-Lymphocyten (CTL) konnte damit über Antigen-spezifische Rezeptoren an Antigen-spezifische B-Lymphozyten erfolgen und die Anzahl an B- Zellen in vivo manipuliert (erniedrigt) werden.
Neben B- und/oder T-Zellen wurden auch aktivierte Makrophagen als Effektorzellen in Verbindung mit bispezifischen Antikörpern vorgeschlagen. Erste klinische Prüfungen mit derartig getriggerten Makrophagen sollen eine erhöhte Tumorlyse bestätigt haben (BAUER, T. & DRAKEMAN, D. L., Vox Sang 61, 1 56 - 1 57, 1 991 ). Periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) als Effektorzellen werden von MENARD, S. et al., Int. J. Biol. Markers 4 (3), 1 31 - 1 34, 1 989, offenbart, wobei als bispezifisches Reagenz ein anti-CD3 x anti-Ovarkarziπom Antikörper zur Lyse der Zielzellen (Ovarialkarzinom) verwendet wurde.
Bekannt ist auch, daß bispezifische Antikörper zur Anwendung bei immundiagnostischen Assays (ELISA) und in der Immunhistochemie geeignet sind. Ein Beispiel für diese Anwendung wird beschrieben von MILSTEIN, C. & CUELLO, A. L. , Nature 305, 537 - 540, 1983. In diesem Fall konnte mit einem anti-So- matostatin x anti-Peroxidase bispezifischen Antikörper immunhistochemisch So- matostatin in bestimmten Hypophysenregionen nachgewiesen werden.
MICHAELSEN, T. E., Eur. J. Immunol. 21, 1 1 - 1 6, 1991 , stellten chimäre anti-(4- hydroxy-3-nitrophenyl)acetyl (NP) Antikörper her, die auch mit dem Hapten p- Nitrophenylphosphat (NIP) reagierten, um damit die Complement vermittelte lytische Eigenschaften von IgG Isotypen zu untersuchen. Es wurden durch die Markierung mittels zweier verschiedener Haptene eine Verteilung von zwei verschiedenen Antigenen auf den Zielzellen festgestellt. Gemäß der Publikation von JU, S.-T. et al., Mol. Immunol. 26 (3), 283 - 292, 1989, wurden durch Fusion einer Myelomzetlinie, die α/λ2 Antikörper produzierte, und einer Hybridomlinie, die μ/λ-j Antikörper produzierte inter alia Immunglobuline der Serotypen IgM und IgA sezerniert, die bispezifisch waren für sowohl das Hapten 2,4-Dinitrophenyl (DNP) als auch für das Hapten 4-Hydroxy-3- nitrophenylacetyl (NP). Grundlage der Untersuchung war hierbei festzustellen, welche Molekülklassen der L- und H-Ketten nach Myelom-Hybridom Fusionen welche Haptene (NP und/oder DNP) mit welcher Avidität zu binden vermochte und um zu bestimmen, welche Bedeutung die Vλ-| und Vλ2 Sequenzen (L-Ketten) bei der Entstehung der Antikörperaktivität haben. Es wurde eine duale Bindungseigenschaft bei K, λ-j und λ2 der anti-NP Antikörper festgestellt.
Neben den vorgenannten Verwendungen sind für bispezifische Antikörper spezifische, duale Bindungen an CD3 und CD25 (p55 Kette des IL-2 Rezeptors) beschrieben worden. Ein solcher anti-CD3:anti-CD25 bispezifischer Antikörper war in der Lage, selektiv an aktivierte CD25 exprimierende T-Zellen und Lymphoma zu binden, wobei beide Antigene CD3 und CD25 erkannt und von aktivierten T-Zellen koexprimiert werden. Bekannterweise sind T-Zellen Hauptmediatoren bei ?
Abstoßungsreaktionen und bei einer Anzahl von Autoimmunerkrankuπgeπ Entgleisende oder dysregulierte T-Zellen spielen somit eine wichtige Rolle in vielen Autoimmunerkrankungen und lymphopro ferativen Krankheiten (z.B. Lymphome). Von MACLEAN, J. A. et al. , J. Immunol. 150, 1 61 9 1 628, 1 993, konnte gezeigt werden, daß antι-CD3:antι-CD25 bispezifische monoklonale Antikörper Cytolyse von CD25 tragenden alloreaktiven T-Zellen und bei cytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) mit Undefinierter Spezifität bewirken. Da eine derartige "redirected" Cytolyse einen engen räumlichen Kontakt von CTL mit CD25 + Zellen verlangt, ist ein therapeutischer Effekt für solche Gewebe und Zellen zu erwarten, die durch aktivierte CTL infiltriert sind, wie es in Organen mit Zellabstoßungsreaktionen oder Autoimmuneffekten der Fall ist. Im vorliegenden Fall konnte durch den anti- CD3:anti-IL-2 Rezeptor (anti-CD25) bispezifischen Antikörper eine wirkungsvolle CTL Stimulation erreicht werden, um CD25 Antigen tragende PHA (Phytohemagglutinin) stimmulierte T-Zellen und IL-2 Rezeptor positive Tumorzellen zu lysieren.
In einem anderen Fall konnten über CD3:CD19 bispezifische Antikörper T-Zellen von Patienten mit chronisch lymphocytischer Leukämie, in Kombination mit monospezifischen, bivalenten anti-CD28 Antikörpern, aktiviert werden. Hierbei wurden insbesondere CD4 "1" T-Zellen aktiviert und zur Proliferation angeregt. Es war eindeutig eine starke Abnahme der Anzahl von CD19 + malignen B-Zellen zu erreichen, wohingegen sowohl mit anti-CD3:anti-CD1 9 bispezifischen Antikörpern für sich allein als auch auch mit den einzelnen Antikörpern anti-CD3 plus anti-CD19 plus antι-CD28 keine solche Abnahme erzielt werden konnte, aber auch keine Stimulation von CD2 + , CD4 + und CD25 + T-Lymphocyten. In diesem Fall konnte nur mit der Kombination anti-CD3:antι-CD19 plus anti-CD28 eine Cytotoxizität gegen autologe maligne B-Zellen erreicht werden. Eine derartige T-Zell Aktivierung war selbst mit sehr geringen Dosen der eingesetzten Antikörper (1 ng/ml) zu erhalten. Eine Stimulierung von T-Zellen mit der genannten Kombination von bispezifischen und monospezifischen, bivalenten Antikörpern war mit einem starken Anstieg einer IL-2, IL-6 und Interferon-γ Sekretion der betreffenden T-Zellen verbunden. Für die Therapie von chronisch lymphocytischer Leukämie wird eine solche Vorgehensweise vorgeschlagen (BOHLEN, H. et al., Blood 82, 1 803 - 1 81 2, 1 993). 2
Weitere Verwendungen bispezifischer Antikörper, auch in Kombination mit anderen anti-CD Antikörpern, sind in der vielfältigen Literatur beschrieben und sind dem Fachmann bekannt. Es soll hierbei inter alia auf die entsprechenden Übersichtsartikel und auf die weitere in der Publikation von BOHLEN, H. et al. , 1 993, loc cit., zitierte Literatur verwiesen werden.
Weiterhin sind erfolgreiche cytolytische Wirkungen von bispezifischen Antikörpern bekannt bei renalem Zellkarzinomen (VAN, DJ. et al. , Int. J. Cancer 43, 344, 1989), Melanomen (JUNG, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 84, 461 1 , 1987) , Gliomen (NITTA, T. et al., J. Neurosurg. 72, 426, 1 990), Lymphomen (GRAVELLE, M. & OCHI, A. , J. Immunol. 142, 4079, 1989), Leukämien (OSHIMI, K. et al. , Blood 77, 1044, 1991 ) und bei Arzeimittel-resistenten Tumorzellen (VAN, D.J. et al. , Int. J. Cancer 44. 738, 1 989).
Die im Stand der Technik beschriebenen bispezifischen und zum Teil auch trispezifischen Antikörper und damit verbunden die mit diesen Reagenzien und Agenzien durchgeführten Bestimmungsmethoden und therapeutischen Verfahren und Maßnahmen haben jedoch eine Reihe gravierender Nachteile. Für jede Änderung von mindestens einer von zwei oder mehreren Bindungsspezifitaten eines Antigens (z.B. Epitop, Zielzelle, Oberflächenrezeptor), an die ein bispezifischer Antikörper binden soll, ist die Herstellung eines völlig neuen bispezifischen Antikörpers notwendig. Dies macht die bisher bekannten bispezifischen Systeme des "targetings" , des Triggerns oder des Markiereπs aufwendig, unflexibel und teuer. Bei der direkten Kopplung von großen Molekülen (z.B. Marker-, Reporter- oder Effektormolekülen) an einen bispezifischen Antikörper können die Bindungseigenschaften des betreffenden bispezifischen Antikörpers verändert bzw. verschlechtert werden, was zu Problemen bei beispielsweise immunhistochemischen oder immuncytologischen Markierungen mit Farbstoffen und Enzymen oder bei diagnostischen Testsystemen, aber auch bei immuntherapeutischen Maßnahmen führen kann.
Ein weiterer Nachteil entsteht bei der bisherigen direkten Kopplung von Farbstoffen, Enzymen oder Effektormolekülen an einen Antikörper dadurch, daß für jedes neu gewählte Molekül (z.B. Effektormolekül), für das der Antikörper eine Spezifität hat, immer eine erneute Kopplung an einen neuen Antikörper erfolgen muß. Das hat zur Folge, daß die Anzahl der zu synthetisierenden Konjugate gleich ist der Anzahl der gewählten Moleküle pro Antikörper. In einem solchen Fall ergibt sich eine Vielzahl an Endprodukten. Für beispielsweise 1 00 Antikörper mit unterschiedlicher Spezifität und beispielsweise 5 verschiedenen Reporter- oder Effektormolekülen müßten demzufolge 500 verschiedene Produkte hergestellt werden, um die gewünschten Reporter- oder Effektormoleküle an den gewünschten Ort (beispielsweise zu Testzwecken) zu bringen.
Jedes neue Einbringen eines Antigens in ein Testsystem oder in ein Therapieschema, beispielsweise in der Immundiagnostik, bei ELISAs, Immunocytochemie, optischen Immunoassays usw. als auch bei der Immuntherapie für ein targeting von Zielzellen oder Tumormarkern usw. zieht nach dem bekannten Stand der Technik für jede neue Kombination eine aufwendige und teuere Entwicklung, Charakterisierung und Herstellung eines neuen Antikörperkonstrukts nach sich. Darstellung der Erfindung und bevorzugte Ausführunqsformen
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Mittel und neue Verfahren zur Verfügung zu stellen, die die Nachteile des Standes der Technik beseitigen.
Gelöst wurde die Aufgabe gemäß Anspruch 1 dadurch, daß eine Kombinationspräparation bereitgestellt wird, bestehend aus mindestens einer mit einer definierten spezifischen, immunologisch reaktiven Determinante Ha -| ausgestatteten bzw. verbundenen ersten Komponente, einer mindestens bispezifischen zweiten Komponente mit Bindungsspezifität für Ha-| (anti-Ha-| ) und für mindestens eine weitere Bindungsspezifität für eine definierte spezifische, immunologisch reaktive Determinante Ha2 (anti-Ha2) oder mit weiteren
Bindungsspezifitaten für mehrere solcher Determiaπten Han (anti-Han), welche untereinander verschieden sind, und einer dritten Komponente, welche mit mindestens einer definierten spezifischen, immunologisch reaktiven Determinante
Ha2 oder mit mehreren solcher Determinanten Han ausgestattet bzw. verbunden ist oder sind, wobei Ha -| , Ha2 und Han untereinander verschieden sind.
Im weiteren wird zur Vereinfachung der Ausdruck "definierte spezifische, immunologisch reaktive Determinante" ersetzt durch den synonym zu verstehenden Begriff "Determinante" bzw. durch die Bezeichnungen "Hai ", "Ha2" und "Han". iO
Die erste mit einer Determinanten Ha-] verbundene bindungsspezifische Komponente 1 umfaßt ein Reagenz mit spezifischen Bindungseigenschaften, das es befähigt, an Zellen, Geweben oder spezifischen Strukturen des tierischen und menschlichen Körpers in vitro und in vivo zu binden. Insbesondere umfaßt das Reagenz ein Protein vorzugsweise ein Immunglobulin oder Antikörper oder einem Fragment oder Derivat davon oder einen beliebigen Liganden mit den oben genannten Bindungseigenschaften bzw. Spezifitäten für eine antigene Bindungsstelle, beispielsweise ein Lectin, oder Adhäsionsmoleküle, Cytokine oder Chemokine, von denen bekannt ist, daß sie Rezeptoren und andere Bindungstellen von Geweben, Zellen oder Strukturen des Körpers erkennen und dort spezifisch und zielgerichtet anlagern können. Bevorzugt ist für diese erste Komponente ein Antikörper.
Die zweite, mindestens bispezifische Komponente 2 umfaßt ein Mittel bzw. Reagenz mit mindestens bispezifischen Eigenschaften, beispielsweise einen inerten Partikel oder ein Protein mit Spezifität für mindestens zwei Determinanten, wobei das Protein ein Ligand sein kann, beispielsweise ein Immunoglobulin bzw. Antikörper oder ein Lectin, oder aus einem beliebigen Linkermolekül, welches Bindungsspezifität für die gewünschten Determinanten Ha-] , Ha2 bzw. Han aufweist, wobei mindestens eine Determinanten-erkennungsstelle komplementär ist für Ha i ( eine andere für Ha2 oder eine oder mehrere weitere für Han. Bevorzugt ist ein bispezifischer Antikörper mit anti-Ha-] und anti-Ha2 Spezifität, welcher mit mindestens zwei verschiedenen Determinanten reagieren kann, wobei ein Reaktionspartner die Determinante Ha-] der andere Ha2 ist, wobei Hai und Ha2 verschieden sind.
Als dritte Komponente 3 der erfindungsgemäßen Kombination kommt ein mit einer Determinante Ha2 verbundenes Effektormolekül oder ein Reportermolekül in Betracht, vorzugsweise ein Antikörper, eine beliebige Markersubstanz, ein Enzym, eine radioaktive Substanz, ein Kontrastmittel, biologisch aktive Substanzen, ein cytostatisch, cytocidal oder cytotoxisch wirkendes Agens oder beliebige Substanzen und Antigene, sowie Adhäsionsmoleküle, Cytokine oder Chemokine, von denen bekannt ist, daß sie spezifische Bindungstellen an Zellen oder Strukturen des Körpers eines Säugetieres erkennen und dort spezifisch und zielgerichtet anlagern können. //
Die erfiπdungsgemaßen Kombinationspraparationen finden breite, universelle Verwendung in der Immunologie, insbesondere auf dem Gebiet der Immundiagnostik, der Immunhistochemie oder Immunhistologie, Immuncytologie und der Immuntherapie. Der Bereich der Anwendung umfaßt aber auch die Prognose und Bestimmung von Krankheitszustanden, bei denen die erfindungsgemäße Kombinationspräparationen Wirkung entfalten, aber auch die prophylaktische Verwendung beispielsweise zur Verhütung des Ausbruchs oder der Entwicklung eines Krankheitszustandes oder zur Verhinderung einer Exazerbation eines Krankheitszustandes.
Daruberhiπaus sind die erfinduπgsgemäßen Kombinationspräparationen breit und universell verwendbar bei der therapeutischen Behandlung von solchen Krankheiten, welche bekannterweise immunologischen, therapeutischen Verfahren zugänglich sind. Insbesondere betrifft dies Infektionskrankheiten und Erkrankungen, bei denen ein Tumorgeschehen zugrundeliegt. Aber auch bei der Immunisierung bzw. für die Vaccinierung, insbesondere mit Tumorproteinen, eignen sich die erfindungsgemäßen Kombinationen in gleicher hervorragender Weise.
Demzufolge besteht die vorliegende Erfindung aus drei Komponenten oder Formulierungen, wobei das Kernstück der erfindungsgemäßen Kombination die Verwendung eines mindestens bispezifischen Mittels bzw. Reagenz ist, welches Spezifität für mindestens zwei untereinander verschiedenen Determinanten Ha-] und Ha2 bzw. Han hat.
Insofern umfaßt die vorliegende Erfindung nicht nur die Kombination der drei genannten Präparationen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher auch die Verwendung eines Mittels bzw. Immunolinkers in vivo und in vitro mit Bindungsspezifität für mindestens zwei verschiedene Determinanten zum Verbinden von mindestens zwei mit verschiedenen Determinanten ausgestatteten Mitteln oder Reagenzien sowohl in der Diagnostik, in der Therapie bzw. Immuntherapie oder für Immunisierungszwecke.
Das der Erfindung zugrundeliegende Prinzip besteht darin, daß die mit mindestens einer Determinanten Ha-| ausgestattete Komponente 1 mit einer spezifischen Bindungstelle, beispielsweise auf der Oberfläche einer Zelle, beispielsweise mit einer Antigenbindungsstelle, einem Epitop, einer Rezeptorbindungsstelle, mit einer II
Adhäsionsmolekulbindungsstelle oder mit einem Zuckerrest spezifisch reagiert und daran bindet, diese über ihre Determinante Ha -j oder Determinanten Han mit der entprechenden anti-Ha -] bzw. antι-Han Spezifität einer mindestens bispezifischen Komponente 2 (mit anti-Ha -| und antι-Ha2 bzw. antι-Han Spezifitäten) reagiert und daß mindestens eine weitere mit einer Determinante Ha2 oder mehreren verschiedenen Determianten Han ausgestattete Komponente 3 an die antι-Ha2 bzw. antι-Han Erkennungsstelle der Komponente 2 bindet.
Die einzelnen Komponenten sind erfindungsgemäß als eine funktionelle Einheit zu verstehen, wonach sowohl eine gemeinsame zielgerichtete Verwendung dieser drei Einzelbestandteile als auch das räumliche Nebeneinander dieser einzelnen Mittel (als kit-of-parts) umfaßt werden. Umfaßt wird aber auch die Verwendung der Komponente 2 per se für immunologische Zwecke zur Herstellung einer Präparation zum Verbinden von mindestens zwei unterschiedlichen mit jeweils mindestens zwei untereinander verschiedenen Determinanten ausgestatteten Mitteln oder Molekülen oder Reagenzien.
Als Determinanten Ha-| , Ha2 bzw. Han kommen erfindungsgemäß Haptene, spezifische, koppelbare antigene Strukturen, Epitope, Paratope, Idiotope in Frage. Als bevorzugte Determinanten Ha-] , Ha2 bzw. Han werden Haptene umfaßt.
Der allgemeinen Definition für die erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen liegt gemäß Tabelle 1 folgendes Schema für die Zusammensetzung der drei Komponenten zugrunde:
B
Tabelle 1
I
Komponente 1 : (T):X— Ha -]
Komponente 2: anti-Ha -| — Y — anti-Ha2 bzw.
anti-Ha -] — Y — anti-Han
Komponente 3: Ha2 — Z bzw. Han — Z
worin (T) ein Zielort bzw. ein "target", insbesondere eine spezifische, biologische Bindungsstruktur oder Bindungsstelle, beispielsweise auf der Oberfläche einer Zelle oder einer Membran oder eines Teils davon, beispielsweise ein Antigen, ein Allergen, ein Epitop, ein Rezeptor, eine Adhäsionsmolekülbinduπgsstelle, ein Zuckerrest, eine Droge, ein Toxin, woran, ohne Beteiligung einer Determinanten Ha-j , X — Ha-| binden kann, wobei (T) nicht als Bestandteil der erfindungsgemäßen Komponente 1 zu verstehen ist, sondern nur erklärenderweise zur Veranschaulichung und daher in Klammern dargestellt wurde,
X ein mit einer Determinante Ha -] ausgestattetes bzw. verbundenes Reagenz ist, welches mσnospezifisch hinsichtlich seines Zielortes (T) sein kann, beispielsweise umfassend ein Protein, ein Immunglobulin bzw. ein Antikörper oder ein Derivat oder Fragment davon, ein Ligand, ein Lectin, ein Rezeptorbindungsmolekül, ein Adhäsionsmolekül, ein Cytokin, ein Chemokin, ein Lymphokin,
Ha-j eine definierte spezifische, immunologisch reaktive Determinante, beispielsweise umfassend ein Hapten, eine spezifische koppelbare antigene Struktur, ein Epitop, ein Paratop, ein Idiotop, Y ein mindestens für mindestens zwei Determinanten Ha-| und Ha2 bzw. Han bispezifisches Reagenz beispielsweise umfassend ein inerter Partikel, ein Protein, ein Immunoglobulin bzw. ein Antikörper, ein Diabody, mit den entsprechenden anti-Ha -] , anti-Ha2 bzw. anti-Han Spezifitäten, Ha2 eine von Ha -] verschiedene, definierte spezifische, immunologisch reaktive Determinante, beispielsweise umfassend ein Hapten, eine spezifische koppelbare antigene Struktur, ein Epitop, ein Paratop, ein Idiotop, Han eine beliebige andere von Ha-| und Ha2 verschiedene definierte spezifische, immunologisch reaktive Determinante, beispielsweise umfassend ein Hapten, eine spezifische koppelbare antigene Struktur, ein Epitop, ein Paratop, ein Idiotop, Z ein mit mindestens einer Determinante Ha2 bzw. Han ausgestattetes bzw. verbundenes biologisch, chemisch oder physikalisch wirksames oder detektierbares koppelbares Mittel, beispielsweise umfassend ein Effektormolβkül, ein Rezeptorbindungsmolekül, ein Immunglobulin bzw. Antikörper, eine Markersubstanz, ein Enzym, eine radioaktive Substanz, eine radioaktiv markierte Substanz, ein Kontrastmittel, eine biologisch aktive Substanz, ein cytotoxisch, cytocidal, cytostatisch oder cytolytisch wirkendes Mittel oder ein beliebiges Antigen mit Effektor- Marker- oder Reporterfunktion, eine Wirkstoffvorstufe (prodrug), ein Adhäsionsmolekül, ein Cytokin, ein Lymphokin, ein Chemokin, ein Ligand, bedeuten.
Wenn beispielsweise X monospezifisch hinsichtlich seines Zielortes (T) ist, beispielsweise im Falle, daß X ein Antikörper, ein Rezeptorbindungsmolekül, ein Adhäsionsmolekül oder ein Lectin ist, kann das Reagenz X an eine spezifische biologische Bindungsstruktur oder an Teilen davon binden, beispielsweise umfassend eine Zelloberflächenstruktur, ein Antigen, ein Allergen, ein Epitop, ein Rezeptor, eine Adhäsionsmolekülbindungstelle oder Teile der genannten Strukturen, oder einen Zuckerrest, eine Droge, ein Toxin.
Eine solche spezifische, biologische Bindungsstruktur oder Teile davon können natürlichen Ursprungs sein oder über DNA Rekombinantion, synthetisch oder semisynthetisch hergestellt werden, oder, insbesondere betreffend Antigene und Epitope aus biologischen und nicht-biologischen Flüssigkeiten stammen bzw. darin enthalten sein.
Zum grundsätzlichen Verständnis sei erklärend ausgeführt, daß demzufolge Komponente 2 als ein universell einzusetzender "Immunolinker" bzw. immunologischer Linkerbaustein zu verstehen ist, dem die Funktion zukommt, eine mit mindestens einer Determinanten (Ha2 bzw. Han) ausgestatteten bzw. verbundenen, beispielsweise haptenisierten, Komponente 3, wie oben definiert über eine mit einer bestimmten von Ha2 bzw. Han verschiedenen Determinanten Ha-] ausgestatteten bzw. verbundenen, beispielsweise haptenisierten, monospezifischen Komponente 1 , wie oben definiert, an einen Zielort (T), wie oben definiert, zielgerichtet zu transportieren. Das heißt, die Funktion des eigentlichen "targeting" wird von der Komponente 1 ausgeübt, welche Spezifität für den betreffenden Zielort besitzt, an dem ein Effekt gewünscht wird. Die Komponente 3 ist daher im engeren Sinn als Träger zu verstehen, der den gewünschten Effekt ermöglicht. Die der Erfindung zugrundeliegende Variabilität dieses Systems wird somit durch die Komponenten 2 und 3 ermöglicht, in dem beliebige Determinanten Ha2 bzw Han, welche verschieden sind, beispielsweise untereinander verschiedene Haptene, an Z gekoppelt und beliebige, mindestens bispezifische Reagenzien Y mit entprechendeπ anti-Ha2 bzw. anti-Han Spezifitäten miteinander nicht-kovalent binden können. Entscheidend hierbei ist, daß die einzelnen Determinanten so gewählt werden, daß sie untereinander verschieden sind.
Bevorzugt wird eine Kombinationspräparation, bei der X und Z mit Haptenen ausgestattete bzw. verbundene Reagenzien bzw. Mittel sind, bei der Y ein mindestens bispezifischer Antikörper ist, der anti-Ha -\ und anti-Ha2 bzw. anti-Han Spezifitäten aufweist und bei der Z ein mit mindestens einem Hapten Ha2 ausgestattetes bzw. verbundenes biologisch, chemisch oder physikalisch wirksames oder detektierbares Mittel ist.
Insofern wird eine Kombinationspräparation bevorzugt, wobei eine mit einem Hapten Ha-] verbundene bindungsspezifische Komponente 1 ein Reagenz mit spezifischen Bindungseigenschaften umfaßt, das es befähigt, an Zellen, Geweben oder spezifischen Strukturen des tierischen und menschlichen Körpers zu binden. Insbesondere umfaßt das Reagenz ein Protein vorzugsweise ein Immunoglobulin oder Antikörper oder einem Fragment oder Derivat davon oder einen beliebigen Liganden mit den oben genannten Bindungseigenschaften bzw. Spezifitäten für eine antigene Bindungsstelle, beispielsweise ein Lectin, oder Adhäsionsmoleküle, Cytokine oder Chemokine, von denen bekannt ist, daß sie Rezeptoren und andere Bindungstellen von Geweben, Zellen oder Strukturen des Körpers erkennen und dort spezifisch und zielgerichtet anlagern können.
Die zweite, mindestens bispezifische Komponente 2 umfaßt bevorzugt ein Mittel bzw. Reagenz mit mindestens bispezifischen Eigenschaften, insbesondere einen inerten Partikel oder ein Protein mit Spezifität für mindestens zwei Haptene, wobei das Protein ein Ligand sein kann, beispielsweise ein Immunoglobulin bzw. Antikörper oder ein Lectin, oder aus einem beliebigen Linkermolekul, welches Bindungsspezifität für die gewünschten Haptene Ha -] , Ha2 bzw Han aufweist, wobei mindestens eine Haptenerkennungsstelle komplementär ist für Ha-] eine andere für Ha2 oder eine weitere für Han. Bevorzugt ist ein bispezifischer Antikörper mit anti-Ha -j und antt Ha2 Spezifität, welcher mit mindestens zwei verschiedenen Haptenen reagieren kann, wobei ein Reaktionspartner das Hapten Ha-] der andere Ha2 ist, wobei Ha-| und Ha2 verschieden sind Als dritte Komponente 3 der erfindungsgemaßen Kombination kommt bevorzugt ein mit einem Hapten Ha2 verbundenes Effektormolekul oder ein Reportermolekül in o Betracht, vorzugsweise ein Antikörper, eine beliebige Markersubstanz, ein Enzym, eine radioaktive Substanz, ein Kontrastmittel, biologisch aktive Substanzen, ein cytostatisch, cytocidal oder cytotoxisch wirkendes Agens oder beliebige Substanzen und Antigene, sowie Adhäsionsmolekule, Cytokine oder Chemokine, von denen beispielsweise bekannt ist, daß sie spezifische Bindungstellen an Zellen 5 oder Strukturen des Körpers eines Saugetieres erkennen und dort spezifisch und zielgerichtet anlagern können.
Besonders bevorzugt wird eine Kombmationspraparation, bei der X ein mit einem Hapten Ha -] ausgestattetes bzw. verbundenes Protein ist, bei der Y ein mindestens 0 bispezifischer Antikörper ist, der anti-Ha-] und antι-Ha2 bzw. antι-Han Spezifitäten besitzt, und bei der Z ein mit mindestens einem Hapten Ha2 bzw. Han ausgestattetes bzw. verbundenes biologisch, chemisch oder physikalisch wirksames oder detektierbares Mittel ist.
Ganz bevorzugt wird eine Kombinationspraparatioπ, bei der X ein mit einem Hapten Ha -] verbundener Antikörper ist, der mit einem Antigen als spezifische Bindungsstruktur reagiert, bei der Y ein bispezifischer Antikörper ist, der anti-Ha -| und anti-Ha2 Eigenschaften besitzt und bei der Z ein mit einem Hapten Ha2, welches verschieden ist von Ha-] , verbundenes Enzym, eine radioaktive Substanz, 0 ein Kontrastmittel, ein Fluoreszenzmolekül bzw. eine Markersubstanz ist, wenn die Kombinationspraparation, vorzugsweise in vitro, zu immmundiagnostischen, immunhistochemischen, immunhistologischen oder immuncytologischen Zwecken oder für Immunoassays verwendet werden soll. Davon wiederum bevorzugt ist eine Kombinationspraparation wie oben angeführt,
■ ■ jedoch mit der Besonderheit, daß Z ein mit einem Hapten verbundenes Effektormolekül, ein Antikörper, eine radioaktive Substanz, eine biologisch aktive Substanz, ein cytotoxisch, cytocidal, cytostatisch oder cytolytisch wirkendes Mittel ist, wenn die Kombinationspraparation, vorzugsweise in vivo, zu immuntherapeutischen oder prophylaktischen Zwecken oder bei der Prognose und
Bestimmung von Krankheitszustanden verwendet werden soll.
Eine ganz besonders bevorzugte Kombinationspraparation besteht darin, daß X ein mit einem Hapten Ha-| verbundener monoklonaler Antikörper ist und Y ein bispezifischer Antikörper ist, welcher antι-Ha -| und antι-Ha2 Eigenschaften hat, wobei Z wie oben definiert ist und mit einem Hapten Ha2 verbunden ist.
Eine besondere, beispielhafte Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßeπ Kombinationspraparation kann dann bestehen, daß Ha-| von X ein Nitrophenyldeπvat (NP), insbesondere 2,4-Dιnιtrophenol (DNP), ist, und Ha2 von Z ein Steroidhapten, beispielsweise Digoxigenin (Δ20:22-3/?, 1 2/914,21 - Tetrahydroxynorcholensaurelakton) (DIG) und Y ein monoklonaler Antikörper mit antι-NP:antι-DIG Spezifität ist, insbesondere mit antι-DNP:anti-DIG Spezifität, und mit beliebiger Spezifität von X und beliebiger Funktion von Z im Umfang der oben beschriebenen Definition.
Eine weitere beispielhafte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen kann darin liegen, daß X ein Protein, beispielsweise KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) oder OKT3 Antikörper ist, welches mit DNP als Hapten Ha -| verbunden ist, Y ein bispezifischer, monoklonaler Antikörper ist, der anti-DNP:antι-DIG Spezifitäten aufweist und wobei Z ein Enzym, ein Farbstoff oder eine T-Zelle ist, welche mit DIG konjugiert bzw. verbunden sind.
Erfindungsgemäß umfaßt wird aber auch die Verwendung eines mit mindestens bispezifischer Spezifität für mindestens zwei verschiedene Haptene ausgestatteten Mittels, gemäß der in Tabellel angegebenen Definition für Y bzw. gemäß Anspruch 2 und den davon abhängigen Unteransprüchen, zur Hersteilung eines Kombinationspräparates zu Verwendung in der Immunologie für diagnostische, prophylaktische, therapeutische Zwecke und für Immunisierungen.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Kombinationspräparationen zur Herstellung eines Mittels für immundiagnostische Zwecke. Ein zusatzlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Kombinationspräparationen zur Herstellung von Mitteln für immunhistochemische, immuncytochemische, immunhistologische Zwecke und für Immuπassays.
Ein daruberhinaus zusätzlicher Aspekt ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen zum "Imaging" . d.h. zum Dedektieren und Lokalisieren von Zellen und/oder Geweben in vitro und in vivo, die sowohl in normaler, nichtpathologischer Form vorliegen können als auch maiigen entartet oder durch andere pathologische Ereignisse und Prozesse spezifisch verändert sein können.
Als ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Kombinationspräparationen zur Herstellung eines Mittels oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, gegebenenfalls zusammen mit physiologisch verträglichen Trägern und Zusatzstoffen, zur Prognose und Bestimmung in vitro und in vivo von Krankheitszuständen in einem oder außerhalb eines Säugetierorganismus.
Ein daruberhinaus weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Kombinationspräparationen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, gegebenenfalls zusammen mit physiologisch verträglichen Trägern und Zusatzstoffen, für die Immuntherapie von malignen Tumoren.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Kombinationspräparationen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, gegebenenfalls zusammen mit physiologisch verträglichen Trägern und Zusatzstoffen, für die Therapie von durch Viren, Bakterien, Pilzen oder Parasiten bedingten Infektionserkrankungen.
Ein zusätzlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Kombinationspräparationen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, gegebenenfalls zusammen mit physiologisch verträglichen Trägern und Zusatzstoffen, für die Therapie von Entzündungserkrankungen.
Ein daruberhinaus zusätzlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Kombinationspräparationen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, gegebenenfalls zusammen mit physiologisch Q verträglichen Trägern und Zusatzstoffen, für die Therapie von
Autoimmunerkrankuπgen und zur Immunsuppression.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Kombinationspräparationen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, gegebenenfalls zusammen mit physiologisch verträglichen Trägern und Zusatzstoffen, für die akute Behandlung von Abstoßungsreaktionen.
Ein zusätzlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Kombinationspräparationen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, gegebenenfalls zusammen mit physiologisch verträglichen Trägern und Zusatzstoffen, für die prophylaktische Behandlung von Tumor-, Entzündungs-, Infektions-, oder Autoimmunerkrankungen oder
Abstoßungsreaktionen oder zur Verhinderung einer Exazerbation eines solchen bestehenden Krankeitszustandes.
Ferner umfaßt wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, gegebenenfalls zusammen mit physiologisch verträglichen Trägern und Zusatzstoffen, für die Therapie und Prophylaxe von Erkrankungen, die mit Blutgerinnungsstörungen (pathologische Blutverklumpungen innerhalb eines Säugetierorganismus) einhergehen und die Fibrinolyse unterstützen oder erhöhen.
Außerdem ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung der Kombinationspräparationen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, gegebenenfalls zusammen mit physiologisch verträglichen Trägern und Zusatzstoffen für die Immunisierung bzw. Vaccinierung von Tieren und Menschen, mit beispielsweise Tumorproteineπ mittels modulierenden Antigenen, beispielsweise solchen auf ARC (Antigen Presenting Cells).
Erfindungsgemäß umfaßt wird aber auch die Verwendung einer Komponente mit mindestens bispezifischen Spezifitäten gemäß der Definition in Tabelle 1 (anti-Ha-] — Y — anti-Ha2 bzw. anti-Ha-] — Y — anti-Ha2). zur Herstellung eines in der Immundiagnostik und der Immuntherapie verwendbaren Mittels oder einer pharmazeutischen Präparation mit der funktioneilen Eigenschaft eines Immunolinkers, insbesondere in der Immunhistochemie, der Immuncytologie, der 2o Immunhistologie, bei Immunassays sowie bei der Prognose, Prophylaxe und der
Therapie von malignen Tumoren, von Entzündungskraπkheiten, von
Infektionserkrankungen, von Autoimmunerkrankungen, zur Vermeidung von
Abstoßungsreaktionen, zur Erzielung einer Immunsuppression, zur Verhinderung einer Krankheitsexazerbation, zur Prognose oder zur Bestimmung eines
Krankheitszustandes bzw. Krankeitsverlaufs.
Zusätzlich werden erfindungsgemäß demzufolge umfaßt pharmazeutische Formulierungen und deren Verwendungen wie oben beschrieben, welche aus den Komponenten 1 , 2 und 3 oder aus den Komponenten 1 und 2 oder welche nur aus Komponente 2 bestehen.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung umfassen Verfahren zur Bestimmung, ob Mittel mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften bei der in vitro oder in vivo Diagnostik bzw. Immundiagnostik, bei der Immuntherapie (einschließlich prophylaktischer Behandlungen) oder bei Immunisierungen, im Sinne der oben angegebenen Verwendungsmöglichkeiten, geeignete biologische, chemische oder physikalische Wirkungen entfalten können oder zeigen, die als potentielle Kandidaten in Betracht kommen, aber von denen die erwünschte Wirkung a priori nicht bekannt ist.
Noch weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung umfassen Verfahren zum Screenen (Suchen, Durchtesten) einer Pluralität von Mitteln mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften für die Zwecke der in vitro oder in vivo Diagnostik bzw. Immundiagnostik, für die Immuntherapie (einschließlich prophylaktischer Behandlungen) oder für Immunisierungen, im Sinne der oben angegebenen Verwendungsmöglichkeiten, welche geeignete biologische, chemische oder physikalische Wirkungen entfalten können oder zeigen, die als potentielle Kandidaten in Betracht kommen, aber von denen die erwünschte Wirkung a priori nicht bekannt ist.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen die Verwendung eines Mittels bestehend aus einer Kombinationspraparation umfassend die Komponenten 1 , 2 und 3 oder umfassend die Komponente 1 und 2 oder umfassend die Komponente 2 in einem der oben genannten Bestimmungs- oder Screening- Verfahren. Daruberhinaus werden von der Erfindung Verfahren umfaßt zur Herstellung von in der in vitro und in vivo Immundiagnostik, für die Immunprophylaxe, für die Immuntherapie oder für die Immunisierung geeigneten, verwendbaren Mitteln bzw. pharmazeutischen Zubereitungen, wonach die Bereitstellung neuer Diagnostika, Immuntherapeutika bzw. Immunprophylaktika oder Vaccine ermöglicht wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit-of-parts, bestehend aus den Komponenten 1 , 2 und 3 oder aus den Komponenten 1 und 2 oder bei dem die Komponente 1 Bestandteil ist gemäß den Ansprüchen bzw. gemäß der Definition für X, Y und Z in Tabelle 1 .
Zusätzliche Aspekte der vorliegenden Erfindung sind in den Unteransprüchen dargestellt.
Es hat sich herausgestellt, daß die erfindungsgemäßen Kombinatioπspräparate gegenüber dem Stand der Technik wesentliche Vorteile aufweisen: Da Komponente 1 (X-Ha-| gemäß Tabelle 1 ), beispielsweise ein für ein targeting geeignetes monospezifisches Reagenz (beispielsweise ein spezifischer Antikörper) mit nur einer Determinante Ha-] , beispielsweise mit einem Hapten, gekoppelt (haptenisiert) werden muß, ändern sich seine Bindungseigenschaften nicht, wohingegen die direkte Kopplung von Makromolekülen an Antikörper nach dem Stand der Technik die Bindung eines betreffenden Antikörpers an den Zielort (beispielsweise eine Zelloberflächenstruktur oder ein Epitop eines Oberflächenrezeptors einer Zelle) nachteilig beeinflußt.
Da die Bindungseigenschaften des zentralen, mindestens bispezifischen Reagenz der Komponente 2 (anti-Ha-] — Y — anti-Ha2 gemäß Tabelle 1 ) für definierte Kombinationen von Determinanten, beispielsweise eine Haptenkombination (gekoppelt an X und Z gemäß Tabelle 1 ) immer konstant bleiben, genügt es, die gleiche bindungspezifische Komponente 2 zur Bindungsvermittlung zwischen allen möglichen mit definierten Determinanten ausgestatteten, beispielsweise mit definiert haptenisierten Reagenzien (zum Beispiel ein Protein, ein Antikörper) als Zielobjekt (X — Ha-] , gemäß Tabelle 1 ) und allen mit definierten Determinanten ausgestattete Mittel (beispielsweise definiert haptenisierte Antigene) mit Effektor-, Marker oder Reporterfunktion (Ha2 — Z bzw. Han — Z, gemäß Tabelle 1 ) zu benutzen. Jegliche aufwendige Neukonstruktion an beispielsweise bispezifischen Antikörpern bei verschiedenen, gewü nnschten Neukombinationen hinsichtlich Effektorzellen, Marker- oder Reportersubstanzen, Enzymen, biologisch wirksamen Proteinen (z.B. Cytokine, Hormone) oder anderen Substanzen, die am Zielort Markierungen oder biologische, chemische oder physikalische Effekte verursachen sollen, entfällt.
Bisher mußte bei der Bereitstellung von Reagenzien, beispielsweise, Antikörperkonjugaten, nach dem Stand der Technik ein spezifischer Antikörper direkt mit dem entsprechenden Reagenz (Farbstoff, Enzym, Toxin usw.) konjugiert werden, sodaß entsprechend viele Einzelkonjugate hergestellt werden mußten, wenn verschiedene Effektorsysteme verwendet werden sollten. Demzufolge mußten aus jedem spezifischen Antikörper entsprechend viele vordefinierte Endprodukte bereitgestellt werden.
Mit den erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen wird die benötigte Zahl an Endprodukten drastisch erniedrigt und sie bringen zusätzlich den Vorteil einer bisher nicht vorhandenen Flexibilität für die Anwendungen von Immunreagenzien in der in vitro und in vivo Diagnostik als auch bei der Verwendung von Immunagenzien in der Prophylaxe, Therapie und bei Immunisierungen. Wenn die Determinanten Hai und Ha2 bzw. Han beispielsweise Haptene sind, wird ein Anwender in die Lage versetzt, über die mindestens für zwei Haptene spezifische Komponente 2 (beispielsweise ein anti-Ha-] :anti-Ha2 bispezifischer Antikörper) eine Vielzahl verschiedener Kombinationen von einerseits zielgerichteter Reagenzien der Komponente 1 (beispielsweise ein spezifischer Antikörper) und andererseits von verschiedenen Komponenten 3 (wobei Z definiert sein kann gemäß Tabelle 1 ), jeweils mit untereinander verschiedenen Haptenen haptenisiert, leicht, schnell, spezifisch, flexibel, stöchiometrisch (wenn die betreffenden Komponenten 1 und 3 jeweils die Haptene Ha -] und Ha2 in einem Molverhältnis von 1 : 1 aufweisen) und nicht zuletzt preiswert und maßgeschneidert für seine Bedürfnisse und Problemlösungen zu benutzen bzw. herzustellen.
Bisher hatte ein Anwender von beispielsweise konjugierten Antikörpern für die Verwendung bei den verschiedensten immunologischen Zwecken in vitro oder in vivo nur die Wahl, entweder ganz bestimmte, einzelne und fertige Konstrukte umständlich herzustellen oder sie einzeln kommerziell teuer zu erwerben, wenn bei gleicher Spezifität des Bindungsreagenzes (meist ein Antikörper) beispielsweise eine Markierung gewechselt werden sollte oder die Kopplung mit einem anderen Effektorsystem gewünscht war. Bei den erfindungsgemaßen
Kombinationspraparattonen entscheidet unmittelbar der Benutzer, welche Markierung eingesetzt werden soll, und er kann sich in kurzer Zeit, meist innerhalb weniger Minuten, das gewünschte Produkt im Sinne eines Baukastensystems selber herstellen. Hierbei ist es völlig unerheblich, ob das zu lösende Problem bei in wf/O-Systemen (beispielsweise zu immundiagnostischen Zwecken, für Assays oder allgemein in Zellsystemen) oder bei in wvo-Systemen (im lebenden Säugetierorganismen, beispielsweise in der Immuntherapie) besteht.
Aufgrund dieser Vorteile können in einfacher Weise mit den erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen solche Mittel oder Substanzen, von denen bekannt ist, daß sie biologische, chemische oder physikalische Eigenschaften oder Wirkungen aufweisen, bestimmt oder identifiziert werden, die dann bei der in vitro und in vivo Diagnostik, bei der immuntherapie bzw. Immunprophylaxe oder bei Immunisierungen in vorteilhafter Weise zur Anwendung kommen können. Ebenso sind die betreffenden Kombinationspräparationen in hervorragender Weise für ein Screening geeignet, um aus einer Vielzahl von potentiellen Kandidaten bzw. Mitteln, von denen bekannt ist, daß sie biologische, chemische oder physikalische Eigenschaften oder Wirkungen aufweisen, solche zu erfassen, die für die erfindungsgemäßen Zwecke geeignet erscheinen. Derartige potentielle Kandidaten werden weiter unten noch näher beschrieben.
Bedeutung erlangt die Bereitstellung der erfindungsgemäßen
Kombinationspräparationen aber auch in Verfahren zur Herstellung von in der in vitro und in vivo Immundiagnostika zu verwendenden Mitteln als auch zur Herstellung von für die Immunprophylaxe, Immuntherapie und für Immunisierungen verwendbaren pharmazeutischen Präparatioπen. Es ist hierbei von besonderer Bedeutung, daß über derartige Verfahren, wie sie weiter unten und in den Ansprüchen näher beschrieben sind, diagnostische oder therapeutische Mittel als Verfahrensprodukte bereitgestellt werden können, die nach dem Stand der Technik nicht oder nur sehr umständlich oder nur durch Zufall erhalten werden können. Bereits die oben kurz beschriebenen Vorteile der erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen und ihre Anwendungen machen es dem Fachmann plausibel, daß mit der vorliegenden Errfindung auf besonders einfache und effiziente Weise Mittel und Verfahren bereitgestellt werden, um diagnostisch und therapeutisch wertvolle Substanzen herzustellen und diese nach bekannten
Methoden zu den jeweiligen Zwecken anzuwenden.
Auf diesen Feststellungen gründet die Universalität der erfindungsgemäßen ; Kombinationspräparationen und sie umfassen daher alle diejenigen Anwendungen, die im Stand der Technik für die in der Immunologie bisher verwendeten Reagenzien, beispielsweise für die herkömmlichen Antikörper-konstruktionen, beschrieben sind oder auf die in der hier vorliegenden Beschreibung exemplifiziert hingewiesen wird. in Die Vorteile der erfindungsgemäßen Kombiπationspräparate lassen sich wie folgt kurz umrissen zusammenfassen:
• keine nachteilige Beeinflussung der bindungsspezifischen Komponente 1 , z.B. ein Antikörper, durch Kopplungen desselben mit biologisch, chemisch oder physikalisch wirksamen oder detektierbaren Effektorsystemen bzw.
15 Makromolekülen (Z gemäß Tabelle 1 ).
• Entfallen von Neukonstruktionen von mindestens bispezifischen Reagenzien im Falle von unterschiedlichem Einsatz von koppelbaren Mitteln bzw. Effektorsystemen, die gewünschte Effekte an bestimmten Zielorten ausüben sollen. 0 • Drastische Erniedrigung der gewünschten Endprodukte für die Verwendung in der Immunologie bei z.B. Diagnose, Therapie, Prophylaxe, Immunoassays oder Immunisierungen.
• Hohe Flexibilität des Systems, dadurch schnellere und leichtere Handhabung.
• Preiswerte Herstellung von individuell gewünschten Kombinationen.
25 • Universelle Anwendung für das gesamte Gebiet der Immunologie in vitro und in vivo.
• Universell einzusetzender Immunolinker (Komponente 2).
• Problemlose Anpassung an und Verwendung für etablierte und im Stand der Technik mit herkömmlichen immunologischen Mitteln vorgeschlagenen
30 Lösungen in vitro und in vivo in der Diagnose, Therapie, Prophylaxe, bei
Immunoassays oder bei Immunisierungen.
• Leichtes Identifizieren, Bestimmen oder Screenen von Mitteln, die diagnostisch und immuntherapeutisch (einschließlich der Prophylaxe und der Immunisierung) anwendbar sind.
15 . Leicht und effizient durchzuführende Verfahren zur Herstellung von Diagnostika, Therapeutika und Vaccinen. 15 Aufgrund der universellen Verwendbarkeit und der sehr breiten Anwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen im immunologischen Bereich in vitro und in vivo, ist die Auswahl der einzelnen Bestandteile der Komponenten, wie sie in Tabelle 1 dargestellt sind, völlig unkritisch und muß auch a priori nicht vorgegeben werden. Der Fachmann weiß, welche Bestandteile er für vorteilhaft erachtet und kann diese entsprechend seinen speziellen Bedürfnissen auswählen und anpassen. Insofern kann von bevorzugten, ganz bevorzugten oder ganz besonders bevorzugten Kombinationspräparationen nicht gesprochen werden, da der Grad der Bevorzugung eng zusammenhängt mit dem jeweiligen Zweck und Ziel der speziellen Anwendung, die der Fachmann zur Lösung einer bestimmten immunologischen Aufgabe durchführen möchte. Im Folgenden soll die breite Verwendbarkeit der erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen weiter verdeutlicht werden und der Fachmann kann schon allein aus dieser näheren Beschreibung erkennen, daß er die für sich als notwendig betrachteten Komponenten und Bestandteile davon ohne weiteres im Sinne eines Baukastensystems zur Lösung seiner speziellen Probleme auswählen kann.
Die einzelnen Komponenten der erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen und deren Herstellung sind dem Fachmann entweder bekannt und in der Literatur erschöpfend beschrieben oder er kann sie ohne weiteres anhand der der vorliegenden Beschreibung zugrundeliegenden Offenbarung herstellen.
Die erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen sind gemäß der vorliegenden Beschreibung für scheinbar ganz verschiedene Anwendungsgebiete verwendbar. Es soll an dieser Stelle jedoch hervorgehoben werden, das die verschiedenen beschriebenen Anwendungsaspekte in vitro und in vivo in der Immundiagπostik, der Immunhistochemie, der Immunhistologie, der Immuncytologie, der Immuntherapie einschließlich der Prognose und Bestimmung von Krankheitszuständen eines Säugetierorganismus, der Immunisierung bzw. Vaccinierung und der prophylaktischen Verwendung insofern durch einen einzigen, einheitlichen erfinderischen Gedanken verbunden sind, als daß die erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen in dem gesamten die Immunologie betreffenden Gebiet universell einsetzbar sind und daher das erfinderische Prinzip dieser Verwendungen als solches betrachtet werden muß. Dies kommt beispielsweise dadurch zum Ausdruck, daß eine Immuntherapie und eine vorherige Diagnose eines Krankeitszustandes, um die Art der Erkrankung zu erfassen, welche mit weiteren Mitteln der in vitro Immundiagnostik (z.B. mittels eines Immunoassays oder über histologisch/cytologische Untersuchungen) konkretisiert werden kann, regelmäßig Hand in Hand geht und über die Auswahl der geeigneten therapeutisch oder prophylaktisch einzusetzenden der der Erfindung zugrundeliegenden Kombinationspräparationen entscheiden. Demzufolge können diese
Anwendungsaspekte durch die erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen miteinander verknüpfend umfasst werden. Analoges gilt, wenn nicht-biologische Systeme Grundlage immunologischer Untersuchungen sind. Die Einheitlichkeit kommt aber auch allein schon durch die universelle Anwendbarkeit der erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen als solche zum Ausdruck.
Die hinsichtlich der in der vorliegenden Beschreibung benutzten Begriffe und Terminologien sollen als eine orientierende Übersicht wie folgt kurz definiert werden, obwohl sie dem Fachmann per se oder im Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung verständlich sind, wenn nicht an anderer Stelle eine speziellere Erklärung oder Definition gegeben wird.
Der Begriff "Reagenz" umfaßt Verbindungen oder Stoffe, die mit einem Partner eine bevorzugt nicht-kovalente Bindung eingeht. Insbesondere wird hinsichtlich Y gemäß Tabelle 1 darunter ein mindestens bispezifisches Mittel verstanden, welches mit mindestens einem mit mindestens einer definierten spezifischen, immunologisch reaktiven Determinante Ha-] ausgestatteten bzw. verbundenen Mittel (X) oder mit mindestens einer definierten spezifischen, immunologisch reaktiven Determinante Ha2 bzw Han ausgestatteten bzw. verbundenen Mittel (Z) als entsprechende Reaktionspartner nicht-kovalent bindet, beispielsweise im Sinne einer Antigen-Antikörper Reaktion. Insofern können die Komponenten 1 , 2 und 3 als Reagenzien betrachtet werden, die miteinander nicht- kovalent reagieren.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung sind unter "definierten spezifisch, immunologisch reaktiven Determinanten" spezifische, für ein Reagenz (Komponente 2) erkennbare biologische Strukturen zu verstehen, an die dieses Reagenz aufgrund seiner Spezifitäten spezifisch nicht-kovalent binden kann, und mit denen die entsprechenden Reaktionspartner, beispielsweise ein Protein, ausgestattet bzw. an denen sie gebunden sind. Unter solche Strukturen fallen beispielsweise oberflächenspezifische antigene Strukturen (antigene Determinanten) von Zellen oder Bestandteilen davon, partikuläre Antigene, Epitope, Paratope, Idiotope oder Haptene. Als "Agens" wird eine Wirkstoffverbindung verstanden, die eine therapeutische oder prophylaktische (verhütende) oder hemmende Wirkung in vivo oder in vitro entfaltet (Effektorfunktion), oder eine Marker- oder Reporterfunktion aufweist Insbesondere ein Mittel gemäß der Definition für Z gemäß Tabelle 1 .
Unter dem Begriff "Hapten" werden niedermolekulare Substanzen subsummiert, die für sich selbst keine Antikörperreaktionen verursachen, aber nach Bindung an ein Immunogen eine Immunreaktion auslosen können, wobei gegen diese gerichtete Antikörper gebildet werden.
Der Begriff "monospezifisches Reagenz" oder "bindungsspezifische Komponente" umfaßt ein Mittel gemäß der Definition für X in Tabelle 1 , welches in der Lage ist, zielgerichtet an einen definierten Ort bzw. an eine "target structure" bzw. an "target cells" nicht-kovalent zu binden (als "targeting" bekannt), wobei der definierte Ort eine Zielzelle oder ein Teil davon, ein partikulares Antigen bzw. ein Immunogen sein kann. Im Falle eines Reagenzes, welches in diesem Sinn nicht monospezifisch ist, werden damit beliebige Mittel, beispielsweise Proteine (zum Beispiel Keyhole Limpet Hempcyanin, KLH) umfaßt, an die eine bestimmte Determinante der oben angegebenen Definition gebunden ist.
Der Begriff "mindestens bispezifische Komponente" bzw. "mindestens bispezifisches Reagenz" umfaßt Reagenzien und Agenzien, die Bindungsspezifitaten gegen verschiedene definierte spezifische, immunologisch reaktive Determinanten besitzen (Y in Tabelle 1 ), beispielsweise mit anti-Hapten Spezifitäten.
Mit "bindungsspezifischen Strukturen des tierischen und menschlichen Körpers" bzw. "spezifische biologische Bindungsstrukturen" werden solche Strukturen innerhalb und an der Oberfläche von Zellen, Geweben und Organen umfaßt, die im immunologischen Sinn als Antigene, Epitope bzw. antigene Determinanten bezeichnet werden oder Rezeptorbindungsstellen oder Bindungsstellen für Adhäsionsmoleküle umfassen und an die spezifische Antikörper, rezeptorbindende Stoffe, Adhäsionsmoleküle usw. sowie Derivate und Fragmente davon oder antikörperähnliche Stoffe (wie zum Beispiel Lectine, mit spezifischen Strukturen ausgestattete inerte Partikel) zu binden vermögen. Insofern steht der Begriff "bindungsspezifische Strukturen des tierischen und menschlichen Körpers" bzw. "spezifische biologische Bindungsstrukturen" als Oberbegriff summarisch für definierte Zelloberflächenstrukturen, Antigene, Epitope, Rezeptoren, Adhasionsmolekülbindungsstellen oder Teilen von den genannten Strukturen, sowie Zuckerreste, Drogen oder Toxine 2g
Als "Antigene" werden natürlich vorkommende oder chemisch synthetisierte
Moleküle verstanden, die spezifisch von gegen diese Antigene gerichtete
Antikörper bzw. Immunglobuline nicht-kovalent gebunden werden. Antigene mit
Immunsystem-aktivierenden Eigenschaften, welche die Antikörpersynthese induzieren, werden als "Immuπogene" bezeichnet.
Der Begriff "Epitop" umfaßt diskrete Bereiche auf einem Makromolekül (zum
Beispiel ein Protein), welche die Antikörpersynthese auslösen und gegen die spezifische Antikörper synthetisiert werden bzw. mit denen Antikörper spezifisch reagieren können, wobei diese an das betreffende Epitop (bzw. die antigene Determinante) nicht-kovalent binden.
Unter "Lectinen" versteht der Fachmann Proteine bzw. Liganden mit zwei oder mehreren Bindungsstellen für ganz spezifische Zuckerreste auf Glykoproteinen und Glykolipiden an Zelloberflächen, wodurch diese, ähnlich wie Antikörper, die entsprechenden Moleküle kreuzvernetzen können und auch an entsprechend mit einer Determinante ausgestatteten bzw. verbundenen, beispielswiese haptenisierten, Bindungspartner zu binden vermögen.
Als "inerte Partikel" werden solche Partikel umfaßt, die keinerlei körpereigene
Immunreaktion auszulösen vermögen, an die aber Haptene, Antigene oder Epitope bzw. antigene Determinanten gebunden ("gecoatet") werden können und darüber spezifisch mit entsprechenden bindungsspezifischen Strukturen und Komponenten als Reaktionspartner analog wie Antikörper reagieren können.
Mit "Linkermolekülen" sind chemisch synthetisierte Verbindungsmoleküle gemeint, die kovalent oder nicht-kovalent zwei Proteine, insbesondere Antikörper, Derivate oder Fragmente davon zu Heteroaggregaten verbinden können. Insbesondere werden damit hetero- und/oder homobifunktionelle Verbindungen umfaßt, beispielsweise solche, die mit ε-Aminogruppen oder mit SH-Gruppen (beispielsweise der "hinge" Region) von Antikörpern reagieren, oder die Thiole an Fab Fragmente aktivieren. Umfaßt werden aber auch andere Linkermoleküle, die Biomoleküle mit weiteren Stoffen verbinden können, beispielsweise das Avidin - Biotin-System oder das Streptavidin-Biotin-System.
Unter "Effektormoleküle" werden solche bekannten Mittel, Moleküle, Verbindungen oder Partikel biologischen oder nicht-biologischen Ursprungs umfaßt, die am Zielort Wirkung, insbesondere therapeutische Wirkung, entfalten oder vermitteln, wie beispielsweise lytische, cytostatische, cytocidale, cytotoxische, fibrinolytische, immunsuppressive, entzündungshemmende, infektionshemmende oder immunisierende Wirkung. Insbesondere vermittelt durch biologisch aktive sg •
Substanzen, wie beispielsweise Antigene (zum Beispiel Hormone, Enzyme, Cytokine oder modulierende Antigene auf antigen-prasentierenden Zellen, beispielsweise HLA-Klasse II) oder Effektorzellen (zum Beispiel T-Zellen, NK-Zellen, Makrophagen) oder durch geeignete radioaktive Stoffe bzw. Isotopen insbesondere [3- und γ Emitter, beispielsweise 99mTc, l 1 1 ln, 1 3 1 J, 1 23J, 90Y, 1 86Re
Der Begriff "Reporter olekul" umfaßt solche bekannte Mittel, die geeignet sind, an organischen bzw. biologischen Strukturen (Zellen und Gewebe und Bestandteilen davon, Toxine, Antigene, usw.) oder Teilen davon ein detektierbares Signal auszulösen oder ein solches Signal zu bedingen, beispielsweise durch Markersubstanzen wie zum Beispiel Farbstoffe, Fluoreszenzstoffe (beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat), Enzym (beispielsweise Luciferase), Konstrastmittel (beispielsweise ein paramagnetisches Kontrastmittel), Radioisotope beispielsweise der Halogene, des Technetiums, Bleis, Thalliums, Indiums oder Quecksilbers, wie zum Be.sp.el 25|, 1 23,, 131 ,, 1 1 1 |n, 99mTc, 203Pb# 201TI| 198Hg, 90Y/ 186Re.
Um eine noch genauere Beschreibung zu geben, sind im Sinne der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff "Immunglobuline" oder synonym dafür "Antikörper", mindestens bispezifische bivalente bzw. polyvalente, monoklonale Antikörper zu verstehen, insbesondere der Isotypen IgG, IgM, IgA, IgE und IgD und deren Unterklassen und Derivate davon, aber auch solche, die Fragmente davon darstellen und Derivate davon, einschließlich solcher, die die idiotypische Region des Antikόrpermoleküls enthalten, insbesondere solche, die die Fv-Region enthalten, beispielsweise die F(ab>2 und Fab Fragmente, aber auch a priori chimare Antikörper oder Hybπdantikόrper mit mindestens zwei Antigen- bzw. Epitopbindungsstellen, oder bispezifische rekombinante Antikörper (beispielsweise "Double-single-chain" Antikörper, Diabodies), anti-idiotypische Antikörper und solche davon, die chemisch modifiziert wurden und als Derivate dieser Antikörper zu verstehen sind und die entweder über DNA-Rekombination, mittels Hybridomatechnik oder Antikörper-Engineering oder synthetisch oder semisynthetisch nach an sich bekannten Verfahren herstellbar sind und die bekannten und beschriebenen Reaktionseigenschaften hinsichtlich der dem Fachmann bekannten und beschriebenen Methoden der Immunologie aufweisen.
Aus der vielfältigen Literatur über die Gewinnung von monoklonalen Antikörpern und Derivaten davon sei nur beispielhaft hingewiesen auf Arbeiten von KOHLER, G.
& MILSTEIN, C, Nature 256, 495 - 497, 1975; BIOCCA, S. et al., EMBO J. 9, 101 3o
- 1 08, 1 990; BIRD, R. E. et al. Science 242, 423 - 426, 1 988; BOSS, M. A. et al. Nucl. Acids Res. 1_2, 3791 - 3806, 1984; BOULIANNE, G. L. et al. , Nature 31 2. 643 - 646, 1 984; BUKOVSKY, J. & KENNETT, R. H. , Hybridoma 6, 21 9 - 228, 1 987; DIANO, M. et al. , Anal. Biochem. 166, 223 229, 1 987; HUSTON, J. S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 5879 - 5883, 1 988; JONES, P. T. et al. , Nature 321, 522 - 525, 1 986; LANGONE, J. J. & VUKANIS, H. V. (Hrsg) , Methods Enzymol. 121, Academic Press, London, 1 987; MORRISON, S. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8J_, 6851 - 6855, 1984; Ol, V. T. & MORRISON, S. L. , BioTechniques 4, 214 - 221 , 1 986; RIECHMANN, L. et al., Nature 332, 323 - 327, 1 988; TRAMONTANO, A. et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 6736 - 6740, 1 986; WOOD, C. R. et al., Nature 314, 446 - 449, 1 985; BRILES, D. E. & KEARNEY, J. F. , Methods in Enzymoiogy 1 16, 1 74 - 189, 1985. Mitumfaßt sind auch humanisierte Antikörper oder CDR-grafted Antikörper, beispielsweise gemäß GÜSSOW, D. & SEEMANN, G. , Methods in Enzymoiogy 203, 99 - 121 , 1 991 , oder gemäß EP-A 0239 400, WO 92/05274 oder WO 92/1 5683, und Diabodies beispielsweise gemäß HOLLIGER, P. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 6444 - 6448, 1 993.
Monoklonale Antikörper, die die erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen ganz bevorzugt enthalten können, können durch jede beliebige, bekannte Technik erhalten werden, die für die Herstellung von Antikörpern über Kultivierung von Zellinien zur Verfügung stehen. Zu derartigen bekannten Techniken zählen beispielsweise die von KÖHLER, G. & MILSTEIN C, 1975, |oc. dt. , oder TAGGART & SAMLOF, Science 219, 1 228 - 1 230, 1 983, beschriebenen Verfahren mit Hybridomazellen oder solche mit B Zeil Hybridomen (KOZBOR et al. Immunology Today 4, 72 - 79, 1 983) oder mittels Hybrid Hybridoma (TAKAHASHI, M et al., Methods in Enzymoiogy, 203. 31 2 - 327, 1991 ).
Alternativ kommen natürlich auch kommerziell erhältliche monoklonale Antikörper in Frage, beispielsweise solche, wie sie in der EP-A 0 466 637, Seiten 4 bis 6, einschließlich deren kommerziellen Bezugsquellen, genannt werden und das X in Komponente 1 Verwendung finden können.
Hinsichtlich der Herstellung von polyklonalen Antikörpern, stehen ebenfalls eine
Anzahl bekannter Verfahren zur Verfügung. Es können z.B. für diesen Zweck in an sich bekannter Weise verschiedene Tiere durch Injektion mit einem geeigneten bzw. gewünschten Antigen, welches natürlichen Ursprungs, über DNA- Rekombination oder synthetisch bzw. semisynthetisch hergestellt sein kann, oder Teilen davon, immunisiert werden und aus den danach gewonnenen Seren bzw Blutproben die gewünschten polyklonalen Antikörper nach an sich bekannten Methoden gewonnen und gereinigt werden. Bevorzugte Antigene sind solche, die von Viren Prokaryonten und Eukaryonten abstammen bzw. solche darstellen. Die Methoden der Herstellung polyklonaler Antikörper beispielsweise über Immunisierung eines Tieres sind dem Fachmann bekannt und sind beispielsweise beschrieben in "Practicai Immunology", Hudson, L. & Hay F. C. (eds.), Third Edition, Blackwell Scientific Publications, 1989. Als Alternative können auch intakte Zellen benutzt werden. Verschiedene Adju vantien zur Erhöhung der gewünschten Immunantwort auf die Antigen Exposition können, abhängig von dem für die Immunisierung ausgewählten Tier, ebenfalls verwendet werden - beispielsweise komplettes Freund's Adjuvant, Mineralgele wie z.B. Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie z.B. Polyanionen, Peptide, Olemulsionen, Hemocyanine, Dinitrophenol oder Lysolecthin.
Bevorzugt werden jedoch Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, Fragmente oder Derivate davon.
Bispezifische Antikörper können über prinzipiell drei verschiedene Verfahren hergestellt werden.
Eine der früheren Methoden umfaßt die Fusion von zwei Hybridomazellen zu Tetradomen (MILSTEIN, C, & CUELLO, A. C. Nature 305, 537 - 540, 1983). Die Herstellung eines bispezifischen Antikörpers kann demgemäß beispielsweise dadurch erfolgen, daß eine geeignete Anzahl parentaler Hybridomazellen (ca. 10^ bis 10^) , die sensitiv gemacht werden, beispielsweise für Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT), durch entsprechende Selektion auf eine Hypoxanthinphosphoryltransferase negative Variante. Diese werden in einem geeigneten Verhältnis (zum Beispiel 1 : 1 bis 10: 1 ) mit den zweiten parentalen Hybridomazellen fusioniert. Die zweiten parentalen Hybridomazellen werden dafür vorher vorzugsweise mit einer lethalen Menge eines geeigneten cytocidalen Reagenz (zum Beispiel 10mM Jodacetamid) vorbehandelt. Die Fusion selbst kann dabei in Gegenwart eines polyfunktionellen Alkohols erfolgen, beispielsweise in einer Lösung von Polyethylenglykol (PEG, ca. 50% w/v). Das überschüssige PEG wird entfernt und die Zellen werden wie üblich ausplattiert in einer Konzentration von ungefähr 10^ bis 10 ' Zellen/ml in einem geeigneten, gepufferten Medium 34 ■
(beispielsweise Bicarbonat gepuffertes Dulbecco Medium, oder RPMI 1 640 Medium, gegebenenfalls supplementiert mit einem Serum, insbesondere fetalem Kälberserum (ca. 5 % v/v)) . Nach Kultivieren der Zellen bei beispielsweise 37° C können die Hybridoma in einem geeigneten Medium selektiert werden.
Grundsätzlich führt die Verschmelzung von zwei Hybridomzellen zu Tetradomen (so genannt aufgrund der Abstammung aus insgesamt vier Ursprungszellen), welche zu antikörperproduzierenden Zellen führt, die bispezifische Moleküle sezernieren, die den natürlich vorkommenden Immunglobulinen in Struktur und Größe vergleichbar sind. Technisch wird dabei ähnlich wie bei der Herstellung von Hybridomen vorgegangen. Zunächst wird eine der zu hybridisierenden Hybridomzellen auf Sensitivität, beispielsweise auf HAT-Sensitivität, selektiert. Dies wird durch Kultivieren der Zellen in Medium mit ansteigenden Konzentrationen an beispielsweise 8-Azaguanin induziert und bedeutet, daß der entstehende Zellklon einen genetischen Defekt, beispielsweise für das Enzym Hypoxanthin-Guanin- Phosphoribosyl-Transferase (HGPRT) aufweist, und damit nicht in Zellkulturmedien wächst, die Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthalten (HAT-Medium). Das andere Hybridom kann entweder gegen einen anderen biologischen Stoff sensibilisiert oder zum Beispiel mit lodoacetamid irreversibel inaktiviert werden. Nach der Fusion der elterlichen Hybridome, können dann im HAT-Medium nur solche Hybridome wachsen, die die genetische Information beider elterlicher Hybridome enthalten. Nach Subklonierung erfolgt dann die Etablierung stabiler Tetradomzellinien, die einen möglichst hohen Anteil bispezifischer Moleküle sezernieren. Derartige bispezifische Moleküle können als Komponente 2 Verwendung finden.
Eine andere Möglichkeit zur Herstellung von Tetradomen ist die Möglichkeit der Oberflächenmarkierung der zu fusionierenden Zellen mit unterschiedlichen fluoreszierenden Farbstoffen, und der Sortierung von doppelgefärbten Zellen nach der Hybridisierung mit Hilfe der Durchflußzytometrie (FACSort, "fluorescent activated cell sorting").
Die entstehende Tetradomzelle enthält also das Genmaterial beider ursprünglicher Hybridomzellen und damit die Information zur Bildung der vier elterlichen schweren bzw. leichten Antikörperketten. Nach stochastischer Reassoziierung ergeben sich insgesamt zehn Kombinationsmöglichkeiten der jeweils schweren und leichten Ketten. Von diesen stellen jedoch lediglich drei in funktioneller Hinsicht korrekte Antikörpermoleküle dar, in denen die Bindungsstellen der Molekülhälften aus Schwer- und Leichtkette desselben elterlichen Hybridoms stammen. Hierbei handelt es sich um die beiden elterlichen (monospezifischen) Antikörper, sowie den neugeformten bispezifischen Antikörper, dessen Hälften aus schwerer und leichter Kette jeweils aus einem elterlichen Hybridom stammen. Die restlichen sieben Kombinationsmöglichkeiten, sogenannte "mismatches" , stellen funktionell fehlerhafte Immunglobuline dar, die jedoch durch die meistbevorzugte Assoziation der schweren und leichten Kette desselben elterlichen Antikörpers in weitaus geringerem Maße entstehen. Der Anteil der korrekt sezernierten bispezifischen Antikörper im Tetradomprodukt kann bei den verschiedenen Zellinien zwischen 5% und 50% des insgesamt produzierten Immunglobuliπs variieren. Da bei der späteren Aufreinigung der bispezifischen Antikörperfraktion in der Regel eine Differenzierung über die proteinchemischen Eigenschaften der konstanten Teile der schweren Kette erfolgt, ist schon bei der Fusion darauf zu achten, daß Hybridome miteinander kombiniert werden, die vorzugsweise Immunglobuline unterschiedlicher Isotypen sezernieren. So ist zum Beispiel bei der Verwendung von gegen menschliche Antigene gerichtete Mausantikörper die Kombination der Isotypen IgG-] und lgG2a sowie IgG -, und lgG2b 'm Hinblick auf die spätere Differenzierung zwischen elterlichen und bispezifischen Antikörpern besonders geeignet. Um eine Differenzierung innerhalb der trotz Monoklonalität heterogenen Immunglobulinfraktion zu erreichen, können vorzugsweise im Anschluß an eine Affinitätschromatographie weitere Aufreiniguπgsverfahren angeschlossen werden. Hier bieten sich zusätzliche chromatographische Reinigungsschritte, beispielsweise die lonenaustausch- und die hydrophobe Interaktionschro-matographie, an, wobei sich letztere auch ohne vorherige Immunglobulinanreicherung durchführen läßt, da in einem einzigen Chromatographieschritt sowohl Differenzierung zwischen Immunglobulinen und anderen Proteinbestandteilen des Zellkulturmediums, als auch ausreichende Separierung innerhalb der Antikörperfraktion, erfolgen kann. Aber auch andere Isolationsverfahren wie beispielsweise die elektrophoretische Auftrennung mittels isoelektrischer Fokussierung, die die unterschiedlichen isoelektrischen Punkte der elterlichen und bispezifischen Antikörper zur Differenzierung benutzen, können erfolgreich angewendet werden. Die über die oben beschriebenen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Präparationen von bispezifischen Antikörpern kommen für Komponente 2 in Betracht, wie auch die anderen Präparationsverfahren, die zu bispezifischen Molekülen führen. Aber auch über DNA-Rekombination hergestellte Antikörper (sog. Engineered Antibodies) werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung mitumfaßt, beispielsweise solche, die nach den beschriebenen Verfahren gemäß COLOMA, M. J. et al. , J. Immunol. Methods 152, 89 - 104, 1992; "Methods in Enzymoiogy" 1 78, 1 989 oder EP A 0 1 25 023 produziert werden können.
Beispielsweise kann ein bispezifischer Antikörper nach diesem Verfahren dadurch erhalten werden, daß einzelkettige Proteine aus V,_ und V^ Domänen der Antikörper (Fv) mit dem C-Terminus der einen Domäne und dem N-Terminus der anderen Domäne verbunden werden (BIRD, R.E. & WALKER, B. W., Trends in Biotechnol. 9(4), 132, 1991 ). Zu einem vergleichbaren Fusionsprotein mit bispezifischen Eigenschaften (zum Beispiel CD4:Fcγ oder CD4:CD3) führt das Verfahren von TRAUNECKER, A. et al., EM.BO J. 10(1 2), 3655, 1991 , und von BRYN, R. A. et al., Nature 344, 667 - 670, 1990). Ein weiterer bispezifischer (Fusions-) Antikörper kann nach dem gentechnischen Verfahren gemäß ASHKENAZI, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88(23), 10535 - 10539, 1 991 , hergestellt werden. In diesem Fall betraf das Fusionsprotein ein Immunglobulin (Immunoadhäsion), welches Entzündungen dadurch hemmt, daß es mit einem anderen Adhäsionsmolekül interferierte. Von DEMONTE, L. B. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87(8), 2941 - 2945, 1990, wird ein Gentransfer über retrovirale Shuttle-Vektoren zur Herstellung bispezifischer Antikörper vorgeschlagen. Eine weitere Methode, bispezifische Antikörper herzustellen, besteht darin, daß über einen "Leucin-Reißverschluß" ("leucine-zipper") bestimmte Transkriptionsfaktoren (Jun und Fos) genetisch mit anti-Tac bzw. anti-CD3 Fab2' Regionen fusioniert werden. Die bispezifischen Antikörper werden dann durch Zusammenmischen beider Konstrukte gebildet (KOSTELNY, S. A. et al., J. Immunol. 148, 1 547 - 1 553, 1992).
Über gentechnologische Methoden herstellbar sind auch kleine Antikörperfragmente mit zwei antigenen Bindungsorten, sog. "Diabodies", welche für die erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen ebenfalls in Betracht kommen. Derartige Fragmente, welche aus einer variablen Domaine der schweren Kette (V^) bestehen, die mit einer variablen Domäne der leichten Kette (M ) an der selben Proteinkette verbunden sind ( -J^→ — V[_) können beispielsweise gemäß HOLLIGER, P. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 6444 - 6448, 1993, hergestellt werden. Diabodies stellen ähnlich den single-chain-Antikörpern nach bekannten Methoden genetisch konstruierte Proteine dar. Die Bindungssequenzen der schweren und der leichten Ketten der (Maus ) Immunolglobuline können nach bekannten Verfahren in Bakteriensystemen exprimiert werden, wobei in der Gensequenz der variable Teil der schweren Kette (V^ l ) des einen Antikörpers an die Sequenz der leichten Kette (V[_2) des anderen Antikörpers und vice versa (Vn2/V|_1 ) insertiert werden kann. Das Bakterienprodukt kann sich dann derart falten, daß die Bindungsstellen Vj_] 1 und V|_1 , sowie V - 2 und V|_2 in funktioneil korrekter Stellung zueinander zu liegen kommen und damit ein bispezifisches Molekül entstehen kann, welches vergleichbare Bindungsaffinitäten wie ein natürlicher Antikörper aufweist, gleichzeitig aber nur aus den variablen Domainen der ursprünglichen Immunoglobuliπe besteht und somit nur wenig immunogen im humanen System wirken kann.
Die Expression von Antikörperfragmenten in Bakterien gehört zum Stand der Technik, sodaß derartige rekombinante Antikörperfragmente-Hybridome als die Hauptquelle von bispezifischen Antikörpern für medizinische (Prophylaxe, Therapie, Immunisierungen) und diagnostische Anwendungen im Sinne der vorliegenden Erfindung vorteilhaft in Betracht kommen. Antikörperfragmente haben nämlich gegenüber vollständigen Antikörpern Vorteile, beispielsweise die einer billigeren Produktion in Mikroorganismen oder Zellkulturen (beispielsweise Bakterien, Säugetierzellen) und, auf Grund eines geringeren Molekulargewichts, eine bessere Penetration von beispielsweise Körpergeweben und Tumoren.
Da Diabodies bispezifisch sein können, können diese vorteilhaft als Komponente 2 (Y) verwendet werden. Demzufolge kann eine derartige Komponente 2 zwei Bindungsstellen (anti-Ha-| und anti-Ha2) auf demselben Molekül besitzen: eine zum Binden an eine entsprechende Determinante Ha i auf einem Zielantigen (beispielsweise einem Tumormarker), eine andere an eine entsprechend verschiedene Determinante Ha2 auf beispielsweise einer Effektorzelle des Immunsystems, sodaß letztere auf diese Weise zum Zielgewebe (zum Beispiel ein Tumor) transportiert wird. Auf diese Weise kann die erfindungsgemäße Kombinationspraparation unter Benutzung von Diabodies beispielsweise zum Abtöten von Killer-T-Zellen aktivierten Tumorzellen verwendet werden.
Diabodies können aber nicht nur Killer-T-Zellen aktivieren: durch Variation der Effektorbindungstelle läßt sich eine ganze Palette von Immuneffektorfunktionen, wie beispielsweise Komplement-Aktivierung oder Antikörper-aktivierte Zellyse, aktivieren. Vorteilhaft für die Benutzung von Diabodies ist ihre Reinigung über einen einzigen Chromatographieschritt. 3b
Insofern sind Diabodies für den Zweck der erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen, insbesondere für Komponente 2, vorteilhaft zu verwenden.
Bispezifische Antikörper können aber auch über chemische Wege hergestellt werden, wobei verschiedene Verfahren bekannt sind. Beispielsweise können gemäß KARPOVSKY, B. et al. , J. exp. Med. 160, 1 686, 1984, Heterokonjugate ("hetero- cross-linked-aggregates") hergestellt werden oder es kann nach dem Verfahren gemäß GLENNIE, M. J. et al., J. Immunol. 139, 2367 - 2375, 1987, vorgegangen werden, wonach bispezifische F(ab'γ)2 Antikörper über Thioether-verbundene Fab'γ Fragmente mittels o-Phenylendimaleimid konstruiert werden. Die Präparation von bispezifischen Antikörpern kann auch durch chemische Rekombination von Fragmenten monoklonaler Antikörper erfolgen (BRENNAN, M. et al., Science 229, 81 - 83, 1 985). In solch einem Fall werden die Fc' Anteile des betreffenden Antikörpers (zum Beispiel IgG) unter milden Bedingungen durch limitierte Pepsinhydrolyse (beispielsweise 2% w/w Pepsin in 0, 1 M Natriumacetat, pH 4,2, 18 Stunden, 37°C) entfernt und F(ab'>2 Teile erhalten. Reduktion der F(ab'>2 Fragmente mit Mercaptoethylamin (zum Beispiel 1 mM) in Natriumphosphat oder Natriumarsenit (beispielsweise 0, 1 M, pH 6,8), und EDTA (zum Beispiel 1 mM) bei 25°C für 1 8 Stunden, führt zur Umwandlung von F(ab'>2 zu Fab' . Vorzugsweise wird diese Umwandlung mit einem Dithiolkomplexierungs-Agens durchgeführt. Bevorzugt werden die freien Thiole, nachdem mit Natriumarsenit verhindert wird, daß sich intermolekulare S-S-Bindungen ausbilden, mittels eines geeigneten, die Thiolgruppen aktivierenden Reagenz, stabil derivatisiert. Beispielsweise durch Reaktion mit Ellman's Reagenz (5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoesäure)) . Eines der dabei entstehenden Fab'-Thionitrobenzoat (TNB)-Derivate wird anschließend durch Reduktion mit 2-Mercaptoethylamin in die Fab'-Thiole umgewandelt und mit äquimolaren Mengen Fab-TNB gemischt, wodurch sich die gewünschten bispezifischen Antikörper bilden.
Hinsichtlich zweier oder mehrerer distinkter Proteine, die durch ein Linkermolekül miteinander chemisch kovalent verbunden sind und dadurch mindestens bispezifischen Charakter erhalten, insbesondere wenn Y gemäß Tabelle 1 zwei oder mehrere distinkte, miteinander verbundene Antikörper bedeuten, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle dem Fachmann bekannten Moleküle oder "Crosslinkers" oder "Cross-Linking-Reagents" zu verstehen, mit denen mindestens 3? zwei gleiche oder verschiedene Proteine oder Peptide nach an sich bekannten
Methoden miteinander kovalent verbunden werden können. Unter dem Begriff "Crosslinkers" oder "Cross-Liπking-Reagents" werden solche Moleküle mit den genannten Eigenschaften verstanden, welche funktioneile Gruppen enthalten, die an Aminosäureresten in Proteinen und Peptiden binden. Demzufolge werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle Crosslinker bzw. Cross-Linking-Reagentien umfaßt, die intermolekulare kovalente Bindungen zwischen zwei Proteinen oder Teilen davon erzeugen können. Im weiteren wird daher nur noch von "Verbiπdungsmolekülen" gesprochen, wenn von derartigen Crosslinkern oder Cross-Linking-Reagentien die Rede ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden insbesondere solche Verbindungsmoleküle, deren reaktive Gruppen gleich (homobifunktionelle Verbindungsmoleküle) oder verschieden (heterobifunktionelle Verbindungsmoleküle) sind.
Aus der Gruppe der homobifunktionellen Verbindungsmoleküle kommen solche in Betracht, die vorzugsweise mit primären Aminen (aminreaktiv) oder mit Sulf- hydrylgruppen (thiolreaktiv) reagieren, beispielsweise Imidoester bzw. Maleimide, Alkylhalide, Arylhalide, α-Haloacyle, Pyridyldisulfide.
Bei den heterobifunktionellen Verbindungsmolekülen, die mindestens zwei verschiedene reaktive Gruppen besitzen, sind insbesondere solche geeignet, die eine aminoreaktive funktioneile Gruppe an einem Ende und eine sulfhydrylreaktive Gruppe am anderen Ende besitzen, beispielsweise solche, die als eine erste Gruppe eine N-hydroxysuccinimidester Gruppe und als eine zweite funktionelle Gruppe eine Maleimidgruppe besitzen.
Aber auch solche heterobifunktionelle Verbindungsmoleküle kommen in Betracht, die mit Carboxylgruppen reagieren, beispielsweise mit Glutaminsäure- oder Asparaginsäureresten als Reaktanten. Beispielsweise seien Carbodiimide genannt. Daruberhinaus sind aber auch die bekannten photoreaktiven Verbindungsmoleküle geeignet, welche eine funktionelle photoaffine Gruppe aufweisen, die erst durch Exposition mit UV-Licht oder anderer sichbarer Strahlung (Photonen) reaktiv werden, beispielsweise aromatische Azide (Arylazide) oder Benzophenone, welche mit Aminen, Sulfhydrylen, Carbohydraten und Carbonylen reagieren.
Als Beispiele einiger heterobifuπktioneller Verbindungsmoleküle, die für die Herstellung von mindestens bispezifischen Reagenzien, insbesondere Antikörpern, in Betracht kommen, können folgende Verbindungen in Betracht kommen, wobei diese Aufzählung nicht vollständig ist und der Fachmann weitere ihm geeignete Verbindungen aus dem Stand der Technik entnehmen kann: 4-succinιmidyloxycarbonyl-α-methyl- (2-pyridyldithιo)-toluol fSMPT], Λ/-succιnimιyi 3-(2-pyπdyldithio)propιonat [SPDPj, Sulfosuccmimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)propιonamιdo]hexanoat, Sulfosuccinimidyl 4-(Λ -maleimidomethyl)cyclohexan- 1 -carboxylat, Succinimidyl 4-(/V-maleimidomethyl)cyclohexan- 1 -carboxylat [SMCC], Λ/-Succinimidyl (4-iodoecetyl)aminobenzoat [SIAB], 5, 5'-dithiobis(2-nitrobenzoesäure) [Ellman's Reagenz],
Als Beispiele einiger homobifunktioneller Verbindungsmoleküle, die für die
Herstellung von mindestens bispezifischen Reagenzien, insbesondere Antikörpern, in Betracht kommen, seien die folgenden Verbindungen genannt, wobei auch diese Aufzählung nicht vollständig ist und der Fachmann weitere ihm geeignete
Verbindungen dieser Art aus dem Stand der Technik ohne weiteres verwenden kann:
Dithio.ÖΛs(succinimidylpropionat) [DSP],
3,3'-Dithioό/s(sulfosuccinimidylpropionat) [DTSSP], Bis(sulfosuccinimidyl)suberat,
Disuccinimidylsuberat [DSS],
Disuccinimidyltartrat [DST].
Als Beispiele einiger photoreaktiver Verbindungsmoleküle, die für die Herstellung von mindestens bispezifischen Reagenzien, insbesondere Antikörpern, in Betracht kommen, seien die folgenden Verbindungen genannt, wobei diese Aufzählung ebenfalls nicht vollständig ist und der Fachmann weitere ihm geeignete
Verbindungen dieser Art ohne weiteres aus dem Stand der Technik entnehmen kann: Azidobenzoyl Hydrazid,
Λ -Hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylsäure,
Λ/-[4-(p-azidosalicylamido)butyl]-3'(2'-pyridyldithio)propionamid [ADPD].
Die Verwendung solcher und der weiteren bekannten Verbindungsmoleküle zur Herstellung bispezifischer Antikörper gestatten somit auch vielfache
Markierungsmöglichkeiteπ der erhaltenen Produkte, wie beispielsweise
Radiomarkierungen mit radioaktiven Isotopen zum Beispiel über entsprechende lodierung von beispielsweise l -(p-Azidosalycylamido)-4-(iodoacetamido)butan oder beispielsweise Fluoreszenzmarkierungen durch Verwendung geeigneter Verbindungsmoleküle, zum Beispiel von Sulfosuccinimidyl7-azido-4- methylcoumarin-3-acetat.
Die genannten und die anderen dem Fachmann bekannten Verbindungsmoleküle lassen sich nach an sich bekannten Methoden herstellen oder sie sind kommerziell erhältlich (z.B. Pierce Europe B.V., Oud-Beijerland, Holland). Die genannten und weitere für die vorliegende Erfindung geeignete und zu verwendende homo- und heterobifunktionelle Verbindungsmoleküle und deren Anwendungen und Reaktionen mit den reaktiven Gruppen der betreffenden Proteine bzw. Immunglobuline sind ferner individuell beschrieben von BRINKLEY, M., Bioconjugate Chem., 3, 2 - 13, 1992 und von MATTSON, G. et al. , Mol. Biol. Rep. 17, 167 - 183, 1993. Weitere zum Zweck der Herstellung von bispezifischen Antikörpern geeignete Verbindungsmoleküle sind individuell beschrieben von SCHEIDTMANN; K. H. In: Protein structure, a practical approach, Creighton, T. E. (Ed.), IRL Press at Oxford University Press, Chapter 4, 93 - 1 1 5, 1989; TRAUT, R. R. et al. In: Protein function, a practical approach, Creighton, T. E. (Ed.), IRL Press at Oxford University Press, Chapter 5, 101 - 133, 1989; TAE, H., Methods in Enzymoiogy 91, 580 - 609, 1983; BAUMERT, H. G. & FASOLD, H., Methods in Enzymoiogy 1 72. 584 - 609, 1 989.
Die Herstellung der über die oben beschriebenen Verbindungsmoleküle kovalent verbundenen Antikörper kann nach literaturbekannten Methoden erfolgen, wie sie zum Beispiel in den schon genannten Veröffentlichungen über die Verbindungsmoleküle beschrieben sind, einschließlich der dort angegebenen weiteren Literatur (beispielsweise BRINKLEY, M., 1992, loc. cit.; MATTSON, G. et al., 1993, loc. cit.; Katalog von Pierce).
Beispielsweise kann die Herstellung eines mindestens bispezifischen Reagenz, wenn Y gemäß Tabelle 1 ein Protein, insbesondere ein Imunoglobulin bzw. ein Antikörper ist, durch kovalente Bindung dadurch erfolgen, daß geeignete Immunglobuline nach an sich bekannter Methode gewonnen und gereinigt werden. Anschließend werden diese Immunglobuline, beispielsweise ein IgG, mit einem geeigneten Verbindungsmolekül, beispielsweise ein homobifunktionelles Verbindungsmolekül, beispielsweise ein Imidoester, unter geeigneten Bedingungen in Reaktion gebracht. Die Reaktionsprodukte können dann nach bekannten Verfahren von den übrigen Bestandteilen der Reaktionslosung getrennt und gereinigt werden, beispielsweise durch Dialyse, Zentπfugation und/oder Chromatographie.
Neben den genannten hetero- und homobifunktionellen und photoreaktiven Verbindungsmolekülen kommt auch die Verbindung zweier Reagenzien, beispielsweise Antikörper, zur Herstellung von Y der Komponente 2, mit Avidin bzw. Streptavidin und Biotin in Betracht. Hierbei wird die hohe Avinitat zu Biotin genutzt. Um ein bispezifisches, für die Komponente 2 vorteilhaft zu verwendendes Reagenz Y zu erhalten (zum Beispiel ein bispezifischer Antikörper), wird einer der zu koppelnden Antikörper mit Biotin und der andere Antikörper mit Streptavidin nach bekannten Methoden markiert. Nach äquimolarer Mischung beider markierter Antikörper ergibt sich über die Avidin (Streptavιdin)-Bιotιn-Kopplung ein bispezifisches Reagenz hoher Stabilität. Ein Vorteil bei dieser Methode liegt darin, daß durch die leichte Austauschbarkeit der jeweiligen Partner (anti-Ha-] und anti- Ha2 bzw. anti-Han) ein großes Spektrum verschiedener bispezifischer Reagenzien Y herstellbar wird. So kann zum Beispiel ein Streptavidin-markierter Antikörper mit Spezifität für eine bestimmte Determinante Ha-j mit einer Vielzahl von Biotin- markierten Antikörpern, die unterschiedliche Determinanten (Han) erkennen, gekoppelt werden.
Bispezifische Antikörper, die über Hybridhybridoma-Fusion hergestellt werden, zeigen gegenüber solchen Heterokonjugaten, die über chemisches Cross-linking erzeugt werden, gewisse Vorteile. Chemisch über beispielsweise heterobifunktionelle Linker erzeugte Antikörper sind dimere oder multiaggregierte Moleküle, die sehr viel schneller über das reticuloeπdotheliale System entfernt werden und somit eine viel kürzere Halbwertszeit im Blutkreislauf aufweisen als solche, die über Hybridhybridoma hergestellt werden. Derartige große, über chemische Linker erzeugte Heterokonjugate können ferner den Nachteil haben, daß sie schwerer in das extravaskulare Gewebe eindringen. Aufgrund ihrer Bi- oder Multivalenz können sie leichter auf dem Zielantigen Modulationen induzieren. Da bekannt ist, daß das Membran-Immunoglobuhn von Lymphomazellen leicht moduliert wird, wenn es durch bivalente Antikörper kreuzverbunden wird, werden, beispielsweise im Falle von Lymphomen, über Hybridhybridoma Fusionen hergestellte bispezifische Antikörper als bevorzugte Komponente 2 (Y) betrachtet. m
Für den Fall einer in vitro Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen, können jedoch auch chemisch, beispielsweise über hetero- oder homobifunktionelle Linker hergestellte oder über Avidin(Streptavidιn) Biotin verbundene bispezifische Antikörper verwendet werden.
Ein gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendender bispezifischer Antikörper gemäß der Definition in Tabellel (Komponente 2) kann beispielsweise dergestalt sein, daß ein Antikörper bispezifisch ist für 2,4-Dinitrophenol (DNP) und für Digoxigenin (DIG). Die Herstellung eines solchen anti-DNP:anti-DIG Antikörpers kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß nach bekannten Methoden Mäuse mit geeigneten DNP- und DIG-Konjugaten immunisiert werden, die Milzzellen der immunisierten Mäuse mit Myelomzellen fusioniert werden, beispielsweise mit einem polyfunktionellen Alkohol (PEG) oder über Elektrofusion (beispielsweise gemäß VIENKEN, J., ZIMMERMANN, U. FEBS Letters 182:278 - 280, 1985), und die entstandenen Hybridome nach beschriebenen Verfahren selektiert und zu Tetradomen, beispielsweise über PEG-Fusion, fusioniert werden.
Die für die erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen benötigten und nach den bekannten Verfahren herstellbaren Antikörper, können nach bekannten Methoden gereinigt werden, beispielsweise über Fällung, Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie, Immunoabsorptionschromatographie,
Immunoaffinitäts-chromatographie, HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) oder Kombinationen davon. Antikörperfragmente, welche den Idiotyp des Moleküls enthalten, können gleichermaßen nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können F(ab'>2 Fragmente durch Pepsin Verdauung des vollständigen poly- oder monoklonalen Antikörpers erhalten werden. Fab Fragmente können erhalten werden, indem beispielsweise die Disulfidbrücken des betreffenden F(ab')2 Fragments reduziert werden und Fab Fragmente können gewonnen werden beispielsweise durch Behandlung der Antikörpermoleküle mit Papain und gegebenenfalls einem Reduktionsmittel. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt und gehören zum Stand der Technik.
Eine Reinigung kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß die über die oben beschriebenen Verfahren erhaltenen Antikörper in einem Puffer (zum Beispiel Tris-
HCI, 20mM, pH 8,0) auf das 3-fache Volumen verdünnt werden, danach gefiltert (Filterporen ca. 0,2 μm) und über eine Q-Sepharose Fast Flow Säule gereinigt werden. Die Antikörperfraktion kann beispielsweise mittels eines NaCI Gradienten eluiert werden. Die gesammelten Fraktionen können anschließend in bespielsweise NH .(S04)2 (2 M) verdünnt und über eine geeignete Säule, zum Beispiel über eine Phenyl-Superose Säule, weiter gereinigt werden, wobei als Elutionsmittel ein linearer Gradient von beispielsweise 0,8 M NH4(Sθ4>2 / 0.1 M Na2HPθ4 (pH 7,2) in Frage kommt. Die erhaltenen Fraktionen können anschließend anhand üblicher Assays getestet werden.
Zur Identifizierung und Selektion von Antikörpern, Fragmenten oder Derivaten davon, die mit mindestens einem Epitop des entsprechenden Antigens reagieren, kann jedes bekannte Verfahren verwendet werden. Beispielsweise dadurch, daß diese nach entsprechender Markierung detektierbar sind, wenn sie an isoliertes oder gereinigtes Antigen gebunden haben oder über Immunpräzipitation des beispielsweise über Gelfiltration, Chromatographie oder Polyacrylamidgele gereinigten Antigens, oder dadurch, daß Antikörper gegen ein entsprechendes Antigen mit anderen Antikörpern um das Binden an dasselbe Antigen konkurrieren.
Die Wahl, Art, Quelle und das Herstellungsverfahren der Antikörper für die erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen sind nicht kritisch für die Ausführung der vorliegenden Erfindung. Sie können aus jeder Klasse oder Subklasse und durch jedes bekannte Verfahren, je nach dem welches der Fachmann für sich favorisiert, ausgewählt und hergestellt werden. Im Falle, daß die erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen für den therapeutischen Gebrauch und zum "Targeting" von zu behandelten Zellen oder Geweben verwendet werden sollen, sind die dafür benutzten Antikörper hinsichtlich ihrer Toxizität auszuwählen. Ein beispielsweise mit einem Effektormolekül konjugierter Antikörper Z (gemäß Tabelle 1 ) zusammen mit den beiden anderen Komponenten 1 und 2, welche X und Y gemäß Tabelle 1 enthalten, kann vorerst in vitro auf Cytotoxizität getestet werden, wenn eine Kombinationspraparation für vorzugsweise immunotherapeutische Zwecke an Säugetierorganismen, insbesondere an Menschen, eingesetzt werden soll. An bekannten Tiermodellen, beispielsweise an Mäusen oder Ratten, kann die entsprechende Kombinationspraparation weiter hinsichtlich ihrer Wirksamkeit in vivo untersucht werden. Grundsätzlich ist es für den Fachmann ohne weiteres möglich einen Antikörper mit der Funktion X gemäß Tabelle 1 , vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, gegen alle vorkommenden iß antigenen Determinanten und Antigene auszuwählen, herzustellen und, wie oben skizziert, zu testen und zu untersuchen. Beispielsweise sind solche Antigene Tumor-, Bakterien-, Virus-, Parasiten-, Pilz-, Mycoptasmen-, Histokompatibilitäts-, Zelloberflächen-, Zellrezeptor-Antigene oder Antigene auf Basis von Toxinen, Enzymen, Allergenen oder andere physiologisch relevante Stoffe einschließlich pflanzliche Antigene.
Hinsichtlich diagnostischer Methoden, Nachweisverfahren oder Assays können die erfindungsgemäßen Kombinationspräparate bei allen bekannten serologisch- immunologischen diagnostischen Verfahren verwendet werden.
Beispielsweise eignen sich die erfindungsgemäßen Kombinatioπspräparationen bei Immunfluoreszenztests, beispielsweise direkter (IFT) oder indirekter Immunfluoreszenztest (IIFT); Enzymimmunoassays (EIA); Agglutinationstests, wie beispielsweise Agglutinationshemmtest, Immunsorbent Agglutination Assay (ISAGA); Radioimmunassays (RIA); Immunoradiometrischer Assay (IRMA), Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), μ-capture-Assay; Enzym Membran Immuno Assay (EMIA); fmmuno Enzymo-Metric-Assay (IEMA); Double Antibody Liquid Phase- Assay (DALP-Technik); Fluoreszenzimmunoassay (FIA), beispielsweise homogener Fluoreszenzimunoassay, Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay, Fluoreszenz- Enhancement-Immunoassay, Fluoreszenz Quenching Immunoassay, Fluoreszenz Excitation Transfer Immunoassay (FETIA), Substrate Labelled Fluorescent Immunoassay (SLIFA), Heterogener Fluoreszenz Immunoassay,
Immunofluorometrischer Assay (IFMA), Time Resolved Fluorescence Immunoassay (TR-FIA); Lumineszenzimmunoassay, beispielsweise Chemilumineszenz Immuno Assay (CELIA), Solid Phase Antigen Luminescence Technique (SPALT), Immunoluminometrischer Assay (ILMA), Immunolumiπometric Labelled Second- antibody Assay (ILSA); Immunoblot bzw. Western blotting oder Dot-blot Techniken. Es soll an dieser Stelle hervorgehoben werden, daß die oben beispielhaft aufge- zählten in der Literatur beschriebenen und dem Fachmann bekannten, für die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen geeigneten Verfahren nicht vollständig sind und auch nicht sein müssen, da derartige Verfahren, die der immunologischen Diagnostik zur Verfügung stehen und die auf Basis von Immunglobulinen bzw. Antikörpern arbeiten, dem Fachmann bekannt sind. Überdies sind derartige Verfahren und Techniken in der Literatur vielfältig beschrieben, beispielsweise von BAUER, S. , Lab. Med. 3, 50, 1 979 (Immunfluoreszenztechniken); DWENGER, A. , J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22, 883 - 894, 1984 (RIA); ADDISON, G. M. & HALES, C. N., In: Kirkham, K E.. Hunts, W.M. eds., Radioimmunoassay methods, Livingstone, Edinburgh, 595, 1971 (IRMA); OELLERICH, M., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22, 895 - 904, 1984 und MIYAI, K. , Adv. Clin. Chem. 24, 61 - 1 10, 1 985 und LINKE, R. , Mitt. Dt. Ges. Klin. Chem., 1986, 291 (EIA); HEMMILÄ, I . , Clin. Chem. 3_1, 359 - 370, 1985 und WISSER, H., GIT-Labormedizin 1985, 89 (FIA); WEEKS, I. et al. Clin. Science 70, 403 - 408, 1986 und GADOW, A. et al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 12, 337 347, 1984 und WOOD, W.G. et al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22, 349 - 356, 1984 (Lumineszenzimmunoassay); BURNETTE, W.N., Anal. Biochem. 1 12, 195 203, 1 981 , (Western blotting), DESMONTS, G. et al. , J. Clin. Microbiol. 14, 486 491 , 1 981 (ISAGA).
Wenn ein frühzeitiges Resultat an technischen Daten erwünscht ist, aufgrund dessen eine Diagnose erstellt werden kann, können solche Immunoassays bevorzugt sein, die innerhalb kurzer Zeit die gewünschten Daten zu liefern vermögen. Hierzu kommen beispielsweise solche Immunoassays in Betracht, die auf einem Sandwich-Test, kompetitiven Test, kolorimetrischen Test (wie beispielsweise der CEDIA™ Test gemäß HENDERSON, D. R., et al, Clin. Chem. 23(9): 1 637 - 1 641 , 1986) beruhen und als Schnelltests anwendbar und dem Fachmann bekannt sind.
Im Falle des Sandwich-Assays kann die Komponente 1 aus einem mit einer Determinante Ha-] verbundenen Protein bestehen, das ein beispielsweise in einer Untersuchungsprobe enthaltenes Antigen erkennenden monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein kann, insbesondere ein monoklonaler Antikörper, welches an eine anti-Ha - Bindungstelle (von Komponente 2) binden kann und andererseits einen an ein Trägermaterial, beispielsweise eine Mikrotiterplatte, immobilisierten Fangantikörper erkennen kann. Komponente 2 kann dann über ihre anti-Ha-] Stelle an Komponente 1 binden. Im weiteren kann ein mit einer Determinante Ha2 ausgestattetes Mittel, beispielsweise ein Enzym, (zum Beispiel Meerrettischperoxidase), welches vorzugsweise reagieren kann mit einem detektierbaren Mittel, das heißt einem Markierungs- bzw. Indikatormolekül, beispielsweise 2,2'-azino-ö/s(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat (ABTS). Ein beispielsweise in der EP-B1 0 394 81 9 offenbartes Verfahren kann ohne weiteres für die erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen adaptiert werden. 1*5 Eine andere Variante kann beispielsweise auf mit Biotin konjugierten Antikörpern beruhen, welche an einem mit Streptavidin beschichteten Träger binden. Durch Hinzufügen zu diesem System von Peroxidase markierten, mit einer Determinanten Ha2 verbundenen Antikörpern und der zu untersuchenden Probe kann in Gegenwart eines geeigneten, detektierbaren Mittels (beispielsweise 2,2' azino- ö/s(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat) die Farbreaktion nach bekannten Methoden spektrophotometrisch gemessen werden.
Vorteilhafterweise können demzufolge die erfindungsgemäßen Kombinations- präparationen auch für ein Verfahren auf Basis eines Immunoassays verwendet werden, bei dem beispielsweise ein erster mit einer Determinante Ha -| ausgestatteter Antikörper, der an ein zu testendes Antigen in einer Probe binden kann, mit einem Bindungsprotein einer biologischen Bindekonstanten k-jjs > 0' - 2 M/L, beispielsweise Biotin oder ein Biotinderivat, verbunden ist. Ein entsprechendes, mit einer Determinante Ha2 ausgestattetes Mittel, beispielsweise ein zweiter Antikörper, welcher entsprechend an ein Antigen in einer Probe binden kann, kann vorteilhafterweise markiert sein mit einem Indikatormolekül. An einem Trägermaterial kann ein Protein mit Bindungsprotein-bindenden Eigenschaften gebunden sein. Im Falle, daß das Bindungsprotein Biotin ist, kommt hierbei Avidin oder Streptavidin oder ein funktionelles Derivat davon in Betracht. Als Indikatormolekül, mit dem der nicht mit einem Bindungsprotein verbundene, aber mit Ha2 ausgestattete zweite Antikörper markiert ist, kommen alle bekannten Markierungs- oder Indikatormoleküle in Betracht, beispielsweise Meerrettichperoxidase. Der dadurch gebildete Immunkomplex kann nach bekannten Verfahren optisch dargestellt werden. Im Prinzip wird ein solcher auf Streptavidin- Biotin-Bindung beruhender Immunoassay beispielsweise beschrieben von MÜLLER- BARDORFF, M. et al., Circulation 92(10):2869 - 2875, 1995, welches ohne weiteres in vorteilhafter Weise für die erfindungsgemäßen
Kombinationspräparationen übertragen und damit angewendet werden kann.
In einer weiteren Variante eines ELISA Sandwich-Assays zur Detektierung von Antigenen in einer Probe kann ein Trägermaterial, beispielsweise übliche Mikrotiterplatten, mit Antikörpern gegen dieses Antigen beschichtet ("gecoated") werden, wonach die Probe mit diesem beschichteten Trägermaterial in Gegenwart eines geeigneten Puffers in Kontakt gebracht wird. Unter vorheriger Zugabe der entsprechenden Komponente 2 kann anschließend ein geeignetes mit einer tl
Determinanten Ha -| ausgestattetes Reagenz, beispielsweise ein Antikörper hinzugegegeben und entsprechend in Gegenwart eines geeigneten Puffersystems inkubiert werden. Danach kann ein mit einer Determinanten Ha2 ausgestattetes IgG-Peroxidase-Konjugat und ein geeignetes Reagenz (beispielsweise o ■ Phenylendiamin) hinzugefugt und die Reaktion mittels einer Mineralsaure (z.B H2SO4) gestoppt werden. Anschließend kann die Absorption nach üblichen Methoden gemessen werden Das beispielsweise von TSUBOUCHI, H. et al. , Hepatology 1_3(1 ): 1 - 5, 1991 , beschriebene Verfahren kann ohne weiteres auf die Anwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen übertragen io werden.
Als Trägermateπal, welches für das erfindungsgemäße Verfahren in Frage kommt, und welches gemäß der vorliegenden Beschreibung mit entsprechenden Bindungsproteinen beschichtet sein kann bzw. an dem erfindungsgemäß die
I5 geeigneten Reagenzien, Proteine oder speziell Antikörper immobilisiert sein können, eignen sich alle bekannten, für einen Immunoassay verwendbaren Materialien. Insbesondere kommt jedes wasserunlösliche Material in Betracht, von dem der Fachmann weiß, daß es Proteine bzw. Polypeptide auf seiner Oberfläche binden bzw. adsorbieren kann, vorzugsweise solches aus Kunstoffen, wie beispielsweise 0 Polyvinyle, Polystyrole, Acrylate, Polypropylene, Polycarbonate, Silikone. Derartige aus solchen Stoffen bestehenden Trägermaterialien können von unterschiedlicher Form und Größe sein, je nach den individuellen Bedürfnissen des Fachmanns, der den Assay anwendet. Demgemäß kann das Trägermaterial aus mit einem Hohlkörper (beispielsweise Röhrchen, Tuben, Küvetten) oder aus mit mindestens
25 einer Vertiefung oder Mulde, die gerundet oder eckig ausgestaltet sein kann, versehenen Formkörper bestehen, der vorzugsweise flächig ausgestaltet sein kann (beispielsweise Platten, Scheiben, Tafeln, Streifen, Objektträger, Mikrotiterplatten).
Um die in einem Immunoassay erfindungsgemäß zu verwendeten Mittel der 30 Komponente 3 detektierbar zu machen, können diese in geeigneter Weise und nach bekannten Methoden mit Markierungs- oder Indikatormolekülen markiert werden. Besonders geeignete Markierungs- oder Indikatormoleküle für das erfindungsgemäße Verfahren sind mit Determinanten Ha2 bzw. Han ausgestattete Proteine, beispielsweise Antikörper, Enzyme (beispielsweise Peroxidasen, ß- 35 Galaktosidasen, alkalische Phosphatase), und daran gekoppelte Farbstoffe (insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat), paramagnetische Atome, chromogene Substrate (beispielsweise o Phenylendiamin oder 2,2' Azιno-dι[3-ethylbenzthιazolιn-sulfonat(6)], Radioisotope (beispielsweise der Halogene, des Technetiums, des Bleis, des Thalliums, des Indiums oder des Quecksilbers) Metalle (beispielsweise Gold bzw. Goldpartikel oder Silber) Verfahren zur Durchfuhrung solcher Markierungen sind dem Fachmann bekannt und sind literaturbeschπeben. Im Falle, daß als Indikatormolekul Gold bzw Goldpartikel verwendet werden, kann gemäß der bekannten Immungold Technik das Gold mit einem Protein mit Bindungsprotein-bindenden Eigenschaften, beispielsweise mit Biotin bindenden Proteinen (beispielsweise Avidin oder Streptavidin) überzogen werden. Im Zusammenspiel mit beispielsweise entsprechend biotinylierten Antikörpern erfolgt die optische Detektierung. Ein derartiges der optischen Detektierung zugrundeliegendes Signal kann zusätzlich verstärkt werden, indem die Fähigkeit der Goldpartikel ausgenutzt wird, in Gegenwart eines geeigneten Reduktionsmittels (beispielsweise Hydrochinon), Silberionen zu reduzieren. In diesem Fall wird bei dieser Immungold-Silberfärbung eine Nachkontrastierung dadurch erzielt, daß sich Silber auf den Goldpartikeln niederschlägt, sodaß eine dunkelbraune bis tiefschwarze Färbung erzeugt wird. Dadurch kann vorteilhafterweise eine Empfmdlichkeitssteigerung des betreffenden Immunoassays zum Nachweis von Antigenen in einer Untersuchungsprobe erzielt werden
Die Detektierung über Biotin kann über Biotinylierung mittels bekannter Methoden erfolgen, beispielsweise dadurch, daß die Bindung eines Antigens an Biotin unter Verwendung von N-hydroxysuccinimidbiotin (beispielsweise in Dimethylsulfoxid) in bekannter Weise erfolgt. Derart biotmylierte Antigene bzw. die entsprechenden Antikorperkomplexe können identifiziert werden beispielsweise mittels Avidin- konjugierter alkalischer Phosphatase (ExtrAvidin, Sigma, Deisendorf, Deutschland).
In beispielhafter Weise kann eine Anwendung in einem Immunoassay dadurch erfolgen, daß Komponente 1 ein gegen ein bestimmtes Antigen, beispielsweise ein Tumorantigen, gerichteter mit emem Hapten Ha-] , beispielsweise 2,4-Dιnιtrophenyl (DNP), verbundener Antikörper (X in Ha-] — X), vorzugsweise ein haptenisierter monoklonaler Antikörper, ist. Als Komponente 3 kommt beispielsweise ein mit einem Hapten Ha2 (zum Beispiel Digoxigenin (DIG)) verbundener Fluoreszenzfarbstoff (Z in Ha2 — Z) in Frage, zum Beispiel Fluoresceinisothiocyanat Als Immunlinker (Komponente 2) kommt hierbei ein bispezifisches Reagenz in Betracht, welches anti-Ha-] (antι-DNP):antι-Ha2 (anti-DIG) Spezifitäten aufweist. IS
Vorzugsweise ist der Immunlinker ein bispezifischer monokolaler Antikörper mit den entsprechenden Spezifitäten. Die Komponenten 1 und 2 werden entweder zusammen mit Komponente 3 mit der zu untersuchenden Probe (Körperflüssigkeiten, Zellen, Gewebe oder Organteile) nach bekannten Verfahren in Kontakt gebracht oder Komponente 3 kann nach erfolgter Reaktion der Komponenten 1 und 2 anschließend, zeitlich verzögert, hinzugefügt werden. Eine nähere Beschreibung über bevorzugte Anwendungsmodalitäten erfolgt an anderer Stelle der vorliegenden Beschreibung.
Eine weitere Bedeutung in der Anwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen liegt darin, daß sie zum "Imagiπg" geeignet sind. Darunter ist das spezifische Detektieren, Auffinden und Lokalisieren von gesunden, nicht-pathologischen und pathologisch veränderten bestimmten Zellen und Geweben und Teilen davon in vitro und in vivo, also extrakorporal und intrakorporal, zu verstehen. Pathologisch veränderte Zellen und Gewebe können beispielsweise maligen entartete Zellen oder Gewebe sein. Ein solches "Imaging" kann dadurch erfolgen, daß X und Z gemäß Tabelle 1 definitionsgemäß mit zwei verschiedenen Determinanten Ha-| und Ha2 (bzw. Han), beispielsweise Haptenen, konjugiert sind und Y entsprechende anti-Ha-] und anti-Ha2 (bzw. anti-Han) Spezifitäten aufweist. In diesem Fall kann Z ein mit einer radioaktiven Substanz, mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder mit einem Kontrastmittel markiertes Trägermolekül sein, beispielsweise ein mit einer Determinanten ausgestattetes Protein, beispielsweise ein Enzym. Betreffend radioaktive Isotope kommen alle bekannten ß- und γ-Emitter in Betracht, vorzugsweise jedoch solche mit kurzer Halbwertszeit. Im Falle, daß ein Radioisotop gewählt wird, stehen dem Fachmann die ihm bekannten radioaktiven Mittel zur Verfügung, beispielsweise sind geeignet 1 25, 1 23| 1 31 |, 1 1 1 ,nr 1 13m|n 99mTc, 203Pb, 201T|, 198Hg, 90γ, 186Re, 60Co, 67Ga, 75Se, 1 12mAg, 198Au, 203 g, 32P, 51 Cr| 59pe, A|s Fluoreszenzfarbstoff kommt beispielsweise ein Fluorescein (zum Beispiel Fluoresceinisothiocyanat) und als Kontrastmittel beispielsweise ein paramagnetisches Kontrastmittel in Betracht. Mittels dem Fachmann bekannter, geeigneter Vorrichtungen, beispielsweise mit einer Gamma-Scintillationskamera, über magnetische Resonanzmessung oder mikroskopisch, können mit einer solchen Kombinationspraparation Zeil- und Gewebetypen und Teile davon leicht detektiert und lokalisiert werden. In derartigen Systemen können natürlich die Determinanten, beispielsweise Haptene, selber das Objekt einer derartigen Markierung sein. Auch in diesem Fall kann Komponente 3, beispielsweise konjugiert mit einem Isotop, zeitlich verzögert gegeben werden, verbunden mit dem Vorteil einer geringeren radioaktiven Belastung beim in vivo Imaging.
Zur näheren Erläuterung der Verwendung einer der der Erfindung zugrundeliegenden Kombinationspraparationen für das Imaging soll im weiteren eine noch detailiertere Beschreibung erfolgen, obwohl der Fachmann zu diesem Zweck auf seine Erfahrung und die ihm bekannte Literatur zurückgreifen kann und ihm von daher eine Anzahl von Verfahren zur Verfügung steht, die er für den erfindungsgemäßen Zweck ohne weiteres unter seinen Laborbedingungen io übernehmen, anpassen und verwenden kann.
Grundsätzlich ist bei einem Immunimaging zu berücksichtigen, in wie weit ein "Targeting " kleiner radiomarkierter Liganden durch bispezifische Reagenzien (zum Beispiel Antikörper) vermittelt werden kann, ob dieses "Targeting" genügend spezifisch ist und welche Art von radioaktiv markierten Antigen oder Hapten (Z
1 oder Ha2 bzw Han in Ha2-Z bzw Han-Z gemäß Tabelle 1 ) vorzugsweise verwendet werden soll. Zur Lösung derartiger Fragen kann Z, beispielsweise ein Antikörper oder ein anderes Protein bzw. Fragment davon, direkt mit einem Radioisotop nach bekannten Verfahren markiert werden, oder die Markierung erfolgt über Kopplung des entsprechenden Isotops an eine ausgewählte Determinante Ha2, beispielswiese
20 ein Hapten, bzw. an ausgewählte Determinanten bzw. Haptene Han, welches bzw. welche an ein Träger (Z) gebunden ist. Im Falle eines Haptens kann dieses aus einem monovalenten Hapten oder einem bivalenten Hapten bestehen, welches hydrophob oder hydrophil sein kann. Als monovalentes, hydrophiles Hapten kommt beispielsweise Dinitrophenyl in
2 Frage, welches mit einem der oben genannten Radioisotopen markiert und an ein Protein oder Peptid gebunden sein kann, beispielsweise 1 25| oc(er 1 1 1 ,n. Beispiele für bivalente hydrophile Haptene sind Derivate der Diethylentnaminpentaessigsäure, worin Isotope, beispielsweise 1 5| ocjer 1 1 1 |n als Metallchelate vorliegen können. Derartige Haptene sind in der Lage, über ihre Carboxylgruppen im Sinne einer
30 Säureamidbindung vorzugsweise an Peptide oder Proteine (Z) zu binden.
Wenn ein Imaging, insbesondere ein Immunoimaging von Tumoren, unter klinischen Bedingungen durchgeführt werden soll, kann Z vorzugsweise ein über ein bivalentes, hydrophiles Hapten chelatisiertes Radioisotop, beispielsweise 1 25, ocjer 1 1 1 In, sein, welches beispielsweise durch Reaktion mit dem zyklischem Anhydrid
I der Diethylentnaminpentaessigsäure erhalten werden kann, beispielsweise gemäß LE DOUSSAL, J.-M. et al., Cancer Res. 50, 3445 - 3452, 1990. Für solch einen So
Fall sind bivalente Haptene, insbesondere hydrophiler Natur, bevorzugt gegenüber monovalenten, hydrophoben Haptenen. Weitere Beispiele für in Frage kommende bivalente Haptene wären Dinitrophenyldeπvate bzw. Abkömmlinge der N-t- Dinitrophenylaminocapronsäure, welche mit 125| jodiert oder mit ^ '• - n markiert werden können. Derartige Haptene sind kommerziell erhaltlich Für weitere Beispiele für die Verwendung und Herstellung mono- und bivalenter Haptene, welche mit beispielsweise ^ 25, 0(-|er 1 1 1 |n markiert sein können und die über Säureamidbiπdungen an Aminosäuren und somit an Peptide und Proteine kovalent gebunden sein können, und die bekannterweise für ein Tumoπmaging aber auch für therapeutische Zwecke im Sinne der vorliegenden Erfindung geeignet sind, ist auf die Literatur zu verweisen, beispielsweise auf LE DOUSSAL, J.-M. et al., J. Nucl. Med. 30, 1358 - 1366, 1989. Allgemein kann auf der Grundlage der Ergebnisse von LE DOUSSAL, 1990, loc cit. , davon ausgegangen werden, daß bivalente Haptene gegenüber monovalenten Haptenen Vorteile besitzen. Dem Fachmann sind die Methoden der Markierung von Proteinen einschließlich Antikörpern mit Radioisotopen aus der vielfältigen Literatur gut bekannt, sodaß es hierzu unnötig ist, auf spezielle Literatur hinzuweisen. Als Beispiel für eine radioaktive Markierung von Proteinen sollen rein exemplarisch die EP A 0 237 150 oder die EP A 0 36 678 genannt werden.
Auf diese Weise können mit den erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen Radioisotope direkt an den gewünschten Ort zielgerichtet transportiert werden. Betreffend die vorgenannte Verwendung eines Chelators ist für den Fachmann klar, daß nicht nur die beispielhaft genannten Chelatoren in Betracht kommen und nicht nur die damit chelatisierten, beispielhaft genannten Radioisotope, sondern daß alle bekannten Chelatoren für eine Vielzahl an detektierbaren Markern stehen können, insbesondere Radiometalle oder magnetresonanzverstärkende Metallionen. Weitere Beispiele geeigneter Chelatoren sind Ethylendiamintetraessigsäure oder Bisthiosemicarbazone von 1 ,2- oder 1 ,3-Dicarbonylverbindungen. Hinsichtlich einer geeigneten Applikationsweise der drei Komponenten Ha-, — X, anti-Ha -| — Y — anti-Ha2 bzw. — Y — anti-Han und Ha2 — Z bzw. Han — Z für ein Tumorimaging, können diese gleichzeitig, sequentiell oder konsekutiv gegeben werden. Vorteilhaft kann aber eine schrittweise Vorgehensweise sein, indem zuerst die Komponente 1 (X) gegeben wird, um am Zielort zu binden, zusammen oder zeitlich getrennt mit der Immunolinkerkomponente (Y), und erst danach, um Minuten, Stunden oder Tage verzögert (abhängig vom Untersuchungszweck und Sl ■ der Lokalisation, Größe und Art des Zielortes bzw. Tumors), die Komponente 3 (Z). Alternativ kann dieses schrittweise Verfahren auch dadurch erfolgen, daß das Zeitintervall der Applikation zwischen den Komponenten 1 und 2 (X bzw Y) liegt und die Komponente 2 (Y) zusammen mit der Komponente 3 (Z) gegeben wird. Hierdurch kann ein durch Komponente 1 (bzw. Komponenten 1 und 2) vermitteltes "pre-targeting" erreicht werden, wodurch eine effektivere Aufnahme von in diesem Fall radιoaktιvem(n) Determinanten, beispielsweise Hapten(en), bzw. von radioaktiv markiertem Z erfolgen kann. Außerdem ist damit eine schnellere Clearaπce der Determinante bzw. des Haptens bzw. der Komponente 3 aus dem Plasma zu erwarten, was zu einem verbesserten Tumor/Nicht-Tumor Kontrast führen kann. Ebenso möglich ist eine gleichsam zeitlich verzögerte Applikation aller drei Komponentenl , 2 und 3.
Als vorteilhaft kann eine Applikationsweise angewendet werden, bei der die Komponente 3, zeitlich um Minuten, Stunden oder Tage verzögert, zuletzt gegeben wird. Die Zeitintervalle der verzögerten Applikationen zwischen den Komponenten 1 und 2 und von Komponente 3 hängt insbesondere ab von dem gewählten Radioisotop bzw. dessen Halbwertszeit (welche zwischen 1 ,2 Minuten bei 1 1 mAg und 121 Tagen bei ^^Se liegen kann) und der Art des zu untersuchenden Materials. Als Applikationsrouten kommen alle die dem Fachmann bekannten Wege in Betracht, insbesondere i.V., i.m., s.c, i.p., i.a., i.e.
Eine typische Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen für das Imaging besteht beispielsweise darin, daß ein nach bekannten Methoden hergestelltes monospezifisches, mit einem Hapten Ha^ verbundenes monospezifisches Reagenz gemäß Komponente 1 , worin X vorzugsweise ein Antikörper ist, in einen Säugetierorganismus beispielsweise i.v. appliziert wird, sodaß es spezifisch an eine korrespondierende Bindungsstelle (zum Beispiel ein Antigen bzw. Epitop bzw. eine "target strueture") beispielsweise einer Tumorzelle bindet. Anschließend oder gleichzeitig wird die Komponente 2 gegeben (zum Beispiel i.v.), welche an die Determinante (Ha-] ) über ihre anti-Ha •] Spezifität bindet. Vorzugsweise zeitlich verzögert wird anschließend die mit einem geeigneten Radioisotop markierte und mit einer geeigneten Determinante Ha2 oder geeigneten Determinanten Han verbundene Komponente 3 verabreicht (in diesem Falle ebenfalls i.v.), die mit der anti-Ha2 Stelle von Komponente 2 (Y — anti-Ha2) reagiert. Zum Zweck einer Vorbestimmung betreffend die Bioverteilung des radioaktiven Mittels (Komponente 3) der erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen können entsprechend behandelte Versuchstiere (Mäuse, Ratten, Kaninchen usw.) nach der letzten Applikation getötet und ihre Organe sowie ihr Blut entnommen werden. Zur weiteren Untersuchung kann das Blut wie üblich heparinisiert, zeπtrifugiert und die
Radioaktivität im Plasma gemessen werden. Die entnommenen Organe und Tumore werden üblicherweise in entsprechend große Schnitte zerlegt und deren Radioaktivität analog gemessen bzw. der Zerfall des betreffenden Radionuklids mit einem Counter gezählt. Auf diese Weise läßt sich das Verhalten von Komponente 3 in einem Säugetierorganismus vorbestimmen und die Applikationsweisen (Menge,
Dosis, zeitliche Verabfolgung) ohne weiteres optimieren.
Für das eigentliche Imaging kann das zu untersuchende Säugetier oder der Patient zuerst mit der Komponente 1 (im Falle eines Antikörpers vorzugsweise ein humanisierter Antikörper, wenn ein Mensch untersucht werden soll) injiziert werden (systemisch oder topisch, beispielsweise i.V., i.m. oder s.c, in die Nähe, an oder in das zu untersuchende Material). Anschließend oder gleichzeitig mit Komponente 1 wird die Komponente 2 und, vorzugsweise zeitlich verzögert, die mit einer geeigneten Determinante Ha2 verbundene, radioaktiv markierte Komponente 3 über die entsprechende gleiche Route appliziert. Beispiele für dafür geeignete Radioisotope sind 1 5| uncj 1 1 1 |n beispielsweise im Bereich von 1 bis 500 μCi (3,7-104 bis 1 ,85 -107 Bq), insbesondere um 100 μCi (3,7-106 Bq). Einem solchen Zweischrittsystem folgend, wird in einer ganz bevorzugten Ausführung ein monoklonaler Antikörper mit anti-Tumor Eigenschaften und mit einem Hapten Ha-] , welches beispielsweise ein Dinitrophenylderivat, zum Beispiel 2,4-Dinitrophenol (DNP), sein kann (Komponente 1 ), gekoppelt, mit einem bispezifischen monoklonalen Antikörper mit anti-Ha-] :anti-Ha2 Eigenschaften (beispielsweise anti-DNP:anti-DIG, wenn Ha2 ein Digoxigenin [DIG] ist) in üblicher Weise intravenös in einen Säugetierorganismus gegeben. Nach einem geeigneten Zeitintervall von beispielsweise 24 bis 120 Stunden als Richtwert (abhängig von der Affinität des gewählten Antikörpers der Komponente 1 , des gewählten Isotops und der Art des Tumors) wird die Komponente 3, beispielsweise ein "* ^ Inmarkiertes oder 123|-mar| jertes mjt QIQ haptenisiertes Trägermolekül, beispielsweise ein Protein, intravenös appliziert, gegebenenfalls zusammen mit einer geringeren Menge von Komponente 2 als Träger. Auf diese Weise kann das m in oder das ^ 23| an den vorher mit Komponente 1 bzw. Komponente 2 "vormarkierten" Tumor spezifisch und zielgerichtet transportiert werden und die gewünschte Wirkung entfalten. Ein ähnliches, jedoch herkömmliches System wird beispielsweise von STICKNEY, D. R. et al. , Antibody, Immunoconjugates, and Radiopharmaceuticals 2( 1 ), 1 - 1 3, 1 989, beschrieben. Nach der letzten Injektion werden in entsprechenden zeitlichen Intervallen von beispielsweise 0.5, 1 , 2, 4, 6,
1 0, 24, 48 oder 72 Stunden über eine Gammakamera szintigraphische Aufnahmen vorgenommen und die erhaltenen Szintigramme wie üblich ausgewertet. Diese beispielhafte Darstellung stellt selbstverständlich nur eine Möglichkeit dar, die erfindungsgemaßen Kombinationspraparationen zu verwenden und der Fachmann ist ohne weiteres in den Lage, andere Variationen anzuwenden und äquivalente Anwendungen durchzuführen. Auf die vielfältige Literatur sei daher hingewiesen, auf die hier nicht erschöpfend eingegangen werden kann und aus vorgenannten Gründen auch nicht eingegangen werden muß.
Es ist daher auch selbstverständlich, daß ein solches "pre-targeting" auch bei den anderen beschriebenen immundiagnostischen Verfahren in vitro angewendet werden kann, wofür die zu untersuchende Probe zuerst mit der Komponente 1 , dann entweder gleichzeitig oder verzögert mit den Komponente 2 und nach einer minütlichen oder stündlichen Verzögerung mit Komponente 3 in Kontakt gebracht wird.
Eine weitere vorteilhafte Verwendungsmöglichkeit der erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen besteht in einem Verfahren zur Bestimmung, ob ein Mittel mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften umfassend ein Effektormolekül, ein Rezeptorbindungsmolekül, ein Immunglobulin bzw. Antikörper, eine Markersubstanz, ein Enzym, eine radioaktive Substanz, eine radioaktiv markierte Substanz, ein Kontrastmittel, eine biologisch aktive Substanz, ein cytotoxisch, cytocidal, cytostatisch oder cytolytisch wirkendes Mittel oder ein beliebiges Antigen mit Effektor- Marker- oder Reporterfunktion, eine Wirkstoffvorstufe (prodrug), ein Adhäsionsmolekül, ein Cytokm, ein Lymphokin, ein Chemokin, ein Ligand, eine bei der in vitro und in vivo Diagnostik, bei der Immuntherapie oder bei Immunisierungen geeignete biologische, chemische oder physikalische Wirkung in vitro oder in vivo entfaltet oder zeigt, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) eine erste Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 , 2 und 3 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Z, Ha-, und Ha2 bzw. Han, mit einem ersten zu bestimmenden Mittel Z mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften herstellt, b) eine mindestens zweite Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 , 2 und 3 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Z, Ha-, und Ha2 bzw. Han, mit einem von a) unterschiedlichen zweiten zu bestimmenden Mittel Z mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften herstellt, c) die nach a) und b) bereitgestellten Kombinationspräparationen nacheinander oder gleichzeitig in einem in vitro oder in einem in vivo System, welches gleich oder verschieden sein kann, in Kontakt bringt mit einer zu untersuchenden, spezifischen biologischen Bindungsstruktur bzw. einer zu untersuchenden Probe innerhalb oder außerhalb eines tierischen oder menschlichen Körpers, d) den Schritt gemäß c) beliebig wiederholt, wobei das zu bestimmende Mittel Z an Komponente 3 bei jeder Wiederholung hinsichtlich seiner biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften verschieden ist, e) die nach Schritt c) oder d) eingetretenen biologischen, chemischen oder physikalischen Wirkungen mißt, detektiert oder aufzeichnet und f) die nach e) erhaltenen Ergebnisse einzeln oder miteinander vergleichend auswertet.
Zusätzlich wird mit den erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen eine Variante des oben beschriebenen Verfahrens bereitgestellt, welche ebenfalls in vorteilhafter Weise geeignet ist zur Bestimmung, ob ein Mittel mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften umfassend ein Effektormolekül, ein Rezeptorbindungsmolekül, ein Immunglobulin bzw. Antikörper, eine Markersubstanz, ein Enzym, eine radioaktive Substanz, eine radioaktiv markierte Substanz, ein Kontrastmittel, eine biologisch aktive Substanz, ein cytotoxisch, cytocidal, cytostatisch oder cytolytisch wirkendes Mittel oder ein beliebiges Antigen mit Effektor- Marker- oder Reporterfunktion, eine Wirkstoffvorstufe (prodrug), ein Adhäsionsmolekül, ein Cytokin, ein Lymphokin, ein Chemokin, ein Ligand, eine bei der in vitro und in vivo Diagnostik, bei der Immuntherapie oder bei Immunisierungen geeignete biologische, chemische oder physikalische Wirkung in vitro oder in vivo entfaltet oder zeigt, dadurch gekennzeichnet, daß man a) eine Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 und Komponente 2 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Ha -] und Ha2 bzw. Han, herstellt, b) die nach a) bereitgestellte Kombinationspraparation in einem in vitro oder in einem in vivo System in Kontakt bringt mit einer zu untersuchenden, spezifischen biologischen Bindungsstruktur bzw. einer zu untersuchenden Probe innerhalb oder außerhalb eines tierischen oder menschlichen Körpers, c) eine erste Komponente 3 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für Z, mit einem ersten zu bestimmenden Mittel Z mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften herstellt, d) die nach c) bereitgestellte Komponente 3 dem System nach b) hinzufügt, e) daran anschließend eine zweite oder weitere Komponente 3 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für Z, mit einem zu bestimmenden Mittel Z mit von c) und untereinander unterschiedlichen biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften dem System gemäß b) gleichzeitig oder nacheinander hinzugibt, f) gegebenenfalls die Schritte a) bis e) beliebig wiederholt, wobei das zu bestimmende Mittel Z an Komponente 3 bei jeder Wiederholung hinsichtlich seiner biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften verschieden ist, g) die nach Schritt e) oder f) eingetretenen biologischen, chemischen oder physikalischen Wirkungen mißt, detektiert oder aufzeichnet und h) die nach g) erhaltenen Ergebnisse einzeln oder miteinander vergleichend auswertet.
Daruberhinaus wird mit den erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen in vorteilhafter Weise ein Verfahren bereitgestellt zum Screenen einer Pluralität von Mitteln mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften ausgewählt aus Effektormolekülen, ein Rezeptorbindungsmolekülen, Immunglobulinen bzw. Antikörpern, Markersubstanzen, Enzymen, radioaktiven Substanzen, radioaktiv markierten Substanzen, Kontrastmitteln, biologisch aktiven Substanzen, cytotoxisch, cytocidal, cytostatisch oder cytolytisch wirkenden Mitteln oder beliebige Antigenen mit Effektor- Marker- oder Reporterfunktion, Wirkstoffvorstufen (prodrugs), Adhäsionsmolekülen, Cytokinen, Lymphokinen, Chemokinen, Liganden, die eine bei der in vitro und in vivo Diagnostik, bei der Immuntherapie oder bei Immunisierungen geeignete biologische, chemische oder physikalische Wirkungen in vitro oder in vivo entfalten oder zeigen sollen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) eine erste Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 , 2 und 3 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Z, Ha-, und Ha2 bzw. Han, mit einem ersten zu bestimmenden Mittel Z mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften herstellt, b) eine mindestens zweite Kombinationspraparation gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Z, Ha-| und Ha2 bzw. Han, mit einem von a) unterschiedlichen zweiten zu bestimmenden Mittel Z mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften herstellt, c) die nach a) und b) bereitgestellten Kombinationspräparationen nacheinander oder gleichzeitig in einem in vitro oder in einem in vivo System, welches gleich oder verschieden sein kann, s ■ in Kontakt bringt mit einer zu untersuchenden, spezifischen biologischen Bindungsstruktur bzw. einer zu untersuchenden Probe innerhalb oder außerhalb eines tierischen oder menschlichen Körpers, d) den Schritt gemäß c) beliebig wiederholt, wobei das zu bestimmende Mittel Z an Komponente 3 bei jeder Wiederholung hinsichtlich seiner biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften verschieden ist, e) die nach Schritt c) oder d) eingetretenen biologischen, chemischen oder physikalischen Wirkungen mißt, detektiert oder aufzeichnet und f) die nach e) erhaltenen Ergebnisse einzeln oder miteinander vergleichend auswertet.
Eine Variante des vorgenannten Verfahrens zum Screenen einer Pluralität von Mitteln mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften ausgewählt aus Effektormolekülen, ein Rezeptorbindungsmoleküleπ, Immunglobulinen bzw. Antikörpern, Markersubstanzen, Enzymen, radioaktiven Substanzen, radioaktiv markierten Substanzen, Kontrastmitteln, biologisch aktiven Substanzen, cytotoxisch, cytocidal, cytostatisch oder cytolytisch wirkenden Mitteln oder beliebige Antigenen mit Effektor- Marker- oder Reporterfunktion, Wirkstoffvorstufen (prodrugs), Adhäsionsmolekülen, Cytokinen, Lymphokinen, Chemokinen, Liganden, die eine bei der in vitro und in vivo Diagnostik, bei der Immuntherapie oder bei Immunisierungen geeignete biologische, chemische oder physikalische Wirkungen in vitro oder in vivo entfalten oder zeigen sollen, ist dadurch gekennzeichnet, daß man a) eine Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 und Komponente 2 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Ha-| und Ha2 bzw. Han, herstellt, b) die nach a) bereitgestellte Kombinationspraparation in einem in vitro oder in einem in vivo System in Kontakt bringt mit einer zu untersuchenden, spezifischen biologischen Bindungsstruktur bzw. einer zu untersuchenden Probe innerhalb oder außerhalb eines tierischen oder menschlichen Körpers, c) eine erste Komponente 3 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für Z, mit einem ersten zu bestimmenden Mittel Z mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften herstellt, d) die nach c) bereitgestellte Komponente 3 dem System nach b) hinzufügt, e) daran anschließend eine zweite oder weitere Komponente 3 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für Z, mit einem zu bestimmenden Mittel Z mit von c) und untereinander unterschiedlichen biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften dem System gemäß b) gleichzeitig oder nacheinander hinzugibt, f) gegebenenfalls die Schritte a) bis e) beliebig wiederholt, wobei das zu bestimmende Mittel Z an Komponente 3 bei jeder Wiederholung hinsichtlich seiner biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften verschieden ist, g) die nach Schritt e) oder f) eingetretenen biologischen, chemischen oder physikalischen Wirkungen mißt, detektiert oder aufzeichnet und h) die nach g) erhaltenen Ergebnisse einzeln oder miteinander vergleichend auswertet.
Auch die für die genannten Verfahren in Frage kommenden Mittel mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften, wie sie in der vorliegenden Beschreibung beispielhaft genannt wurden, sind dem Fachmann bekannt oder er kann sie aus der vielfältigen Literatur entnehmen. Dementsprechend ist der Fachmann in der Lage, die geeigneten biologischen, chemischen oder physikalischen Wirkungen der potentiell in Frage kommenden Mittel zu erkennen. Solche Wirkungen oder Meßparameter können beispielsweise umfassen: Ausmaß an Cytolyse, Zelltod oder Cytotoxizität, Auftreten von spezifischen und unspezifischen Reaktionen des Immunsystems, Grad, Art und Ausprägung radioaktiver Markierungen bzw. radioaktiver Signale oder von Bindungen von radioaktiven Stoffen an Zielorten, Verlauf von Tumorwachstum, Grad von Stimulierungsreaktionen beispielsweise mittels Adhesionsmolekülen, Grad der Aktivierung und Akkumulierung von Effektorzellen, Art und Grad der Bindung von Effektormolekülen an einen Zielort, Verlauf von Autoimmunkrankheiten, Abstoßungsreaktionen, Infektionserkrankungen oder Erkrankungen des Gerinnungssystems, Außmaß und Effizienz eines "drug targeting" oder eines "cell targeting", Messung fibrinolytischer Potenz von fibrinolytisch aktiven Mitteln (zum Beispiel Urokinase, Streptokinase, Gewebeplasminogen Aktivatoren (tPA), Messung der Inhibition der Replikation oder Multiplikation von Viren, Eintritt von Immunisierungen, Messen von Farbstoff reaktionen, Radioaktivitäten, Immunreaktionen (zum Beispiel Trübungen, Agglutinationen) oder Bindungen an Zielorten (zum Beispiel Rezeptorbindungen) in Immunoassays.
Des weiteren wird mit den erfindungsgemäßen Kombinationspräparationen in vorteilhafter Weise ein Verfahren zur Herstellung eines in der in vitro und in vivo Immundiagnostik verwendbaren Mittels ermöglicht, welches die Schritte umfaßt a) Bereitstellen mindestens einer Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 , 2 und 3 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Z, Ha-, und Ha2 bzw. Han, oder b) Bereitstellen mindestens einer Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 und 2 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Ha -] und Ha2 bzw Han, c) Identifizieren eines hinsichtlich seiner immundiagnostischen Eigenschaft biologisch, chemisch oder physikalisch wirksamen Mittels mittels der in a) und b) bereitgestellten Kombinationspraparationen über die oben offenbarten Bestimmungs- und Screenings-Verfahren d) Formulierung des aus c) erhaltenen Mittels in Form einer Kombinationspraparation gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Z, Ha-j und Ha2 bzw. Han mit den bekannten Hilfs- und Tragerstoffen, oder d) Formulierung des aus c) erhaltenen Mittels durch Verbinden mit einem monospezifischen Reagenz, welches an biologische Bindungsstrukturen zu binden vermag, nach bekannten Methoden und mit den bekannten Hilfs- und Trägerstoffen, oder e) Formulieren des aus c) erhaltenen Mittels für sich allem nach bekannten Methoden mit den bekannten Hilfs- und Trägerstoffen.
Es ist für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich, daß für die genannten Verfahren die Verwendung eines Mittels ganz besonders vorteilhaft ist, welches aus einer Kombinationspraparation besteht, umfassend die Komponenten 1 , 2 und 3 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Z, Ha-| und Ha2 bzw. Han, oder bestehend aus einer Kombinationspraparation umfassend die Komponenten 1 und 2 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Ha-, und Ha2 bzw. Han, oder bestehend aus Komponente 2 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für Y, in einem der genannten Bestimmungs-, Screening- oder Herstellungs-Verfahren.
Es soll an dieser Stelle hervorgehoben werden, daß selbstverständlich die in den oben offenbarten Verfahren und Verwendungen der Mittel für diese Verfahren beschriebenen technischen Merkmale die in der vorliegenden Beschreibung offenbarten Definitionen gelten.
Es soll an dieser Stelle auch betont werden, daß ein derartiges pre-targeting mit den erfindungsgemaßen Kombinationspraparationen auch bei der Immuntherapie oder bei Immunisierungen in vivo zur Anwendung kommen kann, aber auch bei der prophylaktischen und prognostischen Anwendung und zur Bestimmung von Krankheitszuständen und Krankheitsverläufeπ sowie zur Verhütung und Verhinderung des Ausbruchs oder der Entwicklung oder Exazerbation eines Krankheitszustandes.
Eine detailiertere Beschreibung über die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen hinsichtlich Art und Dosierung bei klinischen Anwendungen soll weiter unten erfolgen. Da eine therapeutische/prophylaktische/prognostische und verhütende klinische Anwendung in enger Beziehung steht mit einem Imaging von Tumoren und anderen pathologisch/klinisch bedeutungsvollen Antigenen, gelten die hierzu vorgeschlagenen Maßnahmen in analoger Weise auch für die Zwecke des Imaging und vice versa.
Betreffend die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen in der Therapie, insbesondere in der Immuntherapie, eröffnen sich eine Reihe an Anwendungsmöglichkeiten.
Wie auch bei der diagnostischen Anwendung, ist natürlich auch für die thera- peutische Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen erfindungsrelevant, daß X und Z (Tabelle 1 ) mit zwei verschiedenen Determinanten Ha-] und Ha2 (bzw. Han für Z) ausgestattet bzw. verbunden sind und daß Y entsprechende anti-Ha-, und anti-Ha2 (bzw. anti-Han) Spezifitäten aufweist. Unter diesen festgelegten Voraussetzungen kann Z beispielsweise ein lytisch wirkender oder ein cytocidal bzw. cytotoxischer Wirkstoff (zum Beispiel ein Toxin, ein Enzym, ein anderes biologisch wirksames Protein oder ein Effektormolekül oder ein Radioisotop) sein, der insbesondere die Vermehrung und Proliferationsrate von malignen Tumorzellen hemmt, unterdrückt oder herabsetzt. In diesem Fall kann Z in der betreffenden Kombinationspraparation ein mit einer Determinante Ha2 ausgestattetes, beispielsweise haptenisiertes, Enzym sein (beispielsweise alkalische Phosphatase), ein Cytokin (beispielsweise Interferon α, ß oder γ oder Derivate davon, ein Interleukin, wie beispielsweise IL-2), mit einer Determinante, beispielsweise einem Hapten, ausgestattete Effektorzellen oder Triggermoleküle (beispielsweise cytotoxische T-Lymphocyten, Monocyten, Macrophagen, NK- Zellen, Granulocyten [polymorphonukleare Neutrophile, Eosinophile], Fc-Rezeptoren für IgG, CD2, CD3) ein cytotoxisches Toxin oder ein Radioisotop. Hinsichtlich Toxinkonjugationen, die erfindungsgemaß in Betracht kommen, werden weitere und naher beschriebene derartige cytotoxische Substanzen für immuntherapeutische Zwecke, die zur Kopplung an die entsprechende Komponente der erfindungsgemaßen Kombinationspraparationen geeignet sind, beispielsweise in der EP-A 0 368 68, insbesondere auf den Seiten 6 bis 14, und in der dort aufgeführten Literatur, beschrieben.
Daruberhinaus ist ein "drug targeting" für die A-Kette von RICIΠ, für Vmca Alkaloide, Saporin, Daunomycin, alkalische Phosphatase (Umwandlung von Mitomycinphosphat zum wirksameren Mitomycinalkohol) übersichtlich in BRISSINCK, J. , Drugs of the Future 17, 1003 - 1010, 1992, beschrieben
Wenn ein oder mehrere Radioisotope für therapeutische Zwecke in Betracht kommen, so kommen hierfür die nach bekannten Methoden herstellbaren Radioimmunkonjugate in Frage. Hierbei ist Z gemäß Tabelle 1 als radioaktiv markiertes, mit mindestens einer Determinante, beispielswiese einem Hapten, ausgestattetes Molekül zu wählen oder wobei die Determinante selbst Trager von Radioisotopen sein kann, beispielsweise ein Hapten gemäß vorliegender Beschreibung und der bekannten Literatur. Es kommen insbesondere als Radioisotope sowohl ß- als auch γ-Emitter in Frage, beispielsweise 1 5,, 1 23,, 131 l, 1 l 1 |n, 99mjc, 90γ, 1 86RΘ Derartige therapeutische Anwendungen sind auf dem "Fourth International Conference of Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer", San Diego, California, 30.3. - 1 .4.1989, vorgestellt worden (GOLDENBERG, D. M., Immunology Today 10(9), 286 - 288, 1989).
Auch für die klinische Verwendung der erfindungsgemaßen Kombinationspraparate kann es von Vorteil sein, die oben schon beschriebene Anwendungsweise in analoger Weise durchzufuhren, unabhängig davon, ob Ha2 in Z Trager der Radioaktivität ist oder ob das mit Ha2 verbundene Z radioaktiv markiert ist oder ob Z ein anderes mit einer Determinante Ha2 ausgestattetes, eine Wirkung entfaltendes Mittel bedeutet (beispielsweise ein Enzym, ein Cytokin, ein T- Lymphocyt, ein Adhäsionsmolekül usw.). Die für das Tumonmaging vorgeschlagenen Applikationsweisen für die erfindungsgemäßen
Kombinationspraparationen finden daher für die klinische Verwendung entsprechende Anwendung. Es kann zudem von Vorteil sein, wenn multiple Injektionen von Komponente 3, gleichgültig ob damit ein Radioisotop oder ein anderer cytocidal, cytotoxischer oder cytostatischer Wirstoff oder eine Markersubstanz verbunden ist, appliziert werden Insbesondere dann, wenn es notwendig erscheint, über einen längeren Zeitraum zu behandeln. Damit können höhere Konzentrationen an Wirkstoff bzw Radioaktivität am Wirkort erzielt werden Im Falle, daß Tumorzellen innerhalb kurzer Zeit (' 1 Tag) auf eine Behandlung ansprechen und abgetötet werden können oder lediglich markiert bzw detektiert werden sollen, wäre eine Bolusinjektion, die einmal oder mehrfach hintereinander gegeben werden kann, vorzugsweise in der vorbeschriebenen Weise über zwei Schritte, vorteilhaft. Eine derartige Einmalanwendung kommt sicher auch für den vorgenannten Zweck des Imaging in Betracht, da das zu lokalisierende Organ oder Gewebe nur für kurze Zeit ein Signal emittieren muß.
Allgemein gilt, daß für die Behandlung eines Tumors mittels der erfindungsgemaßen Kombinationspraparationen, gleichgültig welches antitumor wirkende Mittel damit verbunden ist, die Größe und Art (klein, groß, homogen, heterogen, Ausmaß der Vaskulaπsation, Stadium, Art des exprimierten Antigens) von Bedeutung sein kann. Für nicht oder schlecht lokalisierte, heterogene Tumore ist das Erreichen einer konstanten Plasmakonzentration an Wirkstoff wünschenswert. Für diesen Fall sind multiple, systemische Applikationen, vorzugsweise i.v. Injektionen, von Komponente 3 vorteilhaft. Andererseits wird bei lokalisierbaren Tumoren, beispielsweise der Lymphknoten oder des Peritoneums, eine lokale Applikation, gegebenenfalls mehrfach, erforderlich sein. Hinsichtlich des schon erwähnten Zweischritt-Verfahrens hängt der Zeitraum der Gabe von Komponente 3 (nach Applikation der Komponenten 1 und 2) davon ab, welche Bindungsaffmitat die Komponente 1 (beispielsweise bestehend aus einem haptenisierten monoklonalen Antikörper mit spezifischer Reaktivität für ein bestimmtes Tumorantigen) für das betreffende Antigen besitzt. Bei einer hohen Bindungsaffinität kann das Zeitintervall ein Tag bis mehrere Tage sein. Die zu verwendende Dosis des zu apphzierenden Wirkstoffs ( Z ), folgt vorteilhafterweise stöchiometrisch der Menge an vorab applizierten Komponenten 1 und 2. Daraus folgt, daß die Dosis von Komponente 1 letztendlich derjenige Faktor ist, der die Wirkung des eingesetzten Wirkstoffs (Z in Komponente 3) beeinflußt und bedingt - vorausgesetzt, alle drei Komponenten werden in einem stöchiometπschen Verhältnis zueinander eingesetzt, was hier natürlich grundsätzlich vorausgesetzt wird, und was auch einer der der Erfindung zugrundeliegenden Vorteile darstellt. Hierzu kann allgemein gelten, daß hinsichtlich Komponente 1 eine hohe Tumorkonzentration bzw. eine hohe Konzentration am Zielorgan oder am Zielgewebe anzustreben ist, sodaß sich die Wahl einer geeigneten Komponente 1 als bindungsspezifisches Reagenz eindeutig nach dessen Bindungsaffinitat am Zielort bzw. Zielantigen richtet.
Richtlinien für solche Anwendungen von Antikörper gebundenen Radioisotopen, Wirkstoffen oder "prodrugs" finden sich bei YUAN, F et al , Cancer Res. 5_1, 31 19
31 30, 1991 . Umfaßt wird auch die Verwendung eines "prodrugs" , das heißt einer Arzeimittel- bzw. Wirkstoff-Vorstufe, insofern, als daß ein derartiges prodrug mit einer Determinanten, beispielsweise einem Hapten, ausgestattet sein kann. Ein Beispiel für ein Konvertieren oder Aktivieren eines relativ nicht-toxischen prodrug am Zielort (beispielsweise ein Tumor) in einen cytotoxischen Wirkstoff ist die Umwandlung von Etoposidphosphat in Etoposid. Das kann dadurch erreicht werden, daß ein targeting oder pre-targeting mit den erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen mit der Maßgabe erfolgt, daß die Komponente 3 eine mit einer Determinanten Ha2 ausgestattete alkalische Phosphatase ist und die Komponenten 1 und 2 die entsprechenden beschriebenen, bzw. korrespondierenden Eigenschaften aufweisen. Das Enzym bindet über Ha2 an Y der Komponente 2 und diese wiederum über Ha-, von Komponente 1 an den Zielort, in diesem Fall ein Tumor. Nach einer geeigneten Zeitverzόgerung von annähernd 5 bis 24 Stunden, welche u.a. abhängig ist von der Tumorart und seiner Lokalisation (wie bereits oben ausführlich beschrieben), wird Etoposidphosphat in üblicher Applikationsweise (i.v., i.m., i.p., i.e. , s.c.) in einer Dosis appliziert, in der diese Substanz nicht toxisch ist. Die Toxizität von Etoposidphosphat:Etoposid beträgt ca. 1 : 100. Am Zielort wird das relativ nicht toxische Etoposidphosphat in das cytotoxische Etoposid durch die alkalische Phosphatase (Komponente 3) enzymatisch umgewandelt und entfaltet die cytotoxische Wirkung erst am Tumor. Auf diese Weise können cytotoxische Wirkstoffe in einer nicht-toxischen Vorstufe als prodrug für therapeutische Zwecke durch Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen einem Säugetier unter weitgehender Vermeidung unerwünschter Nebenwirkungen zugeführt werden. Auch in diesem Fall ist das Zweischrittverfahren für die Anwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen ein vorteilhaftes und daher bevorzugtes Verfahren.
Erfolgreiche Aktivierungen von prodrugs über herkömmlich konjugierte Antikörper werden beispielsweise beschrieben von SENTER, P. D. et al.., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 4842 - 4846, 1 988, und von SENTER, P. D. et al., Cancer Res. 49, 5789 - 5792, 1989. Wie schon eingangs beschrieben, können bispezifische Antikörper einen zielgerichteten Transport von Wirkstoffen oder Wirkmolekulen bzw. Effektorzellen vermitteln Die Verwendung der erfindungsgemaßen Kombinationspraparationen umfaßt selbstverständlich, und in analoger Weise wie für das Imaging schon ausführlich offenbart, gleichfalls das targeting derartiger Mittel. Lediglich zur Illustration dieses Sachverhalts kann beispielsweise Z gemäß Tabelle 1 ein mit Ha2 haptenisiertes CD3 sein und X ein mit Ha-, haptenisierter anti-Tumor Antikörper, wobei Y die bispezifische Eigenschaft anti-Ha -] :antι-Ha2 aufweist. Gleichermaßen kann Z in Ha2 — Z ein anderes Triggermolekül (beispielsweise CD4, CD8, CD1 5, CD1 6, CD1 9, CD25, CD28, CD30, CD32, CD58, CD59, CD64) und Kombinationen davon (beispielsweise CD3/CD30, CD3/CD 19), ein beliebiges Enzym (zum Beispiel Urokinase, tPA, alkalische Phosphatase), eine beliebige Effektorzelle (CTL, NK- Zelle), ein beliebiges Cytokin (Interleukine, Interferone), ein gegen pathogene Erreger gerichteter Antikörper (zum Beispiel anti-Nukleoprotein, anti-Hämagglutinin von Influenzaviren, anti-HIV Antigene) sein. Für X in Ha -| — X steht jedes diagnostisch und therapeutisch relevante Antigen, gleichgültig, ob es sich um ein Tumor assoziiertes Antigen (TAA) oder ein bei Mikroorganismen, Viren, Pflanzen, oder durch diese und andere biologische Systeme produzierte Antigene (z.B. bakterielle, pflanzliche, oder von Pilzen herstammende Toxiπe) oder in nicht- biologischen Systemen vorkommende Antigene handelt.
Entsprechend der vielgestaltigen und flexiblen Kombinationsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen, die eine der weiteren grundlegenden Vorteile darstellen, können beliebige Effektormoleküle oder Trigger- bzw. Aktivatormoleküle insbesondere für die Tumorimmuntherapie kombiniert und gleichzeitig, sequenziell oder konsekutiv oder, insbesondere betreffend Komponente 3, beliebig verzögert appliziert werden. Beispielsweise kann zur Behandlung von malignen Tumoren, wie zum Beispiel B-Zell Lymphomen bzw. chronisch lymphocytischen Leukämien, Melanomen, Ovaπalkarzinomen, aktivierte autologe T- Zellen zur Lyse dieser maligen entarteten Zellen veranlaßt werden.
Die Aktivierung von "ruhenden" T-Zellen kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß für X in der Komponente 1 beispielsweise ein antι-CD3 Antikörper gewählt wird, welcher mit einer geeigneten Determinante Ha-, , beispielsweise ein Hapten, zum Beispiel 2,4-Dinιtrophenyl (DNP) oder 2-Nitrophenyl (NP) ausgestattet bzw. haptenisiert wurde. Für Z kann ein anti-CD19 Antikörper gewählt werden, welcher beispielsweise haptenisiert ist mit einem Hapten Ha2- welcher verschieden ist von 61,
Ha-, , beispielsweise mit Digoxigenin (DIG) oder einem beliebigen anderen von Ha -, verschiedenen Hapten. Entsprechend dieser Konstellation ist Y ein anti-Ha-, :antι- Ha2 (antι-DNP:antι-DIG bzw. antι-NP:antι-DIG) bispezifischer Antikörper. Die Komponente 1 kann zusammen mit Komponente 2 oder auch getrennt wie bereits beschrieben, systemisch appliziert werden, wobei eine zeitlich von der Gabe von Komponenten 1 und 2 verzögerte Applikation von Komponente 3 bevorzugt wird. Gemäß BOHLEN, H. et al., Blood 82, 1 803 - 1 81 2, 1993, kann es von Vorteil sein, wenn zusätzlich zu der Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen eine Co-stimulierung der T-Zellen erfolgt, insbesondere durch eine zusätzliche, insbesondere systemische Gabe eines entsprechenden Antikörpers gegen ein Zelloberflächeπantigen, beispielsweise ein monospezifischer anti-CD28 Antikörper. Mit solch einer Maßnahme konnte beispielsweise bei chronisch lymphocytischer Leukämie (CCL) in vitro gezeigt werden, daß es zu einer Aufregulierung von T-Zell Aktivierungsmarkern (CD25, CD38) und zur Cytotoxizität gegen autologe chronisch lymphocytische Leukämiezellen und allogenen B-Zellen kommt (BOHLEN, H. et al., 1 993, loc cit.). Die Stimulierung der ruhenden T-Zellen mit einer solchen Kombination, insbesondere zusammen mit CD28 Antikörpern, führte vorzugsweise zur Proliferation von CD4+ T-Zellen, wobei die Induktion bis zum 14fachen gegenüber CD8 gesteigert war. Die für eine T-Zell Aktivierung hierzu benötigte Dosis kann zwischen 1 ng/ml und 1000 ng/ml an den entsprechenden Antikörpern (Komponenten 1 und 3 sowie dem zusätzlichen Antikörper, hier anti- CD28) liegen, insbesondere bei ca. 100 ng/ml.
Mit einer anderen erfindungsgemäßen Kombinationspraparation, der neben der vorgenannten Kombination (Ha-, — antι-CD3 und Ha2 — anti-CD19 für Ha-| — X bzw. Ha2 — ) zusätzlich eine zweite Kombination der Gestalt Ha -| — anti-CD28 für Komponente 1 (Ha-] — X) und Ha2 — anti-CD22 für Komponente 3 (Ha2 — Z) sein kann, kommt eine weitere vorteilhafte Anwendung in Betracht, wobei Y die entprechende bispezifische Spezifität aufweist (BOHLEN, H. et al., Cancer Res. 53, 4310 - 4314, 1993).
Nach eigenen Befunden muß der Kombination CD3 x CD28 oder CD3 x CD19 für X und Z in Ha-j — X bzw. Ha2 — Z, gegebenenfalls in weiterer Kombination mit CD19 bzw. CD28 eine besonders vorteilhafte Wirkung bei der Immuntherapie von Tumoren, insbesondere von B-Zell Tumoren, zugesprochen werden. Eine derart bevorzugte erfindungsgemäße Kombinationspraparation besteht beispielsweise demnach darin, daß X in Ha -] — X ein anti-CD3 Antikörper und Z in Ha2 — Z ein anti- bs
CD28 oder ein anti-CD 1 9 Antikörper ist, wobei für die Komponente 2 ein entsprechendes bispezifisches Reagenz gemäß anti-Ha -,— Y — anti-Ha2 zu wählen ist. Für Ha2 kommt sowohl ein monovalentes als auch ein bivalentes Hapten in Betracht. Bevorzugte Reagenzien für X und Y sind monoklonale Antikörper bzw. bispezifische monoklonale Antikörper mit den jeweiligen spezifischen Aktivitäten.
Die beschriebenen Verwendungen der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen sowohl in vitro als auch in vivo in der Diagnostik als auch Therapie, zur Prophylaxe, zur Prognose und zur Bestimmung von Tumoren, sind natürlich nicht nur auf die beispielhaft genannten Tumoren beschränkt, sondern umfassen alle soliden und diffusen Tumore eines Säugetiers einschließlich des Menschen. Insbesondere epitheliale Tumore des Ektoderms und Entoderms, Karzinome, me- senchymale Tumore des Mesoderms, Sarkome, embryonale Tumore aus undiffe- renziertem Gewebe wie beispielsweise Nephroblastom, Neuroblastom, Medulloblastom, Retinoblastom, embryonales Rhabdomyosarkom, Teratom, endokrin aktive Tumore (mit Bildung von menschlichen Choriongonadotropin, HCG), interkranielle, neuroepitheliale, spinale Tumore, Melanome, Gliome, Tumore des lymphatischen Systems (Lymphome), Tumore des Blutgewebes (Leukämien). Ebenso nicht beschränkt ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen auf die in der vorliegenden Beschreibung ausgewählten Beispiele und Literaturzitate, sondern umfassen selbstverständlich und ohne Ausnahme alle dem Fachmann bekannten und literaturbeschriebenen Systeme des targetings, soweit diese mit Antikörper/Antigen-Wechselwirkungen verbunden sind.
Daruberhinaus eignen sich die erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen zur Immunisierung, beispielsweise mit Tumorproteinen bzw. Tumorzellen (zum Beispiel Lymphomzellen). Für diese Zwecke kann Komponente 2 ein bispezifischer Antikörper mit anti-Ha-| :anti-Ha2 bzw. anti-Ha -| :anti:Han Spezifitäten, Komponente 1 ein mit einer Determinante Ha-] , vorzugsweise ein Hapten, ausgestatteter Idiotyp, beispielsweise Antigen-präsentierende Zellen, zum Beispiel dendritische Zellen, und Komponente 3 ein mit einer Determinanten Ha2 oder mehreren Determinanten Han, vorzugsweise Haptene, ausgestatteter Antikörper, beispielsweise ein gegen "human γ heavy chain" gerichteter Antikörper, sein. Ha-, und Ha2 können zum Beispiel DNP bzw DIG sein. Äquimolare Mengen der drei Komponenten können in vitro vermischt werden und der entstandene Komplex (X-Ha-μanti-Ha-, — Y — anti- Ha2:Ha2"Z) zur Immunisierung in einem Säugetierorganismus über die bekannten Routen, beispielsweise i.v. oder i.p., appliziert werden.
Das der Erfindung zugrundeliegende, in der vorliegenden Beschreibung detailiert und für den Fachmann in seinem ganzen Anwendungsspektrum verständlich beschriebene Prinzip der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen läßt klar erkennen, daß neben malignen Tumoren auch andere gegenüber einem gesunden Zustand von Zellen, Geweben und Organen pathologisch veränderte, auffällige und typische antigene Eigenschaften, die nach bekannten Verfahren erkannt werden können, gleichfalls mitumfaßt sind. Das betrifft insbesondere Infektionserkrankungen, die durch Viren, Bakterien, Parasiten, Mykoplasmen, Pilze verursacht werden und die weiteren in der vorliegenden Beschreibung angeführten mit pathologischen Zuständen assoziierten Antigene. Aber auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen bei Autoimmunerkrankungen und Erkrankungen des Blutgerinnungssystems sowie die Verwendung zum Zweck einer Verhinderung von Abstoßungsreaktionen und zur Verhinderung oder Auslösung einer Immunsuppression werden umfaßt. Denn die detailiert beschriebenen Verwendungen der erfindungsgemäßen
Kombinationspraparationen lassen sich auf einfache Weise auf diese Indikationsgebiete anwenden und analog übertragen.
Alle für die Ausführung der Erfindung relevanten Verfahren wie beispielsweise radioaktive Markierungen, das Haptenisieren, die Synthese von Antikörpern, Fragmenten und Derivaten davon, Assays, chemische Verknüpfungen von Liganden oder Synthesen von niedermolekularen Verbindungen sind dem Fachmann bekannt oder in der Literatur beschrieben. Dasselbe gilt für die Anwendungen selber, wobei diese mit den erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen in einfacher Weise auf die beschriebenen Methoden der konventionellen Systeme übertragen werden können.
Die erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen sind auch vorteilhafterweise zum Zwecke einer Bestimmung aller möglichen Antikörper bei bekannten Antigenen und vice versa ebenso zur Bestimmung von Antigenen bei bekannten Antikörpern, beispielsweise in Form des Neutralisations- bzw. Agglutinations-Hemmtests, geeignet. Die Anwendung des erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen beschränkt sich daher nicht nur auf das Gebiet der Diagnostik von pathologischen Zuständen im engeren Sinne, sondern umfaßt allgemein das Suchen, Erkennen und Bestimmen jedes beliebigen Antigens (Antigen-Screening und Antigen-Dtagnostik) zum Erfassen bzw. Diagnostizieren eines physiologischen Zustandes biologischer Systeme, beispielsweise eines Säugetieres bzw. Menschen (z.B Schwangerschaftsnachweis), eines nicht regelhaften Zustandes eines biologischen Systems, beispielsweise eines pathologischen körperlichen Zustandes bzw. einer Erkrankung eines Saugetieres bzw. Menschen (z.B. Tumordiagnostik, Infektionsdiagnostik) oder eines durch Einnahme von pharmakologisch wirksamen Wirkstoffen verursachten Zustandes (z.B. Medikamentenmißbrauch, Nachweis von Medikamenten- oder Drogenmetaboliten oder von Wirkstoff- oder Metabo tenakkumulationen, Halbwertszeitbestimmung von pharmakologisch wirksamen Stoffen, Bioverfügbarkeit und Clearance derselben, Medikamenten- oder Drogenabhängigkeit) in einem Säugetierorganismus bzw. in einem Menschen, soweit diese Zustände durch das Auftreten von für sie spezifischen Antigenen und/oder Antikörpern begleitet und gekennzeichnet sind. Darüber hinaus kann eine zu untersuchende Probe ein nicht-biologisches flüssiges Medium sein, soweit dieses agglutinierbare, markierbare oder detektierbare Antigene und/oder Antikörper enthält.
Aufgrund dieser Offenbarungen ergeben sich für den Fachmann demzufolge neue und vorteilhafte Verfahren zur Herstellung von für die Immuπprophylaxe, Immuntherapie und für die Immunisierung verwendbaren pharmazeutischen Zubereitungen, welche die Schritte umfassen a) Bereitstellen mindestens einer Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 , 2 und 3 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Z, Ha -, und Ha2 bzw. Han, oder b) Bereitstellen mindestens einer Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 und 2 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Ha-] und Ha2 bzw. Han, c) Identifizieren eines hinsichtlich seiner immunprophylaktischen oder immuntherapeutischen Eigenschaften oder seiner Immunisierungs- Eigenschaften biologisch, chemisch oder physikalisch wirksamen Mittels mittels der in a) und b) bereitgestellten Kombinationspraparationen über die oben offenbarten Bestimmungs- und Screening-Verfahren d) Formulierung des aus c) erhaltenen Mittels in Form einer Kombinationspraparation gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Z, Ha -, und Ha2 bzw. Han, mit den bekannten Hilfs- und Trägerstoffen, oder d) Formulierung des aus c) erhaltenen Mittels durch Verbinden mit einem monospezifischen Reagenz, i8 welches an biologische Bindungsstrukturen zu binden vermag, nach bekannten Methoden und mit den bekannten Hilfs und Tragerstoffen, oder e) Formulieren des aus c) erhaltenen Mittels für sich allein nach bekannten Methoden mit den bekannten Hilfs- und Tragerstoffen
Das monospezifische Reagenz kann vorteilhafterweise ein Protein, ein Immunglobulin bzw. ein Antikörper oder ein Derivat oder Fragment davon, ein Ligand, ein Lectin, ein Rezeptorbindungsmolekül, ein Adhasionsmolekul, ein Cytokin, ein Chemokin, ein Lymphokin sein. Die genannte biologische Bindungsstruktur ist definiert wie in der Beschreibung oder in den Patentansprüchen offenbart.
Es ist dem Fachmann somit auch klar, daß für die genannten Verfahren zur Herstellung der betreffenden pharmazeutischen Zubereitungen die Verwendung eines Mittels ganz besonders vorteilhaft ist, welches aus einer Kombinationspraparation besteht, umfassend die Komponenten 1 , 2 und 3 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Z, Ha-] und Ha2 bzw. Han, oder bestehend aus einer Kombinationspraparation umfassend die Komponenten 1 und 2 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Ha-| und Ha2 bzw. Han, oder bestehend aus Komponente 2 gemäß Tabelle 1 , mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für Z, in einem der oben angebenen Herstellungsverfahren für pharmazeutische Zubereitungen zum Zwecke der Immunprophylaxe, Immuntherapie oder von Immunisierungen.
Die aus den genannten Verfahren zur Herstellung von sowohl pharmazeutischen Zubereitungen für die Immunprophylaxe, Immuntherapie und für die Zwecke einer Immunisierung als auch von in vitro und in vivo zu verwendenden Immundiagnostika unmittelbar gewonnenen Verfahrensprodukte können nach bekannten Methoden formuliert und gegebenenfalls mit den bekannten Hilfs- und Trägerstoffen zusammen vermischt werden. Für die jeweilige Verwendungsart und für die Dosierung dieser Produkte steht dem Fachmann ein umfangreicher Stand der Technik zur Verfugung. So kann gemäß dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren ein für einen bestimmten therapeutischen oder diagnostischen Zweck vorteilhaft erkanntes Mittel, zum Beispiel ein cytotoxisches oder cytolytisches Agens (beispielsweise ein Antikörper oder ein Antikörperheterokonjugat) oder ein markiertes Antigen in PBS (Phosphat gepufferte Saline), beispielsweise in einem Konzentrationsbereich von 1 bis 1000 μg/ml, aufgenommen bzw. gelöst werden oder es kann lyophilisiert werden, wobei das Lyophilisat nach bekannten Methoden in physiologischer Kochsalzlösung, PBS oder in sterilem Wasser rekonstituiert werden kann. Im allgemeinen kann davon ausgegangen werden, daß, beispielsweise in dem Fall, daß das als vorteilhaft erkannte Mittel ein Protein (zum Beispiel ein Antikörper) ist oder als Bestandteil in diesem Mittel vorliegt, im Mengenbereich zwischen 1 und 1000 μ g verwendet wird. Die erfindungsgemäß identifizierten Mittel bzw. die über die erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren bereitgestellten Mittel können ferner über geeignete Assays hinsichtlich ihrer Wirkungen und Eigenschaften weiter charakterisiert werden, wobei jeder in vitro oder in vivo Immunoassay in Betracht kommt. Beispiele hierfür wären ein in vitro Cytotoxizitäts-Assay (beispielsweise der "51 Cr release assay"), zum Beispiel gemäß RAMMENSEE; H.-G. et al., Eur. J. Immunol. V Λ33 - 436, 1 987, oder gemäß JUNG, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:4497 - 4483, 1 986, oder ein in vivo Antitumor-Assay wie beschrieben von beispielsweise GARRIDO, M. A. et al. , Cancer Research 50:4227 - 4232, 1990.
Für die genannten Bestimmungs-, Screening- und Herstellungs-Verfahren werden erfindungsgemäß auch Kits zur Verfügung gestellt zur vorteilhaften Durchführung dieser Verfahren, wobei der Begriff "Kit" auch "kit of parts" umfaßt, und wobei diese Kits die folgenden Bestandteile enthalten können: a) die Komponenten 1 , 2 und 3 gemäß Tabelle 1 mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Z, Ha-] und Ha2 bzw. Han, oder b) die Komponenten 1 und 2 gemäß Tabelle 1 mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definitionen für X, Y, Ha-] und Ha2 bzw. Han, oder c) die Komponente 2 gemäß Tabelle 1 mit den in der vorliegenden Beschreibung angegebenen Definition für Y, oder d) Komponenten 1 , 2 und 3 oder 1 und 2 oder 2, wie oben definiert, zusammen mit mindestens einer weiteren voneinander unterschiedlichen Komponente 3, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs- und Trägerstoffen. Die im Kit d) vorgesehenen unterschiedlichen Komponenten 3 können hierbei hinsichtlich ihrer stofflichen Zusammensetzung und/oder hinsichtlich ihrer biologischen, chemischen und physikalischen Eigenschaften verschieden sein. Betreffend "inerte Partikel" sind diese insbesondere für diagnostische Zwecke (z.B Immunassays) geeignet und umfassen alle die dem Fachmann bekannten Partikel, an denen Proteine oder Proteinfragmente adsorbiert werden können Werden als Proteine beispielsweise Antikörper gewählt, können diese inerten Partikel damit derartig beladen werden, daß sie bispezifische oder multispezifische Eigenschaften annehmen und als partikulare Formen eines bispezifischen oder multispezifischen Antikörper betrachtet werden können. Die Verwendung solcher Partikel hat den Vorteil, daß aufwendige chemische oder gentechnologische Verfahren zur Konstruktion von Antikorperheteroaggregaten, chimaren Antikörpern oder "cross- κι linked" Antikörpern umgangen werden können. Derartige, mit Immunreagenzien beladene inerte Partikel bzw. an diese adsorbierte ("gecoatete") Antikörper sind dem Fachmann bekannt und im Stand der Technik beschrieben
Als "inerte Partikel" im konkreteren Sinn sind Partikel zu verstehen, an die
1 Antikörper oder Derivate oder Fragmente davon binden bzw. adsorbieren können. Zu diesem Zweck können alle dem Fachmann bekannten natürlichen, synthetischen, organischen oder anorganischen Partikel verwendet werden, an die Antikörper, Derivate und Fragmente davon adsorbiert werden können. Beispielsweise zahlen dazu Blutzellen (Erythrozyten, wie zum Beispiel Toxocell IHA 0 von Redιtest,S.A. »Barcelona, oder Mast Serodia-Anti HBs FD 41 1 von Mast Diagnostica, Hamburg, oder gemäß BIRD, T. & STEPHENSON, J.H., J. clin. Path. 26, 623 627, 1973, oder Serodia-AFP von Fujizuki Pharmaceutical Co., Ltd., Japan), Latex bzw. Polystyrol-Kugeln (beispielsweise von Tokuyama Soda Co., Ltd. , Japan, oder wie sie in der EP-A 0435851 oder von KOLBER M. A., J. 5 Immunol. 143, 1461 - 1466, 1989, beschrieben sind), Mikroorganismen (Bakterien und Pilze, beispielsweise Salmonellen, Candida albicans oder Yersinia gemäß Yersinia Agglutube der Firma Labor Diagnostika GmbH, Heiden, Deutschland, oder Serratia gemäß SAUL, F. et al. Ärztl. Lab. 23, 407 - 41 1 , 1977 (Blue-ASO-Test)), Bentonit (REISBERG, M.A. et al., J. Immunol. 105, 1 1 51 , 1970), Kohlenhydrate
30 wie z.B. Zellulose (CAMPBELL, D.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 37, 575, 1 951 ; WELIKY, N. & WEETALL, H.H., lmmunochemistry_9, 967, 1 972), Sepharose (WILCHEK, M. et al., Biochemistry 10, 2828, 1971 ), Glasperlen (WEETALL, H.H. , J. Biochem. 1 17, 257, 1970), Styrole und Derivate davon (EP-A 04661 70), Liposomen, Metalloxidpartikel, Holzkohlepartikel, Gelatine (beispielsweise Serodia™ s -HIV von Fujirebio Inc., Tokyo, Japan). ?/
Proteine, beispielsweise Antikörper oder Fragmente davon, können an dem
Fachmann bekannte inerte Partikel, beispielsweise Polvstyrolkugeln, in für den Fachmann bekannter Weise dadurch gebunden werden, daß ein dem Fachmann bekannter, geeigneter Antikörper, beispielsweise von der American Type Culture Collection . Rockville, Maryland, USA, (ATCC), von Linscott's Directory of Immunological and Biological Reagents, 40 Glen Drive, Mill Valley, California, USA, 94941 , oder aus anderen bekannten, kommerziellen Quellen öffentlich verfügbarer Antikörper (beispielsweise OKT3 [ATCC, Hybridom CRL8001 ], OKT4 [ATCC, Hybridom CRL8002] oder beschrieben in EP A 0468 637) in einer geeigneten Lösung und unter geeigneten Bedingungen, beispielsweise NaHCθ3, bei Raumtemperatur mit Polystyrolkugeln inkubiert wird, wobei anschließend mit einer physiologischen Lösung (beispielsweise Phosphat gepufferte Saline, PBS) mit einem inerten Protein (beispielsweise Rinder Serum Albumin, BSA) gewaschen wird. Die große der Polystyrolkugeln ist nicht kritisch. Ein Durchmesser dieser Polystyrolkugeln im μ-Bereich bzw. von ca. 1 μ bis 20μ kann als üblicher Näherungswert betrachtet werden. Geeignete Polystyrolkugeln sind beispielsweise erhältlich von Polysciences, Warrington, PA, USA. Ein derartig mit beispielsweise einem bispezifischen Antikörper oder Derivat oder Fragment davon "gecoateter" inerter Partikel erhält somit die Eigenschaften eines bispezifischen partikulären Antikörpers und kann gemäß der Beschreibung und der Beispiele erfindungsgemäß verwendet werden.
Demzufolge werden auch in analoger Weise hergestellte inerte Partikel als Teil von Y in der Komponente 2 der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen von der Erfindung mitumfaßt.
Hinsichtlich des der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Begriffs Immunogen bzw. Antigen werden alle diejenigen Substanzen umfaßt, die in einem Säugetierorganismus eine Immunantwort und somit eine Immunglobulin- (Antikörper- Jsynthese induzieren können. Insofern kann ein solches Antigen natürlichen Ursprungs sein, über DNA-Rekombination oder synthetisch oder semisynthetisch hergestellt worden sein oder Teile von diesen darstellen. Derartige Antigene können in biologischen Flüssigkeiten eines Säugetierorganismus einschließlich des Menschen extrazellulär, intrazellulär, transzellulär (third space) oder interstitiell vorkommen, wie beispielsweise Blut, Serum und Fraktionen davon, Exkremente (wie z.B. Urin, Faeces), Tränenflüssigkeit, Speichel, Amnionflüssigkeit, Gewebeflüssigkeit, Aszites, Samenflüssigkeit, Pleuraflüssigkeit, Cystenflüssigkeit, Cerebralflύssigkeit, Eiter, Sekrete des Magen-Darm-Trakts, Liquor, Augenkammerflüssigkeit, Ödemflüssigkeit, pathologisch auftretende Flüssigkeiten bei beispielsweise Heus oder Peritonitis, Sekrete, Zerebrospinalflüssigkeit. Plasma, Lymphe oder Flüssigkeiten, einschließlich solchen, die aus Gewebeextrakten erhalten werden und in Gewebe- und Zellkulturen vorkommen.
Es kommen insbesondere auch solche Antigene in Betracht, die assoziiert sind mit einer im Saugetierorganismus vorkommenden Zelle, einem Gewebe, einem Organ oder einem Syntheseprodukt davon oder die einem Krankheitszustand zugeordnet werden können, beispielsweise Immunoglobuline bzw. Antikörper im Sinne der oben gegebenen Definition, Proteine, Polypeptide, Oligopeptide, Hormone (z.B. Steroidhormone wie z.B. Östrogene, Gestagene, Androgene, Glukokortikoide, Mineralokortikoide, Cholecalciferole, Proteohormone, biogene Amine, Oxytozin, Vasopressin (ADH), Insulin, Glukagon, Parathormon, Kalzitonin, Erythropoetin, Prostaglandine, Gonadotropine wie z.B. luteinisierendes Hormon (LH), Choriongonadotropin (HCG bzw. ß-HCG), Follikel stimulierendes Hormon (FSH), Prolaktin und andere Plazentahormone, Serotonin, Histamin, Bradykinin, Kallikrein, gastrointestinale Hormone, Schilddrüsenhormone, Katecholamine, Azetylcholin), Enzyme, Tumormarker bzw. Tumorantigene (wie z.B. karzinoembryonales Antigen (CEA), Reπal Cell Carcinom Antigen (RAGE), Melanom Cell Antigen (MAGE), Tumorassoziiertes Antigen (TAA), alpha-1 -Fetoprotein (AFP), CA 15-3, CA 19-9, CA-50, CA-125, Postata-spezifische saure Phosphatase (PAP), neuronspezifische Enolase (NSE), Bence-Jones-Protein, alkalische Phosphatase (AP), Prostataspezifisches Antigen (PSA), Hormone endokriner Tumore, LDH, Gamma-GT, Neopterin, Ferritin.
Es kommen aber auch solche Antigene in Betracht, die von Viren, Prokaryonten und nicht zu einem Säugetier zugeordneten Eukaryonten abstammen oder Teile davon sind. Insbesondere Mikroorganismen wie Gram-negative und Gram-positive Bakterien (beispielsweise der Familien bzw. Ordnungen Enterobacteriaceae [ beispielsweise die Gattungen Escherichia, Salmonella, Shigella, Yersinia], Corynebacteriaceae, Spirochetales [beispielsweise die Gattungen Treponema, Leptospira, Borrelia], Pseudomonadaceae, Mycoplasmataceae [beispielsweise die Gattung Mycoplasma], Mikrococcaceae [beispielsweise die Gattung Staphy- lococcus], Chlamydiae, Bacillaceae [beispielsweise die Gattungen Bacillus, Clos- tridium], Lactobacillaceae [beispielsweise die Gattung Streptococcus], Neisse- riaceae [beispielsweise die Gattung Neisseria], Spirillaceae [beispielsweise die Gattung Vibrio], Brucellaceae [beispielsweise die Gattungen Hemophilus, Borde- tella, Francisellaj, Actinomycetales [beispielsweise die Gattungen Mycobacterium, Actinomyces, Nocardia, Streptomyces], Rickettsiaceae [beispielsweise die Gattung Rickettsia], Chlamydiae [beispielsweise die Gattung Chlamydiaj), Pilze und Sporen davon (beispielsweise Candida, Cryptococcus, Blastomyces, Paracoccidoides, Coccidoides, Aspergillus, Histoplasma), und die von den genannten Mikroorganismen synthetisierten Toxine bzw. Endo- und Exotoxine, ferner auf DNA- und RNA-Viren beruhenden Antigene, beispielsweise virale Capsidantigene oder Hüllproteine (zum Beispiel Hepatitis Viren und verwandte Antigene, wie zum Beispiel HBe, HBc, HBs, Pockenviren, Coxsackieviren, Echoviren, Myxoviren, Rhabdoviren, Togaviren, Reoviren, beispielsweise HIV, Tumorviren, Picornaviren, Herpesviren, Paramyxoviren, Rubellaviren, Mumpsviren, RS-Viren, Coronaviren), Endo- und Ektoparasiten, insbesondere Protozoen (wie bespielsweise Cestoden, Flagellaten, Amöben, Leishmania, Trichomonas, Trypanosoma, Sarcocystidae einschließlich Toxoplasma, Eimeriidiae, Plasmodium, Cryptosporiidae) und die davon synthetisierten Toxine und Metaboliten, Tumor-spezifische Proteine, einschließlich solcher von durch Tumorviren infizierten oder transformierten Zellen, die im entsprechenden Wirt eine Immunantwort hervorrufen. Mitumfaßt sind auch über die bekannten Methoden der DNA-Rekombination hergestellten Antigene, beispielsweise wie sie für Toxoplasma gondii in der EP-A 0431541 beschrieben sind, und über die bekannten synthetischen und semisynthetischen Verfahren herstellbaren Antigene. Aber auch Allergene sind hiervon mitumfaßt, da sie ebenso wie die beschriebenen Antigene die Antikörpersynthese in Gang setzen, insbesondere IgE, beispielsweise Milben oder Hausstaub. Ferner sind Antigene auf Basis von Drogen und Medikamenten und Metaboliten davon (beispielsweise Opiate und Opioide, Kokain, Diazepine, Barbiturate, Paracetamol, Theophylline) und von chemisch hergestellten Toxinen mitumfaßt.
Aber auch Antigene pflanzlichen Ursprungs werden per definitionem mitumfaßt, beispielsweise Pollen assoziierte Antigene oder in Pflanzensäften gelöste antigen wirkende Substanzen.
Es kommen aber auch Antigene in Betracht, die in nicht-biologischen Systemen vorkommen und untersucht werden sollen. "Nicht-biologische Systeme" bzw. Untersuchungsproben können im Sinne der vorliegenden Erfindung Abwässer,
Trinkwasser, stehende oder fließende Gewässer oder Grundwasser sein bzw. solche, die nicht an das Vorkommen in biologischen Systemen oder Organismen, wie z.B. Zellkulturen oder einem Säugetierorganismus gebunden sind und nichtlösliches, partikuläres immunologisch aktives Material im obigen Sinne enthält oder dieses in löslicher Form vorliegt und bei Bedarf im nachhinein in bekannter Weise an Partikel gebunden bzw. adsorbiert oder nach den bekannten Methoden entsprechend chemisch behandelt und entsprechend modifiziert bzw. polymerisiert werden kann.
Erfindungsgemäß umfaßt werden demzufolge auch a priori lösliche Antigene, die durch die bekannten Methoden unlöslich gemacht werden können, beispielsweise durch Polymerisation mit Ethylchlorkohlensäureester gemäß AVRAMEAS, S. & TERNYNCK, T., J. Biol. Chem. 242. 1 651 - 1 659, 1967, oder durch Verwendung von Glutaraldehyd nach AVRAMEAS, S. & TERNYNCK, T., Immunochemistry 6, 53, 1 969, oder von Ethyienmaleinsäureanhydrid nach CENTENO, E.R. & SEHON, A.H., Immunochemistry 8, 887, 1971. Demzufolge kann die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen nicht nur für a priori partikuläre Antigene oder für an inerte Partikel gebundene korpuskulare Antigene Anwendung finden, sondern auch für a priori lösliche Antigene.
Unter dem Begriff "Hapten" versteht der Fachmann niedermolekulare Verbindungen, die an sich keine Antikörperproduktion hervorrufen und im allgemeinen ein Molgewicht von unter 1000 Daiton aufweisen. Werden solche Haptene an eine immunologische Reaktion auslösende Substanz (z.B. ein Protein) gebunden, können Antikörper erhalten werden, die spezifisch gegen das betreffende Hapten oder die betreffenden Haptene gerichtet sind. Beispiele für Haptene, die erfindungsgemäß zur Hapteπisierung der betreffenden Komponenten der Kombinationspraparationen, sind 2-Nitrophenyl, Nitrophenylphosphat, Digitoxigenin, Digoxigenin, Cholinchlorid, Aminophenylphosphochloride, Glycerophosphocholin, Nitrophenylacetat, Trinitropheπyl, Trinitrophenylglycin, Dimethylsulfoxid, Guanidinhydrochlorid, 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetat, 2,4- Dinitrophenyl, Benzyl-EDTA, um nur einige zu nennen. Derartige niedermolekulare, als Haptene geeignete Verbindungen und deren Herstellung sind dem Fachmann bekannt und sind auch aligemein kommerziell erhältlich, beispielsweise bei Sigma, Deisenhofen, Deutschland. Haptenisierungen von X und Z können nach allen bekannten Methoden erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind oder aus der Literatur entnommen werden können. Eine Haptenisierung mit beispielsweise einem Nitrophenylderivat (beispielsweise p- Nitrophenylphosphat) von X und Z kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß das betreffende Mittel, beispielsweise ein Protein (zum Beispiel ein Antikörper oder ein Fragment oder ein Derivat davon) in NaHCÜ3 (beispielsweise 0, 1 M, pH 8,5) in Gegenwart von NaCI (zum Beispiel 0.1 5 M) eingebracht wird. Ein Volumen von ca. 1 ml davon wird in 10 bis 100 μl von beispielsweise p- Nitrophenylphosphatcapronsäure-o-succinimidester (in einem aprotischen Lösungsmittel, beispielsweise Dimethylformamid, beispielsweise 20mg/ml) hinzugefügt. Nach ca. 1 Stunde bei Raumtemperatur werden ca. 100 μl einer 1 M Ethanolaminlösung, pH 8,5, dazugegeben und gegen Phosphat gepufferte Saline (PBS), pH 7.3, dialysiert. Die Bindungsrate von Hapten.'Protein kann anschließend photospektrometrisch aufgrund der unterschiedlichen Adsorptionen von Hapten und Hapteπprotein bei verschiedenen Wellenlängen ermittelt werden.
Nach einer anderen Methode kann eine Haptenisierung des betreffenden zu hap- tenisierenden Proteins in dem entsprechenden aktivierten Ester, beispielsweise Nitrophenylphosphatcapronsäure-o-succinimidester, welches in einem aprotischen Lösungsmittel, beispielsweise Dimethylformamid, gelöst und in 0.1 M NaHCθ3, pH 8,5 (in Gegenwart von 0.1 5 M NaCI) suspendiert wird, erfolgen. Nach einer Reaktionszeit von ungefähr 1 Stunde bei Raumtemperatur ist die Haptenisierung abgeschlossen und das Material kann gegen PBS dialysiert werden.
Es soll an dieser Stelle betont werden, daß nicht nur die Verfahren des Haptenisierens dem Fachmann bekannt sind, sondern daß auch alle anderen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung notwendigen Verfahren und Prozesse (Markierungen, Kopplungen, Konjugationen, Synthesen und Messungen) zum Stand der Technik gehören.
Unter zellulären Adhäsionsmolekülen sind Oberflächenmoleküle von Leukocyten zu verstehen, welche das Adsorbieren oder Andocken an zellulären Strukturen (Zellen, Geweben, beispielsweise Endothelzellen) vermitteln, um dort gegen körperfremde Stoffe und Partikel (beispielsweise Bakterien, Viren, Pilze, veränderte Zellen) co- stimmulierend im Zusammenspiel mit weiteren Faktoren (beispielsweise CD8 + Lymphocyten) zu wirken, indem die betreffende Zelle lysiert wird. Derartige Oberflächenmoleküle von T-Ze ≠llen . sind bekannt. Beispielsweise das auf den meisten Lymphocyten befindliche Heterodimer "Lymphocyte Function- associated Antigen- 1 " (LFA- 1 ) oder das auf Macrophagen, Granulocyten und Lymphocyten lokalisierte Heterodimer Mac-1 . Solche Oberflächenmoleküle besitzen eine entscheidende Funktion bei der Zelladhäsion und gehören zur Familie bestimmter Glykoproteine (KEIZER, G., et al., Eur. J. Immunol. 15, 1 142 - 1 147, 1 985) mit einer -Kette und einer ß-Kette (SANCHEZ-MADRID, F. et al. , J. Exp. Med. 1 58. 1785 - 1803, 1983), letztere ist auch als CD18 bekannt. Derartige Adhäsionsmoleküle werden gemäß der Definition des oben dargestellten Schema's in Tabelle 1 von der Erfindung mitumfaßt (Komponente 1 ) - aber auch Liganden, die an LFA- 1 binden, wie beispielsweise interzelluläre Adhäsionsmoleküle ICAM-1 (CD54) oder ICAM-2, welche als Mitglieder zu der Immunoglobulin Superfamilie gerechnet werden, sowie Derivate und Fragmente davon. Es ist bekannt, daß beispielsweise ICAM- 1 auf der Oberfläche von endothelialen Zellen lokalisiert ist. Wenn beispielsweise in Komponente 1 X im oben angegebenen Schema ein gegen ein solches Adhäsionsmolekül, ein Derivat oder ein Fragment davon, gerichteter mit einem Hapten Ha-] verbundener Antikörper ist, Y ein gegen zwei Haptene bispezifisches Reagenz mit anti-Ha-| und anti-Ha2 Eigenschaften und Z ein mit einem Hapten Ha2 verbundenes Reportermolekül (beispielsweise ein Enzym, Farbstoffmolekul, Radioisotop), kann damit ein gezieltes targeting zur Lokalisierung von Infektionsorten und Entzündungsstellen erfolgen, da bekannt ist, daß solche Liganden (beispielsweise ICAM-1 ) an derartigen Orten exprimiert werden.
Es ist bekannt, daß CD28 nur von etwa der Hälfte aller CD8 + Lymphocyten exprimiert wird, demgegenüber exprimieren praktisch alle CD4 + Lymphocyten CD28 (LINDSLEY, P. S. & LEDBETTER, J. A., Annu. Rev. Immunol. H, 1 91 - 21 2, 1 993). Es konnte festgestellt werden, daß die durch bispezifische monoklonale Antikörper bedingte Cytotoxizität überwiegend durch CD8 + Lymphocyten und Effektorzellen vermittelt wird und das die Blockierung des LFA- 1 /ICAM-1 oder CD2/LFA-3 Adhäsionswegs diese Cytotoxizität herabsetzt. Daher haben Adhäsionsmoleküle eine entscheidende Funktion als Co-Stimulatoren bei durch bispezifische monoklonale Antikörper aktivierte T-Lymphozyten, wodurch eine Verstärkung der Signalübermittlung durch die CD3/TCR und CD28 Wege erfolgt. Daraus ergibt sich eine weitere therapeutische Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen, die darin besteht, daß Z in Ha-| — Z ein Adhäsionsmolekül ist, X in Ha -, — X eine T-Zell aktivierende Komponente und Y anti- Ha -| :anti-Ha2 Spezifitäten aufweist. Mit solch einem System können Krankheitszustände, die mit einer Defizienz von Adhäsionsmolekülen, beispielsweise ICAM-1 oder ICAM-2, einhergehen therapiert oder diagnostiziert werden, wobei die oben beschriebenen Applikationsweisen für diese Zwecke zu übertragen sind.
Die erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen können in flüssiger oder fester Form vorliegen und in Flaschen, Ampullen oder anderen dazu äquivalenten Behältern, vorzugsweise in solchen aus Glas oder Kunststoffen, gefüllt und verpackt werden.
Hinsichtlich des Vorliegens der Komponenten 1 , 2 und 3 der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen in flüssiger Form sind die dem Fachmann bekannten Puffer und Medien verwendbar, gegebenenfalls zusammen mit einem Stabilisierungsmittel. Entsprechend eignen sich zum Beispiel Tris-, Phosphat- (beispielsweise Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, PBS) oder Carbonat-Puffer, steriles Wasser, einfach- oder bidestilliertes Wasser oder physiologische Kochsalzlösungen. Als Stabilisierungsmittel eignen sich die bekannten und üblichen Zusätze, wie beispielsweise Albumine oder Serumalbumine (Rinderserumalbumin [ RSA], Humanserumalbumin [HSA]) oder andere inerte Proteine, aber auch Biozide. Für die Veterinär- und humanmedizinische Anwendung kommen natürlich nur die genannten und dem Fachmann bekannten toxikologisch unbedenklichen und physiologisch inerten Zusatzstoffe und Stabilisierungsmittel in Frage. Die erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen bzw. die Teile davon können aber auch in lyophilisierter Form vorliegen, wenn sie als Produkt in fester Form bestehen. In solchen Fällen können die dem Fachmann bekannten Techniken der Lyophilisation und der vor der Verwendung der entsprechenden Antikörper durchzuführenden Rekonstitution (beispielsweise mit einem der genannten Puffer und Medien) angewandt werden. Bevorzugt wird für die Komponenten 1 , 2 und 3 dann die lyophilisierte Form, wenn diese als für die Lyophilisierung zugängliche Substanzen vorliegen. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn Komponenten 1 , 2 und 3 ein Protein sind oder ein mit einem Färb- und/oder eine Effektorsubstanz (beispielsweise ein Radioisotop, ein Reportermolekül, ein Kontrastmittel) verbundenes Protein. Die Rekonstitution kann vorzugsweise mittels sterilem Wasser für Injektionszwecke oder mit PBS, beispielsweise pH 7.0 - 7.2, durchgeführt werden. Allgemein können die einzelnen Komponenten jedoch ohne Einschränkungen nach den bekannten Methoden formuliert werden, wie sie in der pharmazeutischen Chemie verwendet werden und bekannt sind. Grundsätzlich sind die einzelnen Komponenten in allen bekannten physiologisch unbedenklichen, vorzugsweise sterilen, Flüssigkeiten lösbar oder suspendierbar, soweit diese für die parenterale Applikation geeignet sind, wie beispielsweise physiologische Saline (PBS) , Wasser für Injektionszwecke.
Die für die erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen bzw. Teilen davon geeigneten Träger und ihre Formulierungen, beispielsweise human Serumalbumin (HSA) sind beschrieben, beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. (Osol, A., Ed.), 1980.
Zusätzlich können auch pharmazeutische Verfahren verwendet werden, um die Dauer der Wirkung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen zu steuern. Präparationen zur gesteuerten oder kontrollierten Freisetzung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen (kontrollierte Wirkstoff-Freigabe) können durch Verwendung von Polymeren erhalten werden, an die die erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen (zum Beispiel die entsprechenden Proteine oder Antikörper oder Teile davon) adsorbieren oder komplexieren können. Die kontrollierte Freisetzung kann dann durch die Auswahl der zur Verfügung stehenden Polymere bzw. Makromoleküle, beispielsweise Polyester, Polyvinyl, Polyaminosäuren, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Pyrrolidon,
Ethylenvinylacetat, erreicht werden. Daruberhinaus können die erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen in Partikel inkorporiert werden, wodurch ebenfalls eine kontrollierte Freisetzung bzw. Wirkstoff-Freigabe erreicht werden kann. Die betreffenden Partikel sind für diesen Zweck aus polymeren Materialien auszuwählen, beispielsweise Polyester, Hydrogele, Polyaminosäuren, Polymilchsäure. Ebenfalls möglich ist, solche Effekte durch Mikroverkapselung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen zu erreichen. In solch einem Fall bieten sich die bekannten Verfahren (zum Beispiel Koazervation) mit beispielsweise Hydroxymethylcellulose oder Mikroverkapselungen in Gelatinekapsein oder Methylmethacrylat bzw. Polymethylmethacrylat oder kolloidale Syteme, beispielsweise Liposomen, Mikrospheren (Zum Beispiel Albumin), Emulsionen. Solch Verfahren sind dem Fachmann bekannt und können aus Remington's Phramaceutical Sciences, 1980, entnommen werden. ¥9
Die gebrauchsfertigen Formulierungen finden bevorzugt dann Anwendung, wenn die erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen für in vivo Zwecke angewendet werden sollen. Für in vitro Zwecke sind natürlich gleiche oder äquivalente Formulierungen geeignet, wobei hier die physiologische Unbedenklichkeit keine derartige Bedeutung hat.
Als beispielhafte Richtlinie kann davon ausgegangen werden, daß die entsprechenden Lyophilisate der Komponenten 1 , 2 und 3 im Verhältnis 1 : 10 (ml wässπge Lösung/mg der jeweiligen Komponente) gelöst werden können. Beispielsweise kann eine gebrauchsfertige Formulierung darin bestehen, daß je 10 mg der jeweiligen Komponente 1 , 2 oder 3, bzw. äquimolare Mengen davon, vorzugsweise wenn X, Y oder Z ein Protein ist, in jeweils 1 bis 10 ml PBS, pH 7.2, gelöst werden; oder es können je 5 mg je Komponente, bzw. äquimolare Mengen davon, in 0.5 bis 5 ml sterilem Wasser für Injektionszwecke gelöst werden. Die erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen liegen entweder in gebrauchsfertiger Verdünnung oder Konzentration vor oder sie können nach Belieben weiter verdünnt oder ankonzentriert werden, wobei der Fachmann weiß, welche individuelle Konzentration oder Verdünnung er abhängig von seinem Verwendungszweck einsetzen möchte. Beispielsweise können X, Y oder Z gemäß Tabelle 1 , insbesondere wenn diese Komponenten Proteine, beispielsweise Antikörper sind, in einem Titerbereich von 1 : 1 bis 1 : 10.000, beispielsweise 1 : 10 bis 1 : 1000, insbesondere um den Bereich von 1 : 100 vorliegen. Dosierungen von 0.1 bis 200 mg, insbesondere 1 bis 50 mg kommen je nach dem Zweck der Verwendung und den dem Fachmann bekannten Anwendungsweisen in Betracht. Zur Verdünnung der Antikörperkonzentration können die oben genannten Puffer und Medien oder sterilen wässrigen Lösungen verwendet werden, beispielsweise PBS, Kochsalzlösungen oder Wasser.
Die Art und Weise der Verabreichung bzw. Anwendung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen in Form von Komponenten 1 , 2 und 3 für die in vitro oder in vivo Diagnostik und für die medizinisch/klinische Zwecke (therapeutisch oder prophylaktisch oder zum Zweck einer Immunisierung) ist zudem in der Beschreibung einschließlich dem darin zitierten Stand der Technik zur Illustration dargestellt und kann ausführlich aus der bekannten Literatur entnommen werden, sodaß die Anwendungen und Verabreichungen für die genannten Zwecke dem Fachmann ohne weiteres möglich sind. Spezielle Dosierungen und Anwendungsmodalitäten hängen von individuellen Gegebenheiten ab, wie sie in der vorliegenden Beschreibung und in der Literatur beschrieben sind und sind somit ebenfalls dem Fachmann bekannt. Insbesondere hinsichtlich der medizinisch/klinischen Anwendungen in vivo für die Diagnostik, Therapie und Immunisierung, einschließlich der Prophylaxe, kommt für die Verabreichung das gesamte dem Fachmann bekannte Spektrum ohne Einschränkungen in Betracht. Beispielsweise kann die Verabreichung der Komponenten 1 , 2 oder 3 der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen gemäß Tabelle 1 intravenös, intraarteriell, intraperitoneal, intrapleural, intrathecal, subcutan, durch Perfusion, beispielswiese über einen Katheter, oder durch Injektion, beispielsweise mittels einer Spritze, systemisch oder lokal, beispielsweise durch direkte intraläsionale Injektion oder durch Injektion in die Nähe des zu behandelnden Organs oder Gewebes, erfolgen.
Im allgemeinen wird die Applikation in Form einer sterilen wässrigen Lösung, wie oben beschrieben, durchgeführt. Für die einzelnen Komponenten 1 , 2 und 3 bzw. für X, Y und Z gemäß Tabelle 1 können Mengen im ng-, μg- oder mg-Bereich zur Anwendung kommen, je nach Art und Weise der zu therapierenden Erkrankung. Für die in vitro Anwendungen können die Dosen im ng- und μg-Bereich liegen, wohingegen für die in vivo Anwendungen Dosierungen im μg- und mg-Bereich in Betracht kommen können, abhängig von der Ansprechrate oder Wirkung, der Erkrankung und der Reaktionen der behandelten Patienten auf die Verabreichungen. Der Fachmann weiß aufgrund dieser Parameter, wann die Dosierungen zu erniedrigen sind oder wann sie erhöht werden müssen. Im allgemeinen kann in diesen Fällen für die einzelnen Komponenten von Dosierungen zwischen 0.5 bis 200 mg, insbesondere zwischen 5.0 und 100 mg ausgegangen werden. Auch die Applikationsrouten hängen ab von der Art, Lokalisation und den Grad der Erkrankung. Bei beispielsweise Lungen- und Brusttumoren oder bei leukämischen Tumoren oder Entzündungerkrankungen oder zur Verhütung von Abstoßungsreaktionen ist vorzugsweise die intravenöse, intraarterielle oder intrapleurale Gabe anzuwenden. Die intraperitoneale Verabreichung kommt vorzugsweise für Ovarialtumore oder bei Erkrankungen des Peritoneums in Betracht. Bei Tumoren und entzündlichen Erkrankungen des Gehirns kann insbesondere die intrathecale und intravenöse Applikation in Betracht kommen. Subcutane Gaben werden beispielsweise bei Hautläsionen, Morbus Hodgkin oder bei Lymphomen anzuwenden sein. Perfusionen mittels eines Katheters können vorzugsweise dann in Betracht kommen, wenn metastasierende Tumore, beispielsweise der Lunge, der Brust oder der Leber zu behandeln sind. Bei lokal bzw. isoliert zu behandelnden Erkrankungen von Gliedmaßen oder von Organen kann die isolierte Perfusion nach bekannten
Methoden erfolgversprechender sein als beispielsweise eine systemische intravenöse Applikation.
Die Komponenten 1 , 2 und 3 der erfindungsgemäßen Kombinationspräparate können als räumlich getrennte Bestandteile in Form einer Verpackungseinheit vorliegen, insbesondere als Kit oder Kit-of-parts, oder Komponenten 1 und 2 können in einer Packungseinheit zusammen von Komponente 3 räumlich getrennt vorliegen.
Legenden zu den Figuren
Fig.1 : Prinzipielle schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen . a) Herkömmliches System mit bispezifischen Reagenzien (BiAb), welche spezifisch einen Zielort (T) mit einer Bindungsstelle BS-] und ein Effektormolekül (EM) mit einer Bindungsstelle BS2 über die anti-BS-| und anti-BS2 Bindungsstellen verbindet, b) Erfindungsgemäße Kombinationspraparation, wobei in diesem Fall X beispielhaft für einen Antikörper steht. Ein monospezifischer, mit einer
Determinante Ha-] ausgestattetes Reagenz R(χ) bindet spezifisch an einen Zielort (T). Mit der Determinante Ha-| reagiert der eine anti-Ha 1 Teil des bispezifischen Reagenz (BiAb(γj), der andere anti-Ha2 Teil mit einem wirksamen oder detektierbaren Mittel, beispielsweise einem Effektormolekül EM(z), welches eine Determinante Ha2 trägt, wobei Ha-| ≠
Ha2 ist und Ha-] , Ha2, T, R(χ) BiAb(γ) und EM( ) definiert sind gemäß Ha-] , Ha2, T, X, Y und Z wie in Tabelle 1 .
Fig.2: ELISA Darstellung gemäß Beispiel 7. Die Graphik zeigt das Absorptionsspektrum bei 405 nm nach 30 minütiger Inkubation bei
Raumtemperatur.
I = Die mit lgG4 beschichtete Platte wurde wie beschrieben geblockt, mit haptenisierten Ziege anti-Human Antikörpern inkubiert und im Anschluß mit Komponente 2 (anti-DNP:anti-DIG bispezifische Antikörper) inkubiert. Im nächsten Schritt wurde haptenisiertes Enzym zugegeben und nach dem Waschen mit Substrat inkubiert. 81 ■ II = wie I, jedoch ohne anti-DNP:anti-DIG bispezifischen Antikörper.
111 = wie I, jedoch ohne Ziege anti-human Antikörper.
Fig.3: Durchflußzytometrische Analyse. Die B-Zellen wurden mit haptenisierten CD 19 Antikörpern inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zeilen mit dem anti-DNP:anti-DIG bispezifischen Antikörper inkubiert und nach zweimaligem Waschen mit haptenisierten FITC gefärbt.
A: alle Komponenten zugefügt, (anti-CD19-[Hapten], bispezifischer
Antikörper, [Hapten)-FITC]). B: kein haptenisierter CD 19 Antikörper, (bispezifischer Antikörper,
[Hapten]-FITC).
C: kein bispezifischer Antikörper, (anti-CD19-[Hapten], [Hapten]-FITC).
D: Irrelevanter Erstantikörper; (anti-CD3-[Hapten], bispezifischer
Antikörper, [Hapten]-FITC)
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher beschreiben, ohne sie einzuschränken.
Beispiel 1 Herstellung des mit 2,4-Dinitrophenol konjugierten Proteins Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH-DNP) als Komponente 1
1 .1 . Dialyse von Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH)
Ein Dialyseschlauch einer Länge von 1 5 cm, der Größe 3-20/32" und einem Durchmesser von 1 5.9 mm (Firma Faust, Köln, Deutschland) wurde für 1 5 Minuten in 1 Liter destillierten Wasser (dH2θ) (Fresenius, Deutschland) mit 2 mM EDTA (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) getaucht. Danach wurde diese Lösung abgegossen und der Dialyseschlauch für weitere 1 5 Minuten in 1 Liter dH2θ, 1 mM EDTA, langsam gerührt. Anschließend wurde der Dialyseschlauch mit dH2θ gespült und in einer wässrigen Natriumazidlösung (0.02% Natriumazid (Sigma) in dH2θ) bei 4°C gelagert. KLH wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in einem Dialysevolumen von 1 5 ml 3 mal gegen 0.1 M Natriumhydrogencarbonat, pH 8,0 (Merck, Darmstadt, Deutschland) für 1 Stunde bei Raumtemperatur für je 1 Stunde bei Raumtemperatur und danach 1 mal über Nacht bei Raumtemperatur dialysiert. 1 .2. Haptenisierung von KLH mit 2,4-Dinitrophenol (DNP)
Die Kopplung von DNP an KLH (Boehringer Mannheim, Deutschland) wurde nach bekannten Methoden durch Veresterung mit einem aktivierten Succinimidester durchgeführt. Es wurde 3-lodo-4-hydroxy-5-nitrophenyl-caprionsäure
Succinimidester (Nip-cap-OSuc, MG 420) (Cambridge Research Biochemicals, U.K.) in einer Konzentration von 1 mg/ml in N,N-Dimethylformamid (DMF) (Merck) gelöst. Das dialysierte KLH und NIP-cap-OSuc wurde in einem Konzentrationsverhältnis von 10: 1 (entsprechend einem Molekülverhältnis von 40: 1 ) zusammengegeben, wobei erreicht wird, daß jedes KLH Molekül mit mindestens einem NIP-cap-OSuc Molekül gekoppelt wird. Die Kopplungsreaktion fand innerhalb von zwei Stunden bei Raumtemperatur statt, wobei die Reaktionslösung mit einem Schüttler (DPC® Micromix 5, Gwynedd, Wales. UK) bewegt wurde. Anschließend wurde die Reaktionslösung 3 mal gegen 1 Liter Phoshat gepufferte Saline, pH 7,0 (PBS) für je 2 Stunden bei Raumtemperatur dialysiert, um Reste von DMF und ungekoppelten Nip-cap-OSuc zu entfernen. Danach wurde die Kopplung mit einem ELISA nachgewiesen. Zur weiteren Lagerung wurde das KLH-DNP Konjugat steril gefiltert (Filter: 3μ, Millipore) und kurzfristig bei 4°C, für längere Lagerungen bei -20°C aufbewahrt.
Beispiel 2 Haptenisierung des monospezifischen Antikörpers OKT3 (anti-CD3) mit 2,4-Dinitrophenol (anti-CD3 — DNP)
2.1 . Dialyse des monoklonalen, monospezifischen Antikörpers OKT3
Die Dialyse des OKT3 Antikörpers (anti CD3, ATCC CRL 8001 , Proc.Nat.Acad.Sci.,USA77:4914-4917,1980, U.S. Patent 4,361 ,549) erfolgte gemäß Beispiel 1 .1 .
2.2. Haptenisierung von OKT3 mit 2,4-Dinitrophenol (DNP)
Die Haptenisierung von OKT3 mit DNP wurde auch hier durch Veresterung mit einem aktivierten Succinimidester durchgeführt, wobei gemäß Beispiel 1 .2. vorgegangen wurde. Dazu wurde die gemäß Beispiel 2.1 . dialysierte Antikörper- Lösung (1 mg/ml) mit NIP-cap-OSuc in einem Konzentrationsverhältnis von 10: 1 8t, (entsprechend einem Molekülverhältnis von 40: 1 ) zusammengegeben und wie in
Beispiel 1 .2. beschrieben weiterverfahren.
2.3. Nachweis von OKT3(anti-CD3)-DNP monoklonalen Antikörper im ELISA
Als ungekoppelter Fangantikörper wurde ein polyklonaler Ziege anti-Mouse IgG (Southern Biotechnology Association, Ine (SBA)., Birmingham, U.S.A.), mit H- und L-Ketten, verwendet. Dieser Antikörper wurde auf einer 96 Lochplatte (Immuno Maxisorp F96, Nunc GmbH, Wiesbaden, Deutschland) durch Bindung an die Plastikoberfläche mit einer Konzentration von 5 μg Antikörper pro ml PBS (Gibco BRL, Gaithersburg, U.S.A.) und 50 μl pro Loch bei 4°C über Nacht immobilisiert. Die freien Bindungsstellen der Plastikoberfläche wurden durch 100 μl PBS mit 10% Rinder Serum Albumin (BSA, Sigma, Deisendorf, Deutschland) pro Loch bei einer Inkubationszeit von 30 Minuten und Raumtemperatur abgesättigt, um eine unspezifische Bindung weiterer Reagenzien zu verhindern. Der OKT3-DNP Antikörper wurde in den Verdünnungen 1 , 0.5, 0.2, 0.1 , 0.05 und 0.01 mg/ml in PBS/1 %BSA und den entsprechenden positiven Kontrollen (gleicher Isotyp, DNP- gekoppelt) und negativen Kontrollen (anderer Isotyp, nicht DNP gekoppelt) auf die Platte pipettiert. Das Volumen betrug 50 μl pro Loch und die Inkubationszeit 30 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wurde 3 mal mit 250 μl PBS/1 %BSA pro Loch gewaschen. Anschließend wurde der Überstand des anti-DNP Antikörpers (lgG2a/λ) in der Verdünnung 1 : 10 hinzupippetiert und für 30 Minuten inkubiert. Nach 3 maligem Waschen in PBS/1 %BSA wurde ein Peroxidase - gekoppelter Antikörper (Ziege anti-Maus Lambda (Southern Biotechnology Association, Inc. Birmingham, U.S.A.) in der Verdünnung 1 : 2500 in PBS mit 1 % BSA und 50 μl Substratpuffer (10 ml 55 mM Citronensäure, pH 4,0, 100 μl 2,2'-Azino-bis[3- Ethylbenzthiazolin]-6-sulfonsäure (ABTS) (Stocklösung: 1 5 mg/ml), 3,3 μl H2O2 (33%ig) pro Loch hinzugegeben und für mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die enzymatische Farbreaktion (ABTS) wurde im ELISA- Reader bei 405 nm (Titertek Multiscan® Plus MK II, Flow Laboratories, U.S.A.) gemessen. Die genaue Inkubationszeit des Substrates richtete sich nach der Reaktionsgeschwindigkeit und hatte einen OD-Wert von 1 .0 nicht überschritten, sodaß ein linearer Meßbereich gewährleistet war. Beispiel 3: Herstellung eines bispezifischen anti-2,4-Dinitrophenyl:anti-Digoxigenin Antikörpers als Komponente 2
3.1 . Immunisierung von Mäusen mit 2,4-Dinitrophenol (DNP) und Digoxigenin (DIG)
Zur Immunisierung von Balb/c Mäusen wurden die beiden Haptene 2,4- Dinitrophenol (DNP) und Digoxigenin (DIG) (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) mittels Glutaraldehyd (Merck, Darmstadt, Deutschland) zur Bildung von KLH- Konjugaten mit Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) (Boehringer Mannheim, Deutschland) kreuzvernetzt. Dazu wurden jeweils 1 ,0 mg DNP und 1 ,0 mg DIG mit 5,0 mg KLH in einem Mol- Verhältnis von 1 : 3 in O.1 M a2HPθ4, pH 8,3, gelöst und zusammen mit 0,05% Glutaraldehyd auf einem Schüttler (DPC® Micromix 5, Gwynedd, Wales, UK) für 30 Minuten bei 21 °C (Raumtemperatur) inkubiert. Ein Volumen von 2,0 ml dieser Lösung wurde in einen Dialyseschlauch (1 5 cm Länge, Größe 3-20/32", Durchmesser 1 5,9 mm, Firma Faust, Köln, Deutschland) gegeben und bei 4°C für 1 Stunde gegen 0,5 Liter 0, 1 M NH4CI dialysiert, wobei die Reaktion gestoppt wurde. Die entsprechenden DNP- bzw. DIG-Konjugate wurden gegen 2,0 Liter PBS bei 4°C für 3 Stunden dialysiert. Anschließend wurden jeweils 50 μg Konjugat zusammen mit komplettem Freund'schen Adjuvanz F-5881 (Sigma) in einem Gesamtvolumen von 100 μl pro Maus (Balb/c) intraperitoneal injiziert. Diese Immunisierungen wurden in wöchentlichen Intervallen insgesamt 2 mal wiederholt, wobei die letzte Immunisierung in komplettem Freund'schen Adjuvanz durchgeführt wurde.
3.2. Polyethylenglykol-Fusion und Isolierung von anti-DNP und anti-DIG Antikörper produzierende Hybridome
Drei Tage nach der letzten Immunisierung gemäß Beispiel 3.1 . wurden Myelomzeilen (Sp2/0, ATCC CRL 1 581 ) und Milzzellen der sowohl mit DNP als auch mit DIG immunisierten Mäuse in einem Verhältnis von 1 :2 durch Polyethylenglykol (PEG)-Fusion (PEG 4000, Boehringer Mannheim, Deutschland) in RPMI 1 640 Medium (Gibco BRL) nach bekannten Methoden wie folgt fusioniert: 50 x 106 Sp2/0 Myelomzeilen und 10 x 107 Milzzellen, letztere wurden vorher mechanisch homogenisiert, wurden zusammengegeben. Der Ansatz wurde dann zwei mal in RPMI 1640 Medium zur Entfernung von Proteinkomplexen gewaschen (400 x g, 5 Minuten, dann 200 x g, 5 Minuten, jeweils bei 21 °C). Auf das & erhaltene lockere Zellpellet wurde unter leichtem Schütteln 37°C warmes PEG (PEG 4000, Boehringer Mannheim, Deutschland) (1 .0 ml) zupipettiert. Der Fusionsansatz wurde dann langsam auf 50 ml mit RPMI 1 640 aufgefüllt und bei 200 x g bei Raumtemperatur für 5 Minuten abzentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde noch einmal wiederholt, bevor der Fusionsansatz in 36 ml Selektionsmedium bzw. HAT- Medium (RPMI 1640 mit Glutamax KGibco BRL), 10% fötales Kälberserum (FCS), dekomplementiert für 30 Minuten bei 56°C (Gibco BRL), 0, 1 % Ciprofloxacin (Bayer AG, Deutschland), 5x10'3 M Hypoxanthin, 2x10 5 M Aminopterin, 8x10"4 M Thymidin) aufgenommen wurde.
3.3. Selektion von Hybridomen durch HAT-Sensitivität und lodoacetamid
Die Herstellung von Defektmutanten mit HGPRT-Defekt (Hypoxanthin-Guanin- Phosphoribosyl-Transferase) der jeweiligen DNP- und DIG-Hybridome erfolgte zur Selektion der gebildeten Hybridome und zur Verhinderung des Wachsens nicht- fusionierter Parentalzellen. In Gegenwart von 8-Azaguanin können nur die HGPRT- Defektmutanten überleben.
Es wurden 2 x 108 Zellen von DNP-Hybridomen in 650ml Kulturflaschen mit HAT- Medium in Gegenwart von 8-Azaguanin (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) mit einer Endkonzentration von 1 ,32 x 104 M für 3 Tage bei 37°C kultiviert. Danach waren mehr als 99% der Zellen abgestorben. Diese 8-Azaguanin Kultivierung wurde 2 mal wiederholt. Abgestorbene Zellen wurden gegenüber den überlebenden Zellen dadurch bestimmt, daß die jeweilige homogene Zellsuspension je nach Zelldichte mit 2 bis 10 Teilen Trypanblau (0,05 mg/ml; ICN Biochemical GmbH, Meckenheim, Deutschland) verdünnt wurde. Nach 1 Minute wurden 10μl der gefärbten Zellen in eine Neubauer-Zählkammer (Faust, Köln, Deutschland) pipettiert und 16 Felder innerhalb eines Quadrates ausgezählt. Der Kammerfaktor betrug 10^ und ein Quadrat hatte ein Volumen von 0, 1 μl. Eine Kontrolle in HAT-Medium wurde durchgeführt, um 8-Azaguanin resistente Zellen durch Wachsen in diesem Medium auszuschließen.
Die Immunglobulinproduktion der nach der 8-Azaguanin Kultivierung überlebenden
Hybridome wurden im ELISA überprüft und anschließend subkloniert.
In Analogie zu den DNP-Hybridomen wurden Defektmutanten der DIG-Hybridome isoliert. Für den ELISA wurde gemäß Beispiel 2.3. vorgegangen mit dem Unterschieden, daß als Fangantikörper ein Ziege anti-Maus anti-κ und anti-λ in einer Konzentration von 5 μg/ml vorlag, daß keine Überstände des anti-DNP Antikörpers bzw. des DIG- Antikörpers hinzupippetiert und inkubiert wurden und daß das Ziege anti-Maus IgG Meerrettichperoxidase Konjugat 1 :2000 verdünnt wurde. Die anti-DNP und die anti- DIG Antikörper wurden in den selben Verdünnungen wie in Beispiel 2.3. angegeben (1 , 0.5, 0.2, 0.1 , 0.05 und 0.01 mg/ml in PBS/1 %BSA) und in gleichen Volumina (50 μl) auf die Platten pipettiert und die Farbreaktion mit ABTS analog gemessen. Die Subklonierung bzw. Isolierung erfolgte nach COLLER, H. S. & COLLER, B. S., Method in Enzymol. 1 21 :412 - 417, 1983, wonach die Hybridomzellen in Medium derart verdünnt wurden, daß gemäß einer Poisson-Verteilung in jedem Loch einer Kulturplatte statistisch 0,3 Zellen vorlagen. Gemäß der oben beschriebenen Trypanblaufärbung wurde die Zellzahl der jeweiligen Hybridome bestimmt und Verdünnungsreihen (10,3, 1 und 0,3 Zellen pro 0, 1 ml und pro Loch) in Zellkulturmedium (RPMI 1640 (GIBCO BRL), 5% fötales Käberserum (GIBCO BRL) 100 lU/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomyciπ und 0,3 mg/ml Glutamin) durchgeführt. Für jede Verdünnung wurden auf die 96 Loch Rundboden- Kulturplatten (Costar, Cambridge, USA) 100μl der Zellsuspensions-verdünnungen ausplattiert und bei 37°C, 7% CÜ2, für eine Woche kultiviert. Für die zweite Selektion wurden 5 x 107 Zellen der DIG-Hybridome ohne HGPRT Defekt (nicht HAT-sensitive Zellen) für 1 5 Minuten bei Raumtemperatur in 5 ml lodoacetamid, 1 5 μmol, (Sigma) inkubiert und 3 mal in RPMI 1640 gewaschen.
Anschließend wurden die jeweiligen DNP-und DIG-Hybridomzeilen (je 2 x 107 Zellen) gemischt, 2 mal in 50 ml RPMI 1 640 gewaschen (1400 upm bzw. 300 x g, 5 Minuten, Raumtemperatur), gemäß Beispiel 3.2. fusioniert und analog hierzu weiterbearbeitet.
3.4. Herstellung von Tetradomen über Polyethylenglycol (PEG) Fusion
Für die Fusion der beiden Hybridomzellinien aus Beispiel 3.3. (DNP- und DIG- Hybridome) wurden jeweils 2x107 Zellen in 50 ml RPMI 1 640 Medium aufgenommen und 3 mal gewaschen (400 x g, 5 Minuten, Raumtemperatur). Die Zellpellets wurden anschließend unter leichtem Schütteln in 37°C warmen PEG 4000 (1 ml) (Boehringer Mannheim, Deutschland) resuspendiert, auf 50 ml mit RPMI 1640 Medium aufgefüllt und bei 200 x g bei Raumtemperatur für 5 Minuten abzentrifugiert. Anschließend wurde der Fusionsansatz in 8,0 ml Selektionsmedium (RPMI 1 640 mit Glutamax KGibco BRL), 10% fötales Kälberserum (FCS), dekomplementiert für 30 Minuten bei 56°C (Gibco BRL), 0, 1 % Ciprofloxacin (Bayer AG, Deutschland), 5x10-3 M Hypoxanthin, 2x10-5 M Aminopterin, 8x10"4 M Thymidin, 100 IU IL-6/ml (Sigma)) aufgenommen und in 24 Lochplatten (Costar, Cambridge, USA) mit 5 x 10^ Zellen/ml und 1 ,0 ml/Loch unter sterilen Bedingungen in einem Brutschrank (Tecnomara, Heraeus, Osterode, Deutschland) in einer feuchtigkeitsgesättigten Atmosphäre mit einem CO2 Gehalt von 7% und bei konstanter Temperatur von 37°C pipettiert. Das Heranwachsen von Hybrid- Hybridomen (Tetradomen) wurde im Umkehrmikroskop überprüft und im Überstand die bispezifische Immunglobulinproduktion durch ELISA nachgewiesen. Für diesen ELISA wurde wie folgt vorgegangen: Rinderserum Albumin (BSA) wurde gemäß dem Protokoll von Beispiel 1.1 . und 1 .2 mit DNP haptenisiert. Die erhaltenen BSA-DNP Konjugate (10 μg/ml) wurden an 96 Lochplatten gebunden (PBS, 4°C, über Nacht). Nach Absättigung der Platten mit 10% fötalem Kälberserum (FCS)/PBS (100 μl pro Loch) für 30 Minuten wurde der Überstand der Tetradomkulturen (50 μl pro Loch) zugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 3 maligem Waschen mit PBS/10% FCS (200 μ I/Loch wurde DIG-konjugierte Peroxidase, welche analog zu Beispielen 1.1 . und 1 .2. hergestellt wurden, in einer Verdünnung von 1 :2000 aus einer Stammlösung (1 mg/ml) pro Loch zupipettiert (100 μl pro Loch) und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 3 maligem Waschen (PBS/10% FCS, 200 μl pro Loch) wurde gemäß Beispiel 2.3. ABTS hinzugegeben und anschließend wie in Beispiel 2.3. analysiert.
Tetradomkulturen, in welchem die gewünschten bispezifischen anti-DNP:anti-DIG Antikörper nachgewiesen werden konnten, wurden anschließend bis zu 20 mal subkloniert. Die produzierten Antikörper wurden 3 mal mit Tris-Puffer (20 mM, pH
8.0) verdünnt, steril filtriert (0.2 μm, Millipore) und über eine Q-Sepharose Fast-
Flow Säule (Pharmacia) aufgereinigt. Die Elution der Antikörper Fraktion erfolgte durch einen Schrittgradienten gegen NaCI (0.01 - 0,5 M NaCI). Diejenigen Fraktionen, in denen Antikörper nachgewiesen werden konnten, wurden im weiteren mit 2 M NH4<S0 >2 zu einer Endkonzentration von 0.85 M (NH4(Sθ >2 verdünnt. Die bispezifischen Antikörper wurden weiter aufgereinigt auf einer
Phenyl-Superose-Säule (Pharmacia) aus der sie durch einen kontinuierlichen
Gradienten von 0.85 M NH (SO4)2/0.1 M Na HPO4, pH 7.2, bis 0.001 M NH4(SO4)2/0.1 M Na2HP04, pH 7.2, eluiert wurden. Beispiel 4: Herstellung von mit Digoxigenin-konjugierter Meerettich-Peroxidase (HRP-DIG) als Komponente 3
In Analogie zu Beispielen 1 .1 . und 1 .2. wurde Meerettich-Peroxidase (Sigma) dialysiert und mit DIG haptenisiert, wobei die selben Proteinkonzentrationen, Lösungen, Reagenzien und Bedingungen verwendet wurden.
Beispiel 5.: Herstellung von cytotoxischen T Zellen (Effektorzellen)
Humane mononukleare Blutzellen (PBMC) wurden über Ficoll Dichtezentrifugation wie üblich isoliert. PBMC wurden resuspendiert in einer Konzentration von 5 x 10^ Zellen/ml in DMEM, 4.5 g Glukose/I (Gibco, Deutschland), enthaltend 5 x 10'5 mol/l 2-Mercaptoethanol (Sigma, Deutschland), 10 mmol/l Natriumpyruvat (Gibco, Deutschland), 100 U/ml Penicillin und 100 μg Streptomycin. Die Zellen wurden auf einer mit OKT3(CD3) (ATCC CRL8001 ), 10 μg/ml, vorbehandelten (precoated) Platte bei 37° C und 5% CO2 inkubiert. Nach 5 Tagen wurden die Zellen geerntet und über "magnetic activated cell sorting" (MACS, Mini-Macs, Milteny, Deutschland) positiv (CD8, Milteny) angereichert.
Beispiel 6: Cytotoxischer Assay
Gemäß dem Verfahren nach BOHLEN, H. et al., J. Immun. Math. 1 73(1 :55 - 62, 1 994, wurden über Elektroporation Europium-markierte EBV-immortalisierte B-
Zellen hergestellt. Die EBV-immortalisierten B-Zellen wurden nach dem Verfahren von STUART, A. D. et al., Oncogene H(9): 1 71 1 -1 719, 1995, gewonnen. Diese
Zellen wurden als Zielzelten in Löcher einer 96-Loch Platte mit V-Boden gegeben
(50 μl/Loch, 1 x 105 Zellen/ml). Effektorzellen (jeweils 1.0 x 105 Zellen/ml) gemäß Beispiel 5 und Antikörperlösungen (anti-DIG:anti-DNP aus Beispiel 3, anti-CD3-DNP aus Beispiel 2 und anti-CD1 9-DIG, haptenisiert in Analogie zu Beispiel 1 .1 . und 1 .2.
(anti-CD19 wurde von Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland, bezogen)) wurden danach zu einem Endvolumen von 200 μl hinzugegeben. Maximale und spontane Freisetzung wurden durch Zusatz von entweder 1 50 μl komplettes Medium oder durch Triton X-100 (0,5%) bestimmt. Die Platten wurden für 5
Minuten bei 300 x g zentrifugiert. Nach der Inkubationszeit wurde die Markerfreisetzung durch Hinzufügung von 20 μl Überstand zu 200 μl
"enhancement" Lösung (Pharmacia, Freiburg) gemessen.
Die Fluoreszenz wurde dann in einem DELFIA Fluorometer (Wallac, Turku, Finnland) evaluiert durch Verwendung eines 613 nm Filters für die Bestimmung von Europium. Hintergrundfluoreszenz wurde aus drei Extra-Löchern erhalten, welche
5000 Zielzellen in 200 μl Komplettmedium enthielten. Die Cytotoxizität wurde berechnet gemäß
{ (Probe-Zählung — Zählung spontane Freisetzung)
/Zählung maximale Freisetzung — Zählung spontane Freisetzung)} x 100 = % spezifische Lyse.
Um Artefakte zu vermeiden, welche durch zufällige Europium Kontaminationen herrühren könnten, wurden alle Reagenzien vor dem Assay daraufhin überprüft.
Beispiel 7: Verwendung der anti-DNP:anti-DIG bispezifischen Antikörper in einem Enzym-gekoppelten Immunosorbenttest (ELISA)
Das Prinzip des ELISA ist die spezifische Antigenbestimmung mit Antikörpern. In diesem Beispiel wird der Test zum Nachweis von Immunglobulin G4 (Human) verwendet. Der Aufbau dieses Testsystems beruht auf dem Sandwichprinzip. An eine Plastikoberfläche werden sogenannte Fangantikörper gekoppelt, welche den zu testenden Antikörper erkennen. Anschließend wird der zu testende Überstand zugegeben. In einem weiteren Schritt kommt ein zweiter, Hapten (DNP)- gekoppelter Antikörper hinzu, der wiederrum spezifisch an den Testantikörper bindet. Im nächsten Schritt wird der bispezifische anti-DNP:anti-DIG Antikörper zugegeben und dann gewaschen. Im weiteren wird Hapten (DIG) markiertes Enzym hinzugegeben und nach Inkubation und Waschen durch Substrat visualisiert bzw. detektiert. Die Markierung des Detektionsantikörpers mit dem Enzym kann auch vor dem ELISA durch die equimolare Mischung von Hapten-markierten Detektionsantikörper mit anti-DNP:anti-DIG bispezifischen Antikörpern sowie Hapten (DIG)-markiertem Enzym durchgeführt werden.
Für den Assay wurden folgende Materialien verwendet:
• 96 Lochplatten (Immuno Maxisorp F96, Nunc GmbH, Deutschland) • Phosphat-gepufferte Saline (PBS; Gibco BRL)
• PBS mit 1 % Rinder Serum Albumin (BSA; Sigma)
• Substratpuffer der Zusammensetzung: Sl
10 ml 55 mM Citronensäure (Merck, Darmstadt), pH 4,0 100 μl ABTS (2,2'-Azino-bis[3-Ethylbenzthiazolin]-6-sulfonsäure) (Boehringer Mannheim); Stammlösung: 1 5 mg/ml 3,3 μl H2O2 (33%ig) (Merck, Darmstadt) • ELISA-Reader: Titertek Multiscan® Plus MK II (405 nm) (Flow Laboratories)
Als Reagenzien wurden benutzt:
Reagenz Nr Reagenz konjugiert mit
1 Human lgG unkonjugiert
2 Ziege anti human total-DNP DNP und HRP* (1 :2000)* *
(Komponente 1 )
3 anti-DNP:anti-DIG - (Komponente 2) bispezifischer Antikörper
4 HRP* DIG (1 :5000) * * (Komponente 3)
* HRP = Meerrettich-Peroxidase, * * Werte in Klammern geben die eingesetzten Verdünnungen an
Der unkonjugierte Antikörper Human lgG (Reagenz 1 ) (LD Labordiagnostika, Heiden, Deutschland) wurde auf der 96 Lochplatte durch Bindung an das Plastik mit einer Konzentration von 5 μg Antikörper /ml PBS und 50 μl/Loch bei 4°C über Nacht immobilisiert. Die freien Bindungsstellen der Plastikoberfläche wurden durch 100 μl PBS mit 1 % BSA/Loch bei einer Inkubationszeit von 30 Minuten und Raumtemperatur (RT) abgesättigt, um eine unspezifische Bindung weiterer Reagenzien zu verhindern. Die zu testende Lösung (Reagenz 2) wurde in verschiedenen Verdünnungsreihen (1 , 0.5, 0.2, 0.1 , 0.05 und 0.01 mg/ml in PBS/1 %BSA) und den entsprechenden positiven und negativen Kontrollen auf die Platte pipettiert. Das Volumen betrug 50 μl/Loch und die Inkubationszeit 30 Minuten bei RT. Anschließend wurde 3 mal mit 250 μl PBS/Loch gewaschen. Danach wurde der bispezifische anti-DNP:anti-DIG Antikörper (Reagenz 3, bzw. Komponente 2) in einer Verdünnung von 0.1 μg/ml zugefügt und für eine Stunde bei RT inkubiert. Nach dreimaligen Waschen wurden 100 μl DIG-konjugierte HRP (Reagenz 4 bzw. Komponente 3) zugefügt. Substratpuffer (200 μl/Loch) wurden nach 1 Stunde Inkubation und dreimaligem Waschen zugegeben und für mindestens 5 Minuten bei RT inkubiert. Die Inkubationszeit wurde so gewählt, daß der OD-Wert von ca. 1 .0 wurde hierbei nicht überschritten wurde. Die 9* • enzymatische Farbreaktion (ABTS) wurde im ELISA-Reader bei 405 nm gemessen. Das Resultat, welches die Funktionsfähigkeit der erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen anhand dieses Beispiels demonstriert, zeigt Figur 2.
Beispiel 8: Oberflächenfärbung von PBMC mit Fluorescein-Isothiocyanat
Für diesen Versuch wurden folgende Materialien verwendet: • Antikörper oder Antikörper-Fragmente Fa(b) gegen die Oberflächenstruktur CD19 (anti-CD19) (Becton-Dickinson) mit DNP haptenisiert (als Komponente 1 )
• anti-DNP:anti-DIG bispezifischer Antikörper (als Komponente 2),
• BSA haptenisiert mit DIG und konjugiert mit Fluorescein-Isothiocyanat (als Komponente 3)
PBMC (1 x 106 pro Test) wurden nach bekannten Methoden über Fico® isoliert und mit dem DNP haptenisierten anti-CD19 Antikörper (5 μg/ml) inkubiert (15 Minuten, RT). Nach dem Waschen der Zellen (5,0 ml PBS) wurden die Zellen mit dem anti-DNP:anti-DIG bispezifischen Antikörper (1 ,0 μg/ml) bei RT für 1 5 Minuten inkubiert und im weiteren mit dem DIG-haptenisierten BSA (5,0 μg/ml), welches nach bekannten Methoden mit Fluorescein-Isothiocyanat konjugiert war, für 1 5 Minuten bei RT inkubiert. Die Fluoreszenzaktivität wurde nach Waschen mit 5,0 ml PBS im Durchflußzytometer (auf 5 x 104 Zellen) bestimmt. Die Figur 3 zeigt das erhaltene Ergebnis und sie demonstriert zugleich, daß auch für detektierbare Oberflächenmarkierungen die erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen bestens geeignet sind.
9*
Beispiel 9: Immunisierung mit Tumorproteinen durch Focussierung von Tumorantigenen an dendritische Zellen
Für diesen Versuch wurden folgende Reagenzien verwendet:
. Idiotyp (38 CB) (beschrieben in BERGMAN, Y. & HAIMOVICH J., Europ. J. Immunol. 7:413-41 7, 1977 und ESHAR, Z. et al., J. Immunol. 122:2430-2434, 1979) mit DNP haptenisiert (als Komponente 1 ), • anti-DNP:anti-DIG bispezifischer Antikörper (als Komponente 2) . anti-Klasse II Antikörper (ATCC, HB42) haptenisiert mit DIG (als Komponente 3)
Es wurden in vitro äquimolare Mengen der oben beschriebenen Komponenten 1 , 2 und 3 miteinander für 1 Stunde bei RT in PBS inkubiert, wobei die Antikörperkonzentrationen 50 μg/ml betrugen. Im Anschluß daran wurden jeweils 10 (n = 10) C3H/He Mäuse (Charles River Wiga, München, Deutschland) mit den oben beschriebenen Komponenten 1 , 2 und 3 (Test), und jeweils mit der Kontrolle 1 (Komponenten 1 plus Komponente 2) Kontrolle 2( Komponente 2 plus Komponente 3), Kontrolle 3 (nur Komponente 1 ) Kontrolle 4 (nur Komponente 2) und Kontrolle 5 (nur Komponente 3) intraperitoneal immunisiert, wobei jeweils 50 μ g pro Maus der jeweiligen Komponente (in 100 μl PBS) verwendet wurden. Im Anschluß daran wurde die Immunisierung durch Analyse des Überlebens und Tumorgröße durchgeführt. Als Ergebnis konnte festgestellt werden, daß nach Immunisierung mit den Komponenten 1 , 2 und 3 sowohl anti-idiotypische Antikörper als auch 40% langzeitüberlebende Mäuse notiert werden konnten. Die nachfolgende Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse.
Tabelle 2: Tumorimmunität bei Mäusen (N = 10), induziert durch Turmorzellen (38 CB) mit anti-Klasse II Antikörpern durch Verwendung der oben beschriebenen Kombinationspraparation
Tage nach der i.p. Injektion der jeweiligen Komponenten
10 1 5 20 25 30 35
Überlebende (n = 10)
Test 10 10 10 10 6 4
Kontrolle 1 10 10 8 2 0 0
Kontrolle 2 10 10 7 3 0 0
Kontrolle 3 10 10 8 4 0 0
Kontrolle 4 10 10 8 4 0 0
Kontrolle 5 10 10 7 2 0 0
Die erfindungsgemäßen Kombinationspraparationen eignen sich anhand dieses Beispiels hervorragend für die Immunisierung mit Tumorproteinen.
Beispiel 10: Formulierung einer Kombinationspraparation
Komponente 1 Anti-human-Cytomegalovirus Immediate Early Antigen (IEA) monoklonaler Antikörper, Maus IgG-] (IEA E13, Argene
Biosoft Perc Technologique, Delta Sud BP24, Varilhes,
Frankreich, Bestell Nummer: 1 1 -003), haptenisiert mit DNP.
1 Fläschchen mit 0,5 ml Konjugat, Konzentration 250 μg/ml in PBS pH 7,2 mit 1 % Rinder Serumalbumin (BSA), 50%
Glyzerin und 0,01 % Thimerosal. Komponente 2: Bispezifischer anti-DNP:anti-DIG Antikörper.
1 Fläschchen mit 0,5 ml des bispezifischen Antikörpers,
Konzentration 350 μg/ml in PBS, pH 7,2, mit 1 % BSA, 50%
Glyzerin und 0,01 % Thimerosal.
Komponente 2: Meerrettich-Peroxidase (HRPO), haptenisiert mit DIG.
1 Fläschchen mit 0,5 ml Konjugat, Konzentration 140 μg/ml in PBS, pH 7,2, mit 1 % BSA, 50% Glyzerin und 0,01 %
Thimerosal. 35 In diesem Fall wurde zugrundegelegt, daß 50% der Komponente 1 mit einem Molekül DNP und 50% mit zwei Molekülen DNP konjugiert sind. Komponente 2 enthält daher ca. 30% mehr Antikörper als Komponente 1 . Bei der Konzentration der Komponente 3 wurde berücksichtigt, daß 50% der Peroxidase mit einem Molekül DIG gekoppelt sind, 50% mit zwei Molekülen. Damit jede Bindungsstelle der Komponente 2 jeweils ein Molekül Peroxidase binden kann, wurde die Zahl der verfügbaren Peroxidasemoleküie der Komponente 3 um mehr als 30% erhöht im Vergleich zur Zahl der bispezifischen Antikörper (Komponente 2). Durch die Wahl der Konzentrationen kann der Anwender jede Komponente gleich verdünnen. Für immundiagnostische, insbesondere immunzytochemische, Anwendungen, werden die Antikörper 1 : 10 in PBS, pH 7,2, verdünnt. Je nach Art der Probe und des Verwendungszweckes kann eine andere Verdünnung gewählt werden.

Claims

36Patentansprüche
1 . Kombinationspraparationen bestehend aus mindestens einer mit einer definierten spezifischen, immunologisch reaktiven Determinante Ha-| ausgestatteten ersten Komponente, einer mindestens bispezifischen zweiten
Komponente mit Bindunsgspezifität für Ha-] (anti-Ha -\ ) und für mindestens eine weitere Bindungsspezifität für eine von Ha-] verschiedene definierte spezifische, immunologisch reaktive Determinante Ha2 (anti-Ha2> oder mit weiteren Bindungsspezifitaten für mehrere solcher Determinanten Han (anti- Han), welche untereinander verschieden sind und einer dritten Komponente, welche mit mindestens einer definierten spezifischen, immunologishch reaktiven Determinante Ha2 oder mit mehreren solchen Determinanten Han ausgestattet ist oder sind, wobei Ha-] , Ha2 und Han untereinander verschieden sind.
2. Kombinationspraparationen gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie zusammengesetzt sind aus
Komponente 1 : <T):X — Ha-|
Komponente 2: anti-Ha -| — Y — anti-Ha2 bzw.
anti-Ha 1 — Y — anti-Han
Komponente 3: Ha2 — bzw. Han — Z worin
X ein mit einer Determinante Ha-| ausgestattetes bzw. verbundenes
Reagenz ist, welches monospezifisch hinsichtlich seines Zielortes (T) sein kann, umfassend ein Protein, ein Immunglobulin bzw. ein Antikörper oder ein Derivat oder Fragment davon, ein Ligand, ein Lectin, ein Rezeptorbindungsmolekül, ein Adhäsionsmolekül, ein Cytokin, ein Chemokin, ein Lymphokin,
Ha -| eine definierte spezifische, immunologisch reaktive Determinante, umfassend ein Hapten, eine spezifische koppelbare antigene Struktur, ein Epitop, ein Paratop, ein Idiotop, Y ein mindestens für mindestens zwei Determinanten Ha-j und Ha2 bzw. Han bispezifisches Reagenz umfassend ein inerter Partikel, ein Protein, ein Immunoglobulin bzw. ein Antikörper, ein Diabody, mit den entsprechenden anti-Ha-] , anti-Ha2 bzw. anti-Han Spezifitäten, Ha2 eine von Ha-| verschiedene, definierte spezifische, immunologisch reaktive Determinante, umfassend ein Hapten, eine spezifische koppelbare antigene Struktur, ein Epitop, ein Paratop, ein Idiotop,
Han eine beliebige andere von Ha-| und Ha2 verschiedene definierte spezifische, immunologisch reaktive Determinante, umfassend ein Hapten, eine spezifische koppelbare antigene Struktur, ein Epitop, ein Paratop, ein Idiotop, Z ein mit mindestens einer Determinante Ha2 bzw Han ausgestattetes bzw. verbundenes biologisch, chemisch oder physikalisch wirksames oder detektierbares koppelbares Mittel, umfassend ein Effektormolekül, ein Rezeptorbindungsmolekül, ein Immunglobulin bzw. Antikörper, eine Markersubstanz, ein Enzym, eine radioaktive Substanz, eine radioaktiv markierte Substanz, ein Kontrastmittel, eine biologisch aktive Substanz, ein cytotoxisch, cytocidal, cytostatisch oder cytolytisch wirkendes Mittel oder ein beliebiges Antigen mit Effektor- Marker- oder Reporterfunktion, eine Wirkstoffvorstufe (prodrug), ein Adhäsionsmolekül, ein Cytokin, ein Lymphokin, ein Chemokin, ein Ligand, bedeuten.
3. Kombinationspraparationen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß X an eine spezifische biologische Bindungsstruktur oder Teilen davon binden kann.
4. Kombinationspraparationen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische biologische Bindungsstruktur eine Zelloberflächenstruktur, ein Antigen, ein Allergen, ein Epitop, ein Rezeptor, eine Adhäsionsmolekülbindungsstelle oder Teile davon oder ein
Zuckerrest, ein Toxin, eine Droge umfaßt.
5. Kombinationspraparationen nach Ansprüchen 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische biologische Bindungsstruktur mit einem Prokaryonten oder einem Eukaryonten assoziiert ist.
6. Kombinationspraparationen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische biologische Bindungsstruktur mit einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ eines Säugetiers assoziiert ist oder aus einer biologischen Flüssigkeit stammt.
7. Kombinationspraparationen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Zelloberflächenantigen ist.
8. Kombinationspraparationen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Zelloberflächenantigen ein Histokompatibilitätsantigen, ein
Zellrezeptorantigen, ein Lymphopcytenoberflächenantigen, ein Oberflächenantigen von Epithelzellen oder ein Zuckerrest ist.
9. Kombinationspraparationen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen oder Epitop viralen Ursprungs ist.
10. Kombinationspraparationen nach Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische biologische Bindungsstruktur oder Teile davon von Bakterien, Endo- und Ektoparasiten, Pilzen oder von einer Pflanze abstammt.
1 1 . Kombinationspraparationen nach Ansprüchen 3 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische biologische Bindungsstruktur natürlichen Ursprungs ist oder über DNA Rekombination, synthetisch oder semisynthetisch hergestellt worden ist oder aus einer nicht-biologischen
Flüssigkeit stammt
1 2. Kombinationspraparationen nach Ansprüchen 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische biologische Bindungsstruktur assoziiert ist mit einem Toxin, welches produziert wird von einem Virus, einer Zelle oder einem Organismus gemäß Ansprüchen 9 und 10.
13. Kombinationspraparationen nach Ansprüchen 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische biologische Bindungsstruktur ein mit einem pathologischen Zustand oder ein mit einem nicht-pathologischen 59 •
Zustand einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ eines Säugetierorganismus assoziiertes Antigen oder Epitop ist.
14. Kombinationspraparationen nach einem der Ansprüche 3 bis 1 3, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische biologische Bindungsstruktur in
Gewebeextrakten enthalten ist und in Gewebe- und Zellkulturen vorkommt.
15. Kombinationspraparationen nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische biologische Bindungsstruktur ein Tumorantigen ist.
16. Kombinationspraparationen nach einem der Anspruch 2 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische biologische Bindungsstruktur ein ein Allergen ist.
17. Kombinationspraparationen nach Ansprüchen 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische biologische Bindungsstruktur assoziiert ist mit einer Droge, einem Medikament oder einem Metabolit davon oder einem chemisch hergestellten Toxin.
18. Kombinationspraparationen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein a priori lösliches Antigen ist.
19. Kombinationspraparationen gemäß Ansprüchen 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente X ein monoklonaler Antikörper, ein Derivat oder ein Fragment davon ist.
20. Kombinationspraparationen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß X ein Adhäsionsmolekül ist ausgewählt ist aus der Gruppe LFA, Mac,
ICAM.
21 . Kombinationspraparationen nach Ansprüchen 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die an X und Z gebundenen Haptene univalente oder bivalente Haptene sind. l 22. Kombinationspraparationen gemäß Ansprüchen 1 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die Hapten niedermolekulare Verbindungen mit einem
Molekulargewicht von kleiner 1000 Dalton sind.
23. Kombinationspraparationen nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Haptene ausgewählt sind aus der Gruppe 2-Nitrophenyl, Nitrophenylphosphat, Digitoxigenin, Digoxigenin, Cholinchlorid, Aminophenylphosphochloride, Glycerophosphocholin, Nitrophenylacetat, Trinitrophenyl, Trinitrophenylglycin, Dimethylsulfoxid, Guanidinhydrochlorid, 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetat, 2,4-Dinitrophenyl,
Benzyl-EDTA.
24. Kombinationspraparationen gemäß Ansprüchen 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß Y ein inertes Partikel ist, welches synthetischer, organischer oder anorganischer Herkunft ist und an dem ein Antikörper, ein Derivat oder Fragmente davon gebunden sind.
25. Kombinationspraparationen nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der inerte Partikel aus Polystyrol besteht.
26. Kombinationspraparationen gemäß Ansprüchen 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß Y ein mindestens bispezifischer monoklonaler Antikörper ist, mit der Eigenschaft, mit mindestens zwei verschiedenen definierten spezifischen, immunologisch reaktiven Determinanten, welche an unterschiedliche Reagenzien, Moleküle oder Substanzen gebunden sind, spezifisch zu reagieren.
27. Kombinationspraparationen gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der mindestens bispezifische Antikörper über Fusion von Hybridomazellen, über DNA Rekombination erhalten wurde oder ein durch Verbindungsmoleküle zusammengesetztes Heterokonjugat, bestehend aus mindestens zwei distinkten Antikörpern oder Fragmenten davon, ist.
28. Kombinationspraparationen gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Heterokonjugat über -S — S- Bindungen oder über 10t homobifunktionelle oder heterobifunktionelle Verbindungsmoleküle zusammengesetzt ist.
29. Kombinationspraparationen gemäß Ansprüchen 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das radioaktive Mittel Z ein ß- oder γ-Emitter ist.
30. Kombinationspraparationen gemäß Ansprüchen 29, dadurch gekennzeichnet, daß der ß- oder γ-Emitter ausgewählt ist aus ^ 25| 123|; 131 |, 1 1 1 |n, 1 13m|n, 99mTCr 203Pb, 201-π. 198Hg, 90γ, 186Rβ r 60Cθf 67Ga, 75Sβ( 1 12mAg, 198ÄU/ 203Hg, 32P> 51 Cr, 59Fe.
31 . Kombinationspraparationen nach einem der Ansprüche 1 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß Z als Effektormolekül oder als cytotoxisch, cytocidal, cytostatisch oder cytoloytisch wirkendes Mittel, eine biologisch aktive Substanz ist ausgewählt aus der Gruppe der Hormone, Enzyme, Cytokine,
T-Zellen, NK-Zellen, Makrophagen, Adhäsionsmoleküle, Wirstoffvorstufen (prodrugs), Triggermoleküle.
32. Kombinationspraparationen nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz ein cytotoxisch, cytocidal, cytostatisch oder cytolytisch wirkendes Mittel ist und zusätzlich besteht aus einem gegen ein weiteres, unterschiedliches Lymphozytenoberflächenantigen gerichteten Antikörper.
33. Verwendung eines Kombinationspräparates nach Ansprüchen 1 bis 32 für die therapeutische und prophylaktische Behandlung, für immundiagnostische und prognostische Zwecke, zur Bestimmung eines Krankheitszustandes bei einem Säugetier in vitro und in vivo und für die Immunisierung eines Säugetiers.
34. Verwendung eines Kombinationspräparates nach Anspruch 33 für ein Imaging.
35. Verwendung eines Kombinationspräparates nach Ansprüchen 33 und 34 bei malignen Tumoren, Iπfektions- und Entzündungserkrankungen,
Autoimmunerkrankungen, zur Immunsuppression, zur Verhinderung einer ICO. ■ Abstoßungsreaktion, zur Verhinderung einer Exazerbation eines Krankheitszustandes, bei Erkrankungen des Blutgerinnungssystems oder bei Erkrankungen, die mit einer Defizienz von Ahäsionsmolekülen einhergehen.
36. Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es aus den Komponenten gemäß Ansprüchen 1 bis 32 besteht.
37. Mittel bestehend aus Komponente 2 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 32.
38. Immunolinker, bestehend aus einem mindestens bispezifischen Reagenz Y gemäß der Definition nach Ansprüchen 2, 26 bis 28 mit Bindungsspezifitaten für mindestens zwei verschiedene definierte spezifische, immunologisch reaktive Determinanten gemäß Ansprüchen 2, 21 bis 23.
39. Verwendung eines Immunolinkers gemäß Anspruch 37 in vivo und in vitro zum Verbinden von mindestens zwei mit mindestens zwei verschiedenen definierten spezifischen, immunologisch reaktiven Determinanten gemäß Ansprüchen 21 bis 23 ausgestatteten Reagenzien und biologisch, chemisch oder physikalisch wirksamen oder detektierbaren koppelbaren Mitteln.
40. Verwendung eines Immunolinkers nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß der Immunolinker ein mindestens bispezifischer
Antikörper ist.
41 . Verfahren zur Bestimmung, ob ein Mittel mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften umfassend ein Effektormolekül, ein Rezeptorbindungsmolekül, ein Immunglobulin bzw. Antikörper, eine
Markersubstanz, ein Enzym, eine radioaktive Substanz, eine radioaktiv markierte Substanz, ein Kontrastmittel, eine biologisch aktive Substanz, ein cytotoxisch, cytocidal, cytostatisch oder cytolytisch wirkendes Mittel oder ein beliebiges Antigen mit Effektor- Marker- oder Reporterfunktion, eine Wirkstoffvorstufe (prodrug), ein Adhäsionsmolekül, ein Cytokin, ein
Lymphokin, ein Chemokin, ein Ligand, eine bei der in vitro und in vivo Diagnostik, bei der Immuntherapie oder bei Immunisierungen geeignete biologische, chemische oder physikalische Wirkung in vitro oder in vivo entfaltet oder zeigt, dadurch gekennzeichnet, daß man a) eine erste Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 , 2 und 3 gemäß Ansprüchen 1 bis 32 mit einem ersten zu bestimmenden
Mittel Z mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften herstellt, b) eine mindestens zweite Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 , 2 und 3 gemäß Ansprüchen 1 bis 32 mit einem von a) unterschiedlichen zweiten zu bestimmenden Mittel Z mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften herstellt, c) die nach a) und b) bereitgestellten Kombinationspraparationen nacheinander oder gleichzeitig in einem in vitro oder in einem in vivo System, welches gleich oder verschieden sein kann, in Kontakt bringt mit einer zu untersuchenden, spezifischen biologischen Bindungsstruktur bzw. einer zu untersuchenden Probe innerhalb oder außerhalb eines tierischen oder menschlichen Körpers, d) den Schritt gemäß c) beliebig wiederholt, wobei das zu bestimmende Mittel Z an Komponente 3 bei jeder Wiederholung hinsichtlich seiner biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften verschieden ist, e) die nach Schritt c) oder d) eingetretenen biologischen, chemischen oder physikalischen Wirkungen mißt, detektiert oder aufzeichnet und f) die nach e) erhaltenen Ergebnisse einzeln oder miteinander vergleichend auswertet.
42. Verfahren zur Bestimmung, ob ein Mittel mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften umfassend ein Effektormolekül, ein Rezeptorbindungsmolekül, ein Immunglobulin bzw. Antikörper, eine Markersubstanz, ein Enzym, eine radioaktive Substanz, eine radioaktiv markierte Substanz, ein Kontrastmittel, eine biologisch aktive Substanz, ein cytotoxisch, cytocidal, cytostatisch oder cytolytisch wirkendes Mittel oder ein beliebiges Antigen mit Effektor- Marker- oder Reporterfunktion, eine Wirkstoffvorstufβ (prodrug), ein Adhäsionsmolekül, ein Cytokin, ein Lymphokin, ein Chemokin, ein Ligand, eine bei der in vitro und in vivo
Diagnostik, bei der Immuntherapie oder bei Immunisierungen geeignete biologische, chemische oder physikalische Wirkung in vitro oder in vivo entfaltet oder zeigt, dadurch gekennzeichnet, daß man a) eine Kombinationspraparation gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28 bestehend aus Komponente 1 und Komponente 2 herstellt, b) die nach a) bereitgestellte Kombinationspraparation in einem in vitro oder in einem in vivo System in Kontakt bringt mit einer zu untersuchenden, spezifischen biologischen Bindungsstruktur bzw. einer zu untersuchenden Probe innerhalb oder außerhalb eines tierischen oder menschlichen Körpers, c) eine erste Komponente 3 gemäß einem der Ansprüche 1 , 2, 29 bis 32 mit einem ersten zu bestimmenden Mittel Z mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften herstellt, d) die nach c) bereitgestellte Komponente 3 dem System nach b) hinzufügt, e) daran anschließend eine zweite oder weitere Komponente 3 gemäß einem der Ansprüche 1 , 2 29 bis 32 mit einem zu bestimmenden Mittel Z mit von c) und untereinander unterschiedlichen biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften dem System gemäß b) gleichzeitig oder nacheinander hinzugibt, f) gegebenenfalls die Schritte a) bis e) beliebig wiederholt, wobei das zu bestimmende Mittel Z an Komponente 3 bei jeder Wiederholung hinsichtlich seiner biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften verschieden ist, g) die nach Schritt e) oder f) eingetretenen biologischen, chemischen oder physikalischen Wirkungen mißt, detektiert oder aufzeichnet und h) die nach g) erhaltenen Ergebnisse einzeln oder miteinander vergleichend auswertet.
43. Verfahren zum Screenen einer Pluralität von Mitteln mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften ausgewählt aus
Effektormolekülen, ein Rezeptorbindungsmoleküien, immunglobulinen bzw. Antikörpern, Markersubstanzen, Enzymen, radioaktiven Substanzen, radioaktiv markierten Substanzen, Kontrastmitteln, biologisch aktiven Substanzen, cytotoxisch, cytocidal, cytostatisch oder cytolytisch wirkenden Mitteln oder beliebige Antigenen mit Effektor- Marker- oder
Reporterfunktion, Wirkstoffvorstufen (prodrugs), Adhäsionsmolekülen, Cytokinen, Lymphokinen, Chemokinen, Liganden, die eine bei der in vitro und in vivo Diagnostik, bei der Immuntherapie oder bei Immunisierungen geeignete biologische, chemische oder physikalische Wirkungen in vitro oder in vivo entfalten oder zeigen sollen, dadurch gekennzeichnet, daß man a) eine erste Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 , 2 und 3 gemäß Ansprüchen 1 bis 32 mit einem ersten zu bestimmenden
Mittel Z mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften herstellt, b) eine mindestens zweite Kombinationspraparation bestehend aus
Komponente 1 , 2 und 3 gemäß Ansprüchen 1 bis 32 mit einem von a) unterschiedlichen zweiten zu bestimmenden Mittel Z mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften herstellt, c) die nach a) und b) bereitgestellten Kombinationspraparationen nacheinander oder gleichzeitig in einem in vitro oder in einem in vivo
System, welches gleich oder verschieden sein kann, in Kontakt bringt mit einer zu untersuchenden, spezifischen biologischen Bindungsstruktur bzw. einer zu untersuchenden Probe innerhalb oder außerhalb eines tierischen oder menschlichen Körpers, d) den Schritt gemäß c) beliebig wiederholt, wobei das zu bestimmende
Mittel Z an Komponente 3 bei jeder Wiederholung hinsichtlich seiner biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften verschieden ist, e) die nach Schritt c) oder d) eingetretenen biologischen, chemischen oder physikalischen Wirkungen mißt, detektiert oder aufzeichnet und f) die nach e) erhaltenen Ergebnisse einzeln oder miteinander vergleichend auswertet.
44. Verfahren zum Screenen einer Pluralität von Mitteln mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften ausgewählt aus
Effektormolekülen, ein Rezeptorbindungsmolekülen, Immunglobulinen bzw. Antikörpern, Markersubstanzen, Enzymen, radioaktiven Substanzen, radioaktiv markierten Substanzen, Kontrastmitteln, biologisch aktiven Substanzen, cytotoxisch, cytocidal, cytostatisch oder cytolytisch wirkenden Mitteln oder beliebige Antigenen mit Effektor- Marker- oder
Reporterfunktion, Wirkstoff vor stufen (prodrugs), Adhäsionsmolekülen, lob Cytokinen, Lymphokinen, Chemokinen, Liganden, die eine bei der in vitro und in vivo Diagnostik, bei der immuntherapie oder bei Immunisierungen geeignete biologische, chemische oder physikalische Wirkungen in vitro oder in vivo entfalten oder zeigen sollen, dadurch gekennzeichnet, daß man a) eine Kombinationspraparation gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28 bestehend aus Komponente 1 und Komponente 2 herstellt, b) die nach a) bereitgestellte Kombinationspraparation in einem in vitro oder in einem in vivo System in Kontakt bringt mit einer zu untersuchenden, spezifischen biologischen Bindungsstruktur bzw. einer zu untersuchenden Probe innerhalb oder außerhalb eines tierischen oder menschlichen Körpers, c) eine erste Komponente 3 gemäß einem der Ansprüchel , 2, 29 bis 32 mit einem ersten zu bestimmenden Mittel Z mit biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften herstellt, d) die nach c) bereitgestellte Komponente 3 dem System nach b) hinzufügt, e) daran anschließend eine zweite oder weitere Komponente 3 gemäß einem der Ansprüche 1 , 2 29 bis 32 mit einem zu bestimmenden Mittel Z mit von c) und untereinander unterschiedlichen biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften dem System gemäß b) gleichzeitig oder nacheinander hinzugibt, f) gegebenenfalls die Schritte a) bis e) beliebig wiederholt, wobei das zu bestimmende Mittel Z an Komponente 3 bei jeder Wiederholung hinsichtlich seiner biologischen, chemischen oder physikalischen
Eigenschaften verschieden ist, g) die nach Schritt e) oder f) eingetretenen biologischen, chemischen oder physikalischen Wirkungen mißt, detektiert oder aufzeichnet und h) die nach g) erhaltenen Ergebnisse einzeln oder miteinander vergleichend auswertet.
45. Verfahren zur Herstellung eines in der in vitro und in vivo
Immundiagnostik verwendbaren Mittels, gekennzeichnet durch die Schritte a) Bereitstellen mindestens einer Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 , 2 und 3 nach einem der Ansprüche 1 bis 32, oder lό) b) Bereitstellen mindestens einer Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 und 2 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28, c) Identifizieren eines hinsichtlich seiner immundiagnostischen Eigenschaft biologisch, chemisch oder physikalisch wirksamen Mittels mittels der in a) und b) bereitgestellten Kombinationspraparationen über die Verfahren gemäß Ansprüchen 41 bis 44, d) Formulierung des aus c) erhaltenen Mittels in Form einer Kombinationspraparation gemäß einem der Ansprüche 1 bis 32 mit den bekannten Hilfs- und Trägerstoffen, oder d) Formulierung des aus c) erhaltenen Mittels durch Verbinden mit einem monospezifische Ragenz, welches an biologische Bindungsstrukturen zu binden vermag, nach bekannten Methoden und mit den bekannten Hilfsund Trägerstoffen, oder e) Formulieren des aus c) erhaltenen Mittels für sich allein nach bekannten Methoden mit den bekannten Hilfs- und Trägerstoffen.
46. Verwendung eines Mittels bestehend aus einer Kombinationspraparation umfassend die Komponenten 1 , 2 und 3 gemäß einer der Ansprüche 1 bis 32 oder bestehend aus einer Kombinationspraparation umfassend die Komponenten 1 und 2 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28 oder bestehend aus Komponente 2 gemäß einem der Ansprüche 1 , 2, 26 bis 28 und 38 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 41 bis 45.
47. Verfahren zur Herstellung einer für die Immunprophylaxe, Immuntherapie und für die Immunisierung verwendbaren pharmazeutischen Zubereitung, gekennzeichnet durch die Schritte a) Bereitstellen mindestens einer Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 , 2 und 3 nach einem der Ansprüche 1 bis 32, oder b) Bereitstellen mindestens einer Kombinationspraparation bestehend aus Komponente 1 und 2 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28, c) identifizieren eines hinsichtlich seiner immunprophylaktischen oder immuntherapeutischen Eigenschaften oder seiner Immunisierungs- Eigenschaften biologisch, chemisch oder physikalisch wirksamen Mittels mittels der in a) und b) bereitgestellten Kombinationspraparationen über die Verfahren gemäß Ansprüchen 41 bis 44, d) Formulierung des aus c) erhaltenen Mittels in Form einer Kombinationspraparation gemäß einem der Ansprüche 1 bis 32 mit den bekannten Hilfs- und Trägerstoffen, oder d) Formulierung des aus c) erhaltenen Mittels durch Verbinden mit einem monospezifische Reagenz, welches an biologische Bindungsstrukturen zu binden vermag, nach bekannten Methoden, gegebenenfalls mit den bekannten Hilfs- und Trägerstoffen, oder e) Formulieren des aus c) erhaltenen Mittels für sich allein nach bekannten Methoden, gegebenenfalls mit den bekannten Hilfs- und Trägerstoffen.
48. Verfahren nach Ansprüchen 46 und 47, dadurch gekennzeichnet, daß das monospezifische Reagenz ein Protein, ein Immunglobulin bzw. ein Antikörper oder ein Derivat oder Fragment davon, ein Ligand, ein Lectin, ein Rezeptorbindungsmolekül, ein Adhäsionsmolekül, ein Cytokin, ein Chemokin, ein Lymphokin, ist und daß die biologische Bindungsstruktur definiert ist gemäß Ansprüchen 4 bis 18
49. Verwendung eines Mittels bestehend aus einer Kombinationspraparation umfassend die Komponenten 1 , 2 und 3 gemäß einer der Ansprüche 1 bis 32 oder bestehend aus einer Kombinationspraparation umfassend die
Komponenten 1 und 2 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28 oder bestehend aus Komponente 2 gemäß einem der Ansprüche 1 , 2, 26 bis 28 und 38 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 47 und 48.
50. Kit zur Durchführung der Verfahren nach einem der Ansprüche 41 bis 48 enthaltend a) die Komponenten 1 , 2 und 3 gemäß Ansprüchen 1 bis 32 oder b) die Komponenten 1 und 2 gemäß Ansprüchen 1 bis 28 oder c) die Komponente 2 gemäß Ansprüchen 1 , 26 bis 28, 38 oder d) Komponenten 1 , 2 und 3 oder 1 und 2 oder 2 zusammen mit mindestens einer weiteren voneinander unterschiedlichen Komponente 3, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs- und Trägerstoffen.
PCT/EP1997/004493 1996-08-28 1997-08-18 Kombinationspräparationen und ihre verwendung in der immundiagnostik und immuntherapie Ceased WO1998008875A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU41193/97A AU4119397A (en) 1996-08-28 1997-08-18 Novel combination preparations and their use in immunodiagnosis and immunotherapy

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19634730.0 1996-08-28
DE19634730A DE19634730A1 (de) 1996-08-28 1996-08-28 Neue Kombinationspräparationen und ihre Verwendung in der Immundiagnostik und Immuntherapie
DE19703699.6 1997-02-03
DE1997103699 DE19703699A1 (de) 1997-02-03 1997-02-03 Neue Kombinationspräparationen und ihre Verwendung in der Immundiagnostik und Immuntherapie

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1998008875A1 true WO1998008875A1 (de) 1998-03-05

Family

ID=26028819

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1997/004493 Ceased WO1998008875A1 (de) 1996-08-28 1997-08-18 Kombinationspräparationen und ihre verwendung in der immundiagnostik und immuntherapie

Country Status (2)

Country Link
AU (1) AU4119397A (de)
WO (1) WO1998008875A1 (de)

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999066951A3 (en) * 1998-06-22 2000-06-15 Immunomedics Inc Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
WO2001032207A1 (en) * 1998-10-30 2001-05-10 United States Army Medical Research And Materiel Command Methods for conferring active/passive immunotherapy
US7138103B2 (en) 1998-06-22 2006-11-21 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US7387772B1 (en) 1999-06-22 2008-06-17 Immunimedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-CSAP monoclonal antibodies
US7405320B2 (en) 1998-06-22 2008-07-29 Immunomedics, Inc. Therapeutic and diagnostic conjugates for use with multispecific antibodies
US7429381B2 (en) 1998-06-22 2008-09-30 Immunomedics, Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
WO2010052014A1 (en) * 2008-11-07 2010-05-14 Micromet Ag Treatment of acute lymphoblastic leukemia
WO2010052013A1 (en) * 2008-11-07 2010-05-14 Micromet Ag Treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia
US7833528B2 (en) 1998-06-22 2010-11-16 Immunomedics, Inc. Use of multispecific, non-covalent complexes for targeted delivery of therapeutics
WO2011003557A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 F. Hoffmann-La Roche Ag A complex of bi-specific antibody and digoxigenin conjugated to a therapeutic or diagnostic agent
DE102013105144A1 (de) * 2013-05-17 2014-11-20 Arno Thaller Pharmazeutisches Kombinationspräparat mit einem anti-idiotypischen Antikörperfragment

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0217577A2 (de) * 1985-09-12 1987-04-08 Hybritech Incorporated Antikörperkomplexe von haptenmodifizierten diagnostischen oder therapeutischen Mitteln
WO1992020746A1 (en) * 1991-05-14 1992-11-26 Hybritech, Incorporated Polymeric compositions having bound antibodies
WO1994015642A1 (en) * 1993-01-08 1994-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Methods of delivering agents to target cells
WO1995008577A1 (en) * 1993-09-22 1995-03-30 Medical Research Council Retargeting antibodies
JPH0829419A (ja) * 1994-07-12 1996-02-02 Aisin Seiki Co Ltd 抗原性物質の検出方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0217577A2 (de) * 1985-09-12 1987-04-08 Hybritech Incorporated Antikörperkomplexe von haptenmodifizierten diagnostischen oder therapeutischen Mitteln
WO1992020746A1 (en) * 1991-05-14 1992-11-26 Hybritech, Incorporated Polymeric compositions having bound antibodies
WO1994015642A1 (en) * 1993-01-08 1994-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Methods of delivering agents to target cells
WO1995008577A1 (en) * 1993-09-22 1995-03-30 Medical Research Council Retargeting antibodies
JPH0829419A (ja) * 1994-07-12 1996-02-02 Aisin Seiki Co Ltd 抗原性物質の検出方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOHLEN, H. ET AL: "CD3XAnti-hapten bispecific antibodies and diabodies: a new universal tool for T-cell retargetting", EXPERIMENTAL HEMATOLOGY, vol. 23, no. 8, 1995, pages 776, XP002047464 *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 124, no. 19, 1996, Columbus, Ohio, US; abstract no. 258508, SATOSHI F. ET AL: "Bispecific antibody for antigen determination" page 1047; column 2; XP002047466 *
PAULUS H.: "Preparation and biomedical application of bispecific antibodies", BEHRING INSTITUTE MITTEILUNGEN, vol. 78, 1985, pages 118 - 132, XP002028195 *

Cited By (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7833528B2 (en) 1998-06-22 2010-11-16 Immunomedics, Inc. Use of multispecific, non-covalent complexes for targeted delivery of therapeutics
US7641891B2 (en) 1998-06-22 2010-01-05 Immunomedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-CSAp monoclonal antibodies
US7138103B2 (en) 1998-06-22 2006-11-21 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US7914787B2 (en) 1998-06-22 2011-03-29 Immunomedics, Inc. Production and use of novel peptide-based agents with bispecific antibodies
US7405320B2 (en) 1998-06-22 2008-07-29 Immunomedics, Inc. Therapeutic and diagnostic conjugates for use with multispecific antibodies
US7414121B2 (en) 1998-06-22 2008-08-19 Immunomedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-CSAp monoclonal antibodies
US7429381B2 (en) 1998-06-22 2008-09-30 Immunomedics, Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
US7553953B2 (en) 1998-06-22 2009-06-30 Immunomedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-CSAp monoclonal antibodies
US7560110B2 (en) 1998-06-22 2009-07-14 Immunomedics, Inc. Production and use of novel peptide-based agents with bispecific antibodies
US8158573B2 (en) 1998-06-22 2012-04-17 Immunomedics, Inc. Therapeutic and diagnostic conjugates for use with multispecific antibodies
US7666415B2 (en) 1998-06-22 2010-02-23 Immunomedics, Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
US7943343B2 (en) 1998-06-22 2011-05-17 Immunomedics, Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
WO1999066951A3 (en) * 1998-06-22 2000-06-15 Immunomedics Inc Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US7820164B2 (en) 1998-06-22 2010-10-26 Immunomedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-CSAP monoclonal antibodies
WO2001032207A1 (en) * 1998-10-30 2001-05-10 United States Army Medical Research And Materiel Command Methods for conferring active/passive immunotherapy
US7387772B1 (en) 1999-06-22 2008-06-17 Immunimedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-CSAP monoclonal antibodies
WO2010052013A1 (en) * 2008-11-07 2010-05-14 Micromet Ag Treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia
WO2010052014A1 (en) * 2008-11-07 2010-05-14 Micromet Ag Treatment of acute lymphoblastic leukemia
US11597766B2 (en) 2008-11-07 2023-03-07 Amgen Research (Munich) Gmbh Treatment of acute lymphoblastic leukemia
CN102209729A (zh) * 2008-11-07 2011-10-05 米克罗麦特股份公司 小儿急性淋巴细胞白血病的治疗方法
WO2011003780A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Bi-specific digoxigenin binding antibodies
CN102470171A (zh) * 2009-07-06 2012-05-23 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 双特异性抗体和与治疗或诊断剂缀合的地高辛配基的复合物
CN102481367A (zh) * 2009-07-06 2012-05-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 结合地高辛配基的双特异性抗体
JP2012532174A (ja) * 2009-07-06 2012-12-13 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 二重特異性ジゴキシゲニン結合抗体
US8907069B2 (en) 2009-07-06 2014-12-09 Hoffmann-La Roche Inc. Complex of bi-specific antibody and digoxigenin conjugated to a therapeutic or diagnostic agent
EP2823821A1 (de) * 2009-07-06 2015-01-14 F. Hoffmann-La Roche AG Spezifisch an Digoxigenin bindender Antikörper
CN102481367B (zh) * 2009-07-06 2015-04-29 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 结合地高辛配基的双特异性抗体
US9050375B2 (en) 2009-07-06 2015-06-09 Hoffmann-La Roche, Inc. Bi-specific digoxigenin binding antibodies
US9574016B2 (en) 2009-07-06 2017-02-21 Hoffmann-La Roche Inc. Complex of bi-specific antibody and digoxigenin conjugated to a therapeutic or diagnostic agent
WO2011003557A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 F. Hoffmann-La Roche Ag A complex of bi-specific antibody and digoxigenin conjugated to a therapeutic or diagnostic agent
DE102013105144A1 (de) * 2013-05-17 2014-11-20 Arno Thaller Pharmazeutisches Kombinationspräparat mit einem anti-idiotypischen Antikörperfragment

Also Published As

Publication number Publication date
AU4119397A (en) 1998-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69032484T4 (de) Zusammensetzungen und deren verwendung zur förderung der immunopotentiation
DE69333182T2 (de) Therapeutische konjugate von toxinen und medikamenten
DE69430450T2 (de) Zell- und serum- proteinanker und konjugate
EP0404097B1 (de) Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente Rezeptoren, ihre Herstellung und Verwendung
DE3853740T2 (de) Bifunktionelle Antikörperkonstruktionen und Verfahren zur selektiven Tötung von Zellbeständen.
DE69636015T2 (de) Bispezifische antikörper in denen die bindungsfähigkeit durch eine mittels licht spaltbare gruppe reversibel inhibiert wird
DE69519929T2 (de) Verfahren und zusammensetzungen für die spezifische koagulation von tumorgefässen
DE69233011T2 (de) Rekombinante antikörper zur humanen therapie
DE69130561T2 (de) Hybride Reagenzien mit der Fähigkeit, Moleküle selektiv in Zellen freizusetzen
DE68906728T2 (de) Polyspezifische anti-leukocytenkonjugat zum aufspueren und behandeln infektioeser und entzuendlicher laesionen.
DE69028684T2 (de) Gegen die beta-kette des leukozyten-adhäsions-rezeptors gerichtete monoklonale antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE69431797T2 (de) Verfahren und Stoffe zur Modulation der immunsuppressiven Aktivität und Toxitätvon monoklonalen Antikörpern
DE69128791T2 (de) Modifizierte antikörper mit kontrollierter clearance-zeit
DE69031410T2 (de) Monoklonale Antikörper gegen den humanen alpha/beta-T-Zellenrezeptor, ihre Herstellung und Verwendung
DE3883803T2 (de) Monoklonale Antikörper gegen melanoma-assoziierte Antigene, Hybridzellinien, die diese Antikörper produzieren, und ihre Verwendung.
DE69033631T2 (de) Therapeutische verwendungen der hypervariablen region des monoklonalen antikörpers m195 und konstrukte davon
JPS60502104A (ja) α―インターフェロンに対する抗体と複合されたα―インターフェロン治療製剤
DE4228389C2 (de) Gewinnung und Kultivierung transformierter Zellen
WO1998008875A1 (de) Kombinationspräparationen und ihre verwendung in der immundiagnostik und immuntherapie
EP3615073A1 (de) Biologische bindemoleküle
DE69020182T2 (de) Vernetzte Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung.
JPH01501201A (ja) 抗体
DE3687014T2 (de) Zum erkennen von tumoren faehige klonierte t-zelle und ein t-zellen-antigenrezeptor.
DE3875306T2 (de) Immunosuppression bei der auf immunotoxin basierten behandlung von menschen.
Goldstein Monoclonal antibody specificity: Orthoclone OKT3 T-cell blocker

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU BR BY CA CN CZ HU IL JP KR MX NO NZ PL RU SI SK UA US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 98511237

Format of ref document f/p: F

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

122 Ep: pct application non-entry in european phase