DE69405093T2

DE69405093T2 - Siliergut-mikrobielles mattesystem und methode

Info

Publication number: DE69405093T2
Application number: DE69405093T
Authority: DE
Inventors: Judith Bender; Peter Phillips
Original assignee: Microbial & Aquatic Treatment
Current assignee: Microbial & Aquatic Treatment
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1994-03-30
Publication date: 1998-03-12
Anticipated expiration: 2014-03-31
Also published as: CA2159484A1; ATE157068T1; ES2110235T3; DE69405093D1; AU675537B2; AU6699094A; DK0691938T3; NZ265764A; EP0691938B1; WO1994022773A1; EP0691938A1; US5522985A; EP0691938A4

Description

Die Erfindung betrifft allgemein abbauende bakterielle Systeme und insbesondere ein heilendes bakterielles System in einer gebildeten Matte, die siliertes Material enthält.

HINTERGRUND

Natürlich auftretende mikrobiologische Matten, aufgebaut aus Schichten von Cyanobakterien und Bakterien, entwickelten sich in Urzeiten und besetzten die meisten unwirtlichen Gegenden auf der Erde.
In jüngerer Zeit Wurden, stimuliert durch siliertes geschnittenes Gras, gemischte mikrobielle Matten als alternatives Fischfutter entwickelt. Solche Matten haben sich als Wirksam erwiesen, um Schwermetalle aus verunreinigtem Wasser zu binden, und reduzieren verschiedene Metalbide in die elementare Form. Die ersten Matten wurden durch einfaches Aufbringen von siliertem Gras auf Laborböden und Impfen mit Oscillatoria oder Anabaena gezüchtet. Alle anderen Mikroben konnten aus dem Wasser und dem Boden eindringen und tätig werden. Es wurde nichts unternommen, um die mikrobielle Besiedelung zu stoppen oder um bestimmte Typen von Mikroben festzulegen, die die Matte besiedeln sollten.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft eine hergestellte gemischte mikrobielle Matte für spezifische biologisch abbauende Anwendungen, wie Öl- oder Erdölabbau oder den Abbau von anderen toxischen Stoffen. Solche hergestellten Matten haben nicht nur die Fähigkeit von Umweltschäden heilender Wirkung, sondern haben eine hohe Toleranz gegenüber toxischen Stoffen und bleiben über längere Zeiträume aktiv. Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, dab eine hergestellte mikrobielle Matte, die mit chemotropischen Bakterien geimpft wurde, die Fähigkeit hat, zahlreiche organische Verbindungen, wie Erdöl, im Stoffwechsel zu verarbeiten. Es wurde gefunden, daß das am besten zum Abbau von organischen Verbindungen geeignete Bakterium Chromatium war und es war insbesondere wirksam, wenn eine Nahrungsquelle in der hergestellten Matte erhältlich war, die Chromatium lebensfähig hält. Wenn die Matte silierte Pflanzen mit gärungserregenden Bakterien und mit stickstoffbindenden Bakterien enthält, Wurde der Abbau von organischen Verbindungen durch das Chromatium über ausgedehnte Zeitperioden und mit erhöhten Abbauraten aufrecht erhalten. Die Matte wird hergestellt durch Impfen von siliertem geschnittenem Gras mit Cyanobakterien und einem chemotropischen Bakterium. Die Matte kann sich während einer Zeit von mehreren Tagen entwickeln. Die sich bildende Matte hat die Fähigkeit, zahlreiche organische Verbindungen, wie z.B. zahlreiche Erdölverbindungen, mikrobiell zu anorganischen Verbindungen abzubauen. Das fermentative Bakterium in den silierten Pflanzen in Verbindung mit Cyanobakterien liefert dem chemotropischen Bakterium seinen Kohlenstoffbedarf, ebenso wie seinen Stickstoff-/Proteinbedarf, so daß ein vollständiger Träger für das chemotropische Bakterium geschaffen ist, um seine Lebensfähigkeit zusammen mit dem Vermögen, organische Stoffe zu anorganischen Stoffen abzubauen (mineralisieren), zu verlängern.
Diese und andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden besser verständlich aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und den beigefügten Abbildungen, die folgendes wiedergeben:

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Abbildung 1 ist eine Reihe von Diagrammen, die die normalisierten KOH- Werte für zahlreiche Matten während einer Prüfdauer von 29 Tagen wiedergeben.
Abbildung 2 ist eine Reihe von Diagrammen, die die normalisierten KOH- Werte für zahlreiche Matten während einer Prüfdauer von 24 Stunden während der Versuche wiedergeben, wobei die Werte in ng/Stunde umgerechnet wurden.
Abbildung 3 ist eine Reihe von Diagrammen, die die normalisierten KOH- Werte für zahlreiche geprüfte Matten während einer Zeit von 29 Tagen wiedergeben, wobei die Werte in ng/Tag umgerechnet wurden.
Abbildung 4 ist eine Reihe von Diagrammen, die den Gesamtabbau der anorganischen Produkte in Prozent wiedergeben, basierend auf nicht normalisierten KOH-Werten für zahlreiche geprüfte Matten während einer Zeit von 29 Tagen.
Diese Abbildungen und die nachfolgende detaillierte Beschreibung offenbaren spezielle Ausführungsformen der Erfindung.

BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG

Die Erfindung wird aus den folgen den Versuchen besser verständlich.
Drei Kategorien von Mikroben wurden in den hergestellten Matten verwendet und sechs Typen von hergestellten Matten wurden geprüft und verglichen bezüglich ihres Vermögens, Hexadecan, ein Paraffin und Chrysen, einen 4-Ring polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoff (PAH) zu anorganischen Verbindungen abzubauen.
Sechs Behandlungen oder mikrobielle Mattentypen wurden verwendet. Diese schließen unsere im Labor entwickelten metallverträglichen Matten als auch speziell hergestellte mikrobielle Silagematten ein. Die mikrobiellen Gruppen, die für die hergestellten Matten und Kennzeichnung ihrer Haupteigenschaften verwendet wurden, waren:
1. Oscillatoria spp.: sauerstoffhaltig, phototrop mit heterotropischem Vermögen, stickstoffbindend, schleimentwickelnd.
2. Chromatium spp.: Anaerob (anoxygenic) phototropisch, chemotropisch, freibeweglich, sucht Zonen mit niedrigem Sauerstoffgehalt, durchdringt Erdboden, erhöht den Redox-Wert durch Entfernen von H&sub2;S.
3. Fermentative anaerobe Gruppe, einschließend Lactobacillus spp. und Clostridium spp. (aus siliertem Grasschnitt oder Silagematerial):
Heterofermenativ, benutzt zahlreiche Träger, einschließlich widerspenstiger Kohlehydrate, wie Hemicellulose.
Das Mattenherstellungsverfahren beinhaltet Impfen einzeln abgetrennter (oder Mischungen, wenn fermentativ wirkende Bakterien) der drei mikrobiellen Gruppen in sterile Flaschen mit siliertem Grasschneidegut. Wenn Matten faulen, migriert das Chromatium spp. unter das Oscillatoria spp. und wird als rote ausgebreitete Bereiche sichtbar. Grasschneidegut zersetzt sich fortlaufend und zeigt die Anwesenheit von Hemicelluloseabbauenden Bakterien an.
Nachdem alle Matten zu stabilen Gemeinschaften verfault waren, die fest zu einer gelatinösen Matrix angelassen waren, wurden sie unter nichtsterilen Bedingungen auf die Petroleumdestillatlösungen aufgebracht. Anschließend wurden keine Anstrengungen unternommen, um die Matten gegen Invasion wilder Mikroben zu schützen. Sie erschienen jedoch als intakt bleibend und behielten die Unversehrtheit ihrer mikrobiellen Populationen während des ganzen Versuches.

Metalltolerante hergestellte mikrobielle Silagematten

1. CM+SS; vollständige Matte (CM) und sterile Silage (SS):
Diese Matten enthielten Cyanobakterien (hauptsächlich Oscillatoria spp.) und zahlreiche Spezies von Bakterien, einschließlich blauroter photosynthetischer Schwefelbakterien. Alle diese Spezies von Cyanobakterien und Bakterien kamen spontan aus Georgia Piedmont Erdboden und waren zuvor mittels bekannter Techniken metalltolerant (Bi, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Pb, Se, Zn) gemacht worden.
Silage versehen mit organischen Säuren (Kohlehydrate), Bakterien und Aufbauträgermaterial für mikrobielle Mattenlagerung und Mattenentwicklung. Bei diesem Mattentyp wurde die Silage in einem Autodaven (SS) sterilisiert, um die Wirkung von Silagebakterien zu entfernen.
2. CM+RS; Vollständige Matte und Rohsilage (RS):
Diese Matten enthalten die gleichen Bodenmikroorganismen, die metalltolerant gemacht wurden, wie in Nr. 1, zusätzlich zu nichtsteriler oder roher Silage. Deshalb waren Silagebakterien vorhanden.
3. OSPB+SS; Oscillatoria spp. (OS), Chromatium spp. (PB) und sterile Silage:
Diese Matten enthalten kommerziell erhältliches Oscillatoria spp. und Chromatium spp. Sterile, im Autodaven behandelte Silage wurde zugesetzt.
4. OSPB+RS: Oscillatoria spp., Chromatium spp. und rohe Silage: Diese Matten enthalten die gleichen Mikroorganismen wie in Nr. 3, zusätzlich zu nichtsteriler Silage. Deshalb waren Silagebakterien vorhanden.
5. OS+SS; Oscillatoria spp und sterile Silage:
Diese Matten enthielten nur das Oscillatoria spp., wie in Nr. 4 und 5 verwendet, zusätzlich zur sterilen Silage.
6. OS+RS; Oscillatoria spp. und rohe Silage:
Diese Matten enthalten nur Oscillatoria spp., wie in Nr. 4 und 5 verwendet, zusätzlich zu roher Silage.
Diese Code Bezeichnungen werden verwendet, um die zahlreichen Matten in den Abbildungen zu identifizieren.
Eine gleiche Reihe von Prüfrohren wurde verwendet, um das Abbauvermögen von nur blaurotem photosynthetischem Schwefelbakterium, Chromatium spp., zu prüfen, einem Hauptbestandteil mikrobieller Matten.
Die nachfolgenden Petroleumkohlenwasserstoffe wurden mit jeder der zuvor beschriebenen Matten geprüft:
Hexadecan, ein geradkettiges Alkan und Chrysen, ein polycyclischer aromatischer Kohlenwasserstoff (PAH) mit hohem Molekulargewicht, wurden als repräsentative Bestandteile von Erdöl ausgewählt.
Beide Kohlenwasserstoffe waren entweder ¹&sup4;C-markiert (Chrysen: spezifische Aktivität=6.3 mci/mmol, Amersham Corp., Arlington Heights, IL., und Hexadecan: spezifische Aktivität=1.2 mci/mmol, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) oder nicht markiert.

Versuchsaufbau

Mikrobielle Matten enthalten sowohl photosynthetisierende und heterotrope Mikroorganismen, von denen beide in der Lage sind, Petroleumkohl enwasserstoffe abzubauen. Einige der photosynthetisierenden Mikroorganismen sind auch wirksame heterotrope Mikroorganismen. Deshalb schloß der Aufbau der Versuche belichtete und dunkle Reihen, für jede Behandlung (Mattentyp), ein, um Unterschiede beim Abbau zu anorganischen Stoffen in Abwesenheit von Licht festzustellen.
Eine Gesamtmenge von 104 Prüfrohren wurde verwendet für alle sechs Mattentypen unter Belichtung und in Dunkelheit. Diese schließen ein: dreifache Versuchsrohre (mit einem lebenden Mattenpfropfen) für jeden Mattentyp, ein zusätzliches Rohr, enthaltend die ¹&sup4;C-markierten Verbindungen plus 25 mg/l nicht markiertem Chrysen oder Hexadecan für jeden Mattentyp; ein Gegenprobenrohr ohne Matte und versehen mit der ¹&sup4;C- markierten Verbindung für jeden der Kohlenwasserstofftypen: und ein Gegenprobenrohr mit abgetöteter mikrobieller Matte mit 1 ml von 0,1 M HgCl&sub2; und versehen mit der ¹&sup4;C-markierten Verbindung für jeden Kohlenwasserstofftyp.
Zusätzliche 12 Prüfrohre wurden verwendet, um das Mineralisierungsvermögen von Chromatium spp. zu prüfen. Ein Milliliter der reinen Kultur wurde verwendet, um eine Reihe in der gleichen Weise auszuführen, wie die Reihen mit mikrobiellen Matten.
Prüfungen signifikanter Unterschiede des Abbaus unter Behandlung der hergestellten Matten wurden ausgeführt unter Verwendung von Einweganalyse von Varianz und geschützten t-Versuchen (GB-Strat Professional Statistics and Graphics, Dynamic Microsystems, Inc., Silver Springs, MD).
Nur ein Kohlenwasserstoff wurde jedem Rohr zugesetzt. Zugaben der ¹&sup4;C- markierten Verbindungen zu den Prüfrohren waren vorgesehen, um die Media mit einem Niveau von mehr als 4800 dpm/ml zu versehen. Deshalb wurde jedes Rohr versehen mit 144.000 dpm/ml von ¹&sup4;C-markiertem Hexadecan (=12,259 µp) oder Chrysen (=2.348 µg). In Rohren, die zusätzlich 25 mg/l Kohlenwasserstoff enthalten, führt dies zu einem zusätzlichen 375 µl von Hexadecan oder 375 µg von Chrysen, aufgelöst in Methylenchlorid.

Arbeitsweise

Stücke von mikrobieller Matte wurden abgetrennt, gewogen (Naßgewicht) und in sterile Borsilicatprüfrohre eingebracht. Ein Milliliter von Chromatium spp. Kultur wurde den betreffenden Rohren zugesetzt. Der geeignete ¹&sup4;C-markierte oder nicht markierte Kohlenwasserstoff wurde zugesetzt und das Endvolumen in den Rohren wurde eingestellt auf 15 ml durch Zugabe von Allen/Arnon-modifiziertem Medium (Allen & Arnon, 1955).
Ein 7-ml fassendes Scintillationsglas als KOH-Falle, enthaltend 1 ml 0.3 M KOH, wurde über der Oberfläche des Mediums unter Verwendung eines Stücks Teflonbandes angeordnet. Das Letztere wurde mittels eines mit Teflonband beschichteten Korkstopfens fest in seiner Stellung gehalten. Teflon reagiert nicht mit Kohlenwasserstoffen (Bauer & Capone, 1985).
Belichtete Rohre wurden 24 Stunden gehalten unter gemischtem Fluoreszenzlicht und Glühlicht. "Dunkle" Rohre wurden an der gleichen Stelle gehalten bedeckt mit zwei Schichten von Aluminiumfolie. Die Umgebungstemperatur war im Bereich von 28 bis 32ºC.
Proben des radioaktiven Kulturmediums (1 ml) wurden aus den Rohren abgezogen und in ein 7-ml fassendes Scintillationsglas eingebracht am Tag Null und dem 28. Tag. Am 1., 7., 14. und 28. Tag wurde die KOH Falle aus jeder Flasche entfernt (und ersetzt am 1. 7. und 14. Tag). Fünf ml Scintillationsflüssigkeit (Ultima Gold, Packard Chemical Co., Menden, CT) wurden zu jedem Scintillationsgefäß zugegeben und 10 Minuten gezählt in einem Flüssigkeits-Scintillationszähler (Packard Bell). Am 28. Tag wurde der pH-Wert jedes Prüfrohrmediums mit H&sub2;SO&sub4; auf < 4,5 abgesenkt, um CO&sub2; aus dem Medium in die KOH Falle auszutreiben.
Hexan wurde verwendet, um ¹&sup4;CO&sub2; aus ausgewählten mikrobiellen Mattenproben auszuwaschen. Diese Scintillationen wurden gezählt, um eine grobe Information über ¹&sup4;C-Einschluß zu erhalten.

Ergebnisse

Es werden die Ergebnisse berichtet, getrennt für jede Matte der sechs Mattentypen, während der 28 Tage Zeitperiode, wie folgend: ¹&sup4;C-Niveaus der KOH-Falle in dpm/ml und normiert auf das Ausgangsgewicht der mikrobiellen Matte (Abbildung 1); normierte Werte der KOH-Falle in dpm/ml, umgerechnet in ng Von zu anorganischer Verbindung angebautem Kohlenwasserstoff in ng/Stunde (während der ersten 24 Stunden) oder ng/Tag (Abbildung 2 und 3): und die Abbaurate zur anorganischen Verbindung wurde berechnet als Prozent der Ausgangsmenge von Kohlenwasserstoff, die jedem Rohr zugesetzt wurde (Abbildung 4). Die Abbauleistung zu anorganischen Verbindungen von Chromatium spp. ist in Tabelle 1 wiedergegeben.
Weder das ¹&sup4;C-markierte Hexadecan oder Chrysen, noch die Rohre, die zusätzlich 25 mg/l Hexadecan oder Chrysen enthielten, erwiesen sich als toxisch für die mikrobielle Matte. Unter belichteten Bedingungen stieg das Naßgewicht der Matte im Mittel auf 103,3% (s.d.=68,4 während der Behandlung) in Hexadecan und auf 140,6% (s.d.=107,0 während der Behandlung) in Chrysen an. Im allgemeinen erhöhten sich die Naßgewichte der Matten wenig oder verringerten sich sogar unter dunklen Bedingungen in Hexadecan (Mittelwert=-7,2%, s.d.=47,3 während der Behandlung) und in Chrysen (Mittelwert=26,0%, s.d.=25,7 während der Behandlung.
Ungeachtet der beabsichtigten Beschickungsrate von > 4800 dpm/ml zeigte Hexadecan niedrigere Zählungen in den 1-ml-Proben, die im Moment der Anfangszugabe abgezogen wurden (belichtete Reihen Mittelwert=755,01 dpm/ml, s.d.=354,90: und dunkle Serien Mittelwert=2803.38 dpm/ml, s.d.=658,60). Die Anfangszählungen der CM+RS Behandlung, verglichen mit allen anderen Behandlungen unter Dunkelbedingungen, OSPB+RS Behandlung zeigten den größten Abbau (signifikant bei p< 0,01 oder 0,05, verglichen mit CM+SS, OS+SS und OS+RS). Bei Chrysen erfolgt der Abbau bei Belichtung und in Dunkelheit dem gleichen Trend (CM+RS-Matte unter Belichtung; OSPB+RS-Matte in Dunkelheit), obwohl diese Ergebnisse nicht statistisch signifikant waren. Alle Behandlungen mit Oscillatoria spp. (0S+RS und OS+SS) wiesen die niedrigsten Zählungen von allen auf (ausgenommen OS+RS Hex L). Wenn dem Prüfrohrmedium zusätzlich 25 mg/l von nicht markiertem Kohlenwasserstoff als Überschußnährsubstanz zugesetzt wurden, waren die ¹&sup4;CO&sub2;-Zählungen üblicherweise niedriger, jedoch bleibt der gleiche allgemeine Trend bestehen (Daten werden nicht wiedergegeben).
Berechnungen von Mineralisierungsraten entsprechend den ¹&sup4;CO&sub2;-Werten. Die Abbauraten für Hexadecan waren mehr als 150-fach größer, verglichen mit denen von Chrysen in den ersten 24 Stunden. Prüfung der Daten für Versuchsreihen in Dunkelheit für sowohl Hexadecan als auch Chrysen ergab, daß die Abbaurate zu anorganischen Verbindungen gleichmäßig während des 4 Wochen dauernden Versuches anstieg. Während dieser Zeit wurde Hexadecan abgebaut mit einer Rate von größer dem 400-fachen von Chrysen. Während der ersten 24 Stunden lagen die experimentellen Werte im Bereich von 0,01-0,04 ng/h für Chrysen für Reihen des Abbaues unter Belichtung bis zu 1,5-12,2 ng/h für Hexadecan bei Versuchsreihen unter Belichtung. Die Werte für Versuchsreihen in Dunkelheit für die gleiche Zeitperiode lagen im Bereich von 0,01-0,10 ng/h für Chrysen und 3,0-27,6 ng/h für Hexadecan. Die täglichen Mineralisierungsraten bis zum 28. Tag lagen im Bereich von 0,022-0,644 ng/Tag für Chrysen bei Versuchsreihen unter Belichtung bis Zu 3,6-100,4 ng/Tag bei den belichteten Versuchsreihen mit Hexadecan. Die Werte für die Versuchsreihen in Dunkelheit während der gleichen Zeit lagen im Bereich von 0,494-2.998 ng/Tag für Chrysen und 63,2-1.232,8 ng/Tag für Hexadecan.
Während 28 Tagen war der Prozentsatz der Mineralisierung der gesamten ursprünglich zugesetzten Menge signifikant größer für Hexadecan, im Vergleich zu Chrysen (Abbildung 4). Die Endwerte von Versuchsreihen unter Belichtung lagen im Bereich von 0,01 bis 0,08% für Chrysen und 0,47-3,07% für Hexadecan. Die Endwerte von Versuchsreihen in Dunkelheit lagen im Bereich von 0,14-0,21% für Chrysen und 4,65-14,29% für Hexadecan.
Am 28. Tag wurden mit Hexan gewaschene Proben von Matten geprüft auf Spuren der Einlagerung von ¹&sup4;CO&sub2; in die Biomasse der mikrobiellen Matte, entstanden durch Abbau von Hexadecan oder Chrysen. Hohe Niveaus von ¹&sup4;CO&sub2; wurden in allen Proben gefunden (Tabelle 2). Chromatium spp. baut auch Hexadecan und Chrysen gleichermaßen unter Belichtung und in Dunkelheit ab (Tabelle 2). Hexadecan wurde jedoch mit einer sehr viel größeren Rate abgebaut als Chrysen
Obwohl einige Informationen vorhanden sind, die auf das Potential von Cyanobakterien zum Abbau von Kohlenwasserstoff hinweisen, zeigen diese Versuche, daß eine hergestellte Matte, die chemotrope Bakterien in Kombination mit Cyanobakterien und gärungserregenden Bakterien enthält, überragende Ergebnisse bei der Mineralisierung ergibt. Am Ende des Versuches war feststellbar, daß die Zugabe von Silage und ihre begleitende mikrobielle Flora (rohe Silage enthält Lactobacillus spp. und Clostridium spp) den Abbau von Kohlenwasserstoff zu anorganischen Verbindungen signifikant verstärkt. Die sowohl Hexadecan als auch Chrysen am besten wirksam abbauenden Mittel unter Belichtung waren die vollständigen Matten, entwickelt aus natürlich auftretenden Mikroorganismen (hauptsächlich Oscillatoria spp. und photosynthetische blaurote (purpurfarbene) Schwefelbakterien aus Georgia Piedmont Erdboden). Ohne die Beeinflussung von ¹&sup4;CO&sub2;-Aufnahme über Photosynthese ergeben die Versuchsreihen in Dunkelheit die zuverlässigsten Daten. Unter diesen letzteren Bedingungen waren die hergestellten Matten aus kommerziell gelieferten Oscillatoria spp. und Chromatium spp. die wirksamsten abbauenden Mittel für sowohl Hexadecan als auch Chrysen.
Es besteht ein wesentlicher Beweis, daß verschiedene mikrobielle Spezies in einer gemischten Kultur notwendig sein können für einen signifikanten Abbau von Öl, weil ein einzelnes Spezies nicht in der Lage zu sein scheint, ein spezielles Öl abzubauen. Unsere Ergebnisse zeigen klar, daß von Cyanobakterien beherrschte mikrobielle Matten, die auch noch durch ein chemotropes Bakterium besiedelt sind, ein biologisches Heilpotential für Erdöl haben.
Wir haben gefunden, daß unsere mikrobiellen Silagematten gegenüber übersalzten Bedingungen (bis zu 100 Teile pro Tausend) ohne vorherige Anpassung tolerant sind. In anderen parallelen Reihen mit schrittweiser Anpassung der Versuche haben wir gefunden, daß mikrobielle Silagematten bei schwankenden Konzentrationen von Naphthalin und Phenanthren bis zu 100 mg/l, Chrysen bis zu 50 mg/l und in reinem Hexadecan "berlebten.
Jede unserer mikrobiellen Matten ist eine zeitweilige Verbindung, enthaltend Chromatium sp., ein autotropes/chemotropes purpurfarbenes Bakterium und Oscillatoria sp. ein photosynthetisches/Stickstoff bindendes Cyanobakterium. Die auf der Oberfläche von Wasser schwimmende Matte ist stabilisiert und wird mit Nährstoff versorgt durch silierten Grasschnitt, wie es schematisch in Abbildung 5 gezeigt ist. Zone 1 wird beherrscht von photosynthetischem/Stickstoff bindendem Cyanobakterium Oscillatoria und Zone 2 wird beherrscht vom heterotropenlchemotropischen und autotropen/chemotropischen Bakterium Chromatium. Das Oscillatoria ist angegeben in Abbildung 5 durch A, das silierte Grasschnittgut ist angegeben als B, Luftblasen C tragen zum Auftrieb der Matte bei und das heterotrope oder autotrope Bakterium Chromatium ist mit D bezeichnet.
Das Wasser ist geimpft mit unseren Laboratoriumsvorräten oder mit aus kommerziellen Quellen erhältlichem Chromatium und Oscillatoria. Unsere Lagervorräte sind widerstandsfähige dauerhafte Stämme, die zuvor angepaßt wurden, eine Zahl Von toxischen Chemikalien und Metallen zu tolerieren. Abbildung 6 zeigt eine vorhersagbare Folge von Mikroben, die in der Wassersäule auftreten, wenn diese Mattenvereinigung in Wasser entwickelt wird, das gegebenenfalls über einem Bett aus Erdboden liegt. Anfänglich erfolgt ein Blühen einer breiten Zahl von heterotropen Bakterien (1-3 Tage), die aus dem Erdbett zum Vorschein kommen, mit nachfolgender schneller Besiedelung der Oberfläche der Wassersäule durch Oscillatoria. Wenn das Oscillatoria wächst, verschwinden die Bakterien in der Wassersäule. Das Chromatium migriert in den Bereich unter dem Oscillatoria, wo es von Kohlehydraten und Protein erhalten wird, die durch Cyanobakterium zugeführt werden. Chromatium behält jedoch seine Mobilität und häufig migriert ein Teil der Population weg von Oscillatoria durch das Wasser oder den Boden unter der Matte. Die Vorstehenden sind jedoch nicht in der Lage, ihre Lebensfähigkeit für ausgedehnte Zeitperioden abseits der Matte ohne Nahrungszufuhr zu behalten. Wenn erforderlich, werden ausgereifte Matten durch schrittweises Aussetzen ansteigenden Konzentrationen der Verunreinigung an Zielverunreinigungen angepaßt.
Es ist wichtig zu beachten, daß Chromatium ein chemotropischer Organismus ist (der eine -Anzahl von Chemikalien zur Energiegewinnung umsetzt). Obwohl es auch autotrop (photosynthetisch) ist, begrenzt die Photosynthese das Ansprechen des chemotropischen Verhaltens nicht. Es ist ein einzigartiger primitiver Organismus, der H&sub2;S anstelle von Wasser für Photosynthese verwendet. Dieses isoliert (sequestriert) Sulfid aus Wasser mit anschließender Oxidation zu elementarem Schwefel entfernt es einen Teil des reduzierenden Potentials der Umwelt und trägt wahrscheinlich zu den erhöhten Redox-Bedingungen bei, die um die Matten vorhanden sind.
Die gereiften Matten werden dicht in einer Schleimmatrix angelassen, die von den Zellen abgeschieden wird. Die entstehenden laminierten Filme von Mikroben haben diskrete oxidierende und reduzierende Zonen, die in unmittelbarer Nachbarschaft innerhalb der Matrix liegen. Diese Eigenschaften (Auftreten von oxidierenden/reduzierenden Zonen und erhöhte Redox-Bedingungen in der Wassersäule) tragen Wahrscheinlich zur Entfernung von zahlreichen Metallen aus Wasser bei.
Die Matten werden leicht immobilisiert auf zahlreichen Trägern, einschließlich Glas, Wolle, keramischen Fliesen, Kalk, Kieselsteinen, Beton und fadenförmigen Grünalgen. Wenn sie auf Grünalgen fixiert sind, sind sie wirksam geschützt vom Abstreifen in das Umgebungsfeld (Mechanismus unbekannt). Bei Feldversuchen in Teichen, die auf Grünalgen fixierte Matten enthalten, haben sich diese 6 Monate lang als beständig erwiesen.
Mikrobielle Matten haben ein einzigartiges Vermögen, aktiv Chlordankugeln vom Boden der Wassersäule über Biofilme zu sequestrieren. Beispielsweise hat ein Biofilm sich fortschreitend zum Boden von Testrohren, die verschiedene Konzentrationen von Hexadecan enthalten, ausgedehnt. Dieser Film hat gezeigt, dab er Chlordankugeln in einem Vielfachen seines Eigengewichts sequestrieren kann. Diese Eigenschaft kann wichtig sein, um dichte Verunreinigungen zu entfernen, die zu Boden fallen und Ablagerungsbereiche von flachen Teichen und Flußmündungen verunreinigen.

Herstellung von Matten

Die nachfolgenden Schritte fassen das Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen Matten zusammen:
1. Siliertes Grasschnittgut (7 g/l), hergestellt aus frisch geschnittenem Gras (gemischte wilde Gräser), das in 1 Liter fassende Standgefäße unter Ausschluß von Lufttaschen gepackt wird und sich 20 Tage bei Raumtemperatur anaerob umsetzen konnte, wird auf die Oberfläche einer Wassersäule und Oscillatoria/Chromatium- Mischung (jeweils 0,1-0,5 g/l) gegeben. Die gegorene Silage wird verwendet, um die Wassersäule anzureichern, um die mikrobielle Blüte anzuregen und um einen Nährboden für die Zugabe von Cyanobakterien auf die Oberfläche der Wassersäule zu schaffen. Es werden keine Anstrengungen unternommen, um ein steriles System aufrechtzuerhalten oder die Typen der heterotropen Bakterien, die sich in die Matte integrieren können, zu steuern. Zwei mikrobielle Stämme werden als wesentlich für das Behandlungssystem betrachtet. Dies sind Oscillatoria und Chromatium. Jedes dieser Beiden besiedelt leicht Grasschnittgut und sie werden nicht eliminiert durch wetteifernde Eingriffe anderer heterotroper Bakterien. Zusätzlich wird eine gemischte Population von gärungserregenden Bakterien zusammen mit dem silierten Grasschnittgut zugesetzt. Man nimmt an, daß die gemischten heterotropen Populationen aus dem Erdboden und dem Graschnittgut tatsächlich den Abbau gewisser Bestandteile verstärken können, so lange die beiden geimpften Stämme ihren Zusammenhalt behalten. Zusammengefaßt, nach dem Impfen mit den zwei Stämmen erfolgt eine natürliche, ausgeglichene Selbstorganisation der Mikroben in eine Matte, beherrscht durch Oscillatoria mit anhaltender Besiedelung durch Chromatium an der Unterseite der Matte. Diese Selbstorganisation und die langzeitige strukturelle Beständigkeit des Systems ist sehr gut reproduzierbar.
2. Belichtung mit Glühlicht (60 W in 25 cm Abstand von der Oberfläche). Teilweises Abdecken mit klarem Kunststoff, um die Verdampfung zu minimieren.
3. Die bakterielle Phase entwickelt sich spontan (1-3 Tage).
4. Cyanobakterien werden spontan beherrschend in 4.7 Tagen. Die Matte kann 10-15 Tage reifen. Ersatz Von verdampftem Wasser mit Leitungswasser. Die mikrobiellen Matten tolerieren Leitungswasser und Süßwasser und Brackwasser aus der Feldumgebung. Salzwasser kann verwendet werden nach vorheriger Anpassung (schrittweises Aussetzen) der Stämme steigenden Salzkonzentrationen.
5. Anschließend werden getrennte Teile der gereiften Matte für mikrobielle Impfung (1-2 cm²/l Wasser) verwendet.

Verwendung der Matte für biologische Heilbehandlungen:

Mikrobielle Matten weisen eine Anzahl von Eigenschaften auf, so daß sie einfach zu Abwasserbehandlungen verwendet werden können. Diese Eigenschaften schließen Folgendes ein: (1) Herstellung von Flockungsmitteln, die die Wassersäule von Trübungen klären, wie es in Abbildung 7 gezeigt ist, (2) Sequestrieren von eutrophierenden Mineralien, (3) Anheben von sauren pH-Niveaus (Tabelle 1), (4) Abbau von organischen Stoffen und (5) Entfernung von heterotropen Bakterien (einschließlich Koliformen) aus der Wassersäule. Abbildung 6 zeigt, daß die Verringerung der Bakterien in der Wassersäule mit dem Wachstum von Oscillatoria auf der Teichoberfläche korreliert. Tabelle 1 Durch mikrobielle Matten über die Zeit zustande gebrachte Wäßrige pH Änderung
Die Matten wurden erfolgreich verwendet, um Chlordan, Hexadecan, Chrysen, Naphthalin, Phenanthren, 2,4,6-Trinitrotoluol (TNT) und polychlorierte Biphenyle (PCB) abzubauen. Repräsentative Daten sind in Abbildungen 8-10 und in Tabelle 2 wiedergegeben. Die Daten über den Chlordanabbau in Wasser zeigen, daß Chromatium schneller abbaut als Oscillatoria. Chlordan wird im Erdboden ebenso schnell durch die mikrobiologische Matte abgebaut. In Wasser mit Chlordan tritt eine intensive Blüte von Chromatium auf. Ein gleiches Phänomen der Penetration von rotem Chromatium in Erdboden wurde beobachtet. In dem Beispiel tritt ein vollständiger Abbau von Hexadecan und Chrysen zu Kohlendioxid auf mit Oscillatoria, ist jedoch wesentlich verstärkt, wenn Chromatium vorhanden ist in der Matte zusammen mit Oscillatoria. TNT wird abgebaut mit der vollständigen Matte. Tabelle 2 Biologischer Abbau durch mikrobielle Matten
(1) Prozent Abbau von Erdöldestillaten bestimmt den Abbau in dunklen Versuchszyklen (bestimmt durch ¹&sup4;C-markiertes Kohlendioxid, das in Kaliumhydroxidfallen gesammelt wird). Menge der Matte (Mattenoberfläche, cm²) aufgebracht auf zahlreiche Nährböden, wobei: TNT = 2,0 pro Petrischale, Chlordan in Wasser = 16,0 pro 50-ml-Medium, Chlordan im Erdboden = 2,5 pro Prüfrohr, Erdöldestillate = 2,0 pro 100-ml-Medium.
(2) EIP: Versuche laufen noch.
Tabelle 3 gibt eine Zusammenfassung des Vermögens der Matten, Metalle zu entfernen. Obwohl die Zellabsorption von Cyanobakterien und Bakterien seit langem bekannt ist als ein Verfahren zum Entfernen von Metallen aus wäßrigem Medium arbeitet das Mattensystem mit einem einzigartigen Mechanismus. Die Reinigung der chemischen Umgebung der Wassersäule unter der Matte ist Wahrscheinlich in das Verfahren einbezogen. Hohe Redox- Bedingungen (auch im Dunkeln vorhanden) und hoher Sauerstoff während des Tages führt wahrscheinlich zur Ablagerung von Mn als MnO&sub2;. Mikroanalysen von Matten, die Zink (Zn) und Mangan (Mn) ausgesetzt waren, zeigen kleine Übereinstimmung der Metallablagerungen mit Zellmorphologie (dies zeigt an, daß die Zellabsorption nicht der Hauptmechanismus der Metallablagerung sein kann, sondern es ist die zuvor beschriebene Reinigung der lokalen chemischen Umgebung. Tabelle 3 Entfernung von Metallen und Metalloiden aus flachen Laborbecken. Pb = Blei, Se = Selenium, As = Arsen, Zn = Zink, Mn = Mangan, Cu = Kupfer, Cd = Cadmium
(1) Frei schwimmende Matte. Selbstschwimmende Matten wurden kultiviert auf der Oberfläche von Laborbecken, enthaltend Blei (Pb) oder Seien (Se). Die Anfangslösung von Selenat Wurde teilweise reduziert zu elementarem Seien, das sich in der Oberfläche der Matte ablagerte. Blei wurde in der Matte als Bleisulfid abgelagert. Die pH-Wert Bedingungen für frei schwimmende Matten waren 6-8.
(2) RND. Rate nicht bestimmt. 1.746 mg As/M²&supmin;matte wurde bis zum 19. Tag beseitigt. Keine Zwischenproben wurden aus der Wassersäule gezogen.
(3) Auf schwimmendem Material festgelegte Matten. die Matte wurde aufgebracht aus Glaswolleballen, die in mit Zn/Mn verunreinigtem Wasser bei pH 7-9 schwammen.
(4) Ausgeschnittene Matten. Kleine Teile der Matte wurden ausgeschnitten und aufgebracht auf eine gemischte Lösung von Cu, Zn, Cd und Eisen (Fe), wobei die Proben aus der Abwasserableitung der Iron Mountain Mine, Kalifornien, entnommen wurden. Der pH wurde auf 3.4 vor der Zugabe der Mattenabschnitte eingestellt. Eisen wurde nicht gemessen.
Bei Anwendung der mikrobiellen Matten in Feldversuchen in Teichen zum Sequestrieren von mit Metall verunreinigtem Minenabwasser wuchs eine schwimmende Matte (1-2 cm Dicke), aufgebaut aus Oscillatoria und festgelegt auf faserförmigen Grünalgen, schnell im Teich nach Zugabe einer mikrobiell geimpften Silagematte. Eine zweite Matte von Cyanobakterien bedeckte ebenso den Kalk am Boden. Dadurch floß das mit Metall verunreinigte Wasser zwischen den zweischichtigen Matten. Es waren etwa sechs Wochen erforderlich, um eine vollständige Abdeckung des Teiches mit einer Matte zu erreichen, die wirksame Metallentfernung begann jedoch in einem frühen Stadium des Mattenwuchses. Abbildung 12 zeigt die Profile der Metallentfernung in den Teichen mit Fließgeschwindigkeiten von 2-5 l/min. Metalle (Mn und Fe) wurden wirksam entfernt, nachdem das einfließende Wasser eine Wegstrecke von etwa 1-2 m durch den Teich zurückgelegt hatte. Alle Probennahmepunkte nach diesem Abstand zeigten Metallkonzentrationen < 1,2 mg/l. Kissen von roten Kolonien zeigten die Anwesenheit von Chromatium in und um die Matte herum an. Es gibt kein Anzeichen einer Metallablagerung auf der oberen Oberfläche der Matte. Hohe Redox-Bedingungen in der Wassersäule, gebildet durch die photosynthetischen Prozesse dieser zwei mikrobiellen Gruppen, bewirkten wahrscheinlich die schnelle Ablagerung des Mangans. Das System blieb 5 Monate funktionsfähig bei einer Ablagerung von etwa 2,6 g von Mn/m/Tag.
Redox- und aufgelöste Sauerstoff-Niveaus waren hoch während der belichteten Zeit und die pH-Niveaus lagen im Bereich von 6,4-7,7. Sogar nach 10 Stunden Dunkelheit lagen die Sauerstoff-Niveaus noch bei 6 mg/l in einigen Bereichen der Matte im Teich. Während der photosynthetischen Perioden wurden Sauerstoffblasen in der Schleimmatrix eingeschlossen, die typischerweise die Matte bindet. Offensichtlich bleibt der aufgenommene Sauerstoff erhältlich während der gesamten Nacht. Dies ist zu erwarten, weil Cyanobakterien üblicherweise nur ein begrenztes Vermögen haben, organische Nährstoffe zur Energieproduktion in der Dunkelheit zu nutzen, so daß der Sauerstoffverbrauch niedrig bleibt.
Obwohl die Bedingungen von hohem Sauerstoff und Redox der Zentralpunkt für die Ablagerung von Mn-Oxiden sein mag, können auch andere Faktoren ebenso wirksam sein. Flockungsmittel wurden identifiziert in der Wassersäule unter der Matte. Laboruntersuchungen zeigen, daß spezielle biologische Flockungsmittel aus der Matte austraten als Antwort auf die Anwesenheit von Mn&spplus;² (Manuskript in Vorbereitung). Diese Stoffe trugen Oberflächenladungen im Bereich von -58,8 bis -65,7mV. Die Ladungen änderten sich in +1,8 in Gegenwart von zweiwertigem Metall. Dies zeigt Metallbindung an die biologischen Flockungsmittel.
Obwohl Metalle, die adsorbiert, gefällt oder komplex gebunden sind, zurück in die Lösung gelangen können in einer Gleichgewichtsreaktion, wurden solche Fluktuationen nicht beobachtet während einer vier Monate dauernden Versuchszeit. Bedingungen von neutralem pH mit hohem gelösten Sauerstoff und Redox-Niveaus (erzeugt durch die Biochemie des Ökosystems der Matte) begünstigen die chemische Ausfällung von Manganoxiden und Eisenhydroxiden. Diese wirken wiederum als Reservoire für zusätzliche Metallabscheidung.
Das Potential der Bioverfügbarkeit von Metallen wird begünstigt durch erhöhte Surekonzentration, Verringerung von Spannung und Salzgehalt. Hergestellte Matten, die Oscillatoria und Chromatium enthalten, neigen dazu, die Bioverfügbarkeit zu mindern durch Anheben des pH und Redox des Systems. Obwohl anaerobe Zonen in den im Labor kultivierten Matten identifiziert wurden und wahrscheinlich auch in Matten bei Feldversuchen vorhanden sind, blieben die Redox-Bedingungen der Wassersäule unter der Matte in dem Versuchsteich sogar nach ausgiebigen Dunkelperioden hoch.
Obwohl nur das chemotropische Bakterium Chromatium hier offenbart wurde, kann jedes Mitglied der Familie der Chromatiaceae, das chemotropische Eigenschaften hat, verwendet werden.

Claims

1. Ein hergestelltes mikrobielles System, enthaltend:

ein chemotropes Bakterium und

ein Wachstumsmedium zum Versorgen des chemotropen Bakteriums mit exogenem Protein und Kohlehydrat, um das Wachstum des chemotropen Bakteriums zu unterstützen.

2. Mikrobielles System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Wachstumsmedium Cyanobakterien enthält.

3. Mikrobielles System nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Wachstumsmedium silierte Pflanzen enthält.

4. Mikrobielles System nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Matte aufweist, die durch Impfen der silierten Pflanzen mit den Cyanobakterien und dem chemotropen Baktenum und Wachsenlassen der Matte aus diesen geimpften silierten Pflanzen ausgebildet wurde.

5. Mikrobielles System nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das chemotrope Bakterium vom Genus Chromatium ist.

6. Mikrobielles System nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Cyanobakterium vom Genus Oscillatoria ist.

7. Mikrobielles System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin einen unbeweglich machenden Träger enthält, auf dem das Wachstumsmedium und das chemotrope Bakterium angeordnet sind.

8. Mikrobielles System nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der unbeweglich machende Träger faserförmige Grünalgen sind.

9. Mikrobielles System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es auf Wasser schwimmt.

10. Mikrobielle Hatte zum Abdecken der zu behandelnden Fläche mit einer oberen Zone, die hauptsächlich photosynthetische Cyanobakterien enthält, und einer unteren Zone, die hauptsächlich ein chemotropes Bakterium enthält und die zum Kontakt mit der zu behandelnden Fläche ausgebildet ist.

11. Mikrobielle Hatte nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin mit der oberen und unteren Zone verbundene silierte Pflanzen enthält, um der oberen und unteren Zone Nährstoffe zuzuführen.

12. Verfahren zum Herstellen einer mikrobiellen Hatte durch:

a) Impfen von silierten Pflanzen mit einem chemotropen Bakterium und einem Cyanobakterium und

b) Zusammenwachsenlassen der silierten Pflanzen, des chemotropen Bakteriums und des Cyanobakteriums zu einer Matte.