DE68929287T2

DE68929287T2 - Oberflächenaktives Lungenprotein und verwandte Polypeptide

Info

Publication number: DE68929287T2
Application number: DE68929287T
Authority: DE
Inventors: Charles G. Cochrane; Susan D. Revak
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1988-01-06
Filing date: 1989-01-05
Publication date: 2001-07-05
Anticipated expiration: 2009-01-06
Also published as: EP0593094B1; DE68929248T2; DK439089D0; WO1989006657A1; AU3960089A; EP0593094A2; DK439089A; US5164369A; AU629233B2; EP0593094A3; EP0350506B1; EP0350506A1; DE68929248D1; FI102180B1; DE68929287D1; JPH02502917A; FI894187A0; ATE199730T1; JP3009690B2; ATE196298T1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Polypeptide, die beim Bilden von synthetischen Lungen-Surfactants brauchbar sind.

Hintergrund

Lungen-Surfactant (LS) bedeckt das Alveolenepithel von reifen Säugerlungen. Natürliches LS ist als "Lipoproteinkomplex" beschrieben worden, da es sowohl Phospholipide als auch Apoproteine enthält, welche wechselwirken, um die Oberflächenspannung an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche der Lunge zu verringern.
Seit der Entdeckung von Lungen-Surtactant und der anschließenden Feststellung, dass sein Mangel die Hauptursache des Atemnotsyndroms (RDS) des Neugeborenen ist, war eine Reihe von Untersuchungen auf die Entwicklung einer wirksamen Surfactant-Ersatztherapie für betroffene Personen, insbesondere Säuglinge gerichtet, wobei exogenes LS verwendet wurde. Zum Beispiel wurden Verbesserungen der Lungenfunktion, die an einer Abnahme des mittleren Atemwegsdrucks und des Sauerstoffbedarfs gemessen werden, unter Verwendung von exogenen Surfactants bei menschlichen Frühgeburten gezeigt. Siehe Hallman, et al., Pediatrics, 71: 473-482 (1983); Merritt, et al., J. Pediatr., 108 : 741-745 (1986); Hallman, et al., J. Pediatr., 106: 963-969 (1985); Morley, et al., Lancet, i:64-68 (1981); Merritt, et al., New England J. Med., 315: 785-790 (1986); Smyth, et al., Pediatrics, 71 : 913-917 (1983); Enhorning, et al., Pediatrics, 76: 145-153 (1985); Fujiwara, et al., The Lancet, 1: 55-59 (1980); Kwong, et al., Pediatrics, 76: 585-592 (1985); Shapiro, et al., Pediatrics, 76: 593-599 (1985); Fujiwara, in "Pulmonary Surfactant", Robertson, B., Van Golde, L. M. G., Batenburg J. (Hrsg.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, S. 479-503 (1984).
Unter einem pharmakologischen Gesichtspunkt wäre das optimale exogene LS zur Verwendung bei der Behandlung von RDS ein vollständig im Labor unter kontrollierten und sterilen Bedingungen synthetisiertes LS mit vernachlässigbarer Variabilität der Eigenschaften von Charge zu Charge. Um die Möglichkeit von immunologischen Komplikationen zu minimieren, sollte die Apoproteinkomponente eines exogenen LS mit der in Menschen vorkommenden identisch sein. Leider ist die Zusammensetzung von natürlich vorkommendem LS komplex und das Fachgebiet hat noch nicht alle biochemischen Komponenten identifiziert, welche die biophysikalischen Eigenschaften hervorbringen, die für eine hohe physiologische Aktivität in der Lunge erforderlich sind. Insbesondere ist dem Fachgebiet nicht gelungen, alle in natürlichem LS vorkommenden Apoproteine zu charakterisieren oder die Funktion der gegenwärtig bekannten LS-Apoproteine zu identifizieren.

Zusammenfassung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Polypeptid, bestehend aus nicht mehr als ungefähr 60 Aminosäureresten, wie es in Anspruch 1 definiert ist, bereit. Dieses Polypeptid bildet, wenn es mit einem pharmazeutisch annehmbaren Phospholipid vermischt ist, ein synthetisches Surfactant, das eine Surfactant-Aktivität aufweist, die größer ist als die Surfactant-Aktivität des Phospholipids allein.
In einer anderen Ausführungsform zieht die vorliegende Erfindung ein synthetisches Lungensurfactant in Betracht, das ein pharmazeutisch annehmbares Phospholipid mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid vermischt umfasst.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

A. Definitionen

Aminosäure: Alle hier identifizierten Aminosäurereste liegen in der natürlichen L-Konfiguration vor. In Übereinstimmung mit der Standardpolypeptidnomenklatur, J. Biol. Chem., 243 : 3557-59, (1969) sind die Abkürzungen für die Aminosäurereste wie in der folgenden Zuordnungstabelle gezeigt: ZUORDNUNGSTABELLE:
Es sollte beachtet werden, dass alle Aminosäuresequenzen hier durch Formeln wiedergegeben sind, deren Ausrichtung von links nach rechts in der herkömmlichen Richtung vom Aminoende zum Carboxylende angegeben ist. Außerdem sollte beachtet werden, dass ein Bindestrich am Beginn oder Ende einer Aminosäuresequenz eine Bindung an einen Rest wie H und OH (Wasserstoff und Hydroxyl) an den Amino- bzw. Carboxylenden oder eine weitere Sequenz aus einem oder mehreren Aminosäureresten bedeutet. Außerdem sollte beachtet werden, dass ein Schrägstrich (1) am rechten Ende einer Sequenz anzeigt, dass die Sequenz in der nächsten Zeile fortgesetzt wird.
Polypeptid und Peptid: Polypeptid und Peptid sind Begriffe, die hier austauschbar verwendet werden, um eine lineare Folge von nicht mehr als ungefähr 60 Aminosäureresten zu bezeichnen, von denen jeweils einer mit dem anderen durch Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino- und Carboxylgruppen von benachbarten Resten verbunden sind.
Protein: Protein ist ein Begriff, der hier verwendet wird, um eine lineare Folge von mehr als ungefähr 60 Aminosäureresten zu bezeichnen, von denen jeweils einer mit dem anderen wie in einem Polypeptid verbunden ist.
"Surfactant-Aktivität" für ein Protein oder Polypeptid ist definiert als die Fähigkeit, eine Aktivität in dem in vivo-Assay von Robertson, Lung, 158 : 57-68 (1980) aufzuweisen, wenn es mit Lipiden kombiniert ist, entweder allein oder in Kombination mit anderen Proteinen. In diesem Assay wird die zu bestimmende Probe durch einen Endotrachealtubus an fötale Kaninchen oder Lämmer verabreicht, die vorzeitig durch Kaiserschnitt zur Welt gebracht wurden. (Diese "Frühchen" besitzen kein eigenes LS und werden von einem Beatmungsgerät beatmet.) Messungen der Lungencompliance, der Blutgase und des Beatmungsgerätedrucks ergeben Kennziffern der Aktivität. Eine Vorbestimmung der Aktivität kann auch durch einen in vitro-Assay, z. B. den von King et al., Am. J. Physiol., 223: 715-726 (1972) oder den nachstehend erläuterten Assay erfolgen, welcher eine Messung der Oberflächenspannung an einer Luft-Wasser-Grenzfläche verwendet, wenn ein Protein oder Polypeptid mit einem Phospholipid vermischt ist.

B. Polypeptide

Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung (Polypeptid, das Gegenstand der Erfindung ist) ist gekennzeichnet durch seine Aminosäuresequenz und neue funktionelle Eigenschaften. Ein Polypeptid, das Gegenstand der Erfindung ist, bildet, wenn es mit einem pharmazeutisch annehmbaren Phospholipid vermischt ist, ein synthetisches Lungen- Surfactant, das eine Surfactant-Aktivität aufweist, die größer ist als die Surfactant- Aktivität des Phospholipids allein.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid besteht aus nicht mehr als 60 Aminosäureresten, wobei die Sequenz des Polypeptids durch die Formel:
(ZaUb)cZd
wiedergegeben ist.
Z und U sind Aminosäurereste, so dass bei jedem Vorkommen Z und U unabhängig ausgewählt werden. Z ist ein hydrophiler Aminosäurerest, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R, D, E und K. U ist ein hydrophober Aminosäurerest, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus V, I, L, C und F. "a", "b", "c" und "d" sind Zahlen, welche die Anzahl der hydrophilen oder hydrophoben Reste angeben. "a" weist einen Mittelwert von 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 auf. "b" weist einen Mittelwert von 3 bis 12, am meisten bevorzugt ungefähr 3 bis ungefähr 10 auf. "c" ist 3 bis 10, vorzugsweise 3 bis 6. "d" ist 0 bis 3, vorzugsweise 1 bis 2. Das Polypeptid weist somit abwechselnde Bereiche mit hydrophoben und hydrophilen Aminosäureresten auf
Die Angabe, dass der durch Z und U wiedergegebene Aminosäurerest unabhängig ausgewählt ist, bedeutet, dass bei jedem Vorkommen ein Rest aus der angegebenen Gruppe ausgewählt wird. Das heißt, wenn beispielsweise "a" 2 ist, wird jeder der durch Z wiedergegebenen hydrophilen Reste unabhängig ausgewählt und kann somit RR, RD, RE, RK, DR, DD, DE, DK usw. umfassen. Die Angabe, dass "a" und "b" Mittelwerte aufweisen, bedeutet, dass die Mittelwerte von "a" und "b" ungefähr 1 bis ungefähr 5 bzw. ungefähr 3 bis ungefähr 20 betragen, wenngleich die Anzahl der Reste innerhalb der wiederholten Sequenz (ZaUb) innerhalb der Peptidsequenz etwas schwanken kann.
Beispielhafte bevorzugte Polypeptide der vorstehenden Formel sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1
¹ Die Bezeichnung ist eine Abkürzung für die angegebene Aminosäuresequenz.
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann durch beliebige Methoden synthetisiert werden, die Fachleuten auf dem Gebiet der Polypeptide bekannt sind. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung der vielen zur Verfügung stehenden Methoden findet man in J. M. Steward und J. D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969, und J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Bd. 2, S. 46, Academic Press (New York), 1983 für die Festphasenpeptidsynthese und E. Schroder und K. Kubke, "The Peptides", Bd. 1, Academic Press (New York), 1965 für eine klassische Synthese in Lösung.
Im Allgemeinen umfassen diese Verfahren dis nacheinander erfolgende Addition von einem oder mehreren Aminosäureresten oder auf geeignete Weise geschützten Aminosäureresten an eine wachsende Peptidkette. Normalerweise ist entweder die Amino- oder Carboxylgruppe des ersten Aminosäurerests durch eine geeignete, selektiv entfernbare Schutzgruppe geschützt. Eine andere selektiv entfernbare Schutzgruppe wird für Aminosäuren verwendet, die eine reaktive Seitengruppe enthalten, wie etwa Lysin.
Bei einer Festphasensynthese, die hier als Beispiel verwendet wird, wird die geschützte oder derivatisierte Aminosäure über ihre ungeschützte Carboxyl- oder Aminogruppe an einen inerten festen Träger gebunden. Die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe wird anschließend selektiv entfernt und die nächste Aminosäure in der Sequenz mit der komplementären (Amino- oder Carboxyl)-Gruppe, welche auf geeignete Weise geschützt ist, wird hinzugemischt und unter Bedingungen umgesetzt, die zum Bilden der Amidverknüpfung mit dem bereits an den festen Träger gebundenen Rest geeignet sind. Die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe wird anschließend von diesem neu addierten Aminosäurerest entfernt und die nächste Aminosäure (die auf geeignete Weise geschützt ist) wird anschließend addiert usw.. Nachdem alle gewünschten Aminosäuren in der richtigen Reihenfolge verknüpft worden sind, werden etwaige noch vorhandene End- und Seitengruppen-Schutzgruppen (und der feste Träger) nacheinander oder gleichzeitig entfernt, so dass das fertige Polypeptid erhalten wird.

C. Synthetische Surfactants

Ein Polypeptid, das Gegenstand der Erfindung ist, kann mit einem pharmazeutisch annehmbaren Phospholipid vermischt werden, um ein synthetisches Lungen-Surfactant (LS) zu bilden, das bei der Behandlung des Atemnotsyndroms brauchbar ist.
Der Begriff "pharmazeutisch annehmbar" bezieht sich auf molekulare Gebilde und Zusammensetzungen, die keine allergische oder ähnlich ungünstige Reaktion ergeben, wenn sie einem Menschen verabreicht werden.
Phospholipide, die zum Bilden von synthetischen Alveolen-Surfactants durch Vermischen mit Protein brauchbar sind, sind im Fachgebiet wohlbekannt. Eine Übersicht über die Verwendung sowohl von nativen als auch synthetischen Phospholipiden für synthetischen Surfactants findet man in Notter et al., Clin. Perinatology, 14: 433-79 (1987). In einer Ausführungsform zieht die vorliegende Erfindung ein synthetisches Lungen- Surtactant in Betracht, das bei der Behandlung von RDS wirksam ist, welches eine wirksame Menge eines Polypeptids, das Gegenstand der Erfindung ist, mit einem pharmazeutisch annehmbaren Phospholipid vermischt umfasst. Wenngleich Verfahren zum Bestimmen der optimalen Polypeptid : Phospholipid-Gewichtsverhältnisse für eine bestimmte Polypeptid-Phospholipid-Kombination wohlbekannt sind, liegen therapeutisch wirksame Verhältnisse im Bereich von ungefähr 1 : 5 bis ungefähr 1 : 10000, vorzugsweise ungefähr 1 : 100 bis ungefähr 1 : 5000 und mehr bevorzugt ungefähr 1 : 500 bis ungefähr 1 : 1000. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform liegt das Polypeptid : Phospholipid- Gewichtsverhältnis im Bereich von ungefähr 1 : 5 bis ungefähr 1 : 2000, vorzugsweise ungefähr 1 : 7 bis ungefähr 1 : 1000 und mehr bevorzugt ungefähr 1 : 10 bis ungefähr 1 : 100. So kann ein synthetisches Lungen-Surtactant dieser Erfindung ungefähr 50, üblicherweise ungefähr 80 bis beinahe 100 Gew.-% Lipid und ungefähr 50, üblicherweise ungefähr 20 bis weniger als 1 Gew.-% Polypeptid enthalten. Vorzugsweise ist der Anteil eines Polypeptids, das Gegenstand der Erfindung ist, ungefähr 1 bis ungefähr 10 Gew.- % des Surfactants für Polypeptide, die Teilen der SP18 Sequenz entsprechen, und 1 : 100 für Polypeptide, die dem gesamten SP18-Monomer entsprechen.
Der Lipidteil umfasst vorzugsweise ungefähr 50 bis ungefähr 90, mehr bevorzugt ungefähr 50 bis ungefähr 75 Gew.-% Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), wobei der Rest ungesättigtes Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerol (PG), Triacylglycerole, Palmitinsäuresphingomyelin oder Gemische davon umfasst. Das synthetische Lungen-Surtactant wird durch Vermischen einer Lösung von einem Polypeptid, das Gegenstand der Erfindung ist, mit einer Suspension von Liposomen oder durch Vermischen des Polypeptids, das Gegenstand der Erfindung ist, und der Lipide direkt in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels hergestellt. Das Lösungsmittel wird anschließend durch Dialyse oder Verdampfung unter Stickstoff und/oder Anlegen eines Vakuums entfernt. Ein synthetisches Lungen-Surtactant, das Gegenstand der Erfindung ist, wird vorzugsweise für eine endotracheale Verabreichung formuliert, z. B. typischerweise als flüssige Suspension, als trockenes Pulver "Staub" oder als Aerosol. Zum Beispiel wird ein synthetisches Surfactant (Polypeptid-Lipid-Mizelle) in einer Flüssigkeit mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipiens wie Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerol und dergleichen suspendiert. Eine surfaetanthaltige therapeutische Zusammensetzung kann auch kleine Mengen von ungiftigen Hilfssubstanzen wie pH-Puffersubstanzen enthalten, wozu Natriumacetat, Natriumphosphat und dergleichen gehören. Um ein synthetisches Surfactant in Staubform herzustellen, wird ein synthetisches Surfactant so hergestellt, wie es hier beschrieben ist, anschließend lyophilisiert und als trockenes Pulver erhalten. Wenn es bei der Verabreichung eines Aerosols verwendet werden soll, wird ein synthetisches Surfactant, das Gegenstand der Erfindung ist, in fein verteilter Form zusammen mit einem zusätzlichen Surfactant und Treibmittel geliefert. Typische Surfactants, die verabreicht werden können, sind Fettsäuren und Ester. Es ist jedoch im vorliegenden Fall bevorzugt, die anderen Komponenten des Surfactant-Komplexes DPPC und PG zu verwenden. Brauchbare Treibmittel sind typischerweise Gase bei Umgebungsbedingungen und sie werden unter Druck kondensiert. Niederes Alkan und fluoriertes Alkan, wie etwa Freon, können verwendet werden. Das Aerosol wird in einen Behälter verpackt, der mit einem geeigneten Ventil ausgestattet ist, so dass die Inhaltsstoffe bis zur Freisetzung unter Druck gehalten werden können.
Ein synthetisches Surfactant wird entsprechend der Dosierungsform durch einen Endotrachealtubus, durch Verabreichung eines Aerosols oder durch Vernebeln der Suspension oder des Staubs in dem eingeatmeten Gas verabreicht. Mengen des synthetischen LS zwischen ungefähr 1,0 und ungefähr 400 mg/kg, vorzugsweise ungefähr 50 mg bis ungefähr 500 mg/kg werden in einer Dosis verabreicht. Zur Verwendung bei Neugeborenen sind im Allgemeinen eine bis drei Verabreichungen ausreichend. Für Erwachsene wird ausreichend rekonstituierter Komplex verabreicht, um ein PO&sub2; innerhalb des Normalbereichs zu ergeben (Hallman et al. J. Clinical Investigation, 70: 673- 682, 1982).
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung veranschaulichen, aber nicht beschränken.

Beispiele

Beispiel 1 - In vitro Bestimmung der Surfactant-Aktivität eines Polypeptids A. Methoden

Messung der Surtactant-Aktivität

Messungen des Oberflächendrucks über eine Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (angegeben als negative cm von H&sub2;O-Druck) bei minimalen Blasenradius wurden zu verschiedenen Zeitpunkten unter Verwendung der pulsierenden Blasenmethode bestimmt, die von Enhorning, J. Appl. Physiol., 43: 198-203 (1977) beschrieben ist.
Kurz gesagt misst das Enhorning Surfactometer (Surfactometer international, Toronto, Ontario) den Druckgradienten (eP) über eine Flüssigkeits-Luft-Grenzfläche einer Blase, die mit einer Rate von 20 Zyklen/min zwischen einem maximalen Radius (0,55 mm) und einem minimalen Radius (0,4 mm) pulsiert. Die Blase, die in einer von Wasser umschlossenen 20 ul-Probenkammer bei 37ºC gebildet wird, wird durch eine Mikroskopoptik beobachtet, während die Druckänderungen an einem Bandschreiber aufgezeichnet werden, der für 0 und -2 cm H&sub2;O kalibriert ist.

Phospholipide

Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC, beta, gamma-Dipalmitoyl-Lalpha-lecithin) und Lalpha-Phosphatidyl-DL-glycerol (PG, Derivat von Ei-Lecithin) wurden entweder von Calbiochem-Behring (La Jolla, CA) oder Avanti Polar-Lipids, Inc. (Birmingham, AL) bezogen. DPPC wurde zu PG in Chloroform in einem Gewichtsverhältnis von 3 : 1 zugegeben. Phospholipidghosphor-Assavs
Phospholipide wurden quantitativ bestimmt gemäß dem Verfahren von BarBett, J. Biol. Chem., 234: 466-468 (1959).
Bestimmung des zusammengesetzten Hydrophobiewerts
Der zusammengesetzte Hydrophobiewert von jedem Peptid wurde bestimmt, indem jedem Aminosäurerest in einem Peptid sein entsprechender Hydrophiliewert zugewiesen wurde, wie er in Tabelle 1 von Hopp et al. Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 78: 3824-3829 (1981) beschrieben ist, wobei diese Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. Für ein bestimmtes Peptid wurden die Hydrophiliewerte aufsummiert, wobei die Summe den zusammengesetzten Hydrophobiewert darstellt.

Herstellung von synthetischen Surfactants

Nach dem Vermischen mit dem Lösungsmittel wurde jedes Peptid gemäß einem der folgenden Verfahren mit Phospholipiden (DPPC : PG), 3 : 1 kombiniert, um ein synthetisches Surfactant zu bilden.
Das Verfahren A wurde durchgeführt durch Vermischen von 16 ul des Peptid/Lösungsmittel-Gemisches (40 ug Peptid) mit 100 ul Chloroform, das 400 ug Phospholipide enthält, Rühren des Gemisches während ungefähr 10 Minuten bei 37ºC, um ein PeptidlPhospholipid-Gemisch zu bilden. Chloroform wurde aus dem Peptid/Phospholipid- Gemisch durch Trocknen unter N&sub2; entfernt. Das so gebildete synthetische Surfactant wurde anschließend mit 90 ul H&sub2;O vermischt und ungefähr 10 Minuten lang bei 37ºC leicht gerührt. Anschließend wurde 10 ul von 9% NaCl zu der surfactanthaltigen Lösung zugemischt.
Verfahren B wurde durchgeführt, indem zuerst 100 ul Chloroform, das 400 ug Phospholipide enthielt, in ein Glasröhrchen gegeben wurde und das Chloroform durch Trocknen unter N&sub2; während ungefähr 10 Minuten bei 37ºC entfernt wurde. 16 ul eines PeptidlLösungsmittel-Gemisches und 74 ul H&sub2;O wurden mit den getrockneten Phospholipiden vermischt und anschließend ungefähr 10 Minuten lang bei 37ºC leicht gerührt. Zu dem so gebildeten synthetischen Surfactant wurden 10 ul von 9% NaCl hinzugemischt.
Verfahren C wurde durchgeführt, indem zuerst das Polypeptid-PL-Gemisch 10 Minuten lang bei 43ºC gehalten wurde, wonach die Lösungsmittel durch Trocknen unter N&sub2; aus dem Gemisch entfernt wurden. Falls es erforderlich war, wurden die Gemische durch 15 Minuten langes Anlegen eines Vakuums weiter getrocknet, um ein getrocknetes Polypeptid-PL-Gemisch zu bilden. Anschließend wurde Wasser mit jedem getrockneten Gemisch in einer Menge vermischt, die so berechnet war, dass sie 90% des Volumens betrug, das erforderlich ist, um eine PL-Endkonzentration von entweder 4 oder 10 mg/ml (wie in Tabelle 7 angegeben) zu ergeben, um ein zweites Gemisch zu bilden. Dieses zweite Gemisch wurde eine Stunde lang bei 43ºC gehalten, wobei gerührt wurde. Anschließend wurde ein Volumen von 6% NaCl, das 10% des Volumens entsprach, das erforderlich ist, um die gewünschte PL-Konzentration zu ergeben, mit dem zweiten Gemisch vermischt und das resultierende fertige Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 43ºC gehalten. In den meisten Fällen wurde das fertige Gemisch einem letzten Schritt aus drei Gefrier- und Auftauzyklen unterworfen.

B. Ergebnisse

Die Surfactant-Aktivität von beispielhaften Polypeptiden dieser Erfindung wurde untersucht, wobei der "Blasenassay" verwendet wurde, der vorstehend beschrieben ist. Die Ergebnisse der Untersuchung sind nachstehend in Tabelle 2 veranschaulicht.
Jedes Polypeptid wurde mit dem angegebenen Lösungsmittel in einer Konzentration von 2,5 mg Polypeptid pro ml Lösungsmittel vermischt. Das resultierende Gemisch wurde beobachtet, um festzustellen, ob eine Lösung oder eine Suspension von unlöslichem Polypeptid gebildet wurde. Diejenigen Gemische, die eine Suspension bildeten, wurden durch eine Beschallung in einem Wasserbad während 10 Sekunden weiter vermischt, um eine sehr feine Suspension zu bilden, die zum Pipettieren unter Verwendung von Glaspipetten geeignet ist.
Nach dem Vermischen mit dem Lösungsmittel wurde jedes Peptid mit Phospholipiden (PL), DPPC : PG, 3 : 1 in Chloroform in einem Glasröhrchen vermischt, so dass die zugegebene Menge an Polypeptid einem Zehntel (10 Gew.-%) der Menge des zugegebenen PL entsprach, um ein synthetisches Surfactant nach Verfahren C zu bilden.
Von jedem der synthetischen Surfactants wurde anschließend die Surfactant-Aktivität bestimmt, die durch ihre Fähigkeit zum Verringern der Oberflächenspannung in vitro in dem wie vorstehend beschrieben durchgeführten Blasenassay nachgewiesen wird. Der Druckgradient (AP) ist ein Maß der Surfactant-Aktivität in dem fertigen Polypeptid-PL- Gemisch, welche unter Verwendung eines Enhoming Surfactometers wie vorstehend beschrieben bestimmt wurde. Messungen wurden zu den Zeitpunkten 15 Sekunden (15"), 1 Minute (1') und 5 Minuten (5') erhalten und sind angegeben als Mittelwert von drei unabhängigen Messungen des angegebenen Polypeptid-PL-Gemisches. Messungen des Druckgradienten für vergleichbare Proben von PL allein (PL) und natürlichen menschlichen Surfactants wurden als Kontrollen durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2
(1) Es ist angegeben, ob das ursprüngliche Gemisch von Peptid und eine Lösung oder eine Suspension war
(2) Die Buchstaben geben das verwendete Herstellungsverfahren für das synthetische Surfactant an. Diese Verfahren sind vorstehend beschrieben. Ein "+" gibt an, dass das fertige Gemisch einem letzten Schritt aus drei Gefrier- und Auftauzyklen unterworfen wurde. Ein "" zeigt an, dass der Schritt nicht durchgeführt wurde.
(3) Die Konzentration ("Konz.") des Phospholipids (PL) in dem fertigen Gemisch ist in Milligramm PL pro Milliliter Gemisch (mg/ml) angegeben.
(4) Der Druckgradient ist ein Maß der Surfactant-Aktivität in dem fertigen Polypeptid- PL-Gemisch, die unter Verwendung eines Enhorning Surfactometers wie in Beispiel 2 beschrieben bestimmt wurde. Die Messungen wurden an drei Punkten bei 15 Sekunden (15"), 1 Minute (1') und 5 Minuten (5') erhalten und sind als Mittelwert von drei unabhängigen Messungen des angegebenen Polypeptid-PL- Gemisches wiedergegeben. Druckgradientmessungen für vergleichbare Proben von PL allein (PL) und natürlichem menschlichen Surfactant sind ebenfalls gezeigt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Polypeptid, das Gegenstand der Erfindung ist, wenn es mit pharmazeutisch annehmbaren Phospholipiden vermischt ist, ein synthetisches Lungen-Surtactant bildet, das eine größere Surfactant-Aktivität aufweist als dis Phospholipide allein, wie durch das höhere Volumen pro vorgegebenen Druck gezeigt wird.

Beispiel 2 - In vivo-Bestimmung der Aktivität des synthetischen Surfactants A. Methoden

Herstellung von synthetischen Surfactants

Ein Polypeptid, das Gegenstand der Erfindung ist, wurde zuerst mit Lösungsmittel vermischt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Das resultierende Gemisch wurde außerdem mit Phospholipid (PL) vermischt, so dass die zugegebene Menge an Polypeptid entweder 3 Gew.-%, 7 Gew.-% oder 10 Gew.-% der zugegebenen Menge von PL betrug, die nachstehend angegeben ist. Das fertige Polypeptid-PL-Gemisch (synthetisches Surfactant) wurde gemäß Verfahren C gebildet, wobei der abschließende Gefrier- Auftau-Schritt eingesetzt wurde, welcher ausführlich in dem Abschnitt "Herstellung von synthetischen Surfactants" in Beispiel 1 beschrieben ist, mit der Ausnahme, dass das fertige Gemisch eine Konzentration von 20 mg Phospholipid pro ml des fertigen Gemisches aufwies.

Instillationsprotokolle

Protokoll 1: Fötale Kaninchen wurden durch Injektion von 0,1 ml einer Lösung, welche entweder ein wie vorstehend beschrieben hergestelltes synthetisches Surfactant oder entweder 2 mg natives Surfactant (NS) oder 2 mg PL enthielt, in die Luftröhre behandelt.
Protokoll 2: Synthetisches Surfactant wurde durch Injektion der folgenden drei Komponenten aus einer einzigen Spritze in die Luftröhre in fötale Kaninchenlunge eingeträufelt, so dass die Komponenten die Spritze in der folgenden Reihenfolge verlassen: (1) 0,05 ml Luft; (2) 0,1 ml eines wie vorstehend beschrieben hergestellten synthetischen Surfactants oder entweder 2 mg PL oder 2 mg natives Surfactant; und (3) 0,1 ml Luft.
Protokoll 3: Aus einer Spritze wurde ein 0,1 ml-Aliquot eines wie vorstehend beschrieben hergestellten synthetischen Surfactants (oder 2 mg NS oder PL) wie vorstehend beschrieben in die Kaninchenluftröhre eingeträufelt, gefolgt von der Injektion von 0,05 ml von mit Lactat versetzter Ringer-Lösung (lactated Ringers Solution) und 0,2 ml Luft aus einer zweiten Spritze.
Protokoll 4: Aus einer Spritze wurden 0,1 ml eines wie vorstehend beschrieben hergestellten synthetischen Surfactants (oder 2 mg NS oder PL), 0,15 ml Luft, 0,1 ml Salzlösung und 0,3 ml Luft wie vorstehend beschrieben in die Luftröhre eingespritzt. Es wurden zwei nachfolgende Aliquote von 0,3 ml Luft gegeben.
Protokoll 5: Fötale Kaninchen wurden durch Injektion der folgenden vier Komponenten aus einer einzigen Spritze in die Luftröhre behandelt, so dass die vier Komponenten die Spritze bei der Injektion in der angegebenen Reihenfolge verlassen: (1) 0,2 ml Lösung, die entweder ein wie vorstehend beschrieben hergestelltes synthetisches Surfactant oder entweder 4 mg natives Surfactant oder 4 mg PL enthält; (2) ein 0,15 ml-Volumen Luft; (3) 0,1 ml einer normalen Salzlösung; und (4) ein 0,3 ml-Volumen Luft. Die vorstehende Injektion wurde anschließend 15 Minuten nach der ersten injektion wiederholt.
Protokoll 6: Kaninchen wurden wie in Protokoll 5 beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, dass zwei anschließende Aliquote von 0,3 ml Luft im Anschluss an die ursprüngliche Instillation gegeben wurden und keine zusätzliche Instillation bei 15 Minuten gegeben wurde.

Fötales Kaninchenmodell zum Untersuchen der Surfactant-Aktivität

Die Surfactant-Aktivität von beispielhaften Polypeptiden dieser Erfindung wurde untersucht, wobei die Verfahren verwendet wurden, die zuvor ausführlich von Revak et al. Am. Rev. Respir. Dis., 134: 1258-1265 (1986) beschrieben wurden, mit den nachstehend angegebenen Ausnahmen.
Fötale Kaninchen wurden nach siebenundzwanzig Tagen Schwangerschaft durch Gebärmutterschnitt entbunden und es wurde ihnen unmittelbar 0,05 ml Norcuron (Organon, Inc., NJ) injiziert, um eine spontane Atmung zu verhindern. Die fötalen Kaninchen wurden anschließend gewogen und eine kleine Kanüle wurde durch Tracheotomie in die Luftröhre eingeführt. Anschließend wurde ein wie vorstehend beschrieben hergestelltes synthetisches Surfactant in die fötale Kaninchenlunge durch eines der vorstehenden Instillationsprotokolle eingeträufelt.
Im Anschluss an die Instillation wurde das Kaninchen in einen speziell ausgelegten Plethysmograph (der einen Celesco-Wandler enthielt) gegeben, der mit einem Beatmungsgerät (Baby Bird, Baby Bird Corp., Palm Springs, CA) verbunden war, und die mit der Instillation behandelte Lunge wurde mit einer Rate von 30 Zyklen pro Minute mit einem Spitzeneinatemdruck von 25 cm H&sub2;O, einem positiven Endausatmungsdruck von 4 em H&sub2;O und einer Einatemzeit von 0,5 Sekunden beatmet. In einigen Untersuchungen wurden dynamische Compliance-Messungen zu verschiedenen Zeitpunkten während des Beatmungsvorgangs durchgeführt. In anderen erfolgten statische Compliance- Messungen im Anschluss an die Beatmung.
Statische Compliance-Messungen erfolgten nach 30-minütiger Beatmung. Die Tiere wurden aus dem Beatmungsgerät entnommen und die Lungen wurden bei -20 cm H&sub2;O in einer Vakuumglocke unter Vakuum entgast. Danach wurden die Lungen zuerst aufgeblasen und anschließend durch ein T-Verbindungsstück, das mit einem Tracheostomietubus verbunden war, entleert. Das Luftvolumen, das erforderlich war, um statische Drücke von 5, 10, 15, 20, 25 und 30 cm H&sub2;O zu erreichen, wurde sowohl während der Aufblas- als auch der Entleerungsphasen gemessen, um statische Druck/Volumen- Kurven als Maß der statischen Compliance zu erzeugen.
Dynamische Compliance-Messungen erfolgten zu verschiedenen Zeitpunkten während eines 60-minütigen Beatmungszeitraums, wobei der Plethysmograph verwendet wurde. Eine computergestützte Datenanalyse ergab Compliance-Daten, die als ml Luft pro cm H&sub2;O pro Gramm Körpergewicht zu jedem Zeitpunkt angegeben wurden. Die Compliance wurde gemäß der folgenden Formel berechnet.
Compliance = ΔV/ΔP
ΔPtp = (C)&supmin;¹ · (ΔV) + (R) · (F)
Ptp - transpulmonaier Druck
C = Compliance (elastische Komponente - bringt eine Änderung des Volumens mit dem Druck in Beziehung)
R = Widerstand (bringt Strömung mit dem Druck in Beziehung)
F = Strömung
V = Volumen = das Integral der Strömung bezüglich der Zeit
Die vorstehende Gleichung wurde mit einer linearen Mehrfachregression für C und R gelöst. Die Compliance (C) gibt die elastische Beschaffenheit der Lunge wieder und der Widerstand (R) gibt den Druck wieder, der erforderlich ist, um den Widerstand gegen die Strömung von Gasen in die Lunge hinein und heraus zu überwinden.

B. Ergebnisse

Jedes der synthetischen Surfactants dieser Erfindung und das natürliche Surfactant verbesserten die dynamischen Compliance-Werte im Vergleich zu Phospholipid allein (die Daten sind nicht gezeigt). Die in vivo-Compliance-Untersuchungen zeigten, dass die Verwendung einer Reihe von beispielhaften synthetischen Surfactants dieser Erfindung zu einer erhöhten Compliance im Vergleich zu Phospholipid allein für jedes der untersuchten synthetischen Surfactants führte. Somit bilden die Proteine und Polypeptide dieser Erfindung, wenn sie mit pharmazeutisch annehmbaren Phospholipiden vermischt sind, synthetische Surfactants, die eine größere Surfactant-Aktivität aufweisen als Phospholipid allein. Die Verwendung der synthetischen Surfactants ist von Vorteil beim Hervorbringen von verbesserten Compliance-Werten in vivo.
Die vorstehende Beschreibung einschließlich der spezifischen Ausführungsformen und Beispiele soll die vorliegende Erfindung erläutern und soll nicht als beschränkend angesehen werden. Zahlreiche andere Abwandlungen und Modifikationen können ausgeführt werden, ohne von dem wahren Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen, wie er in den Ansprüchen definiert ist.

Claims

1. Polypeptid, bestehend aus nicht mehr als 60 Aminosäureresten, wobei die Sequenz dieses Polypeptids durch die Formel (ZaUb)cZd wiedergegeben ist, wobei:

Z ein hydrophiler Aminosäurerest ist, der unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus R, D, E und K;

U ein hydrophober Aminosäurerest ist, der unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus V, I, L, C und F;

a einen Mittelwert von 1 bis 5 aufweist;

b einen Mittelwert von 3 bis 12 aufweist;

c 3 bis 10 ist; und

d 0 bis 3 ist,

wobei das Polypeptid, wenn es mit einem pharmazeutisch annehmbaren Phospholipid vermischt ist, ein synthetisches Lungen-Surtactant bildet, das eine Surfactant-Aktivität aufweist, die größer ist als die Surfactant-Aktivität des Phospholipids allein.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei a 1 bis 3 ist; b 3 bis 10 ist; c 3 bis 6 ist; und d 1 oder 2 ist.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei Z K ist.

4. Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei Z R ist.

5. Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei Z D ist.

6. Polypeptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei U L ist.

7. Polypeptid nach Anspruch 1, mit einer Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

8. Polypeptid mit der Formel RLLLLCHLLRLLLLCHLLR.

9. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, vermischt mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Phospholipiden zum Bilden eines Lungen-Surfactants mit einer Surfactant-Aktivität, die größer ist als die Surfactant-Aktivität von Phospholipid allein.

10. Verfahren zum Herstellen eines therapeutischen Arzneimittels, das zum Behandeln des Atemnotsyndroms (respiratory distress syndrome) brauchbar ist, umfassend das Vermischen von einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Phospholipiden mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8.