DE68918643T2 - Artikel zur Durchführung von Immuntests unter Verwendung von organischen Farbstoffen sowie Methoden zu seiner Herstellung und seiner Verwendung. - Google Patents
Artikel zur Durchführung von Immuntests unter Verwendung von organischen Farbstoffen sowie Methoden zu seiner Herstellung und seiner Verwendung.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein immunologische Assays und insbesondere einen Artikel zur Verwendung bei der Durchführung von immunologischen Festphasen-Assays unter Verwendung organischer Farbstoffe. Die Erfindung betrifft weiterhin immunologische Verfahren zur Verwendung des Artikels, ein Verfahren zur Herstellung des immunologischen Artikels und Kits zur Durchführung immunologischer Assays, die den Artikel umfassen.
- In seinem breitesten Sinn ist ein immunologischer Assay ein Verfahren, durch das eine immunologisch reaktive Komponente in einem biologischen Fluid nachgewiesen wird, indem ihre Bindung an ihr spezifisches immunologisches Gegenstück gemessen wird. Die immunologisch reaktive Komponente kann entweder ein Antigen oder ein Antikörper sein und ihr immunologisches Gegenstück würde dann der für eine solche Komponente spezifische Antikörper oder das spezifische Antigen sein. Die immunologisch reaktive Komponente oder ihr Gegenstück könnte zusätzlich an anderes Material oder eine Substanz gebunden sein, welche(s) ihre oder seine immunologischen Eigenschaften nicht zerstört.
- Es ist eine große Vielfalt von Verfahren entwickelt worden, um die Anwesenheit des Antigen-Antikörper-Komplexes nachzuweisen. In einem radioimmunologischen Assay wird eine bekannte Menge eines radioaktiv markierten Antigens zu dem Fluid zugegeben, in dem das unbekannte Antigen anwesend ist. Dieses Fluid wird mit einer anderen Mischung umgesetzt, welche für das Antigen spezifische Antikörper enthält. Das markierte und das unmarkierte Antigen reagieren mit dem Antikörper im Verhältnis ihrer relativen Konzentrationen in dem Fluid. Nach der Trennung des Antikörper-gebundenen Antigens von freiem Antigen wird dann die Radioaktivität des Antigen-Antikörper-Komplexes gemessen.
- In einer Enzym-verknüpften immunologischen Reaktion ist die radioaktive Markierung durch ein Enzym, z.B. alkalische Phosphatase oder Peroxidase, ersetzt. Die Menge des in der unbekannten Probe anwesenden Antigens oder Antikörpers wird bestimmt durch Messung der Menge des Enzymreaktionsprodukts, das in einem Zeitraum erzeugt wurde. Diese Menge ist proportional zur Menge des in der Untersuchungsprobe anwesenden Antikörpers.
- Um immunologische Assay-Tests mit einem höheren Grad an Empfindlichkeit und Spezifität zu erhalten, wurden immunologische Assay- Verfahren in fester Phase entwickelt. Dies erlaubt die Komponente des Antigen-Antikörper-Komplexes in dem biologischen Fluid von anderen Komponenten in der Reaktionsmischung zu trennen. In einem Festphasen-Immunoassay ist eine Komponente der immunologischen Reaktion, entweder Antigen oder Antikörper, an die Oberfläche eines Festphasen-Trägers immobilisiert. Es sind eine Anzahl von Verfahren entwickelt worden, um Antigene oder Antikörper direkt an den Festphasen-Träger zu immobilisieren. Ein solches Verfahren verwendet eine Triazinyl-"Brücken"-Gruppe, um das Antigen oder den Antikörper an den Festphasen-Träger zu immobilisieren; ein anderes Verfahren verwendet ein niederes Hydroxyalkylamin, um einen polymeren Festphasen-Träger mit Antigenen oder Antikörpern zu beschichten; ein drittes Verfahren verwendet Glutaraldehyd, um das Antigen oder den Antikörper zu immobilisieren. Während sich diese Verfahren als nützlich für die direkte Immobilisierung von Antigenen oder Antikörpern erwiesen haben, waren sie nicht effektiv beim Immobilisieren ganzer Zellen, z.B. Erythrozyten, Leukozyten, Lymphozyten, Blutplättchen oder anderen Säugerzellen. Es ist bekannt, daß Antigene auf der Oberfläche dieser Zelltypen präsentiert werden oder adsorbiert werden können. Es ist zweckmäßig geworden, die Anwesenheit dieser Antigene in Assays zur Blutgruppenbestimmung und für Agentien infektiöser Krankheiten zu bestimmen, insbesondere diejenigen, die direkt die zellulären Blutkomponenten betreffen. Die Immobilisierung ganzer Säugerzellen an einen Festphasen-Träger ermöglicht es dem Techniker, eine größere Spezifität bei den Ergebnissen dieses Immunoassay-Typs zu erhalten.
- In der Vergangenheit sind eine Vielfalt von Versuchen unternommen worden, um ganze Zellen an Festphasen-Träger zu immobilisieren. Ein Verfahren verwendet ein chemisches Mittel, um Zellen kovalent an den Festphasen-Träger zu binden. Dieses Verfahren hat begrenzte Anwendung bei der Immobilisierung von Zellen gefunden, aufgrund der hohen Kosten der koppelnden Agenzien und der begrenzten Anzahl von Zelltypen, die unter den nötigen Kopplungsbedingungen immobilisiert werden können, ohne die immunologische Integrität der Zelle zu zerstören. Glutaraldehyd war die primär verwendete Chemikalie, um ganze Zellen kovalent zu immobilisieren. Diese Chemikalie weist an jedem Ende des Moleküls eine Aldehydgruppe auf, welche die Zellen mit dem Träger vernetzt. Während dieses Verfahren einige Wirksamkeit bei der Bindung von Zellen an Festphasen-Träger gezeigt hat, wurde gefunden, daß Glutaraldehyd die Zelloberfläche modifiziert, was die immunologische Reaktion stört.
- Das bevorzugteste Verfahren zur Immobilisierung ganzer Zellen an einem Festphasen-Träger verwendet eher Adsorption als kovalente Bindung, um eine Schicht von Zellen auf der Oberfläche des Trägers zu erzeugen. Die Adsorption von Zellen auf einen Träger hängt von der Zusammensetzung, der Ladung und dem Alter der Zelloberfläche ab. Darüberhinaus beeinflußt die Zusammensetzung, Ladung und Gestalt des Trägermaterials die Haftung der Zellen an den Träger. Ein inhärentes Problem bei der Adsorption von Zellen ist, daß die Bindung der Zellen an den Träger relativ schwach ist. Dieses Problem wird durch den Einsatz von automatischen Waschvorrichtungen vergrößert, die in den meisten Krankenhäusern und Labors, welche diese Assays durchführen, verwendet werden. Der Einsatz von automatischen Waschvorrichtungen ist vorzuziehen, wenn nicht sogar nötig, um das Risiko einer Kontaminierung des Assays durch wiederholte Handhabung des Trägers zu verringern. Darüberhinaus wird wegen der hochgradig infektiösen Natur einiger Blut-bezogener Krankheiten das Risiko für den Techniker, der den Test durchführt, durch Verfahren verringert, die weniger direkte Handhabung beinhalten. Die automatischen Vorrichtungen sind auch nötig, um eine große Anzahl von Tests in der schnellstmöglichen Zeit durchzuführen, um Medizinern oder anderen die Stellung von Diagnosen und den Beginn der Behandlung so schnell wie möglich zu erlauben.
- Gegenwärtig wird bei der am häufigsten eingesetzten Adsorptionstechnik Poly-L-Lysin verwendet, um Zellen an Polystyrol-Träger zu immobilisieren. Die Bindung zwischen Poly-L-Lysin und dem Träger ist ionischer Natur und erzeugt eine relativ schwache Bindung zwischen den Zellen und dem Festphasen-Träger. Diese schwache Bindung führt zur verringerten Einsetzbarkeit von Poly-L-Lysin als Adsorptionsmittel, wenn automatische Waschvorrichtungen verwendet werden. Die Bindung zwischen dem Poly-L-Lysin und den Zellen ist zu schwach, um zu verhindern, daß die Zellen während des Waschvorgangs disloziert werden. Wenn einige der Zellen, die die Schicht auf dem Träger bilden, so disloziert werden, wird die Genauigkeit des Assays aufgrund nicht-spezifischer Bindung anderer Antigene oder Antikörper in der Probe zu dem Träger selbst oder dem Kopplungsmittel stark verringert.
- Es ist daher zunächst Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Artikel und ein Verfahren zur Durchführung eines immunologischen Assays bereitzustellen, der bzw. das zur Verwendung mit automatischen Waschvorrichtungen geeignet ist.
- Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das ein Adsorptionsverfahren zur Bindung von Zellen an einen Festphasen-Träger verwendet, welches die Integrität der immunologischen Komponenten der Zellenoberfläche aufrechterhält, um immunologische Assays mit hoher Spezifität bereitzustellen.
- Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Antigenen oder Antikörpern in einem biologischen Fluid bereitzustellen, welches ein Adsorptionsverfahren zur Bindung von Zellen an einen Festphasen-Träger bei relativ geringen Kosten verwendet.
- EP-A-0123901 offenbart einen Träger mit einer Polystyrol-Oberfläche, welcher eine Beschichtung aus einer Bis-Diazonium-Verbindung und ein an der Oberfläche adsorbiertes Protein umfaßt. Das Protein ist ausgewählt aus Antikörpern, Antigenen, Hapten-Protein- Konjugaten, Antikörper-bindenden Proteinen, Enzymen und Lektinen.
- DE-A-3022278 offenbart einen Polystyrol-Träger mit an dessen Oberfläche adsorbierten Erythrozyten. Die Erythrozyten sind an das Polymer über ein Diazoniumsalz immobilisiert. Das Diazoniumsalz wird durch chemische Behandlung des Polystyrol-Trägers gebildet. Der Artikel wird zum Nachweis von spezifischen Antikörpern, die an Antigene auf den immobilisierten Zellen binden, und zur Bestimmung von Blutgruppen-Typen verwendet.
- Erfindungsgemäß umfaßt ein Artikel zur Durchführung immunologischer Assays in fester Phase einen Festphasen-Träger; eine Beschichtung aus einem organischen Farbstoff mit einer positiven Nettoladung und einer hydrophoben aromatischen Ringstruktur, der an den Träger adsorbiert ist; und eine Monoschicht ganzer Zellen, die an den organischen Farbstoff immobilisiert sind. Dieser Artikel kann zur Bestimmung der Anwesenheit einer immunologisch-reaktiven Komponente in einem biologischen Fluid eingesetzt werden, indem das Fluid mit dem Artikel für einen Zeitraum in Kontakt gebracht wird, der ausreicht, um die Bindung der Komponente im Fluid an die ganzen Zellen zu erlauben, überschüssiges Fluid von dem Artikel entfernt wird und die Anwesenheit der gebundenen Komponente getestet wird.
- Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß organische Farbstoffe mit einer positiven Nettoladung und einer hydrophoben aromatischen Ringstruktur zur Immobilisierung ganzer Zellen auf einem Festphasen-Träger eingesetzt werden können, und stellt ein vorteilhaftes Verfahren und einen Artikel zur Durchführung immunologischer Assays in fester Phase zur Verfügung. Zuerst wird der Festphasen-Träger mit dem organischen Farbstoff beschichtet. Wenn eine immunologisch-reaktive Komponente mit einer negativen Nettoladung, z.B. Säugerzellen, Erythrozyten, Lymphozyten, Leukozyten oder Blutplättchen, mit dem organischen Farbstoff in Kontakt kommt, wird die Komponente auf nicht-kovalente Weise an den Farbstoff immobilisiert. Diese Bindung zwischen den immunologisch- reaktiven Zellen und dem organischen Farbstoff ist ausreichend stark, um beim Waschen durch die meisten automatischen Waschanlagen gegen ein Aufbrechen der Zell-Monoschicht Widerstand zu leisten.
- Festphasen-Immunoassays verwenden ein breites Spektrum von Artikeln als Struktur für den festen Träger. Der Träger hat oft die Form von Teströhrchen, Kügelchen, flächigem Material, Petrischalen, Membranen oder Mikrotiter-Platten. Andere Typen von Trägern oder Formen von Trägern sind geeignet, um die Ziele und Aufgaben der vorliegenden Erfindung auszuführen, und gleichermaßen einsetzbar.
- Der Festphasen-Träger kann aus einem organischen Polymer wie Polystyrol, Polypropylen, Polyvinylchlorid, oder Nylon bestehen. Jedes Material, das durch einen organischen Farbstoff gefärbt werden kann, kann neben organischen Polymeren als Träger für Festphasen-Immunoassays eingesetzt werden, z.B. Glas.
- Der bevorzugteste Festphasen-Träger zur Ausführung von Immunoassays nach der vorliegenden Erfindung sind Mikrotiter-Platten mit einer Vielzahl von Vertiefungen. Die Mikrotiter-Platten sind vorzugsweise aus einem organischen Polymer hergestellt und am bevorzugtesten aus Polystyrol.
- Der verwendete Festphasen-Träger muß sorgfältig gehandhabt und frei von kontaminierenden Proteinen gehalten werden, welche den Immunoassay stören könnten. Für diese Erfindung geeignete Farbstoffe sind solche organische Farbstoffe, die eine positive Nettoladung besitzen und eine hydrophobe aromatische Ringstruktur aufweisen. Jeder Farbstoff mit einer positiven Nettoladung und einer solchen hydrophoben aromatischen Ringstruktur, daß sie an einem Festphasen- Träger haftet, ist zur Erfüllung der Aufgaben dieser Erfindung geeignet.
- Viele der organischen Farbstoffe, die zur Herstellung eines Festphasen-Artikels zur Durchführung eines Immunoassays geeignet sind, können in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Eine besonders geeignete Klasse von Farbstoffen sind die Azo-Farbstoffe, die eine positive Nettoladung aufweisen. Azo-Farbstoffe sind durch die Anwesenheit einer Azobindung, -N=N-, welche zwei aromatische Ringe verbindet, gekennzeichnet. Diese Verknüpfung erzeugt eine Verbindung, die üblicherweise stark gefärbt ist. Die aromatischen Ringe sind oft Benzol- oder Naphthalin-Ringe. Die Azogruppe, -N= N, kann einmal oder mehrmals in der Verbindung auftreten. Monoazo- Farbstoffe haben die Grundstruktur:
- R-N=N-R
- worin R eine aromatische Ringstruktur darstellt. Beispiele von Monoazo-Farbstoffen schließen ein p-Ethoxychrysoidin mit der chemischen Formel C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub7;N&sub4;OCl und der Struktur:
- Amidolschwarz mit der chemischen Formel C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub0;N&sub5;O&sub4;Cl und der Struktur:
- und Alcian-Gelb mit der chemischen Formel C&sub3;&sub8;H&sub4;&sub2;N&sub8;S&sub4;Cl&sub2; und der Struktur:
- Die Azobindung tritt bei Diazo-Farbstoffen zweimal auf und hat die allgemeine Struktur:
- R-N=N-R-N=N-R
- worin R eine aromatische Ringstruktur darstellt. Beispiele von Diazo-Farbstoffen, die für die Erfindung geeignet sind, schließen ein Janus-Gelb mit der Formel C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub1;N&sub6;O&sub4;Cl und der Struktur:
- und Janus-Rot mit der Formel C&sub2;&sub6;H&sub2;&sub6;N&sub5;OCl und der Struktur:
- Farbstoffe mit mehr als zwei Azobrückengruppen sind als Polyazo- Farbstoffe bekannt. Ein Beispiel eines Polyazo-Farbstoffes ist Luxol Fast Blue G mit der chemischen Formel C&sub1;&sub0;&sub2;H&sub9;&sub7;N&sub1;&sub9;O&sub1;&sub3;S&sub4; und der Struktur:
- Eine weitere Klasse von organischen Farbstoffen mit einer positiven Nettoladung, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind die Diazonium- und Tetrazoniumsalze. Beide beinhalten die Struktur:
- worin R eine aromatische Ringstruktur darstellt. Diazoniumsalze enthalten nur eine dieser Strukturen, während Tetrazoniumsalze zwei enthalten. Beispiele von Diazoniumsalzen schließen ein Diazobenzol mit der chemischen Formel C&sub6;H&sub5;N&sub2;Cl und der Struktur:
- und Fast Scarlet mit der chemischen Formel C&sub6;H&sub3;Cl&sub4;N&sub2;Zn1/2 und der Struktur:
- Ein Beispiel eines Tetrazoniumsalzes ist Fast Blue B mit der chemischen Formel C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub2;O&sub2;N&sub4;Cl&sub8;Zn und der Struktur:
- Eine dritte Klasse von organischen Farbstoffen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind die Tetrazoliumsalze. Tetrazoliumsalze sind auch als Tetrazole bekannt und haben die Grundstruktur:
- worin R eine aromatische Ringstruktur darstellt. Beispiele eines Tetrazoliumsalzes sind Iodnitrotetrazolium mit der chemischen Bezeichnung 2-(p-Iodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-tetrazoliumchlorid; der chemischen Formel C&sub1;&sub9;H&sub1;&sub3;N&sub5;O&sub2;ICl und der Struktur:
- und Ditetrazoliumchlorid mit der chemischen Bezeichnung 3,3'(4,4'- Di-o-anisylen)-2,2'-di(p-nitrophenyl)-bis(5-phenyl), der chemischen Formel C&sub4;&sub0;H&sub3;&sub0;N&sub1;&sub0;O&sub6;Cl&sub2; und der Struktur:
- Eine vierte Klasse von organischen Farbstoffen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind Triphenylmethane. Diese Verbindungsklasse ist durch die Substitution von drei (3) der Wasserstoffatome von Methan, CH&sub4;, durch Phenylgruppen gekennzeichnet. Die allgemeine Formel wird wiedergegeben als:
- wobei ein spezielles Beispiel eines Triphenylmethans, nämlich Malachitgrün, die chemische Formel C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub5;N&sub2;Cl und die folgende Struktur aufweist:
- Eine Klasse von organischen Farbstoffen, die unter den Namen Xanthene oder Acridine klassifiziert sind, umfaßt eine fünfte für die vorliegende Erfindung geeignete Klasse. Verbindungen dieser Klasse sind Derivate von Xanthen, welches die folgende Struktur aufweist:
- Beispiele spezieller Xanthene oder Acridine schließen ein Acridinrot 3B mit der chemischen Formel C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub0;N&sub2;OCl und der Struktur:
- und Atabrin mit der chemischen Formel C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub2;N&sub3;OCl&sub3;.2H&sub2;O und der Struktur:
- Eine sechste Klasse von organischen Farbstoffen kann als Chinolin- Farbstoffe bezeichnet werden. Ein Beispiel eines Chinolin-Farbstoffes ist Pinacyanol mit der chemischen Formel C&sub2;&sub5;H&sub2;&sub5;N&sub2;I und der chemischen Struktur:
- Eine weitere Klasse von organischen Farbstoffen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, werden Thiazole genannt. Thiazole sind durch die Anwesenheit der folgenden Struktur gekennzeichnet:
- worin R eine aromatische Ringstruktur darstellt. Ein spezielles Beispiel eines Thiazols ist Thiaflavin TCN mit der chemischem Formel C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub9;N&sub2;SCl und der chemischen Struktur:
- Eine weitere Gruppe von organischen Farbstoffen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, umfaßt Klassen von Farbstoffen mit den Bezeichnungen Indamine, Azine, Aminoazine, Safranine und Thiazine. Die Indamin-Farbstoffe sind Verbindungen, die die Grundstruktur:
- R-N=R
- beinhalten, worin R eine aromatische Ringstruktur darstellt. Phenylenblau ist ein spezielles Beispiel eines Indamins und besitzt die chemische Formel C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub2;N&sub3;Cl und die chemische Struktur:
- Die Farbstoffe der Azin-Gruppe sind Derivate von Phenazin, welches zwei Formen seiner chemischen Struktur aufweist:
- Wenn eine oder mehrere Aminogruppen in ein Phenazin eingeführt werden, wird ein Aminoazin gebildet. Neutralrot ist ein Beispiel eines Aminoazins und besitzt die chemische Formel C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub7;N&sub4;Cl und die Struktur:
- Safranine sind Farbstoffe, die den Azinen ähnlich sind, aber worin eines der Stickstoffatome der Azin-Gruppe fünfwertig ist und einen damit verknüpften Benzolring aufweist. Ein spezielles Beispiel ist Phenosafranin mit der chemischen Formel C&sub1;&sub8;H&sub1;&sub5;N&sub4;Cl und der Struktur:
- Thiazine sind durch die Substitution eines Schwefelatoms anstelle eines der Stickstoffatome einer Azin-Gruppe gekennzeichnet. Spezielle Beispiele von Thiazinen schließen ein Azur C mit der chemischen Formel C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub1;N&sub3;SCl und der Struktur:
- und Methylenblau mit der chemischen Formel C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub8;N&sub3;SCl und der Struktur:
- Eine letzte beispielhafte Klasse von organischen Farbstoffen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind die Phthalocyanine. Diese sind cyclische Verbindungen mit Isoindol-Gruppen, die ein zentrales Metallatom, typischerweise Kupfer, umgeben, wobei die verknüpfenden Brückenatome -N=-Strukturen sind. Spezielle Beispiele von Phthalocyaninen schließen ein Phthalocyaninblau mit einer Struktur:
- worin X eine Onium-Gruppe ist:
- und Chinolin-Phthalocyanin mit einer Struktur:
- Die obigen Klassen und Beispiele von Farbstoffen sind als erläuternd und nicht als beschränkend anzusehen. Jeder organische Farbstoff mit einer positiven Nettoladung und einer hydrophoben aromatischen Ringstruktur, der imstande ist, einen Festphasen- Träger zu färben, ist als vom Umfang der Erfindung umfaßt anzusehen.
- Jeder dieser Farbstoffe kann unabhängig durch bekannte Verfahren hergestellt werden oder durch bekannte Quellen im Handel erhalten werden.
- Die durch den organischen Farbstoff immobilisierte Komponente kann jede immunologisch reaktive Komponente sein, die eine negative Nettoladung aufweist und hydrophobe Bindungen eingehen kann, z.B. ganze Zellen mit daran haftenden oder adsorbierten Antigenen oder Zellen, die zur Produktion von monoclonalen Antikörpern adaptiert wurden. Die ganzen Zellen, die verwendet werden können, können aus humanen oder tierischen Quellen stammen. Erythrozyten, Blutplättchen, Leukozyten und Lymphozyten und Säugerzellen sind zur Verwendung in immunologischen Assays der vorliegenden Erfindung besonders geeignet. Ganz besonders geeignet sind Erythrozyten und Blutplättchen aus humanen Quellen.
- Sobald ein geeigneter Farbstoff und geeignetes Trägermaterial ausgewählt ist, wird der Träger mit dem Farbstoff beschichtet. Um dies zu erreichen, wird eine flüssige Lösung des Farbstoffs hergestellt und eine Überschußmenge der Farbstofflösung mit dem Träger für einen Zeitraum in Kontakt gebracht, der ausreicht, daß der Farbstoff den Träger beschichten und färben kann. Der Farbstoff kann in jeder geeigneten Flüssigkeit, z.B. isotonischer Salzlösung oder einem geeigneten Alkohol, falls nötig, gelöst sein. Der Farbstoff bindet über nicht-kovalente Wechselwirkungen, z.B. ionische, Wasserstoff-, van der Waal's- und hydrophobe Bindung an den Träger. Der Farbstoff kann mit dem Träger über längere Zeiträume inkubiert werden oder der Träger kann in eine Lösung, die den Farbstoff enthält, getaucht und sofort gewaschen werden, abhängig von der Färbekapazität des Farbstoffs.
- Zur Herstellung von Festphasen-Träger zur Verwendung in erfindungsgemäßen Immunoassays sind insbesondere zwei Farbstoffe verwendet worden; Phthalocyaninblau und Alcian-Gelb. Um einen Festphasen-Träger unter Verwendung von Phthalocyaninblau herzustellen, wird der Farbstoff zuerst in isotonischer Salzlösung gelöst, um eine Konzentration von 1 ug/ml - 1 g/ml des Farbstoffs in der Salzlösung zu erhalten. Ein ausreichendes Quantum der Farbstofflösung, 25-350 ul pro Vertiefung in einer Mikrotiter-Platte, wird dann auf den organischen Polymer-Träger aufgebracht und für einen Zeitraum in Kontakt mit dem Träger gelassen, der ausreicht, daß der Farbstoff an den Träger binden und diesen färben kann. Überschüssiger Farbstoff wird vom Träger abgespült.
- Die Verwendung von Alcian-Gelb ist leicht unterschiedlich insofern, daß Alcian-Gelb in wäßrigen Lösungen nicht löslich ist. Deshalb wird zuerst ein Quantum an Alcian-Gelb in einem ausreichenden Quantum an 100% Methanol gelöst und dann ein gleiches Volumen an isotonischer Salzlösung zur Mischung zugegeben. Der geeignete Konzentrationsbereich liegt wieder zwischen 1 ug/ml - 1 g/ml, und 25-350 ul sind ein ausreichendes Quantum, um auf Vertiefungen einer Mikrotiter-Platte aufgebracht zu werden.
- Wie implizit zu verstehen gegeben, kann jeder der für diese Erfindung geeigneten organischen Farbstoffe auf ähnliche Weise hergestellt und eingesetzt werden. Individuelle Verfahren, um individuelle Farbstoffe in Lösung zu bringen, können nötig sein und werden vom Umfang dieser Erfindung umfaßt, nachdem solche Verfahren den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind.
- Die immunologische reaktive Komponente muß als nächstes auf den mit Farbstoff beschichteten Festphasen-Träger immobilisiert werden. Dies wird erreicht, indem ein Quantum einer Lösung, die die Komponente enthält, auf den mit Farbstoff beschichteten Träger aufgebracht wird und der Komponente erlaubt wird, sich durch Schwerkraft oder durch Zentrifugation auf dem Träger abzusetzen, und erlaubt wird, mit dem Farbstoff für einen ausreichenden Zeitraum in Kontakt zu bleiben, um daran zu haften. Ungebundene immunologisch reaktive Komponenten können dann mit einer Salzlösung weggewaschen werden. Dies hinterläßt eine Schicht der immunologisch reaktiven Komponente, die an den mit Farbstoff beschichteten Träger immobilisiert ist.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung sind ganze Zellen, insbesondere Erythrozyten oder Blutplättchen, die immunologisch reaktive Komponente, die auf den mit Farbstoff beschichteten Träger immobilisiert werden kann. Diese ganzen Zellen weisen eine negative Nettoladung auf und haften durch nicht-kovalente oder hydrophobe Wechselwirkungen an organischen Farbstoffen, die eine positive Nettoladung und eine hydrophobe aromatische Ringstruktur aufweisen. Diese nicht-kovalenten Wechselwirkungen schließen ionische, Wasserstoff-, van der Waal's und hydrophobe Bindung ein. Das Inkontaktbringen der Zellen mit dem organischen Farbstoff erzeugt eine Monoschicht von Zellen über der Oberfläche des Trägers, die zur Durchführung von Immunoassays äußerst geeignet ist, da sie einiges nicht-spezifisches Bindungspotential eliminiert. Um eine Zell-Monoschicht zu erzeugen, müssen die zu immobilisierenden Zellen zuerst frei von kontaminierenden Proteinen im biologischen Fluid gewaschen werden. Wenn dies nicht getan wird, werden diese Proteine durch Adsorption an den Farbstoff immobilisiert werden und die positive Ladung des Farbstoffs blockieren. Dies würde die Zelle daran hindern, an den Farbstoff zu adsorbieren. Die Zellen können in einer geeigneten Flüssigkeit, z.B. Gewebekultur-Fluid, Wasser, isotonischer Salzlösung oder Phosphat-gepufferter Salzlösung, mit einem pH-Bereich zwischen 5-10, gewaschen werden.
- Die gewaschenen Zellen werden dann in isotonischer Salzlösung oder PBS suspendiert und erlaubt, mit dem Farbstoff durch Schwerkraft oder Zentrifugation in Kontakt zu kommen. Nach einem Zeitraum, der ausreicht, um die Wechselwirkung der Zellen mit dem Farbstoff zu erlauben, um Adhäsion zu erreichen, werden ungebundene Zellen mit Salzlösung weggewaschen, was eine Monoschicht von Zellen hinterläßt, die an den mit Farbstoff beschichteten Festphasen-Träger immobilisiert sind. Der Festphasen-Träger ist nun einsatzbereit zur Durchführung von Immunoassays für den Nachweis von Antigenen oder Antikörpern, falls anwesend, in einem biologischen Test-Fluid. Jedes Verfahren, das in der Immunchemie zum Nachweis der Anwesenheit des Antigen-Antikörper-Komplexes eingesetzt wird, kann dann verwendet werden, um den Assay zu quantifizieren, z.B. Adhäsion roter Zellen in fester Phase, Immunfluoreszenz, Radioimmunoassay oder ELISA (Enzym-verknüpfte Immunosorbent-Assays).
- In einer alternativen Ausführungsform können die immobilisierten Zell-Monoschichten dazu verwendet werden, um Antikörper zu adsorbieren, die für die Antigene auf der Zelloberfläche spezifisch sind. In diesem Fall können die immobilisierten Antikörper dann dazu verwendet werden, um Antigene auf der Oberfläche von anderen Zellen oder in einer biologischen Probe nachzuweisen, gefolgt von konventionellen Assay-Verfahren.
- Ein Festphasen-Träger, der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt worden ist, ist auch besonders geeignet zum Nachweis von Antikörpern gegen Erythrozyten, Blutplättchen oder Lymphozyten. Viele Antikörper von klinischer Bedeutung werden in Patienten- oder Donor-Seren gefunden. Einige Antikörper können als Ergebnis von hämolytischen Transfusions-Reaktionen, hämolytischer Krankheit Neugeborener oder autoimmuner hämolytischer Anämie eine verringerte Überlebensrate roter Zellen verursachen. Andere Antikörper können Immunzerstörung von Blutplättchen verursachen. In vitro Antikörper- Nachweis-Tests offenbaren die Anwesenheit dieser Antikörper in Patienten- oder Donor-Seren.
- In einem Assay zum Nachweis von IgG-Antikörpern gegen Erythrozyten, Blutplättchen oder Lymphozyten wird ein Festphasen-Träger, typischerweise eine Mikrotiter-Platte mit U-förmigen Böden, eingesetzt, der mit einem organischen Farbstoff mit einer positiven Nettoladung behandelt worden ist. Ein Quantum vorher gewaschener und präparierter Erythrozyten, Blutplättchen oder Lymphozyten wird zu jeder mit Farbstoff beschichteten Vertiefung zugegeben. Die Zellen werden auf die Oberfläche der Mikroplatten-Vertiefungen zentrifugiert, wo sie ionisch, nicht-kovalent, an die mit Farbstoff beschichtete Vertiefung binden und daran immobilisiert werden. Überschüssige ungebundene Zellen werden von Hand oder durch eine Vorrichtung weggewaschen. Ein Quantum an Patienten- oder Donor-Serum oder Plasma wird zu der Zell-beschichteten Vertiefung zugegeben und erlaubt für einen ausreichenden Zeitraum zu inkubieren. Wenn für die Zellen spezifische Antikörper in der Patienten-Probe anwesend sind, binden sie immunologisch an die Monoschicht von Zellen. Nicht spezifische oder ungebundene Antikörper und andere Komponenten in den Proben werden weggewaschen.
- Um die Anwesenheit von an die Zellen gebundenen Antikörpern nachzuweisen, werden rote Indikator-Blutkörperchen zu den Mikroplatten-Vertiefungen zugegeben und zentrifugiert. Rote Indikator- Blutkörperchen sind Erythrozyten, die mit Anti-Immunglobulin- Molekülen beschichtet worden sind. Wenn die Patienten-Probe Antikörper enthielt, die für die Zell-Monoschicht spezifisch sind, wird das Anti-Immunglobulin auf den Indikator-Zellen an dem Antikörper (Immunglobulin) haften, der an die Zell-Monoschicht gebunden ist, was die Adhäsion der Indikator-Zelle an die Monoschicht veranlaßt; dies ist eine positive Reaktion. Wenn keine Antikörper in der Patienten-Probe für die Zell-Monoschicht spezifisch waren, werden die Anti-Immunglobulin-Indikatorzellen nach Zentrifugationen in einen diskreten und unterscheidbaren Klumpen am Boden der Vertiefung pelletieren; dies ist eine negative Reaktion.
- Die Erfindung umfaßt auch Kits zur Durchführung von Adhäsions- Immunoassays roter Zellen in fester Phase für die Bestimmung von Immunglobulinen (Antikörpern) in Patienten- oder Donor-Seren. Insbesondere sind die Immunoassay-Kits zum Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern bestimmt, die für Erythrozyten, Blutplättchen oder Lymphozyten spezifisch sind. Der Kit umfaßt eine Mikrotiter-Platte mit einer Vielzahl von Vertiefungen mit U-förmigen Böden. Die Mikroplatte ist mit einem organischen Farbstoff, der eine positive Nettoladung aufweist, nach der erfindungsgemaßen Lehre behandelt worden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der verwendete Farbstoff Alcian-Gelb. Die Mikrotiter-Platte wird in einer versiegelten Folie oder einem Plastikbeutel, der oder dem ein Trocknungsmittel beigegeben worden ist, geliefert. Der Kit enthält weiterhin ein Gefäß mit einer Lösung niedriger Ionenstärke, die Glycin, FD&C Violet #1 als Farbstoff und ein Konservierungsmittel, vorzugsweise Natriumazid in 0,1%, enthält; eine Suspension von roten Indikator-Zellen, die mit einem Anti-Human-Immunglobulin beschichtet sind und in einer gepufferten Lösung mit Konservierungsmitteln, vorzugsweise Chloramphenicol in 0,25 mg/ml und Neomycin-Sulfat in 0,1 mg/ml, in einem versiegelten Gefäß suspendiert sind; und Gefäße, die bekannte Antikörper zu den behandelten Zellen, Erythrozyten, Lymphozyten oder Blutplättchen, in mindestens zwei verschiedenen Konzentrationen enthalten, um sie als positive Kontrollen zu verwenden, und auch ein Gefäß, das keine Antikörper enthält, als negative Kontrolle. Die Kits können Gefäße bereitstellen, welche die Zellen enthalten, mit denen eine Mikrotiter- Platte beschichtet werden soll, um die Monoschicht der Zellen für den Assay zu bilden. Auch ein Buch oder eine Informationsbroschüre wird zur Verfügung gestellt werden.
- Die folgenden Beispiele dienen nur zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung.
- Um einen Immunoassay zum Nachweis von Antikörpern, die für Antigene auf der Oberfläche von Erythrozyten spezifisch sind, durchzuführen, wird eine Mikrotiter-Platte mit einer Vielzahl von Vertiefungen mit U-förmigen Böden in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und luftgetrocknet. Eine Lösung von Phthalocyaninblau wird durch Auflösen des Farbstoffs in isotonischer Salzlösung bis zu einer Konzentration von 100 mg/ml hergestellt. 250 ul der Farbstoff- Lösung werden zu den Vertiefungen zugegeben und 15 Minuten lang inkubiert. Überschüssiger Farbstoff wird dann unter Verwendung einer automatischen Waschvorrichtung, z.B. das Bio-Tek Modell EL 402, weggewaschen. Eine Lösung von suspendierten Erythrozyten wird in PBS gewaschen, um kontaminierende Proteine zu entfernen. Ein Quantum der Zell-Suspension wird zu jeder Vertiefung zugegeben und die Mikroplatte in einer Sorval GLC-2B mit einem Rotor, der die Mikroplatte aufnehmen kann, zentrifugiert. Die Zentrifugation wird bei 190xg 5 Minuten lang durchgeführt. Überschüssige oder ungebundene Zellen werden durch 4-6 maliges Waschen mit isotonischer Salzlösung unter standardmäßiger Verwendung der automatischen Waschvorrichtung entfernt. Als nächstes wird ein Quantum der Untersuchungsprobe in verschiedenen Verdünnungen zu den Vertiefungen zugegeben. Der Probe wird erlaubt, in den Vertiefungen bis zu 15 Minuten bei 37ºC zu inkubieren. Die überschüssige Untersuchungsprobe wird entfernt und die Platte 4-6 mal in isotonischer Salzlösung gewaschen. Jede Vertiefung wird dann auf die Anwesenheit von Antikörpern, die an Antigene auf der Oberfläche der Zellen gebunden sind, durch beliebige Standard-Immunoassay- Verfahren wie ELISA untersucht.
- Die Lehre der vorliegenden Erfindung kann in Assays zur Bestimmung des Blutgruppen-Typs von menschlichen roten Blutkörperchen angewandt werden. Eine Mikrotiter-Platte wird wie in Beispiel 1 präpariert. Ein Quantum von menschlichen roten Blutkörperchen der Gruppe A wird zu einigen der mit Farbstoff beschichteten Vertiefungen zugegeben und mittels Zentrifugation erlaubt, daran anzuhaften und immobilisiert zu werden. Überschüssige Zellen werden durch eine automatische Waschvorrichtung weggewaschen. Die Zell- Monoschichten werden mit Anti-A-Immunglobulin sensibilisiert und gewaschen, um überschüssiges Immunglobulin zu entfernen. Ein weiterer Satz von Vertiefungen wird auf eine ähnliche Weise mit menschlichen Zellen der Gruppe B vorbereitet, die mit Anti-B- Immunglobulinen sensibilisiert wurden.
- Eine Probe von roten Blutkörperchen unbekannten Typs wird zu den Vertiefungen zugegeben und 1 Minute lang zentrifugiert. Wenn die Zellen der Probe Gruppe A-Zellen sind, werden sie an das Anti-A- Immunglobulin auf der Zell-Monoschicht haften und damit eine positive Reaktion für den Bluttyp der Gruppe A zeigen. Gruppe A- Zellen werden nicht an das Anti-B-Immunglobulin auf der Zell-Monoschicht der Gruppe B haften und eine negative Reaktion wird durch einen diskreten Klumpen am Boden der Mikroplatten-Vertiefung nach der Zentrifugation angezeigt.
- Ein Kit, der die erfindungsgemäße Lehre verkörpert, kann zum Nachweis von unerwarteten IgG-Antikörpern für Erythrozyten zusammengestellt werden. Eine Mikrotiter-Platte mit einer Vielzahl von Vertiefungen mit U-förmigen Böden wird mit dem organischen Farbstoff Alcian-Gelb beschichtet. Etwa 35-50 ul einer Lösung von gewaschenen und suspendierten roten Blutkörperchen wird zu einer Gruppe von Vertiefungen in der Platte zugegeben. Die Platte wird 5 Minuten lang bei 190xg zentrifugiert. Überschüssige ungebundene Zellen werden entfernt und die Platte 4-6 mal mit isotonischer Salzlösung gewaschen. Die Waschungen werden durch standardmäßige Verwendung einer automatischen Waschvorrichtung durchgeführt. Dies verringert das Risiko einer Kontaminierung der Platte und für den Techniker, der den Assay durchführt. 70-100 ul einer Lösung mit niedriger Ionenstärke wird zu jeder Vertiefung zugegeben. 35-50 ul eines bekannten Standards oder einer Probe der Patienten- oder Donor-Seren oder Plasma werden dann zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platte wird mindestens 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Mischung wird von der Platte dekantiert und nochmals 4-6 mal mit isotonischer Salzlösung wie oben gewaschen. 35-50 ul roter Indikator-Blutkörperchen, die vorher mit Kaninchen-Anti-Human-IgG sensibilisiert worden sind, werden zu den Vertiefungen zugegeben. Die Platte wird sofort bei etwa 450xg 1 Minute lang zentrifugiert. Die Platte wird auf eine beleuchtete Oberfläche gebracht und auf die Adhäsion oder Abwesenheit von Adhäsion an die Monoschicht der roten Zellen untersucht. Eine positive Reaktion wird durch Adhäsion der Indikator-Zellen über die Reaktionsoberfläche angezeigt. Eine negative Reaktion erzeugt einen diskreten Klumpen von roten Indikator-Zellen am Boden der Vertiefungen, die keine Adhäsion zeigen.
- Um einen Immunoassay zum Nachweis von Antikörpern durchzuführen, die spezifisch sind für Antigene auf der Oberfläche von Human- Astrocytoma-Zellen, die in Gewebekultur gezüchtet worden sind, wird eine Lösung von Phthalocyaninblau durch Auflösen des Farbstoffs in einer isotonischen Salzlösung in einer Konzentration von 1 mg/ml hergestellt. 300 ul der Farbstofflösung werden zu Mikrotiter- Plattenvertiefungen mit U-förmigen Böden zugegeben und bis zu 30 Minuten lang inkubiert. Überschüssiger Farbstoff wird mittels einer automatischen Mikroplatten-Waschvorrichtung weggewaschen. Eine Lösung von suspendierten Astrocytoma-Zellen in Gewebekulturfluid wird in PBS gewaschen, um kontaminierende Proteine zu entfernen. Ein Quantum der Zellsuspension wird zu jeder mit Phthalocyaninblau beschichteten Vertiefung zugegeben und die Mikroplatte in einer Sorval GLC-2B mit einem Rotor zentrifugiert, der imstande ist, die Mikroplatte aufzunehmen. Die Zentrifugation wird bei 190xg 5 Minuten lang durchgeführt. Ungebundene Zellen werden durch Waschen mit PBS unter Verwendung einer automatischen Mikroplatten-Waschvorrichtung entfernt. Als nächstes wird ein Quantum der Untersuchungsprobe, von der man annimmt, daß sie für Astrocytoma-Antigene spezifische Human-Antikörper enthält, zu den Vertiefungen zugegeben. Der Probe wird erlaubt, in den Vertiefungen 30 Minuten lang bei 37ºC zu inkubieren. Überschüssige Untersuchungsprobe wird entfernt und die Platte 4-6 mal mit PBS gewaschen, 35-50 ul roter Indikator-Blutkörperchen, die vorher mit Kaninchen-Anti-Human- Immunglobulin sensibiliert wurden, werden zu den Vertiefungen zugegeben. Die Platte wird sofort bei 450xg 1 Minute lang zentrifugiert. Die Platte wird auf Adhäsion oder fehlende Adhäsion an die Astrocytoma-Zell-Monoschicht untersucht. Eine positive Reaktion wird durch Adhäsion der Indikator-Zellen über die Reaktionsoberfläche angezeigt. Eine negative Reaktion erzeugt einen diskreten Klumpen von roten Indikator-Zellen am Boden der Vertiefungen, die keine Adhäsion zeigen.
Claims (13)
1. Artikel zur Durchführung immunologischer Assays in fester
Phase, welcher umfaßt:
einen Festphasen-Träger;
eine Beschichtung eines organischen Farbstoffs mit einer positiven
Nettoladung und einer hydrophoben aromatischen Ringstruktur, der an
den Träger adsorbiert ist;
und eine Monoschicht ganzer Zellen, die an den organischen
Farbstoff immobilisiert sind.
2. Artikel nach Anspruch 1, worin der Träger aus organischem
Polymer oder Glas ist.
3. Artikel nach Anspruch 1 oder 2, worin der Träger aus
Teströhrchen, Mikrotiter-Platten, Kügelchen, flächigem Material und
Membranen ausgewählt ist.
4. Artikel nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche,
worin der Farbstoff ausgewählt ist aus Azofarbstoffen,
Diazoniumsalzen, Tetrazoniumsalzen, Tetrazoliumsalzen, Triphenylmethanen,
Xanthenen, Acridinen, Chinolinen, Thiazolen, Indaminen, Azinen,
Aminoazinen, Thiazinen und Phthalocyaninen.
5. Artikel nach Anspruch 4, worin der Farbstoff eine
Azoverbindung mit der Formel C&sub3;&sub8;H&sub4;&sub2;N&sub8;S&sub4;Cl&sub2; oder ein Phthalocyanin der
Formel
ist, worin X eine Onium-Gruppe mit der folgenden Struktur ist:
6. Artikel nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche,
worin die ganzen Zellen Säugerzellen sind.
7. Artikel nach Anspruch 6, worin die Zellen Erythrozyten,
Lymphozyten, Leukozyten, Blutplättchen oder Gewebezellen sind.
8. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit einer
immunologisch-reaktiven Komponente in einem biologischen Fluid durch den
Nachweis der Adhäsion der Komponente an ganze Zellen, umfassend die
Schritte:
Inkontaktbringen des biologischen Fluids mit einem Artikel nach
irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche für einen ausreichenden
Zeitraum, um der Komponente in dem Fluid zu erlauben, an die ganzen
Zellen zu binden;
Entfernen überschüssigen Fluids von dem Artikel;
und Untersuchen auf die Anwesenheit der gebundenen Komponente.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Komponente
Antikörper umfaßt, welche an Oberflächen-Antigene auf den ganzen Zellen
binden.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, worin die ganzen Zellen
wie in Anspruch 6 oder 7 definiert sind und die Komponente ein
Antikörper ist, der in Serum oder Plasma vorhanden und für die
ganzen Zellen spezifisch ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Anwesenheit der
Komponente durch die Zugabe von roten Indikator-Blutkörperchen
nachgewiesen wird.
12. Verfahren zur Herstellung eines Artikels nach
irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die Schritte:
Inkontaktbringen des Farbstoffs und des Trägers für einen Zeitraum,
der zur Adsorption des Farbstoffs an den Träger ausreicht;
Spülen des Trägers, um nicht-adsorbierten Farbstoff zu entfernen;
und Inkontaktbringen der ganzen Zellen und des mit Farbstoff
beschichteten Trägers für einen ausreichenden Zeitraum, um die
ganzen Zellen zu immobilisieren.
13. Verfahren nach Anspruch 12, worin der Farbstoff wie in
Anspruch 5 definiert ist und in Form einer Lösung in einer
Konzentration von 1 ug/ml bis 1 mg/ml verwendet wird.
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