DE60320009T2

DE60320009T2 - Transplantat-Akzeptanz-induzierende Zellen monozytären Ursprungs, sowie deren Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE60320009T2
Application number: DE60320009T
Authority: DE
Inventors: Bernd Karl Friedrich Kremer; Fred FÄNDRICH; Maren Schulze
Original assignee: Blasticon Biotechnologische Forschung GmbH
Current assignee: Blasticon Biotechnologische Forschung GmbH
Priority date: 2002-07-12
Filing date: 2003-07-11
Publication date: 2009-05-20
Anticipated expiration: 2023-07-12
Also published as: AU2003250939A1; EP1557462A2; ATE390480T1; IL172854A0; JP2005532803A; SI1644484T1; PT1644484E; NO20050719L; CN1681918A; AU2003250939B2; US20060286670A1; EP1492869B9; ES2310711T3; EP1557462A3; ES2304647T3; CA2492383A1; PT1557462E; WO2004007701A1; IL166021A0; DK1492869T3

Description

Die Erfindung betrifft Transplantat-Akzeptanz-induzierende Zellen monozytären Ursprungs, sowie deren Herstellung, und deren Verwendung zur Erzeugung von Transplantat-Akzeptanz.
Vorzugsweise betrifft die Erfindung Transplantat-Akzeptanz-induzierende Zellen (im folgenden auch TAIC genannt), die sich von humanen Monozyten ableiten.
Die Erfindung beschreibt ferner den monoklonalen Antikörper GM-7, der spezifisch erfindungsgemäße Transplantat-Akzeptanz-induzierende Zellen erkennt, die aus dem Menschen abgeleitet sind.
Die Erfindung beschreibt außerdem die Verwendung des Antikörpers GM-7 zum Nachweis und/oder zur Selektion von Transplantat-Akzeptanz-induzierenden Zellen.
Der Begriff "Transplantation" wird in der Immunologie für den Transfer von Zellen, Geweben oder Organen von einem Körper-Bereich in den anderen verwendet. Der Bedarf für Transplantationen ergibt sich aus der Erkenntnis, dass zahlreiche Erkrankungen durch die Übertragung (Transplantation) von gesunden Organen, Geweben oder Zellen von einem diesbezüglich gesunden Individuum – dem Donor – auf ein an der jeweiligen Erkrankung leidendes Individuum – den Empfänger oder Wirt – geheilt werden können.
Abhängig von dem Verhältnis zwischen Donor und Empfänger, unterscheidet man die folgenden Transplantattypen:

1. Autologe Transplantate: Hierbei handelt es sich um Gewebe oder Zellen, die innerhalb ein- und desselben Individuums von einem Körperbereich in den anderen transplantiert werden.
2. Isologe Transplantate: Hierbei handelt es sich um den Transfer zwischen genetisch identischen Individuen. Beispiele hierfür sind Inzuchtstämme von Ratten oder Mäusen. Bei Menschen kommen isologe (syngene) Transplantate zwischen genetisch identischen (monozygoten) Zwillingen in Betracht.
3. Allogene Transplantate: Dieser Begriff bezeichnet Transplantate zwischen genetisch unterschiedlichen Mitgliedern der gleichen Spezies, wie beispielsweise von einem menschlichen Individuum zu einem anderen, oder bei Versuchstieren von einem Inzuchtstamm zum anderen.
4. Xenologe Transplantate: Hierbei handelt es sich um den Transfer zwischen verschiedenen Spezies, wie beispielsweise die Übertragung eines Affenherzens in einen Menschen.

In der Regel erzeugen autologe und isologe Transplantate keine immunologischen Probleme im Sinne einer Abstoßungsreaktion. Dies gilt jedoch nicht im Falle von allogenen und xenologen Transplantaten. Derartige Transplantate werden von dem Immunsystem des Empfängers als fremd erkannt und nach verhältnismäßig kurzer Zeit abgestoßen. Bei der allogenen/xenologen Abstoßungsreaktion spielen die T-Lymphozyten (nachfolgend als T-Zellen bezeichnet) eine zentrale Rolle. Diese Zellen erkennen die fremden Zellen anhand von deren Haupthistokompatibilitäts-Komplexen (MHC = major histocompatibility complex). Der fremde MHC-Komplex sensibilisiert die antigen-reaktiven T-Zellen des Empfängers, und anschließend führen die auf diese Weise aktivierten T-Zellen zur Zerstörung der Donor-Zellen bzw. des Spendergewebes. Zellen mit unterschiedlichen MHC-Komplexen werden auch als "MHC-different" bezeichnet.
Die Transplantation von allogenen oder xenogenen Zellen, Geweben oder Organen führt zwangsläufig zum gemeinsamen Vorhandensein von Zellen zweier unterschiedlicher Individuen, d. h. von MHC-differenten Zellen im Blut des Wirtes. Dieses Phänomen bezeichnet man als "Chimerismus". Man unterscheidet Mikro- und Makrochimerismus. Als Mikrochimerismus wird ein Zustand bezeichnet, bei dem vom Spender abgeleitete Zellen beispielsweise nach Blut- oder Knochenmarkstransfusion oder nach Transplantation Lymphozyten-reicher Organe wie Dünndarm oder Leber, in dem MHC- fremden Wirt zwar persistierend aber nur vereinzelt nachweisbar bleiben. Von Makrochimerismus wird dann gesprochen, wenn mehr als 5% der im Empfänger gefundenen Zellen vom Spender abstammen, wobei in beiden Fällen zwischen Blut- und Organ-Chimerismus mit entsprechendem Nachweis von Spenderzellen im Blut oder in den Organen des Empfängers zu unterscheiden ist.
In gewissem Umfang kann Chimerismus zur Entstehung von Toleranz gegenüber Transplantaten führen. So wurde bei Personen, die sich beispielsweise infolge einer Leukämie oder Lymphomerkrankung einer allogenen Knochenmarktransplantation mit weitgehend übereinstimmendem MHC-Muster zwischen Spender und Empfänger unterziehen mussten, nach entsprechender myeloablativer Konditionierung (Zerstörung des eigenen Knochenmarks und der daraus abgeleiteten Blutzellen) und nachgeschalteter Stammzell-Transplantation, ein "Spenderchimerismus" beobachtet wurde. Bei diesen Patienten stammten mehr als 99% der im Blut nachweisbaren Zellen aus den Stammzellen des Spenders, und dieser Chimerismus bildete die Grundlage für Toleranz gegenüber allen von diesem Spender transplantierten Organen. Diese Beobachtung wurde in einer Reihe von klinischen Beispielen von nachgeschalteten Nieren-, Leber- und Lungensegmentspenden bestätigt [Dey B., et al., "Outcomes of Recipients of both bone marrow and solid Organ transplants: A review." Medicine (Baltimore) 77, 355–369 (1989)]. Für die Toleranzinduktion ist es in diesem Zusammenhang nicht entscheidend, dass ein kompletter Spenderchimerismus – definiert als das Vorhandensein von mehr als 90% Spenderzellen im peripheren Blut eines allogenen Empfängers – vorliegt, sondern es hat sich erwiesen, dass eine Fraktion von 5% Spenderzellen – bezeichnet als "gemischter" Chimerismus – ausreicht, um Toleranz zu induzieren [vgl. Übersicht bei Acholonu I. N. und Ildstad S. T., "The role of bone marrow transplantation and tolerance: Organ-specific and cellular grafts", Curr. Opin. Organ. Transplant 4, 189–196 (1999)].
Prinzipiell wurde damit zwar belegt, dass der mit einer Knochenmarktransplantation (KMTx) einhergehende Spenderchimerismus Toleranz induziert, dessenungeachtet war es jedoch bisher nicht möglich, bei vollständig MHC-differenten Spender- und Empfänger- Konstellationen eine erfolgreiche allogene KMTx durchzuführen. Dies beruht auf der Tatsache, dass die hierfür benötigte Vorbereitung, d. h. die Konditionierung des Empfängers (siehe oben), drei wesentliche Gefahren für den Empfänger birgt. Zum einen führt die Knochenmarktoxizität der angewendeten Chemotherapeutika, die mit oder ohne zusätzliche Bestrahlung verabreicht werden, zu einer erheblichen Morbidität; zum anderen besteht die Gefahr der Abstoßung des transplantierten Knochenmarks trotz vorheriger Konditionierung; und schließlich besteht das Risiko einer Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung, bei der sich die mit dem Transplantat in den Wirt übertragenen T-Zellen gegen den Organismus des Wirts wenden (GvHD = graft versus host disease) [vergl. Wolff S. N., "Hematopoietic cell transplant from volunteer unrelated or partially matched related donors: Recent developments." Curr. Opin. Organ. Transplant 5, 372–381 (2000)]. Diese Erkrankung tritt immer dann ein, wenn das Immunsystem des Empfängers durch die vorherige Konditionierung so geschwächt ist, dass die mit dem Knochenmark übertragenen T-Zellen eine letale Abstoßung im Empfänger auslösen können.
Zur Vermeidung der oben aufgezeigten Probleme herrschen derzeit Bestrebungen, die Konditionierung des Empfängers möglichst schwach zu gestalten. Je größer jedoch die MHC-Differenz zwischen Spender und Empfänger ist, desto stärker muss die Konditionierung gewählt werden, um die Abstoßung des transplantierten Knochenmarks zu verhindern; damit steigt gleichzeitig wieder das Risiko der Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung (GvHD).
Es ist bisher nicht genau untersucht worden, für welche Zeit der induzierte Chimerismus im Empfängerblut nachweisbar bleiben muss, um eine stabile Toleranzsituation für ein Spenderorgan zu gewährleisten. Zuverlässige Daten aus dem Mausmodell sprechen jedoch dafür, dass bereits ein 2 Wochen lang nachweisbarer Makrochimerismus zur Toleranzentstehung ausreicht [Weckerle, T. et al. "Allogenic bone marrow transplantation with co-stimulatory blockade induces macrochimerism and tolerance without cyto-reductive host treatment." Nat. Med. 6, 464–469 (2000)].
Die Notwendigkeit zur Entwicklung von Alternativen zu den derzeit verfügbaren Immunsuppressiva zur Erzeugung von Toleranz ergibt sich unter zwei wesentlichen Gesichtspunkten. Zum einen sind die bisher klinisch verfügbaren Immunsuppressiva nicht in der Lage, die chronische Transplantatabstoßung zu verhindern, und zum anderen gehen mit der permanenten Einnahme von Immunsuppressiva erhebliche Nebenwirkungen einher, die den Patienten gegenüber viralen, bakteriellen und mykotischen Infektionen anfällig machen, und die durch Malignomentstehung und durch Erkrankungen des Herzkreislaufsystems, insbesondere durch Herzinfarkte und durch Herzinsuffizienz [vgl. Wheeler, D. C. und Steiger, J. "Evolution and Etiology of Cardiovascular Diseases in Renal Transplant Recipients" Transplantation 70, 41–45 (2000)] erhebliche Gefährdungen erzeugen.
Munn et al. haben eine Makrophagen-induzierte T-Zellensuppression beschrieben, die auf der selektiven Eliminierung von Tryptophan und/oder Steigerung einer oder mehrerer Tryptophanmetaboliten in der Umgebung der Zellen beruht [vgl. Munn et al. "Inhibition of T Cell Proliferation by Macrophage Tryptophan Catabolism" J. Exp. Med. 189, 1363–1372 (1999)]. Ausgehend von dieser Beobachtung schlagen die Autoren vor, T-Zell-vermittelte Immunreaktionen durch Modifikationen der lokalen extrazellulären Tryptophankonzentration zu modifizieren, insbesondere durch Inhibieren oder Steigern des IDO-vermittelten Tryptophan-Metabolismus, vgl. beispielsweise die US-Patente 6,482,416 und 6,451,840 . Dieser Ansatz stellt somit nur eine weitere Antigen-unabhängige und unspezifische gegen T-Zellen gerichtete Immunsuppression zur Verfügung.
Es wird daher dringend ein klinisch umsetzbares Konzept zur Induktion Spender-spezifischer Toleranz benötigt, d. h., ein Konzept, wonach die Immunantwort des Wirts gegenüber den Gewebeantigenen, die auf dem von dem Spender übertragenen Organ vorhanden sind, spezifisch unterdrückt wird, bei dem jedoch ansonsten die Immunkompetenz des Wirts vollständig erhalten bleibt.

Durch ein derartiges Konzept würde sich auch mittelfristig eine deutliche Senkung der Diskrepanz zwischen Organbedarf und Organangebot ergeben, da auf diese Weise weitaus weniger Organe durch akute und chronische Abstoßungsvorgänge verlorengehen würden. Der Mangel an verfügbaren Organen sei anhand einer Statistik aus den USA vom Februar 2001 erläutert:

Transplantat-Typ	Zahl der wartenden Patienten
Niere	47.996
Leber	17.151
Bauchspeicheldrüse	1.060
Bauchspeicheldrüseninselzelle	185
Niere-Bauchspeicheldrüse	2.442
Darm	151
Herz	4.222
Herz-Lunge	210
Lunge	3.721
Gesamtzahl der Patienten 7	4.800

Tabelle 1: Aktuelle Daten aus der "UNOS (United Nations Organ Share Registry) National Patient Waiting List for Organ Transplant (Februar 2001)"

Auf diese Weise erklären sich die immensen nationalen und internationalen Bemühungen, Konzepte für die Induktion Spender-spezifischer Toleranz zu entwickeln.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, Mittel zur Verfügung zu stellen, mittels derer die T-Zellen des Empfänger-Organismus auf solche Weise beeinflusst werden, dass sie die jeweiligen fremden Zellen, Gewebe oder Organe langfristig ohne Abstoßung tolerieren bzw. akzeptieren. Die Beschaffenheit dieser Mittel sowie ihre Erzeugung oder Verwendung sollten dabei keine ethischen und/oder rechtlichen Probleme verursachen, und sie müssen schnell für den geplanten Therapieeinsatz in den dazu erforderlichen Mengen und zu vertretbaren Herstellungskosten erzeugt werden können.
Zur Lösung der Aufgabe dienen die erfindungsgemäßen Transplantat-Akzeptanz-induzierenden Zellen (TAIC) monozytären Ursprungs aus vertebraten Lebewesen, besonders aus Säugern und insbesondere aus Menschen. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass erfindungsgemäß modifizierte Monozyten aus dem Blut des Spenders (Organ-Donors) in der Lage sind, bei prä- und/oder post-operativer Gabe den Empfängerorganismus vor dessen Körper-eigenen, durch den fremden MHC-Komplex aktivierten T-Zellen zu schützen und damit die Abstoßung des Transplantats zu verhindern. Die modifizierten Zellen lösen bei bestimmungsgemäßer Verwendung zur Induktion von Transplantat-Toleranz als "zelluläre Therapeutika" keine oder keine nennenswerten Nebenwirkungen im Sinne der zellulären Abstoßung, der Induktion von Tumoren, insbesondere von bösartigen Tumoren, und der Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung in dem jeweiligen Patienten aus.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur in vitro Modifikation von Monozyten in solcher Weise führt, dass Zellen erhalten werden, die die Eigenschaften aufweisen, nach der Injektion in einen nicht-immunsupprimierten allogenen Empfänger die natürlicherweise einsetzende Immunantwort gegen Zellen oder Gewebe des Spenders abzuwehren, und die so in der Lage sind, für mindestens 3 Wochen im peripheren Blut zu zirkulieren. Nach Gabe von etwa 10⁵ Zellen/kg Körpergewicht (KG) liegt der resultierende Chimerismus von GM-7 positiven Zellen, siehe unten, im Bereich von 5–20%. Dieser transiente Chimerismus induziert

a) Langzeitakzeptanz für nachgeschaltete Organtransplantationen vom gleichen Spender, vorzugsweise innerhalb von 10 Tagen nach intravenöser Gabe der Zellen, und
b) Langzeitakzeptanz in Verbindung mit kurzfristiger immunsuppressiver Behandlung bei Verwendung der Zellen im Anschluß an die Organtransplantation.

Wie in Beispiel 10 gezeigt, ist der immunsuppressive Effekt der erfindungsgemäßen Zellen nicht mit der Makrophagen-induzierten T-Zellsuppression durch Expression des Tryptophan abbauenden Enzyms Indolamin-2,3-Diogenase (IDO) verbunden, wie sie von Munn et al. (siehe oben) beobachtet wurde. Die erfindungsgemäßen TAIC induzieren vielmehr eine spezifische Toleranz gegen den Donor in dem Empfänger, indem sie einerseits alloreaktive T-Zellen inaktivieren, und andererseits die Bildung regulatorischer T-Zellen in dem Rezipienten induzieren, vgl. Beispiele 12 und 13.
Von Monozyten abgeleitete Makrophagen, welche die Proliferation von T-Zellen durch eine IDO-vermittelte Eliminierung von Tryptophan in der Umgebung der Zellen inhibieren, sind daher nicht Teil der Erfindung.
Beschreibung der Figuren
1: Durchflußzytometrische Bestimmung der Bindungsfähigkeit von GM-7 an monozytäre Ursprungszellen vor (linke Graphik) und nach (rechte Graphik) der erfindungsgemäßen Modifikation der Zellen. Die x-Achse gibt die Anzahl der gebundenen Zellen wieder.
2A: Kaplan-Meier-Überlebenskurven von Herztransplantaten nach heterotopen Herztransplantationen mit und ohne prä-operative Gabe von aus dem Spender abgeleiteten TAIC im Rattenmodell (n = 10 Tiere pro Gruppe).
2B: Histologisches Präparat eines LEW-Allotransplantats am 150. POT (postoperativen Tag) nach heterotoper Transplantation in das Abdomen einer DA-Empfängerratte, die am Tag –7 mit 10⁶ LEW-abgeleiteten TAIC vorbehandelt worden war. Vergrößerungsfaktor: 40.
2C: Histologisches Präparat aus dem Thymus einer mit 10⁶ LEW-abgeleiteten TAIC vorbehandelten DA-Ratte nach Markierung des Präparats mit dem für LEW-MHC-Klasse I spezifischen monoklonalen Antikörper I 1.69. Vergrößerungsfaktor: 40.
2D: Durchflußzytometrischer Nachweis von Spender-abgeleiteten Zellen in vier nicht immunsupprimierte DA-Empfängerratten nach Injektion von LEW-abgeleiteten TAIC (Ratten 1–3: 10⁶ Zellen/kg × KG; Ratte 4: 10⁴ Zellen/kg × KG).
3: Kaplan-Meier-Überlebenskurven von Herztransplantaten nach heterotopen Herztransplantationen mit und ohne post-operative Gabe von aus dem Spender abgeleiteten TAIC in Verbindung mit einer initialen Gabe von 4 Zyklen Cyclosporin A (CSA; 5 mg/kg × KG) im Rattenmodell (n = 6–10 Tiere pro Gruppe).
4A–C: Kaplan-Meier-Überlebenskurven von Herz-(A), Leber-(B) und Nieren-(C) Transplantaten nach heterotopen (A und C) bzw. orthotopen (B) Transplantationen mit und ohne prä-operativer Gabe von aus dem Spender abgeleiteten TAIC (n = 6 Tiere pro Gruppe).
4D–F: Histologische Präparate von DA-Transplantaten der Niere (D), der Leber (E) und der Haut (F) nach heterotoper Transplantation in eine LEW-Empfängerratte.
5A: Kaplan-Meier-Überlebenskurven von Herztransplantaten nach heterotopen Herztransplantationen verschiedener Inzuchtstamm-Kombinationen mit und ohne post-operative Gabe von aus dem Spender abgeleiteten TAIC in Verbindung mit einer initialen Gabe von 4 Zyklen CSA (5 mg/kg × KG) im Rattenmodell (n = 6 Tiere pro Gruppe).
5B: Kaplan-Meier-Überlebenskurven von Herztransplantaten nach heterotopen Herztransplantationen 7 Tage nach Gabe von unterschiedlich präparierten Blutmonozyten aus LEW-Spendertieren (n = 6 Tiere pro Gruppe).
6A: Kaplan-Meier-Überlebenskurven von Lungentransplantaten nach orthotopen linksseitiger Lungentransplantationen in Schweinen ("outbred minipigs") unter Verwendung einer Tripleimmunsuppression aus CSA, Azathioprin (AZA) und Steroiden (STE). (n = 4 Tiere pro Gruppe).
6B: Röntgenthoraxaufnahmen (posterior-anterior-Technik) von zwei einseitig links lungentransplantierten Schweinen ("outbred minipigs") am 41. bzw. 55. POT. Die Tripleimmunsuppression aus CSA, AZA und Steroiden wurde 28 Tage nach Transplantation abgesetzt.
7: Gemischte Lymphozytenkultur aus CD14⁺-Monozyten eines Individuums B (GM-T^–: graue Säule; GM-7⁺: schwarze Säule), Responderzellen eines MHC-diskordanten Spenders A und bestrahlten Zellen eines Spenders C zum Vergleich der Suppressoraktivität von CD14⁺/GM-7⁺- und CD14⁺/GM-7^–-Zellen.
8: Gemischte Lymphozytenkultur von PHA-stimulierten Lymphozyten (PhaLy) und TAIC ("Mo+Ly" oder "Mo"), in zwei Experimenten präinkubiert mit einem Inhibitor (1-MT) Indolamin-2,3-dioxygenase (IDO) zur Untersuchung des Einflusses von 1-MT auf die Suppressoraktivität der TAIC.
9: Flüssigkeits-zytometrische Bestimmung der Menge von CD14⁺-Monozyten und von CD2⁺-Lymphozyten in der Monozytenfraktion sowie der Menge der CD-14⁺/CD3⁺-Zellen, die als TAIC effektiv sind, zur Untersuchung des Einflusses der Reinigung der Zellen zum Anreichern von Monozyten zu Beginn der Kultivierung auf die Bildung von immunsuppressiven CD14⁺/CD3⁺-Zellen.
10: Flüssigkeits-zytometrische Bestimmung von GM-7-Expression im Blut von Patienten postoperativ vor (linke Figur) und nach (rechte Figur) Injektion von TAIC, zur Untersuchung des Einflusses von TAIC auf die in vivo GM-7-Expression in Blutzellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die wesentlichen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von TAIC monozytären Ursprungs umfassen:

(a) Isolieren von Monozyten aus Blut, vorzugsweise aus humanem Blut;
(b) Vermehren der Monozyten in einem geeigneten Kulturmedium, welches ein wachstumsförderndes Mittel, vorzugsweise den Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor (nachfolgend als M-CSF bezeichnet) enthält;
(c) Stimulation der Monozyten mit γ-Interferon (nachfolgend als γ-IFN bezeichnet); und
(d) Gewinnung der in Stufe c) gebildeten Transplantat-Akzeptanz-induzierende Zellen durch Abtrennen der Zellen von dem Kulturmedium.

Es konnte erfindungsgemäß gezeigt werden, dass die Stimulierung mit γ-IFN einen entscheidenen Schritt bei der Herstellung der TAIC darstellt (vgl. Beispiel 7).
In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "TAIC" (transplant acceptance inducing cells of monocytic origin = Transplant-Akzeptanz-induzierende Zellen monozytären Ursprungs) diejenigen Zellen in der Population, welche in Stufe (d) des oben beschriebenen Verfahrens gewonnen werden. Diese Zellpopulation umfaßt neben den aus Monozyten abgeleiteten Zellen, welche erfindungsgemäß wirksam sind, auch Lymphozyten, vgl. Beispiel 11, sowie optional weitere aus dem Buffy-Coat stammende Zellen, wie beispielsweise Granulozyten. Die Menge der von Monozyten abgeleiteten Zellen innerhalb der TAIC-Population beträgt vorzugsweise 50 bis 90%, in besonders bevorzugter Weise 60 bis 70%, bezogen auf die gesamte Zellzahl.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "gesamte Zellzahl" die Menge der vitalen Zellen in der jeweils betrachteten Zellpopulation. Diese Menge kann mittels der "trypan blue dye exclusion technique" (Trypanblaufärbungs-Ausschlußverfahren) bestimmt werden, da dieser Farbstoff die Unterscheidung zwischen vitalen Zellen und nicht vitalen Zellen mit optischen Mitteln erlaubt.
Die TAIC gemäß der Erfindung werden zur Herbeiführung von Transplantat-Akzeptanz in der Regel in einer Menge von 10⁴–10⁶ Zellen je Kilogram Körpergewicht, vorzugsweise 10⁵ Zellen je Kilogramm Körpergewicht, eingesetzt. Die Gabe der TAIC kann mehrfach erfolgen, vorzugsweise bei großer MHC-Differenz dreimal im Abstand von etwa 10 Tagen, wobei die Verabreichung der Zellen vor oder nach der Transplantation stattfinden kann (siehe unten). Die hierzu erforderliche Gesamtzellzahl kann innerhalb von 6 bis 8 Tagen nach Blutabnahme kostengünstig bereitgestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Zellen (TAIC) haben sich im Tierversuch und in Kultur als risikolos bezüglich der Malignom-Entstehung erwiesen, ein Ergebnis, welches aufgrund der Natur der monozytären Ursprungszelle, von der die erfindungsgemäßen Zellen abgeleitet sind, auch nicht anders zu erwarten war.
Wie unten erläutert, können weitere Sub-Populationen von Zellen mit optimierter Wirksamkeit entsprechend der Erfindung aus der in TAIC vorhandenen Zellfraktion isoliert werden, welche von Monozyten abgeleitet ist.
Nach in vitro Kultivierung und Stimulation der Ursprungszellen (Monozyten) mit γ-Interferon entsteht eine Subpopulation von TAIC, siehe Beispiel 9, die den monoklonalen Antikörper GM-7 bindet, der von der Hybridomzellinie DSM ACC2542 gebildet wird. Bei dem monoklonalen Antikörper GM-7 handelt es sich um einen Antikörper vom Immunglobulin Isotyp IgG_2a, dessen leichte Kette den kappa-Isotyp besitzt. Charakteristisch für diesen Antikörper ist seine stringente Bindungsfähigkeit an die durch die erfindungsgemäßen Kulturbedingungen modifizierten Monozyten, da die monozytäre Ursprungszelle nicht erkannt wird, d. h. eine Bindung des Antikörpers an die Ursprungszelle findet nicht statt, (siehe Beispiel 9). Darüber hinaus wurde an 20 freiwilligen Probanden gezeigt, dass GM-7 auch nicht an humane Zellen im peripheren Blut bindet, siehe 10.
Der Antikörper wurde durch Immunisieren von Mäusen mit von humanen Monozyten abgeleitetetn TAIC nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt (Davis, W. C. "Methods in Molecular Biology: Monoclonal Antibody Protocols", New York: Humana Press Inc. Totowa, 1995). Durch Fusion einer den Antikörper produzierenden B-Zelle und einer Myelomzelle aus der Maus wurde im folgenden eine Hybridomazellinie hergestellt. Verfahren, die der Herstellung solcher Zellinien dienen, sind im Stand der Technik bekannt (Davis, W. C. "Methods in Molecular Biology: Monoclonal Antibody Protocols", New York: Humana Press Inc. Totowa, 1995; Kohler, G., Milstein, C. "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specifity", Nature 256, 495–497 (1975)). Die den Antikörper GM-7 produzierende Hybridomazellinie wurde nach den Vorschriften des Budapester Vertrages bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland) unter der Nummer DSM ACC2542 hinterlegt (Datum der Hinterlegung: 13. Mai 2002).
1 zeigt die in der Durchflußzytometrie ermittelte Bindungsfähigkeit von GM-7 an monozytäre Zellen nach erfindungsgemäßer in vitro Modifikation. Es läßt sich erkennen, dass die direkt aus Buffy-coat gewonnenen CD14-positiven Monozyten den Antikörper GM-7 nicht binden (die grau unterlegte Wolke ist deckungsgleich mit der nicht unterlegten Antikörperkontrolle). Dagegen exprimieren ein Teil der Monozyten nach Kultivierung in Gegenwart von M-CSF und Stimulation mit γ-IFN ein Antigen, welches vom monoklonalen GM-7 Antikörper erkannt wird. Der monoklonale Antikörper GM-7 wurde als Isotyp κ-IgG_2a charakterisiert. Das erfindungsgemäße Verfahren führt somit zur Änderung des phenotypischen Musters der Antigenexpression auf der Zellmembran der modifizierten Monozyten (1).
Der monoklonale Antikörper GM-7 bindet spezifisch an diejenige Zellpopulation, die unter denjenigen Zellen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugt worden sind, die wirkungsvollste Transplantat-Akzeptanz-induzieren (vgl. Beispiel 9).
Die Erfindung beschreibt daher solche TAIC, die an den Antikörper GM-7 binden können. Diese Zellen werden nachfolgend als TAIC_GM7 bezeichnet.
Der Antikörper GM-7 repräsentiert somit ein außerordentlich wirksames und leicht handhabares Mittel zur Selektion und Aufreinigung der die Transplantat-Akzeptanz-induzierenden Zellen (TAIC). Mit Hilfe des Antikörpers läßt sich eine homogene und hochwirksame TAIC-Population generieren.
Die in Stufe c) des oben beschriebenen Verfahrens gebildeten Transplantat-Akzeptanz-induzierenden Zellen, welche zur Antigen- Bindung an den Antikörper GM-7 befähigt sind, im Anschluß an die Stufe c) direkt aus dem Kulturmedium selektieren, oder man kann sie aus der Zellpopulation selektieren, die nach Trennung der Zellen von dem Kulturmedium entsprechend der Stufe d) des oben beschriebenen erfindungsgemässen Verfahrens durch Bindung an den von der Hybridomzellinie DSM ACC2542 produzierten Antikörper GM-7 erhalten werden.
Zur Selektion wird der Antikörper mit der Probe unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine Bindung des Antikörpers an die in der Probe befindlichen Transplantat-Akzeptanz-induzierenden Zellen erlauben. Die aus der Bindung resultierenden Reaktionskomplexe werden anschließend von der Probe separiert. Zu diesem Zweck kann der Antikörper vor dem Kontakt mit der Probe auf einem Trägermaterial immobilisiert werden; er kann beispielsweise an eine für chromatographische Zwecke verwendbare Matrix oder an sog. "magnetic beads" gebunden werden. Dieses Vorgehen ermöglicht, Transplantat-Akzeptanz-induzierende Zellen aus großen Probenvolumina zu selektieren und anzureichern.
Zur Gewinnung der Transplantat-Akzeptanz-induzierenden Zellen wird nach der Separierung des Reaktionskomplexes von der Probe die Bindung zwischen Antikörper und Transplantat-Akzeptanz-induzierenden Zellen gelöst. Dies kann nach im Stand der Technik bekannten Methoden wie z. B. durch kompetitive Verdrängung oder durch Waschen mit Salzlösungen erfolgen. Entsprechende Verfahren sind beispielsweise von Utz U. et al. ("Analysis of the T-cell Receptor repertoire of human T-cell leukemia virus type-1 (HTLV-1) Tax-specific CD8+ Cytotoxic T Lymphocytes from patients with HTLV-1 associated disease: Evidence for the oligoclonal expansion" J. of Virology Feb. 1996, 843–851) beschrieben.
Der monoklonale Antikörper GM-7 erlaubt ferner den qualitativen und quantitativen Nachweis der Transplantat-Akzeptanz-induzierenden Zellen monozytären Ursprungs in Blut- und/oder Gewebeproben des Patienten in vitro. Bei diesem Patienten kann es sich beispielsweise um den Empfänger eines noch zu transplantierenden oder eines bereits transplantierten Organs handeln. Die Bildung von Reaktionskomplexen in der Probe, die das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge der Transplantat-Akzeptanz-induzierenden Zellen anzeigen, wird mittels bekannter Verfahren nachgewiesen.
Zum Nachweis der Reaktionskomplexe kann vorliegend beispielsweise der Antikörper GM-7 direkt mit einem nachweisbaren Molekül gekoppelt ("markiert") werden, das z. B. kovalent an den Antikörper gebunden wird. Geeignete nachweisbare Moleküle sind auf dem Gebiet der molekularen Diagnostik in großer Anzahl beschrieben und umfassen u. a. Fluoreszenzfarbstoffe, wie beispielsweise Fluorescein-Isothiocyanat oder Tetramethylrhodamin-5-isothiocyanat, Lumineszenzfarbstoffe, radioaktiv markierte Moleküle und Enzyme, wie beispielsweise Peroxidasen (vgl. Lottspeich, F., Zorbas, H. "Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin, 1998).
Der Nachweis des Antikörpers erfolgt in Abhängigkeit des Moleküls, das zu seiner Markierung gewählt wurde. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde der Antikörper GM-7 mit dem fluoreszierenden Molekül Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) gekoppelt, sodass der Nachweis des Antikörpers mittels Durchflußzytometrie und/oder Fluoreszenzmikroskopie erfolgen konnte. Verfahren zur Markierung von Antikörpern mit FITC sind dem auf dem Gebiet tätigen Fachmann bekannt.
Alternativ kann der Reaktionskomplex auch in einem zweistufigen Verfahren mit Hilfe von sekundären Antikörpern nachgewiesen werden. Dabei kann der unmarkierte Antikörper GM-7 im Reaktionskomplex mit einem weiteren, markierten Antikörper nachgewiesen werden (vgl. Lottspeich, F., Zorbas, H. "Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin, 1998). Dieses zweistufige Nachweisverfahren ist erheblich empfindlicher als der direkte Bindungsnachweis des Antikörpers, da mehrere markierte sekundäre Antikörper an einen GM-7-Antikörper binden können (Signalverstärkung).
Der Antikörper GM-7 erlaubt demgemäß den Nachweis von TAIC im peripheren Blut der mit TAIC behandelten Patienten, beispielsweise in Form eines "monitoring", bei dem in definierten Zeitabständen die Anzahl der Zellen im peripheren Blut bestimmt wird. Es wurde erfindungsgemäß gezeigt, dass die Gegenwart von TAIC, die aus Monozyten des Spenders hergestellt wurden, im peripheren Blut des Transplantatempfängers im Tierversuch mit Toleranz des transplantierten Organs korreliert. Diese Erkenntnis erlaubt dem Kliniker daher das Ausschleichen, d. h. die stufenweise Reduktion der Dosis gegebenenfalls verabreichter Immunsuppressiva. Bisher war es aus klinischer Sicht nicht möglich, gezielte Aussagen darüber zu treffen, ob das Immunsystem eines Patienten zu einem gegebenen Zeitpunkt nach Transplantation Toleranz aufweist.
Wie für den Fachmann ersichtlich, können auch monoklonale Antikörper gegen TAIC aus Monozyten nicht-humaner Vertebraten, insbesondere aus erfindungsgemäß modifizierten Monozyten von Primaten und Schweinen, hergestellt werden. Dabei erfolgt die Immunisierung der entsprechenden Wirtstiere und die Generierung der jeweiligen Hybridom-Zellinien wie oben für die TAIC humanen Ursprungs beschrieben. Die Generierung von wirkungsvollen TAIC-Populationen aus anderen Spezies leistet einen bedeutenden Beitrag auf dem Gebiet der xenologen Transplantionsmedizin.
Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass monoklonale Antikörper gegen TAIC aus Monozyten auch nicht humaner Vertebraten hergestellt werden können, insbesondere von Monozyten von Primaten und Schweinen, die erfindungsgemäß modifiziert wurden. In diesem Zusammenhang wird die Immunisierung der entsprechenden Wirtstiere und die Generierung der entsprechenden Hybridom-Zellinien ausgeführt, wie oben für die TAIC humanen Ursprungs beschrieben. Die Generierung wirksamer TAIC-Populationen aus anderen Spezies stellt einen wichtigen Beitrag im Bereich der xenogenetischen Transplantationsmedizin dar.
Die Erfindung beschreibt auch eine Sub-Population der TAIC, welche die Antigene CD3 und CD14 auf ihrer Zelloberfläche ko-exprimiert. Diese Zellen werden nachfolgend als TAIC_CD3+/CD14+ bezeichnet. Derartige Zellen sind bisher nicht im Stand der Technik beschrieben worden. Monozyten und bekannte, von Monozyten abgeleitete Zellen tragen den CD14-Marker auf ihrer Oberfläche, sie tragen jedoch nicht gleichzeitig den zusätzlichen Oberflächenmarker CD3.
TAIC, welche die Oberflächenantigene CD3 und CD14 ko-exprimieren, können entweder direkt aus den in Stufe c) des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens gebildeten Transplant-Akzeptanz-induzierenden Zellen selektiert werden, oder sie können aus der Zellpopulation selektiert werden, die nach Trennung der Zellen aus dem Kulturmedium entsprechend Stufe d) des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen werden, oder sie können alternativ aus der TAIC_GM7-Population selektiert werden.
Es konnte ferner gezeigt werden, dass die TAIC_CD3+/CD14+ die Gene Foxp3, CTLA4 und Integrin α_Eβ₇ stark exprimieren (vgl. Beispiel 12). Im Gegensatz dazu, werden diese Gene von den Ursprungsmonozyten nicht oder nur in geringem Umfang exprimiert. Die Hochregulation der Expression der Gene Foxp3, CTLA4 und Integrin α_Eβ₇ bildet daher ein Charakteristikum von TAIC_CD3+/CD14+-Zellen.
Wie in Beispiel 12 diskutiert, ist bisher die Expression der Marker Foxp3, CTLA4 und Integrin α_Eβ₇ nur für regulatorische T-Lymphozyten beschrieben worden. T-Lymphozyten, welche die Oberflächengene CD4 und CD25 ko-exprimieren, bilden eine Sub-Population der regulatorischen T-Lymphozyten, welche auch als "Suppressorzellen" bezeichnet werden. Ihre Funktion ist die Suppression der Immunantwort im Körper. Insbesondere wird Foxp3 als ein spezifischer Transkriptionsfaktor angesehen, der als Kontrollgen für die Entwicklung regulatorischer T-Zellen dient, und der spezifisch von diesen Zellen exprimiert wird. Die TAIC_CD3+/CD14+-Zellen mindestens 1 × 10^–9, vorzugsweise mindestens 5 × 10^–9, und in besonders bevorzugter Weise mindestens 1 × 10^–8 μg Foxp3-RNA je μg Gesamt-RNA exprimieren.
CTLA4 wird ebenfalls als Marker für den Nachweis der regulatorischen Funktion von T-Lymphozyten angesehen, insbesondere von CD4/CD25 positiven T-Lymphocyten (vgl. Literatur zitiert in Beispiel 12). Die TAIC_CD3+/CD14+-Zellen sollten mindestens 5 × 10^–7, in bevorzugter Weise mindestens 3 × 10^–6 und in besonders bevorzugter Weise 5 × 10^–6 μg CTLA4-RNA je μg Gesamt-RNA exprimieren.
Integrin α_Eβ₇, welches epitheliales Cadherin erkennt, wurde kürzlich von Lehmann et al. in PNAS 99, Seiten 13031–13036 (2002) als ein neuer Marker für eine Sub-Population hochpotenter regulatorischer T-Lymphozyten beschrieben, welcher mit der epithelialen Umgebung interagiert. Die Expression von Integrin α_Eβ₇-RNA sollte erfindungsgemäß in TAIC_CD3+/CD14+-Zellen vorzugsweise 1 × 10^–12, insbesondere mindestens 1 × 10^–11, in besonders bevorzugter Weise mindestens 1 × 10^–10, und in meist bevorzugter Weise mindestens 1 × 10^–9 μg je 1 μg Gesamt-RNA betragen.
Wie in Beispiel 12 in der Tabelle gezeigt, führt die direkte Ko-Kultivierung von erfindungsgemäßen TAIC mit Lymphozyten zu einer erheblichen Steigerung der Zahl an regulatorischen T-Lymphozyten, insbesondere an CD4/CD25 doppelt-positiven Zellen in der Lymphozytenpopulation mit stark hochregulierter Expression der Foxp3, CTLA4 und Integrin α_Eβ₇. Das Beispiel zeigt ferner, dass dieser Effekt nicht beobachtet wird, wenn TAIC indirekt mit Lymphozyten ko-kultiviert werden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Stimulierung der Bildung und/oder Vermehrung von regulatorischen T-Lymphozyten durch TAIC mit der Induktion von Transplant-Akzeptanz durch die erfindungsgemäßen TAIC im Zusammenhang steht.
Beispiel 13 bestätigt diese Hypothese. In diesem Beispiel wurden Lymphozyten aus den Empfängertieren der Beispiele 3, 4, 5, 6 und 7 mit TAIC aus den jeweiligen Donor-Tieren in vitro inkubiert. Für die Induktion der Toleranz wurden TAIC, die mit Lymphozyten aus den Empfängern vorinkubiert waren, den Tieren anstelle von TAIC injiziert. Auf diese Weise konnte Donor spezifische Toleranz induziert werden, während Tiere, denen Empfänger-Lymphozyten verabreicht wurden, die nicht mit Donor abgeleiteten TAIC ko-kultiviert waren, keine Toleranz erzeugten.
Die erfindungsgemäßen TAIC können als solche in pharmazeutischen Präparaten verwendet werden. Die aus Stufe d) des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Zellen können direkt verwendet werden. Etwa 10 bis 50 der gesamten Zellen der so erhaltenen Populationen werden von Lymphozyten und Granulozyten gebildet, welche aus dem ursprünglichen Monozytenisolat (Buffy-Coat) stammen. Diese Zellen unterstützen die Bildung der von Monozyten abgeleiteten TAIC der Erfindung in der Kultivierungsstufe (vgl. Beispiel 11); sie interferieren nicht mit der Toleranzinduktion, wenn die erfindungsgemäßen TAIC als pharmazeutisches Präparat verwendet werden. Die Sub-Populationen TAIC_GM7 und/oder TAIC_CD3+/CD14+ können jedoch aus der Gesamtheit der TAIC-Population isoliert werden, welche mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde (siehe oben), und sie können zur Toleranzinduktion verwendet werden.
In Kulturmedium (vgl. Beispiel 2) können die TAIC oder die Sub-Populationen TAIC_GM7 und/oder TAIC_CD3+/CD14+ mindestens 48 Stunden lang gehalten werden, ohne ihre Toleranz induzierende Wirkung zu verlieren.
Für den Einsatz als pharmazeutisches Präparat können die TAIC oder die Sub-Populationen TAIC_GM7 und/oder TAIC_CD3+/CD14+ suspendiert in z. B. humanem AB-Serum (universal verwendbar) intravenös als Kurztransfusion verabreicht werden. Zur Induktion von Transplantat-Akzeptanz bei allogener Transplantation können die aus Monozyten des Spenders generierten TAIC oder die Sub-Populationen TAIC_GM7 und/oder TAIC_CD3+/CD14+ dem MHC-differenten Empfänger entweder prä-operativ oder post-operativ injiziert werden. Bei prä-operativer Verabreichung sollten die TAIC etwa 1 Woche vor der Operation ein- oder dreimal injiziert werden. Bei post-operativer Verabreichung sollte der Zeitraum zwischen Operation und der erstmaligen Verabreichung der Zellen nicht länger als 7 Tage betragen. Die erfindungsgemäßen TAIC oder die Sub-Populationen TAIC_GM7 und/oder TAIC_CD3+/CD14+ sind dann in der Lage, die T-Zell-Antwort des Immunsystems des Empfängers gegen das Transplantat abzuwehren und ausreichend lange im Empfängerblut zu persistieren, um langfristige Transplantat-Akzeptanz zu gewährleisten.
Die prä-operative intravenöse Injektion kommt im Rahmen von Lebendspenden in Betracht; wenn es sich hingegen um eine Leichenspende handelt, so ist die post-operative Verabreichung der erfindungsgemäßen TAIC oder der Sub-Populationen TAIC_GM7 und/oder TAIC_CD3+/CD14+ angezeigt. Im Falle einer Leichenspende wird der Körper des Spenders durch Kanülierung der Hauptschlagader mit einem Perfusionsmedium zur Organkonservierung durchspült. Hierbei wird das venöse Blut normalerweie über die Hohlvene abgesaugt und verworfen. Zur Gewinnung der erfindungsgemäß einzusetzenden TAIC kann das venöse Blut gesammelt und wie in Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet werden. Im Falle der Leichenspende können die TAIC alternativ auch aus Zellen (Lymphozyten und Monozyten) der Spender-Milz erhalten werden.
Bei postoperativer Applikation der erfindungsgemäßen TAIC im Rahmen der Leichenspende kann die Zeit zwischen Transplantation und Applikation der Zellen durch Kombination mit Immunsuppressiva überbrückt werden, um eine akute Abstoßung des Organs während des Intervalls zwischen Transplantation und Bereitstellung der aus dem Spenderblut gewonnenen TAIC zu vermeiden. In diesem Zusammenhang kommt die therapeutische Kombination mit herkömmlichen Immunsuppressiva, beispielsweise mit Calcineurin-Inhibitoren wie Cyclosporin A (CSA) oder Tacrolimus oder mit Azathioprin (AZA), Mykophenolatmophetil, Rapamycin, monoklonalen Antikörpern (ATG, ALG, Dicliziumab, Basiliximab) oder mit Steroiden (STE) in Betracht. Die Gegenwart der Immunsuppressiva (mit Ausnahme der bekannten IL-2-Receptor-α monoklonalen Antikörper, wie Dicliziumab und Basiliximab) im Empfängerblut übt keinen negativen Einfluss auf die Wirksamkeit der Immunsuppressiva einerseits oder der TAIC andererseits aus.
In diesem Sinne können die erfindungsgemäß modifizierten Zellen monozytären Ursprungs als "Vehikel zum Toleranztransfer" für jedes zelluläre Transplantat (wie beispielsweise Inselzellen, Hepatozyten, adulte Stammzellen und für jeden anderen programmierten Zelltyp bzw. Gewebetyp) und Organ (wie beispielsweise Niere, Leber, Herz) eingesetzt werden, soweit sie mit den zu transplantierenden Zellen (Organen) genetisch identisch sind, d.h., sie müssen vom Spender selbst oder von dessen identischem Zwilling stammen. Die TAIC erfüllen ihre protektive Funktion, indem sie das Anwachsen der transplantierten Zellen/Organe erlauben und damit dem Empfänger die Nebenwirkungen einer längerfristigen immunsuppressiven Therapie ersparen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren sind Blutmonozyten. Vorzugsweise handelt es sich um Monozyten aus menschlichem Blut. Zum Zwecke der Induktion von Transplantat-Akzeptanz müssen die Zellen vom Spender des Transplantats (oder von dessen identischem Zwilling) stammen. Bei xenologer Transplantation von beispielsweise Affen- oder Schweineorganen in Menschen, müssen die erfindungsgemäßen TAIC demgemäß von Monozyten des jeweiligen Spender-Tieres abgeleitet sein.
Zur Gewinnung der Monozyten kann das Blut zunächst nach üblicher Behandlung mit einem Antikoagulans auf bekannte Weise, vorzugsweise durch Zentrifugation, in Plasma sowie in weiße und rote Blutzellen getrennt werden. Nach der Zentrifugation findet sich das Plasma im Überstand; darunter liegt eine Schicht, welche die Gesamtheit der weißen Blutzellen enthält. Diese Schicht wird auch als "buffy coat" bezeichnet. Darunter befindet sich die rote Blutzellen enthaltende Phase (Hämatokrit).
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zunächst die "buffy coat"-Schicht isoliert und zur Gewinnung der Monozyten beispielsweise durch Zentrifugieren nach bekannten Verfahren aufgetrennt. Gemäß einer bevorzugten Verfahrensvariante wird die "buffy coat"-Schicht auf ein Lymphozyten-Separationsmedium (Ficoll-Hypac) geschichtet und zentrifugiert (vgl. Beispiel 1). Beispiel 1 beschreibt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, bei der Erythrozyten und tote Zellen, die in dem Buffy-Coat enthalten sind, durch Zentrifugieren abgetrennt werden, und die weißen Blutzellen einschließlich der Monozyten als Isolat auf dem Separationsmedium vorhanden sind. Danach kann die weiße Phase von Monozyten vorsichtig abpipettiert werden, und für die Anreicherung von Monozyten in dem Isolat wiederholt zentrifugiert und gewaschen werden. Im Laufe dieses Verfahrens, werden sich die Monozyten zusammen mit einem Teil der Lymphozyten am Boden des Zentrifugationsgefäßes sammeln.
Entsprechend einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, werden die Bedingungen zur Gewinnung des die Monozyten enthaltenden Isolats so kontrolliert, dass das Isolat etwa 10 bis 50% Lymphozyten neben den Monozyten, bezogen auf die Gesamtzahl der Zellen, enthält. Vorzugsweise enthält das Isolat 50 bis 90%, und in besonders bevorzugter Weise 60 bis 70% Monozyten und etwa 10 bis 50%, in bevorzugter Weise 20 bis 50% Lymphozyten, jeweils bezogen auf die Gesamtzellzahl, wobei die Differenz gegebenenfalls durch Granulozyten gebildet werden kann.
Wie in Beispiel 11 gezeigt, führt die Gegenwart von Lymphozyten in einer Größenordnung von 20 bis 30%, bezogen auf die gesamte Zellzahl, während der Kultivierung der Ursprungsmonozyten mit MCSF und γ-Interferon zur Bildung einer erheblich höheren Menge an CD3/CD14-doppelt-positiven TAIC, als wenn nur weniger Lymphozyten (5%) vorhanden sind.
Für die Herstellung einer ausreichenden Menge an TAIC ist es zunächst erforderlich, die Monozyten zu vermehren. Zu diesem Zweck können bekannte, für Monozyten geeignete Wachstumsmedien verwendet werden, das Medium muss jedoch einen für Monozyten geeigneten Wachstumsfaktor enthalten; erfindungsgemäß ist M-CSF (macrophagecolony-stimulating-factor) besonders bevorzugt. M-CSF (auch als CSF-1 bezeichnet) wird von Monozyten, Fibroblasten, Lymphozyten und endothelialen Zellen produziert. Die Konzentration von M-CSF in dem Kulturmedium kann von 2 bis 20 μg/l Medium, vorzugsweise 4 bis 6 μg/l und in besonders bevorzugter Weise 5 μg/l betragen.
Anschließend oder gleichzeitig müssen die Zellen mit γ-IFN stimuliert werden, d.h., in Gegenwart von γ-IFN kultiviert werden. Die Stimulierung der Monozyten mit y-IFN erfolgt nach einer 3 bis 6 Tage langen initialen Vermehrungsphase in dem den Wachstumsfaktor enthaltenden Kulturmedium. Vorzugsweise am 4. Tag nach Beginn der Kultivierung wird mit γ-IFN stimuliert und die Stimulierung erstreckt sich über einen Zeitraum von 24 bis 72 Stunden, vorzugsweise 48 Stunden, unter Brutschrankbedingungen, d.h., bei 37°C und 5% CO₂ Atmosphäre.
Die Konzentration von γ-IFN in dem Medium kann von 0,1 bis 20 ng/ml, vorzugsweise 1 bis 10 ng/ml und in besonders bevorzugter Weise 5 ng/ml betragen.
Die Stimulierung mit y-IFN kann gleichzeitig mit der Vermehrung der Monozyten in dem Wachstumsfaktor enthaltenden Medium beginnen. Die Stimulierung im Anschluß an eine 3 bis 6 Tage lange initiale Vermehrungsphase, wie oben angegeben, ist jedoch bevorzugt. Vermehrung der Zellen und Stimulierung mit γ-IFN sollten insgesamt nicht mehr als 8 Tage in Anspruch nehmen. In jedem Falle sollte die Behandlung mit γ-IFN im Anschluß an die Vermehrungsphase über mindestens 24 Stunden, maximal 72 Stunden, vorzugsweise 48 Stunden durchgeführt werden. Der Zeitraum für die Vermehrung und Stimulierung der Zellen sollte demnach ingesamt 4 bis 8 Tage betragen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Vermehrung und die Stimulierung mit γ-Interferon wie in Beispiel 2 angegeben auf solche Weise durchgeführt, dass die Monozyten zunächst in einem den Wachstumsfaktor enthaltenden Kulturmedium vermehrt werden, und dem Kulturmedium nach 3 bis 6 Tagen γ-IFN in einer solchen Menge zugesetzt wird, dass eine Konzentration 0,1 bis 20 ng/ml, vorzugsweise 1 bis 10 ng/ml und in besonders bevorzugter Weise 5 ng/ml in dem Medium erreicht wird.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren in Kulturgefäßen durchgeführt, deren Oberfläche zuvor mit fötalem Kälberserum (FCS) oder alternativ mit humanem AB-Serum beschichtet wurde (vgl. Beispiel 2). Die Beschichtung mit FCS kann dadurch erfolgen, dass man die Oberfläche der Kulturgefäße vor Ingebrauchnahme mit FCS bedeckt, und nach einer Einwirkungszeit von einigen Stunden, insbesondere 4 bis 72 Stunden, vorzugsweise 12–48 Stunden, und in besonders bevorzugter Weise 24 Stunden, das nicht an der Oberfläche haftende FCS auf geeignete Weise entfernt. Während der Kultivierungs-Stufe setzen sich die Zellen nach etwa 24 Stunden am Boden des Kulturgefässes ab. Aufgrund ihrer adhäsiven Eigenschaften haften die Monozyten und die während des Verfahrens aus den Monozyten gebildeten TAIC am Boden des jeweiligen Kulturgefässes. Wenn das Kulturmedium, wie in Beispiel 2 beschrieben, während der Kultivierung gewechselt wird, wird der Überstand zunächst vorsichtig beispielsweise durch Pipettieren oder Dekantieren entfernt, und anschliessend frisches Kulturmedium eingefüllt. Vorzugsweise werden die am Boden haftenden Zellen jedoch nicht oder nur vorsichtig gewaschen, sodass vorhandene Lymphozyten nicht entfernt werden.
Die Ablösung der adhärenten Zellen kann auf mechanische Weise, beispielsweise mit einem feinen Zellschaber oder Spachtel erfolgen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die vollständige Ablösung der Zellen jedoch durch Behandlung mit einem geeigneten Enzym, beispielsweise mit Trypsin (vgl. Beispiel 2). Die Trypsinlösung (0,1 bis 0,025 g/l, vorzugsweise 0,05 g/l, kann 2 bis 10 Minuten lang bei 35°C bis 39°C, vorzugsweise bei 37°C, in Gegenwart von 5% CO₂ auf die Zellen einwirken.
Die Enzymaktivität wird sodann auf übliche Weise blockiert, und die nun frei flottierenden TAIC können auf übliche Weise durch Zentrifugieren gewonnen werden. Sie stehen nunmehr, entweder suspendiert in einem geeigneten Medium, beispielsweise in PBS, für den sofortigen Einsatz zur Verfügung. Sie können jedoch auch einige Tage lang, insbesondere etwa 2–3 Tage lang, in einem Nährmedium (vgl. Beispiel 2) gehalten werden, wobei dieses Aufbewahrungsmedium weder den Wachstumsfaktor noch γ-IFN enthalten sollte. In einem derartigen Nährmedium können die Zellen mindestens 48 Stunden lang als TAIC aufbewahrt werden.
Für die längere Lagerung können die Zellen tiefgefroren werden. Protokolle zum Tiefgefrieren lebender Zellen sind im Stand der Technik bekannt, vgl. Griffith M. et al., Epithelial Cell Culture, Cornea, in methods of tissue engineering, Atala A. und Lanza R. P., Academic Press 2002, Kapitel 4, Seiten 131–140. Ein bevorzugtes Suspensionsmedium zum Tiefgefrieren der erfindungsgemäßen Zellen ist DMSO enthaltendes FCS.
Die Zellsuspension, welche die Transplant-Akzeptanz-induzierenden Zellen aus den Stufen c) oder d) enthält, bezüglich solcher Zellen weiter gereinigt werden, welche den Antikörper GM-7 binden, um auf diese Weise eine Sub-Population TAIC_GM7 zu gewinnen. Verfahren für eine derartige Reinigung sind oben im Detail beschrieben.
Solche Zellen werden aus der TAIC-Population selektiert, welche die Antigene CD3 und CD14 auf ihrer Zelloberfläche ko-exprimieren. Verfahren zur Selektion derartiger Zellen sind im Stand der Technik bekannt. Beispiele für solche Verfahren zur Gewinnung der Monozyten aus dem Vollblut sind das "Fluorescent-Activating Cell Sorting" (FACS), das "Immuno Magnetic Bead Sorting" und "Magnetic Activated Cell Sorting" (MACS), oder das sogenannte "Rosetting-Verfahren", vgl. Gmelig-Meyling F. et al., "Simplified procedure for the separation of human T- und non-T-cells", Vox Sang. 33, 5–8 (1977).
Die Selektion der TAIC-Sub-Population TAIC_CD3+/CD14+ kann direkt aus der TAIC-Population aus den Schritten c) oder d) des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen, oder aus der TAIC_GM7-Sub-Population. Die letztgenannte Vorgehensweise bedeutet, dass eine schrittweise Anreicherung der TAIC_CD3+/CD14+ stattfindet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen TAIC per se zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die in vivo-Suppression von Transplantabstoßung eingesetzt.
Eine derartige pharmazeutische Zusammensetzung kann vitale erfindungsgemäße TAIC enthalten, die aus Stufe d) des erfindungsgemäßen Verfahrens, suspendiert in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, vorzugsweise in einer Menge von etwa 1 × 10⁵ bis 1 × 10⁷ Zellen/ml, und in besonders bevorzugter Weise von etwa 1 × 10⁶ Zellen/ml des Präparats stammen.
Die Zellen der TAIC_GM7-Sub-Population können per se zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die in vivo-Suppression von Transplantabstoßung eingesetzt werden.
Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können vitale TAIC_GM7-Zellen enthalten, welche den Antikörper GM-7 binden, und in einem pharmakologisch akzeptablen flüssigen Träger vorzugsweise in einer Menge von 1 × 10⁶ bis 1 × 10⁸ Zellen/ml und in besonders bevorzugter Weise von etwa 1 × 10⁶ Zellen/ml der Präparation enthalten sind.
Die Zellen aus der TAIC_CD3+/CD14+-Sub-Population können per se zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die in vivo-Suppression von Transplantabstoßung verwendet.
Derartige pharmazeutische Präparationen können vitale TAIC_CD3+/CD14+-Zellen, welche die Antigene CD3 und CD14 ko-exprimieren, in einer Menge von vorzugsweise 5 × 10⁵ bis 5 × 10⁷ Zellen/ml und in besonders bevorzugter Weise von etwa 5 × 10⁶ Zellen/ml der Präparation enthalten.
Die oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen können die erfindungsgemäßen Zellen suspendiert in einem physiologisch gut verträglichen Medium enthalten. Geeignete Medien sind beispielsweise Ringerlösung, physiologische Kochsalzlösung oder 5–20%ige Humanalbuminlösung und dergleichen.
Zellpräparate entsprechend der Erfindung können vitale TAIC enthalten, welche aus Stufe d) des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wurden. Alternativ, können die Präparate Zellen enthalten, welche zu den Sub-Populationen der TAIC_GM7-Zellen, welche den Antikörper GM-7 binden, oder der TAIC_CD3+/CD14+-Zellen, welche die Antigene CD3 und CD14 auf ihrer Oberfläche ko-exprimieren, gehören. Die Präparate können die jeweiligen Zellen in einer Menge von vorzugsweise mindestens 1 × 10⁵, in mehr bevorzugter Weise von mindestens 5 × 10⁵ und in am meisten bevorzugter Weise mindestens 1 × 10⁶-Zellen per ml, suspendiert in einem flüssigen Trägermedium, enthalten. Das Medium kann eine Zellkultur oder Transportmedium sein, das von Zellen gut toleriert wird, wie 15 bis 20%ige Humanalbuminlösung. Alternativ können die Zellen in dem Präparat tiefgefroren sein und in einem geeigneten Lagermedium, wie beispielsweise RPMI mit 50% Humanalbuminlösung und 10% DMSO enthalten sein.
Schließlich betrifft die Erfindung auch ein Verfahren, bei dem Transplantat-Akzeptanz-induzierende Zellen gemäß der Erfindung (TAIC, TAIC_GM7 oder TAIC_CD3+/CD14+) zum Generieren oder Expandieren regulatorische T-Lymphozyten in vitro verwendet werden. Wie in Beispiel 12 gezeigt, führt die direkte in vitro-Ko-Kultivierung von TAIC mit Lymphozyten zu einer signifikanten Proliferation regulatorischer T-Lymphozyten, insbesondere von CD4⁺/CD25⁺-Lymphozyten, vgl. Wood und Sakaguchi: "Regulatory Cells in Transplantation Tolerance", Nature Review Immunology 3, 199–210 (2003)". Es ist daher möglich, regulatorische T-Lymphozyten, insbesondere CD4⁺/CD25⁺-Lymphozyten durch direktes Ko-Kultivieren von TAIC mit Lymphozyten zu generieren und/oder zu expandieren, wie in Beispiel 12 beschrieben.
Direkte in vitro-Ko-Kultivierung bedeutet erfindungsgemäß, dass TAIC und Lymphozyten in direkten physischen Kontakt in dem gleichen Medium miteinander ko-kultiviert werden, wie es unter anderem in Beispiel 12 exemplifiziert ist.
Bei diesem Verfahren enthält das Medium vorzugsweise die jeweiligen Zellen, d. h. TAIC und Lymphozyten, in etwa gleicher Zellzahl, und jeweils in einer Menge von vorzugsweise mindestens 1 × 10⁵, mehr bevorzugt mindestens 5 × 10⁵ und in am meisten bevorzugter Weise mindestens 1 × 10⁶ Zellen je ml, suspendiert in einem flüssigen Trägermedium; das Medium kann ein Zellkulturmedium oder ein Transportmedium sein, das von Zellen gut toleriert wird, wie 5–20%ige Humanalbuminlösung. Die Ko-Kultivierung erfolgt vorzugsweise unter physiologischen Bedingungen bei etwa 37°C, beispielsweise in einem Inkubator, vorzugsweise 3–5, in mehr bevorzugter Weise 4 Tage lang.
Wie in Beispiel 13 gezeigt, kann Transplantat-Akzeptanz nicht nur durch Verabreichung von TAIC an den Empfänger induziert werden, welche aus Donormonozyten stammen, sondern auch durch die Rückverabreichung von Empfängerlymphozyten an den Empfänger, welche zuvor mit TAIC aus Donormonozyten wie oben beschrieben direkt in vitro ko-kultiviert worden sind.
Entsprechend einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können daher regulatorische T-Lymphozyten in vitro aus Lymphozyten hergestellt werden, die aus dem Empfänger eines Transplantats stammen, indem man Lymphozyten aus dem Empfänger direkt mit TAIC aus dem Donor des Transplantats ko-kultiviert. Rückverabreichung der ko-kultivierten Lymphozyten an den Empfänger wird, wie in Beispiel 13 gezeigt, zu einer Transplant-Akzeptanz bei dem Empfänger führen.
Die so hergestellten, von dem Empfänger stammenden regulatorischen T-Lymophozyten können durch FACS isoliert werden, wie hier beschrieben (siehe oben), und sie können in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vermeidung von Transplantabstoßung in dem Empfänger verwendet werden, wobei die Zellen in einem pharmakologisch akzeptablen Träger, wie oben beschrieben, suspendiert sind.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.
Wenn nicht in den Beispielen definiert, so ist die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Substanzen wie folgt:
1. Penicillin/Streptomycinlösung:
10 000 Einheiten Penicillin als Natriumsalz von Penicillin G and 1000 μg Streptomycin als Streptomycin-sulfat je ml physiologische Natriumchloridlösung (NaCl 0,85%) (Gibco Katalog No. 15140122).
2. Trypsin-EDTA
0,5 g Trypsin und 0,2 g EDTA (4 Na)/l
3. RPMI 1640 (1x, flüssig (11875))

enthält L-Glutamin

RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Medien 1640 sind angereicherte Formulierungen, die extensiv für Säugerzellen verwendet werden können.

Bestandteile	Mol.-Gewicht	Konz. (mg/l)	Molarität (nM)
Anorganische Salze
Calciumnitrat (Ca(NO₃)₂4H₂O)	236	100,00	0,424
Kaliumchlorid (KCl)	75	400,00	5,30
Magnesiumsulfat (MgSO₄)	120	48,84	0,407
Natriumchlorid (NaCl)	58	6000,00	103,44
Natriumbicarbonat (NaHCO₃)	84	2000,00	23,800
Natriumphosphat (Na₂HPO₄)	142	800,00	5,63
Weitere Bestandteile
Glukose	180	2000,00	11,10
Glutathion, reduziert	307	1,50	0,0032
Phenolrot	398	5,00	0,0125
Aminosäuren
L-Arginin	174	200,00	1,10
L-Asparagin	132	50,00	0,379
L-Asparaginisäure	133	20,00	0,150
L-Cysteindihydrochlorid	313	65,00	0,206
L-Glutamininsäure	147	20,00	0,136
L-Glutamin	146	300,00	2,05
Glycin	75	10,00	0,133
L-Histidin	155	15,00	0,0967
L-Hydroxyprolin	131	20,00	0,153
L-Isoleucin	131	50,00	0,382
L-Leucin	131	50,00	0,382
L-Lysinhydrochlorid	146	40,00	0,219
L-Methionin	149	15,00	0,101
L-Phenylalanin	165	15,00	0,0909
L-Prolin	115	20,00	0,174
L-Serin	105	30,00	0,286
L-Threonin	119	20,00	0,168
L-Tryptophan	204	5,00	0,0245
L-Tyrosindinatriumdihydrat	261	29,00	0,110
L-Valin	117	20,00	0,171
Vitamine
Biotin	244	0.20	0,008
D-Calciumpantothenat	477	0.25	0,0005
Cholinchlorid	140	3.00	0,0214
Folsäure	441	1.00	0,0022
i-Inositol	180	35.00	0,194
Niacinamid	122	1.00	0,0081
p-Aminobenzoesäure (PABA)	137	1.00	0,0072
Pyridoxin HCl	206	1.00	0,0048
Riboflavin	376	0.20	0,0005
Thiamin HCl	337	1.00	0,0029
Vitamin B12	1355	0.005	0,00000369

Referenz: Moore G. E., et al., J. A. M. A. 199: 519 (1967)

Bestandteile	g/l
KCl	0,2
KH₂PO₄	0,2
NaCl	8,00
Na₂PHO₄	1,15

5. Ficoll-Hypaque:
Lymphozytentrennmedium (Saccharose/Epichlorhydrin-Copolymerisat Mg 400,000; Dichte 1.077, eingestellt mit Natriumdiatrizoat).
6. L-Glutamin

Flüssig: 29,2 mg/ml

7. Macrophagenkolonie stimulierender Faktor (M-CSF)
Rekombinantes humanes M-CSF aus E. coli; enthält als Monomer (18,5 kD) 135 Amonosäurereste einschließlich des N-terminalen Methionin; liegt vor als Homodimer mit einem Molekulargewicht von 37 kD; (SIGMA Katalog No. M 6518)
8. γ-Interferon (γ-IFN)
Rekombinantes humanes γ-IFN aus E. coli; 16,7 kD Protein enthaltend 143 Aminosäurereste (CHEMICON Katalog No. IF002).
Beispiel 1
Abtrennen von Monozyten aus Gesamtblut
Zur Vermeidung der Blutgerinnung und zum Füttern der Zellen wurden 450 ml humanes Vollblut in einem 3-Kammerbeutel-Set mit 63 ml einer Stabilisator-Lösung vermischt, die je Liter H₂O 3,27 g Citronensäure, 26,3 g Trinatriumcitrat, 25,5 g Dextrose, und 22,22 g Natriumdihydroxyphosphat enthielt. Der pH-Wert der Lösung betrug 5,6–5,8.
Zur Blutkomponententrennung erfolgte anschließend eine »scharfe Zentrifugation« dieses Gemisches zur Blutkomponententrennung, bei 4000 rpm über 7 min bei 20°C. Hieraus resultierte eine 3-Schichtung der korpuskulären und nicht-korpuskulären Bestandteile. Durch Einsetzen des Beutelsets in eine dafür vorgesehene Preßmaschine wurden dann die Erythrozyten in den unteren Beutel, das Plasma in den oberen Beutel gepreßt und der sogenannte Buffy-coat verblieb im mittleren Beutel und enthielt ca. 50 ml Volumen.
Die Menge von 50 ml frisch gewonnenem Buffy-coat wurde nun in jeweils 2 Portionen á 25 ml geteilt und damit jeweils 25 ml Ficoll-Hypaque Separationsmedium überschichtet, welches zuvor in zwei 50 ml Falconröhrchen gefüllt worden war.
Dieser Ansatz wurde 30 Min. lang bei 2500 rpm ungebremst zentrifugiert. Im Buffy coat noch vorhandene Erythrozyten und tote Zellen lagen danach unterhalb der Ficoll-Phase, während die weißen Blutzellen einschließlich der Monozyten als weiße Interphase auf dem Ficoll separiert sind.
Anschließend wurde die weiße Interphase der Monozyten vorsichtig abpipettiert und mit 10 ml Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) gemischt.
Danach wurde dieser Ansatz dreimal 10 Min. lang bei 1800 rpm gebremst zentrifugiert, wobei der Überstand nach jeder Zentrifugation abpipettiert und mit frischem PBS aufgefüllt wurde.
Das am Boden des Zentrifugationsgefäßes (Falconröhrchen) gesammelte Zellpellet enthielt die mononukleäre Zellfraktion, d. h. die Monozyten.
Zur Herstellung der für die Rattenexperimente benötigten Monozyten, wurden jeweils aus 4 genetisch-identen Spenderratten 25 ml Vollblut isoliert und damit 25 ml Ficoll-Hypaque Seperationsmedium überschichtet. Es wurde dann analog wie oben beschrieben fortgefahren. Alternativ können analoge Trennschritte auf Ficoll auch auf Milz-Zellsuspensionen angewendet werden.
Beispiel 2
Vermehrung und Modifikation der Monozyten
Die Kultivierung und Vermehrung der Monozyten erfolgte in Nährmedium der folgenden Zusammensetzung:

RPMI 1640 Medium 440 ml

Foetales Kälberserum (FCS),

alternativ AB-Serum 50 ml

Penicillin/Streptomycin

Lösung 5 ml

Gesamtvolumen 500 ml

Das Nährmedium enthielt 2,5 μg/500 ml M-CSF
Die in Beispiel 1 isolierten Monozyten wurden in einer Menge von insgesamt 10⁶ Zellen in 10 ml des Nährmediums suspendiert und auf eine Petrischale (100 mm Durchmesser) übertragen. Die Petrischale war zuvor mit reinem inaktivierten FCS gefüllt und das FCS nach 24 Stunden abgegossen worden, um auf diese Weise eine FCS beschichtete Platte zu erhalten.
Die Petrischale wurde mit dem zugehörigen Deckel abgedeckt und 3 Tage lang in einem Brutschrank bei 37°C gehalten. Die Zellen setzten sich nach 24 Stunden am Boden der Petrischale ab. Am zweiten Tag wurde der Überstand abpipettiert und die Petrischale mit 10 ml frischem Nährmedium wieder aufgefüllt.
Am 4. Tag wurden 50 ng γ-Interferon in 10 ml Nährmedium zugesetzt und die Platte wurde wiederum verschlossen und weitere 48 Stunden lang bei 37°C im Brutschrank gehalten.
Nachfolgend wurden jeweils 10 ml einer 1:10 mit PBS verdünnten Trypsinlösung in die Petrischale pipettiert. Die geschlossene Petrischale wurde 10 Min. lang bei 37°C im Brutschrank gehalten. Anschließend erfolgte die Separation der auf dem Boden der Petrischale haftenden Zellen mit einem Zellschaber, derart, dass der größte Anteil (> 90%) der Zellen im Überstand flottierten.
Der gesamte Überstand (10 ml Trypsinlösung + 10 ml Medium) wurde abpipettiert, in einem 50 ml Falconröhrchen vereinigt und 10 Min. lang bei 1800 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde nachfolgend verworfen und der Niederschlag (das verbliebene Zellpellet) mit frischem Nährmedium (s. o.) versetzt, wobei pro 10⁶ Zellen 1 ml des Nährmediums zugesetzt wurden. Die Bestimmung der Zellzahl für die exakte Dosierung erfolgte nach bekannten Verfahren, vergl. Hay R. J., Cell Quantification and Characterisation, in Methods of Tissue Engineering, Academic Press 2002, Kapitel 4, S. 55–84.
Diese Zellsuspension wurde zentrifugiert (1800 rpm, 10 min, s. o.) und das Zellpellet wurde entweder in PBS oder zur Anwendung beim Menschen in NaCl (physiol.) aufgenommen. Danach kann die intravenöse Applikation direkt oder innerhalb von 48 Stunden erfolgen.
Alternativ wurden die Zellen nach Zentrifugation und Verwerfen des Trypsin enthaltenden Überstandes mit FCS/DMSO als Einfriermedium versetzt und in einem Volumen von 10 ml tiefgefroren.
Das Einfriermedium enthielt 95% FCS und 5% DMSO. Jeweils etwa 10⁶ Zellen wurden in 1 ml des Mediums aufgenommen und in folgenden Stufen abgekühlt:
30 Min. auf Eis;
2 Stunden bei –20°C im vorgekühlten Styroporkasten;
24 Stunden bei –80°C in Styropor;
Lagerung in Röhrchen in Flüssigstickstoff (N₂) bei –180°C.
1 belegt die mittels Durchflußzytometrie bestimmten phenotypischen Veränderungen der Antigenexpression auf den eingesetzten Monozyten nach Kultivierung und γ-IFN-Stimulation der monozytären Ursprungszellen.
Beispiel 3
Anwendung der Transplantat-Akzeptanz-induzierenden Zellen (TAIC) zur Präkonditionierung des Immunsystems des Transplantat-Empfängers
Die Anwendung von TAIC zur Behandlung eines potentiellen Empfängers vor der Transplantation bietet sich zum Beispiel für den klinischen Fall der Lebendspende an, wo bereits im Vorfeld einer Organtransplantation geklärt ist, wer spendet und wer das Spenderorgan erhält.
Für diesen Fall wurde im Rattenmodell die heterotope Herztransplantation an männlichen Inzuchtratten der Stammkombination LEW[RT1.¹] (im Rahmen der vorliegenden Erfindung als "LEW" bezeichnet) → DA[RT1.^av1] (im Rahmen der vorliegenden Erfindung als "DA" bezeichnet) in der von Ono und Lindsey beschriebenen Technik (Ref. Ono, K. & Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225–229 (1969)) durchgeführt. DA Empfängerratten erhielten zunächst am Tag –7 vor der Transplantation 10⁶ von LEW-Monozyten abgeleitete TAIC in 1 ml PBS intravenös verabreicht. Hiernach erfolgte sieben Tage später die Transplantation eines vom LEW-Rattenstamm entnommenen Herzens, welches heterotop in das Abdomen (Leibeshöhle) des DA-Empfängertieres eingepflanzt wurde. Da es sich bei den verwendeten Rattenstämmen um Inzuchtstämme handelt, exprimierten die erfindungsgemäßen TAIC die identischen Gewebeantigene wie das transplantierte LEW-Herz.
Zur Kontrolle erfolgte eine sogenannte Drittstammtransplantation. Hierbei wurden wiederum am Tag –7 (d. h. 7 Tage vor dem operativen Eingriff) vom gleichen LEW-Spendertier stammende TAIC (10⁶) intravenös in DA Tiere injiziert. Sieben Tage danach erfolgte die Transplantation eines von einem CAP[RT1.^c] (im Rahmen der vorliegenden Erfindung als "CAP" bezeichnet) Ratteninzuchtstamm entnommenen Herzens. CAP-Ratten exprimieren den Haplotyp RT1.^c, sind damit also voll MHC-diskordant (MHC-verschieden) mit den LEW-Spendertieren. Nachfolgend sind die einzelnen Versuchsgruppen, in denen eine heterotope Herztransplantation erfolgte (n = 10) dargestellt:

1. LEW → DA; unbehandelt;
2. LEW → DA; 10⁶ LEW-abgeleitete TAIC i.v., Tag –7 vor LEW-Herztransplantation;
3. CAP → DA; 10⁶ LEW-abgeleitete TAIC i.v., Tag –7 vor LEW-Herztransplantation;
4. CAP → DA; unbehandelt;
5. LEW → LEW, unbehandelt;
6. LEW → LEW, 10⁶ LEW-abgeleitete TAIC i.v., Tag –7, vor LEW-Herztransplantation.

Wie aus den Kaplan-Meier-Überlebenskurven der Herzorgane erkennbar (2A), wurden 9/10 LEW-Herzen von DA-Empfängertieren langzeit (> 150 Tage) akzeptiert, wogegen CAP-Drittstammherzen akut, nach 6,7 ± 0,8 Tagen abgestoßen wurden. Erfolgte keine vorherige Gabe von TAIC, so wurden auch die LEW-Herzen akut nach 7,2 ± 1,0 Tagen abgestoßen. Die Abstoßung von CAP Herzen durch die im DA-Tier stimulierte Immunantwort nach 6,7 ± 0,8 Tagen erfolgte im gleichen Zeitintervall wie in der unbehandelten Kontrollgruppe, in der CAP-Herzen von DA-Ratten nach 6,9 ± 1,0 Tagen abgestoßen wurden siehe Gruppe 3, respektive Gruppe 4. Alle syngen im LEW → LEW-Ansatz transplantierten Herzen überlebten langzeit (> 150 Tage), unabhängig davon, ob TAIC-Vorbehandlungen erfolgt waren oder nicht. Hieraus lässt sich der Schluß ziehen, dass TAIC den Empfängerorganismus nicht im Sinne einer graft-versus-host disease (Transplantat gegen Wirt Erkrankung) gefährden. Ferner lässt sich aus diesem Ergebnis ableiten, dass die i.v.-Gabe von 10⁶ TAIC 1 Woche vor Transplantation, die Möglichkeit zur Induktion von Langzeit-Organakzeptanz eröffnet. Die induzierte Toleranz ist dabei spenderspezifisch, da eine entsprechende Vorbehandlung von DA Ratten mit LEW-abgeleiteten TAIC keine Toleranz für CAP-Drittstamm-Herztransplantate induziert. Im syngenen LEW > LEW-Ansatz beeinflusst die zusätzliche TAIC-Gabe weder das Überleben der Empfängertiere noch der Transplantate.
2B zeigt die histologische Beurteilung eines LEW-Allotransplantats am 150. postoperativen Tag (POT) nach heterotoper Transplantation in das Abdomen einer DA-Empfängerratte. Die Empfängerratte war am Tag –7 vor der Transplantation mit 10⁶ LEW-abgeleiteten TAIC vorbehandelt worden. Das Transplantat wies bis zum Zeitpunkt seiner Entnahme aus der Empfängerratte (150. POT) eine gute Funktion (kräftiger Herzschlag) auf. Das histologische Präparat (× 40) zeigt eine intakte Herzmuskelmorphologie, normale Gefäßendothelien und nur minimale Infiltration mit mononuclearen Zellen ohne Hinweise für akute und chronische Abstoßungsvorgänge.
Bemerkenswert in diesem Zusammenhang ist auch die Tatsache, dass sich spenderabgeleitete Zellen (detektiert durch immunhistochemischen Nachweis mittels dem LEW-MHC-Klasse I-spezifischen Antikörper I1.69) langzeit, über ein Jahr, im Thymus der DA-Empfängerratten nachweisen lassen. 2C zeigt ein histologisches Präparat eines am 150. POT entnommenen Thymus einer mit 10⁶ LEW-abgeleiteten TAIC vorbehandelten DA-Ratte. Das Präparat wurde mit dem für LEW-MHC-Klasse I spezifischen monoklonalen Antikörper I 1.69 markiert. Wie der Figur zu entnehmen ist, führt die Gabe von TAIC zur Besiedlung der Thymusdrüse, wo die Präsentation von Spender-abgeleiteten MHC-Antigenen an die heranreifenden T-Zellen erfolgt; deutlich zu erkennen sind kleine Nester von Zellen, die sich mit dem Antikörper markieren lassen.
Beispiel 4
Nachweis von Spender-abgeleiteten modifizierten Monozyten im Empfänger
Als mögliche Ursache der erfindungsgemäß induzierten Toleranz kommt die Induktion eines gemischten Chimerismus in dem jeweiligen DA-Tier durch die intravenöse Injektion der LEW-abgeleiteten TAIC in Betracht. Es wurde daher geprüft, ob sich nach Injektion von LEW-abgeleiteten TAIC mittels Durchflußzytometrie langfristig (> 45 Tage) mehr als 5% Zellen im Blut des Empfängertiers nachweisen lassen. Die Durchflußzytometrie wurde wie im Stand der Technik beschrieben durchgeführt (Ref. Preffer FI, Flow cytometry In: Diagnostic Immunopathology, Colvin RB, Bhan AK, McCluskey, RT (eds.), Raven Press New York, pp. 725–449 (1994)). Der Nachweis der LEW-Spenderzellen im DA-Empfängerblut erfolgte durch den monoklonalen Antikörper I1.69, der LEW-MHC-Klasse I Antigene spezifisch detektiert (siehe Fändrich F, et al. Nature Med. 8, 171–178, 2002). Die Chimerismusdaten, welche für 4 in Beispiel 3 beschriebenen LEW → DA Transplantationen nach Gabe von 10⁶, respektive 10⁴ TAIC/kg × KG im peripheren Blut der Empfängertiere bestimmt wurden, sind in 2D wiedergegeben.
Nach Injektion von LEW-abgeleiteten TAIC in vier nicht immunsupprimierte DA Empfängerratten (10⁶ Zellen/kg × KG in Ratten 1–3 und 10⁴ Zellen/kg × KG in Ratte 4) zeigen die Ratten 1–3 einen längerfristigen Chimerismus (60–80 Tage) im DA-Empfängerblut, der sich auf Spender-abgeleitete Zellen zurückführen ließ. Der Nachweis von Spender-abgeleiteten Zellen erfolgte durch durchflußzytometrische Bestimmung unter Verwendung des LEW-MHC-Klasse I spezifischen Antikörper I1.69 (ein monoklonaler Antikörper, der nur an MHC-Klasse I positive Zellen vom LEW-Rattenstamm bindet und nicht mit Zellen vom DA-Rattenstamm kreuzreagiert). Da quasi alle Zellen des peripheren Bluts MHC-Klasse I Antigen auf der Zelloberfläche exprimieren, läßt sich der Anteil an Spenderzellen im peripheren Blut der DA Ratte mit I1.69 sehr genau bestimmen. Wie die Graphik gemäß 20 zeigt, exprimieren 3 von 4 Tieren innerhalb der ersten 6 Wochen nach intravenöser Injektion der TAIC mehr als 10% der Zellen das durch I1.69 markierte Spenderantigen. Ab Tag 60 nach Injektion fällt dieser Chimerismusanteil im peripheren Blut dieser DA-Ratten deutlich ab und verschwindet mit Tag 100 komplett. Dieser transiente Chimerismus korreliert aber streng mit dem Transplantatüberleben zweizeitig (d. h. 7 Tage nach TAIC-Injektion) transplantierter LEW-Herzen, die trotz fehlendem Spenderchimerismus (ab Tag 100) nicht mehr abgestoßen werden (im Beispiel Ratte 1–3). Hingegen kann die kurzfristige Chimerismusinduktion nach Gabe von 10⁹ Zellen/kg × KG (Ratte 4; < 20 Tage) keine langfristige Transplantat Akzeptanz des übertragenen Herzens gewährleisten.
Beispiel 5
Gabe von Spender-abgeleiteten Zellen post transplantationem
Für den klinischen Fall der Leichenspende sollte nun evaluiert werden, inwieweit die postoperative Gabe von TAIC in der Lage war, entsprechende Langzeitakzeptanz für das transplantierte Organ im Empfänger zu induzieren. Hierzu wurden im LEW → DA Ratteninzuchtstammmodell heterotope Herztransplantationen durchgeführt. Die DA Empfängerratten erhielten 4 Zyklen Cyclosporin A (CSA) an den Tagen 0, 1, 2 und 3 nach der Transplantation, intravenös, in der Dosierung 5 mg CSA/kg × KG. Am Tag 7 erfolgte dann die intravenöse Gabe von 10⁶ LEW-abgeleiteten TAIC, intravenös, in die Schwanzvene der DA-Empfängerratten. Als Kontrolle dienten folgende Versuchsgruppen (n = 6–10).

1. LEW → DA; unbehandelt
2. LEW → DA; CSA, 5 mg/kg × KG, i.v., Tag 0, 1, 2 und 3
3. LEW → DA; CSA, 5 mg/kg × KG, i.v., Tag 0, 1, 2 und 3 plus 10⁶ LEW-abgeleitete TAIC, i.v., Tag 7
4. LEW → DA; 10⁶ LEW-abgeleitete TAIC, i.v., Tag 7
5. CAP → DA; CSA, 5 mg/kg × KG, i.v., Tag 0, 1, 2 und 3 plus 10⁶ LEW-abgeleitete TAIC, i.v., Tag 7

Die postoperative Behandlung der DA-Empfängerratten mit 10⁶ LEW-abgeleiteten TAIC, intravenös, am 7. POT führt zur Langzeittoleranz, wenn eine initiale Gabe von 4 Zyklen CSA (5 mg/kg × KG, i.v.) von Tag 0–3 erfolgt ist. Die initiale Gabe von CSA ist notwendig, da die alleinige Behandlung mit einer einmaligen Gabe von 10⁶ TAIC am 7. POT (postoperativen Tag) die akute Abstoßung nur in 1/6 Fällen verhinderte. Die gewählte CSA-Dosis wirkt hierbei nur subtherapeutisch, da zwar das Transplantatüberleben verlängert wird, aber keine Langzeitakzeptanz durch alleinige CSA-Gabe induziert werden kann. Die induzierte Transplantat-Akzeptanz ist spenderspezifisch, da eine entsprechende Behandlung von DA Ratten mit LEW-abgeleiteten TAIC keine Toleranz für CAP-Drittstamm-Herztransplantate induziert.
Wie in 3 ersichtlich wurden Herzen der Versuchsgruppe 1 akut nach 7,0 ± 0,8 Tagen abgestoßen. Herzen der Gruppe 2 wurden verzögert nach 14,4 ± 7,0 Tagen abgestoßen. Herzen der Gruppe 3 wurden in 5/6 Fällen länger als 150 Tage akzeptiert. Im Rattensystem gilt die Akzeptanz von Organen für mehr als 100 Tage bereits als Langzeitakzeptanz, da die mittlere Lebenserwartung einer Inzuchtratte nur ca. 2 Jahre beträgt. Die alleinige postoperative Gabe von TAIC (10⁶ Zellen) konnte die akute Abstoßung nur in 1/6 Fällen verhindern, da die Herzorgane nach 22,6 ± 31,6 Tagen zu schlagen aufhörten (Gruppe 4). Die Drittstammkontrolle mit CAP-Herzen zeigte die Spezifität der induzierten Transplantat-Akzeptanz, da Drittstammherzen wiederum akut nach 7,4 ± 2,2 Tagen abgestoßen wurden. Diese Ergebnisse belegen auch, dass die zusätzliche Anwendung von TAIC keine generelle Immunsuppression erzeugt, da die akute Abstoßung der CAP-Herzen nicht verhinderte.
Beispiel 6
Untersuchung der Organspezifität von durch TAIC induzierter Langzeitakzeptanz
Um auszuschließen, dass TAIC lediglich für Herztransplantate einen protektiven Schutz gegen die allospezifische, vom Empfänger gegen die Spenderantigene-gerichtete Immunantwort vermitteln kann, wurden im stark abstoßenden DA → LEW Ratteninzuchtsystem folgende Organe in folgenden Versuchsgruppen (n = 6) transplantiert:

1. DA (Niere) → LEW; unbehandelt
2. DA (Niere) → LEW; 10⁶ DA-abgeleitete TAIC, i.v., Tag –7 und –1 vor Transplantation
3. LEW (Niere) → LEW; unbehandelt
4. DA (Leber) → LEW; unbehandelt
5. DA (Leber) → LEW; 10⁶ DA-abgeleitete TAIC, i.v., Tag –7 und –1 vor Transplantation
6. LEW (Leber) → LEW; unbehandelt
7. DA (Haut) → LEW; unbehandelt
8. DA (Haut) → LEW; 10⁶ DA-abgeleitete TAIC, i.v., Tag –7 und –1 Transplantation
9. LEW (Haut) → LEW; unbehandelt

Wie aus den in 4A–C dargestellten Kaplan-Meier-Plots ersichtlich wurden 6/6 Nierenorgane, 5/6 Leberorgane und 5/6 Hauttransplantate langfristig (> 150) Tage von LEW-Empfängerratten akzeptiert. Alle syngenen Organtransplantationen dienten zur Kontrolle der technisch komplikationslosen Durchführung und wurden uneingeschränkt vom Empfängertier angenommen (nicht in den Überlebenskurven gezeigt). Es zeigt sich demnach auch in diesen Versuchsansätzen, dass die intravenöse Vorabinjektion von 2 × 10⁶ TAIC Langzeitorganakzeptanz für mehr als 80% der transplantierten Organe induziert.
Die o. a. Nieren-, Leber-, und Hauttransplantate, die mit und ohne vorheriger Gabe von TAIC transplantiert worden waren, wurden im folgenden histologisch untersucht. In 4D erkennt man, dass durch die zweimalige intavenöse Injektion von 10⁶ TAIC pro kg Körpergewicht an den Tagen –7 und –1 vor Transplantation, die Morphologie der Transplantatniere als intakt (vgl. Kontrollniere und syngenes Transplantat LEW → LEW) zur Darstellung kommt, wogegen in der nicht-behandelten allogenen Kontrollgruppe DA → LEW eine deutliche Infiltration des Transplantates im Interstitium zu erkennen ist (postoperativer Tag 14). Analog dazu verhält sich das allogene Lebertransplantat (4E), welches ohne TAIC-Vorbehandlung am 12. POT komplett abgestoßen ist (DA → LEW ohne TAIC), wogegen die Vorabgabe von TAIC das Parenchym der Lebertransplantate im Vergleich zum syngenen Transplantat völlig homogen und intakt erscheinen läßt. Auch das allogene Hauttransplantat (DA) heilt komplikationslos ein (s. Vergleich zum syngenen LEW-Transplantat) wogegen das simultan mittransplantierte CAP-Drittstammtransplantat am 12. Postoperativen Tag bereits akut abgestoßen wurde. Dieses Beispiel beweist die Spezifität der durch TAIC induzierten Toleranz, da die Vorbehandlung des LEW-Empfängertieres mit DA-abgeleiteten TAIC an den Tagen –7 und –1 zur Akzeptanz des DA-Transplantates führt, wogegen das am Tag 0 simultan mittransplantierte CAP-Hauttransplantat akut abgestoßen wird (4F).
Beispiel 7A
Untersuchungen zur Haplotypspezifität der durch TAIC induzierten Langzeitorganakzeptanz
Um auszuschließen, dass TAIC lediglich in der gewählten Ratteninzuchtstamm-Kombination LEW → DA Langzeitorganakzeptanz induziert, wurden folgende weitere Inzuchtstammkombinationen im heterotopen Herztransplantationsmodell überprüft (n = 6). Dabei wurde u. a. auch der Inzuchtstamm BN[RT1.ⁿ] (im Rahmen der vorliegenden Erfindung als "BN" bezeichnet) verwendet.

1. DA → LEW; unbehandelt
2. DA → LEW; CSA, 5 mg/kg × KG, i.v., Tag 0, 1, 2, 3 plus 10⁶ DA-abgeleitete TAIC/kg × KG, i.v., Tag 7 und 10 postoperativ
3. CAP → LEW; unbehandelt
4. CAP → LEW; CSA, 5 mg/kg × KG, i.v., Tag 0, 1, 2, 3 plus 10⁶ CAP-abgeleitete TAIC/kg × KG, i.v., Tag 7 und 10
5. BN → LEW; unbehandelt
6. BN → LEW; CSA, 5 mg/kg × KG, i.v., Tag 0, 1, 2, 3 plus 10⁶ BN-abgeleitete TAIC/kg × KG, i.v., Tag 7 und 10

Aus Vorversuchen war bereits bekannt, dass in der sogenannten "high-responder"-Kombination (DA → LEW), die mit der stärksten im Ratteninzuchtmodell bekannten Abstoßungsreaktion einhergeht, die einmalige postoperative i.v.-Gabe von 10⁶ TAIC keine Langzeitakzeptanz erzielen kann. Es wurde daher mit einer zweimaligen Gabe versucht, die Präsenz von TAIC im Empfängertier zu erhöhen. Wie aus den zugehörigen in 5A dargestellten Überlebenskurven hervorgeht, erreichte die zweimalige Gabe von TAIC, an den postoperativen Tagen 7 und 10 verabreicht, eine Langzeitorganakzeptanz in 4/6 Fällen in Gruppe 2 und in 5/6 Fällen in den Versuchsgruppen 4. In der BN → LEW-Stammkombination überlebten alle transplantierten Organe langzeit ohne Hinweise für eine akute Abstoßung. In allen Fällen, in denen die transplantierten Herzen langzeit (> 150 Tage) akzeptiert worden waren, konnte in den Empfängertieren ein gemischter Chimerismus während der ersten 20–45 Tage nach TAIC-Gabe nachgewiesen werden. Ein frühzeitiges Organversagen dagegen ging immer mit fehlenden Spenderzellen im peripheren Blut des Empfängers einher. Aus diesen Daten kann geschlossen werden, dass die i.v.-Gabe von TAIC nur dann zur Langzeitorganakzeptanz führt, wenn die Zellen einen gemischten Spenderchimerismus induzieren, der zumindest für 21 Tage nachweisbar ist. Damit werden auch die 2D gezeigten Versuchsergebnisse bestätigt.
Durch die postoperative Gabe von 10⁶ pro kg Körpergewicht, die jeweils an den Tagen 7 und 10 intravenös den Empfängertieren verabreicht wurden, konnte demnach in allen 3 Inzuchtstammkombinationen in über 80% Langzeittoleranz induziert werden, wenn zusätzlich initial 4 Zyklen CSA verabreicht wurden.
Beispiel 7B
Untersuchungen zur Bedeutung der γ-IFN Stimulation M-CSF-behandelter Monozyten zur in vivo Toleranzinduktion
Um die Effizienz der zusätzlichen Stimulation M-CSF-behandelter Blutmonzyten mit γ-Interferon auf die Toleranzentstehung in vivo näher charakterisieren zu können, wurden im LEW → DA Ratteninzuchtmodell für die heterotope Herztransplantation folgende Versuchsgruppen untersucht (n = 6 Tiere pro Gruppe):

1. LEW → DA, 10⁶/kg × KG LEW-abgeleitete Blutmonozyten (unkultivierte Monozyten), i.v., Tag –7 vor Herztransplantation
2. LEW → DA, 10⁶/kg × KG LEW-abgeleitete Blutmonozyten (M-CSF behandelt), i.v., Tag –7 vor Herztransplantation
3. LEW → DA, 10⁶/kg × KG LEW-abgeleitete Blutmonozyten (γ-IFN stimuliert), i.v., Tag –7 vor Herztransplantation
4. LEW → DA, 10⁶/kg × KG LEW-abgeleitete Blutmonozyten (M-CSF behandelt plus γ-IFN stimuliert), i.v., Tag –7 vor Herztransplantation

Wie aus den Kaplan-Meier Überlebenskurven der 5B hervorgeht, konnte die intravenöse Gabe von frischen, nicht-kultivierten LEW-abgeleiteten Blutmonozyten, 7 Tage vor Herztransplantation, die akute Allotransplantatabstoßung der LEW-Herzen im DA-Empfängertier nicht verhindern. Die Transplantate dieser Versuchsgruppe wurden im Mittel (±SD) nach 7,8 ± 0,8 Tagen abgestoßen. Hingegen führte die Vorabgabe von Monozyten, die über 6 Tage mit M-CSF kultiviert worden waren, zur signifikanten Organüberlebenszeitverlängerung, da in dieser Versuchsgruppe eine Abstoßung im Mittel erst nach 35,0 ± 51,5 Tagen zu beobachten war. Die alleinige Stimulation frischer Blutmonozyten mit γ-IFN über 48 Stunden in RPMI-Medium, welches kein M-CSF erhielt, konnte die akute Abstoßung der Herztransplantate, die im Mittel nach 7,8 ± 1,2 Tagen zu schlagen aufhörten, nicht verhindern. Allein die M-CSF-Behandlung frischer Blutmonozyten über 6 Tage und die zusätzliche Stimulation dieser Zellen mit γ-IFN über 48 Std. (an Tag 5 und 6) führte zur Langzeitorgantoleranz (> 150 Tagen) in 4 von 6 Transplantaten. Die Ergebnisse zeigen die entscheidende Bedeutung der zusätzlichen Stimulation der M-CSF-behandelten Monozyten mit γ-IFN für die Entstehung einer in vivo Toleranz.
Beispiel 8
Untersuchungen zur Speziesspezifität der durch TAIC induzierten Langzeitorganakzeptanz
Um auszuschließen, dass TAIC lediglich in der gewählten Tierspezies Ratte wirksam eine Langzeitorganakzeptanz induzierte, wurden analog der in Beispiel 2 angegebenen Methodik Zellen monozytären Ursprungs aus dem Spenderschwein isoliert, wobei die Stimulation mit γ-IFN durch Zugabe von 1000 U/10 ml Nährmedium für 24 Std. erfolgte. Anschließend erfolgte die Prüfung auf Effektivität von TAIC zur Unterdrückung der akuten Abstoßung im Modell der linksseitigen Lungentransplantation an "SLA-mismatched minipigs", die eine dem Menschen vergleichbare Potenz zum Abstoßen ihrer Organe aufweisen. Hierbei wird der linksseitige Lungenflügel eines Spenderschweins entnommen und in ein genetisch differentes Empfängerschwein orthotop transplantiert (also in die linke Brusthöhle, nachdem dem Empfängerschwein zuvor die linke Lunge entfernt worden war). Zum Zeitpunkt der Lungenentnahme erfolgte simultan die Entnahme von 500 ml Spenderblut, das zur Aufbereitung der TAIC aus Monozyten dieses Schweines diente.
Die Empfängertiere wiesen alle ein Gewicht von 30–35 kg auf.
Folgende Versuchsgruppen wurden im Schwein (n = 4) etabliert:

1. CSA, 5 g/Tag, 50 mg Azathioprin/Tag, 25 mg Methylprednisolon/Tag, für insgesamt 28 Tage
2. wie Gruppe 1, plus 10⁸ Knochenmarkzellen (KM) des Spenderschweins/kg × KG Empfängerschwein plus 4,5 Gy Ganzkörperbestrahlung (GKB) des Empfängerschweins
3. wie Gruppe 1, plus 10⁶ vom Spenderschwein abgeleitete TAIC/kg × KG an den postoperativen Tagen 7 und 10 nach Lungentransplantation

Wie in 6A ersichtlich erfolgte die Abstoßung der Lungentransplantation in Gruppe 1 durchschnittlich nach 50,3 ± 9,9 Tagen nach Absetzen der Immunsuppression. Dagegen stießen Tiere der Gruppe 2 ihre Organe nach 102,3 ± 81,0 Tagen ab. Triple-Immunsuppression in Verbindung mit zweimaliger TAIC-Behandlung verlängerte das Organüberleben auf 292 ± 135,5 Tage, wobei 3/4 Tiere Langzeitorganakzeptanz (> 350 Tage) ihrer Organe zeigten. In allen Fällen der Gruppe 3 war ein gemischter Spenderchimerismus im Empfängerblut von > 21 Tagen zu beobachten, wogegen Tiere der Gruppe 1 und 2 nur kurzfristigen gemischten Chimerismus für 6–8 Tage zeigten. 6B zeigt die Lungentransplantate eines Schweins der Versuchsgruppe 1 (POT 41) und eines mit TAIC behandelten Schweins der Versuchsgruppe 3 (55 Tage nach Transplantation; B). Während in Projektion auf die linksseitige Thoraxwand um die Herzsilhouette eine sichtbare Transparenzminderung (Verschattung) als Ausdruck des abgestoßenen Lungentransplantation bei dem Schwein der Versuchsgruppe 1 zu erkennen ist, zeigt die Röntgenthoraxaufnahme des mit TAIC behandelten Tieres einen röntgenologisch unauffälligen Lungen-, respektive Transplantatbefund mit guter Abgrenzbarkeit zur Herzsilhouette.
Beispiel 9
Bindung des Antikörpers GM-7 an TAIC
Der monoklonale Antikörper GM-7 wurde durch Immunisieren von Mäusen mit humanen TAIC generiert, die wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt worden waren. Die den Antikörper produzierenden Hybridomzellen wurden bei der "Deutschen Sammlung für Mikroorganismen" unter der Zugangsnummer DSM ACC2542 hinterlegt. Die unten beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass der Antikörper spezifisch an ein Antigen bindet, welches nur von CD14+-Zellen exprimiert wird, die einer 6 Tage langen ex situ-Modifikation mit M-CSF und 2 Tage γ-IFN-Stimulierung entsprechend der Erfindung behandelt worden waren.
1 zeigt die mit Flüssigkeitszytometrie gemessene Bindungskapazität von GM-7 an Monozyten nach in vitro Modifikation, d. h. nach Transformation in TAIC. Es zeigt sich, dass die CD14-positiven Monozyten, die direkt aus dem Buffy-Coat erhalten wurden, nicht an den Antikörper GM-7 binden (die grau schattierte Wolke entspricht der Antikörperkontrolle). Im Gegensatz dazu, exprimieren ein Teil der Monozyten nach Kultivierung in M-CSF und Stimulierung mit γ-IFN ein Antigen, welches von dem monoklonalen Antikörper GM-7 erkannt wird. Nach Kultivierung wie in Beispiel 2 beschrieben, sind etwa 80% der transformierten Monozyten in der Lage, an den monoklonalen Antikörper GM-7 zu binden.
In einem weiteren Versuch wurde die Suppressoraktivität der CD14⁺/GM-7⁺-Zellen mit derjenigen von CD14⁺/GM-7^–-Zellen in einer gemischten Lymphozytenkultur (MLC) verglichen. Die MLC wurden wie bei James T. Kurnick, Cellular assays, In: Diagnostic Immunopathology, Colvin RB, Bhan AK, McCluskey, RT (eds.), Raven Press, New York, pp 751–771 (1994) beschrieben, durchgeführt.
In diesem Beispiel stammen die TAIC-Zellen von einem Individuum B. Wie in 7 gezeigt, besteht ein signifikanter Unterschied zwischen der Suppressoraktivität der GM-7-positiven und der GM-7-negativen TAIC. Nur die GM-7-positive Fraktion der TAIC-Population, die nach 6-tägiger Behandlung mit M-CSF und 2-tägiger Stimulation mit γ-IFN erhalten wurde, zeigt einen signifikanten Inhibitionseffekt auf die T-Zellproliferationsaktivität von Responderzellen des Individuums A nach Stimulation mit Zellen von B.
Diese Daten sprechen dafür, dass für klinische Zwecke durch die Verfügbarkeit des monoklonalen Antikörpers GM-7 eine homogene Zellpopulation mit optimaler Suppressorfunktion aus den Ursprungsmonozyten nach Kultivierung mit M-CSF und γ-IFN-Stimulation isoliert werden kann.
Beispiel 10
Nachweis des Einflusses des IDO-Hemmers 1-Methyltryptophan auf die immunsuppressive Aktivität der TAIC
Um zu klären, ob der Inhibitor des Enzyms Indolamin-2,3-dioxygenase (IDO) 1-Mehtyltryptophan (1-MT) die Suppressorfunktion der TAIC beeinflusst, die in den "Mo" und "Mo+Ly" Ansätzen generiert wurden (vgl. Beispiel 11), wurden verschiedene gemischte Lymphozytenkulturen (MLC) mit PHA (Phytohaemagglutinin) stimulierte T-Zellen in Gegenwart und in Abwesenheit von 1-MT angesetzt.
In diese gemischten Lymphozytenkulturen wurden 50 000 Lymphozyten mit 2 μg PHA in die Vertiefungen einer 96-Löcherplatte übertragen, und nachfolgend einer 144 Stunden langen Proliferationsperiode ausgesetzt (bezeichnet als "PhaLy"). Nur in Medium ohne Zusatz von PHA kultivierte Lymphozyten wurden als weitere Kontrolle angesetzt (bezeichnet als "Ly").

Um die Proliferation von PHA-stimulierten Lymphozyten in unterschiedlichen Ko-Kulturen zu untersuchen, wurden die folgenden vier Ansätze laufen gelassen und untersucht:

PhaLy + "Mo+Ly"	PHA-stimulierte Lymphozyten und TAIC [10⁵-Zellen aus dem Ansatz "Mo+Ly" entsprechend Beispiel 11].
PhaLy + "Mo + Ly" + 1-MT	PHA-stimulierte Lymphozyten und TAIC in Gegenwart von 2 μmol 1-MT [10⁵-Zellen aus dem Ansatz "Mo + Ly" entsprechend Beispiel 11].
PhaLy+"Mo"	PHA-stimulierte Lymphozyten und TAIC [10⁵-Zellen aus dem Ansatz "Mo" entsprechend Beispiel 11].
PhaLy+"Mo"+1-MT	PHA-stimulierte Lymphozyten und TAIC in Gegenwart von 2 μmol 1-MT [10⁵-Zellen aus dem Ansatz "Mo" entsprechend Beispiel 11].

Nach einer Kultivierung von 144 Stunden, wurden sämtliche Kontrollen oder Ko-Kulturen für weitere 24 Stunden in der Gegenwart von ³(H)-Thymidin kultiviert ("pulsed") und danach die Menge radioaktiv markierten Thymidins als "counts per minute" (cpm) bestimmt, die inkorporiert worden war, vgl. 8. In diesem Versuchsaufbau ist die Menge der nachgewiesenen Radioaktivität ein Mass für die Menge des markierten Thymidins, welches in die DNA eingebaut worden ist, und daher ein Maß für die Proliferationsrate der Lymphozyten. Die in 8 wiedergegebenen Werte entsprechen den Durchschnittswerten aus dreifachen Messungen von 3 Versuchen, jeweils mit Angabe der Standardabweichung.
Die Ergebnisse zeigen, dass Lymphozyten, die nicht mit PHA ("Ly") stimuliert waren, nicht signifikant proliferierten, wobei die mittlere gemessene Radioaktivität 367 cpm betrug (vgl.
8). Im Gegensatz dazu, führt die Stimulation mit 2 μg PHA zu einer signifikanten Steigerung der Proliferationsrate der Lymphozyten ("PhaLy"), wobei die höchste gemessene Inkorporation in diesen Proben einen Mittelwert von 18459 cpm aufwies.
Der Zusatz von TAIC zu den Lymphozytenkulturen führte eindeutig zu einer starken Senkung der Proliferationsrate, wenn Zellen aus dem Ansatz "Mo+Ly" aus Beispiel 11 hinzugefügt wurden (PhaLy + "Mo+Ly", nachgewiesener Wert 1498 cpm), und weniger stark wenn Zellen aus dem Ansatz "Mo" aus Beispiel 11 hinzugefügt wurden (PhaLy + "Mo", nachgewiesener Wert 3369 cpm).
Die nach Zusatz von 2 μmol 1-Methyltryptophan (1-MT) zu dem Ansatz, der "Mo+Ly" und "Mo" mit stimulierten Lymphozyten erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass 1-Methyltryptophan (1-MT) die Suppressorfunktion der TAIC synergistisch steigert, wobei die Abnahme mit den TAIC aus dem Ansatz "Mo+Ly" (gemessener Wert 267 cpm) stärker war als mit den TAIC aus dem Ansatz "Mo" (gemessener Wert 390 cpm).
Beispiel 11
Einfluss von Lymphozyten auf die Bildung von CD3⁺/CD14⁺-Zellen während der Kultivierung der Monozyten
Der Einfluss von in der Monozytenfraktion vorhandenen Lymphozyten auf die Bildung von CD14⁺/CD3⁺-Zellen, die als TAIC wirksam sind, wurde durch Vergleich von zwei verschiedenen Ansätzen untersucht.
Für den ersten Ansatz (nachfolgend als "Mo" bezeichnet) stammte die Monozytenfraktion ursprünglich aus der Interphase des "Buffy-Coat", wie in Beispiel 1 beschrieben. Wie in Beispiel 2 angegeben, wurden die Zellen anschließend in die Kultivierungsstufe mit M-CSF überführt. Innerhalb einer Stunde nach Beginn der Kultivierung, wurden die an dem Boden des Gewebekulturgefäßes anhängenden Monozyten fünfmal mit jeweils 10 ml PBS gewaschen, und die Menge der in dem Kulturgfäß vorhandenen Lymphozyten wurde dabei auf weniger als 5% (4,8 ± 2,4%) reduziert, während die Menge der so erhaltenen angereicherten Monozyten (CD14⁺) oberhalb 90% (92 ± 5,6%) lag. Weitere Zellkomponenten innerhalb des Ansatzes waren B-Lymphozyten und Granulozyten.
Die Zellen in dem zweiten Ansatz (nachfolgend als "Mo+Ly" bezeinchet), wurden ebenfalls aus der Interphase des "Buffy-Coat" als Monozytenfraktion entnommen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Anders als in Ansatz "Mo" wurden jedoch die an dem Boden des Gewebekulturgefäßes anhängenden Zellen nur 24 Stunden nach Beginn der Kultivierungsphase, wie in Beispiel 2 beschrieben, einmal gewaschen. Als Ergebnis war die so erhaltene Zellpopulation aus 45 ± 5,3% CD14⁺-Monozyten und 23,5 ± 8,9% CD3⁺-Lymphozyten zusammengesetzt. Wie in Ansatz "Mo" waren Lymphozyten und Granulozyten auch in diesem Ansatz vorhanden.
Die Bestimmung der Mengen der jeweiligen Zelltypen in der gesamten Zellpopulation je Ansatz wurde mit Flüssigkeitszytometrie in jeweils drei experimentellen Ansätzen durchgeführt (vgl. 9). Die Ergebnisse sind als Mittelwerte einschließlich der Standardabweichung wiedergegeben.
CD14⁺/CD3⁺-Zellen können weder in dem Ansatz "Mo" noch in dem Ansatz "Mo+Ly" zu Beginn der Kultivieurng nachgewiesen werden (d 0 = Tag 0). Nach einer Kultivierungsperiode von 5 Tagen wurde das Experiment beendet, und die Zellen wurden durch FACS-Analyse charakterisiert, nachdem sie von dem Boden des Gewebekulturgefäßes wie in Beispiel 2 beschrieben abgelöst worden waren. Es zeigte sich, dass die relative Menge an CD14⁺-Zellen in diesen Ansätzen gesunken war, nämlich von 92% auf 42% in Ansatz "Mo" und von 45% auf 28% in Ansatz "Mo+Ly". Offenbar proliferieren Lymphozyten schneller als die Monozyten; die relative Menge an Lymphozyten stieg in Ansatz "Mo" von 4,8% auf 69,8% und in Ansatz "Mo+Ly" von 23,5% auf 50,6%. Während der Kultivierung, werden in beiden Kultivierungen CD14⁺/CD3⁺-Zellen gebildet, die als TAIC wirksam sind. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, dass ein signifikant höherer Anstieg von CD14⁺/CD3⁺-Zellen in dem Ansatz "Mo+Ly" mit einer Menge von 32,0 ± 5,3% gegenüber Ansatz "Mo" mit nur 7,2 ± 3,2% zu beobachten ist.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Reinigung der Zellen zur Anreicherung von Monozyten bis zu einer relativen Menge von mehr als 90% bei Beginn der Kultivierung einen negativen Einfluss auf die Bildung der immunsuppressiven CD14⁺/CD3⁺-Zellen in der TAIC-Population hat, während das in den Beispielen 1 und 2 beschriebene Verfahren zur eine signifikant höheren Ausbeute an CD14⁺/CD3⁺-Zellen führte.
Beispiel 12
In vitro Ko-Kultivierung von humanen TAIC mit allogenen Lymphozyten zur Bildung von regulatorischen T-Zellen
Um zu untersuchen, ob TAIC die Bildung von regulatorischen T-Zellen in dem Empfänger induzieren, d. h. von CD4⁺/CD25⁺-Lymphozyten, wurden verschiedene in vitro-Kulturen von TAIC mit Lymphozyten angesetzt, und die daraus resultierende Bildung von regulatorischen T-Zellen untersucht.
Zu diesem Zweck wurden TAIC von Spender A direkt oder indirekt mit Lymphozyten eines Spenders B in vitro ko-kultiviert. Bei direkter Ko-Kultivierung, wurde der direkte Zell-zu-Zell-Kontakt zwischen den TAIC (von Donor A) und den Lymphozyten (von Donor B) möglich gemacht, während bei der indirekten Ko-Kultivierung eine Membran ("cell culture insert", 0,4 μm Porengröße, Falcon, Bezugsnummer 353090) zwar den Austausch des Mediums erlaubte, aber den physischen Kontakt der beiden Zellpopulationen miteinander inhibierte. Die direkte oder indirekte Ko-Kultivierung wird für vorzugsweise 3 bis 5 Tage, in mehr bevorzugter Weise für 4 Tage unter Inkubatorbedingungen, d. h. bei 37°C und in einer 5%igen CO₂-Atmosphäre durchgeführt.
Nach der Kultivierung, wurden die jeweiligen Zahlen an regulatorischen T-Zellen (CD4⁺/CD25⁺) in beiden Ansätzen sowie in den Kontrollen bestimmt, in denen TAIC oder Lymphozyten jeweils allein kultiviert worden waren. Ferner wurde die Zahl der CD3⁺/CD14⁺-Zellen, welche die Komponente der TAIC Zellpopulation mit der stärksten Suppressorfunktion in der gemischten Lymphozytenkultur repräsentieren, dem Kontroll-ansatz bestimmt, indem die TAIC allein kultiviert worden waren.
In sämtlichen Ansätzen, wurden die Oberflächenantigene der Zellen per FACS-Analyse bestimmt, und die Menge der jeweiligen Zellpopulationen in der Gesamtmenge der Zellen wurde analysiert.
Ferner wurde die relative Expression der drei neuen Mastergene, die spezifisch von regulatorischen T-Zellen exprimiert werden (Foxp3, CTLA-4 und Integrin α_Eβ₇) durch PCR in den jeweiligen Zellpopulationen bestimmt (siehe Tabelle). Foxp3 ist ein spezifischer Transkriptionsfaktor, der als Kontrollgen für die Entwicklung regulatorischer T-Zellen angesehen wird, und der spezifisch von diesen Zellen exprimiert wird [siehe Hori, S. et al., "Control of Regulatory T-cell Development by the Transcription Faktor Foxp3", Science 299, 1057–1061 (2003)].
CTLA-4 ist ein weiterer Faktor, der als Marker für den Nachweis der regulatorischen Funktion von CD4⁺/CD25⁺-T-Zellen verwendet wird (vgl. Khattri, R. et al., "An essential role for Scurfin in CD4⁺/CD25⁺ T regulatory cells", Nature Immunology, online-Veröffentlichung, doi:10.1038/ni909 (2003); Shimizu, J. et al. "Stimulation of CD25⁺/CD4⁺ regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance", Nature Immunology, online-Veröffentlichung, doi:10.1038/ni759 (2003); Cobbold, S. P. et al. "Regulatory T cells in the induction and maintenance of peripheral transplantation tolerance", Transpl. Int. 16(2), 66–75 (2003)].
α_Eβ₇ ist ein Integrin, welches ein epitheliales Cadherin bindet, und welches als Marker für die potenteste Sub-Population regulatorischer CD25+-T-Zellen verwendet werden kann [vgl Lehmann, J. et al. "Expression of the integrin α_Eβ₇ identifies unique subsets of CD25⁺ as well as CD25 regulatory T cells" PNAS 99(20), 13031–13036 (2002)].
Die Bestimmung der Foxp3-, CTLA-4- und Integrin α_Eβ₇-Expression wurde mittels quantitativer PCR durchgeführt, wobei GAPDH und β-Actin zwei "housekeeping" Gene, als Kontrollen verwendet wurden; die so bestimmten Werte wurden einerseits in das Verhältnis zueinander gesetzt, wobei der für CD14⁺/CD3^– Zellen erhaltene Wert als 1 angesetzt wurde; andererseits wurden die absoluten RNA-Mengen in μg je μg Gesamt-RNA angegeben, um die gemessene Suppression durch die TAIC in vitro und die Bildung der CD4⁺/CD25⁺ doppelt-positiven Zellen mit der Expressionsrate der jeweiligen Gene zu korrelieren. Es wurden Standardverfahren für die quantitative PCR verwendet, welche dem Fachmann bekannt sind (vgl. Lottspeich, F., Zorbas, H. "Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin, 1998).
Die Tabelle zeigt, dass innerhalb der Population von Lymphozyten die aus der direkten Ko-Kultivierung erhalten wurden, der Prozentsatz von doppelt-positiven CD4⁺/CD25⁺-Zellen um ein Vielfaches auf einen Wert von 8,7 angestiegen war, im Vergleich zu der Menge der CD4⁺/CD25⁺-Lymphozyten, die aus der indirekten Ko-Kultivierung oder der Kontrolle stammten, die jeweils nahezu identisch mit 2,38 und 2,65 waren.
Die Sub-Population von CD4⁺/CD25⁺-Zellen exprimierte die höchsten relativen Mengen an mRNA von allen untersuchten Mastergenen verglichen mit der Expression in CD4⁺/CD25 Zellen (vgl. Tabelle). Während die Expression von Foxp3 um einen Faktor 10 (37 gegenüber 3,75) gestiegen ist, erreicht die CTLA-4-Expression eine sogar noch höhere maximale Expression (4699 gegenüber 0,376). Die Steigerung der Expression des dritten Mastergen-Integrins α_Eβ₇ in den CD4⁺/CD25⁺-Zellen während der Ko-Kultivierung ist nahezu so hoch wie für CTLA-4, da die absolute Menge von Integrin α_Eβ₇ von 1,4 × 10^–9 in CD4⁺/CD25⁺-Zellen im Vergleich zu 3,4 × 10^–12 μg mRNA/μg Gesamt-RNA in CD4⁺/CD25 Zellen gestiegen ist.
Nach indirekter Ko-Kultivierung, beträgt die relative Menge von Foxp3-mRNA in der CD4⁺/CD25⁺-Sub-Population nur 10 und ist nahezu so gering wie die relative Menge die von den Lymphozyten in der Kontrolle exprimiert wird, die eine relative Menge von Foxp3-mRNA von 15 exprimieren.
Die relative Menge von CTLA-4-mRNA, die von den Lymphozyten in der Kontrolle exprimiert wird, beträgt nur 0,375 in der CD4⁺/CD25⁺-Population und 0,1 in der CD4⁺/CD25-Population.

	Kontrolle				direkte Ko-Kultierung		indirekte Ko-Kultivierung
	TAIC		Lymphozyten		Lymphozyten		Lymphozyten
	CD14⁺/CD3⁺	CD14^+/ CD3^–	CD4⁺/CD25⁺	CD4⁺/CD25^–	CD4⁺/CD25⁺	CD4⁺/CD25^–	CD4⁺/CD25⁺	CD4⁺/CD25^–
FACS [% positive Zellen]	41	20	2,65	30,8	8,7	49	2,38	27,6
relative Foxp3-Expression [PCR]	50	1	15	1,5	37	3,76	10	1,5
absolute RNA-Menge Foxp3	1,6 × 10^–8	3,2 × 10^–10	4,8 × 10^–9	8 × 10^–10	1,2 × 10^–8	1,2 × 10^–9	3,2 × 10^–9	4,8x10^–10
relative CTLA4-Expression [PCR]	12500	1	0,375	0,1	4699	0,376
absolute RNA-Menge CTLA4	6,5 × 10^–6	5,2 × 10^–10	1,9 × 10^–10	5,2 × 10^–10	2,4 × 10^–6	1,9 × 10^–10
absolute RNA-Menge Integrin α_Eβ₇	3,4 × 10^–9	nicht nachweisbar	1,4 × 10^–9	3,4 × 10^–12

Tabelle: Bestimmung der Mengen an spezifischen Zellpopulationen in der Gesamtmenge der Zellen nach direkter und indirekter Ko-Kultivierung unter Bezugnahme auf deren Oberflächenmarker CD3, CD4, CD14, CD25, und Bestimmung der relativen Expression und der absoluten Mengen von RNA von drei Genen (Foxp3, CTLA-4 und Integrin α_Eβ₇) in diesen Zellpopulationen.

Die Expression von CTLA-4 in der CD14⁺/CD3⁺-Sub-Population den TAIC-Zellen entsprach der Expression von Foxp3 und war auch erheblich höher als in allen anderen Populationen.
In diesem Zuammenhang ist es bemerkenswert, dass die CTLA-4-Expression (relativer Wert von 12 500) in der CD14⁺/CD3⁺-Sub-Population vielfach höher als die Foxp3-Expression war, die einen relativen Wert von 50 aufwies.
In der CD14⁺/CD3^–-Sub-Population der TAIC war keine Expression des Integrins α_Eβ₇ nachweisbar, während entsprechend dem Verhalten der Expression der beiden anderen analysierten Gene, die Expression des Integrins in der CD14⁺/CD3⁺-Sub-Population der TAIC, gemessen als absoluter Wert in μg RNA je μg Total-RNA, den höchsten Wert erreichte (3,4 × 10⁹ μg/μg Gesamt-RNA).
Die signifikant gesteigerte Expression der drei Lymphozytenmarker Foxp3, CTLA-4 und Integrin α_Eβ₇ auf die von Monozyten abgeleiteten TAIC verglichen mit normalen Lymphozyten ist vollkommen unerwartet und ist bisher nicht bei Monozyten oder auf von Monozyten abgeleiteten Zellen beobachtet worden.
Zusammenfassend zeigen die oben beschriebenen Ergebnisse dieses Beispiels das Folgende: Geht man von der Annahme aus, dass die Ebene der Foxp3-, CTLA-4-, und Integrin α_Eβ₇-Expression mit den immunregulatorischen Eigenschaften der jeweiligen Zellen korreliert, so wurde hier gezeigt, dass die suppressive Aktivität der CD3⁺/CD14⁺-Sub-Population auf die TAIC mit einer Expression dieser drei Gene verbunden ist. Dies ist noch überraschender wenn man berücksichtigt, dass diese Marker bisher nur für Lymphozyten, nicht jedoch für Zellen monozytischen Ursprungs beschrieben sind.
Es wurde ferner gezeigt, dass die direkte Ko-Kultur von TAIC mit Lymphozyten zu einer signifikant höheren Menge von CD4⁺/CD25⁺-Lymphozyten im Vergleich zur indirekten Ko-Kultivierung und der Ko-Kultivierung von Lymphozyten allein führt. Dies stützt die Annahme, dass auch in vivo (d. h. in einem Patienten) nach Gabe von TAIC regulatorische T-Zellen gebildet werden. Diese Ergebnisse stimmen mit der bekannten immunregulatorischen Funktion von CD4⁺/CD25⁺-Lymphozyten überein und mit der Tatsache, dass der Gehalt von Foxp3-, CTLA-4-, und Integrin α_Eβ₇-mRNA in diesen Zellen signifikant höher ist als in indirekt ko-kultivierten Lymphozyten oder in Kontroll-Lymphozyten.
Beispiel 13
In vivo Induktion von Transplant-Toleranz durch mit TAIC in vitro ko-kultivierte Lymphozyten
Die in Beispiel 12 dargestellten Ergebnisse und Schlussfolgerungen wurden in vivo anhand eines Tierexperiments bestätigt. Anders als das in den Beispielen 3, 4, 5, 6 und 7 beschriebene Verfahren, wurden die Tiere in den ausgewählten LEW → DA Inzuchtkombinationen nicht mit LEW-abgeleiteten TAIC zur Induktion von Toleranz injiziert, sondern es wurden DA-Lymphozyten aus den Empfängern, die über einen Zeitraum von 5 Tagen zuvor mit (LEW)-abgeleiteten TAIC des Spenders direkt ko-kultiviert waren, oder die als Kontrollen allein in Medium kultiviert waren, den Tieren in diesem Beispiel injiziert.
Tiere, die autologe ko-kultivierte DA-Lymphozyten vor einer allogenen Herztransplantation erhalten hatten, entwickelten Donor-spezifische Toleranz, während Kontrolltiere, die unbehandelte, nicht ko-kultivierte Kontroll-DA-Lymphozyten erhalten hatten, das transplantierte Herz innerhalb von 10 bis 14 Tagen akut abstießen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die physische Zell-zu-Zell-Interaktion zwischen Donor-TAIC und Empfänger-Lymphozyten die Bildung von regulatorischen T-Zellen induziert, die, per se, in der Lage sind, dass syngeneische Immunsystem der Empfänger so zu modifizieren, dass potentielle alloreaktive T-Zellen supprimiert werden und die Organabstoßung auf diese Weise verhindert wird.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche Transplantat-Akzeptanz induzierende Zellen monozytären Ursprungs enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man a) Monozyten aus Blut isoliert; b) Monozyten in einem geeigneten Kulturmedium vermehrt, welches den zellulären Wachstumsfaktor M-CSF enthält; c) die Monozyten gleichzeitig mit oder im Anschluss an Stufe b) in einem γ-IFN enthaltendem Medium kultiviert; d) die in Stufe c) gebildeten Transplantat-Akzeptanz induzierenden Zellen gewinnt, indem man die Zellen von dem Kulturmedium abtrennt; und e) die in Stufe c) erhaltenen Zellen zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Monozyten humanen Ursprungs sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Monozyten auf solche Weise aus dem Blut isoliert werden, dass neben den Monozyten auch Lymphozyten in einer Menge von mindestens 10%, bezogen auf die Gesamtzahl der Zellen, in dem Isolat enthalten sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die in Stufe c) gebildeten oder in Stufe d) erhaltenen Transplantat-Akzeptanz induzierenden Zellen durch Bindung an den Antikörper selektiert werden, welcher von der Hybridomzell-Linie DSM ACC2542 gebildet wird, und die so selektierten Zellen zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die M-CSF-Konzentration in dem Kulturmedium 1 bis 20 μg/l beträgt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass im Anschluss an Stufe b), die Monozyten 24 bis 72 Stunden lang in einem Kulturmedium kultiviert werden, welches γ-IFN enthält, wobei die Kultivierung in Gegenwart von γ-IFN 3 bis 6 Tage nach Beginn der Kultivierungsstufe b) beginnt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die γ-IFN-Konzentration in dem Kulturmedium 0,1 bis 20 ng/ml beträgt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtdauer der Kultivierung in den Stufen b) und c) 4 bis 8 Tage beträgt.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Suppression von Transplantat-Abstossungsreaktionen, hergestellt nach dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 8.
Verwendung von Transplantat-Akzeptanz induzierenden Zellen, die anhand der Schritte a) bis c) des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 8 erhalten wurden, zur in vitro-Gewinnung und/oder Vermehrung regulatorischer T-Lymphozyten.
Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die regulatorischen T-Lymphozyten die Antigene CD4 und CD25 auf ihrer Zelloberfläche co-exprimieren.
Verfahren zum Generieren und/oder Propagieren regulatorischer T-Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, dass man a) Transplantat-Akzeptanz induzierende Zellen, hergestellt gemäß den Stufen a) bis c) des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 8 mit einer T-Lymphozytenzubereitung co-kultiviert, und b) die regulatorischen T-Lymphozyten gegebenenfalls aus dem Kulturmedium gewinnt.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die regulatorischen T-Lymphozyten die Antigene CD4 und CD25 auf ihrer Zelloberfläche co-exprimieren.
Verfahren nach den Ansprüchen 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die regulatorischen T-Lymphozyten aus dem Kulturmedium durch FACS-Sortieren gewinnt.