DE60317481T2

DE60317481T2 - Produktion einer ugppase

Info

Publication number: DE60317481T2
Application number: DE60317481T
Authority: DE
Inventors: J. Ins. Agrobio POZUETA ROMERO; E. Ins. Agrobio BAROJA FERNANDEZ; Francisco J. Ins. Agrobio MUNOZ; Imbak Kobe-shi SUH; Ryuji Kobe-shi YAMAMOTO
Original assignee: Universidad Publica de Navarra; JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Universidad Publica de Navarra; JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2002-03-20
Filing date: 2003-03-17
Publication date: 2008-09-18
Anticipated expiration: 2023-03-18
Also published as: JP4346449B2; ES2297131T3; WO2003078617A1; US20090011487A1; AU2002239018A1; WO2003078616A1; JP2005520518A; DE60317481D1; AU2002334411A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft UDP-Glucosepyrophosphatase (UGPPase), ein neues Enzymprotein, von dem festgestellt wurde, dass es in Tieren auftritt, und die Herstellung des Proteins in aufgereinigter Form sowie die Verwendungen des Proteins in dem Gebiet biochemischer Analysen, einschließlich ELISA, und zur Bestimmung von in einer Probe enthaltener UDP-Glucose.
Stand der Technik
Glycogen ist ein Polysaccharid, das das Haupt-Kohlenhydrat in tierischen Zellen und einer Vielzahl von Bakterien, einschließlich Escherichia coli darstellt, sowie es die Stärke in Pflanzen ist. Stärke in Pflanzen und Glycogen in Bakterien werden aus einem gemeinsamen Substrat, ADP-Glucose (ADPG), produziert. In Tieren wird Glycogen zum anderen aus UDP-Glucose (UDPG) produziert (1). Die Nettogeschwindigkeit der Synthese solcher Speicher-Polysaccharide in Organismen wird vermutlich durch viele regulatorische Faktoren gesteuert, die auf die äußere Umgebung sowie innere physiologische Bedingungen reagieren. Solche regulatorischen Faktoren fungieren erwartungsgemäß zum Beispiel bei der allosterischen Steuerung der Reaktion von ADPG- (oder UDPG-)Pyrophosphorylase (AGPase oder entsprechend UGPase) in dem Glycogeneseweg oder durch Steuern der Expression von Genen, die für Enzyme der Gluconeogenese codieren (1–4).
Kürzliche Untersuchungen haben gezeigt, dass das Glycogen während des bakteriellen Wachstums gleichzeitig synthetisiert und abgebaut werden kann, wodurch ein nutzloser Kreislauf aufgestellt wird, in dem AGPase eine Doppelrolle beim Katalysieren der de novo-Synthese von ADPG und beim Rückgewinnen der aus dem Abbau des Glycogens stammenden Glucoseeinheiten hat (5–7).
Es wurde berichtet, dass die gleichzeitige Synthese und der Abbau von Glycogen und Stärke auch in Tieren und entsprechend Pflanzen auftreten (8–10), was angibt, dass der Ablauf eines nutzlosen Kreislaufs Vorteile, wie beispielsweise eine sensitive Regulierung und Kanalisierung überschüssiger Intermediate der Gluconeogenese zu verschiedenen Stoffwechselwegen hin als Reaktion auf physiologische und biochemische Erfordernisse mit sich bringen kann.
In Zusammenhang mit diesem Weg der Art eines nutzlosen Zyklus wurde das Vorhandensein eines einseitigen Enzyms, das die Hydrolyse von ADPG (oder UDPG) katalysiert, vorhergesagt, das eine sensitivere Regulierung der ADPG- (oder UDPG-)Mengen und damit der Nettogeschwindigkeiten der Synthese/des Abbaus von Speicher-Polysacchariden erlauben würde. Das erste solcher Enzyme wurde von Pozueta-Romero, J. und Mitarbeitern entdeckt, die ADP-Glucosepyrophosphatase (AGPPase) aus Gerste und Bakterien isolierten und aufreinigten (11–13). Die AGPPase, die sie isolierten, war ein einseitiges Enzym, das die Hydrolyse von Glucose-1-phosphat (G1P) und Adenosin-5'-monophosphat (AMP) katalysiert. Es wurde bereichtet, dass Enzyme, die den hydrolytischen Abbau von UDPG katalysieren, in Säugetierzellen auftreten (14–16). Diese Enzyme, die eine Rolle bei der Steuerung der Biosynthese von Glycoproteinen, Glycolipiden und Glycosaminoglycanen spielen (17–22), zeigen eine breite Substratspezifität und es wurde gefunden, das sie mit nukleären Fraktionen, mitochondrialen Fraktionen, Fraktionen des endoplasmatischen Reticulums und Fraktionen der Plasmamembran in Verbindung stehen.
Die Biosynthese von Glycogen findet in dem Cytosol statt. Die mögliche Beteiligung des enzymatischen Abbaus von UDPG an der Steuerung des Kohlenstoffflusses zu Glycogen in Säugetierzellen hin, hat uns dazu veranlasst, ein cytosolisches Protein, das als UDP-Glucosepyrophosphatase (UGPPase) bezeichnet wird, zu identifizieren, das UDPG mit im Wesentlichen der höchsten Spezifität hydrolysiert.
Nun haben die vorliegenden Erfinder unter Awenden einer Technik zur Aufreinigung von Enzymproteinen, SDS-freier PAGE (im Folgenden als "native PAGE" bezeichnet) erfolgreich UDP-Glucosepyrophosphatase (UGPPase), ein Enzym, das Eigenschaften aufweist die mit denjenigen von AGPPase in Pflanzen und Bakterien vergleichbar sind, aus Tieren (Mensch und Schwein) aufgereinigt und ein Verfahren zum Herstellen des Enzyms mittels rekombinanter Technologie etabliert. Dieses Enzym, das nun letztlich als UGPPase bezeichnet wird, ist das Enzym, das die Erfinder vorläufig UGPPase oder UGPPase nannten, wie es entsprechend in ihren internationalen Anmeldungen PCT/JP02/02726 , eingereicht am 20. März 2002, oder PCT/JP02/09542 , eingereicht am 17. September 2002, offenbart ist.
UGPPase ist ein einseitiges Hydrolyseenzym, das die Umwandlung von UDPG, dem Vorläufermolekül von Glycogen, zu G1P und UMP katalysiert.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein aufgereinigtes Enzymprotein bereit, das aus der als SEQ ID NO: 2 in dem Sequenzprotokoll angegebenen Aminosäuresequenz besteht. Das Protein besitzt die UGPPase-Aktivität, d. h. die Aktivität zum Hydrolysieren von UDP-Glucose in Glucose-1-Phosphat (G1P) und Uridin-5'-monophosphat (UMP).
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Enzymprotein, das mittels rekombinanter Technologie hergestellt wurde (rekombinantes Protein) und aus der als SEQ ID NO: 2 in dem Sequenzprotokoll angegebenen Aminosäuresequenz besteht, in einer aufgereinigten Form bereit. Es wurde bestätigt, dass das rekombinante Protein UGPPase-Aktivität besitzt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Enzymproteins bereit, das die Schritte umfasst: Einbauen der DNA, die aus der als SEQ ID NO: 1 in dem Sequenzprotokoll angegebenen Nukleotidsequenz besteht, in einen Expressionsvektor, Einschleusen des so konstruierten Expressionsvektors in kompetente Zellen, Kultivieren der mit dem konstruierten Expressionsvektor transformierten Zellen und Aufreinigen des exprimierten Proteins, wobei das Protein eine Aktivität zum Hydrolysieren von UDP-Glucose in Glucose-1-Phosphat und Uridin-5'-monophosphat besitzt.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung des rekombinanten Enzymproteins als einen Referenzstandard im Test auf UGPPase-Aktivität in Proben bereit, wobei das Protein aus der als SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz besteht und wobei das Protein eine Aktivität zum Hydrolysieren von UDP-Glucose in Glucose-1-Phosphat und Uridin-5'-monophosphat besitzt. Eine solche Verwendung ermöglicht, standardisierte Daten über das Ausmaß der Aktivität des Enzyms zu erhalten, was einen genauen quantitativen Vergleich von Daten, die von verschiedenen Proben genommen wurden, die zu verschiedenen Zeiten und an verschiedenen Orten gemessen wurden, erlaubt.
Daneben stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von gereinigter Säugetier-UGPPase, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, bereit, das die Schritte umfasst:

(a) Homogenisieren von Gewebe aus einem Säugetier in einem wässrigen Medium,
(b) Zentrifugieren des so erhaltenen Homogenats,
(c) Sammeln des Überstandes des zentrifugierten Homogenats,
(d) Dialysieren des gesammelten Überstandes gegen einwässriges Medium,
(e) Unterwerfen des in obigem Schritt (d) erhaltenen dialysierten Überstandes einem oder mehreren chromatographischen Verfahren unter Verwendung jeweils ein oder mehrerer stationärphasiger Materialien und Sammeln von Fraktionen, die eine konzentrierte UGPPase-Aktivität aufweisen, wobei das stationärphasige Material oder die Materialien ein Material enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Anionenaustauscher, schwachem Anionenaustauscher, Größenausschlussgel und Hydroxylapatit,
(f) die in obigem Schritt (e) erhaltenen, eine konzentrierte UGPPase-Aktivität aufweisenden Fraktionen werden einer nativen PAGE unterworfen, und
(g) Ausschneiden eines eine konzentrierte UGPPase-spezifische Aktivität enthaltenden Anteils aus dem Gel und Extrahieren des UGPPase-Proteins aus dem Gelanteil mit einem wässrigen Extraktionsmedium.

Das obige Verfahren wird vorzugsweise in Gegenwart von einem oder mehreren Sulfhydrylgruppen-Schutzmitteln, die in einem Medium aufgelöst wurden, das in einem oder mehreren und ganz besonders bevorzugt allen der Schritte (d)–(i) verwendet wird, ausgeführt.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem einen aufgereinigten Antikörper gegen UGPPase bereit, wobei der Antikörper ein polyklonaler oder ein monoklonaler Antikörper sei kann.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Bestimmen der UGPPase-Menge, welches ein Protein ist, wie es in Anspruch 1 definiert ist, in einem Analyten, der auf einem Enzym gekoppelten Immunosorbensassay (ELISA) basiert, bereit, das die Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen einer Festphase, an der ein Anti-UGPPase-Antikörper gebunden ist,
(b) In Kontakt bringen einer ersten Lösung, die eine vorbestimmte Menge des Analyten enthält, mit der Festphase für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um der im Analyten enthaltenen UGPPase eine Bindung an die Anti-UGPPase, die an der Feststoffphase gebunden ist, zu ermöglichen,
(c) nach Entfernen der ersten Lösung in Kontakt bringen einer zweiten Lösung, die eine vorbestimmte Menge eines enzymkonjugierten Anti-UGPPase-Antikörpers enthält, mit der Festphase für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um dem enzymkonjugierten Anti-UGPPase-Antikörper zu ermöglichen, an die UGPPase zu binden, die an die Anti-UGPPase gebunden vorliegt, welche an die Festphase gebunden ist,
(d) nach Entfernen der zweiten Lösung in Kontakt bringen einer dritten Lösung, die eine vorbestimmte Menge eines Substrats für das konjugierte Enzym enthält, mit der Festphase und Reagieren lassen des konjugierten Enzyms mit dem Substrat für eine vorbestimmte Zeitdauer, um ein spezifisches Produkt der Enzymreaktion herzustellen, und
(e) Bestimmen der so produzierten Menge an spezifischem Produkt, und
(f) Bestimmen der Menge an UGPPase im Analyten, bezogen auf den Vergleich zwischen der Menge des spezifischen Produkts in (e) und der Menge des spezifischen Produkts, die aus einer vorherbestimmten Menge der UGPPase unter den gleichen Bedingungen wie in (b) bis (d) hergestellt wurde.

Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Bestimmung der in einer gegebenen Probe, vorzugsweise in einer flüssigen Probe und besonders bevorzugt in einer biologischen Probe, wie beispielsweise Blut, enthaltenen UDPG-Menge bereit. Da ein UDPG-Mangel in Geweben diabetischer Tiere (Patienten) auftritt (25–27), wird die Bestimmung von UDPG in Proben zur Identifizierung von diabetischen Patienten verwendet werden. Das Verfahren, das auf einer eins-zu-eins-Umwandlung von UDPG in G1P basiert, umfasst die Schritte:

(a) Vermischen einer vorherbestimmten Menge einer Probe mit einer Pufferlösung, die eine vorherbestimmte Menge an UGPPase, wie es in Anspruch 1 definiert ist, enthält, um eine Reaktionsmischung herzustellen,
(b) Inkubieren der Reaktionsmischung für eine ausreichende Zeitdauer, um UDPG in G1P umzuwandeln,
(c) Terminieren der Reaktion durch Erhitzen der Reaktionsmischung, und
(d) Bestimmen der Menge an in (d) produziertem G1P durch Umsetzen von G1P, welches zumindest in einem bekannten Anteil der Reaktionsmischung enthalten ist, mit Phosphoglucomutase, G6P-Dehydrogenase und NAD, und Bestimmen der Menge an produziertem NADH, z. B. spektrophotometrisch bei 340 nm.

Dieses Verfahren ermöglicht die Bestimmung der Menge von UGPD in humanen Geweben, in denen die UGPD-Mengen zwischen 0,1 mM und 1 mM in nicht-diabetischen Menschen liegen (28, 29).
Kurze Beschreibung der Figuren
1 veranschaulicht einen schematischen Ablauf biochemischer Reaktionen in tierischen Zellen, die den Glycogen-Stoffwechsel betreffen, an dem UGPPase vermutlich beteiligt ist. In der Figur: Glc; Glucose, HK; Hexokinase, PGM; Phosphoglucomutase.
2 zeigt das Ergebnis der SDS-PAGE des aufgereinigten Produkts (3 μg) in jedem Schritt des Reinigungsprozesses von UGPPase aus Nieren-Homogenat. In der Figur: Bahn M; Molekulargewichtsmarker, Bahn 1; Extrakt des Nierenhomogenats (0,00161 mU), Bahn 2; 30.000 g Überstand (0,00429 mU), Bahn 3; dialysierte Probe (0,00481 mU), Bahn 4; 100.000 g Überstand (0,00579 mU), Bahn 5; Eluat der Q-Sepharose-Säule (0,00655 mU), Bahn 6; zweites Eluat der Q-Sepharose-Säule (0,0248 mU), Bahn 7; Eluat der Q-Sepharose-Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten (0,0523 mU), Bahn 8; Eluat der Superdex200-Säule (0,184 mU), Bahn 9; Eluat der MonoQ-Säule (0,535 mU), Bahn 10; Eluat der MonoP-Säule (2,59 mU), Bahn 11; native PAGE (98,5 mU).
3 ist ein Graph, der die Proteinkonzentration und die UGPPase-Aktivität der Fraktionen 31–45 von einer MonoP-Säule zeigt.
4 zeigt ein Ergebnis der SDS-PAGE der Fraktionen 29–39 von der MonoP-Säule.
5 zeigt ein Ergebnis der SDS-PAGE von zwei Chargen von Proben nach der Aufreinigung mittels nativer PAGE. In der Figur: Bahn M; Molekulargewichtsmarker. Die UGPPase-Menge in dem Gel: 0,184 mU (Charge 1, Fraktion 5), 4,33 mU (Charge 1, Fraktion 6), 2,88 mU (Charge 1, Fraktion 7), 3,74 mU (Charge 2, Fraktion 5), 4,43 mU (Charge 2, Fraktion 6), 0,558 mU (Charge 2, Fraktion 7).
6 zeigt die erste Hälfte der Ergebnisse der ESI-TOF-MS/MS. Die erste Hälfte der abgeleiteten Aminosäuresequenzen von AAD15563.1 (Mensch) und BAB23110.1 (Maus) werden mit den Aminosäuresequenzen von Schwein-UGPPase-Fragmenten liniert. Aminosäuren, die den Spezies gemeinsam sind, sind mit "•••" markiert, während jene, die nur dem Schwein und entweder dem Menschen oder der Maus gemeinsam sind, mit "•" markiert sind.
7 zeigt die zweite Hälfte der Ergebnisse der ESI-TOF-MS/MS. Die zweite Hälfte der abgeleiteten Aminosäuresequenzen von AAD15563.1 (human) und BAB23110.1 (Maus) werden mit den Aminosäuresequenzen von Schwein-UGPPase-Fragmenten liniert. Aminosäuren, die den Spezies gemeinsam sind, sind mit "•••" markiert, während jene, die nur dem Schwein und entweder dem Menschen oder der Maus gemeinsam sind, mit "•" markiert sind.
8 zeigt das Ergebnis der Elektrophorese (0,8% Agarosegel) des PCR-Amplifikationsprodukts.
9 veranschaulicht einen pT7Blue-T-Vektor mit eingebautem AAD15563.1.
10 veranschaulicht einen pET11a mit eingebautem AAD15563.1.
11 zeigt das Ergebnis der Elektrophorese (0,8% Agarose) des mit NdeI/BamHI verdauten pET11a.AAD11563.1.
12 zeigt die Ergebnisse der SDS-PAGE der Suspension der mit pET11a-AAD15563.1 oder pET11a transformierten AD494(DE3)-Zellen: Bahn 1; Kultur der mit pET11a transformierten Zellen nach 0 Stunden, Bahn 2; Kultur der mit pET11a-AAD15563.1 transformierten Zellen nach 0 Stunden, Bahn 3; Kultur der mit pET11a transformierten Zellen nach 3 Stunden, Bahn 4; Kultur der mit pET11a-AAD15563.1 transformierten Zellen nach 3 Stunden. Die auf das Gel aufgebrachte Menge: entsprechend 0,072, 0,034, 0,034 und 0,292 (mU) für die Bahnen 1 bis 4.
13 zeigt die Ergebnisse der SDS-PAGE (10–20% Polyacrylamidgel), die mit jedem der aufgereinigten Produkte (2,0 μg) in den Schritten der Aufreinigung der rekombinanten humanen UGPPase (r-hUGPPase) duchgeführt wurde. In der Figur: Bahn 1; AD494(DE3)-Suspension (1,8 mU), Bahn 2; 10.000 g Überstand (3,0 mU), Bahn 3; Q-Sepharose-Eluat (6,2 mU), Bahn 4; MonoP-Eluat (13,5 mU). Die spezifische Aktivität der Proben betrug: Bahn 1; 0,910 U/mg, Bahn 2; 1,51 U/mg, Bahn 3; 3,09 U/mg, Bahn 4; 6,74 U/mg.
14 ist ein Graph, der den optimalen pH-Bereich für Schweine-UGPPase zeigt. Die Bestimmung wurde in 50 mM Tris-HCl mit (⧫) oder ohne (☐) MgCl₂ durchgeführt.
15 ist ein Graph, der den optimalen pH-Bereich für humane rekombinante UGPPase zeigt. Die Bestimmung wurde in 50 mM Tris-HCl mit (⧫) oder ohne (☐) 20 mM MgCl₂ oder in 50 mM Glycin-KOH (O) mit 20 mM MgCl₂ durchgeführt.
16 ist ein Graph, der die Aktivität von Schweine-UGPPase als Funktion der UGPG-Konzentration (mM) zeigt. Aus dem Graphen wird die Kd des Enzyms als 4,26 mM bestimmt.
17 ist ein Graph, der die Aktivität von humaner rekombinanter UGPPase als Funktion der UGPG-Konzentration (mM) zeigt. Aus dem Graphen wird die Kd des Enzyms als 4,35 mM bestimmt.
18 zeigt das Ergebnis der Northern Blot-Analyse der gesamten RNA aus Schweinegeweben.
19 zeigt das Ergebnis der Northern Blot-Analyse der gesamten RNA aus humanen Geweben.
20 veranschaulicht einen pET19b mit eingebautem AAD15563.1.
21 zeigt das Ergebnis der Elektrophorese (0,8% Agarose) des mit NdeI/BamHI verdauten pET1b.AAD15563.1.
22 zeigt die Ergebnisse der CBB-Färbung (1) und der Western Blot-Analyse des hUGPPase-His-tag-Fusionsproteins, das in transformierten E. coli-Zellen exprimiert und aus diesen aufgereinigt wurde, mit Anti-hUGPPase-Antiserum (2) und mit Anti-His-tag-Antikörper (3).
23 ist ein Graph, der die Ergebnisse des hUGPPase-ELISA des aufgereinigten hUGPPase-His-tag-Fusionsproteins als einen Standard zeigt. Es sind die OD bei 450 nm für Standardlösungen, die das Protein mit 1–1.000 ng/ml enthalten, dargestellt. Die schräge Linie gibt die Linearisierung der Beziehung zwischen der Proteinkonzentration (x) und der OD 450 (y), beide auf einer logarithmische Skala, an.
24 ist ein Graph, der die Ergebnisse des hUGPPase-ELISA der Lysate von zwei Arten von E. coli-Zellen, von denen eine pET-19bAAD15563.1 und die andere pET-19b trägt, bei verschiedenen Verdünnungsstufen zeigt.
25 ist ein Graph, der die Korrelation zwischen der UDPG-Menge, die zu Beginn in den Proben war, und der G1P-Menge, die unter Verwenden der UGPPase bestimmt wurde, zeigt.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Verfahren zur und die Ergebnisse für die Isolierung und Aufreinigung von Schweine-UGPPase, Herstellung humaner rekombinanter UGPPase, deren enzymatische Charakterisierung, Herstellung eines Anti-UGPPase-Antikörpers, auf ELISA basierten Bestimmung von UGPPase und Bestimmung der in einer Probe enthaltenen UDP-Glucose noch ausführlicher beschrieben werden.
Ein monoklonaler Anti-UGPPase-Antikörper kann auch mit einem herkömmlichen Verfahren zum Herstellen eines monoklonalen Antikörpers hergestellt werden, das Schritte wie das Animpfen von Tieren (z. B. Mäusen) mit UGPPase, das Entfernen der Milz eines Tieres, das ausreichende Antikörpertiter zeigt, die Selektion von B-Zellen, die Fusion der B-Zellen mit Myelomzellen mit Usprung aus B-Zellen, um den Antikörper sekretierende Hybridomzellen zu bilden, und die Aufreinigung des Antikörpers aus dem Kulturmedium umfasst. Ein polyklonaler Antikörper kann unter Verwenden beliebiger Säugetiere, wie beispielsweise Kaninchen, Pferde, Mäuse und Meerschweinchen, hergestellt werden.
Beispiele
Materialien und Methoden:
(1) Verfahren zum Bestimmen der UGPPase-Aktivität
Die UGPPase-Aktivität wird auf Basis der durch das Enzym erzeugten Menge an G1P definiert. Die Bestimmung wird in einer zweistufigen Reaktion gemäß dem von Rodriguez-Lopez et al. (11) berichteten Verfahren ausgeführt. In der ersten Reaktion werden 50 μl der Reaktionsmischung, die aus einer Probe, die UGPPase enthält, 0–20 mM Konzentration eines Zuckernukleotids (UDP-, ADP- oder GDP-Glucose) (SIGMA), 20 mM MgCl₂ und 50 mM Tris-HCl (pH 9,0) besteht, hergestellt und die Mischung wird 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Als Kontrolle wird die gleiche Probe, die zwei Minuten lang gekocht wurde, um die UGPPase zu inaktivieren, verwendet. Nach der Inkubationsdauer wird die Reaktion durch zweiminütiges Kochen terminiert und die Mischung 10 Minuten lang bei 4°C mit 20.000 g zentrifugiert.
Die zweite Reaktion wird in einer 300 μl-Reaktionsmischung, die aus 50 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA, 2 mM MgCl₂, 15 mM KCl, 1 Einheit Phosphoglucomutase (ROCHE), 0,6 mM NAD (SIGMA), 1 Einheit Glucose-6-phosphatdehydrogenase (SIGMA) und 30 μl des Überstands der ersten Reaktion besteht, durchgeführt. Die Reaktionsmischung wird in eine FluoroNunc^TM-Platte mit 96 Vertiefungen (NUNC) eingebracht und 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Diese zweite Reaktion erzeugt eine zu der in der ersten Reaktion erzeugten Menge an G1P äquimolare Menge an NADH. Die NADH-Menge wird durch Messen der OD bei 340 nm unter Verwenden einer Vorrichtung zum Auslesen von Mikroplatten (MOLECULAR DEVICE) bestimmt.
Die Menge (Aktivität) der in einer Probe enthaltenen UGPPase wird in Einheiten (unit, U) ausgedrückt, wobei eine Einheit als die Stärke der Enzymaktivität definiert ist, die ein μmol UDPG pro Minute hydrolysiert. Die Aktivität wurde wie folgt berechnet: 1 U = [a]/30/0,03wobei [a] die Menge in μmol von in der Reaktion erzeugtem NADH ist.
Die obigen Bedingungen für die erste Reaktion wurden entsprechend dem Zweck von jedem Test, wie nachfolgend speziell angegeben ist, modifiziert.
(2) Extraktion von Schweine-UGPPase:
Frische Schweinenniere, 3,6 kg Gewicht, wurde in 12 Litern eines 50 mM HEPES-Puffers (pH 7,0), der 2 mM DTT und 2 mM EDTA enthielt, homogenisiert (0,3 g Gewebe pro 1 ml Puffer) und durch Miracloth^TM (CALBIOCHEM) filtriert. Nach Zentrifugation mit 30.000 g für 30 Minuten bei 4°C wurde ein Anteil von 2 Litern des Überstands bei 4°C 12 Stunden lang unter Verwenden einer Dialysiermembran (MW 14 kDa, Schnitt) gegen 20 Liter Dialysatlösung (1 mM DTT, 1 mM 2-Mercaptoethanol) und weitere 12 Stunden lang gegen das gleiche Volumen der frischen Dialysatlösung dialysiert. Dieser Vorgang wurde wiederholt (5-mal insgesamt), um das gesamte Volumen des Überstands zu behandeln. Der ganze hiernach verwendete Puffer enthielt 1 mM DTT und 1 mM 2-Mercaptoethanol. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 4°C mit 200.000 g wurde Tris-HCl bis zu einer Endkonzentration von 50 mM (pH 8,0) zu dem Überstand gegeben. Drei Liter dieser Probe wurden entnommen und gut mit 2 Litern Q-Sepharose Fast Flow-Harz (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) vermischt und das Filtrat wurde dann durch einen Glasfilter entfernt. Proteine, die an das Harz gebunden sind, wurden nacheinander mit jeweils zwei Litern Puffer, der 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und NaCl enthielt, jeweils bei 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 oder 0,5 M, in der Reihenfolge, eluiert. Der Vorgang wurde viermal ausgeführt, um das gesamte Volumen der Probe zu behandeln. Die UGPPase-aktiven Eluatfraktionen wurden gesammelt und miteinander vereinigt.
Eine hälfte (sechs Liter) des oben erhaltenen, aktiven Eluats wurden bei 4°C 12 Stunden lang gegen 20 Liter der Dialysatlösung (1 mM DTT, 1 mM 2-Mercaptoehtnaol, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) und weitere 12 Stunden lang gegen das gleiche Volumen der frischen Dialysatlösung dialysiert. Zwölf Liter dieser puffer-ausgetauschten Lösung wurden gut mit einem Liter Q-Sepharose Fast-Flow-Harz (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) vermischt und das Filtrat wurde dann durch einen Glasfilter entfernt. Proteine, die an das Harz gebunden sind, wurden nacheinander mit jeweils einem Liter Puffer, der 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und NaCl enthielt, jeweils bei 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 oder 0,5 M, in der Reihenfolge, eluiert. Der Vorgang wurde zweimal ausgeführt, um das gesamte Volumen der Probe zu behandeln.
Die vereinigten UGPPase-aktiven Fraktionen, die 1,6 Liter Volumen ausmachen, wurden bei 4°C 12 Stunden lang gegen 20 Liter der Dialysatlösung (1 mM DTT, 1 mM 2-Mercaptoethanol) dialysiert. Nach der Zugabe von Natriumhydrogenphosphatpuffer (pH 7,0) mit der Endkonzentration von 1 mM wurde die dialysierte Lösung gut mit 100 g Hydroxyapatitharz (SEIKAGAKU CORPORAION), das mit dem gleichen Puffer äquillibriert wurde, vermischt. Nach Entfernen des Filtrats durch einen Glasfilter und Waschen mit 200 ml 1 mM Natriumhydrogenphosphatpuffer (pH 7,0) wurden die an dem Hydroxyapatitharz adsorbierten Proteine mit 200 ml 400 mM Natriumhydrogenphosphatpuffer (pH 7,0) eluiert. Die UGPPase-aktiven Fraktionen von dem Hydroxyapatitharz wurden miteinander vereinigt und der Puffer gegen 40 mM Tris-HCl (pH 8,0) ausgetauscht. Sechshundert ml dieser Lösung wurden auf einmal auf eine Q-Sepharose HP HiLoad 26/10-Säule (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) geladen und mit 500 ml 40 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit einem linearen 0–0,5 M NaCl-Gradienten mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min eluiert. Dieser Vorgang wurde insgesamt dreimal durchgeführt, um das gesamte Volumen der Lösung zu behandeln. Fünfzehn ml der vereinigten, UGPPase-aktiven Fraktionen wurden auf einmal auf eine Superdex 200-Säule (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH), die mit 500 ml 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,5) äquillibriert wurde und 0,2 M NaCl enthält, geladen. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min zur Fraktionierung des Molekulargewichts eluiert. Diese Vorgänge wurden achtmal insgesamt durchgeführt, um das gesamte Volumen der vereinigten UGPPase-aktiven Fraktionen zu behandeln.
Die aktiven Fraktionen wurden miteinander vereinigt und bei 4°C 12 Stunden lang gegen 10 Liter der Dialysatlösung (1 mM DTT, 1 mM 2-Mercaptoehtanol, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) dialysiert. Diese Lösung, 85 ml auf einmal, wurden auf eine MonoQ HR5/5-Säule (Anionenaustauscher, AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH), die mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) äquillibriert wurde, geladen und die Säule wurde mit 30 ml 40 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit einem linearen 0–0,5 M NaCl-Gradienten mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Dieser Vorgang wurde dreimal durchgeführt, um das gesamte Volumen der Lösung zu behandeln.
Die gesammelten und vereinigten, aktiven Fraktionen wurden bei 4°C 12 Stunden lang gegen fünf Liter der Dialysatlösung (1 mM DTT, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 75 mM Tris-HCl, pH 9,0) dialysiert. Elf ml dieser dialysierten Lösung wurden auf einmal auf eine MonoP HR5/20-(schwacher Anionenaustauscher, AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH)Säule, die mit 75 mM Tris-HCl (pH 9,0) äquillibriert wurde, geladen und die Säule wurde mit 40 ml 50 mM Tris-HCl (pH 9,0) mit einem linearen 0–0,5 M NaCl-Gradienten mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Dieser Vorgang wurde zweimal durchgeführt, um das gesamte Volumen der dialysierten Lösung zu behandeln.
Die aktiven Fraktionen bei 4°C 12 Stunden lang gegen 10 Liter der Dialysatlösung (1 mM DTT, 1 mM 2-Mercaptoehtanol) dialysiert und lyophilisiert, um das Volumen der Lösung von drei ml auf zwei ml zu verringern. Es wurden 500 μl × 5 Behandlungslösung für Proben einer naiven PAGE (312,5 mM Tris-HCl, pH 7,8, 75% Glycerin, 0,005% BPB) dazugegeben. Dann wurden jeweils 500 μl dieser Probe auf ein Blatt von 12,5 Polyacrylamidgel (insgesamt fünf Blätter) aufgebracht. Das Gel wurde zwei Stunden lang einer Elektrophorese unter Verwenden eines Puffers, der 0,025 M Tris und 0,192 M Glycin (pH 8,4) enthält, mit 40 mA unterworfen (23). Nach Beenden der Elektroporese wurde das Gel in der Längsrichtung des Gels in 3 mm große Stücke geschnitten. Jedes ausgeschnittene Stück des Gels wurde getrennt in 500 μl eines Extraktionspuffers (10 mM Tris, pH 7,4, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 500 mM NaCl) suspendiert und 12 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen, um die Proteine zu extrahieren. Die Proteinfraktionen aus diesen ausgeschnittenen Stücken, bei denen bestätigt wurde, dass sie UGPPase-Aktivität zeigen und eine einzelne Bande auf der SDS-PAGE ergeben, wurden als das aufgereinigte UGPPase-Endprodukt gesammelt.
(3) Molekulargewichtsanalyse:
Die gereinigte Schweine-UGPPase wurde einer SDS-PAGE (10–20% Acrylamid-Gradientengel) unterzogen. Die Banden, die mit Coomassie Brilliants Blue (CBB) angefärbt wurden, wurden aus dem Gel ausgeschnitten und gefriergetrocknet. Das Protein wurde aus dem Gel extrahiert und bei 37°C 16 Stunden lang mit Trypsin in Peptidfragmente verdaut, die aufgereinigt, entsalzen und unter Verwenden von ZipTip (MILLIPORE) aufkonzentriert und einer Massenspektrometrie auf Micromass Q-TOF MS (MICROMASS) unterzogen wurden. In dem Massenspektrometer wurden die Peptidfragmente mit Hilfe des ESI-(Elektrospray-Ionisierungs-)Verfahrens ionisiert und die so erzeugten Peptidionen wurden entsprechend ihrem Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z) aufgetrennt. Peptidionen, die ein m/z von 400 bis 1800 besaßen, wurden ausgewählt und durch Kollisionsenergie mit Inertgasmolekülen weiter fragmentiert, um Ionenleitern mit einem m/z von 50 bis 2000 zu erzeugen. Es wurden zwei Arten von Leitern erhalten, wobei eine Reihe aus Fragmenten von dem N-Terminus und die andere von dem C-Terminus bestand. Die Massenunterschiede zwischen den Fragmenten wurden in einem TOF-(Flugzeit)Massenspektrometriesystem bestimmt und es wurden Informationen über die Aminosäuresequenz von entweder dem N- oder dem C-Terminus des Proteins aus erhalten.
(4) PCR-Klonierung der AAD15563.1-cDNA:
Um die AAD15563.1-cDNA zu amplifizieren wurde eine PCR unter Verwenden von 1,6 μg einer cDNA-Datenbank von humaner Schilddrüse, 4 pmol eines nach vorne laufenden Primers 5'-CATATGGAGCGCATCGAGGGGGCGTCCGT-3' (SEQ ID NO: 9), der an seinem 5'-Ende eine NdeI-Spaltungstelle einschloss, 4 pmol eines rückwärts laufenden Primers 5'-GGATCCTCACTGGAGATCCAGGTTGGGGGCCA-3' (SEQ ID NO: 10), der eine BamHI-Spaltungsstelle einschloss, 1 Einheit AmpliTaq Gold-(PERKIN ELMER) DNA-Polymerase und 0,2 mM dNTP (PERKIN ELMER) in AmpliTaq Gold-Puffer (PERKIN ELMER) in dem Endvolumen von 20 μl auf dem Gene Amp PCR-System 9700 (PERKIN ELMER) unter den folgenden Bedingungen: 94°C für 5 Minuten, 35 Zyklen von (94°C für 1 Minute, 55°C für 1,5 Minuten und 72°C für 2 Minuten); 72°C für 5 Minuten; und dann 4°C durchgeführt. Eine Elektrophorese (0,8% Agarosegel) des Reaktionsprodukts zeigte eine einzelne Bande von AAD15563.1 (8). Fünfzig ng des so amplifizierten 678 bp großen cDNA-Fragments wurden mit einem GFX^TM-PCR-DNA-Kit und einem Kit zur Aufreinigung von Gelbanden (Gel Band Purification kit) (einem Kit, das einen ein chaotropes Mittel enthaltenden Puffer zum Denaturieren des Proteins und zum Auflösen der Agarose, eine Mikrosäule, die mit einer Glasfasermatrix vorgepackt wurde, um spezifisch DNA zu adsorbieren, einen Tris-EDTA-Waschpuffer und autoklaviertes, doppelt-destilliertes Wasser zu Elution einschließt: AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) gereinigt, mit 25 μg DNA des pT7Blue-T-Vektors (NOVAGEN) vermischt und das Volumen der Lösung wurde mit destilliertem Wasser auf 5 μl eingestellt. Dies wurde dann mit 5 μl der Lösung I (einem T4-DNA-Ligase enthaltendem Puffer) des Ligations-Kits Ver. 2 (TAKARA) vermischt und bei 16°C über Nacht stehen gelassen, um das cDNA-Fragment in den Vektor zu klonieren (9). Der Vektor, der die cDNA trägt, wurde in E. coli (JM109) eingeschleust und die Zellen wurden bei 37°C über Nacht in 1,5% LB-Agarmedium (GIBCO BRL) stehen gelassen. Einige der einzelnen Kolonien, die sich auf dem Agarmedium bildeten, wurden bei 37°C über Nacht unter Rühren in 2 ml flüssigem LB-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin (LB+Amp) (DIFCO) enthielt, kultiviert. Die Kultur wurde fünf Minuten lang bei 4°C mit 18.000 g zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Die Plasmide wurden unter Verwenden des RPM^TM-Kits (BIO 101, INC.) aus den präzipitierten Zellen extrahiert. 500 ng des Plasmids, das aus einigen der Klone ausgewählt wurde, wurden entsprechend jeweils mit 1 Einheit der Restriktionsenzyme NdeI (TAKARA) und BamHI (TAKARA) in K-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol, 100 mM NaCl) (TAKARA) in dem Endvolumen von 15 μl und 1 Stunde lang bei 37°C umgesetzt. Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung einer Elektrophorese in 0,8% Agarosegel unterworfen. Die Plasmid-Klone wurden untersucht und diejenigen, die die cDNA trugen, wurden selektiert.
(5) Bestätigung der Sequenz der eingeschleusten AAD15563.1-cDNA:
Einige der vorstehend selektierten Plasmide wurden für die Bestätigung der Nukleotidsequenz der eingeschleusten AAD15563.1-cDNA verwendet. Zwölf μl der Reaktionsmischung enthielten 400 ng von einem der Plasmide, 2 pmol des T7-Primers (T7-Promotor-Primer: 5'-TCTAATACGACTCACTATAGG-3') (SEQ ID NO: 11), 2 pmol des M13-Primers M4 (5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3') (SEQ ID NO: 12), 4,8 μl der Reaktionslösung, die dem Dye Termintor Ready Reaction-Kit (ABI) beigelegt ist. Die Sequenzierungsreaktion wurde auf dem Gene Amp PCR-System 9700 (PERKIN ELMER) unter den folgenden Bedingungen: (96°C für 10 Sekunden, 50°C für 5 Sekunden und 60°C für 4 Minuten) × 25 Zyklen und 4°C durchgeführt. 1,2 μl 3 M Natriumacetat und 30 μl 100% Ethanol wurden zu dem Gesamtvolumen der Reaktionsmischung gegeben, um eine Suspension zu ergeben. Die Suspension wurde dann 20 Minuten lang auf Eis stehen gelassen und 20 Minuten lang mit 18.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und 200 μl 70% Ethanol wurden dazugegeben, um das Präzipitat zu suspendieren, das dann 5 Minuten lang mit 18.000 g zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde verworfen und das Präzipitat wurde getrocknet, in 10 μl Template Suppression Reagent (PERKIN ELMER) resuspendiert, 2 Minuten lang bei 95°C stehen gelassen und in 2 Minuten schnell auf Eis abgekühlt. Diese Probe wurde auf einer Genanalysiervorrichtung ABI PRISM310 Genetic Analyzer (PERKIN ELMER) analysiert, um die Nukleotidsequenz der in das Plasmid eingebauten cDNA zu bestimmen. Nachdem die Nukleotidsequenzen von verschiedenen Klonen bestimmt wurden, wurde ein Klon, der eine cDNA mit der gleichen Sequenz wie derjenigen, die für die AAD15563.1-cDNA berichtet wurde, besaß, selektiert.
(6) Einbau der AAD15563.1-cDNA in einen Expressionsvektor:
Ein μg des Plasmidklons, bei dem bestätigt wurde, dass er die DNA von Interesse enthielt, wurde mit Restriktionsenzymen, NdeI und BamHI (beide von TAKARA) verdaut. Getrennt davon wurde der Vektor pET11a (NOVAGEN) mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut. Das verdaute Plasmid und der verdaute Vektor wurden jeweils einer Elektrophorese in 0,8% Agarosegel unterworfen. Nach Färben mit 1 μg/ml Ethidiumbromid wurden die Banden, die dem cDNA-Fragment bzw. pET11a entsprachen, aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwenden des GFX^TM-PCR-DNA- und des Gel Band Purification-Kit (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) extrahiert und gereinigt. Unter Verwenden von 50 ng des gereinigten cDNA-Fragments und 25 ng pET11a wurde das Fragment mit dem Expressionsvektor ligiert, um auf die gleiche Weise, wie sie oben unter Bezug auf die Ligation des 678 bp großen cDNA-Fragments und der pZ7Blue-T-Vektor-DNA beschrieben ist, zu reklonieren. Das erhaltene Plasmid (10) wurde in E. coli (JM109)-Zellen eingeschleust und dann so, wie oben beschrieben ist, aus den Zellen rückgewonnen. Mit Hilfe eines NdeI/BamHI-Verdaus gefolgt von einer Agarosegel-Elektrophorese wurde bestätigt, dass das rückgewonnene Plasmid die AAD15563.1-DNA enthielt (11). Das Plasmid wurde dann in E. coli AD494(DE3) (NOVAGEN), einen Wirt, der an eine große Expression fremder Proteine angepasst wurde, eingeschleust. Der so erhaltene Transformant wurde am 12. Februar 2002 bei der IPOD International Patent Organisms Depository von RIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higshi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken 305-8566 Japan (Hinterlegungsnr. FERM BP-7886) hinterlegt.
(7) Expression und Aufreinigung des rekombinanten AAD15563.1-Proteins:
Die vorstehend mit dem Plasmid pET11a.AAD15563.1 transformierten E. coli AD494(DE3)-Zellen wurden in 10 ml flüssigem LB-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin (LB+Amp) (DIFCO) enthielt, bei 37°C über Nacht unter Rühren kultiviert. Die gesamten Zellen wurden dann in einem Liter frischen LB+Amp-Medium, das in einem fünf Liter-Erlenmayer-Kolben enthalten war, angeimpft und bei 37°C kultiviert. Wenn die OD₅₅₀ der Kultur ungefähr 0,5 erreichte, wurde 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid zu dem Medium gegeben und die Kultur wurde weitere 3 Stunden lang bei 37°C fortgesetzt. Die Kultur wurde 15 Minuten lang mit 8.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die präzipitierten Zellen wurden gesammelt, in 100 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,5) suspendiert und bei 4°C 15 Minuten lang mit 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die präzipitierten Zellen wurden in 100 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,5), das 1 mM DTT und 1 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, suspendiert und mittels Beschallung auf Eis lysiert. Nach 15-minütiger Zentrifugation bei 4°C mit 10.000 g wurde der Überstand rückgewonnen, durch eine Membran mit der Porengröße von 0,45 μm filtriert und auf eine Q-Sepharose HP HiLoad 26/10-Säule (AMERSHAM PHARMACIA), die mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,5), das 1 mM DTT und 1 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, äquillibriert wurde, geladen. Nach Waschen mit 100 ml des Äquillibrierungspuffers wurde die Säule mit 500 ml des Äquillibrierungspuffers mit einem linearen 0–1,5 M NaCl-Gradienten mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min eluiert. Die UGPPase-aktive Fraktion (18 ml) wurde gesammelt und über Nacht gegen einen Liter einer Dialysatlösung, die aus 1 mM DTT und 1 mM 2-Mercaptoethanol bestand, dialysiert. Bei dieser dialysierten aktiven Fraktion wurde der Puffer gegen 50 mM Tris-HCl (pH 8,5) ausgetauscht. Diese Fraktion wurde dann auf eine MonoP HR5/20-Säule, die mit 20 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,5), das 1 mM DTT und 1 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, äquillibriert wurde, geladen. Die Säule wurde mit 40 ml dieses Äquillibrierungspuffers mit einem linearen 0–1,5 M NaCl-Gradienten mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Die Fraktion, die die höchste UGPPase-Aktivität und die höchste Reinheit zeigte, wurde als das aufgereinigte Endprodukt ausgewählt.
(8) Northern Blot-Analyse von normalen Geweben aus Schwein und einem erwachsenen Menschen
Eine Northern Blot-Analyse wurde unter Verwenden der gesamten RNA aus verschiedenen normalen Geweben von Schwein und Mensch durchgeführt, um die Expressionsmengen von UGPPase in diesen Geweben zu untersuchen. Die untersuchten Schweinegewebe waren Gewebe aus dem Muskel, dem Herzen, der Leber, der Niere, der Lunge, dem Hirn und Fettgewebe. Für eine Northern Blot-Analyse wurde ein kommerziell erhältlicher, bereits hergestellter Northern Blot (Human Adult Notmal Tissue Total RNA Northern Blot I, Katalog-Nr. 021001: BIOCHAIN INSTITUTE, INC, Hayward, CA) verwendet, der die gesamte RNA aus verschiedenen humanen, normalen Geweben (Herz, Hirn, Niere, Leber, Lunge, Pankreas, Milz und Skelettmuskel) enthielt, die auf einem denaturierenden Formaldehyd-1%-Agarosegel laufen gelassen und auf ladungsmodifizierte Nylonmembran übertragen wurden.
(9) Herstellung des Anti-hUGPPase-Antikörpers
Das aufgereinigte Endprodukt der in (7) oben erhaltenen hUGPPase wurde als Antigen zum Erzeugen eines Anti-hUGPPase-Antikörpers verwendet. Zwei hundert μg des Antigenproteins wurden in ein 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen gegeben und 1 ml GERBU ADJUVANT 100 (das 0,025 mg/l Glycopeptid, das aus Zellwänden von L. bulgaricus stammte, 50 g/l aus Parafin basierende Nanopartikel, Kationenbildner, Cimetidin und Saponin: BIOTECHNIK GmbH einschließt), wurden dazugegeben (alternativ dazu kann Freund-Komplett-Adjuvant verwendet werden). Die Mischung wurde mit einem Vortex-Mischer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, um eine Antigenemulsion zu erhalten. Ein 10 Wochen altes, weißes Neuseeland-Kaninchen wurde durch Injizieren dieser Antigenemulsion einmal pro Woche in einen Muskel einer hinteren Gliedmaße immunisiert. Fünf Wochen nach Beginn des Imunisierungsvorgangs wurde das Tier getötet und das Antiserum wurde mit Hilfe eines herkömmlichen Verfahrens hergestellt. Das Antiserum (Anti-hUGPPase-Antiserum) wurde auf zwei Reaktionsröhrchen aufgeteilt und jeweils bei 4°C und –20°C gelagert.
(10) Rekombination der AAD15563.1-cDNA in dem His-tag-Fusionsproteinexpressionsvektor pET-19b
Ein μg pET11a AAD15563.1, dessen Nukleotidsequenz bestätigt wurde, wurde mit Restriktionsenzymen, NdeI und BamHI, in der Reihenfolge verdaut. Getrennt davon wurde der Vektor pET-19b (NOVAGEN) mit den gleichen Restriktionsenzymen in der Reihenfolge verdaut. Die entsprechenden Reaktionsmischungen wurden einer 0,8%-Agarose-Elektrophorese unterworfen und nach Färben mit 1 μg/ml Ethidiumbromid und unter Beleuchtung mit Ultraviolettlicht, wurden die Banden die der hUGPPase-cDNA und dem pET-19b-Vektor entsprechen, aus dem Gel ausgeschnitten. Die DNA-Fraktionen wurden unter Verwenden des GFX^TM-PCR-DNA- und des Gel Band Purification-Kit (AMERSHAM BIOSCIENCES) extrahiert und gereinigt. Fünfzig ng des hUGPPase-cDNA-Fragments wurden dann mit ungefähr 25 ng des Vektors pET-19b vermischt und 5 μl der Lösung I des Ligation-Kits Ver. 2 (TAKARA) wurden zu der Mischung gegeben und die Ligationsreaktion wurde über Nacht bei 16°C stattfinden gelassen. Das so konstruierte Plamids pET-19b AAD15563.1 wurde in E. coli AD494(DE3)-Zellen eingeschleust.
(11) Expression und Aufreinigung des hUGPPase-His-tag-Fusionsproteins
Die E. coli AD494(DE3)-Zellen, die das Plasmid pET-19b AAD15563.1 tragen, wurden in einer Schüttelkultur in flüssigemLB+Amp-Medium [Miller-LB Broth Base (GIBCO BRL), 50 μg/ml Ampicillinnatriumsalz] bei 37°C über Nacht kultiviert. Am folgenden Tag wurden alle Zellen in 11 flüssiges LB+Amp-Medium in einem 51-Erlenmeyer-Kolben überführt. Die Zellen wurden bei 37°C in einer Schüttelkultur kultiviert und wenn die OD der Kultur bei 600 nm ungefähr 0,5 erreichte, wurde Isopropyl-β-D-thiogalactopyanosid mit der Endkonzentration von 1 mM zu dem Medium gegeben und die Schüttelkultur wurde für weitere 3 Stunden bei 37°C fortgesetzt. Dann wurde die Kultur 15 Minuten lang bei 4°C mit 8.000 g zentrifugiert. Die präzipitierten Zellen wurden in 250 ml 50 mM Tris-HCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1% Triton X-100, pH 9,0 resuspendiert. Die Zellen wurden auf Eis beschallt, 15 Minuten lang bei 4°C mit 10.000 g zentrifugiert und der Überstand wurde gesammelt. Der Vorgang wurde auf 6 l des E. coli-Kulturmediums wiederholt, um insgesamt 1,3 l Überstand zu erhalten. Der Überstand wurde durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert und das gesamte Volumen davon wurde auf eine Q-Sepharose HP HiLoad 26/10-Säule (AMERSHAM BIOSCIENCES), die mit 50 mM Tris-HCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1% Triton X-100, pH 9,0 äquillibriert wurde, geladen. Die Säule wurde mit 100 ml des Äquillibrierungspuffers gewaschen und das adsorbierte Protein wurde dann mit 500 ml dieses Äquillibrierungspuffers mit einem linearen 0–1,5 M NaCl-Gradienten mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min eluiert. Eine UGPPase-aktive Fraktion (60 ml) wurde gesammelt und das gesamte Volumen davon wurde auf ein 5 ml-TALON^TM-Metall-Affinitäts-Harz (co-immobilisiertes Affinitätsharz: CLONTECH), das mit 50 mM Tris-HCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1% Triton X-100, pH 9,0 äquillibriert wurde, geladen. Die Säule wurde mit 20 ml dieses Äquillibrierungspuffers, der mit 150 mM Imidazol versetzt war, gewaschen, um eine UGPPase-aktive Fraktion (13,5 ml) zu sammeln. Diese Fraktion wurde dann auf eine Superdex^TM-200 HR-Säule (Gelfiltrationssäule, die aus hochvernetzten, porösen Agarosekügelchen, die kovalent geundenes Dextran tragen, bestand: AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH), die mit 0,2 M NaHCO_s, 0,1 M NaCl, pH 8,3 äquillibriert wurde, geladen und mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min gelfiltriert. Die am meisten UGPPase-aktive und am höchsten gereinigte Fraktion wurde als das aufgereinigte hUGPPase-His-tag-Fusionsprotein-Endprodukt gesammelt.
(12) Western Blot-Analyse des hUGPPase-His-tag-Fusionsproteins
Um sicherzustellen, dass das vorstehend erhaltene aufgereinigte Endprodukt das hUGPPase-His-tag-Fusionsprotein ist, wurde eine Western Blot-Analyse unter Verwenden des in (9) oben erhaltenen Anti-hUGPPase-Antiserums und eines kommerziell erhältlichen, monoklonalen Anti-Histidin-tag-Antikörpers (SIGMA) durchgeführt. Ein μg des hUGPPase-His-tag-Fusionsproteins wurden mittels SDS-PAGE (10–20% Acrylamid-Gradientengel (DAIICHI PURE CHEMICALS CO., LTD.) aufgetrennt und bei 4°C mit 10 V für 2 Stunden auf eine Trans-Blot-Transfermembran (BIO-RAD) übertragen. Die Membran wurde mit 3% (w/v) entrahmter Milch in TBS [Tris gepufferte Kochsalzlösung, pH 8,0 (SIGMA)] blockiert und mit einem monoklonalen, murinen Anti-His-tag-Antikörper (GENZYME/TECHNE), der mit TTBS [Tris gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween 20, pH 8,0 (SIGMA)] verdünnt war, und dann mit dem Anti-hUGPPase-Antiserum, das 1.000-fach mit TTBS verdünnt wurde, jeweils 1 Stunde lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Die Membran wurde 3-mal, jeweils für 5 Minuten, mit TTBS gewaschen. Die Membran wurde 1 Stunde lang bei 37°C entweder mit einem alkalische Phosphatase-konjugierten Ziege-Anti-Maus-IgG (BIO-RAD), der zum Nachweis auf Basis des monoklonalen Anti-His-tag-Antikörpers 1000-fach mit TTBS verdünnt war, oder einem alkalische Phosphatase-konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (BIO-RAD), der zum Nachweis auf Basis des Anti-hUGPPase-Antiserums 1000-fach mit TTBS verdünnt war, inkubiert. Nachdem die Membran 3-mal, für jeweils 5 Minuten, mit TTBS gewaschen wurde, wurde eine Substratlösung zu der Membran gegeben, um eine Farbentwicklung zuzulassen.
(13) Herstellung der Antigensäule
Für die Affinitätsreinigung des Anti-hUGPPase-Antikörpers aus dem Kaninchen-Anti-hUGPPase-Antiserum haben die Erfinder die Herstellung einer Antigensäule auf Basis des hUGPPase-His-tag-Fusionsproteins versucht. Acht mg des aufgereinigten hUGPPase-His-tag-Fusionsproteins wurden in 14,3 ml 0,2 M NaHCO₃, 0,5 M NaCl, pH 8,3 hergestellt. Dies wurde auf eine 5 ml-HiTrap NHS-aktivierte Säule (N-Hydroxysuccinimid-aktivierte Sepharose^®: PHARMACIA BIOTECH), die mit 1 mM HCl äquillibriert wurde, geladen, um eine kovalente Bindung des Proteins an die Säule zuzulassen. Die Säule wurde dann mit 30 ml 1 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, pH 8,3 und 30 ml 0,1 M Citrat, 0,5 M NaCl, pH 3,0 in der Reihenfolge gewaschen.
(14) Reinigung des Anti-hUGPPase-Antikörpers
Nachdem die oben hergestellte Antigensäule mit PBS äquillibriert wurde, wurden 20 ml des Anti-hUGPPase-Antiserums auf die Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit 20 ml PBS gewaschen und dann mit 0,1 M Citrat, 0,5 M NaCl, pH 3,0 eluiert. Die Antikörper-Fraktion wurde über Nacht gegen 5 l destilliertes Wasser dialysiert und dann lyophilisiert.
(15) Markieren des Kaninchen-Anti-hUGPPase-Antikörpers
Der oben erhaltene Kaninchen-Anti-hUGPPase-Antikörper wurde in 100 mM NaHCO₃, pH 8,3 mit einer Endkonzentration von 4 mg/ml gelöst. Zu 150 μl dieser Lösung wurden 50 μl Peroxidase, Activated (aktivierte Peroxidase aus Meerrettich: ROCHE) gegeben und bei Raumtemperatur stehen gelassen, um die Meereettich-Peroxidase (HRP) an den Antikörper binden zu lassen. Nach der Zugabe von 20 μl 1 M Tris-HCl, pH 8,0 und dann 25 μl 200 mM NaBH₄ wurde die Mischung für 30 Minuten auf 4°C gehalten. Dann wurden 12,5 μl 200 mM NaBH₄ dazugegeben und die Mischung wurde 2 Sunden lang bei 4°C gehalten, um die Reaktion vollständig zu terminieren. Nach der Zugabe von 5 μl 1 M Glycin, pH 7,0 zum Stabilisieren des Antikörpers wurde die Lösung gegen 1,5 l PBS 10 mM Glycin, pH 7,4 bei 4°C über Nacht dialysiert. Die so erhaltene Lösung des markierten Antikörpers wurde als der HRP-konjugierte Kaninchen-Anti-hUGPPase-Antikörper bei 4°C gelagert.
(16) hUGPPase-ELISA
Der in (14) oben hergestellte Kaninchen-Anti-hUGPPase-Antikörper wurde mit 50 mM NaHCO₃, pH 9,6 verdünnt, um eine 25 μg/ml-Lösung herzustellen. Die Lösung wurde in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen (NUNC), jeweils 100 μl, gegeben und zur Beschichtung 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Antikörperlösung wurde entfernt und 300 μl eines Blockierungspuffers [1,0% (w/v) BSA, PBS, 10 mM Glycin, pH 7,4] wurde zu jeder Vertiefung gegeben und zur Blockierung 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert.
Für die Herstellung eines Standards wurde das hUGPPase-His-tag-Fusionsprotein unter Verwenden eines Verdünnungspuffers [20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% (w/v) BSA, pH 7,4] schrittweise auf 10 μg/ml bis 0,1 ng/ml verdünnt.
Um sie als Proben zu verwenden, wurden zwei Arten von E. coli AD494(DE3)-Zellen, die eine mit einem eingeschleusten Plasmid pET-19b AAD15563.1 und die andere entsprechend mit dem Plasmid pET-19b, wurden lysiert und mit dem Verdünnungspuffer auf 50, 5, 0,5 und 0,05 μg/ml verdünnt. Aus jeder Vertiefung der Platte wurde der Blockierungspuffer entfernt und diese 3-mal mit jeweils 300 μl TTBS gewaschen. Zu jeder Vertiefung wurden 100 μl des Standards oder der Probenlösung gegeben und es erfolgte eine 1-stündige Inkubation bei 37°C.
Für den Nachweis des hUGPPase-His-tag-Fusionsproteins wurde der in (15) hergestellte HRP-konjugierte Kaninchen-Anti-hUGPPase-Antikörper nach der Verdünnung auf 0,5 μg/ml mit dem Verdünnungspuffer verwendet. Nachdem die Zellen 3-mal mit TTBS gewaschen wurden, wurden 100 μl der Nachweis-Antikörperlösung zu jeder Vertiefung gegeben und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann 3-mal mit TTBS gewaschen und 100 μl TMB LIQUID SUBSTRATE SYSTEM FOR ELISA (ein Flüssigsubstratsystem für ELISA, das das Chromogen 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid in einem Puffer, pH 6,0 enthielt: SIGMA) zu jeder Vertiefung gegeben. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden 50 μl 2 M H₂SO₄ zu jeder Vertiefung gegeben, um die Reaktion zu terminieren und die OD bei 450 nm wurde bestimmt.
(17) Bestimmung von UDPG in einer Probe
Die Untersuchung wurde durchgeführt, um ein Verfahren zur Bestimmung von UDPG in einer Probe zu etablieren. In dem Verfahren wurde die Menge an UDPG als die Menge an G1P, die durch den von UGPPase katalysierten, hydrolytischen Abbau von UDPG in der Probe produziert wird, bestimmt.
Zwanzig μl einer Flüssigprobe, die UDPG in einer der in 25 angegebenen Mengen enthielt, wurden zu einem 30 μl-Cocktail gegeben, der 1,5 Einheiten UGPPase, 30 mM MgCl₂ und 70 mM Tris-HCl (pH 9,0) einschloss. Nach 7-minütiger Inkubation bei 37°C wurde die Reaktion durch Erhitzen für 2 Minuten auf 100°C terminiert. Die Assaymischung wurde dann 5 Minuten lang mit 20.000 x g zentrifugiert. Dreißig μl des Überstands wurden dann zu einem 270 μl-Cocktail gegeben, der 50 mM Hepes, pH 7,0, 0,1 mM EDTA, 2 mM MgCl₂, 15 mM KCl, 0,4 mM NAD⁺ und jeweils 3 Einheiten G6P-Dehydrogenase und Phosphoglucomutase enthielt. Die Menge an erzeugtem NADH (die die Menge an G1P angibt) wurde dann spektrophotometrisch bei 340 nm bestimmt.
Ergebnisse:
(1) Aufreinigung der Schweine-UGPPase

Tabelle 1 zeigt die UGPPase-Aktivität und dessen Reinheit, die bei dem aufgereinigten Produkt in jedem Schritt der Aufreinigung erfasst wurde. 2 zeigt das Ergebnis der SDS-PAGE dieser Proben. Die spezifische Aktivität des aus der nativen PAGE eluierten Endprodukts, das ungefähr 60.000-fach aufgereinigt wurde, betrug 32 U/mg. Es wurde gefunden, dass dieser Wert in hohem Maße mit den berichteten Werten der spezifischen Aktivität der aus Gerste oder E. coli aufgereinigten AGPPase, entsprechend 23 U/mg oder 9,5 U/mg (13, 14), vergleichbar war. Es wird daraus geschlossen, dass die bei der SDS-PAGE nachgewiesene, einzelne Bande des Endprodukts der Aufreinigung (2) aufgrund ihres identischen Verhaltens mit der UGPPase-aktiven Bande in den Schritten der Aufreinigung unter Verwenden von MonoP (3 und 4) bzw. nativer PAGE (5) die UGPPase ist. Tabelle 1

	Aktivität mU	Volumen ml	Gesamtaktivität mU	Proteinkonz. mg/ml	spezif. Aktivität mU/mg	R %	Y %	P-fach
Rohextrakt 30.000 g	6,86	12000	82269	12,80	0,54	100	100	1,00
sup.	18,72	10000	187217	13,10	1,43	248	228	2,67
ppt.	7,07	2350	16618
dialysiert 100.000 g	16,67	13700	228408	10,40	1,60	122	278	2,99
sup.	16,02	10900	174671	8,30	1,93	84	212	3,61
ppt.	13,44	1200	16123
Q-Sepharose
O	3,08	24000	73926	1,41	2,18	84	90	4,08
x	2,00	36000	72054
Re-Q-Sepharose
O	12,14	1600	19426	1,47	8,26	60	24	15,42
x	4,37	5700	24936
Hydroxyapatit Q-Sepharose (linearer Gradient)	10,31	1800	18562	0,59	17,42	96	23	32,52
O	121,86	110	13404	1,99	61,24	72	16	114,3
x	12,68	180	2283
Superdex 200
O	63,28	250	15821	0,36	178,3	118	19	332,8
x	19,80	200	3960
MonoQ
O	548,59	22,0	12069	1,93	284,2	76	15	530,7
x	15,39	27,5	423
MonoP
O	2120,28	3,0	6361	2,46	861,9	53	8	1609
x	118,18	5,0	591
Native PAGE
O	876,28	2,5	2191	0,03	32819	34	3	61275
x	6,10	0,5	3

R; Rückgewinnung, Y; Ausbeute, P; Reinigung, sup.; Überstand, ppt. Präzipitat, O; verwendet in dem nächsten Schritt, x; nicht verwendet

(2) ESI-TOF MS/MS-Analyse der Schweine-UGPPase:
Sieben Peptidfragmente, die durch Trypsinbehandlung des Endproukts der Aufreinigung hergestellt wurden, wurden mitels ESI-TOF MS/MS zur Aminosäuresequenzierung analysiert. Es wurde gefunden dass die so bekannten Sequenzen (SEQ ID NO: 5, 6, 7 und 8) mit vier Bereichen von humanen bzw. murinen Proteinen mit unbekannter Funktion in hohem Maße homolog waren. Die humanen und die murinen Proteine, ID-Nummern AAD15563.1 (NCBI-Hinterlegungsnr. AF111170) (SEQ ID NO: 3) bzw. BAB23110.1 (NCBI-Hinterlegungsnr. AK003991) (SEQ ID NO: 4) wurden als Enzyme betrachtet, da sie ein Nudix-(Nukleosiddiphophat verknüpft mit einem anderen Rest, X)-gleiches Hydrase-Motiv aufwiesen (24). Das gereinigte Schweine-UGPPase-Protein wurde als Schweinehomolog zu diesen humanen und murinen Proteinen, die ungefähr 80% zueinander homolog sind, betrachtet.
(3) Bestimmung der Aktivität des rekombinanten AAD15563.1 und dessen Aufreinigung:
Die für AAD15563.1 codierende DNA, die nun auf Basis der obigen Ergebnisse der ESI-TOF MS/MS als humane UGPPase betrachtet wurde, wurde mittels PCR amplifiziert und in einen Expressionsvektor kloniert (10) und es wurde dann bestätigt, dass das rekombinante Protein UGPPase-Aktivität besaß. Die Primer für diese PCR wurden entsprechend der Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 1), die von der NCBI (dem National Center for Biotechnology Information) berichtet wurde, konstruiert. Die amplifizierte DNA wurde in den E. coli-Expressionsvektor pET11a kloniert, um ein Plasmid, pET11a-AAD15563.1, zu erhalten. Dieses Plasmid wurde in E. coli AD494-Zellen eingeschleust. Die Suspension der transformierten E. coli AD494(DE3)-Zellen, die das eingeschleuste Gen exprimierten, zeigten eine 8-fach höhere UGPPase-Aktivität als die Suspension der Kontrollbakterien, die einfach das intakte Plasmid, pET11a erhielten (12). Die SDS-PAGE (Polyacrylamid 10–20%) der Suspension der transformierten Bakterien bestätigte die Bande des exprimierten Proteins (12). Die Ergebnisse der SDS-PAGE (13) und der Bestimmung der UGPPase-Aktivität der Suspension der AAD15563.1 exprimierenden E. coli AD494(DE3)-Zellen, dessren lösliche Fraktionen nach einer Beschallung und die jeweiligen mittels Q-Sepharose und MonoP aufgereinigten Produkte gaben an, dass die spezifische Aktivität des UGPPase parallel mit der ansteigenden Stärke der Bande zunahm. Die spezifische Aktivität des Endprodukts, das eine einzelne Bande auf der SDS-PAGE zeigte, betrug 6,7 U/mg, ein Wert, der mit demjenigen der finalen, aufgereinigten Schweine-UGPPase vergleichbar war. Diese Ergebnisse geben an, dass das Protein AAD15563.1 eine humane UGPPase ist.
(4) Charakterisierung der humanen und der Schweine-UGPPase:

Unter Verwenden der aufgereinigten Mensch- und Schweine-UGPPase-Endprodukte wurde eine Untersuchung durchgeführt, um die optimalen Bedingungen für ihre enzymatische Aktivität zu erfahren. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Enzyme ihren optimalen pH in dem Bereich von 9,5 bis 10 aufweisen und Mg²⁺-abhängig sind (14 und 15). Die Kd (Dissoziationskonstante) der Enzyme mit dem Substrat UDPG wurde als entsprechend 4,35 mM und 4,26 mM für Mensch- und Schweine-UGPPase bestimmt, wodurch ihre nahezu gleiche Affinität zu dem Substrat angegeben wird (16 und 17). Mit ADPG, UDPG und GDPG zeigten das humane und das Schweine-UGPPase beide die höchste Substratspezifität mit UDPG: in Gegenwart von 5 mM eines entsprechenden Substrats wurde gemessen, dass ihre Aktivität im Vergleich zu der Aktivität mit UDPG (100%) jeweils nur ungefähr 20 und 10% mit ADPG und GDPG betrug (Tabellen 2 und 3). Tabelle 2 (a) Schweine-UGPPase

Substrate	% Aktivität bezogen auf UDPG
UDPG	100
UDP-Glucuronsäure	bdl
UDP-Galactose	bdl
ADPG	20
ADP-Ribose	95
GDPG	10
CDPG	2
ATP	bdl
UTP	bdl
AMP	bdl
UTP	bdl
ADP	bdl
NAD	bdl
Bis-PNPP	bdl
PNPP	bdl

bdl: unterhalb der Nachweisgrenze

Substrate	% Aktivität bezogen auf UDPG
UDPG	100
UDP-Glucuronsäure	bdl
UDP-Galactose	bdl
ADPG	15
ADP-Ribose	110
GDPG	10
CDPG	3
ATP	bdl
UTP	bdl
AMP	bdl
UTP	bdl
ADP	bdl
NAD	bdl
Bis-PNPP	bdl
PNPP	bdl

bdl: unterhalb der Nachweisgrenze

(5) Northern Blot-Analyse von normalen Geweben aus Schwein und einem erwachsenen Menschen
18 und 19 zeigen das Ergebnis der Northern Blot-Analyse der gesamten RNA aus Geweben von entsprechend Schwein und erwachsenem Menschen. Es ist zu sehen, dass die UGPPase-mRNA in verschiedenen, untersuchten Geweben auftritt.
(6) Konstruktion von pET-1b AAD15563.1 und Aufreinigung deshUGPPase-His-tag-Fusionsproteins
Die 20 und 21 zeigen den Expressionsvektor pET-19b AAD15563.1 und das Ergebnis von dessen Agarosegelelektrophorese nach dem Verdau mit NdeI und BamHI. Es wurde gefunden, dass E. coli AD494(DE3)-Zellen, die mit diesem Plasmid transformiert waren, eine große Menge des His-tag-Fusionsproteins exprimierten. Die Western Blot-Analyse des aufgereinigten Endprodukt, das in (11) oben erhalten wurde, bestätigt, dass das Protein das hUGPPase-His-tag-Fusionprotein war (22).
(7) hUGPPase-ELISA
Unter Verwenden eines Kaninchen-Anti-hUGPPase-Antikörpers als Festphase und dem aufgereinigten hUGPPase-His-tag-Fusionsprotein als Standard wurde ein ELISA-Nachweissystem etabliert. Die EC50 (Wirkkonzentration für eine Reaktion mit halbem Maximum) dieses Systems wurde als 246,8 ng/ml bestimmt, wobei die unterste Nachweisgrenze bei 10 ng/ml und der Bereich der Messung 10–1.000 ng/ml betrugen (23).
Der mit den Lysaten von E. coli AD494(DE3)-Zellen, die das Plasmid pET-19b AAD15563.1 tragen, durchgeführte ELISA zeigte einen von der Proteinkonzentration abhängigen Anstieg der OD bei 450 nm, wohingegen kein merklicher Anstieg der OD bei 450 nm bei den E. coli AD494(DE3)-Zellen, die nichts außer den Lysaten des Plasmids pET-19b tragen, auftrat. Die Ergebnisse geben an, dass das oben etablierte ELISA-System eine hohe Spezifität zu hUGPPase besitzt, ohne irgendeine Kreuzreaktion mit intrinsischen E. coli-Proteinen zu zeigen.
(8) Bestimmung von UDPG in einer Probe

Die Menge an in einer Probe enthaltendem UDPG wurde unter Befolgung des oben in dem Abschnitt "Materialien und Methoden" beschriebenen Verfahrens bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 und der 25 gezeigt. Die bestimmte Menge von G1P (nmol), die als gleich mit der Menge an UDPG angesehen wird, zeigte eine ausreichende Korrelation mit der Menge an UDPG, die zu Beginn in der Probe enthalten war, was eine Bestimmung der UDPG-Menge in der Probe zulässt. Tabelle 4

UDPG in der Probe in der Assay-Küvette (nmol)	als erzeugtes G1P bestimmtes UDPG (nmol)
6,0	8,4 ± 2,92
9,0	11,8 ± 4,11
10,0	14,4 ± 3,35
15,0	15,4 ± 5,57
22,5	17,8 ± 4,93
30,0	25,7 ± 6,38
45,0	33,3 ± 3,07
60,1	48,2 ± 4,68
90,1	108,5 ± 15,96
150,2	147,4 ± 28,62
300,3	249,9 ± 30,60

Gewerbliche Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung ermöglicht das Bereitstellen von UGPPase in einer aufgereinigten Form und in einem beliebig gewünschten Maßstab. Das so bereitgestellte, aufgereinigte Enzym kann zum Bestimmen der UDPG-Mengen in Proben, wie beispielsweise Blut, verwendet werden. Daneben wird das aufgereinigte Enzym, zum Beispiel als Referenzstandardprodukt in dem Gebiet biochemischer Assays einer Vielzahl von Proben, einschließlich natürlicher, biologischer Proben, für die Bestimmung des Ausmaßes der Aktivität des Enzyms verwendet. Die Verwendung des Referenzstandards ermöglicht, standardisierte Daten über das Ausmaß der Aktivität des Enzyms zu erhalten, was einen genauen quantitativen Vergleich zwischen den Daten, die aus verschiedenen Proben, die zu verschiedenen Zeiten und an verschiedenen Orten gemessen wurden, zulässt. Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Anti-UGPPase-Antikörper sowie ein Verfahren für einen Enzym gekoppetenl Immunosorbensassay (ELISA) auf Basis des Anti-UGPPase-Antikörpers, der für die Bestimmung und/oder den Nachweis von UGPPase in einer Vielzahl von Proben nützlich ist und auch dazu verwendet werden kann, ein ELISA-Kit für die Bestimmung von UGPPase bereitzustellen, bereit. Die vorliegende Erfindung wird ferner auch für die Bestimmung von UDPG in einer Probe, wie beispielsweise Blut, verwendet.
Referenzen

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Sequenzprotokoll

Claims

Gereinigtes Enzymprotein, bestehend aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2.
Gereinigtes Enzymprotein nach Anspruch 1, wobei das Protein eine Aktivität zur Hydrolyse von UDP-Glucose in Glucose-1-phosphat und Uridin-5'-monophosphat aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Enzymproteins mit den Schritten: Einbauen der DNA, bestehend aus der als SEQ ID NO: 1 im Sequenzprotokoll angegebenen Nukleotidsequenz in einen Expressionsvektor, Einführen des so konstruierten Expressionsvektors in kompetente Zellen, Kultivieren der den konstruierten Expressionsvektor enthaltenden Zellen und Aufreinigen des exprimierten Proteins, wobei das Protein eine Aktivität zur Hydrolyse von UDP-Glucose in Glucose-1-phosphat und Uridin-5'-monophosphat besitzt.
Verwendung des rekombinanten Enzymproteins als einen Referenzstandard im Test auf UGPPase-Aktivität in Proben, wobei das rekombinante Enzymprotein aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 besteht.
Verfahren zur Herstellung von gereinigter Säuger-UGPPase, welches ein Protein ist, bestehend aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2. wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Homogenisieren von Gewebe aus einem Säugetier in einem wässrigen Medium, (b) Zentrifugieren des so erhaltenen Homogenats, (c) Sammeln des Überstandes des zentrifugierten Homogenats, (d) Dialysieren des gesammelten Überstandes gegen ein wässriges Medium. (e) Unterwerfen des in obigem Schritt (d) erhaltenen dialysierten Überstandes einem oder mehreren chromatographischen Verfahren unter Verwendung jeweils ein oder mehrerer stationärphasiger Materialien und Sammeln von Fraktionen, die eine konzentrierte UGPPase-Aktivität aufweisen, wobei das stationärphasige Material oder die Materialien ein Material enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Anionenaustauscher, schwachem Anionenaustauscher, Größenausschlussgel und Hydroxylapatit, (f) die in obigem Schritt (e) erhaltenen, eine konzentrierte UGPPase-Aktivität aufweisenden Fraktionen werden einer nativen PAGE unterworfen, und (g) Ausschneiden eines eine konzentrierte UGPPase-spezifische Aktivität enthaltenden Anteils aus dem Gel und Extrahieren des UGPPase-Proteins aus dem Gelanteil mit einem wässrigen Extraktionsmedium.
Gereinigter Antikörper gegen ein Protein, bestehend aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2.
Verfahren zum Bestimmen der UGPPase-Menge, welches ein Protein ist, bestehend aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, in einem Analyten, der auf einem Enzym gekoppelten Immunosorbensassay basiert, mit den Schritten: (a) Bereitstellen einer Festphase, an der ein Anti-UGPPase-Antikörper gebunden ist, (b) In Kontakt bringen einer ersten Lösung, die eine vorbestimmte Menge des Analyten enthält, mit der Festphase für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um der im Analyten enthaltenen UGPPase eine Bindung an die Anti-UGPPase, die an der Feststoffphase gebunden ist, zu ermöglichen, (c) nach Entfernen der ersten Lösung in Kontakt bringen einer zweiten Lösung, die eine vorbestimmte Menge eines enzymkonjugierten Anti-UGPPase-Antikörpers enthält, mit der Festphase für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um dem enzymkonjugierten Anti-UGPPase-Antikörper zu ermöglichen, an die UGPPase zu binden, die an die Anti-UGPPase gebunden vorliegt, welche an die Festphase gebunden ist, (d) nach Entfernen der zweiten Lösung in Kontakt bringen einer dritten Lösung, die eine vorbestimmte Menge eines Substrats für das konjugierte Enzym enthält, mit der Festphase und Reagieren lassen des konjugierten Enzyms mit dem Substrat für eine vorbestimmte Zeitdauer, um ein spezifisches Produkt der Enzymreaktion herzustellen, und (e) Bestimmen der so produzierten Menge an spezifischem Produkt, und (f) Bestimmen der Menge an UGPPase im Analyten, bezogen auf den Vergleich zwischen der Menge des spezifischen Produkts in (e) und der Menge des spezifischen Produkts, die aus einer vorherbestimmten Menge der UGPPase unter den gleichen Bedingungen wie in (b) bis (d) hergestellt wurde.
Verfahren zur Bestimmung des Anteils an UDPG, der in einer Probe enthalten ist, umfassend die Schritte: (a) Vermischen einer vorherbestimmten Menge einer Probe mit einer Pufferlösung, die eine vorherbestimmte Menge an UGPPase enthält, welches ein Protein ist, bestehend aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, um eine Reaktionsmischung herzustellen, (b) Inkubieren der Reaktionsmischung für eine ausreichende Zeitdauer, um UDPG in G1P umzuwandeln, (c) Terminieren der Reaktion durch Erhitzen der Reaktionsmischung, und (d) Bestimmen der Menge an in (d) produziertem G1P durch Umsetzen von G1P, welches zumindest in einem bekannten Anteil der Reaktionsmischung enthalten ist, mit Phosphoglucomutase, G6P-Dehydrogenase und NAD, und Bestimmen des Anteils an produziertem NADH.