DE60314513T2

DE60314513T2 - Verfahren zur herstellung von milchsäure oder deren salz durch gleichzeitige verzuckerung und fermentation von stärke

Info

Publication number: DE60314513T2
Application number: DE60314513T
Authority: DE
Inventors: Roel Otto
Original assignee: Purac Biochem BV
Current assignee: Purac Biochem BV
Priority date: 2002-05-14
Filing date: 2003-05-13
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2023-05-14
Also published as: EP1504109B1; EP1504109A1; US20080261285A1; BR0309981A; US8119376B2; DE60314513D1; EP1504109B2; BRPI0309981B1; AU2003240845A1; WO2003095659A1; ATE365221T1; JP2005525120A; CN1316031C; DE60314513T3; US20050176120A1; JP4405914B2; CN1662653A; US20080261284A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Milchsäure oder eines Salzes davon, wobei Stärke einem Prozess gleichzeitiger Verzuckerung und Fermentation unterworfen wird.
Fermentationsprozesse werden zur Herstellung einer enormen Zahl von Produkten ausgenutzt, die von beträchtlichem kommerziellen Interesse und schwer synthetisch herstellbar sind. In der Industrie wird Fermentation verwendet, um einfache Verbindungen, darunter Alkohole, wie Ethanol und Butanol; organische Säuren, wie Zitronensäure, Itaconsäure, (R)- oder (S)-Milchsäure und Gluconsäure; Ketone; Aminosäuren, wie Glutaminsäure und Lysin; aber ebenso komplexere Verbindungen wie Antibiotoka, wie Penicillin und Tetracyclin; Enzyme; Vitamine, wie Riboflavin, Vitamin B12 und Betacarotin; und Hormone, herzustellen. Auch in der Brauerei-, Wein-, Milch-, Leder- und Tabak-Industrie werden Fermentationsverfahren verwendet.
Zucker trägt am wesentlichsten zu den Herstellungskosten von Milchsäure bei. Größere Reduzierungen in den Herstellungskosten von Milchsäure können daher erreicht werden, wenn der Herstellungsprozess mit preiswertem Zucker gespeist wird. Stärke und Teilhydrosylate von Stärke, letztere sind auch als Flüssigstärke bekannt, die ebenfalls zu Produkten, wie Malto-Oligosacchariden oder Maltodextrinen, gereinigt werden können, repräsentieren solche preiswerten Quellen. Der Begriff „Flüssigstärke" bedeutet Stärke, die einem Prozess der Verflüssigung unterworfen wurde, was eine Säure-, enzymatische oder thermomechanische Verflüssigung von Stärke bedeutet, die zu einer gelösten oder löslichen Form führt. Der Begriff „Malto-Oligosaccharide" bedeutet Maltosaccharide, die aus α-1,4-glucosidischen Bindungen von Anhydroglucose-Einheiten, die einen Grad an Polymerisierung (DP_n) von 2–50 (n) aufweisen, wie Maltose, Maltotriose, Maltotetraose oder Maltopentaose und ähnlichen, zusammengesetzt sind. Der Begriff „Polymerisationsgrad" oder DP_n bedeutet die Anzahl der Anhydroglucopyranose-Einheiten in einem bestimmten Saccharid. Maltose, die zwei α-1,4-glucosidisch verknüpft Glucosereste besitzt, kann als DP₂ bezeichnet werden; Maltotriose, die drei α-1,4-glucosidische verbundene Glucosereste aufweist, kann als DP₃ bezeichnet werden und so weiter. Der Begriff „Maltodextrin" bedeutet ein Stärkehydrolyseprodukt, das einen DE von weiniger als 20 besitzt. Der Begriff „DE" (Dextrose-Äquivalent) bedeutet die reduzierende Kraft (Verlust von Elektronen, der auf die Anwesenheit einer Carbonyl-Funktion zurückzuführen ist), ausgedrückt als D-Glukose auf einer trockenen Basis. Der Begriff „trockene Basis" bedeutet die auf dem Fehlen von Wasser basierende Verbindung. Zum Beispiel würde ein Produkt, das 25 Gewichts-% von Komponente A, 25 Gewichts-% von Komponente B und 50 Gewichts-% Wasser enthält, 50 Gewichts-% von Komponente A (oder B) auf trockener Basis enthalten. Der Begriff „Milchsäure" bedeutet 2-Hydroxypropionsäure in entweder ihrer freien oder in ihrer Salz-Form. Die Salz-Form des Lactats wird speziell als Lactat-Salz bezeichnet, z.B. entweder als Calcium-Salz der Milchsäure oder Calcium-Lactat. Es werden Alkali- und Erdalkali-Salze von Milchsäure bevorzugt. Milchsäure enthält ein chirales Kohlenstoff-Atom und kann aus diesem Grund als (R)- oder (S)-Enantiomer existieren. Der Begriff „Milchsäure", wie in dieser Anmeldung verwendet, erfasst die reinen (R)- und (S)-Isomere, und Gemische davon, einschließlich des racemischen Gemisches. Der Begriff „enantiomerische Reinheit" für einen Überschuss an (S)-Isomer bedeutet:
Enantiomerische Reinheit = 100% × {((S)-Isomer)/((R)-Isomer+(S)-Isomer)}
Der Begriff „enantiomerische Reinheit" für einen Überschuss an (R)-Isomer bedeutet:
Enantiomerische Reinheit = 100% × {((R)-Isomer)/((R)-Isomer+(S)-Isomer)}
Viele Mikroorganismen, die zu Fermentationsverfahren verwendet werden, sind nicht in der Lage, Stärke, Flüssigstärke, Maltodextrine oder Malto-Oligisaccharide zu fermentieren, da ihnen entweder die enzymatische Maschinerie, Stärke zu verflüssigen oder die enzymatische Maschinerie für die Verzuckerung oder beides fehlt. Der Begriff „Verzuckerung" bedeutet die Säure- oder enzymatische Hydrolyse von Stärke oder Flüssigstärke oder Maltodextrinen oder Malto-Oligisacchariden, die schließlich die Herstellung von D-Glucose oder Maltose oder kleinen Malto-Oligisacchariden oder Gemischen davon, ergeben. Verstärkende Kulturen dieser Mikroorganismen mit Präparationen von α-Amylasen oder Glucoamylasen oder Pullanase oder Gemischen davon, können dieses Inkompatibilitätsproblem in geeigneter Weise lösen. Der Begriff "α-Amylase" bedeutet ein Enzym, das zur Funktions-Klasse mit der EC-Nummer 3.2.1.1 und der trivialen Bezeichnung Glycogenase, Diastase, Pilz-α-Amylase oder bakterielle α-Amylase und der systematischen Bezeichnung 1,4-α-D-Glucan-Glucanhydrolase, gehört. α-Amylasen depolymerisieren Polysaccharide, die drei oder mehr 1,4-α-verknüpfte D-Glucose-Einheiten besitzen, teilweise durch Endohydrolyse von 1,4-α-D-glucosidischen Bindungen. Der Begriff „Glucoamylase" bedeutet ein Enzym, das zur Funktions-Klasse mit der EC-Nummer 3.2.1.3 und der trivialen Bezeichnung Glucoamylase, γ-Amylase, lysosomale α-Glucosidase, Säure-Mattase, Exo-1,4-α-Glucosidase, Glucozym, AMG oder GAM und der systematischen Bezeichnung 1,4-α-D-Glucanglycohydrolase gehört. Glucoamylasen hydrolysieren terminale 1,4-verbundene α-D-Glucose-Reste nacheinander von den nicht-reduzierenden Enden der Ketten mit der Freisetzung von β-D-Glucose und sie hydrolysieren die α-1,6-Bindungen. Der Begriff „Pullanase" bedeutet ein Enzym, das zur Funktions-Klasse mit der EC-Nummer 3.2.1.41 und der trivialen Bezeichnung Grenz-Dextrinase, Debranching-Enzym oder Amylopectin, 6-Glucanhydrolase und der systematischen Bezeichnung α-Dextrin-6-glucanhydrolase oder Pullulan-6-glucanhydrolase, gehört. Pullanasen entzweigen Stärke durch Hydrolyse der α-1,6-Bindungen. Der Begriff „Stärke" bedeutet jede gereinigte oder unbehandelte Stärke oder Flüssigstärke oder jegliches Stärke oder Flüssigstärke enthaltendes Material. Weizen, Mais, Roggen und Kartoffelstärke sind Beispiele für Stärken, die in vorliegender Erfindung brauchbar eingesetzt werden können.
Systeme, die die Verzuckerung von Stärke oder Flüssigstärke und die Fermentation der Verzuckerungs-Produkte (Glucose, Maltose, kleine Malto-Oligosaccharide) sind als „gleichzeitige Verzuckerungs- und Fermentations-(SSF)-Prozesse bekannt. SSF-Systeme sind ziemlich vielversprechend.
Die Fermentierung von Stärke oder Flüssigstärke zu Milchsäure ist auf dem Fachgebiet bekannt, zum Beispiel von EP 354828 A1 , worin ein Verfahren zur Milchsäure-Herstellung offenbart wird, das die Inkubation von Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis oder Lactobacillus rhamnosus in Fermentations-Medium, das flüssige Weizenstärke und eine Präparation einer Glucoamylase enthält, um eine Lactat-haltige Fermentationsbouillon zu produzieren. Hofvendahl et al. beschreiben in Appl. Biochem. Biotechnol., 52: 163–169 (1999) ein SSF-System mit Lactococcus lactis in Weizenstärke die eine Fermentationsbouillon, enthält. Linko et al. beschreiben in Enz. Microb. Technol., 19: 118–123 (1996) ein SSF-System mit Lactobacillus casei in Gerstenstärke die einer Fermentationsbouillon, enthält. US 2588460 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Milchsäure, das das Inkubieren von Lactobacillus delbrueckii in flüssiger Maisstärke die eine Fermentationsbouillon, und eine Präparation einer Glucoamylase enthält, einschließt, um ein Lactat-haltige Fermentationsbouillon herzustellen. Mercier et al. beschreiben in J. Chem. Technol. Biotechnol., 55: 11–121 (1992) ein SSF-System mit Lactobacillus amylophilus, flüssiger Maisstärke die in einer Fermentationsbouillon, enthält. Cheng et al. in J. Indust. Microbiol., 7: 27–34 (1991) und Zhang et al. in Biotechnol. Letters, 13: 733–736 (1991) beschreiben ein SSF-System mit Lactobacillus amylovorus in flüssiger Maisstärke die eine Fermentationsbouillon, enthält. In US 5464760 und WO 94/13826 werden Verfahren zur Herstellung von Milchsäure offenbart, die das Inkubieren einer gemischten Kultur aus (R)- und (S)-Milchsäure-produzierenden Lactobacillus Spezies flüssiger Kartoffelstärke in die Fermentationsbouillon und eine Präparation einer Glucoamylase enthält, um eine Lactat-haltige Fermentationsbouillon herzustellen, umfassen. Tsai et al. beschreiben in Appl. Biochem. Biotechnol., 70/72: 417–428 (1998) ein SSF-System mit einer Lactobacillus Spezies in Kartoffelstärke die einer Fermentationsbouillon, enthält. Der Begriff „Fermentationsbouillon" betrifft sowohl Medien in der ursprünglich den Mikroorganismen bereitgestellten Form als Quelle für Nährstoffe, Wachstumsfaktoren und Kohlenhydrate, als auch Medien, die produziert wurden, nachdem einige oder alle der ursprünglich gelieferten Nährstoffe, Wachstumsfaktoren oder Kohlenhydrate verbraucht wurden und Fermentationsprodukte, einschließlich Milchsäure durch die Mikroorganismen in das Medium abgesondert worden sind.
Obwohl Mikroorganismen, wie Lactobacillus Spezies, Lactococcus Spezies, Streptococcus Spezies, Enterococcus Spezies und Sporolactobacillus Spezies Milchsäure-Produzenten sind, machen bestimmte Eigenschaften diese Spezies weniger für die industrielle Herstellung von Milchsäure geeignet, einschließlich der Tatsache, dass sie eine Wachstumstemperatur im Bereich von 30–35°C besitzen, mit einem Optimum bei 30–37°C, was es schwieriger macht, Infektionen in Fermentationssystemen im industriellen Maßstab zu vermeiden, was die enantiomerische Reinheit der Milchsäure während der Fermentierung gefährdet, als wenn höhere Temperaturen verwendet werden können.
Es ist eine der Aufgaben der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren ohne diesen Nachteil der bekannten SSF-Verfahren bereitzustellen.
Darüber hinaus stimmt der Bereich der Wachstumstemperatur dieser Mikroorganismen nicht mit dem Bereich der Anwendungstemperatur von Glucoamylase und Pullanase, der im Bereich von 50–70°C und von α-Amylase, der im Bereich von 80–105°C liegt, überein. Eine, als SSF mit den Mikroorganismen, bei einer für die Mikroorganismen optimalen Temperatur, durchgeführte Milchfermentierung, ist für die Aktivität des Enzyms suboptimal. Diese verminderten Aktivitäten können durch die Zugaben von mehr Glucoamylase, Pullanase oder α-Amylase oder Gemischen davon, kompensiert werden, aber das wird zu den Kosten beitragen. Außerdem benötigen diese Organismen sowohl eine ausreichende Menge an organischem Stickstoff im Fermentationsmedium, als auch Wachstums fördernde Substanzen, so dass die Bouillon teurer wird und die Milchsäure schwieriger zu reinigen wird, als wenn ein einfaches Fermentationsmedium verwendet werden kann.
Seitens dieser Überlegungen wurde gefunden, dass thermophilere, weniger Nährstoffe benötigende, Milchsäure produzierende Bakterien günstiger sind.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von Milchsäure oder eines Salzes davon, wobei Stärke einem Prozess gleichzeitiger Verzuckerung und Fermentation unterworfen wird, wobei das Verfahren das Verzuckern von Stärke in einem Medium, das mindestens eine Glucoamylase enthält und gleichzeitiges Fermentieren der Stärke unter Verwendung eines Mikroorganismus und optionale Isolation der Milchsäure aus dem Medium, umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass ein gemäßigt thermophiler Milchsäure produzierender Mikroorganismus verwendet wird, der an den pH-Bereich von 5–5,8 angepasst ist.
Die Verwendung von gemäßigt thermophilen Bacillus-Spezies für die Herstellung von Milchsäure aus einfachen Zuckern wie Glucose und Saccharose ist auf dem Fachgebiet bekannt. Der Begriff „gemäßigt thermophil" bedeutet bakterielle Stämme, die imstande sind, bei Temperaturen zwischen 30–65°C, mit einem Optimum zwischen 40–60°C, bevorzugter zwischen 50–60°C zu wachsen. US 5002881 und DE 40 00 942 offenbaren Verfahren zur Herstellung von Milchsäure, die das Inkubieren von Stämmen von Bacillus coagulans bei 48–54°C in einem einfachen Fermentationsmedium, das entweder Glucose oder Saccharose als Kohlenhydrat enthält, um ein Lactat-haltiges Fermentationsmedium zu produzieren. DE 40 00 942 , Olsen in Kemisk, 25: 125–130 (1944) und Payot et al. in Enzyme Microb. Technol., 24: 191–199 (1999) beschreiben eine Milchfermentation bei 50–60°C ohne sterile Bedingungen mit Bacillus coagulans (d.h. Lactobacillus cereale) im Fermentationsmedium mit Saccharose als Kohlenhydrat, um eine Lactat-haltige Bouillon herzustellen. US 6022537 offenbart einen gemäßigt thermophilen amylolytischen Organismus, Bacillus thermoamylovorans, der für die Herstellung von Milchsäure nützlich ist.
Die Verwendung von gemäßigt thermophilen Milchsäure produzierenden Stämmen für die Herstellung von Milchsäure aus Stärke (oder Flüssigstärke) mit der SSF-Technologie, wurde jedoch nie offenbart und wurde nun als vorteilhaft für die Lösung der nicht übereinstimmenden Temperatur, die zwischen dem Mikroorganismus und der Glucoamylase oder Pullanase besteht und für eine Verbesserung für die α-Amylase, gefunden. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass nun enantiomerisch reine Milchsäure oder ein Salz davon einfach hergestellt werden kann. Der Begriff „enantiomerisch rein" bedeutet, dass die enantiomerische Reinheit mindestens 95% beträgt, bevorzugt mindestens 98% und noch bevorzugter mindestens 99%. Obwohl Bacillus coagulans und Bacillus thermoamylovorans ausgezeichnete Lactat-Produzenten sind, haben sie auch bestimmte Eigenschaften, die diese Organismen auf den ersten Blick zu weniger geeigneten Kandidaten für die Herstellung von entantiomerisch reiner Milchsäure aus Stärke oder Flüssigstärke machen würden. Bacillus thermoamylovorans ist heterolactisch, was bedeutet, dass ein Anteil des Kohlenhydrat-Substrats neben Milchsäure zu Produkten (Ethanol, Essigsäure und Ameisensäure) fermentiert wird, was dadurch die Produktausbeute (Mol Milchsäure pro Mol Kohlenhydrat) senkt und das Produkt Milchsäure schwieriger zu reinigen macht. Combet-Blanc et al. offenbaren in Appl. Environm. Microbiol., 65: 4582–4585 (1999); Appl. Environm. Microbiol., 61: 656–659 (1995) und Internat. J. System. Bacteriol., 45: 9–16 (1995), dass der Lactat-Ertrag bei Glucose typischerweise in der Größenordnung von 88–92% (Mol Milchsäure pro Mol Glucose) liegt. Außerdem wurde ebenfalls offenbart, dass die enantiomerische Reinheit der (S)-Milchsäure 98% betrug. Bacillus coagulans ist homolactisch, was bedeutet, dass das Kohlenhydrat nur zu Milchsäure fermentiert wird. Darüber hinaus offenbart DE 40 00 942 , dass die enatiomerische Reinheit der Milchsäure nahe 100% liegt. Andererseits fermentiert Bacillus coagulans Stärke oder Flüssigstärke oder Maltodextrine oder Malto-Oligisaccharide schlecht. Bacillus coagulans und Bacillus thermoamylovorans besitzen ein relativ hohes pH-Optimum (6,0–7,0) für die Milchsäure-Produktion, was in pH-Einheiten wesentlich höher liegt als der bevorzugte Anwendung (Arbeits-) pH-Bereich von Glucoamylase (3,5–5). Der Anwendungs-pH-Bereich von Glucoamylase stimmt daher nicht mit dem des Mikroorganismus überein. Eine Milchfermentation mit den gemäßigt thermophilen Bacillus coagulans und Bacillus thermoamylovorans, als SSF bei einem pH-Wert angewendet, der optimal für den Mikroorganismus ist, reduziert die Aktivität der Glucoamylase. Dies kann durch die Zugabe von mehr Glucoamylase kompensiert werden, aber dies wird zu den Kosten beitragen. Es ist daher eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das SSF-Systems für die Verwendung gemäßigt thermophiler, Milchsäure produzierender Mikroorganismen wie Bacillus coagulans, passend einzusetzen. Dieser Stamm besitzt eine hohe Substrat-Konversionsrate und einen hohen Produktionsertrag. Es ist bekannt, dass Glucoamylase bei hohen Konzentrationen freier Glucose eine reverse Reaktion ergeben kann, um α-1,4-, α-1,6-und α-1,3-Bindungen von Glucose produzierenden Zuckern, wie Maltose, Isomaltose und Nigerose, die durch gemäßigt thermophile Milchsäure Bakterien schlecht oder gar nicht fermentierbar sind (z.B. Reilly (1985): Enzymatic degradation of starch in: Starch Conversion Technology (van Beynum und Roels; Hrsg.), Marcel Dekker Inc, New York, S. 101–142), zu produzieren. Die Anwendung von SSF mit gemäßigt thermophilen Milchsäure-Bakterien verhindert die Akkumulation freier Glucose in der Fermentationsbouillon wodurch die reverse Umsetzung verhindert oder ihre Rate gesenkt wird und wodurch die Akkumulation nicht fermentierbarer Zucker wie Isomaltose und Nigerose verhindert wird. Dies steigert den Lactat-Ertrag bei Stärke oder Flüssigstärke und macht es weniger schwierig, die in der Fermentationsbouillon vorhandene Milchsäure zu reinigen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Stärke verzuckert, fermentiert und wahlweise in einem Gemisch von Glucoamylase und mindestens einer Pullanase oder α-Amylase verflüssigt.
Das vorliegende Verfahren hat zur Folge, dass im Vergleich zu konventionellen Fermentations-Prozessen, wesentlich weniger Restzucker erhalten werden, was die direkte Isolierung von Milchsäure ermöglicht. Die vorliegende Erfindung liefert daher einen Vorteil eines einfachen und kostengünstigen Aufbereitungsverfahrens, das nicht länger einen komplexen Extraktionsschritt benötigt, um die Milchsäure von Restzuckern zu trennen. Ein zusätzlicher Vorteil des vorliegenden Verfahrens ist die Möglichkeit der Verwendung von unbehandelter Stärke, da die niedrigen Mengen an Restzucker die Verwendung gereinigter Stärke als Startprodukt nicht länger erfordern. Üblicherweise sind mit dem Verfahren der Erfindung Gehalte an Restzucker von weniger als 5 g/l, bevorzugt weniger als 2 g/l, leicht zu erreichen.
Wie oben angedeutet wird die Verzuckerung durch Glucoamylase und α-Amylase und/oder Pullanase durchgeführt. Glucoamylase (EC 3.2.1.3, 1,4-α-D-Glucan-Glucohydrolase) spaltet hauptsächlich α-1,4-glucosidische Bindungen sowohl an den nicht-reduzierenden Enden der Stärke, als auch den Enden der nach Hydrolyse durch α-Amylase verbliebenden Fragmente. Glucoamylase ist eine Exohydrolase und greift Di-, Oligo- und Polysaccharide-haltige Glucose, die überwiegend durch α-1,6-glucosidische Bindungen und α-1,3-glucosidische Bindungen miteinander verbunden ist, an, obwohl die α-1,6-glucosidische Bindungen und die α-1,3-glucosidischen Bindungen mit niedriger Frequenz angegriffen werden. Dies ist von beträchtlichem industriellen Interesse, da da Stärke-Hydrolysate nach α-Amylase-Behandlung α-1,6-glucosidische Bindungen enthalten, die gespalten werden müssen, wenn annehmbare Glucose-Erträge erhalten werden sollen. Da die Aktivität von Präparationen von Glucoamylase gegen α-1,6-glucosidischen Bindungen niedrig ist, enthalten einige im Handel erhältliche Glucoamylase-Präparationen Pullanase. Pullanase ist ein sogenanntes Debranching-Enzym, das die in der Stärke und Flüssigstärke vorhandenen α-1,6-glucosidischen Bindungen spaltet. Um Flüssigstärke zu verzuckern, erschienen sowohl Enzym-haltige Glucoamylase als Hauptbestandteil, als auch Kombinationspräparationen, die Glucoamylase und Pullanase enthalten für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Der pH-Bereich der Anwendung für Glucoamylase und Pullanase wurde als optimal zwischen 3,5 und 5 liegend gefunden. Der Temperaturbereich der Anwendung wurde als optimal zwischen 55–70°C liegend gefunden. Es wurde gefunden, dass der Effekt von Calcium-Lactat und pH-Wert auf die Aktivität und Stabilität des Enzyms sich nicht als ein Ergebnis der Akkumulation des Fermentationsprodukts fortschreitend verschlechterte.
Hinsichtlich des Ergebnisses der gesamten Fermentation, wird trotzdem bevorzugt, die Enzyme in mindestens zwei Portionen zuzugeben, statt einer einzelne Zugabe zu Beginn des Prozesses. Es wurden im Handel erhältliche Glucoamylase/Pullanase-Präparationen (von Genencor und Novo Nordisk) getestet. Alle enthielten eine deutliche Debraching-Aktivität. Es wurden auch AMG^TM E (von Novo Nordisk), eine Glucoamylase mit einer hohen Debranching-Aktivität, Dextrozyme^TM E (enthält Glucoamylase und Pullanase) (von Novo Nordisk) und Optimax^TM 7525 HP (enthält Glucoamylase und Pullanase) (von Genencor) getestet und wieder wurde kein großer Unterschied zwischen diesen Präparationen beobachtet. Dextrozyme^TM E leistete etwas weniger als AMG^TM E und Optimax^TM 7525 HP hinsichtlich des gesamten Fermentations-Ergebnisses. AMG^TM E und Optimax^TM 7525 HP arbeiteten fast gleich und beide Enzym-Präparationen wurden genau studiert (siehe experimenteller Teil).
Die Fermentation wird durch einen gemäßigt thermophilen Milchsäure produzierenden Mikroorganismus, wie Mikroorganismen, die von einem Stamm von Bacillus coagulans, Bacillus thermoamylovorans, Bacillus smithii, Geobacillus stearothermophilus oder von Gemischen daraus abgeleitet sind, ausgeführt. Diese Mikroorganismen sind imstande, bei Temperaturen zwischen 30–65°C zu wachsen. Daher sind diese Mikroorganismen besser an das Arbeiten bei den optimalen Arbeitstemperaturen der Enzyme angepasst und das erfindungsgemäße Verfahren wird üblicherweise bei einer Temperatur zwischen 30–70°C durchgeführt. Das Verfahren der Erfindung wird üblicherweise bei einem pH-Wert von 3–8,5 durchgeführt, vorzugsweise bei pH 5–6, bevorzugter bei pH 5,35–5,80, am meisten bevorzugt bei pH 5,50–5,60.
Der thermophile Milchsäure produzierende Mikroorganismus ist an den pH-Bereich von 5–5,80 angepasst. Der pH-Wert beeinflusst die Aktivität stark. Das Enzym wird bei niedrigem pH-Wert stufenweise aktiver. Jedoch die üblichen pH-Bereiche, in denen ein gemäßigt thermophiler Milchsäure produzierender Mikroorganismus optimal arbeitet, liegt zwischen 6,0 und 7. Daher wird ein gemäßigt thermophiler Milchsäure produzierender Mikroorganismus verwendet, der daran angepasst worden ist, sein Leistungsmaximum bei niedrigem pH-Wert (zwischen 5 und 5,80, bevorzugt zwischen 5,35–5,80, am meisten bevorzugt zwischen 5,35–5,80) zu besitzen. Das Adaptionsverfahren des Mikroorganismus ist auf dem Fachgebiet bekannt. Adaption oder Akklimatisierung gemäßigt thermophiler Milchsäure produzierender Bakterien, um die Ausführung bei pH-Werten von 5,35–5,80 zu verbessern, wurde durch die Durchführung von 40–50 seriellen Überführungen in Fermentationsmedium bei pH 5,6 erreicht.
Die gleichzeitige Verzuckerung und Fermentation wurde mit wässriger Stärkeaufschlämmung oder jeder anderen Stärke-haltigen Zusammensetzung durchgeführt. Die Stärke kann flüssig sein oder nicht. Wenn eine nicht flüssige Stärkeaufschlämmung oder jeder andere Stärke-haltige Zusammensetzung verwendet wird, kann die Verzuckerung und Fermentation mit einer Verflüssigung kombiniert werden und es kann auch eine α-Amylase im Fermentationsmedium vorhanden sein.
Ein vollständiger Verzuckerungsschritt kann bis zu 72 Stunden dauern. Es ist jedoch möglich, eine Vor-Verzuckerung von typischerweise 40–90 Minuten durchzuführen und dann die Verzuckerung während der Fermentation zu beenden. Dieser Vor-Verzuckerungsschritt kann bei Temperaturen höher als 50°C durchgeführt werden, unmittelbar vor der Fermentation. Das am weitesten verbreitete Verfahren ist ein gleichzeitiges Verzuckerungs- und Fermentations-(SSF)-Verfahren, wo es keine Haltephase für die Verzuckerung gibt, was bedeutet, dass der fermentierende Organismus und das (die) Enzym(e) zusammen zugegeben werden. In dem erfindungsgemäßen Verfahren können der gemäßigt thermophile Milchsäure produzierende Mikroorganismus und das/die Enzym(e) gleichzeitig zugegeben werden. Es versteht sich von selbst, dass das erfindungsgemäße Verfahren ebenfalls durch eine Vor-Verzuckerung, gefolgt von gleichzeitiger Verzuckerung und Fermentation, wobei ein zusätzlicher Teil der Enzyme mit dem Zusatz des gemäßigt thermophilen Milchsäure produzierenden Mikroorganismus zugegeben wird, durchgeführt werden kann.
Eine Stärkeauschlämmung oder eine Aufschlämmung von geeignetem Stärke-haltigen Material oder Flüssigstärke wird einem Fermenter zugeführt. Das mikrobielle Inoculum und Nährstoffe werden ebenfalls dem Fermenter zugeführt. Während der Fermentation kann eine geeignete Base, wie Calciumhydroxid, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Magnesiumhydroxid, Magnesiumoxid, Ammoniak, Ammoniumhydroxid oder ein geeignetes Carbonat, wie Calciumcarbonat, Natriumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat, Kaliumcarbonat, Kaliumhydrohgencarbonat, Magnesiumcarbonat, Ammoniumcarbonat zur Kontrolle des pH-Werts zugegeben werden.
Im Verflüssigungsschritt der Erfindung wird, sobald er angewendet wird, gelierte Stärke oder Stärke-haltiges Material zu Maltodextrinen gespalten (hydrolisiert) mit einem durchschnittlichen DE zwischen 10 bis 30. Der Begriff „Gelierung" bedeutet den Prozess, der Stärke-Körnchen in Stärke-Paste umgewandelt. Die Hydrolyse kann durch Säurebehandlung oder enzymatisch durch Behandlung mit α-Amylase durchgeführt werden. Die α-Amylase ist von einem Mikroorganismus oder einer Pflanze abgeleitet. Bevorzugte α-Amylasen stammen von Pilzen oder Bakterien. Eine Definition von α-Amylase ist vorstehend angegeben. Der enzymatische Verflüssigungs-Prozess kann bei einem pH-Wert zwischen 5 und 6, bevorzugt zwischen 5,35 und 5,80 und noch bevorzugter zwischen 5,50 und 5,60 durchgeführt werden. Die enzymatische Verflüssigung kann daher zweckmäßigerweise entweder mit der Vor-Verzuckerung oder der gleichzeitigen Verzuckerung und Fermentation oder mit beiden kombiniert werden. Obwohl ihre Verwendung nicht weit verbreitet ist, kann auch eine Säurehydrolyse genutzt werden. Das Rohmaterial können vermahlenes (ganzes) Getreide oder geraspelte, zerschnetzelte Wurzeln (Kartoffel, Tapioka), Knollen, ganzes Getreide, Mais, Kolben, Weizen, Gerste, Roggen, Milo, zuckerhaltige Rohmaterialien, wie Melassen, Fruchtmaterialien, Zuckerrohr oder Zuckerrübe, Kartoffeln, Cellulose-haltige Materialien, wie Holz oder Pflanzenreste, sein.
Ein Seitenstrom der Stärke-Verarbeitung, wie die so genannte B-Stärke kann jedoch ebenfalls verwendet werden. Die Verflüssigung ist auf dem Fachgebiet bekannt und bedarf hier keiner weiteren Erläuterung. Wie vorstehend angedeutet, kann die Verflüssigung auch in Kombination mit der Verzuckerung und Fermentation stattfinden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Verflüssigunsschritt die folgenden Schritte:

1) die heiße Aufschlämmung wird auf 60–95°C erhitzt, bevorzugt 80–85°C und mindestens eine α-Amylase wird zugegeben;
2) Die Aufschlämmung wird bei einer Temperatur zwischen 95–140°C, vorzugsweise bei 105–125°C mit dem Düsenkocher gekocht, um die Gelierung der Aufschlämmung zu vervollständigen;
3) Die Aufschlämmung wird auf 60–95°C abgekühlt und mehr α-Amylase zugegeben, um die Hydrolyse abzuschließen.

Der Verflüssigungsprozess kann bei einem pH-Wert von 5–6, insbesondere bei einem pH-Wert zwischen 5,35 und 5,80, am meisten bevorzugt bei einem pH-Wert von 5,50–5,60 durchgeführt werden.
Nach kombinierter Verzuckerung und Fermentation wird die gebildete Milchsäure optional vom Fermentationsmedium isoliert und wenn nötig gereinigt. Herkömmliche Reinigungs-/Isolations-Methoden für Milchsäure sind Destillation, Extraktion, Elektrodialyse, Adsorption, Ionenaustausch, Kristallisation und ähnliches und Kombinationen der vorstehend erwähnten Reinigungs-/Isolations-Methoden. Destillation ist die am häufigsten verwendete Methode. Wie vorstehend erwähnt, wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Bildung nicht fermentierbarer Zucker reduziert. Deshalb können Isolations- oder Reinigungs-Schritte weniger kompliziert und manchmal sogar überflüssig sein. Weitere Einzelheiten über die Ausführung der Destillation und andere Verfahren zur Gewinnung von Milchsäure sind dem Fachmann bekannt. Die Erfindung wird durch folgende Experimente weiter veranschaulicht, die eingeschlossen sind ohne die Erfindung einzuschränken.
BEISPIELE
SSF-Experimente
Medien und Kulturbedingungen

Die Kultur von Bacillus coagulans, die an einen pH-Wert von 5,65 angepasst war, wurde in einem doppelwandigen 3-Liter Glas Rühr-Reaktor, der mit einer Temperatur und pH-Wert Kontrolle ausgestattet ist (Applikon, Schiedam, Niederlande), kultiviert. Die Kultur wurde routinemäßig aufrechterhalten, indem man alle 24 Stunden 180–200 ml einer aktiv fermentierenden Kultur in einen, eine frisch zubereitete Charge Maltodextrin-Medium enthaltenden Fermenter überführte (siehe Tabelle 1). Die Fermentationen wurden sowohl mit reinen Maltodextrinen, als auch mit Flüssigstärke von der Cargill Raffinerie in Blair (Nebraska, USA) und Glucosesirup, ebenfalls von der Cargill Raffinerie in Blair (Nebraska, USA) (siehe Tabelle 1), durchgeführt. Tabelle 1 Zusammensetzung von Fermentationsmedien für SSF und Glucose-Fermentationen

Komponente	Flüssigstärkemedium	Maltodextrinmedium	Glucosemedium
Glucose Sirup DE 98, 51,7% Trockengehalt*	–	–	800 g
Maltodextrin DE 11–14, 95% Trockengehalt	–	382 g	–
Flüssigstärke DE 9–11, 35% Trockengehalt*	1,1 l	–	–
Diammoniumphosphat	7 g	7 g	7,0 g
Kreide (feingemahlen)	26,7 g	26,7 g	26,7 g
Hefeextrakt (65% DS)	3,4 g	3,4 g	3,4 g
demineralisiertes Wasser (in l)	0,5 l	1,3 l	1,0 l
AMG E^TM (Novozymes) erste Portion bei Start der Fermentation	0,65–0,7 ml	0,65–0,7 ml	–
AMG E^TM (Novozymes) zweite Portion nach 24 Stunden Fermentation	0,30–0,35 ml	0,3–0,35 ml	–

* von Cargill, Blair, Nebraska, USA

Die Temperatur der Fermenter wurde bei 54–56°C durch ein zirkulierendes Wasserbad kontrolliert. Der pH-Sollwert war ein Kompromiss zwischen dem optimalen pH-Wert des Enzyms und dem Optimum für Bacillus coagulans, der an einen pH-Wert von 5,65 angepasst war. Die Fermentation wurde bei pH 6,0 gestartet und es wurde zugelassen, dass er als Ergebnis der Bildung von Milchsäure abfiel. Bei Erreichen eines pH-Werts von 5,55–5,75 wurde der pH-Wert durch die automatische Zugabe von Calciumhydroxid (250 g/l) kontrolliert. Nach 24 Stunden Fermentation erhielt die Kultur eine zweite Portion AMG E^TM (Novozymes). Eine Fortsetzung der Fermentation wurde zugelassen, bis der Bedarf an Calciumhxdroxid aufhörte. Dies war nach 30–40 Stunden Inkubation der Fall.
Ergebnisse der SSF-Experimente
Der Orientierungswert für die SSF-Fermentation wurde durch die Fermentation mit Glucosesirup (DE 98) als Substrat gesetzt. Die SSF-Studie wurde mit einer Maltodextrin-Präparation von Roquette Freres (Glucidex^TM 12, DE 11–14) begonnen und erfolgreich beendet. Zwei Glucoamylase-Präparationen wurden umfassend getestet: AMG E^TM von Novozymes (Glucoamylase mit hoher Debranching-Aktivität) und Optimax^TM 7525 HP von Genencor (Glucoamylase/Pullanase). Eine typische SSF-Fermentation mit reinen Maltodextrinen war innerhalb von zwei Tagen frei von Restzuckern. Die hauptsächlichen vorhandenen Restzucker waren Glucose und Isomaltose, jedoch bei einer durchwegs niedrigeren Konzentration wie in vergleichbaren Kulturen, die DE 98 Glucosesirup als Substrat erhielten. Die Maltosekonzentrationen waren niedrig (< 50 mg/l) im Gegensatz zu vergleichbaren, bei pH-Werten von 6,4–6,6 laufenden DE 98-Kulturen. Mit der Zugabe von Glucidex 12 wurde eine beträchtliche Menge an Maltose in die Fermentation eingeführt. Die Tatsache, dass Maltose bei einem niedrigen pH-Wert fermentiert werden konnte war eine wichtiges Ergebnis. Der Fermentations-Ertrag (produziertes Mol (S)-Lactat pro Mol verbrauchter Glucose) war leicht höher als 100 %. Die organischen Säuren in zuckerfreier SSF-Bouillon wurden analysiert und die Spiegel waren vergleichbar mit Fermentierungen bei pH-Werten von 6,4–6,6 mit Bacillus coagulans. Unter einem pH-Wert von 5,55 war die SSF-Fermentation relativ langsam. Bei einem pH-Wert von 5,90 wurde ein Anstieg des gesamten Restzuckers um 50% beobachtet, im Vergleich zu, bei pH-Werten zwischen 5,55–5,75 laufenden Kulturen. Bei Verwendung von unbehandelter Flüssigstärke wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. In der Endphase, wurden erfolgreiche SSF-Experimente mit unbehandelten Flüssigstärke-Hydrolysaten durchgeführt. Bezüglich der Fermentations-Zeit gab es keinen beobachteten Unterschied zwischen der SSF-Fermentation mit gereinigten Maltodextrinen und der mit Flüssigstärke von der Cargill Raffinerie. Beide SSF-Fermentationen endeten nach 30–40 Stunden. Unbehandelte Flüssigstärke oder Maltodextrin als Substrat enthaltende Kulturen enthielten 180–200 g/l (S)-Milchsäure. Die enantiomerische Reinheit der Milchsäure war besser als 99,5 %.
SSF-Experimente unter Verwendung verschiedener gemäßigt thermophiler Mikroorganismen

Es wurden SSF-Experimente mit Bacillus coagulans, Bacillus thermoamylovorans, Bacillus smithii, Geobacillus stearothermophilus und einem Gemisch aus allen vier durchgeführt. Hierzu wurden die Kulturen gezüchtet und in der kombinierten Verzuckerung und Fermentation von Flüssigstärke, unter Verwendung der gleichen Vorgehensweise und Bedingungen wie in den vorstehend beschriebenen SSF-Experimenten, verwendet. Alle verwendeten Mikroorganismen (einschließlich der Mischkultur) waren imstande, Milchsäure mit hoher optischen Reinheit zu produzieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Tabelle 2: SSF mit verschiedenen gemäßigt thermophilen Mikroorganismen

Mikroorganismus	Milchsäure-Ausbeute (g/l)	optische Reinheit (% S-Lactat)
Bacillus coagulans	35,5*	99,8
Bacillus smithii	18,3*	99,4
Bacillus thermoamylovorans	14,4**	99,6
Geobacillus stearothermophilus	8,7**	99,3
Gemischte Kultur aus Bacillus coagulans, Bacillus smithii, Bacillus thermoamylovorans und Geobacillus stearothermophilus	13,9**	99,7

*) 4,5% Stärke-Einsatz
**) 1,6% Stärke-Einsatz

Claims

Verfahren zur Herstellung von Milchsäure oder eines Salzes davon, wobei Stärke einem Prozess gleichzeitiger Verzuckerung und Fermentation unterworfen wird, wobei das Verfahren umfasst: Verzuckern von Stärke in einem Medium, das mindestens eine Glucoamylase umfasst, und gleichzeitiges Fermentieren der Stärke unter Verwendung eines Mikroorganismus, und wahlweise Isolieren der Milchsäure aus dem Medium, dadurch gekennzeichnet, dass ein gemäßigt thermophiler Milchsäure produzierender Mikroorganismus verwendet wird, der an den pH-Bereich 5–5,8 angepasst ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stärke in einer Mischung aus Glucoamylase und Pullulanase und/oder α-Amylase verzuckert, fermentiert und wahlweise verflüssigt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Milchsäure oder ein Salz davon in einer enantiomerischen Reinheit über 95% hergestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Prozess bei pH 3–8,5 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Prozess bei pH 5–6, vorzugsweise bei pH 5,35–5,8, mehr bevorzugt bei pH 5,5–5,6 durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Mikroorganismus an pH 5,35–5,8, bevorzugt pH 5,5–5,6 angepasst ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Prozess bei 30–70°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Glucoamylase oder die Mischung aus Glucoamylase mit Pullulanase und/oder α-Amylase in mindestens zwei Teilen hinzugefügt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Mikroorganismus von einem Stamm Bacillus coagulans, Bacillus thermoamylovorans, Bacillus smithii, Geobacillus stearothermophilus oder von einer Mischung daraus abgeleitet ist.