DE60306517T2

DE60306517T2 - Verfahren zum nachweis und zur quantifizierung von -aus soliden tumoren abstammenden- zirkulierenden tumorzellen

Info

Publication number: DE60306517T2
Application number: DE60306517T
Authority: DE
Inventors: Jean-Pierre Vendrell; Catherine Panabieres; Geneviève CHOQUET-KASTYLEVSKY; Michel Jolivet
Original assignee: Biomerieux SA; Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier
Current assignee: Biomerieux SA; Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier
Priority date: 2002-03-13
Filing date: 2003-03-13
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2023-03-14
Also published as: ATE331958T1; WO2003076942A3; US20050079557A1; JP4256265B2; DE60306517D1; EP1506407A2; ES2268387T3; JP2005527793A; AU2003242815A1; WO2003076942A2; EP1506407B1; AU2003242815A8

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der biologischen Diagnostik und der Kanzerologie. Genauer gesagt, ist die Aufgabe der vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion und/oder Quantifizierung von zirkulierenden Tumorzellen, die in der Lage sind, in vitro einen oder mehrere Tumormarker abzustoßen oder zu sezernieren, sowie die Verwendung dieses Verfahrens zur Frühdiagnose und Prognose der Pathologie, zur Auswahl therapeutischer Behandlungen und Evaluierung ihrer Wirksamkeit sowie zur Diagnose von Rückfällen im Rahmen solider Krebserkrankungen.
Die derzeitige Diagnose von Krebserkrankungen besteht aus klinischer Diagnostik, wie Mammapalpation im Fall von Brustkrebs, und/oder einer paraklinischen Untersuchung, wie Mammographie, Scanner, wobei die Bestätigung durch eine histologische Analyse, wie Biopsie oder einen chirurgischen Eingriff, erfolgt.
Die klinische oder paraklinische Frühdiagnostik von Krebs ist insbesondere aufgrund fehlender anatomischer Zugänglichkeit der kanzerösen Zonen schwierig. Folglich werden zahlreiche Tumoren gewöhnlich nur verspätet nachgewiesen.
Auf das gleiche Problem stößt man, wenn die Zonen anatomisch zugänglich sind. Beispielsweise hat im Fall von Brustkrebs ein Tumor, wenn er bei einer Mammographie entdeckt wird, oft eine infraklinische Entwicklung von durchschnittlich 8 Jahren.
Zurzeit gibt es kein oder wenige biologische(s) Diagnoseverfahren, die für sich allein eine Krebsdiagnose gestatten.
Mit den zurzeit entwickelten Verfahren zur biologischen Diagnostik lässt sich, beispielsweise durch Messung bestimmter Tumormarker, die Entwicklung einer bereits diagnostizierten Krebserkrankung verfolgen oder ein Rezidiv aufspüren. So werden Serum- oder Urinmarker mit Techniken gemessen, die dem Fachmann bekannt sind.
Dagegen ist die direkte Detektion zirkulierender Tumorzellen wenig untersucht, und es existiert kein Routinetest.
Die Möglichkeit, zirkulierende Tumorzellen nachzuweisen, wurde hauptsächlich mit zwei Diagnoseverfahren untersucht, nämlich der Durchflusscytometrie und der Polymerasekettenreaktion (PCR), gekoppelt mit der Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) (Racila E., Euhus D., Weiss A., Rao C., McConnell J., Terstappen L., Uhr J. Detection and characterization of carcinoma cells in the blood. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4589-4594 (1998), Ghossein R., Bhattacharya S., Rosai J. Molecular detection of micrometastase and circulating tumor cells in solid tumors. Clin. Cancer 5, 1950-1960 (1999) und Moss, T.J., 1991, N. Engl. J. Med., 324, 219-226). Diese zwei Verfahren gestatteten die Detektion zirkulierender Tumorzellen in Blut- oder Knochenmarkszellen bei Patienten, die von Brust- oder Prostatakrebs betroffen waren.
Diese beiden Verfahren haben jedoch Nachteile. Insbesondere können mit keinem dieser Verfahren die seltenen zirkulierenden Zellen detektiert werden, die von einem soliden Tumor stammen. Außerdem ist es möglich, dass mit der PCR Falschpositive erhalten werden, weil es dieser Technik an Sensitivität und Spezifität mangelt. Folglich benötigt man gewöhnlich Tumorgewebe, um das Vorliegen von Tumorzellen zu bestätigen.
Racila, E. et al. (1998, s.o.) haben ein Verfahren zur Detektion und Charakterisierung von Brust- oder Prostatakrebszellen im Blut beschrieben, das eine immunmagnetische Anreicherung von Epithelzellen mit einer Durchflusscytometrieanalyse und dann, im Fall einer positiven Reaktion, mit einer immuncytochemischen Analyse kombiniert. Die immuncytochemische Analyse basiert auf der kolorimetrischen Detektion eines an einen Tumormarker (Anti-Cytokeratin-Antikörper 5, 6, 8 und 18) gekoppelten Enzyms. Dieser Test benötigt einen für den Krebsmarker spezifischen primären Antikörper, ein sekundäres Immunglobulin aus Kaninchen, ein Antialkalische-Phosphatase-Immunglobulin aus Maus, alkalische Phosphatase und das entsprechende Substrat.
Das vorstehende Verfahren hat die folgenden Nachteile:

– es benötigt, insbesondere für die Durchflusscytometrieanalyse, eine spezielle teure Instrumentenausstattung,
– es sind zwei Analysen notwendig, nämlich eine Durchflusscytometrieanalyse und eine anschließende immuncytochemische Analyse und
– es mangelt ihm an Sensitivität.

Ferner können mit keinem der vorstehend genannten Verfahren die Lebensfähigkeit der zirkulierenden Zellen und ihr Überblebenspotenzial gewährleistet werden.
Cordoba F. et al. (2000, British Journal of Haematology, 108, 549-558) haben ein Verfahren zur Detektion von Myelomzellen von Patienten, die von einem multiplen Myelom betroffen waren, unter Verwendung der bekannten Fähigkeit dieser Zellen, Immunglobulin zu sezernieren, beschrieben. Die Myelomzellen gehen aus B-Lymphocyten hervor, die üblicherweise im Blut vorliegen und gewöhnlich Immunglobuline sezernieren.
Zhou Zegi et al. haben im US-Patent 6 107 049 ein Diagnosekit beschrieben, das eine zuvor mit einem oder mehreren Bindungspartnern von für Prostatakrebs spezifischen Tumormarkern beschichtete Kultivierungsoberfläche umfasst.
Diese Marker, Anti-PSA-Antikörper, gestatten eine selektive Messung des prostataspezifischen Antigens (cPSA) sowie eine hohe Sensitivität dieses diagnostischen Tests, wodurch weniger auf Biopsien zurückgegriffen werden muss.
Die Anmelderin hat jetzt überraschenderweise gefunden, dass die aus soliden Krebsen hervorgegangenen zirkulierenden Tumorzellen in der Lage sind, bestimmte Tumormarker abzustoßen oder zu sezernieren, und dass es möglich war, diese Sekretion nachzuweisen.
So hat die Anmelderin ein neues Verfahren zur Detektion und/oder Quantifizierung von soliden Krebsen stammender zirkulierender Tumorzellen bereitgestellt, wobei diese besondere Eigenschaft der Abstoßung oder Sekretion von Tumormarkern genutzt und die vorstehenden Nachteile beseitigt wurden, d.h. es ist einfach durchzuführen in dem Sinne, dass es nur einen einzigen Analyseschritt beinhaltet und kein spezifisches Material benötigt. Außerdem gestattet dieses Verfahren aufgrund seiner sehr hohen Sensitivität die Detektion seltener zirkulierender Zellen und ebenso die Sicherstellung der Lebensfähigkeit dieser Tumorzellen. Somit ist es sowohl zur Diagnostik als auch zur Untersuchung der Resterkrankung sowie der Evaluierung des Überlebenspotenzials und somit der Aggressivität dieser zirkulierenden Zellen sehr nützlich.
So ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Detektion und/oder Quantifizierung zirkulierender Tumorzellen in einer biologischen Probe, die in der Lage sind, in vitro einen oder mehrere Tumormarker abzustoßen oder zu sezernieren, das die folgenden Schritte aufweist:

(i) Bereitstellen einer bekannten Menge dieser Zellen auf dem Boden einer Kultivierungsoberfläche, auf der zumindest ein spezifischer Bindungspartner für den oder die Tumormarker fixiert ist,
(ii) Kultivieren der Zellen unter solchen Bedingungen, unter denen sie die Tumormarker abstoßen oder sezernieren, die auf dem Boden der Kultivierungsoberfläche immunkomplexiert werden,
(iii) Entfernen der Zellen durch Waschen,
(iv) Hinzugeben von zumindest einem für die Tumormarker spezifischen markierten Konjugat und
(v) Visualisieren der so erhaltenen Markierung.

Somit gestattet es das erfindungsgemäße Verfahren, nicht-hämatopoetische, neoplastische, zirkulierende Zellen zu zählen, die aus biologischen Proben von Patienten, die von einem soliden Krebs betroffen sind, stammen.
Solide Krebse sind dem Fachmann bekannt. Als Beispiel kann man Brust-, Prostata-, Schilddrüsen-, Leber-, Hoden-, Ovarialkrebs, Krebs des Verdauungssytems, der Lunge usw. nennen.
Die biologischen Proben, die zirkulierende Tumorzellen enthalten können, umfassen jede biologische Flüssigkeit, wie Blut, Knochenmark, Sekrete, Milch, Hirn-Rückenmarksflüssigkeit und Urin.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die biologischen Proben aus Blut oder Knochenmark.
Die Tumormarker sind für solide Krebse spezifische Tumormarker, die in der Lage sind, in vivo oder in vitro unter bestimmten Kultivierungsbedingungen von Tumorzellen abgestoßen oder sezerniert zu werden.
Unter einem von einer Tumorzelle abgestoßenen Marker versteht man einen Membranmarker, der abgespalten wurde, und unter einem von einer Tumorzelle sezernierten Marker sowohl einen direkt von dieser Zelle sezernierten Marker als auch einen Marker, der im Cytoplasma gespalten und anschließend von der Tumorzelle exkretiert wird.
Als Marker kann man verschiedene (Protein- oder Nicht-Protein-) Antigene nennen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind diese Tumormarker entweder Membranantigene, die in der Lage sind, durch Spaltung am Boden der Kultivierungsoberfläche abgestoßen zu werden, oder intrazelluläre Antigene, die von den Zellen an dem Boden der Kultivierungsoberfläche sezerniert werden.
Als Beispiel für ein Membranantigen kann man das Protein Muc-1 nennen, ein Oberflächenprotein von Brustkrebszellen, das in Form des Proteins CA15-3 (Kohlenhydrat 15-3) gespalten wird.
Als Beispiel für ein sezerniertes Antigen kann man PSA, das von Prostatakrebszellen produziert wird, das Protein Kathepsin-D (Cath-D), eine lysosomale Aspartylprotease, die in allen Geweben exprimiert, aber in den kanzerösen Zellen im Rahmen von Brustkrebs überexprimiert wird, Thyreoglobulin (TG), das von den kanzerösen Zellen im Rahmen von Schilddrüsenkrebs produziert wird, das Protein CA 125, das von den kanzerösen Zellen im Rahmen von Ovarialkrebs produziert wird, die Proteine ACE und CA 19-9, die von den kanzerösen Zellen im Rahmen von Colorektalkrebs produziert werden, und Alpha-Fetoprotein (AFP) nennen, das von den Leberzellen im Rahmen von Leberkarzinomen produziert wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Tumorzellen in der Lage, als Tumormarker das Protein CA15-3 abzustoßen, und der gesuchte Krebs ist Brustkrebs.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Tumorzellen in der Lage, als Tumormarker das Protein TG zu sezernieren, und der gesuchte Krebs ist Schilddrüsenkrebs.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Tumorzellen in der Lage, als Tumormarker das Protein CA 125 zu resezernieren, und der gesuchte Krebs ist Ovarialkrebs.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Tumorzellen in der Lage, als Tumormarker die Proteine ACE und CA 19-9 zu sezernieren, und der gesuchte Krebs ist Colorektalkrebs.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Tumorzellen in der Lage, als Tumormarker Alpha-Fetoprotein zu sezernieren, und der gesuchte Krebs ist primärer Leberkrebs.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Tumorzellen in der Lage, als Tumormarker PSA zu sezernieren, und der gesuchte Krebs ist Prostatakrebs.
Die spezifischen Bindungspartner der Tumormarker beinhalten jeden Partner, der sich an die Tumormarker binden kann. Als Beispiel kann man Antikörper, Antikörperfraktionen und Proteine nennen.
Die Antikörper als Bindungspartner sind entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper.
Polyklonale Antikörper können durch Immunisierung eines Tieres mit zumindest einem Tumorantigen von Interesse, gefolgt von Gewinnung der gesuchten Antikörper in gereinigter Form durch Entnahme von Serum des Tieres und Abtrennung der Antikörper von anderen Serumbestandteilen, insbesondere durch Affinitätschromatographie an einer Säule, auf der ein von dem Antikörper spezifisch erkanntes Antigen, insbesondere ein Tumorantigen von Interesse, fixiert ist, erhalten werden.
Monoklonale Antikörper können durch die Hybridomtechnik erhalten werden, deren allgemeines Prinzip nachstehend erläutert wird.
Zu einem ersten Zeitpunkt wird ein Tier, im Allgemeinen eine Maus (oder Zellen in Kultur im Rahmen von In-vitro-Immunisierungen), mit einem Tumorantigen von Interesse immunisiert, dessen B-Lymphozyten somit in der Lage sind, Antikörper gegen das Antigen zu produzieren. Diese antikörperproduzierenden Lymphozyten werden anschließend mit (bei diesem Beispiel murinen) "unsterblichen" Myelomzellen fusioniert, um Hybridome zu erhalten. Ausgehend von dem so erhaltenen heterogenen Gemisch von Zellen wird dann eine Selektion der Zellen durchgeführt, die in der Lage sind, einen bestimmten Antikörper zu produzieren und sich unendlich zu vermehren. Jedes Hybridom wird in Klonform vermehrt, wobei jedes zur Produktion eines monoklonalen Antikörpers führt, dessen Erkennungseigenschaften für das Tumorantigen von Interesse beispielsweise mittels ELISA, Immunblot in einer oder zwei Dimensionen, Immunfluoreszenz oder mithilfe eines biologischen Fängers getestet werden können. Die so ausgewählten monoklonalen Antikörper werden anschließend insbesondere mithilfe der vorstehend beschriebenen Affinitätschromatographietechnik gereinigt.
Beispiele für Antikörperfraktionen als Bindungspartner von Tumormarkern sind u.a. Anti-CA15-3-, Anti-PSA-, Anti-Alpha-Fetoprotein-, Anti-Thyreoglobulin-, Anti-CA-19-9- und Anti-CA-125-Antikörper.
Im Fall von Brustkrebs, bei dem die Zellen in der Lage sind, das Protein CR15-3 abzustoßen, kann man als Bindungspartner Anti-CA15-3-Antikörper verwenden.
Im Fall von Prostatakrebs, bei dem die Zellen in der Lage sind, PSA zu sezernieren, kann man als Bindungspartner Anti-PSA-Antikörper verwenden.
Im Fall von Schilddrüsenkrebs, bei dem die Zellen in der Lage sind, TG zu sezernieren, kann man als Bindungspartner Anti-TG-Antikörper verwenden.
Im Fall von Ovarialkrebs, bei dem die Zellen in der Lage sind, CA 125 zu sezernieren, kann man als Bindungspartner Anti-CA-125-Antikörper verwenden.
Im Fall von Colorektalkrebs, bei dem die Zellen in der Lage sind, CA 19-9 oder ACE zu sezernieren, kann man als Bindungspartner Anti-CA-19-9- und Anti-ACE-Antikörper verwenden.
Im Fall von Leberkarzinom, bei dem die Zellen in der Lage sind, Alpha-Fetoprotein zu sezernieren, kann man als Bindungspartner Anti-AFP-Antikörper verwenden.
Die Kultivierungsoberfläche kann mehrere Bindungspartner enthalten. Vorzugsweise enthält die Kultivierungsoberfläche bis zu vier verschiedene Bindungspartner.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Kultivierungsoberfläche zwei verschiedene Antikörpertypen, die gegen brustkrebsspezifische Antigene gerichtet sind, vorzugsweise Anti-CA15-3- und Anti-Cath-D-Antikörper.
Die Kultivierungsoberfläche ist derart beschaffen, dass sie die Kultivierung der Tumorzellen gestattet. Als Beispiel kann man Mikrotiterplattenvertiefungen, Mikrotiterplatten, Kunststoffoberflächen und Membranen nennen.
Die Mikrotiterplattenvertiefungen oder die Mikrotiterplatte selbst können aus Kunststoff bestehen, so dass die Bindungspartner direkt an die Mikrotiterplattenvertiefungen oder die Mikrotiterplatte fixiert werden. Sie können auch eine Membran enthalten, die dem Fachmann üblicherweise bekannt ist und die die erfindungsgemäßen Bindungspartner fixieren kann. Als Beispiel kann man Nitrocellulose- und Immobilon-P-Membranen (Millipore Corporation) nennen.
Die biologische Probe von Interesse von Patienten wird direkt auf dem Boden der Kultivierungsoberfläche bereitgestellt oder die nicht-hämatopoetischen Zellen werden vor der Bereitstellung auf dem Boden angereichert.
Im Fall von Blutentnahmen werden die Zellen zum Beispiel mithilfe einer Technik zur Abtrennung von Zellen über Ficoll in Verbindung mit einer Verarmung an Blutzellen unter Verwendung von Anti-CD45-Antikörpern, die an Magnetkugeln (Dynal Biotech ASA, Norwegen) gekoppelt sind, angereichert. Unter diesen Bedingungen können einige zirkulierende Tumorzellen pro Milliliter Gesamtblut gezählt werden.
Jedes andere, dem Fachmann bekannte Anreicherungsverfahren genügt den Zwecken der Erfindung.
Das Zählen der auf der Membran einer Mikrotiterplattenvertiefung bereitgestellten Zellen erfolgt mittels Hämocytometrie (Thomas-Zelle, Kovas-Objektträger).
Die Kultivierungsbedingungen, die das Abstoßen oder die Sekretion der Tumormarker ermöglichen, sind herkömmliche Bedingungen, wie 37°C unter feuchter Atmosphäre bei 5% CO₂.
Die Entfernung der Zellen nach der Immunkomplexierung der Tumormarker durch die auf dem Boden der Kultivierungsoberfläche fixierten Bindungspartner erfolgt durch Waschschritte, die aus der Verwendung herkömmlicher Waschpuffer, wie PBS(Phosphate-Buffered-Saline-)Puffer, mit oder ohne Rinderalbumin (1%) bestehen.
Die nach Entfernung der Zellen verwendeten Konjugate sind dem Fachmann herkömmlicherweise bekannte Konjugate.
Als Beispiel für ein Konjugat lassen sich monoklonale Antikörper und polyklonale Antikörper nennen. Vorzugsweise haben die konjugierten Antikörper eine andere Epitopspezifität als die am Boden der Kultivierungsoberfläche fixierten Antikörper.
Unter Markierung der Konjugate wird die Fixierung eines Markers verstanden, der in der Lage ist, direkt oder indirekt ein detektierbares Signal zu erzeugen. Eine nicht-beschränkende Liste dieser Marker beinhaltet die Folgenden:

• Enzyme, die ein beispielsweise mittels Colometrie, Fluoreszenz, Lumineszenz nachweisbares Signal produzieren, wie Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, α-Galactosidase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase,
• Chromophore, wie fluoreszierende, lumineszierende, färbende Verbindungen,
• radioaktive Moleküle, wie ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I und
• fluoreszierende Moleküle, wie Alexa oder Phycocyanine.

Indirekte Systeme können ebenfalls verwendet werden, wie beispielsweise Liganden, die mit einem Antiliganden reagieren können. Die Ligand/Antiligand-Paare sind dem Fachmann bekannt, wie es beispielsweise bei den folgenden Paaren der Fall ist:
Biotin/Streptavidin, Hapten/Antikörper, Antigen/Antikörper, Peptid/Antikörper, Zucker/Lektin, Polynukleotid/komplementäres Polynukleotid. In diesem Fall trägt der Ligand die Bindesubstanz. Der Antiligand kann direkt durch die im vorstehenden Absatz beschriebenen Marker oder selbst durch einen Ligand/Antiligand detektierbar sein.
Diese indirekten Detektionssysteme können unter bestimmten Bedingungen zu einer Signalamplifikation führen. Diese Signalamplifikationstechnik ist dem Fachmann bekannt, und es wird auf die Patenanmeldungen FR98/10084 oder WO-A-95/08000 des Standes der Technik der Anmelderin oder den Artikel J. Histochem. Cytochem. 45:481-491, 1997 verwiesen.
Je nach dem verwendeten Typ der Markierung des Konjugats fügt der Fachmann die Reagenzien hinzu, die die Visualisierung der Markierung gestatten.
So ist es zum Beispiel im Fall von Enzymen notwendig, ein chromogenes Substrat, wie NBT-BCPI für alkalische Phosphatase oder AEC für Peroxidase, hinzuzufügen. Die Zugabe des chromogenen Substrats lässt dann an der Stelle, an der sich eine Zielzelle befindet, einen gefärbten Niederschlag oder einen Immunspot (blau bei NBT-BCIP und rot bei AEC) erscheinen, der einen von der Zelle hinterlassenen realen Proteinabdruck darstellt.
Die Gesamtheit der auf dem Boden der Kultivierungsoberfläche vorliegenden Immunspots kann mit einem Binokular oder besser mithilfe einer KS-ELISPOT-Apparatur (Firma Carl Zeiss Vision GmbH), die mit einem Hochleistungsmikroskop und einer numerischen Kamera, die mit einem Informationsverarbeitungssystem gekoppelt ist, visualisiert und gezählt werden.
Für die Fluoreszenzmarkierung wird die Gesamtheit der Immunspots mit einer an eine Fluoreszenzuntersuchung angepassten KS-ELISPOT-Apparatur visualisiert und gezählt.
Die für die Analyse dieser Spots verwendeten Kriterien sind u.a. der Durchmesser, die Farbe, die Form, die Sättigung, der Kontrast und der Diffusionsgradient. Tatsächlich nehmen die Dichte und die Granulosität der Spots gemäß einem für eine Proteinsynthese sehr charakteristischen Diffusionsgradienten von der Mitte zum Rand hin zu.
Wenn mehr als zwei Bindungspartner auf der Kultivierungsoberfläche vorhanden sind, erfolgt die Sichtbarmachung der Bindungspartner-Tumormarker-Kopplung vorzugsweise mit sekundären Antikörpern, die mit Fluorochromen markiert sind.
So sind gemäß einer bevorzugten Ausführungsform die erfindungsgemäßen Schritte (iv) bis (v) durch die folgenden Schritte ersetzt:

(iv') Zugabe von mit Fluorochromen markierten sekundären Antikörpern,
(v') Visualisieren der Fluoreszenz, wenn eine Bindung zwischen dem Bindepartner und dem Tumormarker stattgefunden hat.

Das Zählen von Tumorzellen durch das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine Messung ihrer Wanderungskapazität in den soliden Krebsen. Die infraklinische und biologische Prognose, Verfolgung der Wirksamkeit verabreichter therapeutischer Behandlungen, Quantifizierung der Resterkrankung und Diagnose von Rückfällen bei soliden Krebsen werden somit dank des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgrund seiner sehr hohen Sensitivität und Spezifität möglich gemacht.
Außerdem können die Tumoren zirkulierende Tumorzellen vom Beginn ihrer Bildung abstoßen, so dass das erfindungsgemäße Verfahren eine Krebsfrühdiagnose ermöglicht.
Also besteht eine andere Aufgabe der Erfindung aus der Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Frühdiagnose und Prognose der Pathologie, zur Auswahl und Evaluierung der Wirksamkeit therapeutischer Behandlungen und zur Diagnose von Rückfällen im Rahmen solider Krebserkrankungen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren bei der Diagnose von Brust-, Prostata-, Schilddrüsen-, Ovarial-, Colon-, Enddarm- und Leberkrebs verwendet.
Außerdem koppelt das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur spezifischen Detektion mit einem Kultivierungsverfahren und gestattet es somit, einen lebensfähigen und funktionellen Charakter der detektierten Tumorzellen zu gewährleisten, eine Eigenschaft, die im Rahmen der Prognose wichtig ist.
Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht somit in der Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Evaluierung des Überlebenspotenzials der zirkulierenden Tumorzellen von Patienten, die von solidem Krebs betroffen sind.
Tatsächlich weist ein positives Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens ein solches Überlebenspotenzial nach.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann dank eines Diagnosekits durchgeführt werden, das eine Kultivierungsoberfläche umfasst, die zuvor mit einem oder mehreren Bindungspartnern für die Tumormarker, die für den gesuchten Krebs spezifisch sind, dem oder den entsprechenden zuvor markierten Konjugat(en), beschichtet worden sind. Das Kit kann ferner Lösungen zum gründlichen Waschen der Zellen nach der Immunkomplexierung enthalten.
Selbstverständlich kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Zählen jeder beliebigen zirkulierenden Tumorzelle, die in der Lage ist, zumindest einen Marker abzustoßen oder zu sezernieren, der als Tumormarker identifiziert wurde, für den ein spezifischer Bindungspartner existiert, verwendet werden.
So kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Beispiel Folgendes gezählt werden:

– Thyreoglobulin (TG) oder Calcitonin (CT) produzierende Schilddrüsentumorzellen,
– Alpha-Fetoproteine (AFP) produzierende Lebertumorzellen,
– das Hormon Choriogonadotropin (beta-HCG) produzierende Hodentumorzellen,
– CA15-3, Kathepsin D, PS2, Her2/neu, Mammaglobin B produzierende Brusttumorzellen,
– CA-125 produzierende Ovarialtumorzellen,
– PSA produzierende Prostatatumorzellen,
– CA19-9, CA-125, CA 19-9 und ACE produzierende Tumorzellen des Verdauungssystems (Colon, Enddarm, Magen und Pankreas) und
– S-100-Protein produzierende Tumorzellen aus einem Melanom.

Die vorliegende Erfindung wird mithilfe der folgenden, nur zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung gegebenen Beispiele sowie mithilfe der beigefügten 1 bis 3 besser verstanden, in denen:
1 (1A bis 1F) die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgehend von MCF-7-Tumorzellen erhaltenen Immunspots zeigt,
2 die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgehend von CD45(–)-Zellen von Referenzpersonen und von Personen, die von metastasierendem Brustkrebs befallen waren, erhaltenen Immunspots zeigt,
3 die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren bei einer der von metastasierendem Brustkrebs befallenen Personen erhaltenen Immunspots zeigt.
Beispiel 1: Zählen der aus MCF-7- und MDA-MB-231-Tumorzelllinien (Brustkrebs) stammenden Tumorzellen
Die Linie MCF-7 wurde verwendet, weil sie erhöhte Spiegel der Proteine Cath-D und MUC1 sezerniert, und die Linie MDA-MB-231, weil sie nur das Cath-D-Protein exprimiert.
Die Zelllinien MCF-7 und MDA-MB-231 wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Biochrom KG, Berlin, Deutschland), das mit 1% Glutamax (Life Technologies, Paisley, Schottland), 10% fötalem Kälberserum (Life Technologies), 500 UI/ml Penicillin und 500 μg/ml Streptomycin (Life Technologies) ergänzt war, in einem befeuchteten Brutschrank mit 5% CO₂ bei 37°C gehalten.
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Nunc, Roskilde, Dänemark), die eine Immobilon-P-Membran (Millipore Corporation, Bedford, MA, U.S.A) als Festphase verwendeten, wurden mit monoklonalen Anti-Kathepsin-D-Antikörpern D7E3 (Garcia, M., Capony, F., Derocq, D., Simon, D., Pau, B. & Rochefort, H. Characterization of monoclonal antibodies to the estrogen-regulated Mr 52,000 glycoprotein and their use in MCF7 cells. Cancer Research 45, 709-716 (1985)) und monoklonalen Anti-CA15-3-Antikörpern (Dakocytomation, Frankreich) beschichtet und über Nacht bei +4°C belassen. Die nicht an die Membran gebundenen Antikörper wurden durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt. Die ungebundenen Stellen wurden anschließend mit 5% Rinderserumalbumin (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Frankreich) für eine Stunde bei Umgebungstemperatur blockiert.
Wenn nötig, wurden die Zelllinien mit 50 μg/ml Cycloheximid auf einer Vorrichtung, die gleichzeitig Kippen und Rotation gestattete, bei 37°C für eine Stunde behandelt, bevor die Quantifizierungen durchgeführt wurden.
Die aus den Zelllinien hervorgehenden lebensfähigen Zellen wurden nach Anfärbung mittels Ausschluss von Trypan-Blau-Farbstoff in einem Hämocytometer gezählt, dann wurde in den Vertiefungen in Doppelansätzen in einem Wachstumsmedium eine Verdünnungsreihe mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Die Platten wurden anschließend bei 37°C in 5% CO₂ für 24 Stunden inkubiert.
Nach Waschen mit PBS wurden entweder mit Meerrettichperoxidase konjugierte monoklonale Anti-Cath-D-Antikörper M1G8 (Garcia, M., Capony, F., Derocq, D., Simon, D., Pau, B. & Rochefort, H, s.o.) oder mit alkalischer Phosphatase konjugierte monoklonale Anti-CA15-3-Antikörper DF3 (Dakocytomation) (1-Farben-Verfahren) oder ein Gemisch von diesen (2-Farben-Verfahren) hinzugefügt, und die Platten wurden bei Umgebungstemperatur inkubiert.
Das geeignete Substrat, d.h. das AEC-Färbungskit (Sigma-Aldrich) für Meerrettichperoxidase, ein Gemisch von X-Phosphat/5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, Toluidinsalz und 4-Nitro-Blau-Tetrazoliumchlorid (BCIP/NTB, Sigma), wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Es wurden rot (Peroxidase, Vorliegen von Cath-D) oder blau (alkalische Phosphatase/Vorliegen von CR15-3) gefärbte unlösliche Niederschläge in 5 bis 10 Minuten erhalten.
Die Platten wurden anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen, um die Reaktion abzustoppen.
Die Immunspots wurden unter Verwendung einer KS-ELISPOT-Apparatur gezählt. Die Vertiefungen ohne Zellen oder ohne Beschichtung mit spezifischen Antikörpern wurden als Referenz eingeschlossen.
1 zeigt die erhaltenen Ergebnisse. Wie in 1A-B (1A für Cath-D; 1B für CA15-3) gezeigt ist, wobei das 1-Farben-Verfahren verwendet wurde, kann durch Verwendung einer Kombination von monoklonalen Anti-Cath-D- und Anti-CA15-3-Antikörper beobachtet werden, dass etwa 25% der MCF-7-Zellen die Proteine Cath-D und/oder CA15-3 nach 24-stündiger Kultivierung in vitro sezernieren. Die Zugabe von Cycloheximid während der Kultivierung verringert gleichzeitig die Größe und die Anzahl der erhaltenen Spots, was eine Denovo-Proteinsynthese bestätigt (1C-D für Cath-D bzw. CA15-3).
Es sollte beachtet werden, dass die Zellen der MDA-MB-231-Linie mit den Anti-Cath-D-Antikörpern keine Spots ergeben haben (Daten nicht gezeigt).
Mithilfe der 2-Farben-Technik (1E-F) lässt sich schließlich feststellen, dass mit den MCF-7-Zelllinien etwa 17% nur "Cath-D"-Spots (roter Niederschlag), 82% nur "CA15-3-(MUC-1-)"Spots (blauer Niederschlag) und 1% "Cath-D"- und "CA15-3-(MUC-1-)"Doppelspots (brauner Niederschlag) sind.
Beispiel 2: Detektionssensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens
Um die minimale Detektionshöhe des erfindungsgemäßen Verfahren zu bestimmen, wurden Verdünnungsreihen der Zellen der MCF-7-Zelllinie von 100000, 10000, 1000, 100, 10 bis zu 1 Zelle pro Vertiefung verwendet und die Sekretion von Cath-D durch das erfindungsgemäße Verfahren gemäß der im Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise und mit der ELISA-Technik (CisBioInternational, Saclay, Frankreich) im entsprechenden Kulturüberstand gemessen.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben: Tabelle 1 Vergleich der Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens und des ELISA-Verfahrens

*: Mittelwert von 4 Vertiefungen.

Wie in der vorstehenden Tabelle gezeigt, waren bei einer Verdünnung von 100000 bis 10000 Zellen pro Vertiefung die Spots so zahlreich, dass sie nicht gezählt werden konnten, während die Detektion von Cath-D mit der ELISA-Technik möglich war. Bei einer Verdünnung von 1000 Zellen pro Vertiefung wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren etwa 250 Spots gezählt, die Cath-D sezernierenden Zellen entsprachen (25%), während mit der ELISA-Technik keine Cath-D-Sekretion nachgewiesen wurde. Mit den höheren Verdünnungen werden identische Ergebnisse erhalten.
Es soll darauf hingewiesen werden, dass sogar bei einer einzigen Zelle pro Vertiefung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Spot detektiert wird und dass ähnliche Ergebnisse mit dem MUC1-Protein erhalten wurden.
Somit zeigen diese Daten, dass bei Anwendung auf die Detektion von Tumormarker in Kulturüberstand das erfindungsgemäße Verfahren eine 10000-mal höhere Sensitivität als das ELISA-Verfahren hat.
Beispiel 3: Detektion zirkulierender Zellen
Zirkulierende Epithelzellen und periphere mononukleäre Zellen wurden mittels Ficoll-Hypaque- Dichtegradientenzentrifugation (Pharma-cia, Uppsala, Schweden) von 8-10 ml Blutproben isoliert, die von 16 Patientinnen mit metastasierendem Brustkrebs stammten, die am Centre de Recherche et de Lutte contre le Cancer, Val d'Aurelle, Montpellier, Frankreich, behandelt wurden.
Die Effizienz der Isolation der Epithelzellen wurde folgendermaßen getestet: In Blut normaler Personen wurden Zellen der MCF-7-Zelllinie in verschiedenen Konzentrationen (1000, 100 und 10 Zellen pro ml Blut) verdünnt. Anschließend wurden diese aliquotierten Blutmengen mit einem Ficoll-Hypaque-Gradienten behandelt und die Zellen hämatologischen Ursprungs durch magnetische Sortierung unter Verwendung von mit monoklonalen Anti-CD45-Antikörpern beschichteten Kugeln entfernt. In den verbliebenen Zellen wurden die CA15-3-Proteine mit dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht. Die Effizienz der Zählung durch das erfindungsgemäßen Verfahren betrug 67%, was zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren die Gewinnung seltener zirkulierender, aus einem Tumor stammender Zellen gestattet.
Die nicht-hämatopoetischen Zellen wurden durch Verarmung aller CD45(+)-Blutzellen der hämatopoetischen Linie, die von peripheren mononukleären Zellen stammten, unter Verwendung von Anti-CD45-Antikörpern mit einer magnetischen Markierung und eines magnetischen Trennverfahrens nach den Empfehlungen von Dynal Biotech ASA angereichert.
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde an den so angereicherten Zellen von Patientinnen, die von metastasierendem Brustkrebs betroffen waren, und von Referenzpatienten gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 dargestellt: Tabelle 2 Zählen der aus CD45(–)-Zellen stammenden Cath-D- und/oder MUC1-Spots
Wie in der vorstehenden Tabelle angegeben, wurde für 5/5 der getesteten Kontrollpersonen keinerlei Expression des Cath-D-Proteins detektiert, wenn die Referenzpersonen getestet wurden.
Beim Betrachten der CA15-3- (MUC-1-)Spots bei 9 Patientinnen der gleichen Gruppe wurden bei vielen Personen zahlreiche Spots bemerkt, deren Größe kleiner als 1000 μm² ist (siehe 2, oberer Abschnitt). Handelte es sich ums CA15-3- (MUC-1-)Spots bei Patienten, die von Krebs betroffen waren, waren 2 Populationen von Spots nachweisbar, kleine Spots mit einer Größe unter 1000 μm² und größere Spots mit einer Größe zwischen 1200 μm² und mehr als 7000 μm² (2, unterer Abschnitt), was darauf hindeutet, dass eine kritische Schwelle von 1000 μm² für die Definition einer anomalen Expression von MUC1 gegenüber CA15-3 geeignet sein kann (2, unterer Abschnitt).
Bei den 16 von einem fortgeschrittenen Krebs betroffenen Patientinnen exprimierte ein Großteil der Zellen nur ein einziges Tumorantigen mit 0,2 bis 25,5 Zellen pro ml Blut für das Cath-D-Protein und 0,5 bis 170 Zellen pro ml Blut für das CA15-3-Protein, während nur 2 Patientinnen unter den 16 beide Proteine exprimierten (3).
Bei einer Patientin, die während dieser Primärdiagnostik (d.h. ohne Behandlung) eines Tumors (Größe < 2 cm) untersucht wurde und bei der ein Sentinal-Lymphknoten befallen war, zählten wir 5,1 Spots/ml vor dem chirurgischen Eingriff und 0 Spot/ml vier Tage danach.
Beispiel 4: Zählung der aus den Tumorzelllinien LNCAP und MCF-7 (Prostatakrebs) stammenden Tumorzellen
Die LNCAP-Linie wurde verwendet, weil sie erhöhte Spiegel des PSA-Proteins sezerniert, und die MCF-7-Linie, weil sie kein PSA-Protein exprimiert.
Die LNCAP-Zelllinie wurde in RPMI-Medium (Eurobio, Les Ullis, Frankreich) gehalten, das bis auf QSP 450 ml mit 5 ml Glutamin (2 mM), 50 ml fötalem Kälberserum (10%), 100 UI/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 2,5 ml Glucose 100 (4,5 g/l) und 5 ml 100 mM Natriumpyruvat (1 mM) angereichert war.
Die MCF-7-Zelllinie, wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde als Referenz verwendet.
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Nunc, Roskilde, Dänemark), die eine Immobilon-P-Membran (Millipore Corporation, Bedford, MA, U.S.A) als Festphase verwendeten, wurden mit monoklonalen Anti-PSA-Antikörpern (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Frankreich) beschichtet und über Nacht bei +4°C belassen. Die nicht an die Membran gebundenen Antikörper wurden durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt. Die ungebundenen Stellen wurden anschließend mit 5% Rinderserumalbumin (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Frankreich) für eine Stunde bei Umgebungstemperatur blockiert.
Wenn nötig, wurden die Zelllinien mit 50 μg/ml Cycloheximid auf einer Vorrichtung, die gleichzeitig Kippen und Rotation gestattete, bei 37°C für eine Stunde behandelt, bevor die Quantifizierungen durchgeführt wurden.
Die aus den Zelllinien hervorgegangenen lebensfähigen Zellen wurden nach Anfärbung durch Ausschluss von Trypan-Blau-Farbstoff in einem Hämocytometer gezählt, dann wurde in den Vertiefungen in Doppelansätzen eine Verdünnungsreihe in einem Wachstumsmedium mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Die Platten wurden anschließend bei 37°C in 5% CO₂ für 24 Stunden inkubiert.
Nach Waschen mit PBS wurden mit alkalischer Phosphatase konjugierte monoklonale Anti-PSA-Antikörper (bioMérieux) hinzugefügt (1-Farben-Verfahren), und die Platten wurden bei Umgebungstemperatur inkubiert.
Das geeignete chromatische Substrat, im Gemisch von X-Phosphat/5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, Toluidinsalz und 4-Nitro-Blau-Tetrazoliumchlorid (BCIP/NTB, Sigma), wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Es wurden blau gefärbte unlösliche Niederschläge in 5 bis 10 Minuten erhalten.
Die Platten wurden anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen, um die Reaktion abzustoppen.
Die Immunspots wurden unter Verwendung einer KS-ELISPOT-Apparatur gezählt. Die Vertiefungen ohne Zellen oder ohne Beschichtung mit spezifischen Antikörpern wurden als Referenz eingeschlossen.
Es soll darauf hingewiesen werden, dass die Effizienz der Isolation von Epithelzellen wie im Beispiel 3 angegeben getestet wurde und 70% betrug.
Beispiel 5: Detektion PSA sezernierender zirkulierender Zellen:
Zirkulierende Epithelzellen und periphere mononukleäre Zellen wurden durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation (Pharmacia, Uppsala, Schweden) von 8-10 ml Blutproben isoliert, die von 10 Patienten mit metastasierendem Prostatakrebs stammten, die in der Clinique Beau Soleil und am CHU, Montpellier, Frankreich, behandelt wurden.
Die nicht-hämatopoetischen Zellen wurden durch Verarmung aller CD45(+)-Blutzellen der hämatopoetischen Linie, die von peripheren mononukleären Zellen stammten, unter Verwendung von Anti-CD45-Antikörpern mit einer magnetischen Markierung und eines magnetischen Trennverfahrens nach den Empfehlungen von Dynal Biotech ASA angereichert.
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde an den so angereicherten Zellen von Patienten, die von metastasierendem Prostatakrebs betroffen waren, und von Referenzpatienten gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt.
Wenn die Referenzpersonen getestet wurden, wurde für 6/6 der getesteten Personen keinerlei Expression des PSA-Proteins detektiert. Dagegen haben wir bei 10 Patienten mit Knochenmetastasen PSA sezernierende zirkulierende Zellen gezählt.
Beispiel 6: Zählung der aus ML-1-Tumorzelllinien (Schilddrüsenkrebs) stammenden Tumorzellen
Die ML-1-Linie wurde verwendet, weil sie erhöhte Spiegel des TG-Proteins sezerniert.
Die ML-1-Zelllinie wurde uns freundlicherweise von der deutschen Gruppe von D. Grimm zur Verfügung gestellt (Schonberger J, Bauer J, Spruss T, Weber G, Chahoud I, Eilles C, Grimm D. Establishment and characterization of the follicular thyroid carcinoma cell live ML-1, and characterization of the follicular thyroid carcinoma cell live ML-1. J Mol Med 2000; 78(2):102-10).
Sie wurde in DMEM-Medium (4,5 g/l Glucose) gehalten, das mit 20% fötalem Kälberserum, Glutamin (2 mM) und Natriumpyruvat (1 mM) ergänzt wurde.
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Nunc, Roskilde, Dänemark), die eine Immobilon-P-Membran (Millipore Corporation, Bedford, MA, U.S.A) als Festphase verwendeten, wurden mit monoklonalen Anti-TG-Antikörpern (BioRad, Marnes la Coquette, Frankreich) beschichtet und über Nacht bei +4°C belassen. Die nicht an die Membran gebundenen Antikörper wurden durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt. Die ungebundenen Stellen wurden anschließend mit 5% Rinderserumalbumin (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Frankreich) für eine Stunde bei Umgebungstemperatur blockiert.
Die ML-1-Zellen wurden nach Anfärbung durch Ausschluss von Trypan-Blau-Farbstoff in einem Hämocytometer gezählt, dann wurde in den Vertiefungen in Doppelansätzen in einem Wachstumsmedium eine Verdünnungsreihe mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Die Platten wurden anschließend bei 37°C in 5% CO₂ für 24 Stunden inkubiert.
Nach Waschen mit PBS wurden mit alkalischer Phosphatase konjugierte monoklonale Anti-TG-Antikörper (BioRad, Marnes la Coquette, Frankreich) hinzugefügt (1-Farben-Verfahren), und die Platten wurden bei Umgebungstemperatur inkubiert.
Das geeignete chromatische Substrat (Gemisch von X-Phosphat/5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, Toluidinsalz und 4-Nitro-Blau-Tetrazoliumchlorid (BCIP/NTB, Sigma)) wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Es wurden blau gefärbte unlösliche Niederschläge in 5 bis 10 Minuten erhalten.
Die Platten wurden anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen, um die Reaktion abzustoppen.
Die Immunspots wurden unter Verwendung einer KS-ELISPOT-Apparatur gezählt. Die Vertiefungen ohne Zellen oder ohne Beschichtung mit spezifischen Antikörpern wurden als Referenz eingeschlossen.
Es soll darauf hingewiesen werden, dass die Effizienz der Isolation von Epithelzellen wie im Beispiel 3 angegeben getestet wurde und 70% betrug.
Beispiel 7: Detektion TG sezernierender, zirkulierender Zellen:
Zirkulierende Epithelzellen und periphere mononukleäre Zellen wurden durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation (Pharmacia, Uppsala, Schweden) von 8-10 ml Blutproben isoliert, die von 15 Patienten mit metastasierendem Schilddrüsenkrebs stammten, die am Hospital Lapeyronie und am CHU, Montpellier, Frankreich, behandelt wurden.
Die nicht-hämatopoetischen Zellen wurden durch Verarmung aller CD45(+)-Blutzellen der hämatopoetischen Linie, die von peripheren mononukleären Zellen stammten, unter Verwendung von Anti-CD45-Antikörpern mit einer magnetischen Markierung und eines magnetischen Trennverfahrens nach den Empfehlungen von Dynal Biotech ASA angereichert.
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde an den so angereicherten Zellen von Patienten, die von metastasierendem Schilddrüsenkrebs betroffen waren, und von Referenzpatienten gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt.
Wir haben in unsere Studie allein Patient(inn)en mit positiven TG-Serumanteilen eingeschlossen. Es wurden 15 Patient(inn)en im Abstand von der Behandlung des Primärtumors untersucht. Bei 5/6 Patient(inn)en mit metastasierender Entwicklung haben wir die TG sezernierenden, zirkulierenden Zellen gezählt; bei 3 Patient(inn)en war diese Zellzahl nach In-vivo-Stimulation mit Thyrogen erhöht. Bei zwei Patientinnen ohne klinische Komplikationen und mit normalen TG-Anteilen wurden Spots gezählt.
Beispiel 8: Zählung der aus den Tumorzelllinien BG-1 und SKOV3 (Ovarialkrebs) stammenden Tumorzellen
Die BG-1-Linie wurde verwendet, weil sie erhöhte Spiegel des CA-125-Proteins sezerniert, und die SKOV3-Linie, weil sie das CA-125-Protein nicht exprimiert.
Die BG-1-Zelllinie wurde in McCoy's-5a-Medium gehalten, das Glutamin (1,5 mM) und fötales Kälberserum (10%) enthielt.
Die SKOV3-Zelllinie wurde als Referenz verwendet. Sie wurde im gleichen Medium wie die BG-1-Linie gehalten.
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Nunc, Roskilde, Dänemark), die eine Immobilon-P-Membran (Millipore Corporation, Bedford, MA, U.S.A) als Festphase verwendeten, wurden mit monoklonalen Anti-CA-125-Antikörpern (Dakocytomation) beschichtet und über Nacht bei +4°C belassen. Die nicht an die Membran gebundenen Antikörper wurden durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt. Die ungebundenen Stellen wurden anschließend mit 5% Rinderserumalbumin (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Frankreich) für eine Stunde bei Umgebungstemperatur blockiert.
Die BG-1-Zellen wurden nach Anfärbung mittels Ausschluss von Trypan-Blau-Farbstoff in einem Hämocytometer gezählt, dann wurde in den Vertiefungen in Doppelansätzen eine Verdünnungsreihe in einem Wachstumsmedium mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Die Platten wurden anschließend bei 37°C in 5% CO₂ für 24 Stunden inkubiert.
Nach Waschen mit PBS wurden mit alkalischer Phosphatase gekoppelte monoklonale Anti-CA-125-Antikörper (Dakocytomation) hinzugefügt (1-Farben-Verfahren), und die Platten wurden bei Umgebungstemperatur inkubiert.
Das geeignete chromatische Substrat (Gemisch von X-Phosphat/5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, Toluidinsalz und 4-Nitro-Blau-Tetrazoliumchlorid (BCIP/NTB, Sigma)), wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Es wurden blau gefärbte unlösliche Niederschläge in 5 bis 10 Minuten erhalten.
Die Platten wurden anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen, um die Reaktion abzustoppen.
Die Immunspots wurden unter Verwendung einer KS-ELISPOT-Apparatur gezählt. Die Vertiefungen ohne Zellen oder ohne Beschichtung mit spezifischen Antikörpern wurden als Referenz eingeschlossen.
Es soll darauf hingewiesen werden, dass die Effizienz der Isolation von Epithelzellen wie im Beispiel 3 angegeben getestet wurde und 70% betrug.
Beispiel 9: Zählung der aus den Tumorzelllinien Caco2 und HT-29 (Colorektalkrebs) stammenden Tumorzellen
Die Linien Caco2 und HT-29 wurden verwendet, weil sie erhöhte Spiegel der Proteine CA 19-9 und ACE sezernieren. Die beiden Zelllinien wurden hinsichtlich beider Tumormarker untersucht.
Die Caco2-Zelllinie wurde in einem MEM-Medium mit Earles-Salzen und nicht-essenziellen Aminosäuren gehalten, das mit fötalem Kälberserum (20%), Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM) und Natriumbicarbonat (1,5 g/l) angereichert war.
Die HT-29-Zelllinie wurde in einem Medium aus McCoy's-5a-Medium gehalten, das Glutamin (1,5 mM) und fötales Kälberserum (10%) enthielt.
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Nunc, Roskilde, Dänemark), die eine Immobilon-P-Membran (Millipore Corporation, Bedford, MA, U.S.A) als Festphase verwendeten, wurden mit monoklonalen Anti-CA- 19-9- (Dakocytomation) oder Anti-ACE-Antikörpern bioMérieux, Marcy l'Etoile, Frankreich) beschichtet und über Nacht bei +4°C belassen. Die nicht an die Membran gebundenen Antikörper wurden durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt. Die ungebundenen Stellen wurden anschließend mit 5% Rinderserumalbumin (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Frankreich) für eine Stunde bei Umgebungstemperatur blockiert.
Die Caco2- und HT-29-Zellen wurden nach Anfärbung mittels Ausschluss von Trypan-Blau-Farbstoff in einem Hämocytometer gezählt, dann wurde in den Vertiefungen in Doppelansätzen eine Verdünnungsreihe in einem Wachstumsmedium mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Die Platten wurden anschließend bei 37°C in 5% CO₂ für 24 Stunden inkubiert.
Nach Waschen mit PBS wurden mit alkalischer Phosphatase gekoppelte monoklonale Anti-CA-19-9- oder mit Peroxidase gekoppelte Anti-ACE-Antikörper (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Frankreich) hinzugefügt (1-Farben-Verfahren), und die Platten wurden bei Umgebungstemperatur inkubiert.
Das geeignete chromatische Substrat für die alkalische Phosphatase (Gemisch von X-Phosphat/5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, Toluidinsalz und 4-Nitro-Blau-Tetrazoliumchlorid (BCIP/NTB, Sigma)) wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Es wurden blau gefärbte unlösliche Niederschläge in 5 bis 10 Minuten erhalten. Das geeignete chromatische Substrat für Peroxidase, d.h. das ACE-Färbungskit (Sigma-Aldrich), wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Es wurden rot gefärbte unlösliche Niederschläge in 10 Minuten erhalten.
Die Platten wurden anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen, um die Reaktion abzustoppen.
Die Immunspots wurden unter Verwendung einer KS-ELISPOT-Apparatur gezählt. Die Vertiefungen ohne Zellen oder ohne Beschichtung mit spezifischen Antikörpern wurden als Referenz eingeschlossen.
Es soll darauf hingewiesen werden, dass die Effizienz der Isolation von Epithelzellen wie im Beispiel 3 angegeben getestet wurde und 70% betrug.
Beispiel 10: Zählung der aus Lebertumorzelllinien (primärer Leberkrebs) stammenden Tumorzellen
Es wurde die hepatische Linie verwendet, weil sie erhöhte Spiegel von Alpha-Protein sezerniert.
Die Zelllinie wurde in RPMI-Medium gehalten, das Glutamin (1,5 mM) und fötales Kälberserum (20%) enthielt.
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Nunc, Roskilde, Dänemark), die eine Immobilon-P-Membran (Millipore Corporation, Bedford, MA, U.S.A) als Festphase verwendeten, wurden mit monoklonalen Anti-CA-125-Antikörpern (Dakocytomation) beschichtet und über Nacht bei +4°C belassen. Die nicht an die Membran gebundenen Antikörper wurden durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt. Die ungebundenen Stellen wurden anschließend mit 5% Rinderserumalbumin (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Frankreich) für eine Stunde bei Umgebungstemperatur blockiert.
Die Zellen wurden nach Anfärbung mittels Ausschluss von Trypan-Blau-Farbstoff in einem Hämocytometer gezählt, dann wurde in den Vertiefungen in Doppelansätzen eine Verdünnungsreihe in einem Wachstumsmedium mit unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt. Die Platten wurden anschließend bei 37°C in 5% CO₂ für 24 Stunden inkubiert.
Nach Waschen mit PBS wurden mit Peroxidase gekoppelte Anti-AFP-Antikörper (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Frankreich) hinzugefügt (1-Farben-Verfahren), und die Platten wurden bei Umgebungstemperatur inkubiert.
Das geeignete chromatische Substrat für Peroxidase, d.h. das ACE-Färbungskit (Sigma-Aldrich), wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Es wurden rot gefärbte unlösliche Niederschläge in 10 Minuten erhalten.
Die Platten wurden anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen, um die Reaktion abzustoppen.
Die Immunspots wurden unter Verwendung einer KS-ELISPOT-Apparatur gezählt. Die Vertiefungen ohne Zellen oder ohne Beschichtung mit spezifischen Antikörpern wurden als Referenz eingeschlossen.
Es soll darauf hingewiesen werden, dass die Effizienz der Isolation von Epithelzellen wie im Beispiel 3 angegeben getestet wurde und 70% betrug.

Claims

Verfahren zur Detektion und/oder Quantifizierung von nicht-hämatopoetischen, tumorösen, neoplastischen Zellen, die in einer biologischen Probe eines Patienten, der von einem soliden Krebs betroffen ist, zirkulieren, und die in der Lage sind, in vitro einen oder mehrere Tumormarker abzustoßen oder zu sekretieren, das die folgenden Schritte aufweist, nämlich: (i) Bereitstellen der Probe, deren Zellen gezählt wurden, auf dem Boden einer Kultivierungsoberfläche, auf der zumindest ein spezifischer Bindungspartner für den oder die Tumormarker fixiert ist, (ii) Kultivieren der Zellen unter solchen Bedingungen, unter denen die nicht-hämatopoetischen, tumorösen, neoplastischen Zellen die Tumormarker abstoßen oder sekretieren, die auf dem Boden der Kultivierungsoberfläche immunkomplexiert sind, (iii) Entfernen der Zellen durch Waschen, (iv) Hinzugeben von zumindest einem für die Tumormarker spezifischen markierten Konjugat, und (v) Visualisieren der so erhaltenen Markierung.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Proben Blut oder Knochenmark aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumormarker entweder Membranantigene sind, die in der Lage sind, durch Spaltung an dem Boden der Kultivierungsoberfläche abgestoßen zu werden, oder intrazelluläre Antigene sind, die von den Zellen an dem Boden der Kultivierungsoberfläche sekretiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass höchstens vier verschiedene Bindungspartner, vorzugsweise höchstens zwei Bindungspartner, an den Boden der Kultivierungsoberfläche fixiert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzellen in der Lage sind, als Tumormarker das PSA-Antigen zu sekretieren, und der Bindepartner ein Anti-PSA-Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzellen in der Lage sind, als Tumormarker das Proteinantigen CA15-3 abzustoßen, und der Bindepartner ein Anti-CA15-3-Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzellen in der Lage sind, als Tumormarker das Proteinantigen TG zu sekretieren, und der Bindepartner ein Anti-TG-Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzellen in der Lage sind, als Tumormarker das Proteinantigen CA 125 zu sekretieren, und der Bindepartner ein Anti-CA 125-Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzellen in der Lage sind, als Tumormarker das Proteinantigen ACE und/oder CA 19-9 zu sekretieren, und der Bindepartner ein Anti-ACE- und Anti-CA 19-9-Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzellen in der Lage sind, als Tumormarker das Proteinantigen Alpha-Fetoprotein zu sekretieren, und der Bindepartner ein Anti-AFP-Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass zwei Bindepartner vorgesehen sind, die vorzugsweise Anti-CA15-3- und Anti-Cath-D-Antikörper sind.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte (iv) bis (v) durch die folgenden Schritte ersetzt sind: (iv') Zugabe von mit Fluorochromen markierten sekundären Antikörpern, (v') Visualisieren der Fluoreszenz, wenn eine Bindung zwischen dem Bindepartner und dem Tumormarker stattgefunden hat.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 ex vivo in der Frühdiagnose und pathologischen Prognose, in der Entscheidung und Evaluierung der Wirksamkeit von therapeutischen Behandlungen und in der Diagnose von Rückfällen in der Umgebung von festem Krebs.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Krebs Brustkrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Krebs Prostatakrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Krebs Schilddrüsenkrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Krebs Ovarialkrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Krebs Colonkrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Krebs primärer Leberkrebs ist.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12, um das Überlebenspotential von zirkulierenden Tumorzellen zu evaluieren, die aus Patienten stammen, die von solidem Krebs betroffen sind.
Verwendung eines diagnostischen Kits, das eine Kultivierungsoberfläche, die zuvor mit einem oder mehreren Bindepartnern für Tumormarker beschichtet wurde, die spezifisch sind für soliden Krebs, bezüglich dessen eine Untersuchung durchgeführt werden soll, sowie ein oder mehrere zuvor markierte entsprechende Konjugate aufweist, um nicht-hämatopoetische, tumoröse, neoplastische Zellen zu detektieren und/oder zu quantifizieren, die in einer biologischen Probe eines Patienten zirkulieren, der von dem soliden Krebs betroffen ist.