DE69631149T2

DE69631149T2 - Formulierungen in form von emulsionen zur verabreichung von nukleinsäuren an zellen

Info

Publication number: DE69631149T2
Application number: DE69631149T
Authority: DE
Inventors: Dexi Liu; Feng Liu; Jing-Ping Yang; Leaf Huang
Original assignee: University of Pittsburgh
Current assignee: University of Pittsburgh
Priority date: 1995-09-26
Filing date: 1996-09-26
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2016-09-27
Also published as: US20020090377A1; ES2208763T3; JPH11512712A; US20030211143A1; ATE256452T1; DK0852490T3; WO1997011682A3; WO1997011682A2; EP0852490B1; US6120794A; EP0852490A2; DE69631149D1; CA2230940A1; PT852490E; US6586003B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Lipiddispersionen, um biologisch aktive Substanzen Zellen zuzuleiten. Im besonderen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Emulsionsformulierungen und auf die Fähigkeit dieser Formulierungen, stabile Komplexe mit biologisch aktiven Substanzen zu bilden und dadurch das Zuleiten dieser Substanzen zu Zellen zu erleichtern.
Hintergrund der Erfindung
Kationische Liposomen sind von Interesse als ein nicht-virales Vehikel für das Zuleiten biologisch aktiver Substanzen, wie Arzneimittel, Hormone, Enzyme, Nukleinsäuren und Antigene, einschließlich von Viren zu Zellen, sowohl in vitro als auch in vivo. Es wurde in der Tat gezeigt, daß kationische Liposomen Gene in vivo zuleiten (Nabel E. G., et al., (1990) Science, 249: 1285–1288), (Brigham, K. L., et al., (1989) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 195– 200, Stribling, R., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 11 277–11 281), Plautz, G. E. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 4 645–4 649, Stewart, M. J., et al., (1992) Hum. Gene Ther., 3: 267–275). Die Hemmung des Transfers von Nukleinsäuren durch kationische Liposomen durch Serumbestandteile beschränkt jedoch die Anwendung von Liposomen als einen Vektor für Nukleinsäuren in vivo auf die lokale Verabreichungen, welche eine Exposition gegenüber von Serum vermeiden.
Zusätzlich ist die Stabilität ein Hauptproblem, welches die Verwendung von Liposomen limitiert, sowohl die Lebensdauer bei der Lagerung als auch nach einer Verabreichung in vivo betreffend. Daher ist es wünschenswert, die Verwendung anderer Arten von Lipiddispersionen als Gebrauchssysteme für die Zuleitung von biologisch aktiven Substanzen zu erforschen.
Das USP 4 610 888 bezieht sich auf die Verwendung als ein Arzneimittel-Zuleitungssystem von Wasser-in-Öl-Emulsionen, bei welchen das Volumen der wäßrigen Phase in dem Bereich von etwa 0,7% bis etwa 10,25% des Volumens der verwendeten Lipidkomponenten liegt. Solche Wasser-in-Öl-Emulsionen sind jedoch ungeeignet für das Zuleiten von Substanzen in Blut oder in anderen wäßrigen Körpergeweben.
Die WO 95/12 384 beschreibt eine selbstemulgierende Ölformulierung (SEOF), welche eine Ölkomponente und ein Tensid enthält. Das SEOF ist dadurch charakterisiert, daß die Ölkomponente einen Ölvektor und ein kationisches Lipid enthält und wahlweise einen lipophilen öligen Fettalkohol. Die Öl-in-Wasser-Emulsion, welche durch das Mischen der SEOF gebildet wird, hat ölhaltige Tröpfchen, welche positiv geladen sind.
Die WO 93/18 852 beschreibt eine Öl-in-Wasser-Emulsion, welche nützlich ist als ein Zuleitungsvehikel für hydrophobe Inhaltsstoffe, wie pharmazeutische Arzneistoffe und kosmetisch wirksame Mittel, worin die Emulsionsteilchen eine positive Nettoladung haben.
Die EP-A-387 647 beschreibt eine in einem hohen Maß dispergierte pharmazeutische Zusammensetzung in der Form einer Mikroemulsion, welche eine saure oder eine basische Substanz umfaßt oder deren Salz, ein kationisches oder ionisches Material, eine fetthaltige Komponente, welche Isopropylmyristat, 2-Octyldodecanol, Paraffinöl, Tocopherolnicotinat, und/oder Triacetin ist, ein Tensid, welches Polyoxyethylenfettsäureester und oder Polyoxyethylenfettalkoholether ist, und ein Co-Tensid, welches Polyoxyethylenglycerinfettsäureester ist, und Wasser.
Die WO 93/05162 beschreibt ein Verfahren zur Erleichterung des Transfers für Nukleinsäuren in Zellen, umfassend das Herstellen einer gemischten Lipiddispersion eines kationischen Lipids mit einem Co-Lipid in einem geeigneten Trägerlösemittel.
Treiner et al., J. Coloid Interface Sci. 125 Nr. 1 (1988), 261–270 beschreiben eine micellare Solubilisierung in wäßrigen binären Tensidsystemen, in spezifischer Weise Barbitursäuren in gemischten anionischen plus nichtionischen oder kationischen plus nichtionischen Mischungen.
Farhood et al., Biochim. Biophys. Acta 1111 Nr. 2 (1992), 239–246 beschreiben die Wirkung kationischer Cholesterolderivate auf den Gentransfer und die Aktivität von Proteinkinase C.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neuartige Emulsionsformulierungen, welche nützlich für das Zuleiten biologisch aktiver Substanzen zu Zellen sind. Die Emulsionsformulierungen dieser Erfindung sind kompatibel mit Blut, behalten ihre Aktivität in Gegenwart von Serum bei und sind lagerungsstabil. Die Emulsionen dieser Erfindung umfassen Lipidkomponenten, eine Nukleinsäure und einen wäßrigen Träger, worin die Lipidkomponenten eine Ölkomponente, eine kationische amphiphile Komponente, bevorzugtermaßen ein kationisches Lipid und eine nichtionische Tensidkomponente umfassen. Micellare Formulierungen (nicht hierin beansprucht) umfassen Lipidkomponenten, eine Nukleinsäure und einen wäßrigen Träger, worin die Lipidkomponenten eine kationische amphiphile Komponente und eine nichtionische Tensidkomponente umfassen. Die Lipidkomponenten der Emulsionsformulierung der vorliegenden Erfindung können weiter eine neutrale Phospholipidkomponente umfassen.
„Komponente" wie in der Beschreibung und in den Ansprüchen durchweg verwendet, ist definiert als: umfassend mindestens ein kationisches Amphiphiles oder eine Mischung von Amphiphilen, wenn in dem Ausdruck „amphiphile Komponente" verwendet, umfassend mindestens ein Öl oder eine Mischung von Ölen, wenn in dem Ausdruck „Ölkomponente" verwendet, umfassend mindestens ein nichtionisches Tensid oder eine Mischung von nichtionischen Tensiden, wenn in dem Ausdruck „nichtionische Tensidkomponente" verwendet, umfassend mindestens ein neutrales Phospholipid oder eine Mischung von neutralen Phospholipiden, wenn in dem Ausdruck „neutrale Phospholipidkomponente" verwendet.
Die Erfindung bezieht sich auf Komplexe, welche gebildet werden durch das Kombinieren einer Nukleinsäure und wahlweise anderer biologisch aktiver Substanzen und den vorausstehend angegebenen Emulsionsformulierungen. Die Nukleinsäure : Emulsion-Komplexe sind über die Zeit stabil und können einen therapeutischen und/oder prophylaktischen Nutzen in vivo haben, in Abhängigkeit von der Aktivität der in dem Komplex enthaltenen Nukleinsäure.
Diese Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren in vitro bereit für das Zuleiten einer Nukleinsäure zu Zellen, durch das Aussetzen von Zellen gegenüber den Komplexen dieser Erfindung. In einer Ausführungsform wird ein Verfahren des Aussetzens von Zellen gegenüber einer Nukleinsäure bereitgestellt, wobei dieses Verfahren das Kultivieren der Zellen in Gegenwart eines Nukleinsäure : Emulsion-Komplexes umfaßt, wodurch das Zuleiten der Nukleinsäure zu den Zellen erleichtert wird.
Die Erfindung stellt weiter die Verwendung einer Emulsionsformulierung bei der Herstellung eines Medikamentes bei der Behandlung eines Zustandes in einem Tier oder einem Menschen bereit, wobei dieser Zustand ein solcher ist, in welchem die Behandlung das Zuleiten einer Nukleinsäure zu den Zellen des Menschen oder des Tieres umfaßt. Man muß verstehen, daß die für das Zuleiten einer Nukleinsäure zu den Zellen in vitro oder vivo verwendeten Komplexe frisch durch das Beimischen hergestellt werden können oder zuvor, vor ihrer Verwendung hergestellt und gelagert werden können.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Kit bereit, welches einen Komplex enthält, der zwischen einer Nukleinsäure und einer Emulsionsformulierung gebildet wurde.
Verfahren zur Herstellung von Emulsionsformulierungen gemäß der Erfindung werden ebenfalls hierin bereit gestellt.
In einer Ausführungsform umfaßt ein Verfahren zur Herstellung einer Emulsionsformulierung dieser Erfindung

a) das Kombinieren eines organischen Lösemittels mit einer Ölkomponente, einer kationischen amphiphilen Komponente und einer nichtionischen Tensidkomponente
b) das Entfernen des organischen Lösemittels, um einen Lipidfilm zurückzulassen und
c) das Suspendieren des Lipidfilms in einem wäßrigen Träger, um die in wäßriger Lösung mischbare Emulsionsformulierung herzustellen.

In einer alternativen Ausführungsform kann das Öl als das organische Lösemittel in dem Schritt (a) dienen, so daß das Verfahren für das Herstellen einer Emulsionsformulierung dieser Erfindung umfaßt:

a) das Kombinieren einer Ölkomponente, einer kationischen amphiphilen Komponente und einer nichtionischen Tensidkomponente und
b) das Zugeben eines wäßrigen Trägers zu der Kombination von Schritt (a).

Wenn eine neutrale Phospholipidkomponente in der Emulsion eingeschlossen sein soll, wird die neutrale Phospholipidkomponente mit den vorausstehenden Komponenten in dem Schritt (a) kombiniert.
Das Verfahren zur Herstellung einer micellaren Formulierung, welche in einer wäßrigen Lösung mischbar ist, umfaßt:

a) das Kombinieren eines organischen Lösemittels mit einer kationischen amphiphilen Komponente und einer nichtionischen Tensidkomponente.
b) das Entfernen des organischen Lösemittels, um einen Lipidfilm zurück zu lassen und
c) das Suspendieren des Lipidfilms in einem wäßrigen Träger, um die micellare Formulierung, welche in einer wäßrigen Lösung mischbar ist, herzustellen.

Wenn eine neutrale Phospholipidkomponente in der micellaren Formulierung eingeschlossen sein soll, wird die neutrale Phopholipidkomponente mit den vorausstehenden Komponenten in dem Schritt (a) kombiniert.
Beschreibung der Figuren
Die 1 zeigt die Optimierung der Transfektion von BL6 Zellen mit Komplexen die zwischen pCMV-Luc-DNS und den Formulierungen Nr. 21 (•-•), Nr. 27
, Nr. 28 (σ-σ) oder Nr. 30 (O-O) gebildet wurden (siehe Tabelle 3 für die Zusammensetzungen der Formulierungen) durch das Mischen von 6 μl einer jeden Formulierung (6 μl jeder Formulierung enthielt 4,5 μg von DC-Chol) mit variierenden Mengen von pCMV-Luc-DNS wie auf der horizontalen Achse angegeben.
Die 2 zeigt die Optimierung der Transfektion von BL6 Zellen mit Komplexen, die zwischen pCMV-Luc-DNS und variierenden Mengen der Formulierungen Nr. 21 (•-•), Nr. 27
Nr. 28 (σ-σ) oder Nr. 30 (•-•) gebildet wurden, wie auf der horizontalen Achse angegeben (siehe Tabelle 3 für die Zusammensetzungen der Formulierungen). Die Menge der pCMV-Luc-DNS wurde bei 2 μg für die Formulierungen Nr. 27 und Nr. 30 und bei 1,5 μg pCMV-Luc-DNS für die Formulierungen Nr. 21 und Nr. 28 fixiert und „μg -Formulierung" auf der horizontalen Achse bezieht sich auf die μg der Gesamtlipidkomponenten, die in der Menge der Formulierung vorhanden sind, kombiniert mit pCMV-Luc-DNS, um den Komplex zu bilden.
Die 3 zeigt die Stabilität der Komplexe, die zwischen der DNS und den angegebenen Emulsions- oder micellaren Formulierungen gebildet wurden (siehe Tabelle 3 für die Zusammensetzung der Formulierungen). Der Komplex wurde hergestellt mit 2 μg pCMVCAT und 16 μl der angegebenen Formulierungen, welche dieselben Mengen von DC-Chol (12 μg) in einem Endvolumen von 250 μl enthielten, außer für DC-Chol/DOPE-Liposom : DNS-Komplexe, welche hergestellt wurden mit 1 μg pCMVCAT und 6 μg Liposom in einem Endvolumen von 250 μl.
Die 4 zeigt den Effekt der Variation der Konzentration von Tween 80 in Emulsionen, welche 0,25 mg Öl, 0,25 mg DOPE, 0,75 mg DC-Chol und x mg Tween 80 pro ml enthielten,
eine neutrale Phospholipidkomponente. auf den durchschnittlichen Durchmesser der konzentrierten (•-•) und verdünnten (O-O) pCMV-Luc-DNS/Emulsion-Komplexe.
Die 5A und 5B zeigen den Effekt von Tween 80 auf die Transfektionsaktivität von konzentrierten (5A) und verdünnten (5B) pCMV-Luc-DNS/Emulsion-Komplexen in BL6 Zellen in Medium, welches entweder 0 oder 20% Serum enthielt. Die Emulsionsformulierungen, welche verwendet wurden, um die verdünnten und die konzentrierten DNS : Emulsion-Komplexe herzustellen, enthielten 0,25 mg Öl, 0,25 mg DOPE, 0,75 mg DC-Chol und variierende Mengen von Tween 80 pro ml. Der konzentrierte DNS/Emulsion-Komplex wurde gebildet durch das Zugeben von 2 μl einer Lösung, welche 8 μg von pCMV-Luc-DNS enthielt, zu 72 μl der Emulsion, und der verdünnte DNS/Emulsion-Komplex wurde gebildet durch das Kombinieren von 2 μg pCMV-Luc DNS in 125 μl mit 18 μl der Emulsion, verdünnt auf 125 μl.
Die 6 zeigt die Expression des CAT-Reporter-Gens in Mäusen, die über die Schwanzvene mit DNS : Emulsion- oder DNS : Micellen-Komplexen injiziert wurden. Die Komplexe wurden wie folgt gebildet: 200 μl einer jeden von 4× Konzentraten der Formulier-ungen Nr. 21 (1100 μg Gesamtlipidkomponenten), Nr. 28 (1000 μg Gesamtlipidkomponenten), Nr. 34 (900 μg Gesamtlipidkomponenten) und Nr. 31 (700 μg Gesamtlipidkomponenten) wurden gemischt mit 6 μl 5 M NaCl zu einer Endkonzentration von NaCl von 0,15 M und dann kombiniert mit 25 μl von 4 μg/μl pCMV-CAT-DNS (100 μg). Die Menge von DC-Chol, die in einem jeden DNS : Emulsion- und DNS : Micellen-Komplex enthalten war, war 600 μg. Nach 2 Tagen wurden die Organe herausgeschnitten und das Protein wurde extrahiert. Die CAT-Aktivität wurde gemessen durch die Verwendung von 0,1 μCi [¹⁴C]-Chloramphenicol als das Substrat. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert von 2 Mäusen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Emulsionsformulierungen, welche stabile Komplexe mit einer Nukleinsäure bilden und dadurch das Zuleiten der Nukleinsäure zu Zellen erleichtern.
Die Emulsionsformulierungen, dieser Erfindung sind Öl-in-Wasser-Emulsionen, welche einen wäßrigen Träger umfassen und die folgenden Lipidkomponenten, eine Ölkomponente, eine kationische amphiphile Komponente, eine nichtionische Tensidkomponente und wahlweise eine neutrale Phospholipidkomponente.
Bevorzugtermaßen sind die Gesamtlipidkomponenten in der Emulsionsformulierung in einer Menge vorhanden von etwa 0,001 bis etwa 20%, bezogen auf das Gewicht, mehr zu bevorzugen von etwa 0,01 bis etwa 10%, bezogen auf das Gewicht, und am meisten zu bevorzugen von etwa 0,05 bis etwa 2%, bezogen auf das Gewicht, wobei der Rest der Emulsion, bezogen auf das Gewicht, der wäßrige Träger ist. Daher können zum Beispiel für die Formulierung Nr. 1 in der Tabelle 1, wo 0,625 mg von Gesamtlipidkomponenten in 0,5 ml PBS vorhanden sind, die Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten in der Formulierung Nr. 1 wie folgt berechnet werden: Unter der Annahme, daß 1 ml von PBS, wie 1 ml Wasser in etwa 1000 mg wiegt, dann wiegen 0,5 ml von PBS 500 mg und der Gewichts-Prozentsatz der in der Formulierung Nr. 1 enthaltenen Gesamtlipidkomponenten ist:
Von den in den Emulsionsformulierungen dieser Erfindung vorhandenen Gesamtlipidkomponenten ist bevorzugtermaßen die amphiphile Komponente in einer Menge von etwa 5 bis etwa 80 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten in der Emulsionsformulierung vorhanden, die Ölkomponente ist in einer Menge von etwa 10 bis etwa 80 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten vorhanden, die nichtionische Tensidkomponente ist in einer Menge von etwa 5 bis etwa 50 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten vorhanden und wahlweise ist die neutrale Phospholipidkomponente in der Formulierung in einer Menge von etwa 5 bis etwa 25 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten vorhanden.
Mehr zu bevorzugen ist der Ölbestandteil in einer Menge von etwa 10–60 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten in der Emulsionsformulierung vorhanden, die amphiphile Komponente ist in einer Menge von etwa 20–60 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten vorhanden, die nichtionische Tensidkomponente ist in einer Menge von etwa 10–50 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten vorhanden und wahlweise ist eine neutrale Phospholipidkomponente in einer Menge von etwa 10–40 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten vorhanden.
Am meisten zu bevorzugen umfaßt die Emulsionsformulierung die Ölkomponente in einer Menge von etwa 10–20 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten, die amphiphile Komponente in einer Menge von etwa 40–60 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten, die nichtionische Tensidkomponente in einer Menge von etwa 20–50 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten und wahlweise die neutrale Phospholipidkomponente in einer Menge von etwa 10–20 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten. Eine besonders bevorzugte Emulsionsformulierung enthält ein Öl, ein kationisches Amphiphiles, ein nichtionisches Tensid und ein neutrales Phospholipid in einem Gewichtsverhältnis von etwa 2 : 6 : 1 : 2.
Die micellaren Formulierungen sind mit Blut kompatibel. Die micellaren Formulierungen umfassen einen wäßrigen Träger und die folgenden Lipidkomponenten: eine kationische amphiphile Komponente, eine nichtionische Tensidkomponente und wahlweise eine neutrale Phospholipidkomponente.
Bevorzugtermaßen sind die Gesamtlipidkomponenten in der micellaren Formulierung in einer Menge, die in dem Bereich von etwa 0,0001 bis etwa 70%, bezogen auf das Gewicht, liegt, vorhanden, und mehr zu bevorzugen von etwa 0,001 bis etwa 60%, bezogen auf das Gewicht, und am meisten zu bevorzugen von etwa 0,001 bis etwa 50, bezogen auf das Gewicht, wobei der Rest, bezogen auf das Gewicht der micellaren Formulierung, der wäßrige Träger ist. Daher kann zum Beispiel für die Formulierung Nr. 15 in der Tabelle 2, wo 1,25 mg der Gesamtlipidkomponenten in 1 ml PBS vorhanden sind, der Gewichts-Prozentsatz der Gesamtlipidkomponenten in der Formulierung Nr. 15 wie folgt berechnet werden: Unter der Annahme, daß 1 ml PBS, wie 1 ml Wasser, in etwa 1000 mg wiegt, ist der Gewichtsprozent-Anteil der Gesamtlipidkomponenten in der Formulierung Nr. 15
Von den in den micellaren Formulierungen enthaltenen Gesamtlipidkomponenten ist bevorzugtermaßen die amphiphile Komponente vorhanden in einer Menge von etwa 10 bis etwa 90 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten in der micellaren Formulierung, die nichtionische Tensidkomponente ist vorhanden in einer Menge von etwa 10 bis etwa 90 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten, und wahlweise ist die neutrale Phospholipidkomponente in einer Menge vorhanden von etwa 5 bis etwa 40 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten.
Am meisten zu bevorzugen ist die amphiphile Komponente in einer Menge vorhanden von etwa 30 bis etwa 90 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten in der micellaren Formulierung, die nichtionische Tensidkomponente ist vorhanden in einer Menge von etwa 10 bis etwa 70 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten, und wahlweise ist die neutrale Phospholipidkomponente in einer Menge von etwa 5 bis etwa 30 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten vorhanden.
Mehr zu bevorzugen ist die amphiphile Komponente in einer Menge vorhanden von etwa 50 bis etwa 90 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten in der micellaren Formulierung, die nichtionische Tensidkomponente ist vorhanden in einer Menge von etwa 10 bis etwa 50 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten, und wahlweise ist die neutrale Phospholipidkomponente vorhanden in einer Menge von etwa 10 bis etwa 20 Gewichts-% der Gesamtlipidkomponenten. Eine besonders bevorzugte micellare Formulierung enthält ein kationisches Amphiphiles, ein nichtionisches Tensid und ein neutrales Phospholipid in einem Gewichtsverhältnis von etwa 6 : 1 : 2.
Mit Ölkomponente, wie hierin verwendet, wird jedwede mit Wasser nicht mischbare Komponente gemeint, die in einer konventionellen Weise als ein Öl bezeichnet wird. Es versteht sich, daß die Ölkomponente Mischungen von zwei oder mehr Ölen einschließen kann. Beispiele für Öle, welche verwendet werden können, um die Emulsionsformulierungen der vorliegenden Erfindung herzustellen, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf natürliche Öle, wie Mandelöl, Kokosnußöl, Kabeljau- bzw. Schollenleberöl (cod liver oil), Maisöl, Baumwollsamenöl, Castor bzw. Rizinusöl, Olivenöl, Palmöl, Erdnußöl, Pfefferminzöl, Rosenöl, Distelöl, Sesamöl, Sojabohnenöl, Sonnenblumenöl und pflanzliches Öl und synthetische Öle, wie Triethylglycerol und Diethylglycerol. Ein bevorzugtes Öl ist Rizinusöl.
Die kationische amphiphile Komponente der Formulierungen dieser Erfindung kann jedwedes kationische Amphiphile oder jedwede Mischung von Amphiphilen sein, welches) wirksam ist für die Verwendung in Liposomen oder für die Herstellung von Lipidkomplexen, die in der Lage sind, eine biologisch aktive Substanz Zellen zuzuleiten. Zum Beispiel die Amphiphilen, beschrieben in Bolcsak et al. USP 5 100 662, wären für die Verwendung in dieser Erfindung geeignet. Zusätzliche Beispiele für kationische Amphiphile, geeignet für die Formulierung der Emulsionsformulierungen dieser Erfindung, schließen ein, kationische Lipide wie 1,2-bis(Oleoyloxy)-3-(trimethylammonium)propan (DOTAP), N-[1,-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) oder andere N-(N,N-1-Dialkoxy)-alkyl-N,N,N-trisubsituierte Ammoniumtenside, 1,2-Dioleoyl-3-(4'-trimethylammonium)butanoyl-snglycerol (DOBT) oder Cholesteryl-(4'-trimethylammonium)butanoat (ChOTB); wo die Trimethylammoniumgruppe über einen Butanoylspacerarm mit entweder der Doppelkette verknüpft ist (für DOTB) oder mit der Cholesterylgruppe (für ChOTB), DORI (DL-1, 2-Dioleoyl-3-dimethylaminopropyl-B-hydroxyethylammonium) oder DORIE (DL-1,2-O-Dioleoyl-3-dimethylaminopropyl-β-hydroxyethylammonium) (DORIE) oder Analoga davon, wie offenbart in der WO 93/03 709; 1,2-Dioleoyl-3-succinyl-sn-glycerolcholinester (DOSC), Cholesterylhemisuccinatester (ChOSC); Lipopopolyamine wie Doctadecylamidoglycylspermin (DOGS) und Dipalmitoylphosphatidylethanolamidospermin (DPPES) oder die kationischen Lipide, offenbart in dem USP Nr. 5 283 185, Cholesteryl-3β-Carboxyl-amido-ethylentrimethylammoniumiodid, 1-Dimethylamino-3-trimethylammonium-DL-2-propylcholesterylcarboxylatiodid, Cholesteryl-3β-carboxyamidoethylenamin, Cholesteryl-3β-oxysuccinamido-ethylentrimethylammoniumiodid, 1-Dimethylamino-3-trimethylammonium-DL-2-propyl-cholesteryl-3β-oxysuccinatiodid, 2-[(2-Trimethylammonium)-ethylmethylamino]ethyl-cholesteryl-3β-oxysuccinatiodid, 3β[N-(N',N'-Di methylaminoethan)carbamoyl]cholesterol (DC-Chol), und 3β-[N-(Polyethylenimin)-carbamoyl]cholesterol.
Beispiele für bevorzugte Amphiphile schließen ein Cholesteryl-3β-carboxyamidoethylentrimethylammoniumiodid, 1-Dimethylamino-3-trimethylammonium-DL-2-propyl-cholesterylcarboxylatiodid, Cholesteryl-3β-carboxy-amidoethylenamin, Cholesteryl-3β-oxysuccinamidoethylentrimethylammoniumiodid, 1-Dimethylamino-3-trimethylammonium-DL-2-propyl-cholesteryl-3β-oxysuccinatiodid, 2-[(2-Trimethylammonium)ethylmethylamino]ethylcholesteryl-3β-oxysuccinatiodid, 3β[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)-carbamoyl]-cholesterol (DC-Chol) und 3β[N-(Polyethylenimin)-carbamoyl]cholesterol.
Da eine Eigenschaft der Emulsions- und micellaren Formulierungen der vorliegenden Erfindung ihre Stabilität ist, wenn sie allein oder als Komplexe mit biologisch aktiven Substanzen gelagert werden, wird von normalen Fachleuten verstanden werden, daß bevorzugte kationische Amphiphile kationische Lipide sind, in welchen Bindungen zwischen der lipophilen Gruppe und der Aminogruppe stabil in wäßriger Lösung sind. Solche Bindungen schließen Amidbindungen, Esterbindungen, Etherbindungen und Carbamoylbindungen ein. Ein mehr bevorzugtes kationisches Lipid ist DC-Chol.
Die nichtionische Tensidkomponente der Formulierungen dieser Erfindung schließt mindestens ein nichtionisches Tensid mit einem Molekulargewicht zwischen 200 und 20 000 ein. In einer Ausführungsform können diese Tenside gebildet werden durch das Umsetzen einer hydrophoben hydroxylhaltigen Verbindung (z. B. eines Alkohols oder Phenols) mit einem Ethylenoxid, wo die Anzahl von Ehtylenoxidgruppen in jedwedem gewünschten Ausmaß addiert werden kann. Gewöhnliche Fachleute würden jedoch verstehen, daß die Fähigkeit, die Emulsionen oder Micellen dieser Erfindung zu stabilisieren abhängig sein kann von der relativen Menge an Ethylenoxid, das an eine gegebene hydrophobe Gruppe addiert wird. Es versteht sich weiter, daß Tenside mit verzweigtkettigen Ethylenoxideinheiten mehr Oberflächenbereich abdecken als Tenside mit einzelkettigen Ethylenoxideinheiten und daß daher die einzelkettigen Tenside in größeren Menge verwendet werden müßten als die verzweigtkettigen Tenside, um die Emulsions- und micellaren Formulierungen dieser Erfindung herzustellen.
Beispiele für nichtionische Tenside dieser Erfindung schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Polyethylenglycol, Derivate von Phosphatidylethanolamin und synthetische Tenside, die kommerziell erhältlich sind unter den Markennamen Span,
Bevorzugte Tenside sind verzweigtkettige Tenside wie Tween 20, Tween 40, Tween 60 und Tween 80.
Wenn wahlweise den Emulsions- und den micellaren Formulierungen zugegeben, kann die neutrale Phospholipidkomponente ein einzelnes neutrales Phospholipid oder eine Mischung von neutralen Phospholipiden sein. Beispiele für neutrale Phospholipide, welche wahlweise zu den Formulierungen dieser Erfindung zugegeben werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Phosphatidylcholin (PC) oder Phosphatidylethanolamin (PE) oder vollständig gesättigte oder teilweise hydrogenierte Phosphatidylcholine (PC) oder Phosphatidylethanolamine (PE) mit aliphatischen Ketten zwischen 6 und 24 Atomen Länge wie Dioleoyl-PC (DOPC) und Dioleoyl-PE (DOPE). Ein bevorzugtes neutrales Phospholipid ist DOPE.
Verfahren zur Herstellung der Emulsionsformulierungen der vorliegenden Erfindung werden ebenfalls bereit gestellt.
Ein Verfahren zur Herstellung von Emulsionsformulierungen dieser Erfindung umfaßt:

(a) Das Kombinieren eines organischen Lösemittels mit einer Ölkomponente, einer kationischen amphiphilen Komponente, einer nichtionischen Tensidkomponente und wahlweise einer neutralen Phospholipidkomponente,
(b) Das Entfernen des organischen Lösemittels, um einen Lipidfilm zurück zu lassen, und
(c) Das Suspendieren des Lipidfilms in einem wäßrigen Träger, um die Emulsionsformulierung herzustellen.

Ein alternatives Verfahren zur Herstellung der Emulsionsformulierungen dieser Erfindung umfaßt:

(a) Das Kombinieren einer Ölkomponente, einer kationischen amphiphilen Komponente, einer nichtionischen Tensidkomponente und wahlweise einer neutralen Phospholipidkomponente, und
(b) Das Zugeben eines wäßrigen Trägers zu der Kombination der Komponenten in dem Schritt (a), um die Emulsion herzustellen.

Bevorzugtermaßen sind die durchschnittlichen Durchmesser der Emulsionsformulierungen weniger als etwa 1000 nm, mehr zu bevorzugen weniger als 800 nm und am meisten zu bevorzugen weniger als 500 nm.
Bevorzugte Komponenten der Emulsionen der vorliegenden Erfindung schließen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), als den wäßrigen Träger ein, Rizinusöl als die Ölkomponente, DC-Chol als die amphiphile Komponente, Tween 80 als die nichtionische Tensidkomponente und wahlweise Phosphatidylcholin oder DOPE als die neutrale Phospholipidkomponente.
Ein Verfahren zur Herstellung der micellaren Formulierungen umfaßt:

(a) Das Kombinieren eines organischen Lösemittels mit einer kationischen amphiphilen Komponente, einer nichtionischen Tensidkomponente und wahlweise einer neutralen Phospholipidkomponente,
(b) Das Entfernen des organischen Lösemittels, um einen Lipidfilm zurück zu lassen, und
(c) Das Suspendieren des Lipidfilms in einem wäßrigen Träger, um die micellare Formulierung herzustellen.

Bevorzugtermaßen sind die durchschnittlichen Durchmesser der micellaren Formulierungen weniger als etwa 1000 nm, mehr zu bevorzugen weniger als 800 nm und am meisten zu bevorzugen weniger als 500 nm.
Bevorzugte Komponenten der micellaren Formulierungen schließen phosphatgepufferte Kochsalzlösung als den wäßrigen Träger, DC-Chol als die amphiphile Komponente, Tween 80 als die nichtionische Tensidkomponente und wahlweise PC oder DOPE als die neutrale Phospholipidkomponente ein.
Wenn ein organisches Lösemitteln in den vorausstehenden Verfahren verwendet wird, um die micellaren und Emulsionsformulierungen herzustellen, ist jedwedes organische Lösemittel welches keinen toxischen Rest, folgend auf die Entfernung zurückläßt, und welches die Lipidkomponenten der Emulsions- und micellaren Formulierungen solubilisiert, für die Verwendung geeignet. Beispiele für geeignete Lösemittel schließen niedere Alkohole ein, Dimethoxyethan, Dioxan, Tetrahydrofuran, Tetrahydropyran, Diethylether, Aceton, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamide (DMF) und halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Chloroform, Acetonitril oder Mischungen davon. Ein bevorzugtes organisches Lösemittel ist Chloroform.
Das organische Lösemittel kann entfernt werden durch das Trocknen der Kombination von Schritt (a) unter einem geeigneten Gas wie Argon oder Stickstoff und/oder unter einem Vakuum. Der getrocknete Film kann dann lyophilisiert und bei etwa –80 bis 37°C gelagert werden oder kann in einem geeigneten wäßrigen Träger resuspendiert werden. Wäßrige Träger, die zur Verwendung in dieser Erfindung geeignet sind, sind nicht toxisch für Zellen und können gepuffert sein oder nicht. Wenn diese Träger gepuffert sind, schließen geeignete Puffer solche Puffer ein wie Citrat, Carbonat, Bicarbonat, Acetat, Tris, Glycinat und Maleat. Wäßrige Träger, welche in den Formulierungen dieser Erfindung verwendet werden können schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf destilliertes Wasser, normale Kochsalzlösung und phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Man muß verstehen, daß ein bevorzugter pH-Bereich für die Emulsions- und die micellaren Formulierungen ein pH-Bereich ist, in welchem die bestimmte kationische amphiphile Komponente, die in einer Formulierung vorhanden ist, positiv geladen ist. Gewöhnliche Fachleute wären leicht in der Lage, einen solchen pH-Bereich aus dem pKa der kationischen amphiphilen Komponente, welche in einer bestimmten Formulierung vorhanden ist, zu bestimmen.
Es versteht sich weiter, daß der wäßrige Träger, in welchem der Lipidfilm suspendiert wird, Inhaltsstoffe einschließen kann wie Stabilisatoren, Antibiotika und Fungizide und antimykotische Mittel.
Wenn einmal gebildet, können die micellaren und Emulsionsformulierungen mit einer Nukleinsäure gemischt werden, um Komplexe herzustellen, welche lagerungsstabil sind, wie widergespiegelt durch eine Beibehaltung der Aktivität der Nukleinsäure über die Zeit oder durch die Beibehaltung des Durchmessers der Emulsions- oder der micellaren Formulierung über die Zeit.
In einer Ausführungsform kann die Fähigkeit einer Emulsionsformulierung dieser Erfindung eine Nukleinsäure zu einer Zelle zuzuleiten getestet werden durch das Aussetzen von Zellen gegenüber den Komplexen, welche zwischen einer Emulsions- oder micellaren Formulierung und einem Plasmidkonstrukt, welches ein Reportergen als die Nukleinsäure enthält, gebildet werden. Solche Reportergene sind den gewöhnlichen Fachleuten bekannt und schließen das Chloramphenicolacetyltransferasegen, das Luciferasegen, das β-Galaktosidasegen und das Gen für den humanen Wachstumsfaktor ein.
Mit „biologisch aktiver Substanz", wie durchweg in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, meint man ein Molekül, eine Verbindung oder eine Zusammensetzung, welche, wenn sie in einer wirksamen Menge vorhanden ist, mit lebenden Zellen und Organismen reagiert und/oder einen Einfluß auf sie hat. Man muß verstehen, daß in Abhängigkeit von der Natur der aktiven Substanz, die aktive Substanz entweder auf der Zelloberfläche aktiv sein kann oder ihre Aktivität, wie bei DNS oder RNS ausüben kann, nachdem sie in die Zelle eingeführt wurde.
Beispiele für biologisch aktive Substanzen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Nukleinsäuren wie DNS, cDNS, RNS (Vollängen-mRNS, Ribozyme, Antisense-RNS, Lockvögel bzw. Abfänger (decoys)), Oligodesoxinukleotide (Phosphodiester, Phosphothioate, Phosphoramidite, und alle andere chemischen Modifikationen), Oligonukleotide (Phosphodiester etc.) oder lineare und geschlossen zirkuläre Plasmid-DNS; Kohlenhydrate, Proteine und Peptide einschließlich von rekombinanten Proteinen wie zum Beispiel Zytokinen (z. B. Interleukine) trophische und Wachstums- oder Reifungsfaktoren (z. B. NGF, G-CSF, GM-CSF), Enzyme, Vaccine (z. B. HBsAg, gp120); Vitamine, Prostaglandine, Arzneistoffe wie lokale Anästhetika (z. B. Procain), Mittel gegen Malaria (z. B. Chloroquin), Verbindungen, welche die Blut-Hirn-Schranke passieren müssen, wie Mittel gegen Parkinson (z. B. leva-DOPA), Antagonisten von adrenergen Rezeptoren (z. B. Propanolol), antineoplastische Mittel (z. B. Doxorubicin), Antihistamine, biogene Amine (z. B. Dopamin), Antidepressiva (z. B. Desipramin), Anticholinergika (z. B. Atropin), Antiarrhythmika (z. B. Quinidin), Antiemetika (z. B. Chloroprimamin) und Analgesika (z. B. Codein, Morphin) oder Arzneimittel mit einem niedrigem Molekulargewicht wie Cisplatin, welches die Transfektionsaktivität verstärkt oder die Lebensdauer von der DNS innerhalb oder außerhalb der Zellen verlängert.
Wenn die biologisch aktive Substanz ein antigenes Protein oder Peptid ist, können die Komplexe, welche durch die Emulsions- oder micellaren Formulierungen gebildet werden, als Vakzine verwendet werden. In dieser Ausführungsform kann das Vorhandensein von Öl in der Emulsionsformulierung einen Adjuvanseffekt des Komplexes verstärken.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäuren Nukleinsäuren, welche für ein Gen oder ein Genfragment kodieren oder welche eine Transkription und/oder eine Translation bewirken.
Die Komplexe der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um eine Nukleinsäure zu Zellen in vitro oder in vivo zuzuleiten.
Man glaubt, daß das kationische Amphiphile an die negativ geladene Nukleinsäure bindet. Bevorzugtermaßen haben die Nukleinsäure : Emulsion-Komplexe dieser Erfindung, die in vitro oder in vivo verwendet werden sollen, ein Gewichtsverhältnis von Nukleinsäure : Gesamtlipidkomponenten in der Emulsion von etwa 1 : 1 bis zu etwa 1 : 50, mehr zu bevorzugen ein Gewichtsverhältnis von Nukleinsäure : Gesamtlipidkomponenten in der Emulsion von etwa 1 : 1 bis zu etwa 1 : 30 und am meisten zu bevorzugen ein Gewichtsverhältnis von Nukleinsäure : Gesamtlipidkomponenten in der Emulsion von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 20. So war zum Beispiel in dem Beispiel 11, wo ein DNS : Emulsion-Komplex gebildet wurde durch das Kombinieren von 100 μg DNS mit einem Volumen der Emulsionsformulierung Nr. 21, welche 1100 μg Gesamtlipidkomponenten enthielt, das Gewichtsverhältnis von DNS : Gesamtlipidkomponenten der Emulsion 21 in dem Komplex 100 μg/1100 μg oder 1 : 11.
Bevorzugtermaßen haben die Nukleinsäure : Micellen-Komplexe, die in vitro oder in vivo verwendet werden sollen, ein Gewichtsverhältnis von Nukleinsäure : Gesamtlipidkomponenten in der Micelle von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 50, mehr zu bevorzugen ein Gewichtsverhältnis von Nukleinsäure: Gesamtlipidkomponenten in der Micelle von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 30 und am meisten zu bevorzugen ein Gewichtsverhältnis von Nukleinsäure: Gesamtlipidkomponenten in der Micelle von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 20. Daher war zum Beispiel in dem Beispiel 11, in dem ein DNS : Micellen-Komplex gebildet wurde durch das Kombinieren von 100 μg DNS mit einem Volumen der micellaren Formulierung Nr. 31, welche 700 μg Gesamtlipidkomponenten enthielt, das Gewichtsverhältnis von DNS : Gesamtlipidkomponenten der Micelle Nr. 31 in dem Komplex 100 μg/700 μg oder 1 : 7.
Man muß verstehen, daß das Kombinieren der Emulsions- oder micellaren Formulierungen mit einer Nukleinsäure, um die Nukleinsäure : Emulsion- oder Nukleinsäure : micellaren Komplexe zu bilden, mindestens während 5 min. in Gegenwart oder in Abwesenheit von Serum bei einer Temperatur von etwa 4°C bis etwa 37°C durchgeführt werden kann. Die resultierenden Nukleinsäure : Emulsion- und Nukleinsäure : Micellen-Komplexe können dann sofort in vitro oder in vivo verwendet werden oder können vor der Verwendung gelagert werden.
Bevorzugtermaßen sind durchschnittliche Durchmesser von Nukleinsäure : Emulsion- oder Nukleinsäure : Micellen-Komplexen, die in vitro oder in vivo verwendet werden sollen, 100 bis 4000 nm, mehr zu bevorzugen 100 bis 2000 nm und am meisten zu bevorzugen, 100 bis 1000 nm.
In einer Ausführungsform können die Nukleinsäure: Emulsion-Komplexe dieser Erfindung verwendet werden, um Zellen mit Nukleinsäure zu transfizieren. Geeignete Zellen für eine Transfektion in vitro schließen eukaryotische Zellen ein, einschließlich aller Säugetierzelllinien, die geeignet für eine Transfektion mit kationischen Lipiden sind, Zellen, welche von einem Wirt in Primärkultur genommen wurden, oder Zellen, welche aus einer Passage der primären Kultur resultieren.
Wenn zum Beispiel 10⁵ Zellen in vitro transfiziert werden, wird eine Transfektion ausgeführt durch das Aussetzen der Zellen bevorzugtermaßen gegenüber von etwa 0,1 bis etwa 5 μg Nukleinsäure : Emulsion-Komplex, mehr zu bevorzugen gegenüber von etwa 0,5 bis etwa 2 μg von Nukleinsäure : Emulsion-Komplex.
Wenn 10⁵ Zellen mit Nukleinsäure : Micellen-Komplex transfiziert werden sollen, wird eine Transfektion ausgeführt durch das Aussetzen der Zellen bevorzugtermaßen gegenüber von etwa 0,1 bis etwa 20 μg von Nukleinsäure : Micellen-Komplex, mehr zu bevorzugen gegenüber von etwa 1 bis etwa 10 μg von Nukleinsäure : Micellen-Komplex.
Wie hierin verwendet, bezieht sich μg von Nukleinsäure : Emulsion-Komplex oder μg von Nukleinsäure : Micellen-Komplex auf die Summe der Mengen an μg von Nukleinsäure und der Menge μg der Gesamtlipidkomponenten in der Emulsion- oder micellaren Formulierung, welche in dem Komplex enthalten ist. Es können zum Beispiel 5 μg von dem Nukleinsäure : Emulsion-Komplex 0,5 μg von der Nukleinsäure und 4,5 μg von den Gesamtlipidkomponenten der Emulsionsformulierung enthalten.
Gewöhnliche Fachleute würden leicht verstehen, daß die Gesamtmenge von dem Nukleinsäure : Emulsion- oder dem Nukleinsäure : Micellen-Komplex, die verwendet werden soll, in einer direkten Weise mit der Anzahl der Zellen, welche transfiziert werden sollen variiert. Ein Vorteil der Emulsion- und micellaren Formulierungen gegenüber kationischen Lipidvektoren nach dem Stand der Technik ist, daß die Emulsionen und Micellen der Erfindung, wenn sie mit der Nukleinsäure komplexiert werden, effektiver für ein Transfizieren von Zellen sind, welche in serumhaltigem Medium kultiviert werden.
Die Nukleinsäure : Emulsion- und Nukleinsäure : Micellen-Komplexe können verwendet werden, um Nukleinsäuren zu Zellen in einem Tier oder in einem Menschen in vivo zuzuleiten. Daher können die Nukleinsäure : Emulsion- oder Nukleinsäure : Micellen-Komplexe verwendet werden als Zuleitungssysteme in der Gentherapie.
Geeignete Wege der Verabreichung von Nukleinsäure enthaltenden Komplexen dieser Erfindung an ein Tier oder einen Menschen schließen die Inokulierung oder die Injektion durch zum Beispiel intravenöse, orale, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, intra aurale, intraartikuläre oder intramammäre Wege, lokale Applikation, zum Beispiel auf der Haut, der Kopfhaut, den Ohren oder den Augen oder durch die Absorption über Epithel- oder Schleimhäute, zum Beispiel nasale, orale, vaginale, rektale und gastrointestinale unter anderen, und als ein Aerosol. Gewöhnliche Fachleute würden leicht verstehen, daß die Art der Verabreichung diejenige Stelle in dem Organismus bestimmen kann, zu welcher die biologisch aktive Substanz zugeliefert werden wird, und einen Einfluß auf die Menge des Komplexes, der verabreicht werden soll, haben kann.
Da, wie in dem Beispiel 11 gezeigt, die Verabreichung von etwa 4 μg von dem Nukleinsäure : Emulsion- oder dem Nukleinsäure : Micellen-Komplex /g Körpergewicht an eine Maus von 25 g eine Transfektionsaktivität in vivo hergestellt hat, könnten gewöhnliche Fachleute unter Verwendung dieses Verhältnisses von 4 μg eines Komplexes pro Gramm des Körpergewichtes der Maus andere Verhältnisse von μg von Komplex/Gramm Körpergewicht erhalten, welche für eine Transfektionsaktivität in anderen Tieren oder im Menschen optimiert sind.
In einer alternativen Ausführungsform können die Emulsion- und die micellaren Formulierungen selbst an Biomakromoleküle binden (d. h. Moleküle welche von dem Tier oder dem Menschen hergestellt werden) in situ nach systemischen oder lokalen Verabreichungen und sich als ein lokales Depot für endogene bioaktive Substanzen verhalten.
Die folgenden Beispiele erläutern verschiedenartige Aspekte der Erfindung.
Beispiele
Material und Methoden
Materialien:
DC-Chol kationisches Lipid wurde synthetisiert gemäß Gao und Huang (Biochem. Biophys. Res. Commun., 179: 280–285, 1991). Tween 80 und Rizinusöl wurden erhalten von Fisher, Pluronic Copolymer L63 wurde erhalten von BASF. Brij, Span und die Pluronic Tenside F68 und F127 wurden erworben von Sigma. Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und Ei-Phosphatidylcholin (PC) wurden erhalten von Avanti Polar Lipids. LipofektAMIN Liposomen (DOSPA (2, 3-Dioleyloxy-N-[2(spermin-carboxamido)ethyl]-N,N,-dimethyl-1-propanaminium) und DOPE) in einem Gewichtsverhältnis von 3 : 1) wurden erhalten von Life Technologies, Inc.
Herstellung der Emulsionen und Micellen
Tween 80, verdünnt in Chloroform wurde kombiniert mit DC-Chol (Micellen) und, wo angegeben, DOPE oder Phosphatidylcholin; oder mit Rizinusöl, DC-Chol und, wo angegeben, DOPE oder Phosphatidylcholin (Emulsionen) in unterschiedlichen Gewichtsverhältnissen. Das organische Lösemittel wurde dann unter einem Strom von Stickstoffgas verdampft und der Lipidfilm wurde vakuumgetrocknet bei 4°C über Nacht, um restliches organisches Lösemittel zu entfernen. Ein ml von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) wurde dann zugegeben und man ließ die Mischung eine Stunde lang hydratisieren. Die Lipidsuspension wurde dann mit einem Vortexmischer gemischt und anschließend 3 bis 4 min. unter Verwendung eines Gewebezerkleinerers (tissue tearer) bei einer Geschwindigkeit von etwa 20 000 U/min homogenisiert. Die durchschnittlichen Durchmesser der Emulsion- oder Micellenformulierungen und der DNS: Emulsion- oder DNS : Micellen-Komplexe wurden gemessen durch Laserlichtstreuung unter Verwendung eines Coulter N4SD Submikron Teilchengrößen-Messgeräts.
Herstellung von DC-Chol/DOPE-Liposomen:
Unilamellare kleine Liposomen von etwa 100 nm Durchmesser wurden hergestellt durch Mikrofluidisierung einer hydratisierten Mischung von DC-Chol und DOPE (Gewichtsverhältnis von 1 : 1) und sterilfiltriert. Die Lipidendkonzentration der DC-Chol/DOPE-Liposomen, die in den Transfektionsexperimenten verwendet wurden, war 1,2 μg/μl PBS.
Gewebekultur:
Maus-Melanom BL6-Zellen wurden kultiviert in RPMI-Medium, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum. Embryonale 293-Human-Nierenzellen und F₀ wurden kultiviert in DMEM-Medium, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum. CHO Zellen wurden kultiviert in F12-Medium, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum.
Plasmid-DNS:
Ein pCDNS₃-Plasmid, pCMV-Luc, welches das Luciferasegen unter der Kontrolle des sofortfrühen Promotors des Cytomegalievirus (CMV) früher Sofort-Promotor (immediate early promoter) enthielt, wurde verwendet, um die Transfektionseffizienz zu bewerten. Ein ähnliches Plasmid, pRSV-Luc, welches das selbe Luciferasegen unter der Kontrolle eines Promotors des Rous Sarkom Virus enthielt wurde ebenfalls verwendet, um die Transfektionseffizienz zu bewerten. Das Plasmid pCMV-CAT ist ein auf pUC18 basierendes Plasmid, welches das Chloramphenicolacetyltransferase- (CAT) Gen von E. coli stromabwärts von dem CMV-Promoter enthält. Die Präparation und die Reinigung der Plasmid-DNS wurde durchgeführt gemäß Standardverfahren (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Lab Press: Plainview, 1: S. 21–52, 1989).
Transfektion:
In 48-Vertiefungs-Platten bzw. Platten mit 48 Vertiefungen kultivierte Zellen (etwa zu 70– 80% konfluent) wurden für die Transfektion verwendet und drei Vertiefungen wurden mit einer jeden Formulierung transfiziert. Die pCMV-Luc- oder pRSV-Luc-Plasmid-DNS wurden verdünnt in 125 μl serumfreiem CHO-S-SFM-Medium (Life Technologies, Inc.). Die Emulsionen, die Micellen, die DC-Chol/DOPE Liposomen oder LipofektAMINE-Liposomen wurden verdünnt in 125 μl von Hank's balancierter Salzlösung (HBSS). Die verdünnte DNS und die Formulierungen oder Liposomen wurden kombiniert, mit oder ohne Zugabe von fötalem Rinderserum auf 20%, und bei Raumtemperatur während 5 bis 10 min inkubiert, bevor sie zu den Zellen hinzu gegeben wurden. Die Zellen wurden bei 37°C 5 Stunden lang inkubiert. Das Transfektionsmedium wurde durch Wachstumsmedium, welches 10 % fötales Rinderserum enthielt, ersetzt, und die Zellen wurden dann 2 Tage lang kultiviert, bevor der Luciferaseassay durchgeführt wurde.
Luciferaseassay
Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und bei Raumtemperatur in der Gegenwart von 100 μl Lysepuffer (0,1 M Tris-HCl, pH 7,8/0,05 % Triton X-100/2 mM EDTA) 10 min inkubiert und dann bei 12 000 × g zentrifugiert. 10 μl des Überstandes wurden für den Luciferaseassay unter Verwendung des Luciferaseassaysystems (Promega) in einem Luminometer (Autolumat LB 953 von EG & G, Berthhold) genommen. Die Luciferaseaktivität ist angegeben in relativen Lichteinheiten (RLU).
Tierstudien:
Weibliche CD 1 Mäuse, 5 Wochen alt, wurden erworben von Charles River Breeding Laboratories. Die Tierpflege war gemäß den institutionellen Richtlinien. 200 μl von jedem von 4 × Konzentraten (zum Beispiel das 4 × Konzentrat der Formulierung Nr. 21 enthielt 1,0 mg Öl, 1,0 mg PC, 0,5 mg Tween 80 und 3,0 mg DC-Chol pro ml PBS) der Formulierungen Nr. 21 (1100 μg Gesamtlipidkomponenten), Nr. 28 (1100 μg Gesamtlipidkomponenten), Nr. 34 (900 μg Gesamtlipidkomponenten) und Nr. 31 (700 μg Gesamtlipidkomponenten) (600 μg DC-Chol pro Formulierung) wurden gemischt mit 5 M NaCl zu einer Endkonzentration von NaCl von 0,15 M und dann kombiniert mit 25 μl von 4 μg/μl pCMV-CAT-DNS (100 μg). Die Gesamtmischung (231 μl) wurde in Mäuse über die Schwanzvene injiziert. Zwei Tage später wurden die Mäuse getötet, und die Leber, die Milz, die Niere, die Lunge und das Herz wurden für den CAT-Assay herausgeschnitten.
Chloramphenicolacetyltransferase- (CAT) Assay
Die aus den Tieren herausgeschnittenen Organe wurden in 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl homogenisiert. Nach der Homogenisierung wurden die Zellen durch drei Einfrier-Auftau-Zyklen lysiert, und die Lysate wurden bei 65°C 10 min lang erhitzt, um Deacetylasen zu inaktivieren und 10 min lang zentrifugiert. Die Proteinkonzentration der Überstandextrakte wurde mit einem Coomassie blue G 250-Assay (Pierce) gemessen. Das Protein wurde von jedem Organ extrahiert, und 200 μg des Extraktes wurden dann auf die CAT-Aktivität hin getestet unter Verwendung von [¹⁴C]-Chloramphenicol als ein Substrat, wie zuvor beschrieben (Ausubel F. M., Breht, R., Kingstone, R. E. et al., Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, Boston), Bnd. 1, S. 962–965, 1991).
Beispiel 1
Physikalische Stabilität der Emulsionsformulierungen und Transfektionsfähigkeit von DNS : Emulsion-Komplexen
Um zu testen, welche Komponenten der Emulsionsformulierungen wichtig für die physikalische Stabilität und die Transfektionsfähigkeit sind, wurden 9 verschiedene Emulsionsformulierungen, welche verschiedene Mengen von Rizinusöl, Ei-Phosphatidylcholin (PC), Tween 80 und DC-Chol enthielten, formuliert. Der durchschnittliche Durchmesser der Formulierungen wurde gemessen, sowie ihre Fähigkeit, 293-Zellen zu transfizieren, durch das Kombinieren von 6 μl einer jeden Emulsion (7,5 μg Gesamtlipidkomponenten) mit 0,5 μg RSV-Luc. Die resultierenden Daten sind präsentiert in der Tabelle 1.
Tabelle 1 Transfektionsaktivität von DNS : Emulsion-Komplexen, gebildet durch das Kombinieren von DNS mit verschiedenen Emulsionsformulierungen
Die Daten zeigen, dass die Emulsionen physikalisch stabil sind, bei denen die Größe des mittleren Durchmessers im Bereich von 150 bis 218 nm, wie mittels Laserlichtstreuung gemessen, liegt. Darüber hinaus zeigten Komplexe von DNA mit jenen Emulsionen mit hohem Gehalt an DC-Chol (0,750 mg), der einzigen kationischen Komponente in der Emulsion, hohe Transfektionsaktivität, vergleichbar mit derjenigen der kationischen DC-Chol/DOPE- und LipofektAMIN-Liposomen.
Beispiel 2 (nicht von der beanspruchten Erfindung) Transfektionsaktivität von DNS : Emulsion- und DNS : Micellen-Komplexen
Emulsion- und micellare Formulierungen, welche einen hohen Gehalt des kationischen Amphiphilen DC-Chol (0,75 mg oder mehr) enthielten wurden komplexiert mit pRSV-Luc-DNS und auf die Transfektionsaktivität hin in BL6- und 293-Zellen untersucht. Die in der Tabelle 2 gezeigten Daten zeigen, daß Komplexe von DNS mit den Emulsion- und den zwei micellaren Formulierungen (Nr. 15 und Nr. 19) aktiv waren. Der Komplex jedoch, der durch das Kombinieren von DNS mit der Formulierung Nr. 18, welcher Stearylamin anstelle von DC-Chol enthielt, gebildet wurde, zeigte eine niedrige Transfektionsaktivität, welche auf die Toxizität von Stearylamin für Zellen zurückzuführen sein kann, wie durch die Tatsache bewiesen, daß die Menge an extrahierbarem Protein aus den Vertiefungen, welche mit dem Komplex, welcher die Formulierung Nr. 18 enthielt, transfiziert worden waren, geringer war als die Menge an extrahierbarem Protein aus den Vertiefungen, welche mit den Komplexen, welche alle anderen Formulierungen enthielten, transfiziert worden waren (siehe Tabelle 2, Fußnote b). Von Interesse, die Aktivitäten von einem micellaren (Nr. 19) und einem Emulsion- (Nr. 14) DNS-Komplex waren hoch und in der Tat aktiver als die kationische Liposomformulierung (DC-Chol/DOPE) in beiden Zelllinien.
Tabelle 2 Transfektionsaktivität von DNS :Emulsion- und DNS : Micellen-Komplexen [Zusammensetzungen, die mit einem * markiert sind, liegen nicht innerhalb des Umfangs der Erfindung]
Beispiel 3
Die Transfektionsaktivität von mehr DNS: Emulsion- und DNS: Micellen-Komplexen
Der physikalische Durchmesser zusätzlicher Emulsion- und micellaren Formulierungen wurde gemessen sowie die Transfektionsaktivität von Komplexen, welche zwischen DNS und diesen Formulierungen gebildet wurden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3 Transfektionsaktivität von weiteren DNS : Emulsion- und DNS : Micellen-Komplexen [Zusammensetzungen, die mit einem * markiert sind, liegen nicht innerhalb des Umfangs der Erfindung]
Die Ergebnisse zeigen, daß Komplexe von DNS und Micellen, welche DC-Chol und Tween 80 enthalten (Nr. 30 und Nr. 31) wiederum ziemlich aktiv waren, und das Ersetzen von Tween 80 durch Pluronic L63 (Nr. 32 und Nr. 33) veränderte nicht in einer signifikanten Weise die durchschnittlichen Durchmesser der Formulierungen oder ihre Transfektionsaktivität in 293-Zellen. Eine andere Micelle, welche DC-Chol, Tween 80 und PC (Phosphatidylcholin) (Nr. 26) enthielt war ebenfalls aktiv. Die verbleibenden Formulierungen (Nr. 22–25, 27–29) waren Emulsionen, welche Rizinusöl enthielten. Komplexe von DNS und diesen Emulsionsformulierungen waren ziemlich aktiv bei der Transfektion. Wenn Komplexe von DNS und diesen micellaren und Emulsionsformulierungen in einer anderen Zelllinie getestet wurden (BL6-Mausmelanom-Zellen), wurden quantitativ ähnliche Ergebnisse erhalten außer daß die Aktivität in dieser Zelllinie generell niedriger war als diejenige der 293-Zellen. Die Transfektionsaktivitäten von Komplexen von DNS und diesen Emulsionen und Micellen waren vergleichbar mit denjenigen der kationischen Liposomformulierung (DC-Chol/DOPE) in 293-Zellen, aber etwas niedriger in BL6-Zellen.
Beispiel 4
Optimierung der Transfektionsbedingungen
Um die Transfektionsaktivität der DNS : Emulsion- und DNS : Micellen-Komplexe zu optimieren, wurde die Menge von DC-Chol in einer jeden Emulsion- oder Micellenformulierung konstant bei 4,5 μg gehalten (6 μl der Formulierungen Nr. 21, 27, 28 bzw. 30 wurden verwendet, bezug nehmend auf Tabelle 3 für die Zusammensetzungen der Formulierungen) und die Menge von pCMV-Luc-DNS wurde variiert von 0 bis 5 μg. Wie in der 1 gezeigt, zeigten Komplexe von DNS und den Formulierungen Nr. 27 und Nr. 30 (bezug nehmend auf die Tabelle 3 für die Zusammensetzungen) eine maximale Transfektionsaktivität in BL6-Zellen bei 2 μg DNS, während die Komplexe von DNS und den Formulierungen Nr. 21 und 28 eine maximale Aktivität bei 1,5 μg DNS zeigten.
Als nächstes wurde die Menge von pCMV-Luc-DNS bei 2 μg für die Formulierungen Nr. 27 und 30 und bei 1,5 μg für die Formulierungen Nr. 21 und 28 fixiert, und Komplexe von DNS und variierenden Mengen von Emulsion- oder Micellenformulierung, wie angegeben auf der horizontalen Achse der 2 (wo μg Formulierung auf der horizontalen Achse sich auf μg Gesamtlipidkomponenten bezieht, welche in dem Volumen der Formulierung, kombiniert mit pCMV-Luc-DNS, um einen Komplex zu bilden, vorhanden waren) wurden hergestellt. Die in der 2 präsentierten Ergebnisse zeigen, daß Komplexe von DNS und den Formulierungen Nr. 27, 28 und 30 einen relativ breiten Gipfel der Aktivität in BL6-Zellen aufwiesen, wobei die optimale Menge der Gesamtlipidkomponenten, welche in dem Volumen der Formulierung vorhanden war, welches mit DNS kombiniert wurde, um Komplex herzustellen, etwa 18 μg war. Die Komplexe von DNS und der Formulierung Nr. 21 wiesen jedoch einen schmaleren Gipfel der Aktivität auf, wobei die optimale Menge an Gesamtlipidkomponenten, welche in dem Volumen der Formulierung vorhanden waren, das mit DNS kombiniert wurde, um Komplex herzustellen, etwa 13 μg war.
Beispiel 5
Sensitivität der Transfektionsaktivität von DNS : Emulsion- und DNS : Micellen-Komplexen gegenüber Serum
Alle vorausstehend beschriebenen Transfektionsexperimente wurden in einem serumfreien Medium durchgeführt. Daher wurden, um die Sensitivität der Transfektionsaktivität von DNS/Emulsion- und DNS/Micellen-Komplexen gegenüber dem Vorhandensein von Serum zu bestimmen BL6-Zellen in dem Medium, welches 0 oder 20% fötales Rinderserum enthielt, mit Komplexen von DNS und 10 verschiedenen Emulsionen oder Micellen (oder DC-Chol/DOPE Liposomen) wie folgt transfiziert.
Die verschiedenen Formulierungen der Zusammensetzungen, die in der Tabelle 4 gezeigt sind, wurden hergestellt in einem Gesamtvolumen von 1 ml PBS (pH 7,4). BL6-Zellen in einer 48-Vertiefungs-Platte wurden dann mit 2 μg von pCMV-Luc und 16 μl einer jeden Formulierung (welche 12 μg DC-Chol enthielt) oder mit 2 μg pCMV-Luc und 16 μl von DC-Chol/DOPE-Liposomen (1,2 μg/μl) transfiziert in Medium, welches entweder 0 oder 20% fötales Rinderserum enthielt und die Luciferaseaktivität wurde nachgewiesen. Jede Vertiefung enthielt etwa 70 bis 80 μg extrahierbares Protein. Die in der Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß die Transfektionsaktivität von DC-Chol/DOPE-Liposomen gegenüber Serum ziemlich sensitiv war (nur etwa 33% der Aktivität verblieb in Gegenwart von Serum) während von den 10 getesteten Formulierungen nur der Komplex von DNS und der Formulierung Nr. 37 eine Serumsensitivität zeigte, wo Serumsensitivität eine Verminderung bei der Transfektionsaktivität in Gegenwart von Serum relativ zu dem Aktivitätsniveau ist, welches in der Abwesenheit von Serum beobachtet wird. Zusätzlich zeigte die Tatsache, daß der Komplex von DNS und der Formulierung Nr. 39 keine Aktivität in Gegenwart oder Abwesenheit von Serum zeigte, daß das Vorhandensein eines kationischen Amphiphilen kritisch für die Transfektionsaktivität ist. Insbesondere interessant sind die Komplexe von DNS und den Formulierungen Nr. 35, Nr. 36 und Nr. 40 (in den Zusammensetzungen den Formulierungen Nr. 21, Nr. 34 bzw. Nr. 28 in der Tabelle Nr. 3 entsprechend), welche von den getesteten Formulierungen die größte Verstärkung der Transfektionsaktivität in Gegenwart von Serum aufwiesen.
Tabelle 4 Transfektionsaktivität zusätzlicher DNS : Emulsion- und DNS : Micellen-Komplexe [Zusammensetzungen, die mit einem * markiert sind, liegen nicht innerhalb des Umfangs der Erfindung]
Beispiel 6
Sensitivität der Transfektionsaktivität von Komplexen von DNS und ausgewählten Formulierungen gegenüber Serum im verschiedenen Zelllinien
Um zu bestimmen, ob die in BL6-Zellen in der Tabelle 4 beobachtete Sensitivität in anderen Zelllinien beobachtet wurde, wurden F₀ Zellen, CHO Zellen und 293-Zellen mit 16 μl ausgewählter Formulierungen (wobei jede 12 μg DC-Chol/16 μl enthielt) aus der Tabelle 4 kombiniert mit 2 μg pCMV-Luc-DNS oder mit 16 μl DC-Chol/DOPE-Liposomen (1,2 μg/μl) kombiniert mit 2 μg von pCMV-Luc-DNS in Medium, welches 0 oder 20% Serum wie in dem Beispiel 5 enthielt, transfiziert. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der Tabelle 5 gezeigt. Die Daten zeigen, daß Komplexe von DNS und allen Formulierungen wirksam bei der Transfektion von Zellen sind und im allgemeinen serumresistent sind.
Tabelle 5 Transfektionsaktivität von Komplexen von DNS und ausgewählten Formulierungen in verschiedenen Zelllinien
Beispiel 7
Stabilität von DNS : Emulsion- und DNS : Micellen-Komplexen
Fünf verschiedene Formulierungen Nr. 26, 27, 28, 29 und 34 von der Tabelle 3) wurden auf die Stabilität ihres Komplexes mit DNS getestet. Der Komplex wurde hergestellt durch das Kombinieren von 2 μg pCMV-CAT-DNS und 16 μl der angegebenen Emulsion- oder Micellenformulierung (wo 16 μl einer jeden Formulierung dieselbe Menge von DC-Chol, 12 μg enthielten) oder durch das Kombinieren von 1 μg pCMV-CAT-DNS und 6 μg von DC-Chol/DOPE-Liposomen. Wie in der 3 gesehen werden kann, bildeten die Formulierungen Nr. 26, Nr. 28 und Nr. 29 relativ kleine Komplexe mit der DNS. Der durchschnittliche Durchmesser des Komplexes, wie gemessen durch Laserlichtstreuung, lag in dem Bereich von 200 bis 300 nm und verblieb klein selbst nach 10 Tagen bei 4°C. Die Formulierungen Nr. 34 und Nr. 27 andererseits bildeten größere Komplexe mit der DNS mit durchschnittlichen Durchmessern von 600 bzw. 900 nm. Im Gegensatz dazu hatten die DC-Chol/DOPE-Liposomen große Aggregate gebildet (1800 nm an Tag 1), welche zu noch größeren heranwuchsen (> 4000 nm) an Tag 3 und anschließend aus der Lösung präzipitierten (Daten nicht gezeigt). Daher konnten alle neuen Formulierungen Komplexe mit DNS bilden, welche eine bessere physikalische Stabilität hatten als diejenige von Komplexen, die von den DC-Chol/DOPE-Liposomen gebildet wurden.
Beispiel 8
Wirkung verschiedener Tenside auf die Transfektionsaktivität von Komplexen von DNS und Emulsionen, zusammengesetzt aus Öl/DOPE/DC-Chol/Tensid in einem Gewichtsverhältnis von 2 : 2 : 6 : x
Emulsionen, welche verschiedene Tenside enthielten, wurden hergestellt in 1 ml PBS, welches 0,25 mg Öl, 0,25 mg DOPE, 0,75 mg DC-Chol und verschiedene Mengen der angegebenen Tenside enthielt, wo die Gesamtmenge an verwendetem Tensid in einer jeden Formulierung in etwa dieselbe, bezogen auf Mol war. BL6 Zellen wurden dann transfiziert mit 2 μg pCMV-Luc-DNS, kombiniert mit 16 μl der Formulierung (12 μg DC-Chol/16 μl in jeder Formulierung) und auf die Luciferaseaktivität hin getestet. Die Ergebnisse dieses Experimentes sind in der Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6 Wirkung verschiedener Tenside auf die Transfektionsaktivität von Komplexen von DNS und Emulsionen, zusammengesetzt aus Öl/DOPE/DC-Chol/Tensid (0,25 mg : 0,25 mg : 0,75 mg : X mg pro ml PBS)
Von den getesteten Tensiden zeigten die von den Emulsionen, welche Tween 20, Tween 40, Tween 60, Brij 72, Brij 74, F68 oder F127 enthielten, gebildeten Komplexe eine Transfektionsaktivität, die nicht gegenüber dem Vorhandensein von 20% Serum sensitiv war und die Komplexe, welche aus den Formulierungen gebildet wurden, welche die Detergentien der Tween-Reihe enthielten, zeigten den größten Anstieg bei der Transfektionsaktivität in der Gegenwart von Serum, relativ zu derjenigen, welche bei der Abwesenheit von Serum beobachtet wurde.
Beispiel 9
Wirkung der Konzentration von Tween 80 in Emulsionen auf die durchschnittlichen Durchmesser von konzentrierten und verdünnten DNS/Emulsion-Komplexen
Konzentrierter DNS/Emulsion-Komplex wurde gebildet durch die Zugabe von 2 μl einer Lösung, welche 8 μg DNS enthielt (pCMV-Luc), direkt zu 72 μl der Emulsionen, welche 0,25 mg Öl/0,25 mg DOPE/0,75 DC-Chol enthielten und variierende Mengen von mg Tween 80 pro ml. Wie in den vorausstehenden Beispielen wurde verdünnter DNS/Emulsion-Komplex gebildet durch das Kombinieren von 2 μg DNS in 125 μl mit 18 μl derselben Emulsionen, welche bei dem konzentrierten Komplex verwendet wurden, aber verdünnt auf 125 μl. Die durchschnittlichen Durchmesser der konzentrierten und der verdünnten Komplexe wurden 1 Stunde nach der Inkubation bei Raumtemperatur gemessen. Die in der 4 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß zunehmende Mengen an Tween 80 die Größe der konzentrierten Komplexe verminderten, aber keinen Effekt auf die Größe der verdünnten Komplexe hatten.
Beispiel 10
Wirkung der Menge von Tween 80 in einer Emulsion auf die Transfektionsaktivität von konzentrierten und verdünnten DNS/Emulsion-Komplexen in der Gegenwart oder Abwesenheit von 20% Serum
Emulsionen und konzentrierte und verdünnte pCMV-Luc-DNS/Emulsion-Komplexe wurden hergestellt wie in dem Beispiel 9, und die Transfektionsaktivität der Komplexe wurde in BL6-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von 20% Serum gemessen. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in den 5A (konzentrierter Komplex) und 5B (verdünnter Komplex) gezeigt. Während die verdünnten Komplexe eine bessere Aktivität zu zeigen scheinen als die konzentierten Komplexe, könnte die Notwendigkeit, das Volumen des einem Tier verabreichten Komplexes klein zu halten, die Verwendung von konzentrierteren Komplexen in vivo begünstigen.
Beispiel 11
Tierstudien mit DNS: Emulsion- und DNS: Micellen-Komplexen
Die Formulierungen Nr. 21, 28, 31 und 34 (bezug nehmend auf Tabelle 3 für die Zusammensetzungen) wurden auf die Aktivität des Gentranfers in Mäusen getestet. 200 μl eines jeden von 4 × Konzentraten der Formulierungen Nr. 21 (1100 μg Gesamtlipidkomponenten), Nr. 28 (1000 μg Gesamtlipidkomponenten), Nr. 34 (900 μg Gesamtlipidkomponenten) und Nr. 31 (700 μg Gesamtlipidkomponenten)) wurden mit 6 μl von 5 M NaCl auf eine Endkonzentration von 0,15 M NaCl gemischt und dann kombiniert mit 4 μg /μl pCMV-CAT-DNS (100 μg). Die Komplexe wurden dann i.v. injiziert über die Schwanzvene der Maus (jede Maus wog etwa 25 g), und die CAT-Aktivität wurde in den Hauptorganen 2 Tage nach der Injektion gemessen. Die in der 6 gezeigten Daten zeigen in einer klaren Weise, daß Komplexe von DNS und den Formulierungen Nr. 28 (Emulsion), Nr. 31 (Micelle) oder Nr. 34 (Micelle) verschiedenartige Organe mit einer relativ hohen Aktivität transfizieren konnten, während der Komplex von DNS und der Formulierung Nr. 21 (Emulsion) andererseits schwach war und mit demjenigen von DC-Chol/DOPE-Liposomen vergleichbar.
Zusätzlich scheint die Aktivität des Komplexes von DNS und der Formulierung Nr. 31 spezifisch für die Lunge zu sein, da kein anderes Organ in einer signifikanten Weise transfiziert wurde. Der Komplex von DNS und der Formulierung Nr. 28 konnte alle Organe ziemlich gut transfizieren bei nur einer schwachen Transfektion der Niere, und der Komplex von DNS und der Formulierung Nr. 34 zeigte eine hohe Aktivität im Herzen bei sehr niedriger Aktivität in der Niere.

Claims

Ein Nukleinsäure : Emulsion-Komplex umfassend eine Nukleinsäure und eine Öl-in-Wasser-Emulsionsformulierung umfassend Lipidkomponenten und einen wässrigen Träger, worin die Lipidkomponenten eine Ölkomponente, eine kationische Amphiphil-Komponente und ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel als Komponente umfassen.
Der Komplex gemäß Anspruch 1, worin in der Formulierung die Ölkomponente in einer Menge von etwa 10 bis etwa 80 Gew.-% der Gesamtlipidkomponenten vorliegt, die kationische Amphiphil-Komponente in einer Menge von etwa 5 bis etwa 80 Gew.-% der Gesamtlipidkomponenten vorliegt und das nichtionische oberflächenaktive Mittel als Komponente in einer Menge von etwa 5 bis etwa 50 Gew.-% der Gesamtlipidkomponenten vorliegt.
Der Komplex gemäß Anspruch 2, der weiter eine neutrale Phospholipidkomponente umfasst, die in einer Menge von etwa 5 bis etwa 25 Gew.-% der Gesamtlipidkomponenten in der Formulierung vorliegt.
Der Komplex gemäß Anspruch 1, worin die Lipidkomponenten weiter eine neutrale Phospholipidkomponente umfassen.
Der Komplex gemäß Anspruch 1, worin die kationische Amphiphil-Komponente ein Lipid ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1,2-Bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonium)propan (DOTAP), N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA), 1,2-Dioleoyl-3-(4'-trimethylammonium)butanoyl-sn-glycerol (DOBT), Cholesteryl(4'-trimethylammonium)butanoat (ChOTB), DL-1,2-Dioleoyl-3-dimethylaminopropyl-B-hydroxyethylammonium (DORI), DL-1,2-O-Dioleoyl-3-dimethylaminopropyl-β-hydroxyethylammonium (DORIE), 1,2-Dioleoyl-3-succinyl-sn-glycerolcholinester (DOSC), Cholesterylhemisuccinatcholinester (ChOSC), Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS), Dipalmitoylphosphatidylethanolamidospermin (DPPES), Cholesteryl-3β-carboxylamido-ethylentrimethylammoniumiodid, 1-Dimethylamino-3-trimethylammonium-DL-2-propyl-cholesterylcarboxylatiodid, Cholesteryl-3β-carboxyamidoethylenamin, Cholesteryl-3β-oxysuccinamidoethylentrimethylammoniumiodid, 1-Dimethylamino-3-trimethylammonium-DL-2-propyl-cholesteryl-3β-oxysuccinatiodid, 2-[(2-Trimethylammonium)-ethylmethylamino]ethyl-cholesteryl-3β-oxysuccinatiodid, 3β[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl] cholesterol (CD-Chol), und 3β-[N-(Polyethylenimin)-carbamoyl]cholesterol.
Der Komplex gemäß Anspruch 1, worin das Gewichtsverhältnis von Nukleinsäure zu Gesamtlipidkomponenten in der Formulierung von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 50 beträgt.
Der Komplex gemäß den Ansprüchen 1 oder 5 zum Erleichtern des Zuleitens von Nukleinsäure an Zellen, worin das kationische Amphiphil 3β[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterol (DC-Chol) ist.
Der Komplex gemäß Anspruch 1, worin die Ölkomponente ein natürliches Öl ist.
Der Komplex gemäß Anspruch 8, worin die Ölkomponente Rizinusöl ist.
Der Komplex gemäß Anspruch 1, worin das nichtionische oberflächenaktive Mittel ein synthetisches Detergens ist.
Der Komplex gemäß Anspruch 10, worin das synthetische Detergens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sorbitan-Fettsäureester, Polyoxyethylen-Sorbitan-Fettsäureester, Pluronic F68, Pluronic F127, Triton X-100 und Triton X-114.
Der Komplex gemäß Anspruch 11, worin die kationische Amphiphil-Komponente 3β[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterol (DC-Chol) ist.
Der Komplex gemäß Anspruch 1, worin das nichtionische oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus nichtionischen oberflächenaktiven Phosphatidylethanolamin-Derivaten.
Der Komplex gemäß Anspruch 1, worin die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNS und RNS.
Der Komplex gemäß Anspruch 10, worin das synthetische Detergens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sorbitan-Monolaurat, Sorbitan-Monopalmitat, Sorbitan-Monostearat, Sorbitan-Monooleat, Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat, Polyoxyethylen-Sorbitan-Monopalmitat, Polyoxyethylen-Sorbitan-Monostearat, Polyoxyethylen-Sorbitan-Monooleat, Poloxamer 188, Poloxamer 407, Polyoxyethylen(10)isooctylphenylether und Polyoxyethylen(8)isooctylphenylether.
Der Komplex gemäß Anspruch 1, worin die Formulierung für eine in vitro Transfektion geeignet ist.
Ein Verfahren zum Zuleiten von einer Nukleinsäure zu Zellen, wobei das Verfahren umfasst, dass die Zellen dem Komplex gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche in vitro ausgesetzt werden, wodurch das Zuleiten der Nukleinsäure zu den Zellen erleichtert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 17, worin die Zellen Säugerzellen sind, die dem Komplex in Gegenwart von Serum in vitro ausgesetzt werden.
Verwendung eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Behandlung eines Zustandes eines Menschen oder eines Tiers, wobei der Zustand ein solcher ist, bei dem die Behandlung das Zuleiten von einer Nukleinsäure zu Zellen des Menschen oder des Tiers umfasst.
Ein Verfahren zur Herstellung, eines Nukleinsäure : Emulsion-Komplexes umfassend eine Nukleinsäure in Kombination mit einer Öl-in-Wasser-Emulsionsformulierung, umfassend: (a) Kombinieren einer Ölkomponente, einer kationischen Amphiphil-Komponente und eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels als Komponente; (b) Zugeben eines wässrigen Trägers, um die Öl-in-Wasser-Emulsionsformulierung herzustellen; und (c) Zusetzen von Nukleinsäure zu der Öl-in-Wasser-Emulsionsformulierung, um den Nukleinsäure : Emulsion-Komplex herzustellen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 20, das weiter das Kombinieren der Komponenten von Schritt (a) mit einer neutralen Phospholipid-Komponente umfasst,
Das Verfahren gemäß Anspruch 21, worin die Komponenten von Schritt (a) in einem organischen Lösungsmittel kombiniert werden und das Lösungsmittel entfernt wird, um vor dem Schritt (b) einen Lipidfilm zu hinterlassen. 9389