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Hintergrund
der Erfindung
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1. Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Berechnen
der Assoziationskonstanten und der Dissoziationskonstanten zwischen
einer Sonde und einem Protein, ein Verfahren zum Untersuchen der
Funktionalität
von Proteinen unter Verwendung des Berechnungsverfahrens und ein
Verfahren zum Identifizieren von Proteinen unter Verwendung des
Berechnungsverfahrens. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf
ein Verfahren zum Untersuchen der Funktionalität von Proteinen, indem die
DNA-bindende Eigenschaft der Proteine berechnet wird, und auf ein
Verfahren zum Identifizieren der Proteine.
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2. Stand der
Technik
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Es
wird erwartet, dass ein Untersuchen der Funktionalität von DNA
und Proteinen oder ihr Identifizieren Werkzeuge für die Entwicklung
von Arzneimitteln oder für
medizinische Untersuchungen verfügbar
machen würden.
Insbesondere von DNA-bindenden Proteinen wird angenommen, dass sie
zu den wichtigen Substanzen gehören,
welche die Expression von Genfunktionen steuern oder abstimmen,
und die Klärung
ihrer DNA-bindenden Eigenschaften ist eine wichtige Aufgabe.
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Eine
DNA ist ein Polymer, das aus einer Sequenz aus vier Arten von Basen
gebildet wird, und zwei DNAs können über ihre
Sequenzen spezifisch aneinander binden. Da die Nukleinsäuren von
beiden derartigen DNAs negativ geladen sind, wird eine Hybridisierung
in einem hoch ionischen Lösungsmittel durchgeführt. Herkömmliche
Biochips nutzen diesen Vorteil, um eine Proben-DNA nachzuweisen,
indem eine Sonden-DNA auf einem Substrat immobilisiert wird.
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Allerdings
kann beispielsweise ein DNA-bindendes Protein nicht durch einen
herkömmlichen
Biochip identifiziert werden. Dies liegt daran, dass ein Protein
als eine Probe spezifisch an eine Sonden-DNA auf einem Biochip durch
ihren komplementären
DNA-Teil adsorbiert werden kann, und das Protein kann auch unspezifisch
an die Sonden-DNA adsorbiert werden, obwohl nicht angenommen wird, dass
dies passiert, angesichts der DNA. Aufgrund derartiger spezifischer
und unspezifischer Adsorptionen, die offensichtlich an der Sonden-DNA
auftreten, ist es nahezu unmöglich
gewesen, Probenproteine unter Verwendung eines herkömmlichen
Biochips zu identifizieren.
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Folglich
gibt es einen Bedarf, einen Chip zu entwickeln, der spezifisch an
ionische Polymere binden kann, wie etwa Proteine und/oder DNA, und
an einer Technik, ionische Polymere unter Verwendung dieses Chips
präzise
zu identifizieren.
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Es
gibt auch eine Erwartung, dass das Untersuchen der Wechselwirkungen
zwischen ionischen Polymeren in einem lebenden Organismus zu der Entwicklung
neuer Arzneimittel und medizinischer Untersuchungen beitragen würde. Insbesondere
wird die Aufmerksamkeit auf die Assoziationskonstante (KA) und die
Dissoziationskonstante (KD) als wichtige Indikatoren der Wechselwirkungen
zwischen ionischen Polymeren konzentriert. Die Assoziationskonstante
(KA) und die Dissoziationskonstante (KD) sind zueinander reziprok: KA = 1/KD
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Herkömmlicherweise
werden die Assoziationskonstante und die Dissoziationskonstante
zwischen ionischen Polymeren auf der Grundlage einer Bindungskurve
oder Dissoziationskurve berechnet, die durch Überwachen der Adsorption einer
Substanz unter Verwendung einer Vorrichtung zum Messen der Stärke der
Bindung zwischen ionischen Polymeren, wie etwa einer Vorrichtung
zum Messen einer Oberflächenplasmonresonanz
(siehe beispielsweise die japanische Offenlegungsschrift (Kohyo)
Nr. 7-507865), erhalten wird.
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Bei
einem Beispiel einer Oberflächenplasmonresonanzmessvorrichtung
wird ein Ligand auf einer Sensoroberfläche immobilisiert, und es wird
eine Probe, die eine Substanz enthält, die an dem Liganden wirkt, über ein
Mikrokanalsystem zugegeben. Winzige Massenänderungen, die auf die Assoziation oder
Dissoziation von Molekülen
an oder von der Sensoroberfläche
zurückzuführen sind,
werden dann in Echtzeit anhand von Änderungen eines Oberflächenplasmonresonanzsignals
dargestellt. Diese Technik ist beim Untersuchen der Wechselwirkung zwischen
Biomolekülen
oder der Korrelation zwischen Struktur und Funktion wirk sam. Die
Oberflächenplasmonresonanz
wird in einer Vielzahl von Bereichen angewendet, einschließlich der
Grundlagenforschung, der Konstruktion von Proteinen (Proteinengineering)
und dem Screening neuer Arzneimittel. Spezifische Beispiele, bei
denen die Oberflächenplasmonresonanz
genutzt wird, schließen
die Forschung an dem Mechanismus von Aids oder der Krebsentwicklung,
der immunologischen Antwort, Signaltransduktion, den Wegen, auf
denen Rezeptoren und Liganden aneinanderbinden, und dem Mechanismus
der Genexpressionskontrolle ein (siehe beispielsweise Chong L et
al. A human telomeric protein. Science 1995 Dec 8; 270 (5242): 1663-7).
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Um
allerdings die Dissoziationskonstante zwischen einem DNA-bindenden
Protein und einer Reihe von doppelsträngigen DNAs zu bestimmen, ist es
nötig,
einen speziellen Sensorchip für
jede zu messende doppelsträngige
DNA herzustellen. Normalerweise werden ungefähr 4 bis 6 Stunden benötigt, um
einen Sensorchip herzustellen, einschließlich der Zeit für die Vorverarbeitung.
Folglich ist es nahezu unmöglich
gewesen, die Dissoziationskonstante in einer Reihe von Proben mit
doppelsträngiger
DNA in kurzer Zeit zu bestimmen.
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WO
02/18648 offenbart ein Verfahren zur Analyse von Bindungswechselwirkungen,
bei denen ein Protein an einen Nukleinsäurechip gebunden wird. Es werden
Fluoreszenzwerte gegen die höchste
Fluoreszenzintensität
auf einem Fleck für
die spezielle Messung normalisiert. Selektive Waschschritte, um
die Spezifität
der Bindung zu steigern, werden nicht offenbart.
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US 6,355,428 offenbart ein
Verfahren zum Bestimmen der relativen Bindungsaffinität zwischen DNA,
die auf einem Chip immobilisiert ist, und DNA-bindenden Proteinen,
wobei das zweite ionische Polymer markiert ist. Auch hier werden
selektive Waschschritte zum Steigern der Spezifität nicht
offenbart.
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Umgekehrt
mach das Verfahren, das einen Chip zum Identifizieren eines ionischen
Polymers verwendet, es möglich,
das Vorhandensein oder Fehlen einer Bindung zwischen doppelsträngiger DNA
und DNA-bindenden Proteinen oder die relativen Bindungsstärken für eine große Anzahl
an Proteinen gleichzeitig zu bestimmen. Das Verfahren ist allerdings
nicht in der Lage, die Assoziations- und Dissoziationskonstanten,
die absolute Werte darstellen, zu berechnen.
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Folglich
besteht ein Bedarf daran, eine Technik zu entwickeln, die in der
Lage ist, die Assoziations- und Dissoziationskonstanten einer Vielzahl
von ionischen Polymeren mit doppelsträngiger DNA auf einfache und
schnelle Weise zu berechnen.
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Kurzfassung
der Erfindung
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Die
Erfindung wurde gemacht, nachdem erkannt worden war, dass die Berechnung
von groben Werten für
Assoziations- und Dissoziationskonstanten von vielen Arten von doppelsträngigen DNA-Proben,
was gewöhnlich
viel Zeit in Anspruch nahm, in kurzer Zeit durch Verwendung eines
spezifischen Chips zum Identifizieren von Proteinen durchgeführt werden
kann. Der zuvor erwähnte
Bedarf wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst.
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Es
wird ein Verfahren zum Berechnen einer Assoziationskonstanten und
einer Dissoziationskonstanten offenbart, wobei dieses Verfahren
keinen Teil der Erfindung darstellt, das Folgendes umfasst:
einen
ersten Schritt zum Herstellen eines Polymerchips zum Identifizieren
eines ionischen Polymers, wobei der Polymerchip ein Substrat umfasst,
auf welchem ein erstes ionisches Polymer immobilisiert ist, wobei
ein zweites ionisches Polymer komplementär an das erste ionische Polymer
gebunden ist, um eine Sonde zu bilden;
einen zweiten Schritt,
bei dem ein drittes ionisches Polymer als eine Probe veranlasst
wird, spezifisch an die Sonde zu binden, und bei dem die relative
Assoziationsstärke
zwischen der Sonde, welche die ersten und zweiten ionischen Polymere
umfasst, und dem dritten ionischen Polymer gemessen wird;
einen
dritten Schritt zum Berechnen einer präzisen Assoziationskonstante
und Dissoziationskonstante zwischen der Sonde, welche die ersten
und zweiten ionischen Polymere umfasst, und dem dritten ionischen
Polymer unter Verwendung eines Verfahrens zum Messen der Assoziationsstärke zwischen
ionischen Polymeren; und
einen vierten Schritt zum Berechnen
der Assoziations- und Dissoziationskonstanten zwischen der Sonde,
bei der die ersten und zweiten ionischen Polymere komplementär gebunden
sind, und dem dritten ionischen Polymer unter Verwendung einer Korrelation zwischen
der relati ven Assoziationsstärke
zwischen ionischen Polymeren, die in dem zweiten Schritt erhalten
wurde, und den präzisen
Assoziations- und Dissoziationskonstanten zwischen ionischen Polymeren,
die im dritten Schritt erhalten wurden.
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Ebenfalls
offenbart wird ein Verfahren zum Berechnen einer Assoziationskonstante
und einer Dissoziationskonstante, wobei dieses Verfahren keinen
Teil der Erfindung darstellt, das Folgende umfasst:
Einen ersten
Schritt zum Herstellens eines Polymerchips zum Identifizieren ionischer
Polymere, wobei der Chip ein Substrat umfasst, auf dem ein erstes
ionisches Polymer immobilisiert ist, wobei ein zweites ionisches
Polymer, das markiert ist, veranlasst wird, komplementär an das
erste ionische Polymer in einem ionischen Lösungsmittel zu binden, um eine Sonde
zu bilden, die dann getrocknet wird;
einen zweiten Schritt,
bei dem ein drittes ionisches Polymer als eine Probe veranlasst
wird, an der Sonde adsorbiert zu werden, der Chip dann mit einem
ionischen Lösungsmittel
gewaschen wird, um das dritte ionische Polymer, das unspezifisch
gebunden ist, zu entfernen, der Chip weiter mit einem nicht-ionischen
Lösungsmittel
gewaschen wird, um das zweite markierte ionische Polymer zu entfernen,
außer
in dem Fall, in dem das dritte ionische Polymer spezifisch gebunden
ist, und die verbleibende Menge an Markierung abgelesen wird;
einen
dritten Schritt zum Berechnen einer präzisen Assoziations- und Dissoziationskonstanten
zwischen der Sonde, die aus den ersten und zweiten ionischen Polymeren
gebildet ist, und dem dritten ionischen Polymer unter Verwendung
eines Verfahrens zum Messen der Assoziationsstärke zwischen ionischen Polymeren;
und
einen vierten Schritt zum Herstellen einer analytischen
Kurve auf der Grundlage einer Korrelation zwischen der relativen
Assoziationsstärke
zwischen ionischen Polymeren, die in dem zweiten Schritt erhalten
wurde, und den präzisen
Assoziation- und Dissoziationskonstanten zwischen ionischen Polymeren, die
in dem dritten Schritt erhalten wurden, um die Assoziationskonstante
und Dissoziationskonstante zwischen der Sonde, bei der die ersten
und zweiten ionischen Polymere komplementär gebunden sind, und dem dritten
ionischen Polymer zu berechnen.
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Vorzugsweise
können
die ersten bis dritten ionischen Polymere ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend
aus Proteinen, Polyamimosäuren, DNA,
RNA und synthetischen Polymeren.
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Unter
einem Aspekt macht die Erfindung eine Verfahren zum Berechnen von
Assoziations- und
Dissoziationskonstanten zwischen einer Sonde und einem Protein verfügbar, das
Folgendes umfasst:
einen ersten Schritt zum Herstellen eines
DNA-Chips zum Identifizieren von Proteinen, wobei der DNA-Chip ein
Substrat umfasst, auf welchem eine erste DNA immobilisiert ist,
wobei eine zweite DNA, welche markiert ist, komplementär an die
erste DNA in einem ionischen Lösungsmittel
gebunden ist, um eine Sonde mit einer doppelsträngigen DNA zu bilden, wobei
die Sonde dann getrocknet wird;
einen zweiten Schritt, bei
dem ein Protein als eine Probe veranlasst wird, an der Sonde zu
adsorbieren, der DNA-Chip dann mit einem ionischen Lösungsmittel
gewaschen wird, um Proteine, die unspezifisch gebunden sind, zu
entfernen, und der DNA-Chip dann mit einem nicht-ionischen Lösungsmittel
gewaschen wird, um die zweite markierte DNA zu entfernen, außer in dem
Fall, in dem Proteine spezifisch gebunden sind, und die Menge an
verbleibender Markierung abgelesen wird;
einen dritten Schritt
zum Berechnen präziser
Assoziations- und Dissoziationskonstanten zwischen der Sonde mit
einer doppelsträngigen
DNA, die aus der ersten und zweiten DNA besteht, und dem Protein unter
Verwendung eines Verfahrens zum Messen der Assoziationsstärke zwischen
einer doppelsträngigen DNA
und einem Protein, wie etwa durch Oberflächenplasmonresonanzverfahren
und Gelshiftassays; und
einen vierten Schritt zum Herstellen
einer analytischen Kurve auf der Grundlage einer Korrelation zwischen
der relativen Assoziationsstärke
zwischen der doppelsträngigen
DNA und dem Protein, die in dem zweiten Schritt erhalten wurde,
und den präzisen
Assoziations- und Dissoziationskonstanten zwischen der doppelsträngigen DNA
und dem Protein, die in dem dritten Schritt erhalten wurden, um
die Assoziations- und Dissoziationskonstanten zwischen der Sonde
mit der doppelsträngigen
DNA, in der die erste und zweite DNA komplementär gebunden ist, und dem Protein
zu berechnen.
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Beispiele
des Verfahrens zum Messen der Assoziationsstärke zwischen einer doppelsträngigen DNA
und einem Protein schließen
ein Oberflächenplasmonresonanzverfahren
und ein Gelshiftassay-Verfahren ein. Insbesondere das Oberflächenplasmonresonanzverfahren
ist in Bezug auf Präzision
und Durchführbarkeit überlegen,
und es ist geeignet für
das Verfahren zum Berechnen der Assoziations- und Dissoziationskonstanten
gemäß der Erfindung.
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Die
Erfindung macht auch ein Verfahren zum Untersuchen der Funktionalität von Proteinen
unter Verwendung des Verfahrens zum Berechnen von Assoziations-
und Dissoziationskonstanten verfügbar, wie
oben beschrieben, bei dem die Bindungseigenschaft zwischen der Sonde,
in der die erste und zweite DNA komplementär gebunden ist, und dem Protein ausgewertet
wird.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
schematisch einen DNA-Chip zur Identifizierung von Proteinen als
ein Beispiel des Polymerchips zum Identifizieren ionischer Polymere gemäß der Erfindung.
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2 zeigt ein Diagramm, welches das Verfahren
zum Binden eines Proteins unter Verwendung des DNA-Chips zum Identifizieren
von Proteinen nach 1 veranschaulicht.
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3 zeigt
das Messprinzip unter Verwendung einer Oberflächenplasmonmessvorrichtung.
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4 zeigt
ein Beispiel des Biochips.
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5 zeigt
eine Abbildung nach DNA-Hybridisierung.
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6 ist
ein Bild nach Zugabe von TRF-Protein und Waschen mit reinem Wasser.
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7 zeigt
eine Tabelle, welche die Ergebnisse der Standardisierung eines quantisierten
Bildes, das ausgewertet wurde, und die Dissoziationskonstanten,
welche durch die Oberflächenplasmonmessvorrichtung
gemessen wurden, zeigt.
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8 ist
ein Graph (eine analytische Kurve), der eine Korrelation zwischen
den Dissoziationskonstanten, die durch die Oberflächenplasmonmessvorrichtung
gemessen wurden, und den Verhältnissen der
Fluoreszenzintensitäten
auf dem Biochip angibt.
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Beschreibung
der Erfindung
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Das
Material und die Gestalt des Substrats, das in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, sind nicht besonders beschränkt, und
die Materialien und Gestaltungen, die typischerweise für die Substrate
von Biochips verwendet werden, können verwendet
werden. Vorzugsweise wird das Material ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus Glas, Silikagel, Polystyrol, Polypropylen und einer Membran. Die
Gestalt ist vorzugsweise entweder plattenartig oder körnchenartig.
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Der
Marker, mit dem die zweite DNA markiert wird, wird ausgewählt aus
denen, die typischerweise im Bereich von Biochips verwendet werden.
Insbesondere ist eine fluoreszierende Substanz unter dem Gesichtspunkt
optischer Verfahren in einem Leseschritt zu bevorzugen.
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In
Fällen,
bei denen die Sonde, bei der die markierte zweite DNA komplementär an die
erste DNA gebunden ist, und das Protein als eine Probe die gleiche
Ladung aufweisen, sollte ein viertes Probenpolymer mit einer entgegengesetzten
ionischen Eigenschaft vorzugsweise zugegeben werden, damit sie fest
immobilisiert werden können,
gefolgt von einem Schritt, bei dem sie mit einem nicht-ionischen Lösungsmittel
gewaschen werden.
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In
Bezug auf die erste und zweite DNA sollte die Anzahl an Basensequenzen
in der DNA vorzugsweise zwischen 4 bis 13 für jedes Polymer betragen. Wenn
die Anzahl an Basensequenzen in diesem Bereich liegt, wird die komplementäre Bindung
der DNA, welche die erste und zweite DNA umfasst, gestärkt, und
weiterhin wird die spezifische Bindung zwischen dem DNA-Chip, welcher
diese Polymere umfasst, und den DNA-bindenden Proteinen als Proben
auf der Grundlage ihrer chemischen und physikalischen Strukturen
gestärkt.
Als ein Ergebnis kann die Suche nach und die Identifizierung der
Funktionalität
der Probenproteine einfacher und präziser durchgeführt werde.
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Das
nicht-ionische Lösungsmittel,
das in der Erfindung verwendet wird, ist nicht besonders beschränkt. Beispielsweise
handelt es sich um eine Mischung aus einer oder mehreren Arten von
Substanzen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus reinem Wasser,
Alkohol, Aceton und Hexan besteht. Das ionische Lösungsmittel
ist ebenfalls nicht besonders beschränkt. Es kann ein wässriges
Lösungsmittel
aus Natriumchlorid oder Kaliumchlorid sein.
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Biopolymere,
wie etwa DNA und Proteine (Polyaminosäuren und Polypeptide), weisen
eine Ladung auf, die im Fall von DNA aufgrund der Phosphatgruppe
negativ ist, und im Fall von Proteinen in Abhängigkeit von der Art der Aminosäuren entweder positiv
oder negativ ist. Der Doppelstrang von DNA weist normalerweise ein
negatives Ion auf und ist deshalb abstoßend, so dass er in reinem
Wasser nicht hybridisiert. Allerdings kann er über Wasserstoffbrückenbindung
in einem System hybridisieren, in dem ein positives Ion vorhanden
ist, da beispielsweise ein Na+-Ion mit der
Phosphorgruppe von DNA chelatiert. Proteine mit einer positiven
Ladung binden an DANN, die eine negative Ladung im Bereich der Ladung
aufweist.
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Indem
der Biochip mit einem Lösungsmittel mit
verschiedenen Ionenstärken
gewaschen wird, bei denen die Biopolymere über ihre Ladungen gebunden
sind, werden die Polymere mit derselben Ladung dissoziiert, wenn
die Ionenstärke
gering ist, während die
Polymere mit entgegengesetzten Ladungen stark aneinander binden.
Wenn die Ionenstärke
hoch ist, können
selbst Polymere mit derselben Ladung aneinander binden, während Polymere
mit verschiedenen Ladungen ihre Assoziationsstärke verlieren und dissoziiert
werden.
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Indem
auf diese Weise die Ionenstärke
geändert
wird, wird es möglich,
verschiedene Polymere zu identifizieren und die Funktionalität der Polymere zu
untersuchen.
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Die
DNA-bindenden Proteine, wie hier verwendet, beziehen sich auf Proteine,
die eine Affinität zu
DNA aufweisen und die spezifisch oder unspezifisch an Basensequenzen
binden. Beispiele derartiger Proteine schließen folgende ein: Hauptsächlich 1)
doppelsträngige
DNA-bindende Proteine,
welche die Genexpression steuern, indem sie Änderungen in der DNA-Struktur hervorrufen,
2) einzelsträngige DNA-bindende
Proteine, die unverzichtbar sind für den Prozess der Verdopplung,
Rekombination oder Reparatur von DNA, 3) Proteine, die an dem Erhalt der
Strukturen höherer
Ordnung von Chromosomen beteiligt sind, 4) ATP-abhängige
DNAse und 5) Topoisomerasen, welche die DNA-Superhelixstruktur bilden.
Viele von 1) sind Transkriptionsfaktoren, von denen etliche strukturelle
Motive bekannt sind, wie etwa die Helix-Turn-Helix, die in dem Strukturen
des λ-Phagen-Proteins
Cro und von cAMP-Rezeptorproteinen
gefunden wurde, der „Zinkfinger", bei dem Cystein
und Histidin ein Zin kion chelatieren, und der „Leucinzipper", bei dem zwei Moleküle von Proteinen,
die eine α-Helix mit Leucin
umfassen, das an einer Seite angeordnet ist, wie ein Reißverschluss kombiniert
werden. Die Proteine 2) werden als SSB (siegle-stranded DNA-binding
Proteins, Einzelstrang-DNA-bindende Proteinen) bezeichnet, und sie werden
in verschiedenen Lebensformen vom Bakteriophagen bis zu höheren Lebensformen
gefunden. Die Proteine 3) werden durch die Histonproteine repräsentiert,
die in den Chromosomen von Eukaryoten vorhanden sind, und sie bilden
eine Nukleosomenstruktur. Es ist bekannt, dass ähnliche HU-Proteine binden,
um eine Nukleosomen-artige Struktur auch in Bakterien zu bilden.
Die Proteine 4) schließen eine
Helikase ein, welche eine DNA-Replikatikon (beispielsweise DnaB-Proteine),
Rekombination (RecA- und RecBC-Proteine) und das Aufwinden von doppelsträngiger DNA
fördern.
Weiterhin können
in der vorliegenden Erfindung nicht nur die oben erwähnten Proteine
verwendet werden, denen eine DNA-bindende Eigenschaft zueigen ist,
sondern auch Proteine, denen eine DNA-bindende Eigenschaft durch
physikalische oder chemische Behandlungen verliehen worden ist.
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Folglich
können
in der vorliegenden Erfindung die oben erwähnten verschiedenen DNA-bindenden Proteine
verwendet werden. Die Erfindung schließt Fälle ein, bei denen nicht nur
eine Art von DNA-bindenden Proteinen, sondern zwei oder mehrere
Arten von DNA-bindenden
Proteinen verwendet werden.
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DNA-bindende
Proteine weisen charakteristischerweise eine positive Ladung an
der DNA-bindenden
Domaine auf und binden an DNA oder RNA mit negativen Ladungen entweder
spezifisch oder unspezifisch. Die doppelsträngige DNA, an welche diese
DNA-bindenden Proteine gebunden sind, weist eine zunehmende Assoziationsstärke mit
abnehmender Ionenstärke
auf.
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1 zeigt
einen DNA-Chip zum Identifizieren von Proteinen als ein Beispiel
des Polymerchips zum Identifizieren ionischer Polymere gemäß der Erfindung.
Eine erste DNA 2 mit einer Basensequenz GCTA wird auf einem
Substrat 2 immobilisiert. Wenn eine zweite DNA 3,
die mit einer fluoreszierenden Substanz markiert ist und eine Basensequenz
CGAT aufweist, zu einem ionischen Lösungsmittel in Gegenwart der
ersten DNA 2 gegeben wird, binden sie komplementär aneinander
und bilden einen Doppelstrang. Wenn eine zweite DNA 6,
die mit derselben fluoreszierenden Substanz markiert ist und eine
Basensequenz GGTT aufweist, zu einer anderen DNA 5 mit
einer Basensequenz CCAA gegeben wird, binden sie auf ähnliche Weise
komplementär
aneinander und bilden einen Doppelstrang. Wenn ein Protein 4,
das nicht identifiziert worden ist, zu dem DNA-Chip gegeben wird,
bindet das Protein 4 an den Doppelstrang mit der komplementären Bindung
von DNA 2 und DNA 3. Allerdings bindet das Protein 4 nicht
an den Doppelstrang der komplementären Bindung von DNA 5 und
DNA 6. Derartige Phänomene
können durch
ein Fluoreszenzintensitätsmessinstrument
gemessen und dann analysiert werden, um das Protein zu identifizieren.
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2 zeigt ein Diagramm, welches das Verfahren
zum Identifizieren eines Proteins unter Verwendung des in 1 gezeigten
DNA-Chips zum Identifizieren von Proteinen veranschaulicht. Zunächst wird
ein DNA-Chip hergestellt, welcher ein Substant 1 umfasst,
auf welchem DNA 2 und DNA 5 immobilisiert sind
(a). Dann werden DNA 3 und DNA 6, die mit einer
fluoreszierenden Substanz markiert sind, veranlasst, komplementär an den
DNA-Chip in Gegenwart eines ionischen Lösungsmitttels zu binden (b).
Nach Entfernen des ionischen Lösungsmittels
werden nicht identifizierte Proteinen 4 zugegeben. Die
Proteine 4 binden spezifisch an die Doppelstränge der
DNAs 2 und 3, wie sie sollten, und sie binden
auch unspezifisch an die Doppelstränge der DNAs 5 und 6,
obwohl sie dies nicht sollten (c). Folglich wird der DNA-Chip mit
einem ionischen Lösungsmittel
gewaschen, um die unspezifisch gebundenen Proteine zu entfernen
(d). Der DNA-Chip wird weiter mit einem nicht-ionischen Lösungsmittel
gewaschen, um die DNA 6, die mit einer fluoreszierenden
Substanz markiert ist, zu entfernen (e). Die verbleibende Fluoreszenz
wird dann abgelesen, und das Protein wird auf der Grundlage des
Ableseergebnisse identifiziert (f).
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3 zeigt
das Prinzip der Messung, die durch eine Oberflächenplasmonresonanzmessvorrichtung,
verfügbar
von Biacore, durchgeführt
wurde. An dem Boden eines Prismas wird ein Golddünnfilm mit einer Dicke von
bis zu 50 nm gebildet, und die Grenzfläche wird mit polarisiertem
Licht einer Wellenlänge
von 760 nm bestrahlt. Dieses Vorgehen erzeugt eine Energiewelle,
die als eine evaneszente Welle bezeichnet wird, auf dem Dünnfilm.
Da diese evaneszente Welle zur Resonanz einer freien Elektronenwelle
oder eine Plasmonwelle auf der Golddünnschicht verwendet wird, wird
bei einem bestimmten Winkel des reflektierten Lichts ein Energieverlust
beobachtet. Wenn die Intensität
des reflektierten Lichts mit einer Photodiodenanordnung (Photodioden-Array)
gemessen wird, ist ein optisches Tal zu erkennen, wie in I angegeben.
Bei diesen optischen Phänomenen
handelt es sich um die Oberflächenplasmonresonanz,
bei der der Winkelverlust in Abhängigkeit
von Änderungen
der Konzentration des Lösungsmittels
auf der Goldfilmoberfläche
variiert.
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In
dem Fall beispielsweise, in dem eine Lösung mit einem DNA-bindenden
Protein zugesetzt wird, nachdem der doppelsträngige DNA-Chip auf dem Dünnfilm immobilisiert
worden ist, nimmt die Masse der Oberfläche des doppelsträngigen DNA-Chips,
die als ein Sensor wirkt, aufgrund der spezifischen Bindungsreaktion
auf der Oberfläche zu.
Als Ergebnis verschiebt sich der Winkel, bei dem das optische Tal
auftritt, von I zu II. Diese Verschiebung wird dargestellt, nachdem
sie in eine chronologische Bindungskurve, die als ein „Sensorgramm" bezeichnet wird,
umgewandelt wurde.
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Im
Folgenden wird ein spezifisches Verfahren zum Berechnen der Assoziationskonstanten
und Dissoziationskonstanten von Proteinen beschrieben werden. Zunächst wird
eine synthetisierte oligo-DNA auf ein Substrat getupft, und es wird
eine komplementäre
oligo-DNA mit einem markierten Terminus hybridisiert, wodurch ein
doppelsträngiger
DNA-Chip hergestellt wird. Eine Substanz, deren Assoziationskonstante
gemessen werden soll, wird zu dem doppelsträngigen DNA-Chip als eine Probe
gegeben. Wenn der DNA-Chip mit reinem Wasser gewaschen wird, wird
die komplementäre
DNA dissoziiert, falls die Probe nicht an die doppelsträngige DNA
gebunden worden ist. Schließlich
kann durch Ablesen der Fluoreszenz auf dem Chip bestimmt werden,
in welchem Ausmaß die
zu messende Probe an die doppelsträngige DNA gebunden worden ist.
Andererseits werden die Werte der Dissoziationskonstanten KD für drei oder
mehrere Arten von Proben auf dem Chip unter Verwendung einer Ausrüstung zur
Oberflächenplasmonmessung
bestimmt, und es wird eine analytische Kurve hergestellt. Da eine
Korrelation beobachtet werden kann zwischen dem Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten auf
dem Chip und den Werten für
die Dissoziationskonstante KD im Hinblick auf eine Bindung an die
doppelsträngige
DANN, können die
Werte für
die Dissoziationskonstante KD aus dem Verhältnis der Fluoreszenzintensität unter
Verwendung der analytischen Kurve bestimmt werden.
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Beispiel
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In
dem folgenden Beispiel wurde das Protein von TRF1, das bereits identifiziert
worden ist, als eine Probe verwendet. TRF1 wird in dem oben erwähnten Dokument
1, das keine Patentanmeldung und kein Patent ist, eingeführt (Chong
L et al. A human telomeric protein. Science 1995 Dec 8; 270(5242): 1663-7).
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Ein
Biochip wurde hergestellt, wie folgt:
Vier Arten von Sonden-DNA,
die auf einem Chip immobilisiert werden sollen, wurden verfügbar gemacht und
ihre entsprechenden 5'-Termini
wurden biotinyliert. Sie wurden dann an 6 Stellen eines mit Avidin beschichteten
Objektträgers
für jede
Art von Probe unter Verwendung von SPBIO (verfügbar von Hitachi Software Engineering
Co., Ltd.) aufgetupft. In dem vorliegenden Beispiel wurden 4 Arten
von Sonden-DNA verwendet, so dass 24 Flecken hergestellt wurden.
Die Sequenzen der auf dem Chip immobilisierten Sonden-DNA waren
5'-GTTAGGGTTAGGG-3,
5'-GTTAAGGTCAGGG-3, 5'-GTTAAGGTTAGGG-3
und 5'-GTTAGGGCTAGGG-3.
Im Folgenden werden sie als eine AGTT-Sonde, eine AATC-Sonde, eine
AATT-Sonde und eine AGCT-Sonde bezeichnet. Die Konzentration der
aufgetupften Sonden-DNA wurde mit reinem Wasser auf 1 mM eingestellt.
Ein Beispiel eines auf diese Weise betupften Biochips wird in 4 gezeigt.
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Eine
DNA-Probe mit einer Sequenz 3'-CAAYYCCRRTCCC-5' (Y = C oder T, R
= A oder G) wurde als die DNA-Probe zur Hybridisierung synthetisiert,
welche die komplementären
Stränge
für alle
4 Arten enthält.
Der 5'-Terminus
wurde mit einem Fluoreszenzfarbstoff Cy5 markiert.
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Dann
wurde eine 5 × SSC-Lösung hergestellt,
welche die Proben-DNA in einer Konzentration von 100 nM enthielt,
und 10 μl
der Lösung
wurden auf den vorbereiteten Biochip gegeben, um eine Hybridisierung
für 30
Minuten in einer feuchten Umgebung, um ein Austrocknen zu vermeiden,
zu bewirken.
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Nach
der Hybridisierung wurde der Chip mit 1 × SSC gewaschen, getrocknet
und dann unter Verwendung eines Fluoreszenzscanners CRBIO2 (verfügbar von
Hitachi Software Engineering Co., Ltd.) abgelesen.
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Ein
Beispiel eines Bildes, das abgelesen worden ist, wird in 5 gezeigt.
In 5 geben verdunkelte Flecken die Stellen an, an
denen die Cy5-markierte Probe vorhanden ist. Folglich kann die Bildung
einer doppelsträngigen
DNA bestätigt
werden.
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Danach
wurde eine Probenlösung
mit TRF1-Protein, hergestellt mit 5 mM KPB (Phosphorsäure) und
30 mM NaCl in einer Konzentration von TRF1-Protein von 110 μM, zu dem hybridisierten
Biochip gegeben, und es wurde eine Hybridisierung für 10 Minuten
durchgeführt.
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Dann
wurde der Chip mit 0,2 × SSC
bei 40°C drei
Minuten lang gewaschen, um unspezifisch adsorbierte Proteinen zu
entfernen. Der Chip wurde weiterhin mit reinem Wasser bei 40°C gewaschen, um
die Dissoziation der Cy5-markierten Proben-DNA zu erleichtern. Schließlich wurde
der Chip unter Verwendung eines CRBIO2 abgelesen. 6 zeigt
ein Bild, das nach dem Weiterverarbeiten des Zustands in 5 abgelesen
wurde.
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Die
doppelsträngige
DNA, die mit TRF1 hybridisiert wurde, dissoziiert selbst in reinem
Wasser nicht. Folglich kann geschlussfolgert werden, dass der in 6 gezeigte
Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen den vier Arten von
Sonden dem Unterschied in der Assoziationsstärke zwischen dem TRF1-Protein
und dem doppelsträngigen
DNA-Chip entspricht.
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Die
Fluoreszenzintensitäten
an den Stellen der Flecken in dem Bild von 6 wurden
quantifiziert, und es wurde ein Mittelwert aus durchschnittlich 6
Flecken erhalten (T). Die Fluoreszenzintensitäten an den Stellen mit den
Flecken in dem Bild von 5 wurden quantifiziert, und
es wurde ein Mittelwert aus 6 Flecken erhalten (H). Folglich kann
ein standardisiertes Verhältnis
der Fluoreszenzintensität
(T/H) erhalten werden. 7 zeigt eine Tabelle der Verhältnisse
der Fluoreszenzintensitäten
für die
einzelnen Sondensequenzen.
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Eine
präzise
Dissoziationskonstante zwischen jeder der vier Arten von doppelsträngiger DNA und
TRF1 wurde unter Verwendung einer Oberflächenplasmonresonanzmessvorrichtung
Biacore (R) X, verfügbar
von Biacore, untersucht. Die Einzelheiten des Verfahrens sind wie
folgt:
200 μl
von jeder der vier Arten von Sonden (mit biotinylierten 5'-Termini), die auf
dem Chip immobilisiert waren, wurden in einer Konzentration von
30 μM hergestellt.
Andererseits wurden 20 μl
einer hybridisierten DNA-Probe, die nicht mit Cy5-markiert war,
in einer Konzentration von 30 μM
hergestellt. Die DNA-Hybridisierungsprobe wurde dann mit jeder der Sonden,
die auf dem Chip immobilisiert waren, gemischt und dann bei 95°C für 10 Minuten
denaturiert. Die Temperatur wurde dann langsam auf Raumtemperatur
zurückkehren
gelassen, wodurch vier Arten von doppelsträngigen DNA-Sonden hergestellt
wurden.
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Die
oben beschriebenen doppelsträngigen DNA-Sonden
wurden dann an einem mit Avidin beschichten Chip unter Verwendung
der Oberflächenplasmonresonanzmessvorrichtung
immobilisiert. Die Avidinbeschichtung war Sensorchip SA, verfügbar von
Biacore. Der Immobilisierungspuffer setzte 10 mM HEPES pH 7,4 +
3 M EDTA + 150 mM NaCl ein. Das Flussvolumen während der Immobilisierung betrug
5 μl/min.
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Das
TRF1-Protein wurde veranlasst, auf dem immobilisierten Chip in fünf verschiedenen
Konzentrationen von 10 nM, 25 nM, 50 nM, 75 nM und 100 nM zu fließen. Die
Menge an gebundenem TRF1 wurde unter Verwendung der Oberflächenplasmonresonanzmessvorrichtung überwacht,
um eine Assoziationskurve und eine Dissoziationskurve herzustellen,
auf deren Grundlage die Dissoziationskonstante (KD-Wert) berechnet
wurde. Der Kopplungspuffer setzte 10 mM HEPES pH 7,4 + 3 M EDTA
+ 50 mM NaCl ein, und das Flussvolumen betrug 20 μl/min. Die
präzisen
Dissoziationskonstanten der vier Arten von Sonden werden in der
Tabelle von 7 gezeigt.
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Eine
Korrelation kann zwischen denen auf diese Weise gemessenen präzisen Dissoziationskonstanten
(KD) und den Verhältnissen
der Fluoreszenzintensitäten
(T/H), die von dem Chip erhalten wurden, beobachtet werden. Demgemäß wurde
eine analytische Kurve erstellt, indem die Dissoziationskonstanten
von mindestens drei Arten von doppelsträngiger DNA gemessen wurden. 8 zeigt
eine analytische Kurve, die auf der Grundlage der Sonden AGTT, AATC
und AATT hergestellt wurde. In 8 gibt die
vertikale Achse die Dissoziationskonstante (KD-Wert) an, während die
horizontale Achse das Verhältnis
der Fluoreszenzintensität
(T/H) angibt.
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Falls
die Dissoziationskonstanten von anderen Arten von doppelstängiger DNA
bestimmt werden sollen, kann die Fluoreszenzintensität von dem fraglichen
Flecken auf dem Biochip abgelesen werden und mit der analytischen
Kurve verglichen werden, um eine grobe Dissoziationskonstante zu
berechnen. Beispielsweise beträgt
die Fluoreszenzintensität
der AGCT-Sonde 0,437,
wie in 7 gezeigt, so dass auf der Grundlage der analytischen Kurve
von 8 angenommen werden kann, dass die Dissoziationskonstante
grob in der letzteren Hälfte
von 10–8 liegt.
Bei einer Messung unter Verwendung der Oberflächenplasmonresonanzmessvorrichtung
betrug die präzise
Dissoziationskonstante (KD-Wert) 8,17 × 10–8,
wie in 7 gezeigt. Folglich kann beobachtet werden, dass
unter Verwendung der in 8 gezeigten analytischen Kurve
Schätzungen
vorgenommen werden können.
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Folglich
können
in Übereinstimmung
mit der Erfindung bei einer Mutation an einer doppelsträngigen DNA,
an welche ein ionisches Polymer, wie etwa ein Protein bindet, die
Assoziationskonstante (KA-Wert) und die Dissoziationskonstante (KD-Wert), die
Indikatoren der Struktur und Funktion der Mutation sind, umfangreich
und wirksam abgeschätzt
werden. Insbesondere ermöglicht
die Erfindung, grobe Assoziations- und Dissoziationskonstanten in
einer Reihe von Mutanten zu bestimmen, bei denen eine einzelne Basensubstitution,
wie etwa SNP, stattgefunden hat, auf eine einfache und schnelle
Weise. Folglich kann die Erfindung Werkzeuge zur Arzneimittelentwicklung
und/oder zu medizinischen Untersuchungen verfügbar machen.