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Hintergrund
der Erfindung
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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft ein chemisches Lumineszenzverfahren zum Nachweisen
eines markierten Rezeptors oder eines markierten Liganden mit einer
chemischen Lumineszenztechnik. Diese Erfindung betrifft insbesondere
ein chemisches Lumineszenzverfahren, bei dem ein markierter Rezeptor
oder ein markierter Ligand durch die Verwendung einer biochemischen
Analyseeinheit, die mit porösen
adsorptionsfähigen
Bereichen ausgestattet ist, mit einer chemischen Lumineszenztechnik
nachgewiesen wird.
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Beschreibung
des Stands der Technik
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Bei
Mikroarray-Analysesystemen und Makroarray-Analysesystemen werden
Flüssigkeiten,
die spezifische Bindungssubstanzen enthalten (d. h. die Substanzen,
die in der Lage sind, spezifisch an aus Organismen stammende Substanzen
zu binden, und deren Basensequenzen, Basenlängen, Zusammensetzungen, charakteristische
Eigenschaften und dergleichen bekannt sind), auf unterschiedliche
Stellen auf einer Oberfläche
einer biochemischen Analyseeinheit, wie einem Membranfilter, getupft,
wodurch auf der Oberfläche
der biochemischen Analyseeinheit eine Mehrzahl tupfenförmiger Bereiche
ausgebildet wird. Zu Beispielen der spezifischen Bindungssubstanzen
gehören
Hormone, Tumor-Marker, Enzyme, Antikörper, Antigene, Abzyme, andere
Proteine, Nucleinsäuren,
cDNA's, DNA's und RNA's. Danach wird eine
aus einem Organismus stammende Substanz, die mit einer radioaktiven
Markierungssubstanz, einer fluoreszierenden Markierungssubstanz,
einer Markierungsubstanz, die in der Lage ist, chemische Lumineszenz
zu erzeugen, wenn sie mit einem chemischen Lumineszenz-Substrat
in Berührung
gebracht wird, oder dergleichen markiert wurde, einer Hybridisierung,
oder dergleichen, mit den spezifischen Bindungssubstanzen, die in
den tupfenförmigen
Bereichen der biochemischen Analyseeinheit enthalten sind, unterzogen.
Die aus einem Organismus stammende Substanz wird so spezifisch an
eine der spezifischen Bindungssubstanzen, die in den tupfenförmigen Bereichen der
biochemischen Analyseeinheit enthalten sind, gebunden. Die aus einem
Organismus stammende Substanz ist die Substanz, die durch Entnahme,
Isolierung oder dergleichen aus einem Organismus als Probe entnommen
wurde, oder die, nachdem sie als Probe genommen wurde, einer chemischen
Behandlung unterzogen wurde, und die mit der radioaktiven Markierungssubstanz,
der fluoreszierenden Markierungssubstanz, der Markierungssubstanz,
die in der Lage ist, die chemische Lumineszenz zu erzeugen, wenn
sie mit einem chemischen Lumineszenz-Substrat in Berührung gebracht
wird, oder dergleichen, markiert wurde. Zu Beispielen für die aus
Organismen stammenden Substanzen gehören Hormone, Tumor-Marker,
Enzyme, Antikörper,
Antigene, Abzyme, andere Proteine, Nucleinsäuren, DNA's und mRNA's.
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In
Fällen,
in denen die aus einem Organismus stammende Substanz mit der radioaktiven
Markierungssubstanz markiert wurde, wird dann eine stimulierbare
Leuchtstoffschicht eines stimulierbaren Leuchtstoff-Flachmaterials
einer Strahlung ausgesetzt, die von der radioaktiven Markierungssubstanz,
die selektiv in dem tupfenförmigen
Bereich der biochemischen Analyseeinheit enthalten ist, ausgestrahlt
wird. Danach wird die stimulierbare Leuchtstoffschicht stimulierenden
Strahlen ausgesetzt, die die stimulierbare Leuchtstoffschicht dazu
veranlassen, Licht im Verhältnis
zur Menge an Energie, die während
der Strahlungsexposition der stimulierbaren Leuchtstoffschicht in
der stimulierbaren Leuchtstoffschicht gespeichert wurde, zu emittieren. Das
von der stimulierbaren Leuchtstoffschicht emittierte Licht wird
photoelektrisch nachgewiesen, und dadurch werden Daten für eine biochemische
Analyse erhalten.
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In
Fällen,
in denen die aus einem Organismus stammende Substanz mit der fluoreszierenden
Markierungssubstanz markiert wurde, wird Anregungslicht auf die
tupfenförmigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit eingestrahlt, und die
fluoreszierende Markierungssubstanz, die selektiv in dem tupfenförmigen Be reich
der biochemischen Analyseeinheit enthalten ist, wird durch das Anregungslicht
angeregt, um Fluoreszenz zu erzeugen. Die so erzeugte Fluoreszenz
wird photoelektrisch nachgewiesen, und dadurch werden Daten für eine biochemische
Analyse erhalten.
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In
Fällen,
in denen die aus einem Organismus stammende Substanz mit der Markierungssubstanz,
die in der Lage ist, die chemische Lumineszenz zu erzeugen, wenn
sie mit einem chemischen Lumineszenz-Substrat in Berührung gebracht
wird, markiert wurde, wird die Markierungssubstanz, die selektiv
in dem tupfenförmigen
Bereich der biochemischen Analyseeinheit enthalten ist, mit dem
chemischen Lumineszenz-Substrat in Berührung gebracht. Auch wird die
chemische Lumineszenz, die von der Markierungssubstanz erzeugt wird, photoelektrisch
nachgewiesen, und dadurch werden Daten für eine biochemische Analyse
erhalten.
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Bisher
wurden mit den Analysesystemen, die die biochemischen Analyseeinheiten
verwenden, die Hybridisierung, oder dergleichen, gewöhnlich mit
einer Schütteltechnik
durchgeführt.
Bei der Schütteltechnik
gibt der Experimentator manuell eine biochemische Analyseeinheit,
auf der spezifische Bindungssubstanzen fixiert wurden, in eine Hybridisierungstasche
und gibt eine Reaktionsflüssigkeit,
die eine aus einem Organismus stammende Substanz, die markiert wurde,
enthält,
in die Hybridisierungstasche hinein. Der Experimentator gibt auch
manuell Schwingungen auf die Hybridisierungstasche, und die markierte,
aus einem Organismus stammende Substanz wird so durch Konvektion
oder Diffusion bewegt. Auf diese Weise wird die markierte, aus einem
Organismus stammende Substanz spezifisch an eine der spezifischen
Bindungssubstanzen, die an der biochemischen Analyseeinheit fixiert
wurden, gebunden. Danach wird die biochemische Analyseeinheit aus der
Hybridisierungstasche herausgenommen und in einem mit einer Waschflüssigkeit
gefüllten
Gefäß gewaschen.
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Bei
der oben beschriebenen Schütteltechnik
ist es jedoch nicht immer möglich,
die Hybridisierungs-Reaktionsflüssigkeit
in gleichmäßige Berührung mit
der Mehrzahl von tupfenförmigen
Bereichen, die die spezifischen Bindungssubstanzen enthalten, zu
bringen. Daher tritt das Problem auf, dass die spezifischen Bindungssubstanzen
und die markierte, aus einem Organismus stammende Substanz nicht
effizient der Hybridisierung unterzogen werden können.
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Bei
der oben beschriebenen Schütteltechnik
tritt auch das Problem auf, dass die Ergebnisse der Hybridisierung
für verschiedene
Experimentatoren variieren und die Reproduzierbarkeit gering wird.
Außerdem besteht
das Risiko, dass die Reproduzierbarkeit gering wird, selbst wenn
die Hybridisierung von einem gleichen Experimentator durchgeführt wird.
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Zur
Lösung
der oben beschriebenen Probleme hat der Anmelder ein Verfahren vorgeschlagen,
das durch Anspruch 1 definiert wird, bei dem eine Reaktionsflüssigkeit,
die eine markierte, aus einem Organismus stammende Substanz enthält, erzwungenermaßen veranlaßt wird,
durch absorptionsfähige
Bereiche einer biochemischen Analyseeinheit zu fließen, und
die markierte, aus einem Organismus stammende Substanz so veranlaßt wird,
ausreichend in das Innere der adsorptionsfähigen Bereiche der biochemischen
Analyseeinheit einzudringen, wobei das erzwungene Fließen während einer
Zeitdauer, die länger
ist als die Zeitdauer, während
der die die Substanz enthaltende Reaktionsflüssigkeit zum Fließen gezwungen
wurde, eingestellt wird. Das vorgeschlagene Verfahren ist in der
japanischen Patentanmeldung Nr. 2002-26816 beschrieben.
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Bei
dem Nachweisverfahren, das die chemische Lumineszenztechnik verwendet,
in dem die aus einem Organismus stammende Substanz durch Verwendung
der Markierungssubstanz, die in der Lage ist, die chemische Lumineszenz
zu erzeugen, wenn sie mit einem chemischen Lumineszenz-Substrat
in Berührung gebracht
wird, nachgewiesen wird, ist es notwendig, die unten beschriebenen
Verfahren durchzuführen.
Speziell wird die markierte, aus einem Organismus stammende Substanz
(hierin unten auf dem Gebiet der chemischen Lumineszenztechnik als
der markierte Rezeptor oder der markierte Ligand bezeichnet) einer
spezifischen Bindung mit der spezifischen Bindungssubstanz (hierin
unten auf dem Gebiet der chemischen Lumineszenztechnik als der Ligand
oder der Rezeptor bezeichnet) unterzogen. Ebenso wird ein Antikörper bezüglich der
Substanz, wie ein Antigen, mit dem der markierte Rezeptor oder der
markierte Ligand markiert wurde, mit der Markierungssubstanz wie
einem Enzym, das in der Lage ist, die chemische Lumineszenz zu erzeugen, markiert.
(Der so mar kierte Antikörper
wird hierin unten als der Enzym-markierte Antikörper bezeichnet.) Nachdem der
markierte Rezeptor oder der markierte Ligand in der oben beschriebenen
Weise spezifisch an den Liganden oder den Rezeptor gebunden wurde,
wird der Enzym-markierte Antikörper
der spezifischen Bindung mit dem Antigen des markierten Rezeptors
oder des markierten Liganden unterzogen. Danach werden der Enzym-markierte
Antikörper,
der spezifisch an das Antigen des markierten Rezeptors oder des
markierten Liganden gebunden wurde, und das chemische Lumineszenz-Substrat,
das in der Lage ist, eine spezifische Bindung mit dem Enzym des
Enzym-markierten Antikörpers
einzugehen, miteinander in Berührung
gebracht.
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Bei
der konventionellen chemischen Lumineszenztechnik ist es notwendig,
dass neben den Verfahren für
die biochemische Analyseeinheit, die die fluoreszierende Markierungssubstanz
oder die radioaktive Markierungssubstanz verwendet, die unten beschriebenen
Verfahren durchgeführt
werden. Speziell gibt der Experimentator manuell die biochemische
Analyseeinheit, in der der markierte Rezeptor oder der markierte
Ligand an den adsorptionsfähigen
Bereich gebunden wurde, wieder in eine Hybridisierungstasche. Ebenso
gibt der Experimentator manuell die Reaktionsflüssigkeit, die den Enzym-markierten
Antikörper,
der in der Lage ist, eine spezifische Reaktion mit dem Antigen des
markierten Rezeptors oder des markierten Liganden einzugehen, enthält, in die
Hybridisierungstasche hinein. Außerdem gibt der Experimentator
manuell Schwingungen auf die Hybridisierungstasche, und so wird
der Enzym-markierte Antikörper
durch Konvektion oder Diffusion bewegt. Auf diese Weise wird der
Enzymmarkierte Antikörper
spezifisch an den markierten Rezeptor oder den markierten Liganden
gebunden. Danach wird das chemische Lumineszenz-Substrat mit dem
Enzym-markierten Antikörper,
der an den markierten Rezeptor oder den markierten Liganden spezifisch
gebunden wurde, in Berührung
gebracht und dazu veranlaßt,
mit dem Enzym-markierten Antikörper
zu reagieren.
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Bei
der konventionellen chemischen Lumineszenztechnik, die die Schütteltechnik
verwendet, gibt es jedoch die unten beschriebenen Probleme. Speziell
kann der Enzym-markierte Antikörper
nicht ausreichend ins Innere des adsorptionsfähigen Bereichs der biochemischen
Analyseeinheit eindringen. Daher kann das Verhältnis der Intensität der chemischen
Lumineszenz, die der Menge des markierten Rezeptors oder des markierten
Liganden, die an den adsorptionsfähigen Bereich gebunden wurde,
zur Intensität
der Lumineszenz (Rauschen oder Hintergrund) eines adsorptionsfähigen Bereichs,
an den der markierte Rezeptor oder der markierte Ligand nicht gebunden
wurde, nicht hoch gehalten werden. (Das Signal/Rausch-Verhältnis eines
Signals, das die Intensität
der chemischen Lumineszenz repräsentiert,
wobei die Intensität
der Menge des markierten Rezeptors oder des markierten Liganden,
die an den adsorptionsfähigen
Bereich gebunden wurden, entspricht, zum Rauschen oder Hintergrund
kann nicht hochgehalten werden). Dementsprechend wird es in Fällen, in
denen die Menge des markierten Rezeptors oder des markierten Liganden,
die an den adsorptionsfähigen
Bereich gebunden ist, klein ist (1 Pikogramm oder weniger), schwierig,
dass der markierte Rezeptor oder der markierte Ligand nachgewiesen
wird.
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Es
gibt Stand der Technik, der nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung
veröffentlicht wurde
(EP-A-1 333 284 und EP-A-1 333 283). Dieser Stand der Technik betrifft
ein chemisches Lumineszenzverfahren mit den Merkmalen i)-iv) eines
jeden der Ansprüche
1 und 2. Diese Literaturstellen des Stands der Technik offenbaren
jedoch nicht spezifische Merkmale bezüglich der Zeitspanne, in der
das erzwungene Fließen
stattfindet.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein chemisches Lumineszenzverfahren
bereitzustellen, das eine biochemische Analyseeinheit verwendet,
worin ein Enzym-markierter Antikörper
in der Lage ist, effizient an einen markierten Rezeptor oder an
einen markierten Liganden, der an einen Liganden oder einen Rezeptor,
der an einer biochemischen Analyseeinheit fixiert wurde, gebunden
wurde, gebunden zu werden, und worin Daten mit guter Reproduzierbarkeit
und guten quantitativen Eigenschaften erhalten werden können.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein erstes chemisches Lumineszenzverfahren,
das eine biochemische Analyseeinheit verwendet, bereit, das die
in Anspruch 1 definierten Schritte aufweist.
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Das
erste chemische Lumineszenzverfahren, das eine biochemische Analyseeinheit
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet, weist das Merkmal auf, dass, nachdem die den
Enzym-markierten Antikörper enthaltende
Reaktionsflüssigkeit
erzwungenermaßen
veranlaßt
wurde, so zu fließen,
dass die Reaktionsflüssigkeit
durch jeden der porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit fließt, das erzwungene Fließen während einer
Zeitdauer, die länger
ist als die Zeitdauer, während
der die den Enzym-markierten Antikörper enthaltende Reaktionsschlüssigkeit
zum Fließen
gezwungen wurde, eingestellt wird. In solchen Fällen kann, nachdem die den
Enzym-markierten Antikörper
enthaltende Reaktionsflüssigkeit
zum Fließen
gezwungen wurde, das erzwungene Fließen laufend während der
Zeitdauer, die länger
ist als die Zeitdauer, während
der die den Enzym-markierten Antikörper enthaltende Reaktionsflüssigkeit
zum Fließen
gezwungen wurde, eingestellt werden. Alternativ kann ein Zyklus,
der das erzwungene Fließen
der Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzymmarkierten Antikörper
enthält,
und das Einstellen des Fließens
der Reaktionsflüssigkeit aufweist,
dergestalt wiederholt werden, dass insgesamt das erzwungene Fließen während der
Zeitdauer, die länger
ist als die Zeitdauer, während
der die den Enzym-markierten Antikörper enthaltende Reaktionsflüssigkeit
zum Fließen
gezwungen wurde, eingestellt wird.
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Die
folgende Erfindung stellt auch ein zweites chemisches Lumineszenzverfahren
unter Verwendung einer biochemischen Analyseeinheit bereit, das
die Schritte des Anspruchs 2 aufweist.
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Das
zweite chemische Lumineszenzverfahren, das eine biochemische Analyseeinheit
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet, weist das Merkmal auf, dass, nachdem die den
Enzym-markierten Antikörper enthaltende
Reaktionsflüssigkeit
zum Fließen
gezwungen wurde, so dass die Reaktionsflüssigkeit durch jeden der porösen adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit fließt, das erzwungene Fließen während einer
Zeitdauer, die länger
ist als die Zeitdauer, während
der die den Enzym-markierten Antikörper enthaltende Reaktionsflüssigkeit
zum Fließen
gezwungen wurde, eingestellt wird.
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Bei
dem ersten chemischen Lumineszenzverfahren, das eine biochemische
Analyseeinheit gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet, wird zu der Zeit, zu der der Enzym-markierte
Antikörper
der spezifischen Bindung mit dem markierten Rezeptor oder dem markierten
Liganden, der an mindestens einen der Liganden oder an mindestens
einen der Rezeptoren spezifisch gebunden wurde, unterzogen wird,
die den Enzym-markierten Antikörper
enthaltende Reaktionsflüssigkeit
dergestalt zum Fließen
gezwungen, dass die den Enzym-markierten Antikörper enthaltende Reaktionsflüssigkeit
durch jeden der porösen
adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit fließt. Daher kann der Enzym-markierte
Antikörper
veranlaßt
werden, ausreichend in das Innere eines jeden der adsorptionsfähigen Bereiche
einzudringen. Dementsprechend kann die Nachweisgrenze des markierten
Rezeptors oder des markierten Liganden verbessert werden. Auch in
Fällen,
in denen die Menge des markierten Rezeptors oder des markierten
Liganden klein ist, kann der markierte Rezeptor oder der markierte
Ligand mit einem hohen Signal/Rausch-Verhältnis nachgewiesen werden. Daher
kann der markierte Rezeptor oder der markierte Ligand genau nachgewiesen
werden, und Daten können
mit guter Reproduzierbarkeit und guten quantitativen Eigenschaften
erhalten werden.
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Bei
dem ersten chemischen Lumineszenzverfahren, das eine biochemische
Analyseeinheit gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet (und bei dem zweiten chemischen Lumineszenzverfahren,
das eine biochemische Analyseeinheit gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet), kann, nachdem die den Enzymmarkierten Antikörper enthaltende
Reaktionsflüssigkeit
erzwungenermaßen
veranlaßt
wurde, dergestalt zu fließen,
dass die Reaktionsflüssigkeit
durch jeden der porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit fließt, das erzwungene Fließen während einer
Zeitdauer, die länger
ist als die Zeitdauer, während
der die den Enzym-markierten Antikörper enthaltende Reaktionsflüssigkeit
erzwungenermaßen
zum Fließen
veranlaßt
wurde, eingestellt werden. In solchen Fällen kann die Nachweisgrenze
des markierten Rezeptors oder des markierten Liganden sogar noch
weiter verbessert werden, und der markierte Rezeptor oder der markierte
Ligand kann mit einem hohen Signal/Rausch-Verhältnis nachgewiesen werden.
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Bei
dem zweiten chemischen Lumineszenzverfahren, das eine biochemische
Analyseeinheit gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet, wird zu der Zeit, zu der der markierte Rezeptor
oder der markierte Ligand, der mit der Markierungs substanz markiert
wurde, der spezifischen Bindung mit den Liganden oder den Rezeptoren,
von denen jeder an einen der porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit gebunden wurde, unterzogen
wird, die den markierten Rezeptor oder den markierten Liganden,
der mit der Markierungssubstanz markiert wurde, enthaltende Reaktionsflüssigkeit
erzwungenermaßen
veranlaßt, dergestalt
zu fließen,
dass die den markierten Rezeptor oder den markierten Liganden enthaltende
Reaktionsflüssigkeit
durch jeden der porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit fließt. Auch wird zu der Zeit,
zu der der Enzym-markierte Antikörper
der spezifischen Bindung mit dem markierten Rezeptor oder dem markierten
Liganden, der an mindestens einen der Liganden oder an mindestens
einen der Rezeptoren spezifisch gebunden wurde, unterzogen wird,
die den Enzym-markierten Antikörper
enthaltende Reaktionsflüssigkeit
erzwungenermaßen
veranlaßt,
dergestalt zu fließen,
dass die den Enzym-markierten Antikörper enthaltende Reaktionsflüssigkeit
durch jeden der porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit fließt. Daher können der markierte Rezeptor
oder der markierte Ligand und der Enzym-markierte Antikörper veranlaßt werden,
ausreichend in das Innere eines jeden der adsorptionsfähigen Bereiche
einzudringen. Dementsprechend kann der markierte Rezeptor oder der
markierte Ligand in Fällen,
in denen die Menge des markierten Rezeptors oder des markierten
Liganden klein ist, mit einem hohen Signal/Rausch-Verhältnis nachgewiesen
werden.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine schematische perspektivische Ansicht, die ein Beispiel einer
biochemischen Analyseeinheit zeigt, die in dem chemischen Lumineszenzverfahren
unter Verwendung einer biochemischen Analyseeinheit gemäß der vorliegenden
Erfindung benutzt wird,
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2 ist
eine schematische Schnittansicht, die ein Beispiel eines Reaktionsapparates
zeigt, der für das
chemische Lumineszenzverfahren unter Verwendung einer biochemischen
Analyseeinheit gemäß der vorliegenden
Erfindung benutzt wird, und
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3 ist
eine schematische Schnittansicht, die ein anderes Beispiel eines
Reaktionsapparates zeigt, der für
das chemische Lumineszenzverfahren unter Verwendung einer biochemischen
Analyseeinheit gemäß der vorliegenden
Erfindung benutzt wird.
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Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
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Die
vorliegende Erfindung wird hierin unten unter Bezugnahme auf die
begleitenden Zeichnungen detaillierter beschrieben.
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1 ist
eine schematische perspektivische Ansicht, die ein Beispiel einer
biochemischen Analyseeinheit zeigt, die in dem chemischen Lumineszenzverfahren
unter Verwendung einer biochemischen Analyseeinheit gemäß der vorliegenden
Erfindung benutzt wird. Bezugnehmend auf 1 weist
eine biochemische Analyseeinheit 1 eine Grundplatte 2,
die mit einer Mehrzahl an Löchern 3, 3,
... und mit einer Mehrzahl an adsorptionsfähigen Bereichen 4, 4...,
von denen jeder in eines der Löcher 3, 3,
... gefüllt
ist, ausgestattet ist, auf, und sie weist ein poröses Material,
das an der Grundplatte 2 anhaftet, auf. Jeder der Liganden
oder Rezeptoren, deren Strukturen oder charakteristische Eigenschaften
bekannt sind, wurde auf einen der adsorptionsfähigen Bereiche 4, 4,
... getupft, und wurde dann mittels Behandlung immobilisiert.
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Um
zu verhindern, dass in der biochemischen Analyseinheit 1 eine
Lichtstreuung auftritt, sollte die' Grundplatte 2 bevorzugt aus
einem Material hergestellt sein, das Licht nicht durchläßt, oder
das Licht abschwächt.
Das Material für
die Herstellung der Grundplatte 2 sollte bevorzugt ein
Metall oder ein Keramikmaterial sein. Auch sollten in Fällen, in
denen ein Kunststoffmaterial, für
das die Lochherstellungsbearbeitung leicht durchgeführt werden
kann, als das Material zur Herstellung der Grundplatte 2 benutzt
wird, bevorzugt Teilchen dergestalt in dem Kunststoffmaterial verteilt
werden, dass Licht noch weiter abgeschwächt werden kann.
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Zu
Beispielen der Metalle, die bevorzugt für die Herstellung der Grundplatte 2 verwendet
werden können,
gehören
Kupfer, Silber, Gold, Zink, Blei, Aluminium, Titan, Zinn, Chrom,
Eisen, Nickel, Kobalt, Tantal und Legierungen wie rostfreier Stahl
und Bronze. Zu Beispielen der Keramikmaterialien, die bevorzugt
für die
Herstellung der Grundplatte 2 verwendet werden können, gehören Aluminiumoxid,
Zirkondioxid, Magnesiumoxid und Quarz. Zu Beispielen der Kunststoffmaterialien,
die bevorzugt für
die Herstellung der Grundplatte 2 verwendet werden können, gehören Polyolefine,
wie ein Polyethylen und ein Polypropylen; Polystyrole; Acrylharze,
wie ein Polymethyl-methacrylat: Polyvinylchloride; Polyvinyliden-chloride;
Polyvinyliden-fluoride; Polytetrafluorethylene; Polychlortrifluorethylene;
Polycarbonate; Polyester, wie ein Polyethylen-naphthalat und ein
Polyethylen-terephthalat; aliphatische Polyamide, wie ein 6-Nylon
und ein 6,6-Nylon; Polyimide, Polysulfone; Polyphenylen-sulfide;
Siliciumharze, wie ein Polydiphenyl-siloxan; Phenolharze, wie Novolak;
Epoxyharze; Polyurethane; Cellulosen, wie Cellulose-acetat und Nitrocellulose;
Copolymere, wie ein Butadien-Styrol-Copolymer; und Gemische (blends)
von Kunststoffmaterialien.
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Damit
die Dichte der Löcher 3, 3,
..., die durch die Grundplatte 2 gemacht wurden, erhöht werden
kann, kann die Fläche
(Größe) der Öffnung eines
jeden der Löcher 3, 3,
... gewöhnlich
kleiner als 5 mm2 sein. Die Fläche der Öffnung eines
jeden der Löcher 3, 3,
... sollte bevorzugt kleiner als 1 mm2 sein,
sollte bevorzugter kleiner als 0,3 mm2 sein,
und sollte am meisten bevorzugt kleiner als 0,01 mm2 sein.
Auch sollte die Fläche
der Öffnung
eines jeden der Löcher 3, 3,
... bevorzugt mindestens 0,001 mm2 betragen.
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Die
Entfernung der Löcher 3, 3,
... (d. h., der Abstand zwischen den Mittelpunkten von zwei Löchern, die
einander benachbart sind) sollte bevorzugt in den Bereich von 0,05
mm bis 3 mm fallen. Auch sollte der Zwischenraum zwischen zwei benachbarten
Löchern 3, 3,
(d. h., der kürzeste
Abstand zwischen den Rändern von
zwei benachbarten Löchern 3, 3,)
bevorzugt in den Bereich von 0,01 mm bis 1,5 mm fallen. Die Anzahl (die
Array-Dichte) der Löcher 3, 3,
... kann gewöhnlich
mindestens zehn Löcher/cm2 sein. Die Anzahl (die Array-Dichte) der
Löcher 3, 3,
.... sollte bevorzugt mindestens 100 Löcher/cm2 sein, sollte bevorzugter
mindestens 500 Löcher/cm2 sein, und sollte am meisten bevorzugt mindestens
1000 Löcher/cm2 sein. Auch sollte die Anzahl (die Array-Dichte)
der Löcher 3, 3,
... bevorzugt höchstens
100.000 Löcher/cm2 sein, und sollte bevorzugter höchstens
10.000 Löcher/cm2 sein. Die Löcher 3, 3,
... brauchen nicht not wendigerweise mit gleichen Zwischenräumen angeordnet
sein, wie in 1 veranschaulicht. Beispielsweise
können
die Löcher 3, 3,
... in mehrere Anzahlen von Blöcken
(Einheiten), die eine Mehrzahl von Löchern aufweisen, gruppiert
werden, und sie können
in Einheiten der Blöcke
ausgebildet sein.
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Bei
dem chemischen Lumineszenzverfahren unter Verwendung einer biochemischen
Analyseeinheit gemäß der vorliegenden
Erfindung kann als das poröse
Material zur Herstellung der adsorptionsfähigen Bereiche der biochemischen
Analyseeinheit bevorzugt ein Material von poröser Beschaffenheit oder ein
Fasermaterial verwendet werden. Das Material von poröser Beschaffenheit
und das Fasermaterial können
in Kombination verwendet werden, um die adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit zu bilden. Bei dem chemischen Lumineszenzverfahren
unter Verwendung einer biochemischen Analyseeinheit gemäß der vorliegenden
Erfindung kann das poröse
Material, das zur Herstellung der adsorptionsfähigen Bereiche der biochemischen
Analyseeinheit verwendet werden kann, ein organisches Material,
ein anorganisches Material oder ein organisch-anorganisches Verbundmaterial
sein.
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Das
organische Material von poröser
Beschaffenheit, das zur Herstellung der adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit verwendet werden kann, kann aus
einer breiten Vielfalt von Materialien ausgewählt werden. Das organische
Material von poröser
Beschaffenheit sollte jedoch bevorzugt ein Kohlenstoffmaterial von
poröser
Beschaffenheit, wie Aktivkohle, oder ein Material von poröser Beschaffenheit, das
in der Lage ist, einen Membranfilter zu bilden, sein. Als das Material
von poröser
Beschaffenheit, das in der Lage ist, einen Membranfilter zu bilden,
sollte bevorzugt ein in einem Lösungsmittel
lösliches
Polymer verwendet werden. Zu Beispielen der Polymere, die in einem
Lösungsmittel
löslich
sind, gehören
Cellulose-Derivate, wie Nitrocellulose, Regeneratcellulose, Cellulose-acetat
und Cellulose-acetat-butyrat; aliphatische Polyamide, wie ein 6-Nylon,
ein 6,6-Nylon und ein 4,10-Nylon; Polyolefine, wie ein Polyethylen
und Polypropylen; Chlor enthaltende Polymere, wie ein Polyvinylchlorid
und ein Polyvinyliden-chlorid; Fluorharze, wie ein Polyvinyliden-fluorid
und ein Polytetrafluorid; Polycarbonate; Polysulfone; Alginsäuren und
Alginsäure-Derivate,
wie Alginsäure,
Calciumalginat und ein Alginsäure-Polylysin-Polyion-Komplex;
und Collagen. Copolymere oder Verbundmaterialien (Gemischtmaterialien)
der oben aufgezählten
Polymere können
ebenfalls verwendet werden.
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Das
Fasermaterial, das zur Herstellung der adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit verwendet werden kann, kann aus
einer breiten Vielfalt von Materialien ausgewählt werden. Zu Beispielen der
Fasermaterialien, die bevorzugt verwendet werden können, gehören die
Cellulose-Derivate und die aliphatischen Polyamide, die oben aufgezählt sind.
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Das
anorganische Material von poröser
Beschaffenheit, das zur Herstellung der adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit verwendet werden kann, kann aus
einer breiten Vielfalt von Materialien ausgewählt werden. Zu Beispielen der
anorganischen Materialien von poröser Beschaffenheit, die bevorzugt
verwendet werden können,
gehören
Metalle, wie Platin, Gold, Eisen, Silber, Nickel und Aluminium;
Oxide von Metallen und dergleichen, wie Aluminiumoxid, Siliciumoxid,
Titanoxid und Zeolith; Metallsalze, wie Hydroxyapatit und Calciumsulfat;
und Verbundmaterialien der oben aufgezählten Materialien.
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Die
Lochung der Mehrzahl der Löcher 3, 3,
... durch die Grundplatte 2 kann beispielsweise mit einer Stanztechnik
zum Stanzen mit einem Zapfen, einer Technik zur Bearbeitung durch
elektrische Entladung, in der eine gepulste Hochspannung an den
Elektroden angelegt wird, um das Grundplattenmaterial zu verflüchtigen,
einer Ätztechnik
oder einer Laserstrahl-Bestrahlungstechnik durchgeführt werden.
In Fällen,
in denen das Material der Grundplatte ein Metallmaterial oder ein
Kunststoffmaterial ist, kann die biochemische Analyseeinheit mit
einem Vorgang zur Durchführung
einer Koronaentladung oder einer Plasmaentladung auf der Oberfläche der
Grundplatte, Aufbringen eines Klebstoffs auf die Oberfläche der
Grundplatte, und Laminieren des porösen Materials zur Ausbildung
der adsorptionsfähigen
Bereiche mittels einer Einrichtung wie einer Presse, hergestellt
werden. Zum Zeitpunkt der Laminierung kann das poröse Material
zur Ausbildung der adsorptionsfähigen
Bereiche erhitzt und erweicht werden, so dass die adsorptionsfähigen Bereiche
innerhalb der Löcher
leicht ausgebildet werden können.
Ebenso können
in Fällen,
in denen das poröse
Material zur Ausbildung der adsorptionsfähigen Bereiche gegen die Grundplatte
gepreßt
wird, die Grundplatte und das poröse Material zur Ausbildung
der adsorptionsfähigen
Bereiche vorher in eine Mehrzahl von Flachmaterialien aufgeteilt
werden, und die Mehrzahl der Flachmaterialien kann mit Unterbrechungen
gepreßt
werden. Alternativ können
eine lange Bahn der Grundplatte und eine lange Bahn des porösen Materials
zur Ausbildung der adsorptionsfähigen
Bereiche kontinuierlich zwischen zwei Walzen transportiert werden.
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In
dem chemischen Lumineszenzverfahren unter Verwendung einer biochemischen
Analyseeinheit gemäß der vorliegenden
Erfindung kann die biochemische Analyseeinheit verwendet werden,
die durch Verwendung des Materials und der Technik, die oben beschrieben
wurden, hergestellt wurde. Alternativ kann eine im Handel erhältliche
biochemische Analyseeinheit verwendet werden. Es ist auch möglich, eine
biochemische Analyseeinheit zu verwenden, in der die Liganden bzw.
die Rezeptoren bereits an die porösen adsorptionsfähigen Bereiche
gebunden wurden.
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2 ist
eine schematische Schnittansicht, die ein Beispiel eines Reaktionsapparats
(einer Reaktionsvorrichtung), der für das chemische Lumineszenzverfahren
unter Verwendung einer biochemischen Analyseeinheit gemäß der vorliegenden
Erfindung benutzt wird, zeigt. Bezugnehmend auf 2 weist
der Reaktionsapparat ein Reaktionsgefäß 10 und eine Strömungseinrichtung 20 auf.
Das Reaktionsgefäß 10 weist
eine Reaktionsgefäß-Oberhälfte 13 und
eine Reaktionsgefäß-Unterhälfte 14 auf.
Die Reaktionsgefäß-Oberhälfte 13 ist
lösbar
an der Reaktionsgefäß-Unterhälfte 14 befestigt.
Auch ist das Reaktionsgefäß 10 mit
einem Halteabschnitt zum lösbar
Halten der biochemischen Analyseeinheit 1 in dem Reaktionsgefäß 10 ausgestattet,
wobei die biochemische Analyseeinheit 1 mit der Mehrzahl
der porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche, an die die Liganden bzw. die Rezeptoren gebunden wurden,
ausgestattet ist. Der Halteabschnitt weist ein oberes Halteteil 11 und
ein unteres Halteteil 12 auf. Wenn die biochemische Analyseeinheit 1 in
das Reaktionsgefäß 10 eingesetzt
werden soll, wird die Reaktionsgefäß-Oberhälfte 13 von der Reaktionsgefäß-Unterhälfte 14 abmontiert, und
die biochemische Analyseeinheit 1 wird auf das untere Halteteil 12 gesetzt.
Eine Unterseitenwandung der Reaktionsgefäß-Unterhälfte 14 ist mit einem
Reaktionsflüssigkeit-Einlaß 15,
durch den eine Reaktionsflüssigkeit
fließen
kann, ausgestattet. Auch ist eine Oberseitenwandung der Reaktionsgefäß-Oberhälfte 13 mit
einem Reaktionsflüssigkeit-Auslaß 16,
durch den die Reaktionsflüssigkeit
fließen
kann, ausgestattet.
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Die
Strömungseinrichtung 20 weist
eine Reaktionsflüssigkeit-Zirkulationsleitung 21 und
eine Pumpe 22 auf. Ein Ende der Reaktionsflüssigkeit-Zirkulationsleitung 21 ist
lösbar
an dem Reaktionsflüssigkeit-Einlaß 15 des
Reaktionsgefäßes 10 angebracht.
Das andere Ende der Reaktionsflüssigkeit-Zirkulationsleitung 21 ist lösbar an
dem Reaktionsflüssigkeit-Auslaß 16 des
Reaktionsgefäßes 10 angebracht.
Die Reaktionsflüssigkeit wird
von der Pumpe 22 durch den Reaktionsflüssigkeits-Einlaß 15 in
das Reaktionsgefäß 10 eingeführt. In
dem Reaktionsgefäß 10 wird
die Reaktionsflüssigkeit
erzwungenermaßen
dergestalt zum Fließen
veranlaßt,
dass die Reaktionsflüssigkeit
durch jeden der adsorptionsfähigen
Bereiche 4, 4, ... der biochemischen Analyseeinheit 1 fließt. Danach
wird die Reaktionsflüssigkeit
durch den Reaktionsflüssigkeits-Auslaß 16 entlassen,
geht durch die Reaktionsflüssigkeits-Zirkulationsleitung 21 hindurch
und zirkuliert durch das Reaktionsgefäß 10.
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3 ist
eine schematische Schnittansicht, die ein anderes Beispiel eines
Reaktionsapparats, der für das
chemische Lumineszenzverfahren unter Verwendung einer biochemischen
Analyseeinheit gemäß der vorliegenden
Erfindung benutzt wird, zeigt. Der in 3 veranschaulichte
Reaktionsapparat ist grundsätzlich
in derselben Weise wie derjenigen für den Reaktionsapparat von 2 aufgebaut,
außer
dass anstelle der Pumpe 22 eine Spritze 23 und
ein Kolben 24 verwendet werden und die Reaktionsflüssigkeit
dazu veranlaßt
wird, ein Hin- und Herfließen
in dem Reaktionsgefäß einzugehen.
Wie in den Fällen
des in 3 veranschaulichten Reaktionsapparats kann das
erzwungene Fließen
der Reaktionsflüssigkeit
so durchgeführt
werden, dass die Reaktionsflüssigkeit
durch jeden der adsorptionsfähigen
Bereiche 4, 4, ... der biochemischen Analyseeinheit 1 hin-
und herfließt.
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In
den Beispielen der Reaktionsapparate, die in 2 und 3 veranschaulicht
sind, wird die Reaktionsflüssigkeit
durch die biochemische Analyseeinheit 1 zirkuliert. Alternativ
kann ein Reaktionsapparat verwendet werden, in dem die Reaktionsflüssigkeit
nur von unten (oder von oben) durch die biochemische Analyseeinheit 1 hindurchgeht
und nicht zirkuliert wird.
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Wie
das chemische Lumineszenzverfahren unter Verwendung einer biochemischen
Analyseeinheit gemäß der vorliegenden
Erfindung durchgeführt
wird, wird hierin unten beschrieben werden.
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In
dem chemischen Lumineszenzverfahren unter Verwendung einer biochemischen
Analyseeinheit gemäß der vorliegenden
Erfindung werden zuerst die Liganden oder die Rezeptoren jeweils
an die adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit, die mit der Mehrzahl
der porösen
adsorptionsfähigen Bereiche
ausgestattet ist, gebunden.
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Zu
Beispielen für
die Liganden oder die Rezeptoren, die jeweils an die porösen adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit gebunden sind, gehören Hormone,
Tumor-Marker, Enzyme, Antikörper,
Antigene, Abzyme, andere Proteine, Nucleinsäuren, cDNA's, DNA's und RNA's, deren Eigenschaften, Zusammensetzungen,
Strukturen, Basensequenzen, Basenlängen und dergleichen bekannt
sind. Nachdem die Liganden oder die Rezeptoren jeweils auf die adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit getupft wurden, sind die Liganden
oder die Rezeptoren in der Lage, mit Ultraviolettlicht-Bestrahlung
oder dergleichen an den adsorptionsfähigen Bereichen fixiert zu
werden. In Fällen,
in denen die vorgenannte biochemische Analyseeinheit, in der die
Liganden oder die Rezeptoren bereits jeweils an die porösen adsorptionsfähigen Bereiche
gebunden wurden, verwendet wird, werden die Schritte des Auftupfens
und Fixierens der Liganden oder der Rezeptoren weggelassen.
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Danach
wird ein markierter Rezeptor oder ein markierter Ligand, der mit
einer Markierungssubstanz markiert wurde, der spezifischen Bindung
mit den Liganden oder den Rezeptoren, von denen jeder an einen der
porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit gebunden wurde, unterzogen. Der
markierte Rezeptor oder der markierte Ligand wird so spezifisch
an mindestens einen der Liganden oder an mindestens einen der Rezeptoren
gebunden. Der markierte Rezeptor oder der markierte Ligand ist die
Substanz, die durch Entnahme, Isolierung oder dergleichen aus einem
Organismus als Probe genommen wurde, oder die nach der Probennahme
einer chemischen Behandlung unterzogen wurde, und die mit der Markierungssubstanz
markiert wurde.
-
Der
markierte Rezeptor oder der markierte Ligand ist in der Lage, mit
mindestens einem der Liganden, von denen jeder an einen der porösen adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit gebunden wurde, oder mit mindestens
einem der Rezeptoren, von denen jeder an einen der porösen adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit gebunden wurde, die spezifische
Bindung einzugehen. Zu Beispielen für die markierten Rezeptoren
oder die markierten Liganden gehören
Hormone, Tumor-Marker, Enzyme, Antikörper, Antigene, Abzyme, andere
Proteine, Nucleinsäuren,
DNA's und mRNA's. Zu Beispielen
bevorzugter Markierungssubstanzen, mit denen die Rezeptoren oder
die Liganden markiert werden können,
gehören
Antigene, wie Digoxigenin, Biotin, Avidin und Fluorescein, und Antikörper zu
den oben aufgezählten
Antigenen.
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Es
sollte bevorzugt verhindert werden, dass die Probleme auftreten,
dass anstelle des markierten Rezeptors oder des markierten Liganden,
die der spezifischen Bindung mit den Liganden oder den Rezeptoren, die
jeweils an die porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche gebunden wurden, unterzogen werden, der markierte Rezeptor
oder der markierte Ligand direkt an die adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit gebunden oder an an ihnen adsorbiert
wird. Zu solchen Zwecken sollte bevorzugt ein Blockierungsmittel mit
den adsorptionsfähigen
Bereichen der biochemischen Analyseeinheit in Berührung gebracht
werden, bevor die Reaktionflüssigkeit,
die den markierten Rezeptor oder den markierten Liganden enthält, mit
der biochemischen Analyseeinheit in Berührung gebracht wird. Wie in
den Fällen
eines Enzym-markierten Antikörpers, der
später
beschrieben werden wird, sollte das Blockierungsmittel vor der Verwendung
bevorzugt einer Filtration unterzogen werden.
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Nachdem
der markierte Rezeptor oder der markierte Ligand spezifisch an mindestens
einen der Liganden, von denen jeder an einen der porösen adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit gebunden wurde, oder an mindestens
einen der Rezeptoren, von denen jeder an einen der porösen adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit gebunden wurde, gebunden wurde,
wird die biochemische Analyseeinheit in, beispielsweise, das Reaktionsgefäß, das in 2 oder 3 veranschaulicht ist,
und in dem die Reaktionsflüssigkeit
erzwungenermaßen
veranlaßt
werden kann, so zu fließen,
dass die Reaktionsflüssigkeit
durch jeden der adsorptionsfähigen
Berei che der biochemischen Analyseeinheit fließt, eingesetzt. In Fällen, in
denen der markierte Rezeptor oder der markierte Ligand eine Substanz
ist, wie eine markierte DNA, die die adsorptionsfähigen Bereiche
nicht verstopft, kann das Einsetzen der biochemischen Analyseeinheit
in das Reaktionsgefäß in der
Phase durchgeführt
werden, in der der markierte Rezeptor oder der markierte Ligand
der spezifischen Bindung mit den Liganden oder den Rezeptoren, die
jeweils an die porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche gebunden wurden, unterzogen wird. In solchen Fällen kann
der markierte Rezeptor oder der markierte Ligand effizient und gleichmäßig mit
den Liganden oder den Rezeptoren, die jeweils an die porösen adsorptionsfähigen Bereiche
gebunden wurden, in Berührung
gebracht werden. Daher kann die Nachweisgrenze des markierten Rezeptors
oder des markierten Liganden verbessert werden. Auch in Fällen, in
denen die Menge des markierten Rezeptors oder des markierten Liganden
klein ist, kann der markierte Rezeptor oder der markierte Ligand
mit einem hohen Signal/Rausch-Verhältnis nachgewiesen werden.
-
Außerdem können die
Vorgänge,
die von der Phase, in der der markierte Rezeptor oder der markierte Ligand
der spezifischen Bindung mit den Liganden oder den Rezeptoren, die
jeweils an die porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche gebunden wurden, unterzogen wird, bis zu der Phase, in
der der Enzym-markierte Antikörper
der spezifischen Bindung mit dem markierten Rezeptor oder dem markierten
Liganden, der spezifisch an mindestens einen der Liganden oder mindestens
einen der Rezeptoren gebunden wurde, unterzogen wird, reichen, mit
den Techniken zum erzwungenermaßen
Veranlassen der Reaktionsflüssigkeit,
die den markierten Rezeptor oder den markierten Liganden enthält, durch
jeden der adsorptionsfähigen
Bereiche zu fließen,
und zum erzwungenermaßen
Veranlassen der Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzym-markierten Antikörper
enthält, durch
jeden der adsorptionsfähigen
Bereiche zu fließen,
durchgeführt
werden. Daher können
die Prozesse vereinfacht werden und ein genauer Nachweis durchgeführt werden.
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Wie
oben beschrieben, kann der Schritt des Unterziehens des markierten
Rezeptors oder des markierten Liganden der spezifischen Bindung
mit den Liganden oder Rezeptoren, die jeweils an die porösen adsorptionsfähigen Bereiche
gebunden wurden, mit der Technik zum erzwungenermaßen Veranlassen
der Re aktionsflüssigkeit,
die den markierten Rezeptor oder den markierten Liganden enthält, durch
jeden der adsorptionsfähigen
Bereiche zu fließen,
unter Verwendung beispielsweise des in 2 oder 3 veranschaulichten Reaktionsgefäßes durchgeführt werden.
In solchen Fällen
kann der Schritt des in Berührung
Bringens des Blockierungsmittels mit den adsorptionsfähigen Bereichen
der biochemischen Analyseeinheit, wobei der Schritt vor dem Schritt
des Unterziehens des markierten Rezeptors oder des markierten Liganden
der spezifischen Bindung mit den Liganden oder den Rezeptoren, die
jeweils an die porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche gebunden wurden, durchzuführen ist, ebenfalls mit der
Technik zum erzwungenermaßen
Veranlassen, unter Verwendung des Reaktionsgefäßes, der Reaktionsflüssigkeit,
die das Blockierungsmittel enthält,
zu fließen, durchgeführt werden.
In solchen Fällen
können
die Prozesse vereinfacht werden. Auch können genaue Daten mit guter
Reproduzierbarkeit und guten quantitativen Eigenschaften erhalten
werden.
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Damit
der markierte Rezeptor oder der markierte Ligand, der nicht an die
Liganden oder Rezeptoren, die jeweils an die porösen adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit gebunden wurden, spezifisch gebunden
wurde, entfernt wird, sollte die biochemische Analyseeinheit, die
in das Reaktionsgefäß eingesetzt
wurde, bevorzugt mit einer Technik zum erzwungenermaßen Veranlassen
einer Waschflüssigkeit, durch
jeden der adsorptionsfähigen
Bereiche zu fließen,
gewaschen werden. In solchen Fällen
kann, da die Waschflüssigkeit
erzwungenermaßen
veranlaßt
wird, durch jeden der adsorptionsfähigen Bereiche zu fließen, der
markierte Rezeptor oder der markierte Ligand, der nicht an die Liganden
oder die Rezeptoren, die jeweils an die porösen adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit gebunden wurden, spezifisch gebunden
wurde, effizient abgelöst
und entfernt werden. Daher kann die Wasch-Effizienz beträchtlich
verbessert werden.
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Nachdem
die Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzym-markierten Antikörper
enthält,
erzwungenermaßen veranlaßt wurde,
so zu fließen,
dass die Reaktionsflüssigkeit
durch jeden der adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit fließt, und der Enzym-markierte
Antikörper
so der spezifischen Bindung mit dem markierten Rezeptor oder dem
markierten Liganden unterzogen wurde, kann der Enzym-markierte Antikörper, der
nicht spezifisch an den markierten Rezeptor oder den markierten
Liganden gebunden wurde, entfernt werden. In Fällen, in denen der Enzym-markierte
Antikörper,
der nicht spezifisch an den markierten Rezeptor oder den markierten
Liganden gebunden wurde, entfernt werden soll, sollte bevorzugt
der oben beschriebene Waschprozeß durchgeführt werden. Auf diese Weise
kann der Enzym-markierte Antikörper,
der nicht spezifisch an den markierten Rezeptor oder den markierten
Liganden gebunden wurde, effizient abgelöst und entfernt werden. Daher
kann die Wasch-Effizienz beträchtlich
verbessert werden.
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Bevor
der Enzym-markierte Antikörper
der spezifischen Bindung mit dem markierten Rezeptor oder dem markierten
Liganden, der an mindestens einen der Liganden, von denen jeder
an einen der porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit gebunden wurde, oder mindestens
einen der Rezeptoren, von denen jeder an einen der porösen adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit gebunden wurde, spezifisch gebunden
wurde, unterzogen wird, sollte der Enzym-markierte Antikörper bevorzugt
einer Filtration unter Verwendung eines Filters mit einem Porendurchmesser,
der kleiner als der Porendurchmesser der adsorptionsfähigen Bereiche
ist, unterzogen werden. Da der Enzym-markierte Antikörper zum
Agglomerieren neigt, besteht das Risiko, dass der Enzym-markierte
Antikörper
die porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche verstopft. In Fällen
jedoch, in denen der Enzym-markierte Antikörper in der oben beschriebenen
Weise der Filtration unterzogen wird, kann der Enzym-markierte Antikörper ausreichend
ins Innere eines jeden der adsorptionsfähigen Bereiche eindringen.
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Der
Porendurchmesser der adsorptionsfähigen Bereiche kann mit einem
automatischen Porenmeßsystem,
geliefert von Porous Materials Inc., für poröses Material gemessen werden.
Der Porendurchmesser der adsorptionsfähigen Bereiche kann in der
unten beschriebenen Weise gemessen werden. Speziell wird ein poröser adsorptionsfähiger Bereich
mit einer Testflüssigkeit
befeuchtet. Auch wird dem befeuchteten, porösen adsorptionsfähigen Bereich
Luft zugeführt,
und der Luftdruck wird allmählich
erhöht.
Auf diese Weise wird eine Luft-Durchdringungs-Strömungsrate
gemessen. (So wird eine Naß-Strömungsraten-Kurve
gebildet.) Außerdem
wird die Luft-Durchdringungs-Strömungsrate
bei demselben Druck in dem Zustand, in dem der adsorptionsfähige Bereich
nicht mit der Testflüssigkeit
befeuchtet ist, gemessen. (So wird eine Trocken-Strömungsraten-Kurve gebildet.)
Die Naß-Strömungsrate
und die Trocken-Strömungsrate
werden dann miteinander verglichen. (Speziell wird der Druck gefunden,
der zu einem Punkt gehört,
an dem sich eine Kurve mit einer Steigung, die die Hälfte der
Steigung der Trocken-Strömungsratenkurve
beträgt,
und die Naß-Strömungsraten-Kurve schneiden.)
Dann kann ein mittlerer Porendurchmesser aus einer Beziehung zwischen
dem Druck und dem Porendurchmesser berechnet werden. Gewöhnlich wird
der Porendurchmesser des Filters zum Filtern des Enzymmarkierten
Antikörpers
dementsprechend definiert, ob Teilchen mit einer bestimmten Größe durch
den Filter hindurchgehen können
oder nicht. Daher kann zum Filtern des Enzym-markierten Antikörpers ein
Filter ausgewählt
und verwendet werden, der einen kleineren Porendurchmesser als den
Porendurchmesser der adsorptionsfähigen Bereiche, der in der
oben beschriebenen Weise gemessen wurde, hat. Der Porendurchmesser
des ausgewählten
Filters sollte bevorzugt höchstens
die Hälfte
des Porendurchmessers der adsorptionsfähigen Bereiche betragen.
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Danach
wird die Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzym-markierten Antikörper
enthält,
erzwungenermaßen
zum Fließen
veranlaßt,
so dass die Reaktionsflüssigkeit
durch jeden der adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit fließt, und der Enzym-markierte
Antikörper
wird so der spezifischen Bindung mit dem markierten Rezeptor oder
dem markierten Liganden unterzogen. Nachdem die Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzym-markierten Antikörper
enthält,
erzwungenermaßen
veranlaßt
wurde, so zu fließen,
dass die Reaktionsflüssigkeit
durch jeden der porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit fließt, sollte das erzwungene Fließen bevorzugt
während
einer Zeitdauer, die länger
ist als die Zeitdauer, während der
die Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzym-markierten Antikörper
enthält,
erzwungenermaßen
zum Fließen veranlaßt wurde,
eingestellt werden. Die Zeitdauer, während der die Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzym-markierten Antikörper
enthält,
erzwungenermaßen
zum Fließen
veranlaßt
wird, und die Zeitdauer, während
der das erzwungene Fließen
eingestellt wird, kann entsprechend der Art des Liganden oder des
Rezeptors, der Art des markierten Rezeptors oder des markierten
Liganden, der Menge des Liganden oder des Rezeptors, der Menge des
markierten Rezeptors oder des markierten Liganden, und dergleichen
variieren. In Fällen
jedoch, in denen die Zeitdauer, während der die Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzym-markierten Antikörper
enthält,
erzwungenermaßen
zum Fließen
veranlaßt
wird, in den Bereich von einer Minute bis zu 30 Minuten fällt, sollte
die Zeitdauer, während
der das erzwungene Fließen
eingestellt wird, bevorzugt in den Bereich von 30 Minuten bis zu
einer Stunde fallen. Alternativ kann ein Zyklus, der das erzwungene
Fließen
der Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzym-markierten Antikörper
enthält,
und das Einstellen des Fließens
der Reaktionsflüssigkeit aufweist,
wiederholt werden. Speziell kann beispielsweise das erzwungene Fließen der
Reaktionsflüssigkeit, die
den Enzym-markierten Antikörper
enthält,
eine Minute lang durchgeführt
werden, das Fließen
der Reaktionsflüssigkeit
kann 30 Minuten lang eingestellt werden, dann kann das erzwungene
Fließen
der Reaktionsflüssigkeit
eine Minute lang durchgeführt
werden, und danach kann das Fließen der Reaktionsflüssigkeit 30 Minuten
lang eingestellt werden.
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Der
Enzym-markierte Antikörper
ist der Antikörper
bezüglich
der Markierungssubstanz des markierten Rezeptors oder des markierten
Liganden, wobei der Antikörper
mit einem Enzym markiert wurde. (In Fällen, in denen die Markierungssubstanz
des markierten Rezeptors oder des markierten Liganden ein Antikörper ist,
ist der Enzym-markierte Antikörper
das Antigen bezüglich
der Markierungssubstanz des markierten Rezeptors oder des markierten
Liganden, wobei das Antigen mit einem Enzym markiert wurde.) Zu
Beispielen der Enzyme, die als das Enzym des Enzym-markierten Antikörpers bevorzugt
sind, gehören
alkalische Phosphatase, Peroxidase und Luciferase.
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Danach
wird die biochemische Analyseeinheit aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen,
und ein chemisches Lumineszenz-Substrat wird mit dem Enzymmarkierten
Antikörper,
der an den markierten Rezeptor oder den markierten Liganden spezifisch
gebunden wurde, in Berührung
gebracht. In Fällen,
in denen das Enzym des Enzym-markierten Antikörpers alkalische Phosphatase
ist, kann das chemische Lumineszenz-Substrat, das zum Eingehen der
Reaktion mit dem Enzym-markierten Antikörper veranlaßt wird,
Dioxetan sein. In Fällen,
in denen das Enzym des Enzym-markierten Antikörpers Peroxidase ist, kann
das chemische Lumineszenz-Substrat, das zum Eingehen der Reaktion
mit dem Enzymmarkierten Antikörper
veranlaßt
wird, Luminol sein. Auch kann in Fällen, in denen das Enzym des
Enzym-markierten Antikörpers
Luciferase ist, das chemische Lu mineszenz-Substrat, das zum Eingehen
der Reaktion mit dem Enzym-markierten Antikörper veranlaßt wird,
Luciferin sein. Das chemische Lumineszenz-Substrat, das zum Eingehen
der Reaktion mit dem Enzym-markierten Antikörper veranlaßt wird,
ist jedoch nicht auf die oben aufgezählten chemischen Lumineszenz-Substrate
beschränkt.
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In
Fällen,
in denen das chemische Lumineszenz-Substrat und das Enzym miteinander
in Berührung gebracht
werden, wird die chemische Lumineszenz mit Wellenlängen, die
in den Wellenlängenbereich
des sichtbaren Lichts fallen, erzeugt. Daher kann die erzeugte chemische
Lumineszenz photoelektrisch nachgewiesen werden, und die Bilddaten
für eine
biochemische Analyse können
entsprechend der nachgewiesenen chemischen Lumineszenz gebildet
werden. Auf diese Weise kann der markierte Rezeptor oder der markierte Ligand
nachgewiesen und bestimmt werden.
-
Die
vorliegende Erfindung wird durch die folgenden nicht-beschränkenden
Beispiele weiter veranschaulicht.
-
Beispiele
-
Beispiel 1
-
Mit
einer Ätztechnik
wurden 400 feine Löcher
in einem Flachmaterial SUS304 (das als ein Grundplattenmaterial-Flachmaterial
diente) mit einer Größe von 90
mm × 90
mm und einer Dicke von 100 μm
ausgebildet. Jedes der feinen Löcher
hatte einen kreisförmigen Öffnungsbereich
mit einem Loch-Durchmesser von 0,3 mm. Die feinen Löcher wurden
mit einer Loch-Entfernung von 0,4 mm und einem Loch-Zwischenraum
von 0,1 mm ausgebildet.
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Danach
wurde ein Klebstoff auf eine Oberfläche des Grundplattenmaterial-Flachmaterials
aufgebracht, und der Klebstoff, der in die Löcher, die in dem Grundplattenmaterial-Flachmaterial
ausgebildet worden waren, eindrang, wurde durch Saugen entfernt.
Der auf der Oberfläche
des Grundplattenmaterial-Flachmaterials verbleibende Klebstoff wurde
dann getrocknet. Danach wurde eine Membran aus 6,6-Nylon mit einer
Porengröße von 0,45 μm und einer
Dicke von 170 μm
auf die Oberfläche
des Grundplattenmaterial-Flachmaterials gelegt, wobei die Oberfläche mit
dem Klebstoff beschichtet worden war. Die Kombination aus der Membran aus
6,6-Nylon und dem Grundplattenmaterial-Flachmaterial wurde dann
auf eine Temperatur von 150 °C
erhitzt und unter einem solchen Druck gepreßt, dass der Druck pro 1 cm2 300 kg betrug. Die Membran aus 6,6-Nylon
wurde so durch Pressen in den feinen Löchern des Grundplattenmaterial-Flachmaterials
angebracht. Auf diese Weise wurde eine biochemische Analyseeinheit,
die eine Sperrwand aus rostfreiem Stahl und die Mehrzahl an in den
feinen Löchern
ausgebildeten, Polymer-gefüllten
Bereichen aufwies, hergestellt.
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Auch
wurde eine Digoxigenin-markierte pBR328-DNA-Flüssigkeit (geliefert von Roche
Diagnostics K.K.) mit einem TE-Puffer (eine gemischte Lösung aus
10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA, geliefert von Nippon Gene K.K.) auf
eine Konzentration von 50 pg/μl
verdünnt.
Dann wurde eine thermische Denaturierung durchgeführt, und
die Digoxigenin-markierte pBR328-DNA wurde so in eine einzelsträngige Form
umgewandelt. Danach wurden 10 nl der Digoxigenin-markierten pBR328-DNA-Flüssigkeit
auf jeden der absorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit, die in derselben Weise
wie der oben beschriebenen hergestellt worden war, getupft. Danach
wurde durch Einstrahlung von Ultraviolettlicht (254 nm, 33 mJ/cm2) die einzelsträngige Digoxigenin-markierte
pBR328/BglI, HinfI an den adsorptionsfähigen Bereichen der biochemischen
Analyseeinheit fixiert.
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Danach
wurde die biochemische Analyseeinheit in das in 2 veranschaulichte
Reaktionsgefäß eingesetzt.
Auch wurde ein Wasch-Puffer (geliefert von Roche Diagnostics K.K.)
mit sterilisiertem deionisiertem Wasser auf eine Konzentration von
1/10 verdünnt,
und dadurch wurde eine Waschflüssigkeit
hergestellt. Die so hergestellte Waschflüssigkeit wurde in das Reaktionsgefäß, in der
die biochemische Analyseeinheit untergebracht worden war, eingespeist.
Die Pumpe wurde betätigt,
und die adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit wurden mit der Waschflüssigkeit
gewaschen.
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Danach
wurde eine Blockierungspuffer-Lösung
(geliefert von Roche Diagnostics K.K.) unter Verwendung eines Maleinsäure-Puffers
(geliefert von Roche Diagnostics K.K.), der mit sterilisiertem deionisiertem Wasser
auf eine Konzentration von 1/10 verdünnt worden war, auf eine Konzentration
von 1/10 verdünnt.
Die so verdünnte
Blockierungspuffer-Lösung
wurde dann der Filtration mit einem Polyethersulfon-Filter (Porendurchmesser:
0,2 μm)
unterzogen, und dann als ein Blockierungsmittel verwendet. Nachdem
die Waschflüssigkeit
aus dem Reaktionsgefäß entlassen
worden war, wurde das Blockierungsmittel in das Reaktionsgefäß eingespeist,
und die Pumpe wurde für
eine vorbestimmte Zeitdauer betrieben. Danach wurde der Betrieb
der Pumpe eingestellt, und das Blockierungsmittel wurde für eine vorbestimmte
Zeitdauer in dem Reaktionsgefäß stehen
gelassen. Auf diese Weise wurde eine Blockierungsreaktion durchgeführt.
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Danach
wurde ein Anti-Digoxigenin-AP-Konjugat (ein mit alkalischer Phosphatase
markierter Digoxigenin-Antikörper)
einer zentrifugalen Filtration mit einem Polyvinylidenfluorid-Filter
(Porendurchmesser: 0,2 μm)
unterzogen. Das Anti-Digoxigenin-AP-Konjugat, das durch Filtration
gesammelt worden war, wurde dann mit dem vorgenannten Blockierungsmittel
auf eine Konzentration von 1/10.000 verdünnt, und dadurch wurde eine
Enzym-markierte Antikörper-Flüssigkeit
hergestellt. Nachdem das Blockierungsmittel aus dem Reaktionsgefäß entlassen
worden war, wurde die so hergestellte Enzym-markierte Antikörper-Flüssigkeit
in das Reaktionsgefäß eingespeist,
und die Pumpe wurde für
eine vorbestimmte Zeitdauer betrieben. Danach wurde der Betrieb
der Pumpe eingestellt, und die Enzym-markierte Antikörper-Flüssigkeit
wurde für
eine vorbestimmte Zeitdauer in dem Reaktionsgefäß stehen gelassen. Auf diese
Weise wurde eine Antigen-Antikörper-Reaktion durchgeführt.
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Nach
dem Abschluß der
Antigen-Antikörper-Reaktion
wurde der Wasch-Puffer in das Reaktionsgefäß eingespeist. Auch wurde die
Pumpe betrieben, und die adsorptionsfähigen Bereiche der biochemischen
Analyseeinheit wurden 15 Minuten lang gewaschen. Der Waschvorgang
wurde dreimal wiederholt. Die biochemische Analyseeinheit wurde
aus dem Reaktionsgefäß herausgenommen
und wurde dann mit einer Flüssigkeit, die
ein chemisches Lumineszenz-Substrat (CDP-Star, gebrauchsfertig,
geliefert von Roche Diagnostics K.K.) enthielt, in Berührung gebracht.
Auch wurde die chemische Lumineszenz, die von den adsorptionsfähigen Bereichen
der biochemischen Analyseeinheit emittiert wurde, durch Verwendung
einer gekühlten
CCD-Kamera (LAS1000, geliefert von Fuji Photo Film Co., Ltd.) photoelektrisch
nachgewiesen. Auf diese Weise wurde ein digitales Signal gebildet.
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Vergleichsbeispiel 1
-
Eine
biochemische Analyseeinheit mit den adsorptionsfähigen Bereichen, an denen die
einzelsträngige
Digoxigenin-markierte pBR328/BglI, HinfI wie in Beispiel 1 fixiert
war, wurde in eine Nybridisierungstasche hinein gegeben. Dieselbe
Waschflüssigkeit
wie die in Beispiel 1 wurde in die Hybridisierungstasche eingespeist.
Auf die Nybridisierungstasche wurden Vibrationen aufgegeben, und
so wurde fünf
Minuten lang ein Schütteln
der Nybridisierungstasche durchgeführt. Danach wurde die Waschflüssigkeit
aus der Nybridisierungstasche entlassen, und dasselbe Blockierungsmittel
wie das in Beispiel 1 wurde in die Hybridisierungstasche eingespeist.
Dann wurde eine Stunde lang ein Schütteln der Nybridisierungstasche
durchgeführt,
und so wurde eine Blockierungsreaktion durchgeführt. Danach wurde dieselbe
Enzym-markierte Antikörper-Flüssigkeit
wie die in Beispiel 1 in die Nybridisierungstasche eingespeist,
und es wurde eine Stunde lang ein Schütteln der Nybridisierungstasche
durchgeführt.
Auf diese Weise wurde eine Antigen-Antikörper-Reaktion durchgeführt. Nachdem
die Antigen-Antikörper-Reaktion
abgeschlossen war, wurde der Wasch-Puffer in die Hybridisierungstasche
eingespeist, und es wurde unter Schütteln 15 Minuten lang ein Waschen
durchgeführt.
Der Waschvorgang wurde dreimal wiederholt. Nach Beendigung des Waschvorgangs
wurde die biochemische Analyseeinheit aus der Nybridisierungstasche
herausgenommen und dann mit einer Flüssigkeit, die ein chemisches
Lumineszenz-Substrat (CDP-Star, gebrauchsfertig, geliefert von Roche
Diagnostics K.K.) enthielt, in Berührung gebracht. Auch wurde
die chemische Lumineszenz, die von den adsorptionsfähigen Bereichen
der biochemischen Analyseeinheit emittiert wurde, unter Verwendung
einer gekühlten
CCD-Kamera (LAS1000, geliefert
von Fuji Photo Film Co., Ltd.) photoelektrisch nachgewiesen. Auf
diese Weise wurde ein digitales Signal gebildet.
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In
Beispiel 1 wurden die Pumpen-Betriebszeit und die Stationärzeit für die Blockierungsreaktion,
und die Pumpen-Betriebszeit und die Stationärzeit für die Antigen-Antikörper-Reaktion
auf verschiedene Zeitdauern eingestellt. In derartigen Fällen wurden
die Intensitäten
des Hintergrunds, die Intensitäten
des digitalen Si gnals und die Signal/Rausch-Verhältnisse (S/R-Verhältnisse),
die in Tabelle 1 unten aufgelistet sind, erhalten. Auch in Vergleichsbeispiel
1, in dem die konventionelle Technik des Schüttelns der Hybridisierungstasche
benutzt wurde, wurden die Intensität des Hintergrunds, die Intensität des digitalen
Signals und das Signal/Rausch-Verhältnis (S/R-Verhältnis),
die in Tabelle 1 unten aufgelistet sind, erhalten. Tabelle
1
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Wie
oben beschrieben, wird in Beispiel 1 zu der Zeit, zu der der Enzym-markierte
Antikörper
der spezifischen Bindung mit dem markierten Rezeptor oder dem markierten
Liganden, der an mindestens einen der Liganden oder mindestens einen
der Rezeptoren spezifisch gebunden wurde, unterzogen wird, die den
Enzym-markierten Antikörper
enthaltende Reaktionsflüssigkeit
erzwungenermaßen
veranlasst, so zu fließen, dass
die Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzymmarkierten Antikörper
enthält,
durch jeden der porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit fließt. Daher kann in Beispiel
1, in dem die Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzym-markierten Antikörper
enthält,
erzwungenermaßen
veranlaßt
wird, so zu fließen, dass
die Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzymmarkierten Antikörper
enthält,
durch jeden der porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit fließt, der Enzym-markierte Antikörper veranlasst
werden, ausreichend in das Innere eines jeden der adsorptionsfähigen Bereiche
einzudringen, wie aus Tabelle 1 klar ist. Dementsprechend kann,
unabhängig
von der Zeitdauer, während
der die Reaktionsflüssigkeit
er zwungenermaßen
zum Fließen
veranlaßt
wird, das Signal nachgewiesen werden, das eine höhere Intensität hat als im
Vergleichsbeispiel 1 mit der konventionellen Technik des Schüttelns der
Hybridisierungstasche, und die Intensität des Hintergrunds war niedriger
als im Vergleichsbeispiel 1.
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Auch
wird, wie aus Tabelle 1 klar ist, die Intensität des Signals, das von der
Antigen-Antikörper-Reaktion
erhalten wird, stärker
durch die Länge
der Stationärzeit
für die
Antigen-Antikörper-Reaktion
nach dem Betreiben der Pumpe als durch die Länge der Pumpen-Betriebszeit
beeinflußt.
Dies liegt wahrscheinlich daran, dass in Fällen, in denen, nachdem die
Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzym-markierten Antikörper
enthält,
erzwungenermaßen
veranlaßt
wurde, so zu fließen,
dass die Reaktionsflüssigkeit
durch jeden der porösen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit fließt, das erzwungene Fließen in diesem
Zustand eingestellt wird, genauer in Fällen, in denen das erzwungene
Fließen
während
einer Zeitdauer, die länger
ist als die Zeitdauer, während
der die Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzymmarkierten Antikörper
enthält,
erzwungenermaßen
zum Fließen
veranlaßt
wurde, eingestellt wird, der Enzym-markierte Antikörper ausreichend
in Berührung
mit dem markierten Rezeptor oder dem markierten Liganden sein kann,
die Bindung des Enzym-markierten Antikörpers mit dem markierten Rezeptor
oder dem markierten Liganden fest durchgeführt werden kann, und der Nachweis mit
einem hohen Signal/Rausch-Verhältnis
durchgeführt
werden kann.
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Auch
ist, was die Blockierungsreaktion betrifft, in Fällen, in denen, nachdem die
Reaktionsflüssigkeit, die
das Blockierungsmittel enthält,
erzwungenermaßen
veranlaßt
wurde, so zu fließen,
dass die Reaktionsflüssigkeit
durch jeden der porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit fließt, das erzwungene Fließen in diesem
Zustand eingestellt wird, die Intensität des nachgewiesenen Hintergrunds
niedrig. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass in Fällen, in
denen die Reaktionsflüssigkeit,
die das Blockierungsmittel enthält,
so stehen gelassen wird, das Blockierungsmittel zuverlässiger an
die adsorptionsfähigen
Bereiche gebunden oder an ihnen adsorbiert werden kann.
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Beispiel 2
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Nachdem
ein Molekulargewicht-Marker pBR328/BglI, HinfI (25 ng/μl, geliefert
von Roche Diagnostics K.K.), der in dem TE-Puffer gelöst worden
war, fünf
Minuten lang gekocht wurde, wurde die Flüssigkeit eine Minute lang in
einem Eisbad gekühlt,
und der pBR328/BglI, HinfI wurde auf diese Weise in eine einzelsträngige Form
umgewandelt. Die so erhaltene pBR328/BglI, HinfI-Flüssigkeit
wurde dann auf die adsorptionsfähigen Bereiche
der biochemischen Analyseeinheit, die in derselben Weise wie der
in Beispiel 1 hergestellt worden war, getupft. Danach wurde durch
Einstrahlung von Ultraviolettlicht (254 nm, 33 mJ/cm2)
die einzelsträngige pBR328/BglI,
HinfI an den adsorptionsfähigen
Bereichen der biochemischen Analyseeinheit fixiert.
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Danach
wurde eine Hybridisierungsflüssigkeit
hergestellt. Die Hybridisierungsflüssigkeit hatte eine solche
Zusammensetzung, dass 100 ml der Hybridisierungsflüssigkeit
52 ml sterilisiertes de-ionisiertes Wasser, 30 ml an 20×SSC (geliefert
von Nippon Gene K.K.), 2 ml an 0,5 M EDTA (pH 8,0), 10 ml an 50×Denhard's Flüssigkeit,
5 ml einer 10%igen SDS-Flüssigkeit
und 1 ml einer denaturierten Lachs-Spermatozoen-DNA mit einer Konzentration
von 100 μg/ml
enthielten.
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Auch
wurde eine Digoxigenin-markierte pBR328-DNA-Flüssigkeit mit einer Konzentration
von 5 ng/μl mit
dem TE-Puffer verdünnt,
und die Konzentration der Digoxigenin-markierten pBR328-DNA-Flüssigkeit
wurde auf einen vorbestimmten Wert eingestellt. Dann wurde eine
thermische Denaturierung durchgeführt, und die Digoxigenin-markierte
pBR328-DNA wurde so in eine einzelsträngige Form umgewandelt. Danach
wurde die Digoxigenin-markierte pBR328-DNA-Flüssigkeit noch weiter mit der
Hybridisierungsflüssigkeit
verdünnt. Auf
diese Weise wurde eine Digoxigenin-markierte pBR328-DNA-Flüssigkeit
mit einer vorbestimmten Konzentration (d. h. eine Hybridisierungsreaktions-Flüssigkeit)
hergestellt.
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Danach
wurde die oben beschriebene biochemische Analyseeinheit in eine
Hybridisierungstasche hineingegeben, und die Hybridisierungsreaktions-Flüssigkeit,
die in der oben beschriebenen Weise hergestellt worden war, wurde
in die Hybridisierungstasche gefüllt.
Dann wurden auf die Hybridisierungstasche Vibra tionen aufgegeben,
und so wurde 18 Stunden lang ein Schütteln durchgeführt. Auf
diese Weise wurde eine Hybridisierungsreaktion durchgeführt.
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Die
oben beschriebene biochemische Analyseeinheit wurde dann in dem
in 2 veranschaulichten Reaktionsgefäß fixiert.
Danach wurden der Waschvorgang, die Blockierungsreaktion und die
Antigen-Antikörper-Reaktion
in derselben Weise wie der in Beispiel 1 durchgeführt. Die
biochemische Analyseeinheit wurde dann in derselben Weise wie der
in Beispiel 1 mit dem chemischen Lumineszenz-Substrat in Berührung gebracht.
Auch wurde die chemische Lumineszenz, die von den adsorptionsfähigen Bereichen
der biochemischen Analyseeinheit emittiert wurde, unter Verwendung
der gekühlten
CCD-Kamera (LAS1000) photoelektrisch nachgewiesen. Auf diese Weise
wurde ein digitales Signal gebildet.
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Beispiel 3
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Es
wurde dasselbe Verfahren wie das in Beispiel 2 durchgeführt, außer dass
die Hybridisierungsreaktion in dem in 2 veranschaulichten
Reaktionsgefäß 18 Stunden
lang durch Betreiben der Pumpe durchgeführt wurde. Der Waschvorgang,
die Blockierungsreaktion, die Antigen-Antikörper-Reaktion und der Vorgang des
in Berührung
Bringens der biochemischen Analyseeinheit mit dem chemischen Lumineszenz-Substrat wurden
in derselben Weise wie derjenigen in Beispiel 2 durchgeführt. Auch
wurde die chemische Lumineszenz, die von den adsorptionsfähigen Bereichen
der biochemischen Analyseeinheit emittiert wurde, durch Verwendung
der gekühlten
CCD-Kamera (LAS1000) photoelektrisch nachgewiesen. Auf diese Weise
wurde ein digitales Signal gebildet.
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Vergleichsbeispiel 2
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Nachdem
die Hybridisierungsreaktion in derselben Weise wie derjenigen in
Beispiel 2 durchgeführt worden
war, wurde die biochemische Analyseeinheit in der Hybridisierungstasche
behalten, dieselbe Waschflüssigkeit
wie diejenige in Beispiel 2 wurde in die Hybridisierungstasche eingespeist,
und das Schütteln
wurde fünf
Minuten lang durchgeführt.
Danach wurde die Waschflüssigkeit
aus der Hybridisierungstasche entlassen. Auch wurde dieselbe Enzym-markierte
Antikörper- Flüssigkeit
wie diejenige in Beispiel 1 in die Hybridisierungstasche eingespeist,
das Schütteln
wurde eine Stunde lang durchgeführt,
und so wurde die Antigen-Antikörper-Reaktion
durchgeführt.
Nachdem die Antigen-Antikörper-Reaktion
abgeschlossen war, wurde der Wasch-Puffer in die Hybridisierungstasche
eingespeist, und das Waschen wurde unter Schütteln 15 Minuten lang durchgeführt. Der
Waschvorgang wurde dreimal wiederholt. Nachdem der Waschvorgang
beendet war, wurde die biochemische Analyseeinheit aus der Hybridisierungstasche
herausgenommen und dann mit einer Flüssigkeit, die das chemische
Lumineszenz-Substrat (CDP-Star) enthielt, in Berührung gebracht. Auch wurde die
chemische Lumineszenz, die von den adsorptionsfähigen Bereichen der biochemischen
Analyseeinheit emittiert wurde, durch Verwendung der gekühlten CCD-Kamera (LAS1000)
photoelektrisch nachgewiesen. Auf diese Weise wurde ein digitales
Signal gebildet.
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In
jedem der Beispiele 1, 2 und 3 und in dem Vergleichsbeispiel 2 wurde
die Menge der Digoxigenin-markierten pBR328-DNA auf verschiedene
Werte eingestellt. In derartigen Fällen wurden die Intensitäten des
Hintergrunds, die Intensitäten
des digitalen Signals und die Signal/Rausch-Verhältnisse (S/R-Verhältnisse),
die in Tabelle 2 unten aufgelistet sind, erhalten.
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Wie
oben beschrieben, wurde in Beispiel 2 die Hybridisierungsreaktion
mit der konventionellen Technik des Schüttelns der Hybridisierungstasche
durchgeführt,
und die Antigen-Antikörper-Reaktion
wurde mit der Reaktionsvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung
durchgeführt.
In Beispiel 3 wurden sowohl die Hybridisierungsreaktion als auch
die Antigen-Antikörper-Reaktion
mit der Reaktionsvorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung durchgeführt.
Auch wurden im Vergleichsbeispiel 2 sowohl die Hybridisierungsreaktion
als auch die Antigen-Antikörper-Reaktion
mit der konventionellen Technik des Schüttelns der Hybridisierungstasche
durchgeführt.
Wie aus Tabelle 2 klar ist, kann in Beispiel 2 und Beispiel 3 eine
deutlich kleinere Menge der Digoxigenin-markierten pBR328-DNA mit einem höheren Signal/Rausch-Verhältnis als
im Vergleichsbeispiel 2 nachgewiesen werden.
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Wie
oben beschrieben, wird mit dem chemischen Lumineszenzverfahren unter
Verwendung einer biochemischen Analyseeinheit gemäß der vorliegenden
Erfindung zu der Zeit, zu der der Enzym-markierte Antikörper der
spezifischen Bindung mit dem markierten Rezeptor oder dem markierten
Liganden, der an mindestens einen der Liganden oder mindestens einen
der Rezeptoren spezifisch gebunden wurde, unterzogen wird, die Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzym-markierten Antikörper
enthält,
erzwungenermaßen
veranlaßt,
so zu fließen,
dass die Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzym-markierten Antikörper
enthält,
durch jeden der porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit fließt. Daher kann der Enzym-markierte Antikörper veranlaßt werden,
ausreichend in das Innere eines jeden der adsorptionsfähigen Bereiche
einzudringen. Dementsprechend kann der markierte Rezeptor oder der
markierte Ligand in Fällen,
in denen die Menge des markierten Rezeptors oder des markierten
Liganden klein ist, mit einem hohen Signal/Rausch-Verhältnis nachgewiesen
werden.
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In
Beispiel 3 wurde auch zu der Zeit, zu der der markierte Rezeptor
oder der markierte Ligand, der mit der Markierungssubstanz markiert
worden war, der spezifischen Bindung mit den Liganden oder den Rezeptoren
unterzogen wurde, die Reaktionsflüssigkeit, die den markierten
Rezeptor oder den markierten Liganden, der mit der Markierungssubstanz
markiert worden war, enthielt, erzwungenermaßen veranlaßt, so zu fließen, dass
die Reaktionsflüssigkeit,
die den markierten Rezeptor oder den markierten Liganden enthielt,
durch jeden der porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit floß. Daher kann der markierte Rezeptor
oder der markierte Ligand in Fällen,
in denen die Menge des markierten Rezeptors oder des markierten
Liganden auffallend klein ist, mit einem hohen Signal/Rausch-Verhältnis nachgewiesen
werden, wie aus Tabelle 2 klar ist.
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Außerdem kann
in Fällen,
in denen, nachdem die Reaktionsflüssigkeit, die den Enzym-markierten
Antikörper
enthält,
erzwungenermaßen
veranlaßt
wurde, so zu fließen,
dass die Reaktionsflüssigkeit
durch jeden der porösen
adsorptionsfähigen
Bereiche der biochemischen Analyseeinheit fließt, das erzwungene Fließen während einer
Zeitdauer, die länger
ist als die Zeitdauer, während
der die Reaktionsflüssigkeit,
die den Enzym-markierten Antikörper
enthält,
zum Fließen
gezwungen wurde, eingestellt wird, der markierte Rezeptor oder der
markierte Ligand mit einem hohen Signal/Rausch-Verhältnis nachgewiesen
werden.