DE60218710T2

DE60218710T2 - Gen und protein mit bezug zu hepatozellulärem karzinom

Info

Publication number: DE60218710T2
Application number: DE2002618710
Authority: DE
Inventors: Yusuke Yokohama-shi Nakamura; Yoichi Kawasaki-shi Furukawa
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Current assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2001-09-25
Filing date: 2002-09-25
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2022-09-26
Also published as: EP1430152A2; US7767392B2; JP4353798B2; ES2283592T3; US8148080B2; US20100248240A1; US20120149762A1; CN1628179A; US20040235018A1; CN1628179B; DE60218710D1; ATE356223T1; EP1430152B1; AU2002329061A1; WO2003027143A3; JP2005511023A; WO2003027143A2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biowissenschaft, genauer gesagt das Gebiet der Krebsforschung. Im Einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Protein, ZNFN3A1, das am Proliferationsmechanismus von Leberzellenkarzinom-Zellen beteiligt ist. Die Proteine der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel als Zielmoleküle zur Entwicklung von Arzneimitteln gegen Leberkrebs verwendet werden.
Stand der Technik
Leberzellenkarzinom (HCC) ist ist eine der häufigsten Krebsarten weltweit und seine Häufigkeit erhöht sich nach und nach sowohl in Japan als auch in den Vereinigten Staaten (Akriviadis EA, et al., Br J Surg. 1998 Oct; 85 (10): 1319-31). Obwohl jüngste medizinische Fortschritte eine gute Weiterentwicklung bei der Diagnose gemacht haben, wird eine große Anzahl von Patienten mit HCCs immer noch in fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert und ihre vollständigen Heilungen von der Erkrankung bleiben schwierig. Weil Patienten mit Leberzirrhose oder chronischer Hepatitis ein hohes Risiko für HCCs haben, können sie zusätzlich multiple Lebertumore oder neue Tumore auch nach vollständiger Entfernung der ursprünglichen Tumore entwickeln.
Daher ist die Entwicklung von hoch wirksamen, chemotherapeutischen Arzneimitteln und vorbeugenden Strategien eine Sache von dringendem Interesse.
Jüngste Fortschritte in der Molekularbiologie legen zwar nahe, dass der Leberkarzinogenese ein Mehrschrittprozess zugrunde liegt, wie das auch bei der Genese und Progression von Colontumoren der Fall ist. An diesen Prozessen sind qualitative und quantitative Veränderungen von verschiedenen Genprodukten beteiligt. Die genetische Veränderungen wurden in Tumorsuppressor-Genen einschließlich TP53 und AXIN1, und in Onkogenen wie c-myc, Cyclin D1, und s-Catenin, in einer Teilmenge von HCCs beobachtet (Tanaka S, et al., Cancer Res. 1993 Jun 15; 53 (12): 2884-7; Satoh S, et al., Nat Genet. 2000 Mar; 24 (3): 245-50). Ein häufiger Verlust der Heterozygotie (LOH) in Lebertumorzellen wurde in den chromosomalen Regionen 4q, 6q, 8p, 8q, 9p, 9q, 13q, 16p, 16q, und 17p, berichtet (Feitelson MA, et al., Oncogene 2002 Apr 11; 21 (16): 2593-604).
Zusätzlich zu diesen genetischen Änderungen spielt eine veränderte Expression einer Reihe von Genen, wie TGF, eine Rolle in der Leberzellenkarzinogenese (Lee GH, et al., Cancer Res 1992 Oct 1; 52 (19): 5162-70).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfinder haben zuvor die Genom-weite Expression von Genen in Leberzellenkarzinomata analysiert und eine Reihe von Genen identifiziert, die an der Leberzellenkarzinogenese beteiligt zu sein scheinen. Wir haben auch Gene offenbart, die mit der Art des Hepatitisvirus in den Patienten, dem histologischen Stadium des Tumors und dem Status von dessen Gefäßversorgung assoziiert sind (Okabe H, et al., Cancer Res. 2001 Mar 1; 61 (5): 2129-37). Obwohl eine Inaktivierung von einigen Tumor Suppressorgenen, wie p53 und p161NK4A, identifiziert worden ist, wurde bislang von keinem bekannten Onkogen gezeigt, dass es allgemein im Leberzellenkarzinom aktiviert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Gen, ZNFN3A1, bereit, das in Leberzellenkarzinomata überexprimiert ist, und es wurde ein Onkogen identifiziert, welches eine Zinkfingerdomäne und eine SET-Domäne aufweist. Die Expression des Gens, ZNFN3A1, ist in HCCs häufig hochreguliert und scheint eine onkogene Aktivität durch einen transaktivierenden RNA-Polymerase-II-Komplex auf Krebszellen zu übertragen, welcher wiederum die Transkription von Zielgenen, einschließlich EGFR verstärkt. Daher dient ZNFN3A1 als ein neues molekulares Ziel für HCCs.
Die Nukleinsäuresequenz und die Aminosäuresequenz von ZNFN3A1 sind zuvor in der WO 00/44900 (Young et al.) berichtet worden. SEQ ID NO:66 der WO 00/44900 (Young et al.) offenbart eine Nukleinsäuresequenz welche die Aminosäuresequenz von ZNFN3A1 kodiert. Verwandte Nukleinsäuresequenzen wurden in zwei Online-Sequenzdatenbankeinträgen, die unter htt://www.ebi.ac.uk mit den Datenbank-Zugangsnummern:
AK024733 und AL557360
erhältlich sind, berichtet.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen trans-wirkenden Aktivationskomplex bereitzustellen, welcher am Proliferationsmechanismus von Leberzellenkarzinom-Zellen beteiligt ist, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung desselben in der Diagnose von Leberzellenkarzinom (HCC).
Die Erfinder haben sich vorgenommen neue Ziele für eine Arzneimittelentwicklung zur Behandlung von HCC zu entdecken. Dementsprechend analysierten sie Expressionsprofile von HCCs unter Verwendung eines Genom-weiten cDNA Mikroarrays. Hierin wird die Identifizierung eines neuen menschlichen Gens, ZNFN3A1, berichtet, dessen Expression verglichen mit entsprechenden, nicht-krebsartigen Lebergeweben in einer großen Mehrheit von HCCs deutlich erhöht ist. Die ZNFN3A1 cDNA besteht aus 1622 Nukleotiden, welche einen offenen Leserrahmen von 1284 Nukleotiden enthalten, die ein putatives 428-Aminosäureprotein mit einem Zinkfinger-Motiv codieren. Interessanterweise ist die subzelluläre Lokalisation des ZNFN3A1-Proteins im Verlauf des Zellzyklus oder wegen der Dichte von kultivierten Zellen verändert, es reichert sich im Nukleus an, wenn Zellen in der mittleren oder späten S-Phase sind oder unter dünn ausgespähten Bedingungen kultiviert werden, während es sowohl im Zytoplasma als auch Nukleus lokalisiert ist, wenn sie sich in anderen Phasen befinden oder unter dichten Bedingungen kultiviert werden. Außerdem ist ZNFN3A1 direkt mit einer RNA-Helicase, KIAA0054, assoziiert und bildet einen Komplex mit RNA-Polymerase II, welche die Transkription von stromabwärts gelegenen Genen, einschließlich epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), durch eine direkte Bindung des Komplexes mit einem Element aus "(C)CCCTCC(T)" in der 5'-flankierenden Region aktiviert. Logischerweise verleiht eine exogene Expression von ZNFN3A1 in NIH3T3 Zellen ein erhöhtes Zellwachstum, während eine Unterdrückung seiner Expression mit antisense S-Oligonukleotiden eine signifikante Wachstumshemmung von Lebertumorzellen ergab. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ZNFN3A1 onkogene Aktivitäten auf Krebszellen durch transkriptionelle Aktivierung von Zielgenen, einschließlich EGFR, durch einen Komplex mit RNA-Helicase und RNA-Polymerase II überträgt und dass eine Hemmung der Aktivität des Komplexes eine viel versprechende Strategie zur Behandlung von HCC sein könnte.
Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung neue ZNFN3A1-Proteine, die an der Zellproliferation beteiligt sind, und die diese codierenden Gene. Das ZNFN3A1-Protein schließt vorzugsweise die in SEQ ID NO:2 bekannt gegebene Aminosäuresequenz ein. Das ZNFN3A1-Gen schließt eine wie in SEQ ID NO: 1 beschriebene Polynukleotidsequenz ein. Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung das Folgende bereit:
Ein Transkiptionsaktivationskomplex, der ein Protein bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 und mindestens einem Coaktivator davon einschließt. In einen Ausführungsform kann der Coaktivator eine RNA-Helicase und/oder eine RNA-Polymerase sein. Die RNA-Helicase kann RNA-Helicase KIAA0054 sein. Die RNA-Polymerase kann RNA-Polymerase II sein. In einer Form schließt der Komplex das Protein bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, RNA-Helicase und RNA-Polymerase II ein. Der Transkiptionsaktivationskomplex kann eine Transkription von Genen einschließlich epidermalem Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) durch eine direkte Bindung des Komplexes mit einem Element von "(C)CCCTCC(T)" in der 5'-flankierenden Region des EGFR-Gens aktivieren.
Ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung, welche die Aktivität eines Proteins, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, inhibiert, umfassend das Kultivieren von Zellen, welche das Protein, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, oder ein Partialpeptid davon exprimieren, in der Gegenwart einer Versuchsprobe, welche mindestens eine Testverbindung enthält; Bestimmen der Proliferation der Zelle und Auswählen der Testverbindung, welche die Proliferation, im Vergleich zu der in Abwesenheit der Versuchsprobe bestimmten Proliferation, inhibiert.
Ein in vitro Verfahren zum Screenen einer Kandidatenverbindung für ein Antikrebsmittel, wobei das Verfahren das in Kontakt bringen des Proteins, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, einem Coaktivator davon und einer DNA, welche die Zielsequenz des Polypeptids enthält, mit Kandidatenverbindungen unter der geeigneten Bedingung zur Bildung des Komplexes des Proteins, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, und der DNA und Auswählen von Verbindungen, welche die Bildung des Komplexes inhibieren. Die Zielsequenz umfasst eine der folgenden Sequenzen (a) bis (d), welche die 5'-Region des EGFR flankieren.

(a) eine Sequenz, die zwischen -213-bp und -207-bp (cccctcc) in der 5'-flankierenden Region des EGFR identifiziert wird;
(b) eine Sequenz, die zwischen -106-bp und -100-bp (ccctcct) in der 5'-flankierenden Region des EGFR identifiziert wird;
(c) eine Sequenz, die zwischen -65-bp und -59-bp (ccctcct) in der 5'-flankierenden Region des EGFR identifiziert wird;
(d) eine Sequenz, die zwischen -46-bp und -40-bp (ccctcct) in der 5'-flankierenden Region des EGFR identifiziert wird.

Ein in vitro Verfahren zum Screenen einer Kandidatenverbindung für einen Antikrebsmittel, wobei das Verfahren das in Kontakt bringen des Proteins, bestehend aus Aminosäuren SEQ ID NO:2, einem Coaktivator davon und einem Reportergen mit einer Transkriptionsregulationsregion, die von dem Komplex aus dem Protein, bestehend aus Aminosäuren SEQ ID NO:2 und einem Coaktivator erkannt wird, mit Kandidatenverbindungen unter geeigneten Bedingungen zur Expression des Reportergens und Auswählen der Verbindungen, welche die Expression des Reportergens inhibieren.
Ein in vitro Verfahren zur Diagnose von Krebs, welches das Bestimmen eines Expressionsniveaus eines ZNFN3A1-Gens, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 in einer biologischen Untersuchungsprobe, Vergleichen des Expressionsniveaus des ZNFN3A1-Gens, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1, mit dem einer normalen Probe und Definieren eines hohen Expressionsniveaus des ZNFN3A1-Gens, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ED NO:1, in der Probe, dass Krebs vorliegt, einschließt. Der Krebs ist geeigneterweise ein Leberzellenkarzinom.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1A-1C stellen die Expression von A6681 und ZNFN3A1 in HCCs dar. 1A stellt diese relativen Expressionsverhältnisse von A6681 in 20 primären HCCs dar, die durch cDNA Mikroarray untersucht wurden. Seine Expression war in elf der zwölf (91,7%) klinischen HCCs, die den Grenzwertfilter überschritten (sowohl Cy3- als auch Cy5-Signale über 25 000) hochreguliert. 1B zeigt Fotografien, welche die Expression von HCC Kandidatengenen, gezeigt durch Ethidiumbromid-Färbung von RT-PCR Produkten (T, Tumorgewebe; N, normales Gewebe), darstellen. Expression von GAPDH diente als eine interne Kontrolle. 1C ist eine Fotografie, die eine Northernblot-Analyse von mehreren Geweben von A6681 in den verschiedenen menschlichen Geweben von Erwachsenen darstellt.
2A stellt die vorhergesagte Proteinstruktur und Proteinmotive von ZNFN3A1 dar. Die Proteinmotive von ZNFN3A1 wurden durch das Simple Modular Architecture Research Tool (SMART) vorhergesagt. 2B stellt die Homologie zwischen der abgeleiteten Aminosäuresequenz von ZNFN3A1 und AKO10447 dar. Die zf-MYND [Zinkfinger-Protein (MYND-Domäne enthaltende)]-Domäne (A), und die SET [(Su (var) 3-9, Enhancer-of-zeste, Trithorax)]-Domäne (B) zeigten 94% beziehungsweise 95% Identität.
3A-3R zeigen Fotografien, welche die subzelluläre Lokalisation von ZNFN3A1 darstellen, die durch Immunzytochemie, insbesondere durch Fluoreszenzimmunhistochemische Färbung beobachtet wurde. 3A-3C stellen SNU475 Zellen dar, transfiziert mit Plasmid DNA, die ausgestaltet ist, um EGFP-markiertes ZNFN3A1 (pEGFP-ZNFN3A1) zu exprimieren. Fluoreszenz-Mikroaufnahmen von FITC (g, j, m, p), DAPI (h, k, n, q), zusammengenommen (l, l, o, r). 3D-3F stellen SNU475 Zellen dar, transfiziert mit Plasmid DNA, die ausgestaltet ist, um FLAG-markiertes ZNFN3A1 (pFLAG-ZNFN3A1) zu exprimieren. Fluoreszenz-Mikroaufnahmen von anti-FLAG (d), DAPI (e), zusammengenommen (f). 3G-3R stellen endogene Expression von ZNFN3A1 in SNU475 Zellen (g-1) und SNU423 Zellen (m-r) dar. Fluoreszenz-Mikroaufnahmen von anti-ZNFN3A1(g, j, m, p), DAPI (h, k, n, q), zusammengenommen (i, l, o, r). Zellen wurden in der geringen Konzentration (1,25 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) (g-i, m-o) und hohen Konzentration (1,0 × 10⁵ Zellen/Vertiefung) (j-l, p-r) angeimpft.
4A und 4B stellen die Wirkung des Verlaufs des Zellzyklus auf die subzelluläre Lokalisation von ZNFN3A1 dar. 4A stellt die FACS-Analyse von durch Aphidicolin synchronisierten Huh7 Zellen dar. Diese Zellen wurden in der G₁-Phase durch Inkubation mit 7,5 μg/ml Aphidicolin für 36 Std. im Wachstum festgehalten und durch Entfernen des Aphidicolin aus der G₁-Phase entlassen. FACS wurde 0, 4, 8, und 12 Std. später durchgeführt. 4B zeigt Fotografien, die die Fluoreszenz-immunzytochemische Färbung von endogenem ZNFN3A1-Protein in durch Aphidicolin synchronisierten Huh7 Zellen darstellen.
5A-5D stellen die Wachstums-fördernde Wirkung von ZNFN3A1 in NIH3T3 dar. 5A ist eine Fotografie, welche die Ergebnisse eines Koloniebildungsassays von ZNFN3A1 in NIH3T3 Zellen darstellen, verglichen mit der Expression von ZNFN3A1 in Mock-Experiment, NIH3T3-antisense ZNFN3A1 und NIH3T3-sense ZNFN3A1. 5B zeigt die durch elektrische Densitometrie gezählte Zahl an Kolonien. Kolonien wurden durch elektrische Densitometrie gezählt. Koloniezahlen werden als Mittelwert ± SD von Platten in dreifacher Ausfertigung gezeigt. A (*) kennzeichnet einen signifikanten Unterschied (p< 0,05) wie durch einen Fisher-LSD-Test (engl: "Fisher's protected least significant test") bestimmt. 5C zeigt Fotografien, welche die Wachstumsinduktion von NIH3T3 Zellen durch stabiles Exprimieren von ZNFN3A1 darstellen. Expression von ZNFN3A1 mRNA in stabilen Transfektanten(NIH3T3-ZNFN3A1)-Zellen, bestimmt durch RT-PCR. 5D zeigt den Zeitverlauf von Zellzahlen, gemessenen durch das Trypanblau-Färbeverfahren.
6A-6E zeigen die Wachstums-unterdrückende Wirkung von Antisense S-Oligonukleotiden, die dazu bestimmt sind, ZNFN3A1 zu unterdrücken. 6A zeigt die Konstruktion von Sense-(Se) oder Antisense-(As) Oligonukleotiden, die ausgestaltet sind, um ZNFN3A1 zu unterdrücken. 6B zeigt Fotografien, welche die Expression von ZNFN3A1 in SNU475 Zellen darstellen, welche für 24 Std. mit entweder Sense-(Se) oder Antisense-(As) Oligonukleotiden behandelt wurden und durch RT-PCR und Westernblot unter Verwendung von anti-ZNFN3A1 Antikörper untersucht wurden. 6C zeigt Fotografien, welche die Ergebnisse eines Koloniebildungsassays unter Verwendung von sense- oder antisense-Oligonukleotiden gegen ZNFN3A1 mRNA in Huh7, Alexander, SNU423, und SNU475 Zellen darstellen. antisense-Oligonukleotide (As) unterdrückten das Wachstum. 6D stellt die Ergebnisse eines MIT-Assays dar, welcher die Lebensfähigkeit von Zellen 72 Stunden nach Behandlung mit sense- oder antisense-Oligonukleotiden in Huh7, Alexander, SNU423 und SNU475 Zellen bewertet. 6E stellt die Ergebnisse einer FACS-Analyse dar, welche den Zellzyklus von Huh7 Zellen 72 Stunden nach Behandlung mit sense-(Se) oder antisense(As)-Oligonukleotiden bewertet.
7A-7C stellen die Wechselwirkung zwischen ZNFN3A1 und RNA-Helicase KIAA0054 dar. In 7A werden die konservierte Domäne von KIAA0054 und die Regionen zum Binden an ZNFN3A1 kartiert. 7B zeigt Fotografien, die die Ergebnisse eines Hefe-Zwei-Hybrid Experiments zeigen, wobei pAS2-1 enthaltendes ZNFN3A1 mit Bibliotheksvektoren, die zwei unterschiedliche Längen von KIAA0054 enthalten, in den Hefestamm AH109 cotransfiziert wurden. Die Ergebnisse zeigen die Bestätigung der Bindung zwischen ZNFN3A1 und KIAA0054 in Hefestamm AH109. 7C zeigt Fotografien, welche die Bestätigung der Bindung zwischen ZNFN3A1 und KIAA0054 in Säugetierzellen darstellen. Lysate von HeLa-Zellen wurden mit anti-FLAG oder anti-HA Antikörper immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden durch Immunblot mit anti-HA oder anti-FLAG Antikörper analysiert. Lysat wurde als Kontrolle direkt durch Immunblot analysiert.
8 zeigt Fotografien, welche demonstrieren, dass die Wechselwirkung von ZNFN3A1 mit KIAA0054 durch eine SET-Domäne und C-terminale Region von KIAA0054 vermittelt wird. Deletionskonstrukte von ZNFN3A1 wurden im Zwei-Hybrid-System auf ihre Fähigkeit mit der C-terminalen Region von KIAA0054 zu wechselwirken untersucht.
9 zeigt Fotografien, welche demonstrieren, dass RNA-Helicase KIAA0054 mit ZNFN3A1 und RNA-Polymerase II in vivo assoziiert. Zelluläre Extrakte wurden aus mit 8 μg des pFLAG-CMV-ZNFN3A1 (vollst.) und des pCMV-HA-KIAA0054 (vollständige Länge) Expressionsvektors transfizierten HeLa-Zellen hergestellt. Die Extrakte wurden mit anti-RNA-Polymerase II Antikörper, anti-HA Antikörper oder anti-FLAG Antikörper immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden durch Immunblot mit anti-RNA-Polymerase II Antikörper, anti-HA Antikörper oder anti-FLAG Antikörper analysiert. Lysat wurde als Kontrolle direkt durch Immunblot analysiert.
10A und 10B demonstrieren, dass stromabwärts gelegenen Kandidatengene durch ZNFN3A1 reguliert werden. 10A stellt die Sequenz von Oligonukleotiden dar, welche durch Binden und Amplifikationsreaktionen mit ZNFN3A1 von vollständiger Länge enthaltenden GST-Fusionsproteinen isoliert wurden. Die Sequenzen des Kerns, welche die Zufallsnukleotid-Region enthalten, werden gezeigt. 10B zeigt Fotografien, welche die Reverse-Transkriptionsanalyse von verlängerten Transkripten mehrerer Gene in einer stabilen COS7 Transformante, die ZNFN3A1 exogen exprimiert, darstellen.
11(A) Schematische Darstellung von verschiedenen Reporterplasmiden, welche putative ZNFN3A1-bindende Elemente in der 5'-flankierenden Region von EGFR enthalten. Nukleotid-Positionen relativ zur putativen Transkriptionsinitiationsstelle werden durch Plus- oder Minus-Zahlen angegeben. (B) Assay des EGFR-Promotors in SNU475 Zellen unter Verwendung der angegebenen Reporterplasmide. Balken, SD. *, ein signifikanter Unterschied (p < 0.05) wie durch einen Fisher-LSD-Test bestimmt.
12 ist eine Darstellung eines Komplexes, der zwischen ZNFN3A1, RNA-Helicase und RNA-Polymerase II gebildet wurde, um eine Transkription eines Gens zu regulieren.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Wörter "eine(r)", "eine", und "der, die, das," wie hierin verwendet, bedeuten "mindestens ein(r)(e)", falls nicht ausdrücklich anders angegeben.
Die vorliegende Erfindung identifiziert ein neues menschliches Gen ZNFN3A1, dessen Expression verglichen mit entsprechenden nicht krebsartigen Lebergewebe in HCCs deutlich erhöht ist. Die ZNFN3A1 cDNA besteht aus 1622 Nukleotiden, die einen offenen Leserrahmen von 1284 Nukleotiden enthalten, wie in SEQ. ID. NO.1 angegeben.
Der offenen Leserrahmen codiert ein putatives 428-Aminosäure Protein mit einem Zinkfinger-Motiv. Dieses Protein wurde durch ein Nomenklatur-Committee ZNFN3A1 (Zinkfingerprotein, Subfamilie 3A (MYND enthaltend), 1) genannt. Außerdem assoziiert ZNFN3A1 direkt mit einer RNA-Helicase KIAA0054, und bildet einen Komplex mit RNA-Polymerase II, welche die Transkription von stromabwärts gelegenen Genen, einschließlich epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) durch eine direkte Bindung des Komplexes mit einem Element von "(C)CCCTCC(T)° in der 5'-flankierenden Region des EGFR-Gens aktiviert. Logischerweise verleiht eine exogene Expression von ZNFN3A1 in NIH3T3 Zellen ein erhöhtes Zellenwachstum, während die Unterdrückung seiner Expression mit antisense S-Oligonukleotiden eine signifikante Wachstumshemmung von Leberkrebszellen ergab. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ZNFN3A1 onkogene Aktivitäten auf Krebszellen durch transkriptionelle Aktivierung von Zielgenen, einschließlich EGFR, durch einen Komplex mit RNA-Helicase und RNA-Polymerase II überträgt und dass eine Hemmung der Aktivität des Komplexes eine viel versprechende Strategie zur Behandlung von HCC sein könnte.
Die vorliegende Erfindung umfasst das neue menschliche ZNFN3A1-Gen, einschließlich einer Polynukleotidsequenz, wie in SEQ. ID. NO.1 beschrieben, sowie Degenerationen und Mutanten davon, soweit sie ein ZNFN3A1-Protein codieren, einschließlich der in SEQ. ID. NO.2 angegebenen Aminosäuresequenz oder ihres funktionellen Äquivalents. Beispiele für Proteine, welche funktionell äquivalent zu ZNFN3A1 sind, schließen beispielsweise homologe Proteine von anderen Organismen ein, welche dem menschlichen ZNFN3A1-Protein entsprechen, sowie Mutanten der menschlichen ZNFN3A1-Proteine.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "funktionell äquivalent", dass das Subjektprotein die Aktivität hat, Zellproliferation wie ZNFN3A1-Proteine zu fördern und onkogene Aktivität auf Krebszellen durch Bildung eines transaktivierenden Komplexes mit einer RNA-Helicase oder einer RNA-Polymerase oder beides überträgt, was wiederum die Transkription von Zielgenen wie EGFR verstärkt. Ob das Subjektprotein eine Zellproliferationsaktivität aufweist oder nicht, kann durch Einführen der DNA, die das Subjektprotein codiert, in eine Zelle, wie NIH3T3, Exprimieren des Proteins und Nachweisen einer Förderung der Zellproliferation oder eines Anstiegs der Koloniebildungsaktivität beurteilt werden. Die Fähigkeit eines Subjektproteins, einen Komplex mit entweder einer RNA-Polymerase oder einer RNA-Helicase oder beiden zu bilden, kann durch Coimmunpräzipitation, wie solchen, die in den Beispielen unten beschrieben sind, getestet werden. Die Verstärkung der EGFR-Transkription kann außerdem unter Verwendung von Reporterplasmiden, wie solchen, die in den Beispielen unten beschrieben sind, getestet werden.
Verfahren zur Herstellung von zu einem gegebenen Protein funktionell äquivalenten Proteinen sind dem Fachmann gut bekannt und schließen bekannte Verfahren zum Einführen von Mutationen in das Protein ein. Beispielsweise kann ein Fachmann Proteine, die zum menschlichen ZNFN3A1-Protein funktionell äquivalent sind, durch Einführen einer entsprechenden Mutation in die Aminosäuresequenz des menschlichen ZNFN3A1-Proteins durch ortsgerichtete Mutagenese (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995), Gene 152, 271-275; Zoller, MJ und Smith, M. (1983), Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W und Fritz HJ. (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; Kunkel (1988), Methods Enzymol. 85, 2763-2766) herstellen. Aminosäuremutationen können auch in der Natur vorkommen. Das Protein der vorliegenden Erfindung schließt solche Proteine ein, welche die Aminosäuresequenz des menschlichen ZNFN3A1-Proteins aufweisen, in welcher eine oder mehrere Aminosäuren mutiert sind, vorausgesetzt dass die sich ergebenden mutierten Proteine funktionell äquivalent zum menschlichen ZNFN3A1-Protein sind. Die Zahl der zu mutierenden Aminosäuren in solch einer Mutante beträgt im Allgemeinen 10 Aminosäuren oder weniger, vorzugsweise sechs Aminosäuren oder weniger und noch weiter bevorzugt drei Aminosäuren oder weniger.
Von mutierten oder modifizierten Proteinen, Proteinen, die Aminosäuresequenzen aufweisen, welche durch Deletion, Tradition und/oder Ersetzen von einer oder mehreren Aminosäureresten einer bestimmten Aminosäuresequenz modifiziert sind, ist bekannt, dass sie die ursprüngliche biologische Aktivität beibehalten (Mark, D. F. et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, M. J. & Smith, M, Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413).
Der zu mutierende Aminosäurerest wird vorzugsweise zu einer unterschiedlichen Aminosäuren mutiert, in welcher die Eigenschaften der Aminosäure-Seitenkette bewahrt werden (ein Verfahren, das als konservativer Aminosäureaustausch bekannt ist). Beispiele für Eigenschaften von Aminosäure-Seitenketten sind hydrophobe Aminosäuren (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophile Aminosäuren (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) und Seitenketten, welche die folgenden funktionellen Gruppen oder Charakteristika gemeinsam haben: eine aliphatische Seitenkette (G, A, V, L, I, P), eine eine Hydroxylgruppe-enthaltende Seitenkette (S, T, Y); eine ein Schwefelatom-enthaltende Seitenkette (C, M); eine eine Carbonsäure- und Amid-enthaltende Seitenkette (D, N, E, Q; eine eine Base-enthaltende Seitenkette (R, K, H); und eine einen aromatischen Rest enthaltende Seitenkette (H, F, Y, W). Beachten Sie, dass die eingeklammerten Buchstaben den Einbuchstabencode der Aminosäuren anzeigt.
Ein Beispiel für ein Protein, dem eine oder mehrere Aminosäuren zu der Aminosäuresequenz des menschlichen ZNFN3A1-Proteins (SEQ. ID. NO.2) zugefügt wurden, ist ein Fusionprotein, das das menschliche ZNFN3A1-Protein enthält. Fusionsproteine sind Fusionen des menschlichen ZNFN3A1-Proteins mit anderen Peptiden oder Proteinen und sind in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Fusionsproteine können durch dem Fachmann gut bekannte Techniken, wie durch Verknüpfen der DNA, welche das menschliche ZNFN3A1-Protein der Erfindung codiert, mit andere Peptide oder Proteine codierender DNA, so dass die Leserrahmen passen, Einsetzen der Fusions-DNA in einen Expressionsvektor und ihn in einem Wirt exprimieren, hergestellt werden. Es gibt hinsichtlich der Peptide oder Proteine, die mit dem Protein der vorliegenden Erfindung fusioniert werden, keine Einschränkung.
Bekannte Peptide, die als Peptide, welche an das Protein der vorliegenden Erfindung fusioniert sind, verwendet werden können, schließen beispielsweise FLAG (Hopp, T. P. et al., Biotechnology (1988) 6, 1204-1210), 6 × His enthaltende sechsHis (Histidin)-Reste, 10 × His, Influenza Agglutinin (HA), menschliches c-myc-Fragment, VSP-GP-Fragment, p18HIV-Fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T-Antigenfragment, Ick-tag, α-Tubulinfragment, B-tag, ProteinC-Fragment, und dergleichen ein. Beispiele für Proteine, die an ein Protein der Erfindung fusioniert werden können, schließen GST (Glutathion-S-Transferase), Influenza Agglutinin (HA), konstante Region von Immunglobulin, β-Galactosidase, MBP (Maltose-bindendes Protein), und dergleichen ein.
Fusionsproteine können durch Fusionieren von kommerziell erhältlicher DNA, welche die oben diskutierten Fusionspeptide oder -proteine codieren, mit der DNA, welche das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, und Exprimieren der hergestellten fusionierten DNA, hergestellt werden.
Ein alternatives, im Stand der Technik bekanntes Verfahren, um funktionell äquivalente Proteine zu isolieren, ist beispielsweise das Verfahren unter Verwendung einer Hybridisierungstechnik (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Ein Fachmann kann einfach eine DNA, welche eine hohe Homologie mit der gesamten oder einem Teil der DNA Sequenz (SEQ. ID. NO.1), die das menschliche ZNFN3A1-Protein codiert, aufweist isolieren und zum menschlichen ZNFN3A1-Protein funktionell äquivalente Proteine aus der isolierten DNA isolieren. Die Proteine der vorliegenden Erfindung schließen solche ein, die durch eine DNA codiert sind, welche mit einer gesamten oder einem Teil der DNA Sequenz, die das menschliche ZNFN3A1-Protein codiert, hybridisieren und zum menschlichen ZNFN3A1-Protein funktionell äquivalent sind. Diese Proteine schließen Säugetier-Homologe ein, welche dem vom Menschen oder Maus abgeleiteten Protein entsprechen (zum Beispiel ein Protein, das durch ein Affen-, Ratten-, Kaninchen- und Rindergen codiert ist). Beim Isolieren einer zu der DNA, die das menschliche ZNFN3A1-Protein codiert, hoch homologen cDNA aus Tieren ist es besonders bevorzugt, Gewebe aus Ovar oder Testis zu verwenden.
Die Hybridisierungsbedingung zum Isolieren einer DNA, die ein Protein codiert, welches zum menschlichen ZNFN3A1-Protein funktionell äquivalent ist, kann durch einen Fachmann routinemäßig ausgewählt werden. Beispielsweise kann eine Hybridisierung durch Ausführen einer Prähybridisierung bei 68°C für 30 Min. oder länger unter Verwendung von "Rapid-hyb Puffer" (Amersham LIFE SCIENCE), Zugeben einer markierten Sonde und Erwärmen bei 68°C für 1 Std. oder länger durchgeführt werden. Die folgenden Waschschritte können beispielsweise unter Bedingung von geringer Stringenz durchgeführt werden. Eine Bedingung von geringer Stringenz ist beispielsweise 42°C, 2 × SSC, 0,1% SDS, oder vorzugsweise 50°C, 2 × SSC, 0,1% SDS. Weiter bevorzugt werden Bedingungen von hoher Stringenz verwendet. Eine Bedingung von hoher Stringenz ist beispielsweise dreimal waschen in 2 × SSC, 0,01% SDS bei Raumtemperatur für 20 Min., dann dreimal Waschen in 1 × SSC, 0,1% SDS bei 37°C für 20 Min. und zweimal waschen in 1 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C für 20 Min. Verschiedene Faktoren, wie Temperatur und Salzkonzentration, können jedoch die Stringenz einer Hybridisierung beeinflussen und ein Fachmann kann die Faktoren in geeigneter Weise auswählen, um die erforderliche Stringenz zu erreichen.
Anstelle einer Hybridisierung kann ein Genamplifizierungsverfahren, beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Methode unter Verwendung eines basierend auf der Sequenzinformationen der DNA(SEQ. ID. NO.1), die das menschliche ZNFN3A1-Protein codiert, synthetisierten Primers angewandt werden, um eine DNA zu isolieren, welche ein Protein codiert, das funktionell zum menschlichen ZNFN3A1-Protein äquivalent ist.
Proteine, die zum menschlichen ZNFN3A1-Protein funktionell äquivalent sind, welche durch die DNA codiert werden, die durch die obigen Hybridisierungstechniken oder Genamplifizierungsverfahren isoliert wurden, weisen normalerweise eine hohe Homologie zur Aminosäuresequenz des menschlichen ZNFN3A1-Proteins auf. "Hohe Homologie" betrifft typischerweise eine Homologie von 40% oder höher, vorzugsweise 60% oder höher, weiter bevorzugt 80% oder höher, noch weiter bevorzugt 95% oder höher. Die Homologie eines Proteins kann durch Anwenden des Algorithmus in "Wilbur, W. J. und Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80,726-730" bestimmt werden.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann Variationen in der Aminosäuresequenz, dem Molekulargewicht, isoelektrischen Punkt, dem Vorhandensein oder Fehlen von Zuckerketten oder der Form aufweisen, abhängig von der Zelle oder dem Wirt, welcher verwendet wurde, um es herzustellen, oder dem verwendeten Reinigungsverfahren. Trotzdem liegt es innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung, solange es eine Funktion aufweist, die äquivalent zu der des menschlichen ZNFN3A1(SEQ. ID. NO.2)-Proteins der vorliegenden Erfindung ist.
Die Proteine der vorliegenden Erfindung können als rekombinante Proteine oder natürliche Proteine durch Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, hergestellt werden. Ein rekombinantes Protein kann durch Einsetzen einer DNA, welche das Protein der vorliegenden Erfindung (beispielsweise die DNA, welche die Nukleotidsequenz von SEQ. ID. NO.1 umfasst) codiert, in einen geeigneten Expressionsvektor, Einführen des Vektors in eine geeignete Wirtszelle, Erlangen des Extraktes und Reinigen des Proteins durch Unterziehen des Extraktes einer Chromatographie, beispielsweise Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie, Gelfiltration, oder Affinitätschromatographie, unter Verwendung einer Säule an welche Antikörper gegen das Protein der vorliegenden Erfindung befestigt sind, oder durch Kombinieren von mehr als einer der zuvor erwähnten Säulen hergestellt werden.
Wenn das Protein der vorliegenden Erfindung innerhalb von Wirtszellen (beispielsweise Tierzellen und E. coli) als ein Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferaseprotein oder als ein rekombinantes Protein, das mit mehreren Histidinen ergänzt ist, exprimiert wird, kann das exprimierte, rekombinante Protein außerdem unter Verwendung einer Glutathionsäule oder Nickelsäule gereinigt werden.
Nach dem Reinigen des Fusionsproteins ist es außerdem möglich, Regionen außer dem gewünschten Protein durch Schneiden mit Thrombin oder Faktor-Xa, falls erforderlich, auszuschließen.
Ein natürliches Protein kann durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise durch in Kontakt bringen der Affinitätssäule, an welche die unten beschriebenen, an das ZNFN3A1-Protein bindende Antikörper gebunden sind, mit dem Extrakt von Geweben oder Zellen, welche das Protein der vorliegenden Erfindung exprimieren, isoliert werden. Die Antikörper können polyklonale Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper sein.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Partialpeptide des Proteins der vorliegenden Erfindung. Das Partialpeptid weist eine Aminosäuresequenz auf, die spezifisch für das Protein der vorliegenden Erfindung ist, und besteht aus mindestens 7 Aminosäuren, vorzugsweise 8 Aminosäuren oder mehr und weiter bevorzugt 9 Aminosäuren oder mehr. Das Partialpeptid kann beispielsweise verwendet werden, um Antikörper gegen das Protein der vorliegenden Erfindung herzustellen, zum Screenen nach einer Verbindung, die an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet und zum Screenen nach Beschleunigern oder Inhibitoren des Proteins der vorliegenden Erfindung.
Ein Partialpeptid der Erfindung kann durch Gentechnik, durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese oder durch Verdau des Proteins der Erfindung mit einer geeigneten Peptidase hergestellt werden. Zur Peptidsynthese kann beispielsweise eine Festphasensynthese oder Flüssigphasensynthese verwendet werden.
Das isolierte ZNFN3A1-Protein schließt ein putatives 428-Aminosäurenprotein mit einem Zinkfinger-Motif ein, welches durch den offenen Leserrahmen der ZNFN3A1 Polynukleotidsequenz codiert wird. Die Zinkfinger-Domäne (MYND) ist an den Codons 49-87 positioniert und die SET(Su 3-9, Enhancer-of-zeste, Trihorrax)-Domäne ist an den Codons 117-246 positioniert. Wie oben im Detail erörtert, liegt die ZNFN3A1 bindende Region in der SET-Domäne. Deswegen schließt das Partialpeptid von ZNFN3A1 vorzugsweise in die SET-Domäne ein.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung DNA, welche die Proteine der vorliegenden Erfindung codiert, bereit. Die DNA der vorliegenden Erfindung kann zur in vivo oder in vitro Herstellung des Proteins der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, verwendet werden, oder kann zur Gentherapie für Erkrankungen, die einer genetischen Anomalie in dem Gen, welches das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, zugeschrieben werden, verwendet werden. Jede Form der DNA der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, solange sie das Protein der vorliegenden Erfindung codiert. Genauer gesagt, kann von der mRNA synthetisierte cDNA, genomische DNA und chemisch synthetisierte DNA verwendet werden. Die DNA der vorliegenden Erfindung schließt eine DNA ein, welche eine gegebene Nukleotidsequenz sowie ihre degenerierten Sequenzen umfasst, solange die sich ergebende DNA ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert.
Die DNA der vorliegenden Erfindung kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann die DNA der vorliegenden Erfindung durch Herstellen einer cDNA-Bibliothek aus Zellen, welche das Protein der vorliegenden Erfindung exprimieren, und Durchführen einer Hybridisierung unter Verwendung einer Partialsequenz der DNA der vorliegenden Erfindung (beispielsweise SEQ. ID. NO.1) als Sonde hergestellt werden. Eine cDNA-Bibliothek kann beispielsweise durch das in Sambrook J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschriebene Verfahren hergestellt werden; als Alternative können kommerziell erhältliche cDNA-Bibliotheken verwendet werden. Eine cDNA-Bibliothek kann außerdem hergestellt werden durch: Extrahieren von RNAs aus Zellen, welche das Protein der vorliegenden Erfindung exprimieren, Synthetisieren von Oligo-DNAs basierend auf der Sequenz der DNA der vorliegenden Erfindung (beispielsweise SEQ. ID. NO.1), Durchführen einer PCR unter Verwendung der Oligonukleotide als Primer und Amplifizieren von cDNAs, welche das Protein der vorliegenden Erfindung codieren.
Zusätzlich kann durch Sequenzieren der Nukleotide der erhaltenen cDNA routinemäßig die Translationsregion, welche durch die cDNA codiert wird, bestimmt werden und die Aminosäuresequenz des Proteins der vorliegenden Erfindung kann einfach erhalten werden. Überdies kann durch Screenen einer genomischen DNA-Bibliothek, unter Verwendung der erhaltenen cDNA als Sonde, die genomische DNA isoliert werden.
Genauer gesagt, können zuerst die mRNAs aus einer Zelle, Gewebe oder Organ (beispielsweise Ovar, Testis, Plazenta usw.) in welchen das Protein der Erfindung exprimiert wird, hergestellt werden. Bekannte Verfahren können zum Isolieren von mRNAs verwendet werden; zum Beispiel GesamtRNA kann durch Guanidin-Ultrazentrifugation (Chirgwin J. M. et al. Biochemistry 18:5294-5299 (1979)) oder dem AGPC-Verfahren (Chomczynski P. und Sacchi N. Anal. Biochem. 162:155-159 (1987)) hergestellt werden. Zusätzlich kann mRNA aus GesamtRNA unter Verwendung eines mRNA-Aufreinigungskits (Pharmacia) oder dergleichen hergestellt werden, oder als Alternative kann mRNA direkt durch den QuickPrep mRNA Aufreinigungskit (Pharmacia) gereinigt werden.
Die erhaltene mRNA wird verwendet, um DNA unter Verwendung von reverser Transkriptase zu synthetisieren. cDNA kann unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits, wie dem AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthese Kit (Seikagaku Kogyo), synthetisiert werden. Als Alternative kann cDNA synthetisiert und unter Befolgung des 5'-RACE-Verfahrens (Frohman M. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8998-9002 (1988); Belyavsky A. et al. Nucleic Acids Res. 17:2919-2932 (1989)), amplifiziert werden, welches einen hierin beschriebenen Primer und dergleichen, den 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet.
Ein gewünschtes DNA-Fragment wird aus den PCR-Produkten hergestellt und mit einer Vektor-DNA ligiert. Die rekombinanten Vektoren werden verwendet, um E. coli und dergleichen zu transformieren und ein erwünschter rekombinanter Vektor wird aus einer ausgewählten Kolonie hergestellt. Die Nukleotidsequenz der gewünschten DNA kann durch herkömmliche Verfahren, wie Didesoxynukleotid-Kettentermination, verifiziert werden.
Die Nukleotidsequenz einer DNA der Erfindung kann ausgestaltet werden um wirksamer exprimiert zu werden, indem man die Frequenz der Codonnutzung in dem zur Expression verwendeten Wirt berücksichtigt (Grantham R. et al. Nucleic Acids Res. 9:43-74 (1981)). Die DNA der vorliegenden Erfindung kann durch kommerziell erhältliche Kits oder ein herkömmliches Verfahren verändert werden. Zum Beispiel kann die DNA durch Verdau mit Restriktionsenzymen, Insertion eines synthetischen Oligonukleotids oder eines geeigneten DNA-Fragments, Zufügen einer Linkersequenz oder Insertion des Initiationscodons (ATG) und/oder des Stoppcodons (TAA, TGA oder TAG) verändert werden.
Genauer gesagt umfasst die DNA der vorliegenden Erfindung die DNA, welche die Nukleotidsequenz umfasst, die die Zinkfinger-Domäne, positioniert an den Codons 49-87 von SEQ. ID. NO.2 und die SET-Domäne bzw. DET-Domäne, positioniert an den Codons 117-246 von SEQ. ID. NO.2, codiert.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung eine DNA bereit, welche unter stringenten Bedingungen mit einer cDNA hybridisiert, welche die Nukleotidsequenz von SEQ. ID. NO.1 aufweist und ein Protein codiert, das funktionell zu dem oben beschriebenen Protein der Erfindung äquivalent ist. Ein Fachmann kann geeignete, stringente Bedingungen auswählen. Beispielsweise kann eine Bedingung von geringer Stringenz verwendet werden. Weiter bevorzugt kann eine Bedingung von hoher Stringenz verwendet werden. Diese Bedingungen sind die gleichen, wie oben beschrieben. Die obige, hybridisierende DNA ist vorzugsweise eine cDNA oder eine chromosomale DNA.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Vektor bereit, in welchen eine DNA der vorliegenden Erfindung eingesetzt ist. Ein Vektor der vorliegenden Erfindung ist verwendbar, um eine DNA der vorliegenden Erfindung in einer Wirtszelle zu halten oder um das Protein der vorliegenden Erfindung zu exprimieren.
Wenn E. coli eine Wirtszelle ist und der Vektor amplifiziert und in großen Mengen in E. coli (z. B. JM109, DH5α, HB101 oder XL1Blue) hergestellt wird, sollte der Vektor den E. coli "ori" amplifiziert und ein Markergen zum Selektieren von transformierten E. coli (z. B. ein Arzneimittel-Resistenzgen ausgewählt durch ein Arzneimittel, wie Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin, Chloramphenicol oder dergleichen) haben. Beispielsweise können Vektoren der M13-Serie, Vektoren der pUC-Serie, pBR322, pBluescript, pCR-Script, usw. verwendet werden. Zusätzlich können pGEM-T, pDIRECT und pT7 auch zum Subklonieren und Extrahieren von cDNA verwendet werden, wie auch die oben beschriebenen Vektoren. Wenn ein Vektor dazu verwendet wird, das Protein der vorliegenden Erfindung herzustellen, ist ein Expressionsvektor besonders nützlich. Beispielsweise sollten in einem Expressionsvektor, welcher in E. coli exprimiert werden soll, die folgenden Charakteristika in E. coli amplifiziert sein. Wenn E. coli, wie JM109, DH5α, HB101 oder XL1 Blue als Wirtszelle verwendet werden, sollte der Vektor einen Promotor, beispielsweise lacZ-Promotor (Ward et al., Nature (1989) 341,544-546; FASEB J (1992) 6, 2422-2427), araB-Promotor (Better et al., Science (1988) 240,1041-1043) oder T7-Promotor oder dergleichen haben, der wirksam das gewünschte Gen in E. coli exprimieren kann. In dieser Hinsicht können beispielsweise pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress System" (Qiagen), pEGFP und pET (in diesem Fall ist der Wirt vorzugsweise BL21, welcher T7 RNA-Polymerase exprimiert) anstelle der obigen Vektoren verwendet werden.
Zusätzlich kann der Vektor außerdem eine Signalsequenz zur Sezernierung eines Polypeptids enthalten. Eine beispielhafte Signalsequenz, welche das zu sezernierende Protein zum Periplasma von E. coli steuert, ist die pe1B Signalsequenz (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). Mittel zum Einführen des Vektors in die Ziel-Wirtszellen schließen beispielsweise das Calciumchlorid-Verfahren und das Elektroporations-Verfahren ein.
Zusätzlich zu E. coli können beispielsweise Expressionsvektoren, die von Säugetieren abgeleitet sind, (beispielsweise pcDNA3 (Invitrogen) und pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990,18 (17), p5322), pEF, pCDM8), Expressionsvektoren, die von Insektenzellen abgeleitet sind, (beispielsweise "Bac-to-BAC Baculovirus-Expressionssystem" (GIBCO BRL), pBacPAK8), Expressionsvektoren, die von Pflanzen abgeleitet sind (beispielsweise pMH1, pMH2), Expressionsvektoren, die von Tierviren abgeleitet sind (beispielsweise pHSV, pMV, pAdexLcw), Expressionsvektoren, die von Retroviren abgeleitet sind (beispielsweise pZlpneo), Expressionsvektoren, die von Hefe abgeleitet sind (beispielsweise "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01) und Expressionsvektoren, die von Bacillus subtilis abgeleitet sind (beispielsweise pPL608, pKTH50) zum Herstellen des Proteins der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Um den Vektor in Tierzellen, wie CHO, COS oder NIH3T3 Zellen, zu exprimieren, sollte der Vektor einen Promotor aufweisen, der für die Expression in solchen Zellen notwendig ist, beispielsweise den SV40-Promotor (Mulligan et al., Nature (1979) 277,108), den MMLVLTR-Promotor, den EF1α-Promotor (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), den CMV-Promotor und dergleichen und vorzugsweise ein Markergen zum Selektionieren von Transformanten (beispielsweise ein Arzneimittel-Resistenzgen, ausgewählt durch ein Arzneimittel (z. B. Neomycin, G418)). Beispiele für bekannte Vektoren mit diesen Charakteristika schließen beispielsweise pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, und pOP13 ein.
Zusätzlich können Verfahren verwendet werden, um ein Gen stabil zu exprimieren und zur gleichen Zeit die Kopienzahl des Gen in den Zellen zu amplifizieren. Beispielsweise kann ein Vektor, welcher das komplementäre OHFR-Gen umnfasst (beispielsweise pCHO I) in CHO Zellen eingeführt werden, in welchen der Stoffwechselweg zur Synthese von Nukleinsäure deletiert ist, und dann durch Methotrexat (MTX) amplifiziert wird. Außerdem kann für den Fall einer transienten Expression eines Gens, das Verfahren verwendet werden, in welchem ein Vektor, welcher einen Replikationsursprungs von SV40 (pcD, usw.) umfasst, in COS Zellen, welche das SV40 T-Antigen exprimierende Gen auf dem Chromosom umfassen, transformiert wird.
Ein wie oben erhaltenes Protein der vorliegenden Erfindung kann vom Inneren oder Äußeren (wie Medium) der Wirtszellen isoliert und als im Wesentlichen reines, homogenes Protein gereinigt werden. Der Begriff "im Wesentlichen rein", wie hierin verwendet, bedeutet mit Bezug auf ein gegebenes Polypeptid, dass das Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen biologischen Makromolekülen ist. Das im Wesentlichen reine Polypeptid ist mindestens zu 75% (z. B. mindestens 80, 85, 95 oder 99%) rein nach Trockengewicht. Reinheit kann durch jedes geeignete Standardverfahren, beispielsweise durch Säulenchromatographie, Polyacrylamidgelelektrophorese oder HPLC-Analyse gemessen werden. Das Verfahren zur Proteinisolierung und -reinigung ist nicht auf ein bestimmtes Verfahren eingeschränkt; tatsächlich kann jedes Standardverfahren verwendet werden. Zum Beispiel Säulenchromatographie, Filter, Ultrafiltration, Salzpräzipitation, Lösungsmittelpräzipitation, Lösungsmittelextraktion, Destillation, Immunpräzipitation, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, Elektrophorese nach isoelektrischem Punkt, Dialyse und Rekristallisation können in geeigneter Weise ausgewählt und kombiniert werden, um das Protein zu isolieren und zu reinigen.
Beispiele für Chromatographie schließen beispielsweise Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltration, Umkehrphasenchromatographie, Absorptionschromatographie und dergleichen (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988))ein. Diese Chromatographien können durch Flüssigchromatographie, wie HPLC und FPLC durchgeführt werden. Deshalb stellt die vorliegende Erfindung hoch gereinigte Proteine bereit, die durch die obigen Verfahren hergestellt sind.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann wahlweise durch Behandlung mit einem geeigneten Proteinmodifizierungs-Enzym vor oder nach Reinigung modifiziert oder teilweise deletiert werden. Nützliche Proteinmodifizierungs-Enzyme schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Trypsin, Chymotrypsin, Lysylendopeptidase, Proteinkinase, Glucosidase und so weiter.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Antikörper bereit, der an das Protein der Erfindung bindet. Der Antikörper der Erfindung kann in jeder Form verwendet werden, wie als monoklonale oder polyklonale Antikörper und schließt Antiserum ein, welches durch Immunisieren eines Tieres, wie eines Kaninchens, mit dem Protein der Erfindung erhalten wurde, alle Klassen von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, menschliche Antikörper und humanisierte Antikörper, die durch genetische Rekombination hergestellt wurden.
Ein Protein der Erfindung, welches als ein Antigenen verwendet wurde, um einen Antikörper zu erhalten, kann von jeder Tieresspezies abgeleitet sein, ist aber vorzugsweise von einem Säugetier, wie einem Menschen, einer Maus oder Ratte, weiter bevorzugt von einem Menschen abgeleitet. Ein von einem Menschen abgeleitetes Protein kann aus den hierin offenbarten Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen erhalten werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das als ein Immunisierungsantigen zu verwendende Protein ein vollständiges Protein oder ein Partialpeptid des Proteins sein. Ein Partialpeptid kann beispielsweise das Amino(N)-terminale oder Carboxy(C)-terminale Fragment eines Proteins der vorliegenden Erfindung sein. Hierin ist ein Antikörper definiert als ein Protein, das entweder mit der vollständigen Länge oder einem Fragment des Proteins der vorliegenden Erfindung reagiert.
Ein Gen, das ein Protein der Erfindung oder sein Fragment codiert, kann in einen bekannten Expressionsvektor eingeführt werden, welcher dann verwendet wird, um wie hierin beschrieben eine Wirtszelle zu transformieren. Das gewünschte Protein oder sein Fragment kann aus dem Äußeren oder Inneren der Wirtszellen durch jedes Standardverfahren gewonnen werden und kann nachfolgend als Antigen verwendet werden. Als Alternative können vollständige Zellen, die das Protein exprimieren, oder deren Lysate oder ein chemisch synthetisiertes Protein als das Antigen verwendet werden.
Jedes Säugetier kann mit dem Antigen immunisiert werden, aber vorzugsweise wird die Verträglichkeit mit den Elternzellen, die zur Zellfusion verwendet wurden, berücksichtigt. Im Allgemeinen werden Tiere der Ordnung Rodentia, Lagomorpha oder Primaten verwendet.
Tiere der Ordnung Rodentia schließen beispielsweise Maus, Ratte und Hamster ein. Tiere der Ordnung Lagomorpha schließen beispielsweise Kaninchen ein. Tiere der Ordnung Primaten schließen beispielsweise Catarrhini-Affen (Affen der alten Welt) wie Macaca fascicularis, Rhesusaffen, Mantelpavian und Schimpansen ein.
Verfahren zur Immunisierung von Tieren mit Antigenen sind im Stand der Technik bekannt. Intraperitoneale Injektion oder subkutane Injektion von Antigenen ist ein Standardverfahren zur Immunisierung von Säugetieren. Genauer gesagt können Antigene verdünnt und in einer geeigneten Menge an Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), physiologischer Kochsalzlösung usw. suspendiert werden. Falls erwünscht kann die Antigensuspension mit einer geeigneten Menge eines Standard-Adjuvanz, wie Freund's komplettes Adjuvanz, als Emulsion hergestellt und dann den Säugetieren verabreicht werden. Vorzugsweise wird dies von mehreren Verabreichungen von Antigenen, gemischt mit einer geeigneten Menge an Freund's unvollständigem Adjuvanz, alle 4 bis 21 Tage gefolgt. Eine geeignete Trägersubstanz kann ebenfalls zur Immunisierung verwendet werden. Nach einer Immunisierung wie oben, wird Serum durch Standardverfahren auf einen Anstieg der Menge der gewünschten Antikörper untersucht.
Polyklonale Antikörper gegen die Proteine der vorliegenden Erfindung können durch Sammeln von Blut des immunisierten Säugetiers, das auf einen Anstieg der Menge der gewünschten Antikörper im Serum untersucht wurde, und Abtrennen des Serums von Blut durch jedes herkömmliche Verfahren hergestellt werden. Polyklonale Antikörper schließen sowohl Serum ein, welches die polyklonale Antikörper enthält, es kann auch die Fraktion, welche die polyklonalen Antikörper enthält, aus dem Serum isoliert werden. Immunglobulin G oder M, welches nur das Protein der vorliegenden Erfindung erkennt, unter Verwendung von beispielsweise einer Affinitätssäule, gekoppelt mit dem Protein der vorliegenden Erfindung, und weiter Reinigen dieser Fraktion unter Verwendung von einer ProteinA- oder ProteinG-Säule kann aus einer Fraktion hergestellt werden.
Um monoklonale Antikörper herzustellen, werden Immunzellen aus dem mit dem Antigen immunisierten Tier gesammelt und auf ein erhöhtes Niveau der gewünschten Antikörper im Serum, wie oben beschrieben, untersucht, und werden dann einer Zellfusion unterzogen. Die Immunzellen, die zur Zellfusion verwendet werden, werden vorzugsweise aus der Milz erhalten.
Andere bevorzugte Elternzellen, die mit den obigen Immunozyten fusioniert werden sollen, schließen beispielsweise Myelomzellen von Säugetieren und weiter bevorzugt Myelomzellen mit einer erworbenen Eigenschaft zur Selektion von fusionierten Zellen durch Arzneimittel ein.
Die obigen Immunozyten und Myelomzellen können gemäß bekannter Verfahren, beispielsweise dem Verfahren von Milstein et al. (Galfre, G. und Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) fusioniert werden.
Die sich ergebenden Hybridomata, die durch die Zellfusion erhalten wurden, können durch Kultivieren in einem Standard-Selektionsmedium, wie HAT-Medium (Hypoxanthin Aminopterin und Thymidin enthaltenes Medium) selektioniert werden. Die Zellkultur wird typischerweise im HAT-Medium für mehrere Tage bis mehrere Wochen fortgesetzt, wobei die Zeit ausreichend ist, um all die anderen Zellen (nicht fusionierten Zellen) mit Ausnahme der gewünschten Hybridomata sterben zu lassen. Dann wird die Standard-Grenzwertverdünnung durchgeführt, um eine Hybridoma-Zelle zu screenen und zu klonieren, welche den gewünschten Antikörper herstellt.
Zusätzlich zum obigen Verfahren, in welchem ein nicht menschliches Tier zum Herstellen von Hybridoma mit einem Antigen immunisiert wird, können menschliche Lymphozyten, wie solche die mit EB-Virus infiziert sind, mit einem Protein, Protein exprimierenden Zellen oder deren Lysate in vitro immunisiert werden. Dann werden die immunisierten Lymphozyten mit vom Menschen abgeleiteten Myelomzellen, welche in der Lage sind, sich unbegrenzt zu teilen, wie U266, fusioniert um Hybridoma zu erhalten, die einen gewünschten menschlichen Antikörper herstellern, welcher in der Lage ist, das Protein zu binden (ungeprüfte, veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. (JP-A) Sho 63-17688).
Die erhaltenen Hybridomata werden nachfolgend in die Abdominalhöhle einer Maus transplantiert und der Aszitis wird extrahiert. Die erhaltenen, monoklonale Antikörper können beispielsweise durch Ammoniumsulfat-Präzipitation, eine ProteinA- oder ProteinG-Säule, DEAE-Ionenaustauschchromatographie, oder einer Affinitätssäule, an welche das Protein der vorliegenden Erfindung gekoppelt ist, gereinigt werden. Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann nicht nur zur Reinigung und Nachweis des Proteins der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sondern auch als Kandidat für Agonisten und Antagonisten für das Protein der vorliegenden Erfindung. Zusätzlich kann dieser Antikörper auf die Antikörperbehandlung für Erkrankungen, die mit dem Protein der vorliegenden Erfindung in Zusammenhang stehen, angewandt werden. Wenn der erhaltene Antikörper einem menschlichen Körper verabreicht werden soll (Antikörperbehandlung) wird ein menschlicher Antikörper oder humanisierter Antikörper bevorzugt, um die Immunogenität zu verringern.
Beispielsweise können transgene Tiere, die ein Repertoire von menschlichen Antikörper-Genen aufweisen, mit einem Antigen immunisiert werden, das ausgewählt ist aus einem Protein, Protein exprimierenden Zellen oder deren Lysate. Antikörper produzierende Zellen werden dann aus den Tieren gesammelt und mit Myelomzellen fusioniert, um Hybridoma zu erhalten, aus denen menschliche Antikörper gegen das Protein hergestellt werden können (siehe WO 92-03918, WO 93-2227, WO 94-02602, WO 94-25585, WO 96-33735 und WO 96-34096).
Als Alternative kann eine Antikörper herstellende Immunzelle, wie ein immunisierter Lymphozyt, durch ein Onkogen immortalisiert und zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern verwendet werden.
So erhaltene monoklonale Antikörper können außerdem rekombinant, unter Verwendung von Gentechnikverfahren, hergestellt werden (siehe beispielsweise Borrebaeck C. A. K. und Larrick J. W. Therapeutic Monoclonal Antibodies, publiziert in Großbritannien durch MacMillan Publishers LTD (1990)). Beispielsweise kann eine DNA, die einen Antikörper codiert, aus einer Immunzelle wie einer Hybridoma oder einer immunisierten Lymphozyten, die den Antikörper herstellt, kloniert, in einen entsprechenden Vektor eingesetzt und in Wirtszellen eingeführt werden, um einen rekombinanten Antikörper herzustellen. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem rekombinante Antikörper, die wie oben beschrieben hergestellt werden, bereit.
Außerdem kann ein Antikörper der vorliegenden Erfindung ein Fragment eines Antikörpers oder eines modifizierten Antikörper sein, solange er an eines oder mehrere der Proteine der Erfindung bindet. Zum Beispiel kann das Antikörperfragment ein Fab, F(ab')₂, Fv oder Einzelketten-Fv (scFv) sein, in welchem Fv-Fragmente der H- und L-Ketten durch einen geeigneten Linker ligiert sind (Huston J. S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883 (1988)). Genauer gesagt kann ein Antikörperfragment durch Behandlung eines Antikörpers mit einem Enzym, wie Papain oder Pepsin erzeugt werden. Als Alternative kann ein Gen, welches das Antikörperfragment codiert, konstruiert, in einen Expressionsvektor eingesetzt und in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert werden (siehe beispielsweise Co M. S. et al. J. Immunol. 152:2968-2976 (1994); Better M. und Horwitz A. H. Methods Enzymol. 178:476-496 (1989); Pluckthun A. und Skerra A. Methods Enzymol. 178:497-515 (1989); Lamoyi E. Methods Enzymol. 121:652-663 (1986); Rousseaux J. et al. Methods Enzymol. 121:663-669 (1986); Bird R. E. und Walker B. W. Trends Biotechnol. 9:132-137 (1991)).
Ein Antikörper kann durch Konjugation mit einer Vielzahl von Molekülen, wie Polyethylenglycol (PEG) modifiziert werden. Die vorliegende Erfindung stellt solche modifizierten Antikörper bereit. Der modifizierte Antikörper kann durch chemisches Modifizieren eines Antikörpers erhalten werden. Diese Modifikationen sind im Fachgebiet üblich.
Als Alternative kann ein Antikörper der vorliegenden Erfindung als ein chimärer Antikörper, zwischen einer variablen Region, die von einem nicht menschlichen Antikörper abgeleitet ist, und der konstanten Region, die von einem menschlichen Antikörper abgeleitet ist, oder als ein humanisierter Antikörper, umfassend den komplementbestimmenden Bereich (CDR), der von einem nicht menschlichen Antikörper abgeleitet ist, die Gerüstregion (FR), die von einem menschlichen Antikörper abgeleitet ist, und die konstante Region, erhalten werden. Solche Antikörper können unter Verwendung von bekannter Technologie hergestellt werden.
Wie oben erhaltene Antikörper können bis zur Homogenität gereinigt werden. Beispielsweise kann die Trennung und Reinigung des Antikörpers nach den Trennungs- und Reinigungsverfahren durchgeführt werden, die für allgemeine Proteine verwendet werden. Beispielsweise kann der Antikörper durch angemessen ausgewählte und kombinierte Verwendung von Säulenchromatographien, wie Affinitätschromatographie, Filter, Ultrafiltration, Aussalzen, Dialyse, SDS-Polyacrylamidgelektrophorese, isoelektrische Fokussierung und andere (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Gold Spring Harbor Laboratory, 1988), aber nicht darauf beschränkt, getrennt und isoliert werden.
Eine ProteinA- oder ProteinG-Säule kann als Affinitätssäule verwendet werden. Beispielhafte, zu verwendende ProteinA-Säulen schließen beispielsweise Hyper D, POROS und Sepharose F.F. (Pharmacia) ein.
Beispielhafte Chromatographie, mit der Ausnahme von Affinität, schließt beispielsweise Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltration, Umkehrphasenchromatographie, Absorptionschromatographie und dergleichen (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996) ein. Die chromatographischen Verfahren können durch Flüssigphasenchromatographie, wie HPLC, FPLC durchgeführt werden.
Beispielsweise kann eine Messung der Absorption, Enzym-verknüpfter Immunosorbentassay (ELISA), Enzymimmunassay (EIA), Radioimmunassay (RIA), und/oder Immunfluoreszenz verwendet werden, um die Antigenbindungsaktivität des Antikörpers der Erfindung zu messen. In einem ELISA wird der Antikörper der vorliegenden Erfindung auf einer Platte immobilisiert, Protein der Erfindung wird auf die Platte aufgetragen und dann wird eine den gewünschten Antikörper enthaltende Probe, wie ein Kulturüberstand von Antikörper-produzierenden Zellen oder gereinigte Antikörper, aufgetragen. Dann wird ein sekundärer Antikörper, der den primären Antikörper erkennt und mit einem Enzym wie alkalische Phosphatase markiert ist, aufgetragen und die Platte wird inkubiert. Nach dem Waschen wird als Nächstes ein Enzymsubstrat, wie p-Nitrophenylphosphat, zur Platte zugefügt und die Absorption wird gemessen, um die Antigenbindungsaktivität der Probe zu beurteilen. Ein Fragment des Proteins, wie ein C-terminales oder N-terminales Fragment kann als Protein verwendet werden. BIAcore (Pharmacia) kann verwendet werden, um die Aktivität des Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung zu beurteilen.
Die obigen Verfahren ermöglichen den Nachweis oder die Messung von Protein der Erfindung, indem der Antikörper der Erfindung einer Probe ausgesetzt wird, von der angenommen wird, dass sie das Protein der Erfindung enthält, und Nachweisen oder Messen des durch den Antikörper und das Protein gebildeten Immunkomplexes.
Weil das Nachweis- oder Messungsverfahren für das Protein gemäß der Erfindung spezifisch ein Protein nachweisen oder messen kann, kann das Verfahren in einer Vielzahl von Experimenten, in denen das Protein verwendet wird, nützlich sein.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Polynukleotid bereit, welches mit der DNA hybridisiert, die menschliches ZNFN3A1-Protein (SEQ. ID. NO.1) codiert, oder dem komplementären Strang davon und welches mindestens 15 Nukleotide umfasst. Das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Polynukleotid, welches spezifisch mit der DNA, die das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, hybridisiert. Der Begriff "spezifisch hybridisiert" wie hierin verwendet, bedeutet dass keine signifikante Kreuz-Hybridisierung mit DNA, die andere Proteine codiert, unter den normalen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen auftritt. Solche Polynukleotide schließen Sonden, Primer, Nukleotide und Nukleotidderivate (beispielsweise antisense-Oligonukleotide und Ribozyme), welche spezifisch mit der DNA, die das Protein der Erfindung codiert, oder seinem komplementären Strang hybridisieren. Überdies können solche Polynukleotide zur Herstellung eines DNA-Chips verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung schließt ein antisense-Oligonukleotid, das mit jeder Stelle innerhalb der Nukleotidsequenz von SEQ. ID. NO.1 hybridisiert, ein. Dieses antisense-Oligonukleotid ist vorzugsweise gegen mindestens 15 zusammenhängende Nukleotide der Nukleotidsequenz von SEQ. ID. NO.1 gerichtet. Das oben erwähnte antisense-Oligonukleotid, welches ein Initiationscodon in den oben erwähnten mindestens 15 zusammenhängenden Nukleotiden enthält, wird sogar noch weiter bevorzugt.
Derivate oder modifizierte Produkte von antisense-Oligonukleotiden können als antisense-Oligonukleotide verwendet werden. Beispiele für solche modifizierten Produkte schließen Niederalkylphosphonat-Modifikationen, wie vom Typ Methyl-phosphonat oder vom Typ Ethyl-phosphonat, Phosphorthioat-Modifikationen und Phosphoramidat-Modifikationen ein.
Der Begriff "antisense-Oligonukleotide", wie hierin verwendet, bedeutet nicht nur jene, in welchen die Nukleotide, die denjenigen entsprechen die eine bestimmte Region einer DNA oder mRNA darstellen, vollständig komplementär sind sondern auch solche, die einen Mismatch von einem oder mehreren Nukleotiden aufweisen, solange die DNA oder mRNA und das antisense-Oligonukleotid spezifisch mit der Nukleotidsequenz von SEQ. ID. NO.1 hybridisieren können.
Solche Polynukleotide sind in jenen enthalten, die in der "mindestens 15 zusammenhängende Nukleotide-Sequenzregion", eine Homologie von mindestens 70% oder höher, vorzugsweise 80% oder höher, weiter bevorzugt 90% oder höher, noch weiter bevorzugt 95% oder höher, aufweisen. Der hierin aufgeführte Algorithmus kann zur Bestimmung der Homologie verwendet werden. Solche Polynukleotide sind als Sonden zur Isolierung oder zum Nachweis von DNA, die das Protein der Erfindung codiert, wie in einem späteren Beispiel aufgeführt, oder als ein für Amplifikationen verwendeter Primer nützlich.
Die antisense-Oligonukleotid-Derivate der vorliegenden Erfindung wirken auf Zellen, die das Protein der Erfindung herstellen, durch Binden an die DNA oder mRNA, die das Protein codiert, Hemmung seiner Transkription oder Translation, Förderns des Abbaus der mRNA und Hemmung der Expression des Proteins der Erfindung, was hierdurch die Hemmung der Funktion des Proteins ergibt.
Ein antisense-Oligonukleotid-Derivat der vorliegenden Erfindung kann zu einer äußeren Anwendung, wie einem Liniment oder Breiumschlag, durch Vermischen mit einem geeigneten Basismaterial, welches gegenüber den Derivaten inaktiv ist, verarbeitet werden.
Außerdem können die Derivate, wie benötigt, zu Tabletten, Pulvern, Granula, Kapseln, Liposomen-Kapseln, Injektionen, Lösungen, Nasentropfen und gefriergetrockneten Mitteln formuliert werden, durch Zugabe von Trägerstoffen, isotonischen Mitteln, Lösungsmittel, Stabilisierungsmittel, Konservierungsstoffen, Schmerzmitteln und dergleichen. Diese können durch Befolgen der normalen Verfahren hergestellt werden.
Das antisense-Oligonukleotid-Derivat wird dem Patienten durch direkte Anwendung auf die erkrankte Stelle oder durch Injektion in ein Blutgefäß, so dass es die Stelle der Erkrankung erreicht, gegeben. Ein antisense-Einbettungsmedium kann ebenfalls verwendet werden, um die Dauerhaftigkeit und Membranpermeabilität zu erhöhen. Beispiele sind Liposomen, poly-L-Lysin, Lipid, Cholesterin, Lipofectin oder Derivate von diesen.
Die Dosierung des antisense-Oligonukleotid-Derivats der vorliegenden Erfindung kann in geeigneter Weise gemäß des Zustands des Patienten eingestellt und in den gewünschten Mengen verwendet werden. Beispielsweise kann ein Dosisbereich von 0,1 bis 100 mg/kg, vorzugsweise 0,1 bis 50 mg/kg verabreicht werden.
Das antisense-Oligonukleotid der Erfindung inhibiert die Expression des Proteins der Erfindung und ist dadurch zur Unterdrückung der biologischen Aktivität des Proteins der Erfindung nützlich. Außerdem sind Expressionsinhibitoren, die das antisense-Oligonukleotid der Erfindung enthalten, in dem Punkt nützlich, als dass sie die biologische Aktivität des Proteins der Erfindung hemmen können.
Überdies stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen für eine Verbindung, die das Protein der vorliegenden Erfindung bindet, unter Verwendung des Proteins der vorliegenden Erfindung bereit. Dieses Screening-Verfahren umfasst die Schritte von: (a) in Kontakt bringen des Proteins der vorliegenden Erfindung oder eines Partialpeptids davon mit einer Versuchsprobe, (b) Nachweisen der Bindungsaktivität zwischen dem Protein der vorliegenden Erfindung oder dem Partialpeptid davon und der Versuchsprobe und (c) Auswählen einer Verbindung, die an das Protein der vorliegenden Erfindung oder an das Partialpeptid davon bindet.
Das Protein der vorliegenden Erfindung, das zum Screenen verwendet werden soll, kann ein rekombinantes Protein oder ein von der Natur abgeleitetes Protein oder ein Partialpeptid davon sein. Jede Versuchsprobe, beispielsweise Zellextrakte, Zellkulturüberstand, Produkte von fermentierenden Mikroorganismen, Extrakte aus Meeresorganismen, Pflanzenextrakte, gereinigte oder rohe Proteine, Peptide, Nichtpeptidverbindungen, synthetische mikromolekulare Verbindungen und natürliche Verbindungen können verwendet werden. Das Protein der vorliegenden Erfindung, das mit einer Versuchsprobe in Kontakt gebracht werden soll, kann beispielsweise ein gereinigtes Protein, ein lösliches Protein, eine an einen Träger gebundene Form oder ein Fusionsprotein, das mit anderen Proteinen fusioniert ist, sein.
Als ein Verfahren zum Screenen von Proteinen, die beispielsweise an das Protein der vorliegenden Erfindung binden, unter Verwendung des Proteins der vorliegenden Erfindung können viele Verfahren, die einem Fachmann gut bekannt sind, verwendet werden. Solch ein Screenen kann beispielsweise durch das Immunpräzipitations-Verfahren durchgeführt werden, insbesondere in der folgenden Weise. Das Gen, welches das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, wird in Tierzellen usw. durch Einfügen des Gens in einen Expressionsvektor für fremde Gene, wie pSV2neo, pcDNA I und pCD8 exprimiert. Der für die Expression zu verwendende Promotor kann jeder Promotor sein, der normalerweise verwendet wird und schließt beispielsweise den SV40 frühen Promotor (Rigby in Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, p. 83-141 (1982)), den EF-1α-Promotor (Kim et al., Gene 21, p217-223 (1990)), den CAG-Promotor (Niwa et al. Gene 108, p. 193-200 (1991)), den RSV LTR-Promotor (Cullen Methods in Enzymology 152, p. 684-704 (1987)) den SRα-Promotor (Takebe et al., Mol. Cell. Biol 8 p. 466 (1988), den CMV unmittelbaren frühen Promotor (Seed und Aruffo Proc. Natl. Acad. Sci. USA S4, p. 3365-3369 (1987)), den SV40 späten Promotor (Gheysen und Hers J. Mol. Appl. Genet. 1, p. 385-394 (1982)), den Adenovirus späten Promotor (Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 9, p. 946 (1989)), den HSV TK-Promotor usw. ein. Das Einführen des Gens in Tierzellen, um ein fremdes Gen zu exprimieren, kann gemäß jeden Verfahrens durchgeführt werden, beispielsweise gemäß dem Elektroporationsverfahren (Chu G. et al. Nucl. Acids Res. 15,1311-1326 (1987)), dem Calciumphosphatverfahren (Chen, C und Okayama, H. Mol. Cell. Biol. Z, 2745-2752 (1987)), dem DEAE-Dextranverfahren (Lopata, M. A. et al. Nucl. Acids Res. & 5707-5717 (1984)), Sussman, D. J. und Milman, G. Mol. Cell. Biol. 4,1642-1643 (1985)), dem Lipofectinverfahren (Derijard, B. Cell 7, 1025-1037 (1994); Lamb, B. T. et al. Nature Genetics 5, 22-30 (1993): Rabindran, S. K. et al. Science 253, 230-234 (1993)), usw. Das Protein der vorliegenden Erfindung kann als ein Fusionsprotein, umfassend eine Erkennungsstelle (Epitop) für einen monoklonalen Antikörper, hergestellt werden, indem man das Epitop des monoklonalen Antikörpers, dessen Spezifität aufgedeckt worden ist, am N- oder C- Terminus des Proteins der vorliegenden Erfindung einfügt. Ein kommerziell erhältliches Epitop-Antikörpersystem kann verwendet werden (Experimental Medicine 13, 85-90 (1995)). Vektoren, die ein Fusionsprotein mit beispielsweise β-Galactosidase, Maltose-Bindungsprotein, Glutathion-S-Transferase, grün floreszierendem Protein (GFP) usw. unter Verwendung ihrer Mehrfachklonierungsstellen exprimieren können, sind kommerziell erhältlich.
Ein Fusionsprotein, das durch Einführen von nur kleinen Epitopen, bestehend aus einigen bis zu einem. Dutzend Aminosäuren, so dass die Eigenschaft des Proteins der vorliegenden Erfindung durch die Fusion nicht verändert wird, hergestellt ist, wird ebenfalls vorgelegt. Epitope, wie Polyhistidin (His-tag), Influenza Aggregat HA, mnschliches c-myc, FLAG, Vesicular stomatitis Virus Glycoprotein (VSV-GP), T7 Gen 10 Protein (T7-tag), menschliches, Herpes Simplex Virus Glycoprotein (HSV-tag), E-tag (ein Epitop auf monoclonalen Phagen), und dergleichen und monoklonalen Antikörper, welche diese erkennen, können als das Epitop-Antikörpersystem zum Screenen nach Proteinen, die an das Protein der vorliegenden Erfindung binden, verwendet werden (Experimental Medicine 13, 85-90 (1995)).
Bei einer Immunpräzipitation wird ein Immunkomplex durch Zugabe dieser Antikörper zu Zelllysaten, die unter Verwendung eines geeigneten Detergenz hergestellt wurden, gebildet. Der Immunkomplex besteht aus dem Protein der vorliegenden Erfindung, einem Protein, das die Bindungsfähigkeit mit dem Protein umfasst, und einem Antikörper. Eine Immunpräzipitation kann außerdem unter Verwendung von Antikörpern gegen das Protein der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, neben der Verwendung von Antikörpern gegen die obigen Epitope. Ein Antikörper gegen das Protein der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durch Einführen eines Gens, welches das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, in einen geeigneten E. coli Expressionsvector, Exprimieren des Gens in E. coli, Reinigen des exprimierten Proteins und Immunisieren von Kaninchen, Mäusen, Ratten, Ziegen, Haushühnern und dergleichen gegen das Protein, hergestellt werden. Der Antikörper kann außerdem durch Immunisieren der obigen Tiere gegen ein synthetisiertes Partialpeptid des Proteins der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
Ein Immunkomplex kann beispielsweise durch ProteinA-Sepharose oder ProteinG-Sepharose präzipitiert werden, wenn der Antikörper ein Maus IgG Antikörper ist. Wenn das Protein der vorliegenden Erfindung als ein Fusionsprotein mit einem Epitop wie GST hergestellt wurde, kann ein Immunkomplex in der gleichen Weise wie in der Verwendung des Antikörpers gegen das Protein der vorliegenden Erfindung gebildet werden, unter Verwendung einer Substanz, die spezifisch an diese Epitope bindet, wie Glutathion-Sepharose 4B.
Eine Immunpräzipitation kann beispielsweise unter Befolgung oder gemäß der Verfahren in der Literatur ausgeführt werden (Harlow, E. und Lane, D.: Antibodies pp. 511-552, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988)).
SDS-PAGE wird im Allgemeinen zu Analyse von immunpräzipitatierten Proteinen verwendet und das gebundene Protein kann durch das Molekulargewicht des Proteins unter Verwendung eines Gels von angemessener Konzentration analysiert werden. Weil das an das Protein der vorliegenden Erfindung gebundene Protein schwierig durch ein herkömmliches Färbe-Verfahren, wie Coomassie-Färbung oder Silberfärbung nachzuweisen ist, kann die Nachweisempfindlichkeit für das Protein durch Kultivieren der Zellen in Kulturmedium, das ein radioaktives Isotop, ³⁵S-Methionin oder ³⁵S-Cystein enthält, Markieren der Proteine in den Zellen und Nachweisen der Proteine, erhöht werden. Das Zielprotein kann direkt aus dem SDS-Polyacrylamidgel gereinigt werden und seine Sequenz kann bestimmt werden, wenn das Molekulargewicht eines Proteins bekannt gegeben wurde.
Als ein Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die an das Protein der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des Proteins binden, kann beispielsweise eine West-Westernblot Analyse verwendet werden (Skolnik, E. Y. et al., Cell (1991) 65, 83-90). Genauer kann ein Protein, das an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet, durch Herstellen einer cDNA-Bibliothek aus Zellen, Geweben oder Organen (beispielsweise Geweben wie Ovar, Testis, und Plazenta oder kultivierten Zellen) von denen erwartet wird, dass sie ein Protein, das an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet, exprimieren, unter Verwendung eines Phagenvectors (z. B., ZAP), Exprimieren des Proteins auf LB-Agarose, Fixieren des exprimierten Proteins auf einem Filter, reagieren lassen des gereinigten und markierten Proteins der vorliegenden Erfindung mit dem obigen Filter und Nachweisen der Plaques, welche Proteine exprimieren, die an das Protein der vorliegenden Erfindung gebunden sind, durch die Markierung erhalten werden. Das Protein der Erfindung kann durch Verwendung der Bindung zwischen Biotin und Avidin, oder durch Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet, oder eines Peptids oder Polypeptids (beispielsweise GST), das mit dem Protein der vorliegenden Erfindung fusioniert ist, markiert werden. Verfahren unter Verwendung eines Radioisotops oder von Fluoreszenz und dergleichen können ebenfalls verwendet werden.
Als Alternative kann in einer anderen Ausführungsform des Screening-Verfahrens der vorliegenden Erfindung ein Zwei-Hybrid-System unter Nutzung von Zellen verwendet werden, "MATCHMAKER Zwei-Hybrid System", "Mammalian MATCHMAKER Zwei-Hybrid-Assay Kit", "MATCHMAIER One-Hybrid System" (Clontech); "HybriZAP Zwei-Hybrid Vektor System" (Stratagene); die Literaturangaben: "Dalton S und Treisman R (1992) Cell 68, 597-612", "Fields S. und Sternglanz R. Trends Genet (1994) 10:286-292").
Im Zwei-Hybrid-System ist das Protein der Erfindung an die SRF-Bindungsregion oder GAL4-Bindungsregion fusioniert und wird in Hefezellen exprimiert. Eine cDNA-Bibliothek wird aus Zellen hergestellt, von denen erwartet wird, dass sie ein Protein exprimieren, welches an das Protein der Erfindung bindet, so dass die Bibliothek wenn sie exprimiert wird, an die VP16 oder GAL4 Transkriptionenaktivierungsregion fusioniert ist. Die cDNA-Bibliothek wird dann in die obigen Hefezellen eingeführt und die aus der Bibliothek abgeleitete cDNA wird aus den nachgewiesenen positiven Clonen isoliert (wenn ein Protein, das an das Protein der Erfindung bindet, in Hefezellen exprimiert wird, aktiviert die Bindung der beiden ein Reportergen, was positive Clone nachweisbar macht). Ein Protein, das durch die cDNA codiert wird, kann durch Einführen der oben isolierten cDNA in E. coli und Exprimieren des Proteins hergestellt werden.
Als ein Reportergen kann beispielsweise das Ade2-Gen, lacZ-Gen, CAT-Gen, Luciferase-Gen und dergleichen neben dem HIS3-Gen verwendet werden.
Eine Verbindung, die an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet, kann unter Verwendung von Affinitätschromatographie gescreent werden. Das Protein der Erfindung kann beispielsweise auf einem Träger einer Affinitätssäule immobilisiert werden und eine Testprobe, die ein Protein enthält, das in der Lage ist das Protein der Erfindung zu binden, wird auf die Säule aufgetragen. Hierin kann eine Testprobe beispielsweise Zellenextrakte, Zelllysate usw. sein. Nach Laden der Testprobe wird die Säule gewaschen und die an das Protein der Erfindung gebundenen Proteine können hergestellt werden.
Die Aminosäuresequenz des erhaltenen Proteins wird analysiert, eine OligoDNA wird basierend auf der Sequenz synthetisiert und cDNA-Bibliotheken werden unter Verwendung der OligoDNA als Sonde gescreent, um eine DNA, die das Protein codiert, zu erhalten.
Ein Biosensor unter Verwendung des Phänomens der Oberflächen-Plasmonresonanz kann als Mittel zum Nachweis oder zum Quantifizieren der gebundenen Verbindung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Wenn solch ein Biosensor verwendet wird, kann die Wechselwirkung zwischen dem Protein der Erfindung und einer Testverbindung in Echtzeit als ein Oberflächen-Plasmonresonanz-Signal beobachtet werden, wobei nur eine winzige Menge an Protein und ohne Markieren verwendet wird (beispielsweise BIAcore, Pharmacia). Deshalb ist es möglich, die Bindung zwischen dem Protein der Erfindung und einer Testverbindung unter Verwendung eines Biosensors wie BIAcore zu beurteilen.
Die Screeningverfahren für Moleküle, die binden, wenn das immobilisierte Protein der vorliegenden Erfindung synthetischen, chemischen Verbindungen, oder Bibliotheken von natürlichen Substanzen oder einer Bibliothek von auf Phagen präsentierten Zufallspeptiden ausgesetzt wird, oder die Screeningverfahren unter Verwendung von Hochdurchsatz basierend auf Techniken der kombinatorischen Chemie (Wrighton Nc, Farrel FX, Chang R, Kashyap AK, Barbone FP, Mulcahy LS, Johnson DL, Barret RW, Jolliffe LK, Dower WJ; Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458-64, Verdine GL, The combinatorial chemistry of nature. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996,384, p11-13, Hogan JC Jr., Directed combinatorial chemistry. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 p17-9), um nicht nur Proteine sondern auch chemischen Verbindungen zu isolieren, die das Protein der vorliegenden Erfindung binden (einschließlich Agonist und Antagonist) sind einem Fachmann gut bekannt.
Eine Verbindung, die durch das Screening isoliert wurde, ist ein Kandidat für Arzneimittel, welche die Aktivität des Proteins der vorliegenden Erfindung fördern oder hemmen, zur Behandlung oder Verhinderung von Erkrankungen, die beispielsweise Zellproliferationserkrankungen wie Krebs zugeschrieben werden. Eine Verbindung, in welcher ein Teil der Struktur der Verbindung, die die Aktivität aufweist, an das Protein der vorliegenden Erfindung zu binden, welche durch das vorliegende Screening-Verfahren erhalten wurde, durch Addition, Deletion und/oder Ersetzen umgeformt wurde, ist in den Verbindungen, die durch das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, eingeschlossen.
Überdies stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung bereit, welche die Aktivität des Proteins der vorliegenden Erfindung fördert oder hemmt. Weil das ZNFN3A1-Protein der vorliegenden Erfindung die Aktivität aufweist, die Zellproliferation zu fördern, kann eine Verbindung, welche diese Aktivität eines ZNFN3A1-Proteins der vorliegenden Erfindung fördert oder hemmt unter Verwendung dieser Aktivität als ein Anzeichen gescreent werden.
Dieses Screening-Verfahren schließt die Schritte ein: (a) Kultivieren von Zellen, welche das ZNFN3A1-Protein exprimieren, in der Gegenwart der Versuchsprobe (b) Nachweisen der Proliferation der Zellen und (c) Auswählen einer Verbindung, welche im Vergleich mit der Proliferation, welche beim Fehlen der Versuchsprobe nachgewiesen wird, die Proliferation fördert oder hemmt. Verbindungen, die die Expression und/oder Aktivität von ZNFN3A1 hemmen, finden eine Anwendung als Antikrebsmittel.
Alle ZNFN3A1-Proteine können zum Screening verwendet werden, solange sie die Aktivität des Hemmens der Zellproliferation umfassen. Beispielsweise kann ein menschliches ZNFN3A1-Protein verwendet werden und funktionell äquivalente Proteine zu diesen Proteinen können ebenfalls verwendet werden. ZNFN3A1-Proteine können endogen oder exogen durch Zellen exprimiert werden.
Alle Versuchsproben, beispielsweise Zellextrakte, Zellkulturüberstand, Produkte von fermentierenden Mikroorganismen, Extrakte aus Meeresorganismen, Pflanzenextrakte, gereinigte oder rohe Proteine, Peptide, Nichtpeptidverbindungen, synthetische mikromolekulare Verbindungen und natürliche Verbindungen können verwendet werden. Eine Verbindung, die durch das obige Screening auf Verbindungen, die an das Protein der vorliegenden Erfindung binden, erhalten wurde, kann auch als Versuchsverbindung verwendet werden.
Die Verbindung, die durch dieses Screening isoliert wurde, ist ein Kandidat für Agonisten oder Antagonisten des Proteins der vorliegenden Erfindung. Der Begriff "Agonist" betrifft Moleküle, welche die Funktion des Proteins der vorliegenden Erfindung durch daran Binden aktivieren. Desgleichen betrifft der Begriff "Antagonist" Moleküle, welche die Funktion des Proteins der vorliegenden Erfindung durch daran Binden hemmen. Darüber hinaus ist eine Verbindung, welche durch dieses Screening isoliert wurde, ein Kandidat für Verbindungen, welche die in vivo Wechselwirkung des Proteins der vorliegenden Erfindung mit Molekülen (einschließlich DNAs und Proteinen) hemmen.
Die Zellproliferation kann beispielsweise durch Bestimmen der Geschwindigkeit der Zellproliferation, Messen des Zellzyklus und dergleichen sowie durch Messen der Koloniebildungsaktivität, wie in den Beispielen beschrieben, nachgewiesen werden.
Die durch das Screening isolierte Verbindung ist ein Kandidat für Arzneimittel, welche die Aktivität des Proteins der vorliegenden Erfindung hemmen, und können für eine Behandlung von Erkrankungen, die mit dem Protein der vorliegenden Erfindung assoziiert sind, beispielsweise Krebs, genauer Leberzellenkarzinom, verwendet werden.
Überdies ist eine Verbindung, in welcher ein Teil der Struktur der Verbindung, welche die Aktivität des ZNFN3A1-Proteins hemmt, durch Addition, Deletion und/oder Ersetzen umgeformt wurde, ebenfalls in den Verbindungen, die durch das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, eingeschlossen.
Wenn die Verbindung, die durch das Verfahren der Erfindung isoliert wurde, als ein Pharmazeutikum an Menschen oder andere Säugetiere, wie Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Hühner, Katzen, Hunde, Schafe, Schweine, Rinder, Affen, Paviane, Schimpansen verabreicht wird, kann die isolierte Verbindung direkt verabreicht werden oder kann unter Verwendung bekannter pharmazeutischer Herstellungsverfahren zu einer Dosierungsform formuliert werden. Beispielsweise können, entsprechend des Bedarfs, die Arzneimittel oral als Zucker-beschichtete Tabletten, Kapseln, Heiltränke und Mikrokapseln genommen werden oder nicht oral, in der Form von Injektionen von sterilen Lösungen oder Suspensionen mit Wasser oder irgendeiner anderen pharmazeutisch akzeptablen Flüssigkeit. Beispielsweise können die Verbindungen mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern oder Medium, insbesondere sterilisierten Wasser, physiologischer Kochsalzlösung, Pflanzenöl, Emulgatoren, Suspensionsmitteln, Benetzungsmitteln, Stabilisatoren, Geschmacksstoffen, Trägerstoffen, Transportmitteln, Konservierungsstoffen, Bindemitteln und dergleichen in einer Dosisform-Einheit gemischt werden, welche für eine allgemein akzeptierte Arzneimittelimplementierung erforderlich ist. Die Menge an aktiven Inhaltsstoffen in diesen Präparationen macht eine geeignete Dosierung innerhalb des angedeuteten Bereichs erreichbar.
Beispiele für Zusatzmittel, die zu Tabletten und Kapseln gemischt werden können, sind Bindemittel wie Gelatine, Maisstärke, Tragantgummi und Gummiarabicum, Trägerstoffe wie kristalline Zellulose, Quellungsmittel wie Maisstärke, Gelatine und Alginsäure, Schmiermittel wie Magnesiumstearat; Süßstoffe wie Sucrose, Lactose oder Saccharin; Geschmacksstoffe wie Pfefferminz, Methylsalicylatöl und Kirsche. Wenn die Dosierungsform-Einheit eine Kapseln ist, kann ein flüssiger Träger, wie ein Öl außerdem in den obigen Inhaltsstoffen eingeschlossen sein. Sterile Bestandteile für Injektionen können unter Befolgung normaler Arzneimittelimplementierungen unter Verwendung von Transportmitteln wie destilliertem Wasser für Injektionen formuliert werden.
Physiologische Kochsalzlösung, Glucose und andere isotonische Flüssigkeiten, einschließlich Adjuvanzien wie D-Sorbitol, D-Mannnose, D-Mannitol und Natriumchlorid können als wässrige Lösungen für Injektionen verwendet werden. Diese können zusammen mit geeigneten Lösungsvermittlern, wie Alkohol, genauer gesagt Ethanol, Polyalkoholen, wie Propylenglycol und Polyethylenglycol, nicht ionischen Benetzungsmitteln, wie Polysorbat 80 (TM) und HCO-50 verwendet werden.
Sesamöl oder Sojabohnenöl können als ölhaltige Flüssigkeit verwendet werden und können zusammen mit Benzylbenzoat oder Benzylalkohol als Lösungsvermittler verwendet werden und können mit einem Puffer, wie Phosphatpuffer und Natriumazetatpuffer; einem Schmerzmittel, wie Procainhydrochlorid; einem Stabilisierungsmittel wie Benzylalkohol, Phenol und einem Antioxidationsmittel formuliert werden. Die hergestellte Injektion kann in eine geeignete Ampulle gefüllt werden.
Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, können verwendet werden, um die erfindungsgemäße pharmazeutische Verbindung den Patienten zu verabreichen, beispielsweise als intraarteriellele, intravenöse, perkutane Injektionen und auch als intranasale, transbronchiale, intramuskuläre oder orale Verabreichungen. Die Dosierung und das Verfahren der Verabreichung variieren entsprechend dem Körpergewicht und dem Alter eines Patienten und dem Verfahren der Verabreichung; ein Fachmann kann diese jedoch routinemäßig auswählen. Wenn die Verbindung durch eine DNA codierbar ist, kann die DNA in einen Vektor für Gentherapie eingesetzt werden und der Vektor wird verabreicht, um die Therapie auszuführen. Die Dosierung und das Verfahren der Verabreichung variieren entsprechend dem Körpergewicht, Alter und Symptomen eines Patienten, aber ein Fachmann kann sie in geeigneter Weise auswählen.
Und obwohl es einige Unterschiede entsprechend den Symptomen gibt, beträgt die Dosis beispielsweise einer Verbindung, die an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet und seine Aktivität reguliert, ungefähr 0,1 mg bis ungefähr 100 mg pro Tag, bevorzugt ungefähr 1,0 mg bis ungefähr 50 mg pro Tag und weiter bevorzugt ungefähr 1,0 mg bis ungefähr 20 mg pro Tag, wenn sie einem normalen Erwachsenen (Gewicht 60 kg) oral verabreicht wird.
Wenn sie parenteral, in der Form einer Injektionen einem normalen Erwachsenen (Gewicht 60 kg) verabreicht wird, ist es geeignet eine Dosis von ungefähr 0,01 mg bis ungefähr 30 mg pro Tag, bevorzugt ungefähr 0,1 bis ungefähr 20 mg pro Tag und weiter bevorzugt ungefähr 0,1 bis ungefähr 10 mg pro Tag intravenös zu injizieren, obwohl es einige Unterschiede gemäß des Patienten, Zielorgans, der Symptome und des Verfahrens der Verabreichung gibt. Außerdem ist es möglich, im Falle von auch anderen Tieren, eine Menge zu verabreichen, die auf 60 kg pro Körpergewicht umgerechnet ist.
Überdies stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von Krebs unter Verwendung des ZNFN3A1-Gens als einen diagnostischen Marker bereit. Dieses Diagnoseverfahren umfasst die Schritte von:

(a) Bestimmen des Expressionsniveaus des ZNFN3A1-Gens in einer biologischen Untersuchungsprobe;
(b) Vergleichen des Expressionsniveaus des ZNFN3A1-Gens mit dem in einer normalen Probe und
(c) Definieren eines hohen Expressionsniveaus des ZNFN3A1-Gens in der Probe, dass Krebs vorliegt.

Die Expressionsniveaus des ZNFN3A1-Gens in einer bestimmten Untersuchungsprobe kann durch Quantifizieren von mRNA entsprechend dem oder Protein codiert durch das ZNFN3A1-Gen abgeschätzt werden. Quantifizierungsverfahren für mRNA sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise können die Niveaus von mRNAs, die dem ZNFN3A1-Gen entsprechen, durch Northern-Blot oder RT-PCR abgeschätzt werden. Weil alle Nukleotidsequenzen des ZNFN3A1-Gens in SEQ ID NO:1 gezeigt sind, kann jeder Fachmann die Nukleotidsequenzen für Sonden oder Primer zum Quantifizieren des ZNFN3A1-Gens entwerfen.
Das Expressionsniveau des ZNFN3A1-Gens kann auch basierend auf Aktivität oder Quantität des Proteins, das durch das ZNFN3A1-Gen codiert wird, abgeschätzt werden. Ein Verfahren zur Bestimmung der Quantität des ZNFN3A1-Proteins wird unten gezeigt. Beispielsweise ist das Immunasssay-Verfahren zur Bestimmung des Proteins in biologischem Material verwendbar. Alle biologischen Materialien können zur Bestimmung des Proteins oder seiner Aktivität verwendet werden. Beispielsweise wird eine Blutprobe zur Abschätzung des Proteins, das durch einen Serum-Marker codiert wird, analysiert. Auf der anderen Seite kann ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Proteinaktivität, die durch das ZNFN3A1-Gen codiert wird, gemäß der Aktivität jedes zu analysierenden Proteins ausgewählt werden.
Expressionsniveaus des ZNFN3A1-Gens in einer Untersuchungsprobe (Testprobe) werden abgeschätzt und mit jenen in einer normalen Probe verglichen. Wenn solch ein Vergleich zeigt, dass das Expressionsniveau des ZNFN3A1-Gens höher ist, als jenes in der normalen Probe, wird der Proband als von Krebs betroffen beurteilt. Das Expressionsniveau des ZNFN3A1-Gens in den Untersuchungsproben der normalen Probe und des Probanden kann zur gleichen Zeit bestimmt werden. Als Alternative können normale Bereiche der Expressionsniveaus durch ein statistisches Verfahren, basierend auf den Ergebnissen, die durch Analysieren des Expressionsniveaus des ZNFN3A1-Gens in zuvor aus einer Kontrollgruppe gesammelten Untersuchungsproben, bestimmt werden. Ein Ergebnis, das durch Untersuchen der Probe eines Probanden erhalten wurde, wird mit dem normalen Bereich verglichen; wenn das Ergebnis nicht innerhalb des normalen Bereich fällt, wird der Proband als von Krebs betroffen beurteilt. In der vorliegenden Erfindung ist der zu diagnostizierende Krebs vorzugsweise ein Leberzellenkarzinom.
In der vorliegenden Erfindung wird auch ein diagnostisches Mittel zur Diagnose von Leberzellenkarzinom bereitgestellt. Das diagnostische Mittel der vorliegenden Erfindung umfasst eine Verbindung, die an die DNA oder das Protein der vorliegenden Erfindung bindet. Vorzugsweise können Oligonukleotide, die and das die Polynukleotid der vorliegenden Erfindung hybridisieren, oder die Antikörper, welche an das Protein der vorliegenden Erfindung binden können, als diese Verbindung verwendet werden.
Die folgenden Beispiele werden dargestellt um die vorliegende Erfindung zu erläutern und den Durchschnittsfachmann in der Herstellung und der Verwendung derselben zu unterstützen. Die Beispiele sollen in keiner Weise den Umfang der Erfindung in anderer Weise beschränken.
BEISPIELE
Beste Art und Weise die Erfindung auszuführen
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele detailliert erläutert, ist aber nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Materialien und Methoden
Eine Vielzahl von Säugetier-Wirtszellen, einschließlich der menschlichen Hepatoma-Zelllinien Huh7 und Alexander, der menschlichen Zervixzelllinie HeLa und der Maus Fibroblasten-Zelllinie NIH3T3, die alle von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten wurden, wurden verwendet, um ZNFN3A1 zu isolieren und zu charakterisieren. Die menschlichen Hepatoma-Zelllinien SNU423 und SNU475 wurden ebenfalls verwendet und wurden von der koreanischen Zelllinien-Bank erhalten.
Alle Zelllinien wurden in einschichtigen Zellrasen in passenden Medien gezüchtet: Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium für Huh7, Alexander und NIH3T3; Eagle's Minimum Essentielles Medium für HeLa; RPM1640 für SNU423 und SNU475, ergänzt mit 10% fötalen Kälberserum und 1% antibiotischer/antimycotischer Lösung (Sigma), und bei 37°C in Luft mit 5% CO₂ gezüchtet.
Das Klonieren von ZNFN3A1 wurde im Allgemeinen durch PCR unter Verwendung von KOD-plus (TOYOBO) durchgeführt. Zur Expression in E. Coli wurde die codierende Region von ZNFN3A1 in die EcoR I-Kpn I Schnittstelle von pET21a kloniert.
Zur Expression in Säugetier-Zellen wurde die codierende Region von ZNFN3A1 in die EcoR I-Kpn I Schnittstelle von pcDNA3.1(+) und (–) (Invitrogen), die EcoR I-Kpn I Schnittstelle von pFLAG und die EcoR I-Kpn I Schnittstelle von pEGFP (Clontech) kloniert. Die codierende Region von KIAA0054 wurde in die EcoR I-Xho I Schnittstelle von pCMV-HA (Clontech) kloniert.
In den folgenden Experimenten wurde die RNA durch Extraktion von GesamtRNA mit dem Qiagen RNeasy Kit (Qiagen) oder Trizol-Reagenz (Life Technologies) gemäß der Arbeitsanweisung des Herstellers hergestellt:
Die RNA wurde hierin durch RT-PCR amplifiziert. 10 μg GesamtRNA wurden revers zu einzelsträngigen cDNAs unter Verwendung von poly-dT_12,18 Primern (Amersham Biosciences) mit Superscript II reverser Transkriptase (Life Technologies) transkribiert. Jede einzelsträngige cDNA wurde für die nachfolgende PCR Amplifikation verdünnt. Standard RT-PCR wurde in einem 20 μl Volumen von PCR Puffer (TAKARA) durchgeführt und für 4 Min. bei 94°C zur Denaturierung, gefolgt von 20 (für GAPDH) oder 30 (für ZNFN3A1) Zyklen von 94°C für 30 Sek., 56°C für 30 Sek., 72°C für 30 Sek. im GenAmp-PCR System 9700 (Perkin-Elmer) amplifiziert. Primer-Sequenzen waren wie folgt: für GAPDH vorwärts; 5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG (SEQ. ID. NO.4) and rückwärts; 5'-GGTCCACCACTGACACGTTG (SEQ. ID. NO.5), für ZNFN3A1 vorwärts; 5'-TTCCCGATATCAACATCTACCAG (SEQ. ID. NO.6) und rückwärts; 5'-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT (SEQ. ID. NO.7).
Zum Nachweis von ZNFN3A1 wurde ein Kaninchen anti-ZNFN3A polyklonaler Antikörper erzeugt. Die gesamte codierende Sequenz von ZNFN3A1 wurde durch PCR-Reaktion unter Verwendung von Testis cDNA als Template amplifiziert und in pET21a (Novagen) kloniert. Der klonierte Vektor wurde in BL21-CodonPlus^® kompetenten Zellen (StrataGen) transfiziert. Rekombinantes ZNFN3A1-Protein wurde durch 1,0 mM IPTG bei 30°C für 6 Std. induziert. His-ZNFN3A1-Fusionsprotein wurde unter Verwendung von Pro Bond^TM Harz (Invitrogen) gereinigt. Kaninchen wurden zehn mal mit gereinigtem His-ZNFN3A1 immunisiert. Immunblotting mit diesem polyklonalen Antikörper zeigte eine einzelne 50 kD Bande von FLAG-markiertem ZNFN3A1, was ein identisches Muster zu dem war, das unter Verwendung von anti-FLAG monoklonalem Antikörper (Sigma) (Daten nicht gezeigt) nachgewiesen wurde.
Die Wirkung von ZNFN3A1 im Verlauf des Zellzyklus wurde durch Durchflusszytometrie bestimmt. Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/100 mm Schale plattiert. Die Zellen wurden in einem vorgegebenen zeitlichen Ablauf trypsinisiert, in PBS gesammelt und in 70% kaltem Ethanol fixiert. Nach einer RNase-Behandlung wurden die Zellen mit Propidiumiodid (50 μg/ml) in PBS gefärbt. Durchflusszytometrie wurde auf einem Becton Dickinson FACScan durchgeführt und durch CellQuest und Mod Fit Software (Verity Software House) analysiert. Die prozentualen Anteile von Nuklei in G0/G1-, S- und G2/M-Phasen des Zellzyklus und jede sub-G1 Population wurden aus mindestens 20.000 nicht gegateten Zellen bestimmt.
Immunblotting und Immunhistochemie wurden ebenfalls in verschiedenen Experimenten durchgeführt. Für das Immunblotting wurden die Zellen zweimal mit PPS gewaschen und in Lysispuffer (150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50mM Tris-HCl pH 7,4, 1mM DTT und 1 × kompletter Protease Inhibitor Cocktail (Roche)) geerntet. Nachdem die Zellen homogenisiert und bei 10.000 × g für 30 Min zentrifugiert worden waren, wurde der Überstand durch den Bradford-Assay (Bio-Rad) auf Proteinkonzentration standardisiert. Proteine wurden durch 10% SDS-PAGE aufgetrennt und mit Maus anti-FLAG, Kaninchen anti-RNA-Polymerase II, Kaninchen anti-HA Antikörper und Kaninchen anti-ZNFN3A1 Antikörper immungeblotted. HRP-konjugiertes Ziege anti-Maus IgG und anti-Kaninchen IgG dienten als der sekundäre Antikörper für das ECL-Nachweissystem (Amersham Biosciences).
Für die Immunhistochemie wurde eine immunhistochemische Färbung unter Verwendung von anti-ZNFN3A1 Antikörper durchgeführt. In Paraffin eingebettete Gewebeschnitte wurden dem SAB-PO Peroxidase-Immunfärbesystem (Nichirei, Tokyo, Japan) entsprechend des vom Hersteller empfohlenen Verfahrens ausgesetzt. Antigene wurden aus entparaffinierten und rehydrierten Geweben durch Vorbehandlung der Objektträger in Citratpuffer (pH 6) in einem Mikrowellenofen für 10 mm bei 700W wiedererlangt.
Beispiel 1: Identifizierung eines neuen Gens, das in HCCs häufig hochreguliert ist
Unter Verwendung eines genomweiten cDNA Mikroarrays mit 23 040 Genen, haben wir eine exprimierte sequenzmarkierte Stelle (EST) identifiziert, welche im Allgemeinen in Hepatitis B-positiven und/oder Hepatitis C-positiven HCCs hochreguliert war. Unter ihnen haben wir uns auf ein Gen A6681 konzentriert, welches einem EST (Hs. 8109) entsprach, weil seine Expression in elf von zwölf (91,7%) klinischen HCCs verglichen mit den entsprechenden nichtkrebsartigen Lebergeweben (1A) signifikant hochreguliert war. Die erhöhte Expression des Gens A6681 wurde auch in weiteren 10 HCC Fällen durch RT-PCR (1B) bestätigt. Die relative Expression, welche durch halb-quantitative RT-PCR bestätigt wurde, korrelierte gut mit jener, die durch cDNA Mikroarray bestätigt wurde
Beispiel 2A: Isolierung und Charakterisierung eines neuen menschlichen Gens ZNFN3A1
Northernblots mit mehreren Geweben von Clonetech wurden verwendet, um eine mit ³²P markierte, partielle A6681 cDNA mit einem ungefähr 1,7-kb Transkript, das in von Clontech gekaufter Testis und Skelettmuskulatur (1C) exprimiert wurde, zu hybridisieren. Die A6681-Sonde wurde durch RT-PCR unter Verwendung eines Satzes von Primern, 5'-TTCCCGATATCAACATCTACCAG-3' (SEQ. ID. NO.6) und 5'-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT-3' (SEQ. ID. NO.7) hergestellt. Prähybridisierung, Hybridisierung und Waschen wurden gemäß der Empfehlungen des Lieferanten durchgeführt. Die Blots wurden mit Verstärkungsfolien bei –80°C für 24 Std. autoradiographiert. Das ungefähr 1,7 kb Polynukleotid-Transkript wurde das ZNFN3A1-Gen genannt.
Die Sequenz der 5' Region des Transkripts wurde durch 5' schnelle Vermehrung von cDNA-Enden (5'RACE) bestimmt, welche unter Verwendung des Marathon cDNA Amplifikations-Kit von Clontech gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt wurde. Zur Amplifikation des 5' Teils der ZNFN3A1 cDNA, wurde ein Gen-spezifischer, Rückwärts-Primer verwendet (5'-CTGCCAAGAAGTCGGAGTCTGGAG) [SEQ. ID. NO.8]. Das cDNA Template wurde aus mRNA von menschlichem Testis durch RT-PCR synthetisiert. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung des TA Klonierungs-Kits von Invitrogen kloniert und ihre Sequenzen wurden mit einem ABI PRISM 377 DNA-Sequenzierungsgerät von Applied Biosystems bestimmt. Als Ergebnis wurde eine 1622 Nukleotidsequenz zusammengesetzt und, wie gezeigt und beschrieben in SEQ. ID. NO: 1 erhalten, die einen offenen Leserrahmen von 1284 Nukleotiden, welche 428 Aminosäuren codieren, enthält.
Weil keine EST-Klone mit dem 5' Teil des ZNFN3A1-Gens in EST-Datenbanken identifiziert wurden, wurden genomische Sequenzen, die der ZNFN3A1 cDNA entsprechen, in den genomische Datenbanken gesucht. Cosmid-Sequenzen, die der chromosomalen Bande 1q44, welche auch das ZNFN3A1-Gen einschließt, zugeordnet sind, wurden im genomischen Sequenzvergleich gefunden. Unter Verwendung von GENSCAN und Gen Recognition (GENSCAN von MIT http://genes.mit edu/GENSCAN.html) und GRAIL 2 von IMS (http://vww.genome.ad.jp)) und dem Assembly Internet Link Programm (AutoAssembler 2.1) bereitgestellt durch ABI, wurden die Kandidatenexon-Sequenzen vorhergesagt und eine Verbindung der Exone durchgeführt.
Beispiel 2B: Isolierung und Charakterisierung eines neuen menschlichen Proteins, ZNIFN3A1
Mit der 1622 Nukleotidsequenz, die einen offenen Leserrahmen enthielt, welcher 428 Aminosäuren codiert, wurde das ZNFN3A1-Protein unter Verwendung eines Simple Modular Architecture Research Tools (SMART) von EMBL (http://smart embl-heidelberg.de) identifiziert. SMART schlug vor, dass das ZNFN3A1-Protein eine zf-MYND[Zinkfinger Protein (MYND) Domäne enthaltend]-Domäne (Codons 49-87) sowie eine SET (Su (var) 3-9, Enhancer-of-zeste, Trithorax)]-Domäne (Codons 117-246) (2A) enthielt. Die Aminosäuresequenz des ZNFN3A1-Proteins teilt 94% Identität mit der Aminosäuresequenz der Mus musculus ES-Zellen cDNA (GenBank Zugangsnummer AK010447) (2B) und das Gen, welches das Protein codiert, wurde durch das Nomenklatur-Komitee "ZNFN3A1" (Zinkfinger Protein, Subfamilie 3A (MYND Domäne enthaltend), 1) benannt.
Beispiel 3: subzelluläre Lokalisation von ZNFN3A1
Die gesamte codierende Region, die dem ZNFN3A1 entspricht, wurde in einen pEGFP-N1 Vektor und in einen pFLAG-CMV-5α Vektor kloniert und diese Konstrukte wurden in SNU475 Zellen transfiziert und exprimiert. Die Expression von mit EGFP markierten ZNFN3A1 und mit FLAG markierten ZNFN3A1 wurde durch Westerblot bestätigt (Daten nicht gezeigt). Beide, ZNFN3A1-EGFP Fusionsprotein und FLAG-markiertes ZNFN3A1-Protein, wurden durch Fluoreszenz-Immunzytochemie homogen im Zytoplasma und Nukleus (3A-F) nachgewiesen. Subzelluläre Lokalisation von endogenem ZNFN3A1-Protein wurde unter Verwendungen eines spezifischen Antikörpers gegen ZNFN3A1 beobachtet.
Interessanterweise verändert sich die subzelluläre Lokalisation von A1-Protein während des Verlaufs des Zellzyklus oder wegen der Dichte von kultivierten Zellen. Bei der Durchführung von Immunzytochemie für endogenes ZNFN3A1-Protein, wurde eine beträchtliche Menge des Proteins im Nukleus im Falle von Kultur mit geringer Zellkonzentration (3G-I und 3M-O) lokalisiert. Im Falle von Kultur mit hoher Zellkonzentration wurde jedoch das meiste des ZNFN3A1-Proteins im Zytoplasma (3J-L und 3P-R) lokalisiert. Diese Ergebnisse enthüllen, dass die Sub-Lokalisation von ZNFN3A1 von der Zellkonzentration abhängt. ZNFN3A1 akkumuliert im Nukleus, wenn Zellen in der mittleren bis späten S-Phase sind oder wenn kultivierte Zellen dünn ausgesäht sind, während ZNFN3A1 sowohl im Zytoplasma als auch im Nukleus lokalisiert, wenn sie in anderen Phasen sind oder in dichten Bedingungen gezüchtet werden.
Die Immunzytochemie wurde durch Fixieren von kultivierten Zellen auf Objektträgern in Kammern mit PBS, enthaltend 4% Paraformaldehyd für 15 Min., dann Permeabilisieren mit PBS, enthaltend 0,1% Triton X-100 für 2,5 Min. bei RT durchgeführt. Die Zellen wurden mit 2% BSA in PBS für 24 Std bei 4°C bedeckt, um unspezifische Hybridisierung zu blockieren, und nachfolgend mit Maus anti-FLAG Antikörper in 1:2000 Verdünnung und Kaninchen anti-ZNFN3A1 Antikörper in 1:3000 als erstem Antikörper inkubiert. Antikörper wurden mit einem mit Fluoreszenzsubstrat konjugiertem anti-Maus IgG und anti-Kaninchen IgG zweiten Antikörper (ICN/Cappel und Jackson Immuno Research) gefärbt. Nuklei wurden durch 4',6'-Diamidin-2'-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI) gegengefärbt. Ein Fluoreszenz-Bild wurde mit einem ECLIPSE E800 Mikroskop erhalten.
Die Lokalisation von ZNFN3A1 kann abhängig vom Zellzyklus sein und daher wurde der Zellzyklus unter Verwendung von Durchflusszytometrie in unterschiedlichen Zellkonzentrationen von SNU475 Zellen analysiert. Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/100 mm Schale ausgesäht. Die Zellen wurden in einem vorgegebenen zeitlichen Verlauf trypsinisiert, in PBS gesammelt und in 70% kaltem Ethanol fixiert. Nach einer RNase-Behandlung wurden die Zellen mit Propidiumiodid (50 μg/ml) in PBS gefärbt. Durchflusszytometrie wurde auf einem Becton Dickinson FACScan durchgeführt und durch CellQuest und Mod Fit Software (Verity Software House) analysiert. Die prozentualen Anteile von Nuklei in G0/G1-, S- und G2/M-Phasen des Zellzyklus und jede sub-G1 Population wurden aus mindestens 20.000 nicht gegateten Zellen bestimmt.
Verglichen mit geringer Zellkonzentration und hoher Zellkonzentration, erhöhte sich die Population von Zellen in der G0/G1-Phase im Falle der hohen Zellkonzentration, die Population von Zellen in S- und G2/M-Phase verringerte sich jedoch drastisch. Um die Wirkung des Zellzyklus auf die Lokalisation von ZNFN3A1 im Detail zu bestimmen, wurden Huh7 Zellen unter Verwendung von Aphidicolin synchronisiert und die subzelluläre Lokalisation von ZNFN3A1 wurde beobachtet (4a, b). Die Meisten der Huh7 Zellen blieben36 Std. nach Behandlung mit Aphidicolin in der G0/G1-Phase und das ZNFN3A1 war im Cytoplasma lokalisiert. Wenn Aphidicolin aus dem Kulturmedium entfernt wurde, schritt der Zellzyklus fort und das ZNFN3A1-Protein bewegte sich vom Nukleus zum Cytoplasma. Diese Daten zeigten, dass die subzelluläre Lokalisation von ZNFN3A1-Protein durch den Zustand des Zellzyklus geregelt war und dass das ZNFN3A1-Protein sich in der Proliferationsphase zum Nukleus bewegte.
Beispiel 4: Wachstumsförderung von Zellen der Normalgewebe-Zelllinie NIH3T3 durch ZNFN3A1.
Um die Wirkungen des ZNFN3A1-Gentransfers auf das Wachstum von Hepatoma-Zelllinien zu analysieren, wurden Zellen der Normalgewebe-Zelllinie NIH3T3 mit einem Expressionsplasmid pcDNA3.1, das Sense-ZNFN3A1 und Anitsense-ZNFN3A1 enthielt, transfiziert.
NIH3T3 Zellen wurden durch pcDNA3.1 Vektoren (Invitrogen), welche die gesamte codierende Sequenz von ZNFN3A1 enthielten, unter Verwendung von FuGEN 6 Transfektionsreagenz, gemäß der Empfehlungen des Lieferanten transfiziert. Zellen wurden in DMEM, enthaltend 10% FBS und 0,9 mg/ml Geniticin, erhalten und einzelne Kolonien wurden selektioniert. Konstitutive ZNFN3A1 Expression wurde durch RT-PCR bestimmt.
Die NIH3T3 Zellen zeigten im Allgemeinen keine endogene Expression von ZNFN3A1 mRNA. Bei Koloniebildung förderte der sense-ZNFN3A1 Expressionsvektor eine Koloniebildung in NIH3T3 Zellen verglichen mit Mock und antisense-ZNFN3A1 Vektoren, welche kein Wachstum zeigten, wie in 5A, 5B gezeigt.
Koloniebildungsassays wurden durch Plattieren der Zellen in einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/100mm Schale durchgeführt. Nach 24 Std. wurden die Zellen durch Plasmidvektor, unter Verwendung von FuGEN 6 Transfektionsreagenz (Roche), transfiziert und wurden mit einer angemessenen Konzentration von Geniticin für 2 Wochen kultiviert. Zellen wurden mit 100% Methanol fixiert und durch Giemsa-Lösung gefärbt. Diese Koloniebildungsassays wurden durch drei unabhängige Experimente bestätigt.
Um die wachstumsfördernden Wirkungen von ZNFN3A1 weiter zu untersuchen, wurden stabil mit ZNFN3A1 transfizierte NIH3T3 Zellen weiter untersucht. Die mit sense-ZNFN3A1 stabil transfizierten Zellen exprimierten ZNFN3A1 mRNA konstitutiv (5C, 5D). Expression wurde durch RT-PCR bestimmt. Wie in 5C, 5D gezeigt, zeigte der Klon, der ZNFN3A1 konstant exprimierte, eine hohe Wachstumsfähigkeit im Vergleich zu mit antisense-ZNFN3A1- und Kontrollvektor transfizierten Zellen, was zeigt, dass ZNFN3A1 eine wichtige Rolle für die Wachstumsförderung von Leberzellenkarzinoma-Zellen spielt.
Beispiel 5: Verringerte Expression von ZNFN3A1 durch antisense-Oligonukleotide unterdrückt das Wachstum von Hepatomazellen
Um zu untersuchen, ob eine Unterdrückung von ZNFN3A1 eine Wachstumshemmung und/oder Zelltod von HCC Zellen induzieren kann, wurden verschiedene antisense S-Oligonukleotide synthetisiert, um die ZNFN3A1 Expression zu unterdrücken. Sense oder antisense S-Oligonukleotide von ZNFN3A1, die das Startcodon umfassen, wurden unter Verwendung von LIPOFECTIN Reagenz (GIBCO-BRL) transfiziert. Die Sequenzen von Phosphorthioatmodifizierten ODNs waren wie folgt: Antisense S-Oligonukleotide; 5'-GCGGGAGGAT GGAGCC (SEQ. ID. NO.3).
Die Zellen wurden mit dem antisense und sense S-Oligonukleotiden für 24 Stunden kultiviert und auf ihre Expression von ZNFN3A1 und ZNFN3A1 durch RT-PCR und Westernblot unter Verwendung von anti-ZNFN3A1 Antikörper analysiert.
Die mit antisense S-Oligonukleotiden, welche das Startcodon umfassen, transfizierten Zellen verringerten die endogene Expression von ZNFN3A1 in SNU475 und Huh7 Zellen, die eine reichliche Menge an ZNFN3A1 exprimieren, signifikant (6A, B). Transfektion von antisense S-Oligonukleotiden unterdrückte außerdem signifikant die Zellzahlen der Huh7 und SNU475 Zellen, wie durch einen vorher beschriebenen Koloniebildungsassay bestimmt.
Ein MTT-Assay wurde durch Plattieren der Zellen in einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen/100 mm Schale durchgeführt. Am nächsten Tag wurden die Zellen in dreifacher Ausfertigung mit sense oder antisense S-Oligonukleotiden von ZNFN3A1 transfiziert. Nach 72 Std. Kultivierung wurde das Medium durch 10 ml frisches Medium ersetzt, das 5 mg 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium in Bromid (MTT) (SIGMA) enthielt. Nach weiteren 4 Std. Inkubation bei 37°C, wurden die Zellen durch Zugabe von 1 ml 0,01 N HCl/10%SDS lysiert. Die Farbreaktion wurde mit einem ELISA-Plattenlesegerät bei einer Testwellenlänge von 570 nm (Referenz 630 nm) quantifiziert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch die Extinktion verglichen mit der Kontrolle dargestellt.
Eine Unterdrückung des Zellwachstums durch Transfektion mit antisense-ZNFN3A1 wurde auch in anderen HCC Zelllinien, einschließlich Alexander-Zellen und SNU423 Zellen, gesehen, die beide ebenfalls reichliche Mengen an ZNFN3A1 endogen exprimieren, verglichen mit dem der Kontroll S-Oligonukleotide wie in 6C, 6D gezeigt. Die Ergebnisse des Koloniebildungsassays wurden durch drei unabhängie Experimente bestätigt. Außerdem zeigte die Durchflusszytometrie, dass die Hemmung der ZNFN3A1 Expression die Zellzahlen von Zellen in der S-Phasen Population signifikant verringerte und die Zahlen der sub-G1-Phase erhöhte (6E). Diese Ergbnisse enthüllten, dass die Unterdrückung der ZNFN3A1 Expression eine Hemmung des Wachstums und eine Förderung von Appoptose induzierten.
Beispiel 6: Wechselwirkung von ZNFN3A1 mit RNA-Helicase K1AA0054
Um den onkogenen Mechanismus von ZNFN3A1 zu untersuchen, wurden mit ZNFN3A1 wechselwirkende Proteine unter Verwendung eines Zwei-Hybrid Screeningsystems gesucht. Ein Hefe Zwei-Hybrid Assay wurde mit MATCHMAKER GAL4 Zwei-Hybrid-System 2 und -System 3 von Clontech gemäß der Answeisung des Herstellers durchgeführt. Die gesamte codierende Sequenz von ZNFN3A1 wurde in die EcoRI Schnittstelle von pAS2-1 als Vektor für den Köder kloniert. Zum Screenen einer Bibliothek wurde eine menschliche Testis-Bibliothek in pACT2 (Clontech) kloniert. Gleichzeitig co-transformierte AH109 Hefezellen (mit pAS2-1 Ködervektor und einer Anzahl von pACT2 Beutevektoren) wurden auf SD minimalem Medium (-Ade/-His/-Leu/-Trp) zusätzlich mit 25 mg/L X-α-Gal(Clontech) und 25 mM 3-Amino-1,2,4,-trizol(Sigma) plattiert. Das Bibliotheksplasmid wurde aus den positiven Kolonien isoliert und die Sequenz und der Rahmen wurden bestätigt.
Unter den identifizierten Klonen wechselwirkte die C-terminale Region der RNA-Helicase KIAA0054 mit ZNFN3A1 durch gleichzeitige Transformation mit pAS2.1-ZNFN3A1 und pACT2-KIAA0054 (7A, 7B). RNA-Helicasen stellen eine Familie von Proteinen dar, die doppelsträngige RNA unter Verwendung von Nukleosidtriphosphaten als Energiequelle entwinden. Es ist klar, dass RNA-Helicasen eine weit verbreitete Gruppe von Proteinen sind, die in praktisch allen biologischen Prozessen gefunden werden.
Um die Wechselwirkung von ZNFN3A1 mit KIAA0054 weiter zu bestätigen, wurde FLAG-markiertes ZNFN3A1-Protein hergestellt. HeLa-Zellen wurden mit 8 μg pFLAG-CMV-ZNFN3A1 und pCMV-HA-KIAA0054 DNA pro 10-cm Schale transfiziert und nach zusätzlichen 48 Std. gesammelt. Zellen wurden einmal mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 150 mM NaCl (PBS), gewaschen und in NET-N Puffer (150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 20mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, und 1 × kompletter Protease Inhibitor Cocktail) lysiert. In einer typischen Immunpräzipitationsreaktion wurden 300 μg des Gesamtzelllysats des HeLa-Extraktes mit 1 μg des gewünschten Antikörpers und 20 μl ProteinA- oder ProteinG-Sepharosekügelchen (Zymed) bei 4°C für 1-2 Std. inkubiert. Die Kügelchen wurden viermal in 1 ml NET-N-Puffer gewaschen. An die Kügelchen gebundenes Protein wurde durch Kochen im SDS-Probenpuffer eluiert, durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Die Membranen wurden wie oben beschrieben zum Immunblotting verwendet. Das Lysat wurde direkt durch Immunblotting mit anti-FLAG Antikörper und anti-HA Antikörper als Kontrolle analysiert. Das ZNFN3A1-Protein enthüllte seine Assoziation mit HA-markiertem KIAA0054 Protein, das in HeLa-Säugetierzellen exprimiert wurde (7C).
Um die Region von ZNFN3A1 zu identifizieren, die verantwortlich für seine Wechselwirkung mit KIAA0054 ist, wurde ein Zwei-Hybrid-Assay unter Verwendung von Deletionsfragmenten von ZNFN3A1 durchgeführt. Mutanten, denen die Aminosäuren 1 bis 250 oder 100 bis 428 fehlen, waren negativ für eine Wechselwirkung mit der KIAA0054 C-terminalen Region, während ein Fragment, das die Aminosäuren 100 bis 250 enthielt, positiv war (8). Dies deutet an, dass die ZNFN3A1-Bindungsregion in der Region der SET-Domäne sitzt.
Beispiel 7: Wechselwirkung zwischen ZNFN3A1, RNA-Helicase und RNA-Polymerase II
RNA-Helicase spielt durch Bindung an einen Transkriptionsfaktor und RNA-Polymerase II eine entscheidende Rolle bei der Transkription. Diese Ergebnisse zeigten, dass es die Möglichkeit gab, dass das Zinkfingerprotein ZNFN3A1 die Transkription durch Assoziation mit nicht nur RNA-Helicase KIAA0054 sondern auch mit RNA-Polymerase II reguliert. Die Assoziation zwischen ZNFN3A1, RNA-Helicase KIAA0054 und RNA-Polymerase II wurde durch co-Immunpräzipitation (9) getestet. HeLa-Zellen wurden mit 8 μg pFLAG-CMV-ZNFN3A1 und pCMV-HA-KIAA0054 DNA pro 10-cm Schale transfiziert und nach zusätzlichen 48 Stunden gesammelt. Zellen wurden einmal mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 150 mM NaCJ (PBS), gewaschen und in NET-N Puffer (150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 20mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, und 1 × kompletter Proteaseinhibitor-Cocktail) lysiert. In einer typischen Immunpräzipitationsreaktion wurden 300 μg Gesamtzellextrakt mit 1 μg Antikörper und 20 μl ProteinA- oder ProteinG-Sepharosekügelchen (Zymed) bei 4°C für 1-2 Std. inkubiert. Die Kügelchen wurden viermal in 1 ml NET-N Puffer gewaschen. An Kügelchen gebundene Proteine wurden durch Kochen in SDS-Probenpuffer eluiert, durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Die Membranen wurden wie oben beschrieben für Immunblots verwendet.
Eine Assoziierung mit endogener RNA-Polymerase II wurde unter Verwendung von anti-FLAG Antikörper, anti-HA Antikörper und anti-RNA-Polymerase II Antikörper nachgewiesen. Wenn ein anti-FLAG Antikörper zur Immunpräzipitation verwendet wurde und ein anti-RNA Polymerase II zum Immunblot verwendet wurde, wies man eine RNA-Polymerase II spezifische Bande stark nach, für den Fall dass FLAG-ZNFN3A1-Protein und HA-KIAA0054 Protein zusammen exprimiert wurde, und wies wenig nach, für den Fall dass nur FLAG-ZNFN3A1-Protein exprimiert wurde. Wenn andererseits anti-HA Antikörper zur Immunpräzipitation und anti-RNA-Polymerase II Antikörper zum Immunblot verwendet wurde, wies man eine RNA-Polymerase spezifische Bande stark nach, nicht nur für den Fall dass FLAG-ZNFN3A1-Protein und HA-KIAA0054 Protein zusammen exprimiert wurde, sondern auch wenn HA-KIAA0054 Protein allein exprimiert wurde. Überdies wurden die Co-Immunpräzipitation und Immunblots ungekehrt gearbeitet, indem man Antikörper für Immunpräzipitation und Immunblots austauschte. Die Ergebnisse waren ähnlich für den Fall, dass der jeweils andere Antikörper verwendet wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass RNA-Helicase KIAA0054 die Komplexbildung zwischen ZNFN3A1-Protein und RNA-Polymerase II über Kontakte mit beiden Proteinen vermittelt. Daher kann eine Transkriptionsregulation durch ZNFN3A1, RNA-Helicase KIAA0054 und RNA-Polymerase II eine wichtige Rolle bei der Förderung des Zellwachstum bei der Karzinogenese von Leberzellen spielen. 12 ist eine Darstellung des Komplexes, der zwischen ZNFN3A1, RNA-Helicase und RNA-Polymerase II gebildet wurde, um die Transkription eines Gens zu regulieren.
Beispiel 8: Sequenz-spezifische Bindung von ZNFN3A1-Protein
Eine Konsensus-DNA-Bindungsstelle für ZNFN3A1 wurde, unter Verwendung eines Oligonukleotid-Konstruktes, welches einen Kern von 20 Zufallsnukleotiden enthielt, bestimmt. Die putativen Konsensussequenzen, welche in der Lage waren mit dem ZNFN3A1-Protein in vitro zu assoziieren, wurden mittels DNA-Selektion unter Verwendung von Zufalls-Oligonukleotiden gesucht. Ein GST-ZNFN3A1 Fusionsprotein wurde hergestellt und mit Sepharose 46 immobilisiert und doppelsträngige Zufallsoligonukleotid-DNAs, die mit dem Protein assoziierten, wurden ausgewählt. Nach 10 mal Selektion und nachfolgender Amplifikation wurde die amplifizierte DNA in den pCR Vektor (Clontech) kloniert und 92 Klone wurden sequenziert. Unter den 92 Klone enthielten 32 (34,8%) eine Konsensussequenz von 5'-CCCTCC-3', was eine 102-fach höhere Inzidenz ist, als die berechnete Wahrscheinlichkeit (10A). Um ein rekombinantes Protein herzustellen, welches die Zinkfinger-Domäne von ZNFN3A1 exprimiert, wurde ein cDNA Fragment, dass den Codons der vollen Länge von ZNFN3A1 entspricht, durch RT-PCR unter Verwendung eines Satzes von Primern 5'-CGGAATTCATGGAGCCGCTGAAGGTGGAAAAG-3' [SEQ. ID. NO.9] und 5'-CCGCTCGAGGGATGCTCTGATGTTGGCGTCG-3' [SEQ. ID. NO. 10], amplifiziert, das in eine passende Klonierungsstelle des pGEX-6P Plasmids subkloniert wurde. Rekombinantes Fusionsprotein wurde hergestellt und durch eine Sepharose 4B-Säule wie zuvor beschrieben gereinigt. Oligonukleotide mit der Sequenz "5'-GGGAGAATTCCGACACGCGT(N20)CTCGAGCGTCTACATGGATCCTCA-3"' [SEQ. ID. NO.11], wurden wie zuvor beschrieben zur Selektion und Amplifikation verwendet.
Unter Verwendung einer Datenbank für eukaryotische Promotor (http://www.epd.isbslb.cn/mdex.html), wurden stromabwärts von ZNFN3A1 gelegenen Kandidatengene gesucht und 5 Kandidatengene ausgewählt. Zuerst wurde die Expressionshöhe jedes Gens durch halbquantitative RT-PCR in stabil transfizierten COS7, welche ZNFN3A1 exogen exprimierten (10B), bestimmt. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Expression von EGFR, c-myc und Bcl2 durch ZNFN3A1 hochreguliert war.
Vier putative Bindungsstelle für ZNFN3A1, dessen Konsensus-Zielsequenz 5'-(C)CCCTCC(T) oder (A)GGAGGG(G)-3' ist, wurden in der 5' flankierenden Region von EGFR, zwischen -213-bp und -207-bp (CBS1), zwischen -106-bp und -100-bp (CBS2), zwischen -65-bp und -59-bp (CBS3) und zwischen -46-bp und -40-bp (CBS4) identifiziert. Ein Wildtyp-Reporterplasmid (P1), das CBS1, CBS2, CBS3 und CBS4 enthielt, sowie vier Deletionskonstrukte des Plasmids (P2, P3, P4 and P5) wurden durch Klonieren jeder Sequenz in die passenden Enzym-Schnittstellen des pGL3-Basic Vektors (Promega) hergestellt. Plasmide P1, P2, P3, P4 und P5 wurden durch Amplifikation von P1-F (5'-GGGGTACCCAGTGCTGGGAACGCCCCTCTCG-3') [SEQ. ID. NO.12], P2-F (5'-GGGGTACCCACTCCCGCCGGAGACTAGGTCC-3') [SEQ. ID. NO.13], 3-F (5'-GGGGTACCCTCGCATTCTCCTCCTCCTCTGC-3') [SEQ. ID. NO.14], 4-F (5'- GGGGTACCTGGTCCCTCCTCCTCCCGCCCTG-3') [SEQ. ID. NO.15] oder P5-F (5'- GGGGTACCTCCCGCCCTGCCTCCCGCGCCTC-3') [SEQ. ID. NO.16] mit dem gleichen rückwärts Primer (P1-R; 5'-GAAGATCTAG GTGGCCTGTC GTCCGGTCTG G-3') [SEQ. ID. NO.17] konstruiert. Eine ortsgerichtete Mutagenese wurde für beide putativen ZNFN3A1-Bindungsstellen ausgeführt, wodurch CCCTCC durch CATTCC unter Verwendung des QuickChange Kits für ortsgerichtete Mutagenese gemäß der Empfehlungen des Lieferanten (Stratagene) ersetzt wurde.
Jedes Reporterplasmid (2 μg) wurde mit 0,2 μg pRL-TK Plasmid (Promega), unter Verwendung von FuGENE 6 Reagenz (Boehringer), gemäß der Anweisungen des Herstellers co-transfiziert. Luziferaseassays wurden unter Verwendung eines Dual-Luziferase Reporterassay-Systems (Promega) unter Befolgung des Protokolls des Herstellers durchgeführt.
Beispiel 9: Hochregulierung der EGFR-Promotoraktivität durch ZNFN3A1
Weil eine verstärkte Expression von EGFR in HCCs berichtet wurde, haben wir uns auf das Reportermolekül konzentriert und getestet, ob sein Promotor durch die ZNFN3A1-bindenden Sequenzen reguliert wurde. Wir identifizierten vier mögliche ZNFN3A1-Bindungsmotive (CBS1, 2, 3 und 4) in seiner 5' flankierenden Region und stellten Reporterplasmide, welche die vier Motive (P1) enthalten, sowie verschiedene Deletionsformen (P2, P3, P4 und P5) her. Wenn diese Reporterplasmide in SNU475 Zellen transfiziert wurden, war die Aktivität von P1 signifikant höher als die von P2, P3, P4 oder P5. Angesichts der Tatsache, dass die Aktivität von P4 sehr ähnlich zu der von P5 war, vermuteten wir, dass eine Region zwischen –261 und –50, die CBS1, CBS2 und CBS3 enthielt, mit der Transkriptionsaktivität von EGFR assoziiert sein könnte. Um die Rollen dieser Domäne zu offenbaren, konstruierten wir Reporterplasmide, welche mutiertes CBS1 (P1m1) und mutiertes CBS2 (P1m2) oder mutiertes CBS3 (P1m3) enthielten, worin jedes der Kandidaten-Bindungsmotive von 5'-CCCTCC-3' zu 5'-CATTCC-3' (11A) verändert wurde. Reporterassays zeigten, dass Fragmente, welche mutierte Motive (P1ml, P1m2 und P1m3) enthielten, die Transkription von EGFR sehr viel schwächer aktivierten als P1 (11B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die drei putativen ZNFN3A1-Bindungsmotive an der Transkriptionsaktivierung von EGFR beteiligt waren.
Industrielle Anwendbarkeit
Die Expression des neuen menschlichen Gens ZNFN3A1 ist in Leberzellenkarzinom verglichen mit nicht krebsartigen Lebergewebe deutlich erhöht. Entsprechend kann dieses Gen als diagnostischer Marker für HCC dienen und das dadurch codierte Protein kann in diagnostischen Tests dafür verwendet werden.
Die vorliegenden Erfinder haben außerdem gezeigt, dass die Expression des neuen Proteins ZNFN3A1 das Zellwachstum fördert während das Zellwachstum durch antisense-Oligonukleotide, die dem ZNFN3A1 entsprechen, gehemmt wird. Diese Resultate legen nahe, dass ZNFN3A1 die onkogene Aktivität fördert. Daher ist dieses neue Onkoprotein ein nützliches Ziel für die Entwicklung von Antikrebs-Pharmazeutika. Beispielsweise können Mittel, welche die Expression von ZNFN3A1 hemmen oder seine Aktivität verhindern, eine Verwendung als Antikrebsmittel finden, insbesondere Antikrebmittel zur Behandlung von HCC. Beispiele für solche Mittel schließen antisense-Oligonukleotide und Antikörper, die ZNFN3A1 erkennen, ein.
Desweiteren haben die vorliegenden Erfinder gezeigt, dass ZNFN3A1 direkt mit einer RNA-Helicase assoziiert und einen Komplex mit RNA-Polymerase II bildet. Dieser Komplex aktiviert dann die Transkription von stromabwärts gelegenen Zielgenen, einschließlich EGFR, durch eine direkte Bindung des Komplexes mit einem Element "(C)CCCTCC(T)" in der 5' flankierenden Region. Deshalb können Mittel, welche die Aktivität des Komplexes hemmen, ebenfalls eine Anwendung in der Behandlung und Vorbeugung von HCC finden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Transkriptionsaktivationskomplex, umfassend ein Protein, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, und mindestens einen Coaktivator davon.
Komplex nach Anspruch 1, wobei der Coaktivator ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer RNA-Helicase und einer RNA-Polymerase II.
Verfahren zum Screenen einer Verbindung, welche die Aktivität eines Proteins, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, inhibiert, umfassend die Schritte: (a) Kultivieren von Zellen, welche das Protein, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, oder ein Partialpeptid davon exprimieren, in der Gegenwart einer Versuchsprobe, welche mindestens eine Testverbindung enthält, (b) Bestimmen der Proliferation der Zelle, und (c) Auswählen der Testverbindung, welche die Proliferation, im Vergleich zu der in Abwesenheit der Versuchsprobe bestimmten Proliferation, inhibiert.
In vitro Verfahren zum Screenen einer Verbindung für Aktivität gegen Krebs, umfassend die Schritte: (a) Inkontaktbringen einer Versuchsprobe, die mindestens eine Testverbindung enthält, mit einem Protein, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, einem Coaktivator davon und einer DNA, welche die Zielsequenz des Proteins enthält, unter Bedingungen, welche geeignet sind, um Bildung des Komplexes des Proteins mit der DNA zu ermöglichen, und (b) Auswählen der Testverbindung, welche die Bildung des Komplexes inhibiert.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Zielsequenz eine der nachfolgenden Sequenzen (a) bis (d), welche die 5'-Region von EGFR flankieren, umfasst: (a) eine Sequenz, welche identifiziert ist zwischen bp -213 und bp -207 (cccctcc) in der 5'-flankierenden Region von EGFR, (b) eine Sequenz, welche identifiziert ist zwischen bp -106 und bp -100 (ccctcct) in der 5'-flankierenden Region von EGFR, (c) eine Sequenz, welche identifiziert ist zwischen bp -65 und bp -59 (ccctcct) in der 5'-flankierenden Region von EGFR, (d) eine Sequenz, welche identifiziert ist zwischen bp -46 und bp -40 (ccctcct) in der 5'-flankierenden Region von EGFR.
Verfahren zum Screenen einer Verbindung für Aktivität gegen Krebs, umfassend die Schritte: (a) Inkontaktbringen einer Versuchsprobe, die mindestens eine Testverbindung enthält, mit einem Transkriptionsaktivationskomplex, umfassend ein Protein, bestehend aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, und mindestens einen Coaktivator davon und ein Reportergen mit einer Transkriptionsregulationsregion, die von dem Komplex erkannt wird, und (b) Auswählen der Testverbindung, welche die Expression des Reportergens inhibiert.
In vitro Verfahren zur Diagnose von Krebs, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bestimmen des Expressionsniveaus eines ZNFN3A1-Gens, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1, in einer biologischen Untersuchungsprobe, (b) Vergleichen des Expressionsniveaus des ZNFN3A1-Gens, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1, mit dem in einer normalen Probe, und (c) Definieren eines hohen Expressionsniveaus des ZNFN3A1-Gens, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1, in der Probe, dass Krebs vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Krebs Leberzellenkarzinom ist.