DE10119294A1 - Tumorassoziiertes Antigen (B345) - Google Patents

Abstract

Tumorassoziiertes Antigen B345 und dafür kodierende DNA-Moleküle.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Chemotherapie von Tumorerkrankungen.

Normale Körperzellen unterliegen einem strikt geordneten System, das das Wachstum, die Zellteilung und das Absterben bestimmter Zellen kontrolliert. So teilen sich Körperzellen einer erwachsenen Person nur dann, wenn sie tote Zellen ersetzen oder eine Verletzung verheilen müssen. Krebszellen dagegen wachsen unkontrolliert weiter, sie akkumulieren und bilden einen Tumor. Erreicht der Tumor eine kritische Größe, können Krebszellen über die Blutbahnen oder das Lymphsystem auch in andere Bereiche des Körpers transportiert werden und dort Kolonien bilden (Metastasen). Nicht alle Tumore sind kanzerogen, denn benigne Tumore metastasieren nicht und sind daher meistens nicht lebensgefährlich, da sie chirurgisch entfernt werden können. Detailliertere Informationen zu diesem Thema sowie den weiter unten diskutierten Aspekten der Tumorentstehung geben folgende Publikationen: Rauscher und Vogt, 1997; Kastan, 1997; Hesketh, 1995; Pusztai, Lewis und Yap, 1995.

Die Transformation einer gesunden Zelle in eine Krebszelle kann durch eine ganze Reihe von Faktoren, wie Umwelteinflüsse, Strahlung, Viren oder chemische Reagenzien ausgelöst werden. Bei der Tumorentwicklung spielen jedoch auch epigenetische (Methylierungen, Acetylierungen und veränderte Chromatinstruktur) und genetische Modifikationen (Punktmutation, Deletion, Amplifikation, Translokation) eine bedeutendende Rolle.

Mutationen in kodierenden Bereichen von Genen, die an der Regulation der Zell-Proliferation beteiligt sind, können an der Überführung einer normalen Zelle in eine Tumorzelle beitragen, da die transformierte Zelle Wachstumsvorteile gegenüber ihrer gesunden Nachbarzelle hat.

Krebs entsteht also durch eine Ansammlung von vererbten oder erworbenen Mutationen in kritischen Protoonkogenen oder Tumorsuppressorgenen.

Die Zellproliferation steht unter der Kontrolle verschiedener Gensysteme, während Produkte von Onkogenen an der Signalvermittlung von Zelloberfläche zum Zellkern beteiligt sind, geleiten cyclinabhängige Proteinkinase und ihre Inhibitoren die Zelle durch den Zellzyklus. Nicht selten werden Störungen in der Synthese dieser Proteine bei Tumorzellen gefunden. Eine zentrale Rolle spielt dabei das p53-Protein.

Proteine vom Typ des RB-Proteins regulieren die Verfügbarkeit entscheidender Transkriptionsfaktoren.

Die in Tumorgeweben hochregulierten Gene stellen meist den Ausgangspunkt für weitere detaillierte Analysen dar und da Proteine verschiedenster Funktionen hochexprimiert werden, ist der Ansatz für therapeutische Interventionen sehr vielseitig. Es ist daher das Ziel der Krebsforschung weitere neue Zielmoleküle (sog. "Targets") für therapeutische Interventionen zu finden, die dann für eine gezielte Therapie mit geringen Nebenwirkungen benutzt werden können.

In erster Linie gilt es daher molekulare Veränderungen zwischen Normalgewebe und Tumor auf dem Niveau der Genexpression ("Transkriptionslevel") aufzudecken, die einerseits neue Targets identifizieren sollen und andererseits für die Entwicklung bzw. das Auffinden von Substanzen zur Hemmung von Fehlfunktionen herangezogen werden können.

Eine ganze Reihe verschiedenster Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung von neuen Targets, die den Ausgangspunkt für die Entwicklung von neuen Therapeutika darstellen, basieren auf der Erstellung differenzieller mRNA Transkriptionsprofile zwischen Tumoren und Normalgeweben. Dazu zählen die differenzielle Hybridisierung, die Erstellung von Subtraktions-cDNA-Banken ("representational difference analysis"; Hubank und Schatz, 1994; Diatchenko et al., 1996) und der Einsatz der DNA-Chip Technologie oder der SAGE-Methode (Velculescu et al., 1995).

Neben immuntherapeutischen Ansätzen kommt der gezielten Chemotherapie eine wesentliche Rolle bei der Behandlung von Krebs zu. Unter Chemotherapie versteht man die Verabreichung von Substanzen, die durch Eingriff in Stoffwechsel, Signaltransduktion und Zellteilungsvorgänge maligner Zellen entweder zytostatisch oder zytotoxisch-zytolytisch wirken. Chemotherapeutika lassen sich auf Grund der Beeinflussung von spezifischen Targets in der Tumorzelle, nach Art der zellulären Interaktion und der Wechselwirkung mit einer bestimmten Zellzyklusphase, in verschiedene Kategorien unterteilen.

Die Art der Krebsbehandlung hängt vom Tumorstadium ab, entscheidend ist dabei, ob bereits Metastasen vorhanden sind und wie weit diese im Körper verbreitet sind. Die Applikation von Zellgiften zur Krebsbehandlung ist, neben operativen Maßnahmen und der Strahlentherapie, ein integraler Bestandteil der heutigen Therapiekonzepte in der Onkologie.

Im wesentlichen gibt es zwei Hauptziele der Chemotherapie: In erster Linie ist es die Heilung von Krebs; das bedeutet, dass der Tumor verschwindet und nicht mehr auftritt. Ist eine Heilung aus verschiedensten Gründen nicht mehr möglich, versucht man den Tumor in seinem Wachstum und seiner Ausbreitung einzuschränken bzw. zu kontrollieren.

Prinzipiell entfalten Substanzen, die bei der Chemotherapie Anwendung finden, ihre Wirkung bei allen sich teilenden Zellen. Tumorzellen zeigen jedoch eine höhere Empfindlichkeit gegenüber Chemotherapeutika als gesunde Zellen, da hauptsächlich stark proliferierende Zellen angegriffen werden.

Jedes Gewebe hat ein charakteristisches Wachstums­ verhalten, das Zellteilung, Wachstumsstillstand, Differenzierung und Alterung umfasst und durch interne und externe Faktoren beeinflusst und reguliert wird.

Viele der heute eingesetzten zytotoxischen Chemotherapeutika wirken nur bei proliferierenden Zellen (nicht in der G0-Phase der Zellteilung). Dabei werden allerdings sowohl Normal- als auch Krebszellen attackiert. Die Zerstörung von normalen Zellen kann zu starken Nebeneffekten führen; z. B. Zerstörung der Blutzellen-produzierenden Gewebe des Knochenmarks (Myelosuppression).

Chemotherapeutika werden je nachdem, wie sie spezifische Substanzen innerhalb der Tumorzelle beeinflussen, mit welchen zellulären Prozessen die Medikamente interagieren und welche Zellzyklusphase sie beeinflussen, in verschiedene Kategorien unterteilt. Diese Informationen sind für Onkologen notwendig für die Entscheidung welche Präparate bei der Therapie miteinander kombiniert werden können.

Die in Tumorgeweben hochregulierten Gene stellen somit potentielle neue Zielstrukturen dar und da Proteine verschiedenster Funktionen hochexprimiert werden, ist der Ansatz für therapeutische Interventionen sehr vielseitig.

Es ist daher das Ziel der Krebsforschung, weitere neue Targets für therapeutische Interventionen zu finden, die dann für eine gezielte Therapie mit - verglichen mit derzeitig eingesetzten Therapeutika - geringeren Nebenwirkungen benutzt werden können.

In Tumorgeweben hochregulierte Gene stellen Angriffspunkte und somit potentielle Zielstrukturen ("Targets") für die Chemotherapie dar.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein neues, bevorzugt von Tumorzellen exprimiertes Protein bereitzustellen, das ein Zielmolekül für die Intervention mittels chemotherapeutischer Methoden darstellt.

Diese Aufgabe wurde gelöst, indem zunächst mittels RDA ("representational difference analysis") zwischen einer Lungen-Adenokarzinom-Zelllinie (A549) und Normallungengewebe eine cDNA-Substraktionsbibliothek hergestellt wurde. Zur Selektion der im Tumor überexprimierten Antigene wurden anschließend die erhaltenen cDNA-Klone sequenziert und mit in Datenbanken verfügbaren Sequenzen verglichen. Unter den dabei annotierten Genen befanden sich 321 unbekannte, zu denen größtenteils ESTs ("expressed sequence tags")-Einträge in der Datenbank existierten. Nach einer weiteren qualitativen PCR-Analyse in cDNA-Bibliotheken von kritischen Normalgeweben und immunprivilegierten Geweben sowie detaillierteren Datenbankrecherchen wurde die Anzahl der Kandidatenklone auf 59 eingeschränkt, deren ESTs nicht aus kritischen Normalgeweben stammen.

Diese Klone wurden auf Incyte DNA Chips gespottet und mit einer ganzen Reihe von Tumorgeweben und Normalgeweben als Referenz hybridisiert. Das mRNA Expressionsprofil von EST Fragmenten, die in Krebsgeweben und Normalgeweben differentiell exprimiert werden und zu einem noch unbekannten Gen gehören, wurde mit unterschiedlichen Methoden verifiziert.

Die Länge der Transkripte wurde mittels Northern blot Analyse bestimmt und das Expressionsmuster in verschiedenen Zellsystemen durch quantitative PCR exakt charakterisiert. Nur unbekannte Gene bzw. ESTs mit tumorspezifischen Expressionsprofil wurden weiterverfolgt und einer "full length Klonierung" unterworfen. Potentielle ORFs ("open reading frames") werden in die entsprechende Aminosäuresequenz umgewandelt und zur möglichen Funktionsvorhersage mittels in silico Strategien analysiert.

Die humane B345-cDNA wurde kloniert, die in einem ersten Klonierungsansatz erhaltene Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Die Sequenzanalyse der in diesem Ansatz klonierten humanen B345-cDNA zeigte einen durchgehenden offenen Leserahmen von Position 215 bis Position 2461 (exklusive Stopcodon), der, auf Nukleotid- und Proteinebene, in den bekannten Sequenzen der Datenbanken keine Homologie oder Identität aufweist. Aus den aus Northern Blot Experimenten gewonnenen Daten ist zu schließen, dass das B345-Transkript eine Länge von ca. 6,5 kb hat. In einem ersten Ansatz wurde als klonierter Bereich eine B345-cDNA mit 5897 bp (exklusive polyA- Region), erhalten, wobei das Vorhandensein eines Polyadenylationssignals und des PolyA-Tails am 3'-Ende der Sequenz auf die Vollständigkeit der cDNA in diesem Bereich hindeutete. Aufgrund der Tatsache, dass im 5'-Bereich der klonierten cDNA von Position 1 bis 214 kein durchgehender Leserahmen aufschien, wurde zunächst angenommen, dass es sich bei dem ATG an Position 215, die auch zu 75% einer Kozak Translationinitiationsstelle (ACCATGT) (Kozak, 1987) entspricht, um das Startkodon von B345 handelt.

In einem weiteren Klonierungsansatz wurden mittels eine molekularbiologischen Standardmethode, und zwar mittels sog. "Promotor Finder DNA Walking", zusätzliche Informationen über die weiter stromaufwärts liegende Sequenz von B345 gewonnen.

Somit wurde die in dem ersten Klonierunsversuch erhaltene B345-Sequenz (SEQ ID NO: 1) in der 5'Region erweitert. Der Transkriptionsstart konnte unter Anwendung der Primer Extension Analyse genau lokalisiert werden und liegt bei Position 201 (SEQ ID NO: 3). Durch wiederholte Sequenzierungen auch in der 3'Region wurde, im Vergleich zur in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz, eine zusätzliche Base an Position 2430 gefunden, die zu einer Leserasterverschiebung führt und somit das Stoppcodon von Position 2729 auf 2791 verschiebt. Die erhaltene cDNA (SEQ ID NO: 3) besitzt einen offenen Leserahmen, der für ein potentielles Protein mit einer Länge von 836 Aminosäuren (SEQ ID NO: 4) kodiert. Die Translationsinitiationsstelle an Position 283 entspricht etwa zu 70% einer Kozak-Konsensussequenz.

Die Promotorregion 200 bp upstream der mutmaßlichen Transkriptionsstartstelle enthält weder eine TATA noch eine CCAAT box, jedoch eine eindeutige GC-box, welche eine Bindungsstelle des SP1 Proteins darstellt. Die Tatsache, dass der GC Gehalt in der 5'Region über 60% ist, deutet auf ein CpG Island hin (Bird, 1986).

Die resultierende primäre Aminosäuresequenz von B345 ist in SEQ ID NO: 4 gezeigt. Die Analyse des Hydrophilizitäts Plots der Aminosäuresequenz zeigt, dass das B345 Protein zwei charakteristische hydrophobe Domänen aufweist, die ein Signalpeptid und eine helikale Transmembrandomäne darstellen (Fig. 6). Diese polarisierte Struktur deutet darauf hin, dass es sich bei B345 um ein integrales Membraneprotein handelt.

Die extrazelluläre Domäne läßt auf die Existenz von definitiv einer, gegebenenfalls drei, CUB Domänen schließen. CUB Domänen kommen bei verschiedenen, meist während der Embryonalentwicklung regulierten Proteinen vor. Eine kürzlich erschienene Publikation (Gerstein et al., 2000) demonstriert, daß CUB Domänen enthaltende Proteine die am ausgeprägtesten differenziell regulierten Proteine in C. elegans sind. Da Gene, die eine Schlüsselrolle in der Embryonalentwicklung haben, entsprechende Funktionen, z. B. in der Zellteilung, der Zellproliferation oder Signalübertragung, in Krebs ausführen, kann angenommen werden, dass eine Überexpression von B345 in Zellen eine Veränderung in den Eigenschaften der Substratadhäsion oder der extrazellulären Matrix bewirkt. Das B345 Protein weist 12 potentielle N-Glycosylierungsstellen auf, die in der mutmaßlichen extrazellulären Domäne zu finden sind.

Aufgrund seiner Aminosäuresequenz ist anzunehmen, dass das B345-Protein eine β-Sheet Sekundärstruktur ausbildet, da sich CUB Domänen bekanntlich als β-Sandwich falten.

Die intrazelluläre Domäne (Bereich 691-836) weist keine signifikanten Homologien auf. Der gesamte C-Terminus zeigt jedoch eine Identität (82%) über 124 Aminosäuren mit einem EST (Acc No. AW063026) aus humanen Eierstockkrebs-Zellen.

Ausgehend von den Funktionen anderer CUB Domänen enthaltender Proteine kann gefolgert werden, daß das B345 Transmembranprotein in der Kommunikation, der Interaktion und/oder der Signaltransduktion mit extrazellulären Komponenten oder Liganden eine Rolle spielt. Ferner sind die Daten der Expressionsanalyse ein starkes Indiz dafür, dass B345 beim metastatischen Prozess von Krebs, insbesondere Dickdarmkrebs, beteiligt ist.

Für die Aufklärung der physiologischen Funktion und der Rolle von B345 bei der Metastasierung sind folgende Untersuchungsmethoden geeignet:
Zunächst werden Zelllinien, vorzugsweise humane Zelllinien identifiziert, z. B. mittels TaqMan PCR, die B345 nicht endogen exprimieren. Die Zellen werden mit einem Plasmid, das die B345-Sequenz enthält, transfiziert und B345 exprimiert. Änderungen in der Morphologie und/oder dem Migrationsverhalten, das z. B. mittels Softagar Assay (Hamburger und Salmon, 1977) oder Migrationsassay (Liaw et al. 1995) der B345 exprimierenden Zellen gegenüber den nicht-transfizierten Zellen deuten auf eine Rolle von B345 in dem dafür verantwortlichen biologischen Prozess hin. Dies ist ein deutlicher Hinweis auf eine Beteiligung von B345 an der Interaktion von Tumorzellen untereinander und/oder mit der extrazellulären Matrix und somit auf eine Funktion bei der Metastasierung.

Alternativ bzw. zusätzlich zu dieser Funktionsanalyse wird in einem komplementären Ansatz die Expression von 8345 in Zellen, die dieses Protein endogen exprimieren, unterdrückt, um ebenfalls die etwaige Änderungen in Morphologie und/oder Migrationsverhalten festzustellen.

Außerdem wird gegebenenfalls untersucht, ob Proteinkomponenten existieren, die mit B345 inter- oder extrazellulär interagieren (z. B. mittels Yeast Two Hybrid System (Fields und Song, 1989)).

Die Erfindung betrifft somit in einem ersten Aspekt ein tumorspezifisches Polypeptid mit der Bezeichnung B345, mit der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Aminosäuresequenz oder ein Polypeptid, das von einem Polynukleotid kodiert wird, das unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder einer Teilsequenz davon hybridisiert, sowie davon abgeleitete Proteinfragmente oder Peptide.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül, kodierend für das tumorspezifische Polypeptid der Bezeichung B345.

Bevorzugt ist das erfindungsgemäße DNA-Molekül ein Polynukleotid der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder ein Fragment davon oder ein DNA-Molekül, das mit einem DNA-Molekül der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder einer Teilsequenz davon unter stringenten Bedingungen hybridisiert, oder ein Fragment davon.

Unter "stringenten Bedingungen" wird z. B. verstanden: Inkubation über Nacht bei 65°C-68°C mit 6 × SSC (1 × SSC = 150 mM NaCl, 15 mM Tri-Natriumcitrat), 5 × Denhardt's Lösung, 0.2% SDS, 50 µg/ml Lachsspermien-DNA, daran anschließend Waschen zweimal 30 min mit 2 × SSC, 0.1% SDS bei 65°C, einmal 30 min mit 0.2 × SSC, 0.1% SDS bei 65°C und gegebenenfalls abschließendes Spülen mit 0.1 × SSC, 0.1% SDS bei 65°C, oder äquivalente Bedingungen.

Die erfindungsgemäßen DNA Moleküle kodieren für (Poly)peptide der Bezeichnung B345 mit der in SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz bzw. für davon abgeleitete Proteinfragmente oder Peptide; damit sind DNA Moleküle bzw. Fragmente mitumfasst, die durch die Degeneration des genetischen Codes Abweichungen von der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz aufweisen

In einer Ausführungsform der Erfindung betrifft die Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder ein Fragment davon, oder ein DNA-Molekül, das mit einem DNA-Molekül der in SEQ ID NO: 3 dargestellten oder mit einer Teilsequenz davon hybridisiert, kodierend für das natürliche B345-Polypeptid bzw. für ein Fragment davon.

Die B345-DNA-Moleküle können in einer sog. DNA-Vakzine für die Immuntherapie von Tumoren verwendet werden.

Dabei können die B345-DNA-Moleküle Erfindung, vorzugsweise in rekombinanter Form als Plasmide, direkt oder als Bestandteil eines rekombinanten Virus, oder Bakteriums verabreicht werden. Prinzipiell kann jede gentherapeutische Methode für die Immuntherapie von Krebs auf Basis von DNA ("DNA-Vakzine") auf B345-DNA angewendet werden, und zwar sowohl in vivo als auch ex vivo.

Beispiele für die in vivo Verabreichung sind die direkte Injektion von "nackter" DNA, entweder intramuskulär oder mittels Gen-Pistole ("gene gun") von der sich gezeigt hat, daß sie zur Bildung von CTLs gegen Tumorantigene führt. Beispiele für rekombinante Organismen sind Vaccinia Virus, Adenovirus oder Listeria monocytogenes (eine Übersicht wurde von Coulie, 1997, gegeben). Desweiteren können synthetische Träger für Nukleinsäuren, wie kationische Lipide, Mikrosphären, Mikrokügelchen oder Liposomen für die in vivo Verabreichung von Nukleinsäure-Molekülen, kodierend für B345-Peptid verwendet werden. Ähnlich wie für Peptide können verschiedene Hilfsstoffe, die die Immunantwort verstärken, mitverabreicht werden, z. B. Zytokine, entweder in Form von Proteinen oder dafür kodierenden Plasmiden. Die Applikation kann gegebenenfalls mit physikalischen Methoden, z. B. Elektroporation, kombiniert werden.

Ein Beispiel für die ex vivo Verabreichung ist die Transfektion dendritischer Zellen, wie von Tuting, 1997, beschrieben, oder anderer APCs, die als zelluläre Krebsvakzine zur Anwendung kommen.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt die Verwendung von Zellen, die B345 exprimieren, entweder von sich aus oder, in gegebenenfalls modifizierter Form, nach Transfektion mit der entsprechend kodierenden Sequenz, für die Herstellung einer Krebsvakzine.

Alternativ zur natürlichen B345-cDNA bzw. Fragmenten davon können modifizierte Derivate verwendet werden. Diese umfassen Sequenzen mit Modifikationen, die für ein Protein(fragment) bzw. Peptide mit stärkerer Immunogenität kodieren, wobei für die Modifikationen auf DNA-Ebene dieselben Überlegungen gelten wie für die oben beschriebenen Peptide. Eine weitere Art der Modifikation ist die Aneinanderreihung zahlreicher Sequenzen, kodierend für immunologisch relevante Peptide, nach Art einer Perlenschnur ("string-of-beads"; Toes et al., 1997). Die Sequenzen können auch durch Anfügung von Hilfselementen modifiziert werden, z. B. Funktionen, die eine effizientere Abgabe und Prozessierung des Immunogens gewährleisten (Wu et al., 1995). Beispielsweise kann durch Anfügen einer Lokalisierungssequenz in das endoplasmatische Retikulum ("ER targeting sequence") die Prozessierung und damit die Präsentation und letztlich die Immunogenität des Antigens erhöht werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein rekombinantes DNA-Molekül, das B345-DNA enthält, z. B. verbunden mit einer regulatorischen DNA-Sequenz, insbesondere einer heterologen regulatorischen DNA-Sequenz, z. B. einem Promoter oder Enhancer.

Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt Antikörper gegen B345 bzw. Fragmente davon. Polyklonale Antikörper können in herkömmlicher Weise durch Immunisierung von Tieren, insbesondere Kaninchen, mittels Injektion des Antigens bzw. Fragmenten davon, und anschließender Reinigung des Immunglobulins erhalten werden.

Monoklonale anti-B345-Antikörper können nach Standardprotokollen gemäß dem von. Köhler und Milstein, 1975, beschriebenen Prinzip gewonnen werden, indem Tiere, insbesondere Mäuse, immunisiert, anschließend antikörperproduzierende Zellen der immunisierten Tiere immortalisiert werden, z. B. durch Fusion mit Myelomzellen, und der Überstand der erhaltenen Hybridome mittels immunologischer Standard-Assays auf monoklonale anti-B345-Antikörper gescreent wird. Für den therapeutischen oder diagnostischen Einsatz im Menschen können diese tierischen Antikörper gegebenenfalls auf herkömmliche Weise chimerisiert (Neuberger et al., 1984; Boulianne et al., 1984) oder humanisiert (Riechmann et al., 1988 Graziano et al., 1995) werden.

Humane monoklonale anti-B345-Antikörper(fragmente) können auch von sog. "Phage Display Libraries" (Winter et al., 1994; Griffiths et al., 1994; Kruif et al., 1995; McGuiness et al., 1996) und mittels transgener Tiere (Brüggemann et al., 1996; Jakobovits et al., 1995) gewonnen werden.

Die erfindungsgemäßen anti-B345-Antikörper können in immunhistochemischen Analysen für diagnostische Zwecke eingesetzt werden, oder als Therapeutikum in der Krebstherapie. (Ein Beispiel für die erfolgreiche Anwendung eines monoklonalen Antikörpers in der Krebstherapie ist Herceptin; ein Antikörper gegen das Proto-Onkogen HER2. Herceptin kann in Brustkrebs- Patienten angewendet werden, die eine Überexpression von HER2 aufweisen.)

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von B345-spezifischen Antikörpern, um beliebige Substanzen selektiv zu bzw. in einen Tumor zu bringen, der B345 exprimiert. Beispiele für solche Substanzen sind zytotoxische Agenzien oder radioaktive Nuklide, deren Wirkung darin besteht, den Tumor Vorort zu schädigen. Aufgrund der relativ tumorspezifischen Expression von B345 sind dabei nur geringe Nebenwirkungen zu erwarten. In einem weiteren Aspekt können mit Hilfe von B345-Antikörpern Substanzen zur Sichtbarmachung von Tumoren, die B345 exprimieren, herangezogen werden. Dies ist für die Diagnose und die Bewertung des Therapieverlaufs von Nutzen. Therapeutische und diagnostische Anwendungen von Antikörpern, die für anti-B345-Antikörper in Frage kommen, sind in der WO 95/33771 beschrieben.

Das Protein der Bezeichnung B345 gemäß der vorliegenden Erfindung und die davon abgeleiteten Proteinfragmente, Peptide bzw. Peptid-Äquivalente oder Peptidomimetika können in der Krebstherapie eingesetzt werden, z. B. um eine Immunantwort gegen Tumorzellen zu induzieren, die die entsprechenden Antigen-Determinanten exprimieren. Vorzugsweise werden sie für die Therapie von B345-positiven Tumoren verwendet, insbesondere beim Lungen- und Kolonkarzinom.

Es ist bekannt, dass tumorassoziierte Antigene tumorspezifische Mutationen aufweisen können, die zu einer immunologischen Unterscheidung zwischen Tumor und Normalgewebe beitragen (Mandruzzato et al., 1997 Hogan et al., 1998; Gaudi et al., 1999; Wölfel et al., 1994). Um das Vorhandensein tumorspezifischer B345-Mutationen festzustellen, wird, zweckmäßig mit Hilfe von Sonden aus der erfindungsgemäßen isolierten cDNA, die B345-cDNA aus einem oder mehreren unterschiedlichen Tumoren kloniert und die erhaltenen Sequenzen mit Normalgewebs-B345-cDNA verglichen. Es werden Versuche durchgeführt, die zeigen sollen, ob Tumor-B345-Peptide aus einem gegenüber Normalgewebs-B345 mutierten Sequenzabschnitt im Vergleich zu Normalgewebs-B345-Peptiden aus dem entsprechenden Abschnitt eine verstärkte Immunogenität aufweisen. Um zu bestätigen, dass etwaige Mutationen tumorspezifisch sind, können Antikörper gegen diese Bereiche generiert und Tumorzellen auf Expression von möglichen Mutationen untersucht werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt B345-Peptide, abgeleitet von Bereichen eines tumorexprimierten B345, die tumorspezifische Mutationen aufweisen.

Auf Grund der bevorzugten Expression von B345 in Tumorzellen kann angenommen werden, dass dieses Protein eine wichtige Funktion für den Tumor hat, z. B. für Entstehung, Infiltration und Wachstum und somit ein Target für die chemotherapeutische Intervention darstellt.

Im Hinblick auf seinen Einsatz als Target in der gezielten Chemotherapie wird B345 näher charakterisiert, um die geeignete Strategie für die Intervention mit dieser Funktion zu entwickeln.

Als ersten Schritt bei der sog. "down-stream" Funktionsanalyse von B345 führt man zweckmäßig in einem ersten Schritt eine bioinformatische Analyse durch, die den für die experimentelle Validierung von B345 als Target richtungweisend ist.

Für diese Analyse stellen die auf Ähnlichkeit und modularer Struktur beruhenden Bioinformatik-Konzepte eine wesentliche Grundlage dar. Etablierte bioinformatische Hilfsmittel zur Feststellung von Ähnlichkeiten sind BLAST (http:/ / www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST, Altschul et al., 1997) oder FASTA (Pearson & Lipman, 1988), die spezialisierten Datenbanken wie Pfam (http:/ / www.sanger.ac.uk/Pfam, Bateman et al., 2000) und SMART (http:/ / smart.embl-heidelberg.de, Schultz et al., 2000), welche Domänenstrukturen berücksichtigen. Zur Verfeinerung der Analyse können Applikationen wie Clustal (http:/ / www2.ebi.ac.uk/clustalw, Higgins et al., 1996), HMMer (http:/ / hmmer.wustl.edu), PSI-BLAST (Altschul et al., 1997) und die PROSITE Datenbank (http:/ / www.expasy.ch/prosite, Hofmann et al., 1999) herangezogen werden. Statistische Analysemethoden, die nicht auf Homologien beruhen, gestatten die Vorhersage weiterer struktur- und funktionsrelevanter Eigenschaften wie der Sekundärstruktur und des Auftretens von Transmembransegmenten und Helix-Turn-Helix-Motiven. Methoden zur Vorhersage der Sekundärstruktur von Proteinen sind verfügbar; besonders erwähnenswert ist Jpred (http:/ / barton.ebi.ac.uk/servers/jpred.html, Cuff et al., 1998). Die Sekundärstrukturvorhersage kann Funktionshypothesen untermauern, etwa wenn die Struktur des vermuteten Homologen bekannt ist.

Gemäß Bioinformatikanalyse weist B345 eine helikale Transmembrandomäne auf, wobei sowohl der N-terminale als auch der C-terminale Bereich hydrohpil sind, was darauf schließen lässt, dass dieses Protein ein Transmembranprotein darstellt. Der N-terminale, extrazelluläre Bereich besitzt einige CUB-Domänen, welche zu Disulfidbrückenbildung neigen und daher bei der Dimerisierung bzw. bei Protein-Protein Wechselwirkungen beteiligt sind (Bork et al., 1993). Das C-terminale, intrazelluläre Ende zeigt Homologien zu einer Rezeptorkinase und zu einem C-Kinase Substrat.

In weiterer Folge wird B345 einer biochemischen und biologischen Analyse unterworfen.

In einem nächsten Schritt wird die Funktion von B345 für das Tumorgeschehen aufgeklärt; z. B. durch Proliferationsassays in vitro oder in Tiermodellen, die das zu untersuchende B345-Gen überexprimieren (konstitutiv oder induzierbar) und als Kontrolle entweder in deletierter (inaktiver) Form exprimieren oder über Antisense hinunteregulieren (siehe z. B. Grosveld und Kollias, 1992).

B345 kann in Screening-Assays verwendet werden, um Substanzen zu identifizieren, die die Aktivität dieses Proteins modulieren, insbesondere inhibieren. In einer Ausführungsform kann ein derartiger Assay z. B. darin bestehen, das B345 Protein, oder ein aktives Fragment davon, in Zellen, die auf die Aktivität von B345 mit Proliferation reagieren, einzubringen bzw. die entsprechende B345 cDNA in der Zelle zur Expression zu bringen, und die Proliferation der Zellen in Gegenwart und in Abwesenheit einer Testsubstanz zu bestimmen.

Ein Beispiel für Testzellen sind Zellen mit niedriger Teilungsrate, z. B. primäre Zellen, die kein endogenes B345 aufweisen. Um die Eignung der Zellen für einen Screening-Assay festzustellen, werden diese mit B345-cDNA transformiert, gezüchtet und mit Standard- Assays, z. B. Thymidin-Einbau, auf ihre Proliferationsfähigkeit getestet. Aufgrund einer nach B345-Expression signifikanten Erhöhung ihrer Proliferationseigenschaft können sie als Testzellen eingesetzt werden, z. B. in High Throughput Screening Proliferationsassays. Beispiele für Proliferationsassays im High Throughput Format, z. B. auf Grundlage des MTS- Assays, sind in der WO 98/00713 beschrieben.

Substanzen mit proliferationshemmender Wirkung können zur Behandlung von Tumoren mit starker B345-Expression verwendet werden, insbesondere beim Lungen- und Kolonkarzinom.

Figurenübersicht

Fig. 1A: Expressionsprofil von B345, B452 und B540 in individuellen Lungenkarzinomen und Lungentumorzelllinien;

Fig. 1B: Expressionsprofil von B345 in normalem Dickdarmgewebe und Tumorzelllinien;

Fig. 1C: Graphische Darstellung des Alignments von B345, B452 und B540;

Fig. 2A: Northern Blot Analyse der Tumorzelllinie A549 mit einem 490 bp langen B345 PCR-Produkt;

Fig. 2B: Northern Blot Analyse verschiedener Normalgewebe mit einem 490 bp langen B345 PCR-Produkt;

Fig. 2C: Northern Blot Analyse verschiedener Krebsgewebe mit einem 318 bp langen B345 PCR-Produkt;

Fig. 3: mRNA Expressionsanalyse von B345 durch real-time PCR von Tumor- und Normal-Geweben;

Fig. 4: mRNA Expressionsanalyse von B345 durch real-time PCR von Laser-Mikroskop-präparierten Dickdarmtumoren (LCM) sowie normalem Dickdarmgewebe und Tumorzelllinien;

Fig. 5: Graphische Darstellung der Genstruktur von B345;

Fig. 6: Hydrophilizitäts-und Transmembran-Blot des B345-Proteins;

Fig. 7: Potentielle Proteinstruktur von B345.

Tabellenübersicht

Tab. 1: Zusammenfassung der Northern Blot Daten von B345 in verschiedenen Normalgeweben (1A), Krebszelllinien (1B); und verschiedenen Normalgeweben im Vergleich mit dem entsprechenden Tumorgewebe (1C);

Tab. 2A: Zusammenfassung der Daten der quantitativen PCR von B345 in verschiedenen Normal- und Krebsgeweben;

Tab. 2B: Zusammenfassung der Daten der quantitativen PCR von B345 in verschiedenen Normalgeweben und mikrodissektierten Kolonadenokarzinom Geweben.

Zeichenerklärung

+++ extrem positiv
++ stark positiv
+ positiv
(+) schwach positiv
- negativ

Beispiel 1 RDA ("Representational Difference Analysis") von der humanen Adenokarzinom-Zelllinie der Lunge (A549) und normalem Lungengewebe

Die von ATCC bezogene humane Lungenadenokarzinom- Zelllinie A549 (CCL 185) wurde in T150 Zellkulturflaschen hochgezüchtet. Als Nährmedium diente MEM mit 10% hitze­ inaktiviertem, fötalem Kälberserum und 2 mM L-Glutamin. Alle 3 bis 4 Tage wurden die Zellen durch Trypsinisieren 1 : 5 bis 1 : 10 zur Propagation gespalten. Nach Erreichen von etwa 80% Konfluenz wurden pro T150 Zellkulturflasche 4 ml einer Trypsinlösung (Angaben pro Liter: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,13 g Na₂HPO₄-wasserfrei, 0,2 g KH₂PO₄, 100 ml 2,5% Trypsinlösung, 1 g EDTA-Na-Salz; pH 7,2-7,4) zum Ernten der Zellen eingesetzt. Die 4 ml wurden in ein 15 ml Falconröhrchen transferiert, mit 8 ml PBS versetzt, bei 1200 rpm in einer Haereus Tischzentrifuge (Megafuge 2.0R) 5 min bei 4°C zentrifugiert, das Zellpellet mit 1 ml Lysis-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8, 140 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,5% NP40) versetzt, kräftig geschüttelt und in einem 2 ml Eppendorfgefäß bei 12 000 rpm und 4°C 5 min in einer Sigma Tischzentrifuge (Sigma 202 MK) abzentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß transferiert und nach Zusatz von 55 µl 20% SDS-Lösung zweimal mit dem doppelten Volumen an einer CHCl₃/Phenol (1 : 1 v/v) Mischung und einmal mit dem einfachen Volumen an CHCl₃ extrahiert. Die wässrige RNA-enthaltende Phase wurde mit 1/10 Volumen an 3 M NaAc (pH 5) und dem zweifachen Volumen an 96% EtOH versetzt und über Nacht bei -20°C die RNA präzipitiert. Ausgehend von 1 mg Gesamt-RNA wurde für die Isolierung von poly-A(+)RNA mittels des PolyATtract Kit (Promega) entsprechend dem Hersteller-Protokoll vorgegangen. Die Lagerung der A549 poly-A(+)RNA mit einer Konzentration von 1 mg/ml in DEPC-behandeltem H₂O erfolgte in Aliquots bei -80°C.

Zur Durchführung der repräsentativen Differenzanalyse (RDA; Hubank and Schatz, 1994; Diatchenko et al., 1996) wurde die poly-A(+)RNA der Lungenadenokarzinom-Zelllinie A549 als "tester", die von normalem Lungengewebe (1 mg/ml; Clontech, Palo Alto; #6524-1) als "driver" eingesetzt. Die RDA wurde unter Verwendung des PCR-select™ kit (Clontech, Palo Alto) entsprechend dem Hersteller-Protokoll durchgeführt, mit der Ausnahme, dass ein modifiziertes Primer/Adaptor-2- Oligonukleotidsystem zum Einsatz kam: Adaptor-2-alt-1 (SEQ ID NO: 31) und nested-PCR-primer-2-alt (SEQ ID NO: 32) und Adaptor-2-alt-2 (SEQ ID NO: 33). Die neu generierten Primer/Adaptor-Sequenzen ermöglichen durch die Anwesenheit von drei neuen Restriktionsenzymschnittstellen (Kpn I, Sac I und Xho I) in der Sequenz des nested-PCR-primer-2-alt nach Klonierung der subtrahierten cDNA-Fragmente in den pPCRII-Vektor ein nachträgliches Herausschneiden der jeweiligen cDNA-Fragmente. Das Designen einer Primer/Adaptorsequenz mit mehreren verfügbaren Restriktionsenzymschnittstellen war deshalb notwendig, weil besonders in den Primersequenzen - bedingt durch die PCR-Amplifikationsschritte - oft Punktmutationen zu beobachten waren.

Nach der Synthese von doppelsträngiger cDNA mittels oligo-dT wurde die erhaltene cDNA von "tester" und "driver" mit RsaI verdaut (RsaI ist ein 4-Basen erkennendes Restriktionsenzym und liefert im statistischen Mittel 256 bp lange cDNA-Fragmente). Gleiche Teile von "tester-cDNA" wurden entweder mit den Adaptoren 1 oder 2 ligiert und anschließend getrennt mit einem Überschuss an "driver-cDNA" bei 65°C hybridisiert. Danach wurden die beiden Ansätze vereinigt und einer zweiten Hybridisierung mit frischer denaturierter "driver-cDNA" unterworfen. Die angereicherten "tester"- spezifischen cDNAs wurden anschließend durch PCR, mit für die Adaptoren 1 bzw. 2 spezifischen Primern, exponentiell amplifiziert. Für eine weitere Anreicherung wurde ein Aliquot dieser Reaktion einer zweiten PCR mit spezifischen nach innen versetzten ("nested") Primern unterworfen. Die aus dieser Reaktion resultierenden, exponentiell amplifizierten cDNA-Fragmente wurden direkt in den pCRII-Vektor (Invitrogen; "TA-cloning vector") ligiert und anschließend ein Drittel des Ligationsansatzes in kompetente E. coli (OneShot™, Invitrogen) transfiziert.

712 positive Transformanten (Blau-Weiß-Selektion) wurden erhalten und in 96-Napf-Blöcken in LB-Amp Medium (1,3 ml pro Napf) für 48 h bei 37°C kultiviert. Pro Napf wurden 750 µl der E. coli Suspensionen für die Präparation der Plasmid-DNA eingesetzt (96-Napf-Minipräparationsmethode von QIAgen nach Vorschrift des Herstellers). Die verbleibenden Bakterienkulturen wurden als Glycerinstammkulturen bei -80°C gelagert.

Es wurde eine aus 712 Einzelklonen bestehende cDNA- Subtraktionsbibliothek erhalten, die sowohl in Form von E. coli Glycerin-Stammkulturen als auch in Form gereinigter Plasmide vorlag.

Beispiel 2 DNA-Sequenzierung und Annotation von TAA-Kandidaten

Die isolierte Plasmid-DNA sämtlicher 712 Klone (siehe Beispiel 1) wurde nach der Sanger-Methode auf einem ABI-377 Prism Gerät sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden mittels der BioScout-Software (LION, Heidelberg) annotiert und Datenbankvergleichen (Genbank) unterzogen. Von 712 Klonen konnten 678 sequenziert und annotiert werden. Der Rest (34) wies als Insert entweder nur poly(A) Sequenzen auf oder entsprach einem religierten Vektor oder war nicht sequenzierbar. Von den 678 annotierbaren Sequenzen erwiesen sich 357 als Gene mit bekannter Funktion. Die restlichen 321 repräsentierten Klone, kodierend für Gene mit unbekannter Funktion; 59 davon wiesen nicht einmal Einträge in der humanen EST-Datenbank auf. Bekannte Gene wurden nicht weiter behandelt. Für jene unbekannten Gene, für die ein EST-Eintrag verfügbar war, wurde eine Abschätzung des Expressionsprofils vorgenommen: dabei wurden all jene ESTs mit < 95% Identität (BLAST), die zur entsprechend experimentell ermittelten Sequenz der Subtraktionsbibliotheken gehörten, überprüft. Bei der Annotation wurde eine Unterteilung in a) kritische Normalgewebe, b) fötale, "verzichtbare" und immunprivilegierte Gewebe und c) Tumore und Tumor- Zelllinien vorgenommen. Auf der Basis dieses "virtuellen mRNA-Profils" ("virtueller Northern blot") wurden 200 Klone, für die keine ESTs in der Gruppe a) gefunden wurden, für weitere experimentelle Analysen ausgewählt (inklusive der 59 Klone, für die keine EST-Eintragung vorlag). Zur weiteren Einengung der Kandidatenklone wurden aus den von den 200 ausgewählten Klonen ermittelten Sequenzen Oligonukleotidprimerpaare entworfen und synthetisiert. Es wurden zunächst 8 verschiedene, von humanem Gewebe abgeleitete cDNA-Bibliotheken (GibcoBRL "SUPERSCRIPT™"), welche direktional in pCMV-SPORT kloniert sind, mittels qualitativer PCR auf das Vorhandensein der jeweiligen Kandidaten getestet. Die dabei eingesetzten cDNA-Bibliotheken stammten aus Gewebe von Herz (#10419-018), Leber (#10422-012), Leukozyten (#10421-022), Niere (#10420-016), Lunge (#10424-018), Testis (#10426-013), Gehirn (#10418-010) und fötalem Gehirn (#10662-013). Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 20 µl Gesamtvolumen pro PCR-Ansatz enthielten 1 × TaqPol-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 9, 0,1% Triton X-100), 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTPs (Promega), 0,025 U/µl Taq-DNA-Polymerase (Promega), jeweils 5 pM an spezifischen Oligonukleotidprimer für B345 (B345-D, SEQ ID NO: 34) und (B345-U, SEQ ID NO: 35) sowie 100 ng der jeweils zu untersuchenden Plasmid-DNA. Zur Kontrolle wurden spezifische Primer für GAPDH (SEQ ID NO: 36 und 37) eingesetzt. Zur Überprüfung des selektiven Nachweises wurden die jeweiligen B345 spezifischen Primerpaare Oligonukleotidprimer (SEQ ID NO: 34) und (SEQ ID NO: 35) parallel auch auf das isolierte Plasmid mit dem B345 "original Fragment" hin ausgetestet (ursprünglich isoliertes cDNA-Fragment von B345). Die Nachweisbarkeitvon Fragmenten der zu erwartenden Länge mit starkem Signal in einem der kritischen Normalgewebe (Herz, Leber, Lunge, Niere und Leukozyten), nicht jedoch in den cDNA-Bibliotheken aus immunprivilegierten Geweben (Gehirn, fötales Gehirn und Testis) unter diesen PCR-Bedingungen (1 Zyklus: 3' 94°C; 35 Zyklen: 1' 94°C-­ 1' 55°C-1' 72°C; 1 Zyklus: 7' 72°C) wurde als Ausscheidungskriterium definiert. Mittels dieser qualitativen PCR-Analyse konnte die Zahl der Kandidaten auf 56 eingeengt werden; Klon B345 befand sich in dieser bereits vorselektionierten Kandidatengruppe.

Beispiel 3 Expressionsanalyse durch cDNA Chip Hybridisierung

Für das Design eines cDNA Chips wurden von der dBEST Datenbank über Nukleotid-Sequenzsuche eine Reihe von Klonen ausgewählt, die zu verschiedensten Funktionskategorien, wie Apoptose bis zur Zellzyklus- Regulation, gehören. Ingesamt wurden 1299 IMAGE Klone (davon repräsentieren 1024 bereits bekannte Gene) bestellt und zur Kontrolle sequenziert. Mikrotiterplatten mit Bakterien, die ca. 800 bp lange Sequenzen vom 3'Ende des Gens im Vektor enthalten, wurden an Incyte Pharmaceuticals, Inc. (USA) geschickt und diese dort auf 60 Chips gespottet. Neben diesen Klonen wurden auch 120 durch RDA identifizierten EST Klone auf die Chips gespottet. Die so produzierten DNA Chips wurden anschließend mit Cy3 markierter cDNA aus Normalgewebe, Tumorgewebe und Zelllinien zusammen mit Cy5 markierter cDNA aus einer Mischung von neun verschiedenen Normalgeweben hybridisiert und die beiden Signale zur Normalisierung der Expressionswerte verglichen. Die Berechnungen erfolgten teilweise in S-Plus oder in Microsoft Excel. Die Auswertung der Chip Experimente ergab ein sehr ähnliches Expressionsprofil für B345, B540 und B452 bei der Hybridisierung mit Lungenkrebs Proben von Zelllinien und Patientenmaterial (siehe Fig. 1A). Solch ein tumorassoziiertes Expressionsprofil konnte für B345 auch bei Vergleich von Kolon Adenokarcinom mit Kolon Normalgewebe gezeigt werden (siehe Fig. 1B).

Das Sequenzalignment von B345, B540 und B452 zeigte eindeutig ein Überlappen der einzelnen EST Fragmente. Daher konnte man annehmen, dass es sich bei den drei Klonen um ESTs von ein und dem selben Gen handelt. Der daraus resultierende DNA Abschnitt deckt eine Länge von 843 bp ab (siehe Fig. 1C) und wurde in weiteren Versuchen zur Durchsuchung von öffentlichen Datenbanken verwendet. Die Suchergebnisse lieferten keine signifikante Homologie zu bekannten DNA bzw. Protein Sequenzen, was darauf hindeutet, dass es sich bei B345 um ein bislang unbekanntes Gen handelt.

Beispiel 4 Expressionsanalyse von B345 mittels Northern Blots

Bei B345 handelt es sich um ein Gen, das laut DNA Chip Analysen in Tumorgeweben (siehe Fig. 1A und 1B, Tab. 1a und Tab. 1B) hochreguliert ist.

Um einerseits das erhaltene Transkriptionsprofil zu bestätigen und andererseits die Länge der zu erwartenden mRNA für die full size Klonierung zu bestimmen, wurde für B345 eine Northern Blot Analyse unter Einsatz von humanen Zelllinien und des "Human Multiple Tissue Northern Blots" (Clontech und Invitrogen) durchgeführt. Als Sonden dienten die mit [α-³²P]dCTP (NEN, Boston) markierten 490 bp bzw. 318 bp langen PCR Produkte von B345 (Primer (SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8)). Die Hybridisierung erfolgte bei 68° für 2 h; die Visualisierung durch Standard- Autoradiografie (Hyperfilm, Amersham). Fig. 2A, 2B und 2C sowie Tab. 1A und Tab. 1B, 1C zeigen das Ergebnis dieser Analyse: Fig. 2A von der Zelllinie A549, Fig. 2B von 12 Normalgeweben (Periphere Blut Lymphozyten (PBL), Lunge, Placenta, Dünndarm, Leber, Niere, Milz, Thymus, Kolon, Skelettmuskel, Herz und Hirn) und Fig. 2C von 8 Krebszelllinien (Promyelozytische Leukämie HL60, HeLa-S3, chronische myelogene Leukämie K-562, lymphoblastische Leukämie MOLT-4, Burkitt's Lymphom (Raji), Kolon Adenokarzinom SW480, Lungen Adenokarzinom A549 und Melanom G361). Das B345-Transkript zeigt eine Länge von 6,5 kb.

Beispiel 5 Analyse des Expressionsprofils von B345 auf RNA-Ebene mittels quantitativer RT-PCR (real time PCR oder TaqMan-Analyse)

Um eine exaktere Quantifizierung der mRNA Expression in den verschiedenen normal und Tumorgeweben durchzuführen, wurde die "real time PCR" angewandt, die es erlaubt die RNA Konzentration im Vergleich zu einen externen Standard zu berechnen.

Die Isolierung der RNA aus Gefriergewebe erfolgte mit Trizol gemäß dem Herstellerprotokoll von Gibco. Zur Entfernung von etwaig kontaminierender DNA wurde die präparierte RNA wie folgt mit DNAase I verdaut: 3 µg Gesamt-RNA wurden mit 20 µl 5 × AMV Puffer (Promega), 1 µl RNasin (Promega) und 2 µl DNase I (Boehringer Mannheim) in einem Gesamtvolumen von 80 µl 15 Minuten bei 37°C inkubiert. 120 µl Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) wurden zugegeben, auf einem Vortexer gemischt und kurz abzentrifugiert. Die wässrige Phase wurde abgenommen, mit 120 µl Chloroform : Isoamylalkohol (24 : 1) versetzt und wie vorher zentrifugiert. Die gereinigte RNA wurde Ethanol-gefällt und in Wasser gelöst.

Anschließend wurde die Gesamt-RNA mit reverser Transkriptase (Superscript, Gibco, BRL) in cDNA umgeschrieben: Zu 3 µg Gesamt-RNA wurden 1 µl Oligo dT primer (Promega) zugegeben und mit Wasser auf ein Endvolumen von 10 µl gebracht. Nach einer Inkubation von 5 Minuten bei 70°C wurde die Lösung 5 Minuten bei Zimmertemperatur abgekühlt. 5 µl RT reaction buffer (5 ×, Gibco, BRL), 2,5 µl dNTPs (je 10 mM, Boehringer Mannheim), 1 µl RNasin (10 U/µl, Promega), 1,5 µl Superscript (10 U/µl, Gibco, BRL) und 5 µl Wasser wurden zugegeben und 1 Stunde bei 42°C inkubiert und die Reaktion durch Inkubation von 3 Minuten bei 95°C beendet.

Zur Herstellung eines cDNA-pools eines bestimmten Gewebe- oder Tumortyps wurden 3 bis 10 verschiedene Einzelpräparationen von unterschiedlichen Patienten in gleichen Anteilen gemischt.

Die quantitative Bestimmung der "Haushaltsgene" β-Aktin, GAPDH und Tubulin in cDNA-pools wurde wie folgt durchgeführt:

A) β-Actin-TaqMan PCR (Perkin Elmer)

Details über das Prinzip der TaqMan Methode siehe Herstellerinformation (Perkin Elmer). Ein TaqMan PCR Lauf beinhaltete Proben an β-Actin-Kontrollsequenz mit je 10², 10³, 10⁴, 10⁵ und 10⁶ Kopien/µl (Perkin Elmer) zur Bestimmung der Standardkurve, eine Negativkontrolle ohne DNA und die zu quantifizierenden cDNA-pools. Alle Proben wurden in Triplikaten analysiert. Für einen 25 µl Reaktionsansatz wurden 1 µl cDNA, 2,5 µl 10 × Puffer A (Perkin Elmer), 4 µl MgCl₂ (25 mM, (Perkin Elmer)), 0,5 µl je Nukleotid (10 mM dATP, dCTP, dGTP; 20 mM dUTP), 0,125 µl TaqMan Sonde (20 µM; TaqMan Sonde für β-Aktin (SEQ ID NO: 20; fluoreszenzmarkiert am 5'-Ende mit 6-Carboxyfluorescein und mit 6-Carboxytetramethylrhodamine am 3'-Ende), 1 µl je β-Aktin spezifischer Primer (je 20 µM, Forward Primer SEQ ID NO: 21 und Reverse Primer SEQ ID NO: 22), 0,25 µl AmpErase uracil N-Glycosylase "UNG" (1 U/µl, Perkin Elmer), und 0,125 µl AmpliTaq Gold (5 U/µl, Perkin Elmer) gemischt, in MicroAmp Optical Tubes (Perkin Elmer) überführt und mit MicroAmp Optical Caps verschlossen. Die PCR wurde folgendermaßen durchgeführt: ein Zyklus mit 2 Minuten 50°C für die UNG Reaktion, ein Zyklus 10 Minuten 95°C zur Aktivierung der AmpliTaq, 40 Zyklen mit je 15 Sekunden 95° und 1 Minute 60°C. Anschließend wurden die Proben auf 25°C gehalten. Die Auswertung der Daten erfolgt mit dem Programm "Sequence Detection System 1.5b1" (PE Applied Biosystems), wobei im Prinzip die Fluoreszenzsignale der zu quantifizierenden cDNA-Proben mit den Signalen der Kontrollplasmidverdünnungen bekannter Konzentration verglichen wurden.

B) GAPDH-TaqMan PCR

Für die Quantifizierung von GAPDH, das wie β-Aktin oder Tubulin zur Normalisierung der eingesetzten RNAs verwendet wurde, sind folgende Primer bzw. Sonden eingesetzt worden. Als TaqMan Sonde für GAPDH diente (SEQ ID NO: 23) eine am 5'-Ende mit Tetrachlorfluorescein und am 3'-Ende mit Carboxymethylrhodamin markierte Sonde (Forward GAPDH Primer: SEQ ID NO: 24 und Reverse Primer: SEQ ID NO: 25). Die Reaktionen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.

C)Tubulin-SybrGreen PCR (Perkin Elmer)

Prinzip der SybrGreen PCR siehe Herstellerinformation (Perkin Elmer). Ein SybrGreen PCR Lauf beinhaltete Proben an Tubulin-Kontrollplasmid mit je 10², 10³, 10⁴, 10⁵ und 10⁶ Kopien/µl (Perkin Elmer) zur Bestimmung der Standardkurve, eine Negativkontrolle ohne DNA und die zu quantifizierenden cDNA-pools. Alle Proben wurden in Triplikaten analysiert. Für einen 25 µl Reaktionsansatz wurden 1 µl cDNA, 2,5 µl 10 × SybrGreen Puffer (Perkin Elmer), 3,5 µl MgCl₂ (25 mM, Perkin Elmer), 0,5 µl je Primer (je 20 µM, Perkin Elmer), Tubulin Forward (SEQ ID NO: 26); Tubulin reverse (SEQ ID NO: 27), 0,25 µl AmpErase uracil N-Glycosylase "UNG" (1 U/µl, Perkin Elmer), und 0,25 µl AmpliTaq Gold (5 U/µl, Perkin Elmer) gemischt, in MicroAmp Optical Tubes (Perkin Elmer) überführt und mit MicroAmp Optical Caps verschlossen. Die PCR wurde folgendermaßen durchgeführt: ein Zyklus mit 2 Minuten 50°C für die UNG Reaktion, ein Zyklus 10 Minuten 95°C zur Aktivierung der AmpliTaq, 40 Zyklen mit je 15 Sekunden 95° und 1 Minute 60°C. Anschließend wurden die Proben auf 25°C gehalten. Die Auswertung der Daten erfolgt mit dem Programm "Sequence Detection System 1.5b1" (PE Applied Biosystems), wobei im Prinzip die Fluoreszenzsignale der zu quantifizierenden cDNA-Proben mit den Signalen der Kontrollplasmidverdünnungen bekannter Konzentration verglichen wurden.

D) B345-TaqMan PCR

Die quantitative TaqMan-PCR-Analyse von B345 wurde, wie für die "Haushaltsgene" beschrieben, durchgeführt. Es wurden jedoch B345 spezifische Primer (SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 29) (200 ng/µl) und eine B345 spezifische Sonde (SEQ ID NO: 30, 20 µM), die am 5'-Ende mit Tetrachlorfluorescein und am 3'-Ende mit Carboxymethylrhodamin markiert ist, verwendet. Als Standard wurde das PCR Produkt von B345 mit den Primern SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 29 mit bekannter Kopienzahl eingesetzt.

Fig. 3 veranschaulicht die TaqMan-Expressionsanalyse (Fig. 3A: β-Actin; Fig. 3B: Tubulin). Es zeigte sich, dass B345 höher in Dickdarmkrebsgewebe als in Normalgewebe exprimiert ist (siehe Tab. 2A). Nun stellt aber sowohl das Normalgewebe als auch das Tumorgewebe ein sehr heterogenes Gemisch von verschiedenen Zelltypen dar. Weiteres variiert der Anteil von Tumorzellen im Tumorgewebe sehr stark von etwa 30 bis 80%. Um diese biologische Heterogenität auf ein Minimum zu beschränken, wurden die Epithelzellen des Dickdarms, die die Ursprungszellen des Adenokarzinoms darstellen, und die Krebszellen oder Krebsareale durch Laser- Mikrodissektion spezifisch präpariert. Gewebeschnitte von 10 µm Stärke wurden mit dem Kyromikrotom von Leica, Jung CM1800 angefertigt und auf einen mit Polyethylen beschichteten Objektträger aufgebracht (Böhm et al., 1997). Die bei Raumtemperatur für etwa 30 Minuten getrockneten Schnitte wurden mit Mayers Hämatoxylin (SIGMA DIAGNOSTICS) inkubiert und anschließend zur Entfernung von unspezifisch gebundenen Farbstoff fünf Minuten unter fließendem Wasser gewaschen. Nach fünf­ minütigem Trocknen bei 37°C wurde die Laser- Mikrodissektion durchgeführt. Dafür wurde das Lasermikroskop von PALM (PALM GmbH, Bernried, Deutschland) eingesetzt und etwa 2000 bis 5000 Zellen präpariert. Die durch Reverse Transkription gewonnene cDNA, wurde auch hier durch Real Time PCR analysiert. Das Ergebnis zeigt, dass die B345 Expression in Dickdarmkarzinom Zelllinien sowie in Patientenmaterial um ein Vielfaches höher ist als vergleichsweise die des Dickdarmnormalgewebes. Zur Normalisierung wurde der Expressionslevel von GAPDH bestimmt (siehe Fig. 4 und Tab. 2B).

Beispiel 6 a) Klonierung der cDNA von B345

Das Durchsuchen von Datenbanken nach Sequenzen von Genfragmenten (ESTs, expressed sequence tags), die für die "in silico" Klonierung von B345 herangezogen werden können, ergab ein überlappendes EST-Kontig von etwa 1500 bp. Der polyA-Bereich an einem der Enden gab Hinweis auf die Orientierung des DNA Abschnittes in Bezug auf 5'-3' Orientierung, was beim Design von neuen Primern für die Amplifikation von B345- spezifischen cDNA-Fragmenten essentiell ist.

Zunächst wurde das durch die Datenbankanalyse beschriebene potentielle 3' Ende durch experimentelle. Ansätze verifiziert. RNA von der Lungen-Karzinom Zelllinie Calu 6 (AACC No. HTB56) wurde mit Hilfe des Primers (SEQ ID NO: 9) revers transkribiert und die resultierende einzelsträngige cDNA wurde mittels PCR mit den Gen spezifischen Primer SEQ ID NO: 5 und den Adapterprimer SEQ ID NO: 10 amplifiziert.

Für einen 25 µl PCR Ansatz wurden 1 µl des cDNA-pools mit 2,5 µl 10 × Taq Puffer (Promega), 1,5 µl MgCl₂ (25 mM, Promega), 0,5 µl dNTPs (je 10 mM, Boehringer Mannheim), 1 µl Primermischung (je 20 µM), 0,15 µl Taq Polymerase (Promega) in Wasser gemischt. Die PCR wurde wie folgt durchgeführt: 1 × 94°C 3 Minuten; 30 × 94°C 30 Sekunden, 55°C 30 Sekunden, 72°C 1 Minute; auf 4°C halten. Die PCR wurde auf einem 1,2% Agarosegel analysiert.

Die beiden Primer wurden anschließend zum Sequenzieren des gereinigten PCR Produktes verwendet. Die ermittelten Sequenzen zeigten eine hohe Homologie mit dem "in silico" klonierten DNA Abschnitt (inklusive des PolyA- Trakts).

Da das Klonieren von 5'-Endsequenzen einen meist sehr aufwendigen Prozess darstellt, wurden im Folgenden zur Lösung des Problems verschiedene Methoden angewandt.

Als Ausgangszelllinie wurde auch hier Calu 6 verwendet. Nach der reversen Transkription der RNA mit dem Primer SEQ ID NO: 9 und der Zweitstrangsynthese wurde an die Doppelstrang-cDNA ein Linker bestehend aus den beiden Oligos SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12 ligiert (Abe et al., 1992). Die daraus resultierende LoneLinker cDNA Bibliothek wurde dann mit dem Gen spezifischen Primer SEQ ID NO: 6 linear über 35 Zyklen amplifiziert. Ein Aliquot der B345 angereicherten cDNA konnte anschließend mit den Primern SEQ ID NO: 13 und LLEcoRIA SEQ ID NO: 11 weiter amplifiziert werden. Nach der Gelelektrophorese eines Aliquots und Southernanalyse mit dem genspezifischen Oligo SEQ ID NO: 14 konnte eine 5 kb Bande lokalisiert werden. In weiterer Folge wurde dieses Fragment schrittweise sequenziert und auf die Sequenz des EST-Kontigs ausgerichtet ("aligned").

Um die resultierende Sequenz aus der LLcDNA Klonierung zu überprüfen, wurden zwei Fragmente mittels PCR (SEQ ID NO: 15 und SEQ ID NO: 16 bzw. SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 17) amplifiziert und für das Screenen von Lambda gt10 cDNA Phagen Bibliotheken eingesetzt. Positive Plaques wurden isoliert und mittels den gt10 spezifischen Primern (SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19) PCR amplifiziert. Anschließende Sequenzierung und das Alignment mit den Sequenzen führte zu der Annahme, das es sich hierbei um ein differenzielles Spleißprodukt handelt. Die Spleißdonor, Akzeptor und Lariatsequenz konnten in weiterer Folge gefunden werden. Mittels PCR durch geeigneter Primerkombination wurde in verschiedenen Zelllinien nach differenziellen Spleißprodukten gesucht, wobei in allen gescreenten Zelllinien nur ein Produkt gefunden wurde und zu der in Fig. 5 dargestellten Genstruktur führte. Die angeführte cDNA besitzt einen offenen Leserahmen (ORF) der für ein potentielles Protein mit einer Länge von 749 Aminosäuren kodiert. Die Translationsinitiationsstelle an Position 215 entspricht zu etwa 75% einer Kozak- Konsensussequenz. Die in diesem Experiment erhaltenen Ergebnisse veranlassten dazu, in einem weiteren Experiment (Beispiel 6b) die Transkriptionsinitiationsstelle noch exakt durch Primer- Extension zu bestimmen, um sicher zu gehen, dass das hier ermittelte 5' Ende das tatsächliche 5'-Ende von B345 ist. Die von der in diesem Klonierungsversuch erhaltenen cDNA (SEQ ID NO: 1) abgeleitete Aminosäuresequenz von B345 ist in SEQ ID NO: 2 gezeigt.

b) Zweiter Klonierungsversuch; Bestimmung der 5'- und der Promotorregion von B345

Mit Hilfe des Promotor Finder DNA Walking Kit (Clontech) und anschließender Primerextension Reaktion wurden die 5'-Region und die Promotorregion sowie die exakte Transkriptionsinitiationsstelle bestimmt. Die 5'-Region wurde mit Hilfe einer genomischen DNA Library von Clontech mit B345 spezifischen Primern (SEQ ID NO: 38 bzw. nested SEQ ID NO: 39) und Adaptor Primer im Kit amplifiziert. Um den exakten Transkriptionsstart zu bestimmen, wurde die Primer Extension Reaktion durchgeführt. Dafür wurde der Primer SEQ ID NO: 40 am 5'-Ende mit Hilfe 10 U der T4 Polynukleotid Kinase (Promega) und 3 µl [γ-³²P]ATP (3000 Ci/mmol) nach Standard- Protokollen markiert (Sambrook et al., 1989). Das markierte Oligonukleotid wurde durch Präzipitation gereinigt. Für die Primerextension Reaktion wurden 10.000 cpm Oligonukleotid in einem Gesamtvolumen von 20 µl zu 25 µg Total RNA der Colo 205 Zelllinie (ATCC:CCL-222) eingesetzt.

Die RNA der Zelllinie wurde mit dem radioaktiv markierten Primer revers transkribiert und auf ein 10%-Polyacryamidgel aufgetragen. Zur Bestimmung der genauen Bandenlänge wurde ein PCR Fragment von nt 1000-nt 1362 mit ³⁵S markierten Nukleotiden sequenziert und ebenfalls aufgetragen. Das aus der Elongation des reversen Primers resultierende Fragment von 209 Nukleotiden legt den Transkriptionsstart genau an Position 201 fest. Somit wurde die in Beispiel 6a erhaltene B345-Sequenz in der 5'Region erweitert und ein neues Startkodon auf Position 283 bestimmt. Durch wiederholte Sequenzierungen auch in der 3'Region wurde, im Vergleich zur in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz, eine zusätzliche Base an Position 2430 gefunden, die zu einer Leserasterverschiebung führt und somit das Stoppcodon von Position 2729 auf 2791 verschiebt. Die in diesem Versuch erhaltene cDNA (SEQ ID NO: 3) besitzt einen offenen Leserahmen, der für ein potentielles Protein mit einer Länge von 836 Aminosäuren (SEQ ID NO: 4) kodiert.

Beispiel 7 Bioinformatik-Analyse zur Funktion von B345

Die resultierende primäre Aminosäuresequenz von B345 ist in SEQ ID NO: 4 gezeigt. Die Analyse des Hydrophilizitäts Plots der Aminosäuresequenz mit der Methode von Kyte und Doolittle (1982) zeigt, dass das B345 Protein zwei charakteristische hydrophobe Domänen aufweist (Aminosäuren Pos. 1-29 und 666-691), die ein Signalpeptid und eine helikale Transmembrandomäne darstellen (Fig. 6). Diese polarisierte Struktur deutet darauf hin, dass es sich bei B345 um ein integrales Membraneprotein handelt. Die Transmembranhelix verbindet einen etwa 666 Aminosäuren langen extrazellulären und einen kurzen (145 Aminosäuren) intrazellulären Teil (siehe Fig. 7).

Die extrazelluläre Domäne weist außerdem klare Indizien für die Existenz einer CUB Domäne bei Position 220-350 sowie Indizien für 2 mögliche weitere CUB Domänen im Bereich der Aminosäuren 425-660 auf. CUB Domänen kommen bei verschiedenen, meist während der Embryonalentwicklung regulierten Proteinen vor. Außerdem sind manchmal bei EGF(Epidermal Growth Factor)-ähnlichen Domänen auch CUB Domänen anzutreffen. Eine kürzlich erschienene Publikation (Gerstein et al., 2000) demonstriert, dass CUB Domänen enthaltende Proteine die am ausgeprägtesten differenziell regulierten Proteine in C. elegans sind. Da Gene, die eine Schlüsselrolle in der Embryonalentwicklung haben, auch analoge Funktionen in Krebs ausführen, kann angenommen werden, dass eine Überexpression von B345 in Zellen eine Veränderung in den Eigenschaften der Substratadhäsion oder der extrazellulären Matrix bewirkt. Das Protein weist außerdem 12 potentielle N-Glycosylierungsstellen auf, die in der vorhergesagten extrazellulären Domäne zu finden sind, was mit der vorhergesagten Orientierung des Proteins übereinstimmt.

Mit einem BLAST hit (E-value: 5.8 × 10^-2) für den Bereich der Aminosäuren von 235 bis 282 von B345 konnte eine Komplement aktivierende Komponente des RA-reactive factor (RARF) aus mus musculus identifiziert werden. Das Alignment befindet sich innerhalb der CUB Domäne 1 von B345.

Die CUB-Domänen 2 und 3 (Bereich 425-535 und 545-660) weisen marginale Homologien zu dem humanen und Fugu Prokollagen C-Proteinase Enhancer Protein (PCOLCE) auf. Diese Regionen kommen in dem Bereich von PCOLCE vor, welcher ein CUB Domänen Tandem Repeat enthält (E-values: 0.5 (human) und 2.7 (Fugu)). CUB Domänen kommen manchmal in Repeats vor.

Vermutlich bildet das B345-Protein eine β-Sheet Sekundärstruktur, da sich CUB Domänen bekanntlich als β-Sandwich falten.

Die intrazelluläre Domäne (Bereich 691-836) weist keine signifikanten Homologien auf. Der gesamte C-Terminus aligned jedoch mit einem EST (AW063026) von humanen Eierstockkrebs-Zellen (82% Identität über 124 Aminosäuren).

Beispiel 8 Bestimmung der genauen Genstruktur von B345

Zunächst wurden Bac Klone in öffentlichen Datenbanken (BLAST search) gesucht, die das B345-Gen enthalten. Die Bac Klone Ac068625 und Ac010170 enthielten einen Großteil des Gens. Mit intronspannenden Primern wurden Spliceakzeptor und Donorsequenzen in Colo 205 cDNA und genomischer DNA als Template gesucht. Das PCR Protokoll wurde wie folgt durchgeführt: 1 × 95°C 2 Minuten, 35 × 95°C 15 Sekunden, 68°C 3 Minuten und dann auf 4°C gehalten. Die PCR wurde auf einem 1,2% Agarosegel analysiert und dabei die Längen der PCR Produkte der 2 Templates mit gleichen Primerkombinationen verglichen. Es stellte sich heraus, dass B345 aus 8 Exons, getrennt von 7 Introns besteht (Fig. 5).

Die chromosomale Lokalisation des Gens wurde mittels Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) bestimmt. Dabei wurde die humane, Digoxigenin-markierte B345 Sonde zusammen mit der Biotin-markierten Sonde von B47a2 (Knight et al., 1997), welche sich auf der sub­ telomerischen Region des Chromosomenarms 3p befindet, mit Metaphase-Chromosomen zweier "normaler" Individuen hybridisiert (Lichter et al., 1988). Die hybridisierte Digoxygenin-Sonde wurde mittels Anti-Schaf-Dig (Boehringer Mannheim FRG) und Kaninchen Anti-Schaf FITC- markierten Antikörpern detektiert. Die Biotin markierte Probe dagegen wurde mit Maus Anti-Biotin und Kaninchen- Anti-Maus (TRITC) und anschließende Färbung mit DAPI sichtbar gemacht. Die FISH Resultate zeigen, dass eine Mehrheit der Metaphasen eindeutige Signale an einem oder beiden Chromatiden des Chromosoms 3 in der Region p21-p23 haben. Als Bestätigung der Position diente die Co-Lokalisation der B47a2 (TRITC)-Sonde auf dem selben chromosomalen Arm.

Tab. 1A

Tab. 1B

Tab. 1C

Tab. 2A

Tab. 2B

Literatur

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims (7)

1. Tumorassoziiertes Antigen der Bezeichnung B345, dadurch gekennzeichnet, dass es die in SEQ ID NO: 4 definierte Aminosäuresequenz aufweist oder diese als Teilsequenz enthält, oder ein Fragment davon.

2. Isoliertes DNA-Molekül, kodierend für das in Anspruch 1 definierte tumorassoziierte Antigen oder für Fragmente davon.

3. DNA-Molekül nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Polynukleotid mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz ist oder diese Sequenz enthält oder dass es ein Polynukleotid ist oder dieses enthält, das mit einem Polynukleotid der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert, oder ein Fragment davon.

4. Rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend ein DNA- Molekül gemäß Anspruch 2 oder 3.

5. Antikörper gegen das in in Anspruch 1 definierte Polypeptid.

6. Antikörper nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass er monoklonal ist.

7. Antikörper nach Anspruch 5 oder 6 für die Therapie und Diagnose von Krebserkrankungen, die mit der Expression von B345 assoziiert sind.