DE60217300T2

DE60217300T2 - Verfahren zur untersuchung der wirkung eines angionegesis-hemmers unter vermittlung durch hemmung der integrin-expression

Info

Publication number: DE60217300T2
Application number: DE60217300T
Authority: DE
Inventors: c/o Eisa Co. Ltd Naoto Tsukuba-shi ONO; c/o Eisai Co. Ltd Taro Tsukuba-shi SENBA; c/o Eisai Co. Ltd. Naoko Tsukuba-shi HATA; c/o Eisai Co. Ltd Yasuhiro Tsukuba-shi FUNAHASHI; c/o Eisai Co. Ltd. Toshiaki Tsukuba-shi WAKABAYASHI
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 2001-02-21
Filing date: 2002-02-21
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2022-02-22
Also published as: CN1620313A; ATE350660T1; DE60229676D1; ES2317368T3; AU2002233677B2; CA2438427A1; HK1059038A1; EP1362601B1; EP1362601A4; EP1742052B1; ATE412895T1; CN101025419A; EP1742052A1; US20040132783A1; HK1099363A1; JPWO2002066073A1; KR20030080013A; WO2002066073A1; EP1362601A1; CA2438427C

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Überprüfen des Einflusses einer Droge, welche Integrin-Expression beeinflusst, bevorzugter Weise ein Angiogenese-Hemmer.
Hintergrund-Technologie
Krebs ist eine Krankheit, welche eine hohe Mortalität zeigt, und das Ziel von Behandlungen mit Anti-Krebs-Agentien liegt im Allgemeinen darin, des Patienten QOL zu verbessern, und die Überlebens-Dauer auszudehnen. Allerdings ist es schwierig, den lebensverlängernden Einfluss einer Droge in einem kurzen Zeitraum zu ermitteln, und daher werden eine Tumor-Reduktions-Rate und ein Tumor-Antigen-Niveau im Blut als Ersatz-Marker verwendet, welche als Anzeichen (einer) therapeutischen Wirkung dienen.
Da ferner die Verwendung des Lebensverlängerungs-Zeitraums zum Bestimmen (einer) Drogen-Wirkung in klinischen Studien von Anti-Krebs Agentien ebenfalls eine Langzeit-Studie benötigt, wurde die Tumorreduktionsrate, welche in einem verhältnismäßig kurzen Zeitraum ermittelt werden kann, als eine Ersatz-Marker verwendet. Allerdings wurde festgestellt, dass die Tumorreduktionsrate nicht notwendigerweise als ein Anzeichen für Lebensverlängerung dienen kann. Dementsprechend wurde versucht, zusätzlich zur Tumorreduktionsrate Progressionszeit, krankheitsfreie Überlebensdauer, biologische Marker und so weiter als Ersatz-Marker zu verwenden. Allerdings sind diese Verfahren noch nicht etabliert worden.
Es wird in Betracht gezogen, dass ein geeignetes Behandlungs-Verfahren direkt in einer klinischen Studie ermittelt werden kann, wenn ein biologischer Marker, welcher eine durch Verabreichung einer Droge induzierte Veränderung anzeigt, und eng mit Verlängern der Überlebenszeit verbunden ist, als ein Ersatz-Marker verwendet werden kann, und der Marker als ein Anzeichen therapeutischer Wirkung der Droge bei der Behandlung verwendet werden kann.
Die folgenden sind als Ersatz-Marker berichtet worden.
Panorex, welches ein auf Glycoprotein-EpCAM gerichteter Antikörper ist, wurde zuerst als ein Tumor-Marker von Colon-Krebs-Zellen gefunden, und später als ein Adhäsions-Molekül identifiziert. Seine Korrelation mit der Überlebensrate wird derzeit als ein Ersatz-Marker für Elimination von in Knochenmark verbleibenden Mikrokarzinom-Zellen (Stephan B. et al., Clinical Cancer Research ("Klinische Krebsforschung"), 1999, 5, 3999–4004) untersucht, und groß angelegte klinische Phase-III-Studien werden parallel ausgeführt.
Die Prostata("prostatic")-spezifischen Antigene sind als ein Ersatz-Marker in (der) Hormon-Therapie von Prostata-Krebs verwendet worden, um optimale Dosen zu bestimmen (Denis L. & Mahler C. Urology, 1996, 47 (1ASuppl.), 26–32).
Was die Verwendung eines Ersatz-Markers für einen Angiogenese-Hemmer betrifft, wurde ein Verfahren zur Verwendung von Angiogenese bei Wundheilung nach Einbringen eines Loches in die Haut in einer klinischen Phase-I-Studie von BMS275291, welches ein Matrix-Metallproteinase-Inhibitor ist, als ein Indikator untersucht. Ferner wurde bezüglich eines anderen Matrix-Metallproteinase – Inhibitors ein Verfahren berichtet, welches die Enzym-Aktivität an einer Tumorstelle als ein Marker verwendet (Clin. Cancer Res., 2000, 6 (8), 3290–6).
Ferner wird von Angiogenese-Hemmern erwartet, dass sie als therapeutische Agentien dienen, welche für andere Krankheiten als Krebs wirksam sind, beispielsweise Arteriosclerose, diabetische Retinopathie, Okklusion von Retina-Adern ("veins"), Retinopathie im Vor-Erwachsenen-Alter ("prematurity"), altersbezogene/bedingte Macula-Degeneration, neovaskuläres Glaukom, Rheumatische Arthritis, juvenile rheumatische Arthritis, Psoriasis, Angiom, Angiofibrom ("angiofibroma") und so weiter. Wenn ein Ersatz-Marker für Angiogenese gefunden ist, wird es möglich, eine geeignete Dosis einer Droge, Drogen-Einfluss und Verabreichungs-Zeitraum zu bestimmen, indem er als ein Index auch bei diesen Krankheiten verwendet wird.
Integrine sind auf einer Zelloberfläche exprimierte, und aus einer α-Kette und einer β-Kette zusammengesetzte Zell-Adhäsions-Moleküle. Integrine sind an Adhäsion zwischen extrazellulären Matrix-Membran-Proteinen und -Zellen, sowie Adhäsion zwischen Zellen beteiligt. Wenn ein Zell-Adhäsions-Molekül sich an Integrin bindet, beginnen Signalsysteme in der Zelle zu arbeiten. Als ein Ergebnis treten nicht nur Zell-Adhäsion, sondern auch Zell-Extension, Zellwachstum, Apoptose, Differentiation, Cytosklet-Orientatierung, Zellmigration, Gewebebildung, Krebs-Invasion und -Metastasierung, Wundheilung, Blutkoagulation und so weiter auf.
Unter diesen Integrinen ist Integrin-α2β1 dafür bekannt, auf Collagen, Laminin und so weiter als Adhäsions-Moleküle einzuwirken, und an der Rohr-Bildung vaskulärer Endothel-Zellen während der Angiogenese (George E. und Mitautoren, Exp. Cell. Res., 1996, 224, 39–51) beteiligt zu sein. Ferner wurde auch berichtet, dass auf Integrin-α1 und Integrin-α2 gerichtete Antikörper die durch VEGF in vivo induzierte Angiogenese hemmten (Donald R.S. und Mitautoren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1997, 94, 13612–13617).
Integrin αvβ3 existiert spezifisch in Endothel-Zellen unter Angiogenese, und es wurde berichtet, dass der Integrin-αvβ3-neutralisierende Antikörper (LM609) in einem Angiogenese-Modell, welches Hühner-Embryo-Chorioallantois verwendet, die durch Fibroblasten-Wuchsfaktor-2 (FGF-2) induzierte Angiogenese (Brook, P.C. und Mitautoren, Science, 1994, 264, 569–571) hemmte. Ferner wurde berichtet, dass Integrin αvβ3 an durch FGF-2 und Tumornekrosefaktor-α-induzierter Angiogenese beteiligt ist, und das Integrin αvβ5 an durch Vaskulärer-Endothel-Wuchsfaktor ("vascular endothelial growth factor", VEGF) und durch Transformierender-Wuchsfaktor-α("transforming growth factor-α") induzierter Angiogenese beteiligt ist (Friedlander, M. und Mitautoren, Science, 1995, 270, 1500–1502). Der Anti-Integrin αvβ3-Antikörper und der Integrin αvβ3-Inhibitor sind derzeit Gegenstand klinischer Studien.
Trikha und Mitautoren (Cancer Res. 56 (21): 5071–5078, 1996) offenbart, dass Integrin-α2 erhöhte Expressions-Niveaus in Prostata-Tumorgewebe aufweist. WO98/44797 offenbart Verfahren zum Behandeln von Krebs unter Verwendung einer Kombination einer Zusammensetzung, welche ein IntegrinAntagonist ist, und einer Zusammensetzung, welche ein Inhibitor von Farnesylproteintransferase ist. Henk und Mitautoren (Blut 96 (13): 4216–4221, 2000 und Clin. Cancer Res. 6 (1): 166–171, 2000) offenbart, dass Blutplättchen in tumorinduzierter Bildung neuer Gefäße eine wichtige Rolle spielen.
Offenbarung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist, einen Ersatz-Marker für eine Droge bereitzustellen, welche (die) Expression eines Integrins, bevorzugter Weise Integrin-α2 beeinflusst, und Angiogenese inhibiert.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass unter einer (solchen) Bedingung, dass durch eine Droge, welche durch eine Zusammensetzung der Allgemeine Formel (II) (im Folgenden als "Zusammensetzung A" bezeichnet) repräsentiert wird, welche Angiogenese mittels Inhibierung von Integrin-α2-Expression inhibiert, Integrin-α2-Expression erniedrigt wird, Angiogenese zurückgebildet wird, und daher Krebszellen-Wachstum inhibiert wird, (die) Integrin-α2-Expression an den Oberflächen von Blutplättchen in periphärem Blut ebenfalls erniedrigt wurde.
Sie haben ferner herausgefunden, dass die Menge von Integrin-α2 an den Oberflächen von Blutplättchen in periphärem Blut als ein Ersatz-Marker für Angiogenese-Hemmung verwendbar war, und haben damit die vorliegende Erfindung durchgeführt.
Dies bedeutet, dass die vorliegende Erfindung folgendes bereitstellt:

1. Ein Verfahren zum Überprüfen des Einflusses einer Droge auf die Integrin-Expression, welches umfasst: den Schritt, eine Integrin-Expressions-Menge in von einem Patienten gewonnenen Blutplättchen zu messen, welchem die Droge verabreicht wurde, und den Schritt, bei dem der Einfluss der Droge auf die Integrin-Expression von von Blutplättchen verschiedenen Zellen basierend auf dem Rückgang der gemessenen Expressions-Menge gemessen wird, wobei das Integrin Integrin-α2 ist, und die Zellen Zellen eines Gewebes, in dem Angiogenese auftreten kann, oder Tumorzellen sind.
2. Das Verfahren gemäß 1, bei dem die Integrin-Expressions-Menge mittels eines immunochemischen Verfahrens gemessen wird.
3. Das Verfahren gemäß 2, bei dem das immunochemische Verfahren ein Flusscytometrieverfahren ist.
4. Das Verfahren gemäß 1, bei dem die Integrin-Expressions-Menge gemessen wird, indem eine Menge der das Integrin kodierenden mRNS gemessen wird.
5. Das Verfahren gemäß 4, bei dem die mRNS-Menge mittels quantitativer PCR gemessen wird.
6. Das Verfahren gemäß 1, wobei die Droge eine Sulfonamidverbindung ist, die durch die allgemeine Formel (I) repräsentiert wird:
in der B einen C6-C10-Arylring oder einen 6-10-gliedrigen Heteroarylring darstellt, die jeweils substituiert und teilweise gesättigt sein können; K eine Einfachbindung darstellt, -CH=CH- oder -(CR^4bR^5b)_m ^b- wobei R^4b und R^5b gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder C1-C4-Alkyl darstellen und m^b eine ganze Zahl 1 oder 2 ist; R¹ ein Wasserstoffatom oder C1-C6-Alkyl darstellt; Z eine Einfachbindung oder -CO-NH- darstellt; und R einen C6-C10-Arylring oder einen 6-10-gliedrigen Heteroarylring darstellt, die jeweils substituiert und teilweise gesättigt sein können, oder ein pharmazeutisch verwendbares Salz davon oder ein Hydrat davon ist.
7. Das Verfahren gemäß 6, wobei R Indol, Chinolin oder Isochinolin darstellt.
8. Das Verfahren gemäß 1, wobei die Droge eine durch die allgemeine Formel (I^a) repräsentierte Sulfonamidverbindung ist:
in der A^a einen monozyklischen oder bizyklischen aromatischen Ring darstellt, der substituiert sein kann; B^a einen 6-gliedrigen ungesättigten Kohlenwasserstoffring oder einen ungesättigten 6-gliedrigen Heterozyklus darstellt, der als ein Heteroatom ein Stickstoffatom enthält, wobei jeder substituiert sein kann; C^a einen 5-gliedrigen Heterozyklus darstellt, der ein oder zwei Stickstoffatome enthält, welche(s) substituiert sein kann/können; R^1a ein Wasserstoffatom oder C1-C6-Alkyl darstellt; W^a eine Einfachbindung oder -CH=CH- darstellt; Y^a ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom darstellt; Z^a -N(R^2a)- darstellt, wobei R^2a ein Wasserstoffatom oder C1-C6-Alkyl, oder ein Stickstoffatom darstellt; oder ein pharmakologisch verwendbares Salz davon oder ein Hydrat davon ist.
9. Verfahren gemäß 8, wobei W^a eine Einfachbindung darstellt.
10. Verfahren gemäß 8, wobei W^a eine Einfachbindung darstellt, Z^a -NH- darstellt, und Y^a ein Kohlenstoffatomatom darstellt.
11. Verfahren gemäß einem von 8 bis 10, wobei B^a Benzol oder Pyridin darstellt, die substituiert sein können.
12. Verfahren gemäß einem von 8 bis 11, wobei C^a Pyrrol darstellt, das substituiert sein kann.
13. Verfahren gemäß 8, wobei A^a Benzol oder Pyridin darstellt, die substituiert sein können, B^a Benzol darstellt, das substituiert sein kann, C^a Pyrrol darstellt, das substituiert sein kann, W^a eine Einfachbindung darstellt, und Z^a -NH- darstellt.
14. Verfahren gemäß 1, wobei die Droge eine durch die allgemeine Formel (I^b) repräsentierte, Sulfonamid enthaltende, heterozyklische Zusammensetzung ist:
wobei A^b ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, Hydroxyl, C1-C4-Alkyl oder -Alkoxi, die mit einem Halogenatom substituiert sein können, Cyano, -(CO)_k ^bNR^2bR^3b wobei R^2b und R^3b gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder C1-C4-Alkyl, das mit einem Halogenatom substituiert sein kann, und k^b 0 oder 1 ist, C2-C4-Alkenyl oder -Alkinyl, die substituiert sein können, oder Phenyl oder Phenoxi, die einen aus der unten angegebenen Gruppe A ausgewählten Substituenten haben können, darstellt; B^b Aryl oder monozyklisches Heteroaryl darstellt, die einen aus der unten angegebenen Gruppe A ausgewählten Substituenten aufweisen können, oder
wobei Q^b einen aromatischen Ring darstellt, der ein oder zwei Stickstoffatome haben kann, M^b einen C5-C12 ungesättigten monozyklischen oder polyzyklischen Ring darstellt, der eine Doppelbindung mit Q^b teilt (und) der ein bis vier Heteroatome haben kann, die aus einem Stickstoffatom, einem Sauerstoffatom und einem Schwefelatom ausgewählt sind, wobei Q^b und M^b sich ein Stickstoffatom teilen können, und Q^b und M^b einen aus der unten angegebenen Gruppe A ausgewählten Substituenten haben können; K^b eine Einfachbindung oder -(CR^4bR^5b)m^b- darstellt, wobei R^4b und R^5b gleich oder unterschiedlich sein können, und jeweils ein Wasserstoffatom oder C1-C4-Alkyl darstellen, und m^b eine ganze Zahl 1 oder 2 ist; T^b, W^b, X^b und Y^b gleich oder unterschiedlich sein können, und jeweils =C(D^b)- darstellen, wobei D^b ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, Hydroxyl, C1-C4-Alkyl oder -Alkoxi, die mit einem Halogenatom substituiert sein können, Cyano, -(CO)_n ^bNR^6bR^7b, wobei R^6b und R^7b gleich oder unterschiedlich sein können, und jeweils ein Wasserstoffatom oder C1-C4-Alkyl, das mit einem Halogenatom substituiert sein kann, und n^b 0 oder 1 ist, oder C2-C4-Alkenyl oder -Alkinyl, welche(s) substituiert sein kann/können, oder ein Stickstoffatom darstellt; U^b und V^b gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils =C(D^b)- darstellen, wobei D^b dieselbe Bedeutung hat, wie oben definiert ist, ein Stickstoffatom, -CH₂-, ein Sauerstoffatom oder -CO-; Z^b eine Einfachbindung oder -CO-NH- darstellt; R^1b eine Wasserstoffatom oder C1-C4-Alkyl darstellt; ---- eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung darstellt: Gruppe A: ein Halogenatom, Hydroxyl, C1-C4-Alkyl oder -Alkoxi, die mit einem Halogenatom substituiert sein können; Cyano; -R^8bR^9bN(NH)_p ^b-, wobei R^8b und R^9b gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder C1-C4-Alkyl, das mit einem Halogenatom substituiert sein kann, darstellen, und p^b 0 oder 1 ist, und R^8b und R^9b zusammen mit einem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden können, und dieser Ring zusätzlich ein Stickstoffatom, ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom enthalten und substituiert sein kann, Aminosulfonyl, das mit Mono- oder Di-(C1-C4-Alkyl) substituiert sein kann; C1-C8-Acyl, das substituiert sein kann; (C1-C4-Alkyl)-S(O)_s ^b-(C1-C4-Alkylen), wobei s^b eine ganze Zahl 0, 1 oder 2 ist; C1-C4-Alkyl oder Phenylsulfonylamino, die substituiert sein können, -(CO)_q ^bNR^10bR^11b wobei R^10b und R^11b gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder C1-C4-Alkyl darstellen, das mit einem Halogenatom substituiert sein kann, oder Amino, das mit C1-C4-Alkyl substituiert sein kann, und q^b 0 oder 1 ist, oder Aryl oder Heteroaryl, die substituiert sein können, oder ein pharmazeutisch verwendbares Salz davon oder ein Hydrat davon ist.
15. Verfahren gemäß 14, wobei U^b und V^b jeweils =C(D^b)-, wobei D^b dieselbe Bedeutung hat, wie oben definiert ist, oder ein Stickstoffatom, darstellen.
16. Verfahren gemäß 14 oder 15, wobei Z^b eine Einfachbindung darstellt.
17. Verfahren gemäß einem von 14 bis 16, wobei mindestens einer unter T^b, U^b, V^b, W^b, X^b und Y^b ein Stickstoffatom darstellt.
18. Verfahren gemäß einem von 14 bis 17, bei dem A^b ein Halogenatom, C1-C4-Alkyl oder -Alkoxi, die mit einem Halogenatom substituiert sein können, Cyano, -(CO)_r ^bNR^12bR^13b wobei R^12b und R^13b gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder C1-C4-Alkyl, die mit einem Halogenatom substituiert sein können, darstellen, und r^b 0 oder 1 ist, oder C2-C4-Alkenyl oder -Alkinyl, die substituiert sein können, darstellt.
19. Verfahren gemäß einem von 14 bis 18, wobei lediglich einer unter T^b, U^b, V^b, W^b, X^b und Y^b ein Stickstoffatom darstellt.
20. Verfahren gemäß einem von 14 bis 19, wobei lediglich einer unter T^b, W^b, und Y^b ein Stickstoffatom darstellt.
21. Verfahren gemäß 1, wobei die von Blutplättchen verschiedenen Zellen Zellen eines Gewebes sind, in dem Angiogenese auftreten kann, und die Inhibierung der Integrin-Expression als Angiogenese-Inhibierungswirkung bestimmt wird.
22. Verfahren gemäß 1, wobei die von Blutplättchen verschiedenen Zellen Tumorzellen sind, und die Inhibierung der Integrin-Expression als Inhibierungswirkung des Tumorwachstums bestimmt wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Wirkung von Zusammensetzung A auf (die) Integrin-α2-Expression.
2 zeigt die Wirkung des Anti-Integrin-α2 Antikörpers auf (die) Rohr-Bildung.
3 zeigt den Einfluss von Zusammensetzung A auf (die) Rohr-Bildung.
4 zeigt einen inhibierenden Einfluss von Zusammensetzung A auf (den) Tumor-Volumen-Zuwachs.
5 zeigt den Einfluss von Zusammensetzung A auf (die) Integrin-α2-Expression in Blutplättchen.
Bester Modus zum Ausführen der Erfindung
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Überprüfen des Einflusses einer Droge auf (die) Integrin-Expression, welches den Schritt umfasst, bei welchem eine Integrin-Expressions-Menge in von einem Patienten gewonnenen Blutplättchen gemessen wird, dem die Droge verabreicht wurde, und den Schritt, bei dem der Einfluss der Droge auf die Integrin-Expression von von Blutplättchen verschiedenen Zellen basierend auf der gemessenen Expressions-Menge bestimmt wird.
Das Integrin ist Integrin-α2. Integrin-α2 ist eines der Mitglieder der Integrin-Familie von auf Zell-Oberflächen exprimierten Adhäsions-Molekülen. Die Sequenz von Menschen-Integrin-α2 ist bei der GenBank mit der Zugangs-Nummer NM_002203 registriert.
Die oben genannte Zusammensetzung A vermindert insbesondere Integrin-α2-Expression, und weist eine Angiogenese-Hemmwirkung und eine Anti-Tumorwachstum-Wirkung auf. Daher kann der Einfluss einer durch Zusammensetzung A repräsentierten Droge mit höherer Sensitivität durch Messen der Integrin-α2-Expressions-Menge auf/von Blutplättchen bestimmt werden.
Dosierungen und Verfahren zum Verabreichen einer Droge an einen Patient sind nicht besonders begrenzt, und es können diejenigen verwendet werden, welche für den Zweck der Droge geeignet sind. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird bevorzugter Weise verwendet, um den Einfluss einer Droge zu testen, welche mittels systemischer Verabreichung, wie oraler Verabreichung, verabreicht wird.
Die von Blutplättchen verschiedenen Zellen sind Zellen eines Gewebes, in welchem Angiogenese auftreten kann. Beispielsweise können vaskuläre Endothel-Zellen von Tumorgewebe erwähnt werden. Ferner sind sie bevorzugter Weise Fibroblasten oder Tumorzellen, beispielsweise Melanom-Zellen, in welchen Signale, wie diejenigen für Zellwachstum, Apoptose und Differentiation, mittels Integrin-α2 übertragen werden. Da ferner Integrin-α2-Expression in Monocyten, B-Zellen und T-Zellen bestätigt worden ist, können diese Zellen ebenfalls erwähnt werden. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch dazu verwendbar, Funktionen dieser Zellen abzuschätzen.
Das zum Messen einer Integrin-Expressions-Menge in Blutplättchen verwendete Verfahren ist nicht speziell begrenzt. Die Integrin-Expressions-Menge kann mittels eines immunochemischen Verfahrens oder dergleichen gemessen werden, oder es kann eine Menge von Integrin-kodierender mRNS gemessen werden.
Beispiele des Verfahrens zum Messen der Integrin-Expressions-Menge auf der Basis eines immunochemischem Verfahrens beinhalten ein FACS-Verfahren. Das FACS-Verfahren ist ein Verfahren zum Messen von Fluoreszenz-Intensität oder dergleichen von mit Fuoreszenz-markierten Antikörpern immunochemisch gefärbten Zellen unter Verwendung einer Fuoreszenz-aktivierten Zellen-Sortiervorrichtung ("fuorescence activated cell sorter").
Beispiele des Verfahrens zum Messen einer Integrin-kodierenden mRNS-Menge beinhalten quantitative PCR.
Im Folgenden wird eine Ausführungsform des Schritts zum Messen der Expressions-Menge in der Reihenfolge 1. Isolieren von Blutplättchen, 2. Quantifizieren der Integrin-Menge an Blutplättchen-Oberflächen und 3. Quantifizieren der Integrin-mRNS-Menge in Blutplättchen im Detail erklärt werden.
1. Isolieren von Blutplättchen
Blutplättchen können mittels (der) Techniken Zentrifugieren, Gelfiltrieren, Flusscytometrie und so weiter isoliert werden.

1) Zentrifugieren: Zu Blut werden 10 Volumen-% 3,8%-iger wässriger Natriumcitrat-Lösung zugefügt, und die Mischung wird bei 100 × g bei Raumtemperatur für 10 Minuten zentrifugiert. Die obere Lage wird als Blutplättchenreiches Plasma verwendet, und bei 1500 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Blutplättchen werden aus den Präzipitaten gewonnen.
2) Flusscytometrie: mit PBS oder dergleichen verdünntes Blut wird in einem Flusszytometer fließen gelassen und einem Laserstrahl oder einem ähnlichen Strahl ausgesetzt. Blutplättchen können von anderen Blutzellen basierend auf Intensitäten vorwärts gestreuten Lichts und seitwärts gestreuten Lichts, welches zu dieser Zeit erzeugt wird, isoliert werden.

2. Quantifizieren der Integrin-Menge an Blutplättchen-Oberflächen
Die Integrin-Menge an Blutplättchen-Oberflächen kann mittels eines immunochemischen Verfahrens, beispielsweise immuno-histologischem Färben, ELISA, Western-Blotting, Flusscytometrie und so weiter quantifiziert werden. Beispielsweise werden in ELISA Blutplättchen an eine feste Phase mittels Antikörpern gebunden, welche auf ein Blutplättchen-Oberflächen-Antigen ausgerichtet sind, und werden dadurch an der feste Phase immobilisiert, und gewaschen. Dann läßt man Anti-Integrin-markierte Antikörper damit reagieren, und Integrin auf den Blutplättchen-Oberflächen kann aus der Menge bindender Markierungen ("labels") quantifiziert werden. Bei Western-blotting werden beispielsweise isolierte Blutplättchen in einem SDS enthaltenden Puffer aufgelöst, und dann SDS-PAGE und Western-Blotting unterworfen. Das an einer Membran anhaftende ("blotted") Integrin kann quantifiziert werden, indem markierte Anti-Integrin-Antikörper verwendet werden. In diesem Fall kann, wenn durch Verwenden von Antikörpern, welche auf ein Butplättchen-Oberflächen-Antigen gerichtet sind, die Blutplättchen-Menge quantifiziert wird, gleichzeitig die Menge an Integrin pro Blutplättchen ebenfalls quantifiziert werden.
In der Flusscytometrie wird beispielsweise Vollblut verdünnt und mit markierten Anti-Integrin-Antikörpern gebunden. Eine Blutplättchen-Fraktion kann basierend auf vorwärts gestreutem Licht und seitwärts gestreutem Licht isoliert werden, und die Integrin-Menge an Blutplättchen kann durch Messen der Fuoreszenz-Intensität von Blutplättchen quantifiziert werden. Flusscytometrie wird unten speziell erklärt, aber der Bereich der vorliegenden Erfindung ist nicht durch die(se) Erklärung begrenzt. Durch Verwenden von Flusscytometrie kann die Integrin Menge quantifiziert werden, indem Vollblut verwendet wird, ohne Blutplättchen zu isolieren.
Es werden 4 μl Blut mit 396 μl PBS verdünnt, welches 0,0038% wässriger Natriumcitrat-Lösung enthält. Auf Integrin gerichtete, mit FITC markierte Antikörper, bevorzugter Weise auf Integrin-α2 gerichtete Antikörper, beispielsweise FITC-markierte Anti-Maus-CD49b-Antikörper (BD Pharmingen, Cat. No. BD-558757) im Falle einer Maus, oder FITC-markierte Anti-Menschen-CD49b Antikörper (BD Pharmingen, Cat. No. BD-555498) im Falle eines Menschen, werden mit PBS, welches 0,1% BSA enthält, auf eine geeignete Konzentration verdünnt. 10 μl der Antikörper werden zu 90 μl des verdünnten Bluts zugefügt. Der Mischung wird gestattet, bei Raumtemperatur für 60 Minuten zu reagieren, und sie wird dann durch ein Filter (FALCON, Cat. No. 2235) gegeben. Zum Rückstand werden 900 μl PBS zugefügt, und eine Blutplättchen-Fraktion wird basierend auf Intensitäten vorwärts gestreuten Lichts und seitwärts gestreuten Lichts isoliert, welche unter Verwendung eines Flusszytometers (Becton Dickinson, FACS Calibur) gemessen werden. Integrin, bevorzugter Weise Integrin-α2, wird an Blutplättchen durch Messen (der) Fuoreszenz-Intensität an Blutplättchen quantifiziert.
3. Quantifizieren der Integrin-mRNS-Menge in Blutplättchen
1) Extraktion von RNS
RNS kann mittels des Guanidin-Thiocyanat-Verfahrens, Phenol-Verfahrens oder dergleichen extrahiert werden. Die isolierten Blutplättchen werden in 1 ml ISOGEN gelöst, und bei Raumtemperatur für 5 Minuten ruhen gelassen. Der Mischung werden 0,2 ml Chloroform zugefügt, und die Mischung wird gerührt und dann für 2 Minuten ruhen gelassen. Die Reaktions-Mischung wird bei 4°C für 15 Minuten bei 13000 rpm (MX-150, TOMY, Rotor TMA-11) zentrifugiert, und der Überstand in ein anderes Reagenzglas überführt. Es werden 0,5 ml Isopropanol zugefügt, und die Mischung wird bei Raumtemperatur für 5 Minuten ruhen gelassen. Die Mischung wird mit 13000 rpm bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert (MX-150, TOMY, Rotor TMA-11), und der Überstand wird verworfen. Zu den Präzibitaten wird 1 ml 70% wässrige Ethanol Lösung zugefügt, und die Mischung wird mit 15000 rpm bei 4°C für 15 Minuten (MX-150, TOMY, Rotor TMA-11) zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, und die Präzibitate werden in RNAse-freiem H₂O gelöst.
2) Quantifizieren von RNS
RNS kann mittels (der) Techniken Northern-Blotting-Analyse, Dot-Blotting-Analyse, RNAse Assay, Vergleichende RT-PCR, kompetitive RT-PCR, quantitative PCR und so weiter quantifiziert werden. Quantitative PCR ist bevorzugt. Die Technik quantitative PCR wird unten beschrieben werden, aber der Bereich der vorliegenden Erfindung ist nicht durch die Erklärung begrenzt. Quantitative PCR wird unter Verwendung einer TaqMan Probe/Sonde ("probe") und eines ABI Prisma 7700 Sequenz-Detektions-Systems (Perkin-Elmer Applied Biosystems) wie folgt ausgeführt.
Der Vorgang wird mit (den) zwei Schritten Reverse-Transkription-Reaktion und PCR ausgeführt. Die Reverse-Transkription-Reaktion des ersten Schritts wird ausgeführt, indem zur gewonnenen RNS dNTP, Oligo-d(T)₁₆-Primer, RNAse-Inhibitor und Multiscribe Reverse Transkriptase (Perkin-Elmer Applied Biosystems) zugeführt werden, die Mischung für 10 Minuten bei 25°C gehalten wird und die Mischung dann bei 48°C für 30 Minuten erwärmt wird. Die Mischung wird bei 95°C für 5 Minuten erwärmt, um die Reaktion zu beenden.
Die gewonnenen cDNA wird in (der) PCR des zweiten Schritts verwendet. (Die) PCR wird beispielsweise in einem Reaktions-System ausgeführt, welches umfasst: 2,5 ng cDNA, 1 × TaqMan PCR Puffer, 3 mM MgCl₂, jeweils 200 μM von dATP, dCTP und dGTP, 400 μM dUTP, 200 nM Primer-Paar, 0,01 U/μl AmpErase UNG und 0,025 U/μl AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Was die Reaktionsbedingungen betrifft, werden die Reaktionen wie folgt ausgeführt: bei 50°C für 2 Minuten und 95°C für 10 Minuten, gefolgt von einem Zyklus, welcher aus Reaktionen bei 95°C für 20 Sekunden, bei 55°C für 20 Sekunden und bei 72°C für 30 Sekunden besteht, welcher 40 mal wiederholt wird. Die Primer und die Probe/Sonde sind unter Verwendung von "Primer Expression" (Perkin-Elmer Applied Biosystems) entwickelt. Zum Vergleich von zwei oder mehr Probe/Sonden werden quantifizierte Werte nach auf (dem) mRNS-Niveau eines Buchhaltungs("house keeping")-Gens, welches wenig Variation an Transkriptions-Menge in jeder Probe/Sonde zeigt, bevorzugter Weise (dem) mRNS-Niveau von GAPDH basierender Korrektur verwendet.
(Der) Einfluss einer Droge auf (die) Integrin-Expression von von Blutplättchen verschiedenen Zellen wird basierend auf der vom Schritt zum Messen (der) Expressions-Menge gemessenen Expressions-Menge, wie oben beschrieben bestimmt. Die Bestimmung kann basierend auf der Korrelation (der) Integrin-Expressions-Menge in Blutplättchen mit (der) Integrin-Expressions-Menge in von Blutplättchen abweichenden Zellen ausgeführt werden. Dies bedeutet: wenn die Expressions-Menge in Blutplättchen abnimmt, kann die Droge dazu ausgelegt sein, (einen) dahingehenden Einfluss aufzuweisen, dass die Integrin-Expression von von Blutplättchen verschiedenen Zellen abnimmt. Wenn umgekehrt die Expressions-Menge in Blutplättchen abnimmt, kann die Droge dazu ausgelegt sein (einen) dahingehenden Einfluss aufzuweisen, dass sich die Integrin-Expression in von Blutplättchen verschiedenen Zellen erhöht.
Ferner verwendet die vorliegende Erfindung ein Quantifizierungs-Reagens im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.
Das Quantifizierungs-Reagens ist ein Reagens zum Quantifizieren von Integrin zur Verwendung im Verfahren zum Überprüfen (des) Einflusses einer Droge auf die Integrin-Expression, welches den Schritt umfasst, mittels eines immunochemischen Verfahrens (die) Integrin-Expressions-Menge in Blutplättchen eines Patienten zu messen, dem die Droge verabreicht wurde, und den Schritt (umfasst), (den) Einfluss der Droge auf (die) Integrin-Expression in von Blutplättchen verschiedenen Zellen basierend auf der gemessenen Expressions-Menge zu bestimmen.
Die Komponenten des Quantifizierungs-Reagens können zu Reagentien zur Verwendung zum immunochemischen Quantifizieren von Integrin ähnlich sein. Das Quantifizierungs-Reagens kann mittels einer Technik erzeugt werden, welche aus denjenigen ausgewählt ist, welche in Abhängigkeit vom auf einem immunochemischem Verfahren basierenden Mess-Verfahren herkömmlicherweise bei der Produktion von Quantifizierungs-Reagentien verwendet wird.
Üblicherweise wird ein Anti-Integrin-Antikörper aufgenommen. Der Anti-Integrin Antikörper kann mit einer fluoreszierenden Substanz markiert sein/werden.
Das Quantifizierungs-Reagens kann aus zwei oder mehr Komponenten als ein Kit gebildet werden. Ferner kann das Quantifizierungs-Reagens als eine Zusammensetzung bereitgestellt werden, welche ferner einen Träger enthält, welcher bei der Verwendung des Quantifizierungs-Reagens geeignet ist. Beispielsweise kann das Kit einen auf Integrin-α2 gerichteten Fuoreszenz-markierten monoklonalen Antikörper oder einen auf Integrin-α2 gerichteten monoklonalen Antikörper und einen Fuoreszenz-markierten Anti-Maus-Ig Antikörper, ein Verdünnungsmittel und eine Immobilisierungslösung enthalten.
Ein anderes Quantifizierungs-Reagens ist ein Reagens zum Quantifizieren von Integrin zur Verwendung im Verfahren zum Überprüfen (des) Einflusses einer Droge auf die Integrin-Expression, welches den Schritt umfasst, (die) Integrin-Expressions-Menge in Blutplättchen eines Patienten zu messen, dem die Droge verabreicht wurde, indem (die) Integrin kodierende mRNS-Menge gemessen wird, und den Schritt, (den) Einfluss der Droge auf (die) Integrin-Expression in von Blutplättchen verschiedenen Zellen basierend auf der gemessenen Expressions-Menge zu bestimmen.
Die Komponenten des Quantifizierungs-Reagens können ähnlich zu denjenigen von Reagentien sein, welche zum Quantifizieren von Integrin-kodierender mRNS verwendet werden. Das Quantifizierungs-Reagens kann mittels einer Technik erzeugt werden, welche aus denjenigen ausgewählt ist, welche herkömmlicherweise zum Herstellen von auf dem mRNS-Quantifizier-Verfahren basierenden Quantifizier-Reagentien verwendet werden. Beispiele des Verfahrens beinhalten diejenigen, welche auf PCR, Hybridisierung und so weiter basieren. Üblicherweise beinhaltet das Reagens eine Nukleinsäure, welche zur Integrin-kodierenden mRNS komplementär ist, welche als ein Primer oder eine Probe/Sonde verwendet werden kann. Primer und Proben/Sonden können von Fachleuten basierend auf den Nukleotid-Sequenzen, welche bekannte Integrine kodieren, unmittelbar entworfen werden.
Das Quantifizierungs-Reagens kann von zwei oder mehr Komponenten als einem Kit gebildet werden. Ferner kann das Quantifizierungs-Reagens als eine Zusammensetzung bereitgestellt werden, welche ferner einen Träger enthält, welcher zur Verwendung des Quantifizierungs-Reagens geeignet ist. Beispielsweise kann das Kit PCR-Primer bevorzugter Weise für quantitative PCR markierte Primer, einen Kontroll-Primer und Kontroll-DNA enthalten.
Die Droge ist bevorzugter Weise eine durch die allgemeine Formel (I), (I^a) oder (I^b) repräsentierte Sulfonamidverbindung, oder ein pharmazeutisch verwendbares Salz davon, oder ein Hydrat davon.
Der in der allgemeinen Formel (I) durch B und R repräsentierte C6-C10-Arylring oder 6-10-gliedrige Heteroarylring, der/die substituiert und teilweise gesättigt sein kann/können, bedeutet eine aromatische Kohlenwasserstoff-Gruppe, welche 6 bis 10 Kohlenstoffatomatome aufweist, oder einen 6-10-gliedrigen aromatischen Heterozyklus, der zumindest eines von einem Stickstoffatom, einem Sauerstoffatom und Schwefel als einem Heteroatom enthält, von welchen jedes einen oder mehrere Substituenten daran haben kann, und teilweise gesättigt sein kann. Spezifische Beispiele hiervon beinhalten Benzol, Pyridin, Pyrimidin, Pyrazin, Pyridazin, Naphthalin, Chinolin, Isochinolin, Phthalazin, Naphthyridin, Chinoxalin, Chinazolin, Cinnolin, Indol, Isoindol, Indolizin, Indazol, Benzofuran, Benzothiophen, Benzoxazol, Benzimidazol, Benzopyrazol, Benzothiazol, 4,5,6,7-Tetrahydroindol, 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin, 2,3-Dihydrobenzofuran, Indan, Tetralon, Indolin, Isoindolin, Chroman, Tetralin und so weiter. Die vorher genannten aromatischen Ringe können ein bis drei Substituenten aufweisen. Wenn zwei oder mehr Substituenten vorhanden sind, können sie gleich oder unterschiedlich sein. Beispiele der Substituenten beinhalten Amino, welches mit niedrigerem Alkyl oder niedrigerem Cycloalkyl substituiert sein kann; niedrigeres Alkyl; niedrigeres Alkoxi, Hydroxyl, Nitro, Mercapto, Cyano, niedrigeres Alkylthio, Halogen, eine durch die Formel -a^a-b^a repräsentierte Gruppe, wobei a^a eine Einfachbindung darstellt, -(CH₂)_k ^a-, -O-(CH₂)_k ^a-, -S-(CH₂)_k ^a- oder -N(R^3a)-(CH₂)_k ^a-, wobei k^a eine ganze Zahl 1 bis 5 ist, und R^3a ein Wasserstoffatom oder niedrigeres Alkyl darstellt, und b^a -CH₂-d^a darstellt, wobei d^a Amino darstellt, welche(s) mit niedrigerem Alkyl, einem Halogenatom, Hydroxyl, niedrigerem Alkylthio, Cyano oder niedrigerem Alkoxi substituiert sein kann/können, eine durch die Formel -a^a-e^a-f^a repräsentierte Gruppe, wobei a^a die gleiche Bedeutung hat, wie oben definiert ist, e^a -S(O)- oder -S(O)₂- darstellt, und f^a Amino, das/die mit niedrigerem Alkyl oder niedrigerem Alkoxi substituiert sein kann/können, niedrigeres Alkyl, Trifluoromethyl, -(CH₂)_m ^a-b^a oder -N(R^4a)-(CH₂)_m ^a-b^a darstellt, wobei b^a die gleiche Bedeutung hat wie oben definiert ist, R^4a ein Wasserstoffatom oder niedrigeres Alkyl darstellt, und m^a eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, eine durch die Formel -a^a-g^a-h^a repräsentierte Gruppe, wobei a^a die gleiche Bedeutung hat, wie oben definiert ist, g^a -C(O)- oder -C(S)- darstellt, und h^a Amino darstellt, das/die mit niedrigerem Alkyl, Hydroxyl, niedrigerem Alkyl, niedrigerem Alkoxi substituiert sein kann/können, -(CH₂)_n ^a-b^a oder -N(R^5a)-(CH₂)_n ^a-b^a, wobei b^a die gleiche Bedeutung hat, wie oben definiert ist, R^5a ein Wasserstoffatom oder niedrigeres Alkyl darstellt, und n^a eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist; eine durch die Formel -a^a-N(R^6a)-g^a-i^a repräsentierte Gruppe, wobei a^a und g^a die gleichen Bedeutungen haben, wie oben definiert ist, R^6a ein Wasserstoffatom oder niedrigeres Alkyl darstellt, und i^a ein Wasserstoffatom, eine niedrigere Alkoxi-Gruppe oder f^a darstellt (f^a hat die gleiche Bedeutung hat, wie oben definiert ist); eine durch die Formel -a^a-N(R^7a)-e^a-f^a repräsentierte Gruppe, wobei a^a, e^a und f^a die gleichen Bedeutungen haben wie oben definiert ist, und R^7a ein Wasserstoffatom oder niedrigeres Alkyl darstellt; eine durch die Formel -(CH₂)_p ^a-_j ^a-(CH₂)_g ^a-b^a repräsentierte Gruppe, wobei j^a ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom darstellt, b^a die gleiche Bedeutung hat, wie oben definiert ist, und p^a und q^a gleich oder unterschiedlich sein können, und jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 5 darstellen; eine durch die Formel -(CH₂)_u ^a-Ar^a repräsentierte Gruppe, wobei Ar^a Phenyl oder Heteroaryl darstellt, die mit niedrigerem Alkyl, niedrigerem Alkoxi oder einem Halogenatom substituiert sein können, und u^a eine ganze Zahl von 0 oder 1 bis 5 ist, eine durch die Formel -CONH-(CH₂)u^a-Ar^a repräsentierte Gruppe, wobei Ar^a und u^a die gleichen Bedeutungen haben, wie oben definiert ist; eine durch die Formel -SO₂-(CH₂)u^a-Ar^a repräsentierte Gruppe, wobei Ar^a und u^a die gleichen Bedeutungen haben, wie oben definiert ist; und so weiter.
In den durch die allgemeine Formel (I) repräsentierten Zusammensetzungen stellt R bevorzugter Weise Indol, Chinolin oder Isochinolin dar.
In der oben angegebenen allgemeinen Formel (I^a), ist der durch A^a repräsentierte "monozyklische oder bizyklische aromatische Ring, der substituiert sein kann" ein aromatischer Kohlenwasserstoffring oder ein aromatischer Heterozyklus, der zumindest eines von einem Stickstoffatom, einem Sauerstoffatom und einem Schwefelatom enthält, von welchen jedes ein bis drei Substituenten am Ring haben kann. Typische Beispiele des in A^a enthaltenen aromatischen Rings beinhalten Pyrrol, Pyrazol, Imidazol, Thiophen, Furan, Thiazol, Oxazol, Benzol, Pyridin, Pyrimidin, Pyrazin, Pyridazin, Naphthalin, Chinolin, Isochinolin, Phthalazin, Naphthyridin, Chinoxalin, Chinazolin, Cinnolin, Indol, Isoindol, Indolizin, Indazol, Benzofuran, Benzothiophen, Benzoxazol, Benzimidazol, Benzopyrazol, Benzothiazol und so weiter. Die vorher genannten aromatischen Ringe können ein bis drei Substituenten aufweisen. Wenn zwei oder mehr Substituenten vorhanden sind, können sie gleich oder unterschiedlich sein. Beispiele der Substituenten beinhalten Amino, welches mit niedrigerem Alkyl oder niedrigerem Cycloalkyl substituiert sein kann; niedrigeres Alkyl, niedrigeres Alkoxi, Hydroxyl, Nitro, Mercapto, Cyano, niedrigeres Alkylthio, Halogen, eine durch die Formel -a^a-b^a repräsentierte Gruppe, wobei a^a eine Einfachbindung darstellt, -(CH₂)k^a-, -O-(CH₂)k^a-, -S-(CH₂)k^a- oder -N(R^3a)-(CH₂)k^a- wobei k^a eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, und R^3a ein Wasserstoffatom oder niedrigeres Alkyl darstellt, und b^a -CH₂-d^a darstellt, wobei d^a Amino darstellt, welche(s) mit niedrigerem Alkyl, Halogen, Hydroxyl, niedrigerem Alkylthio, Cyano oder niedrigerem Alkoxi substituiert sein kann/können, eine durch die Formel -a^a-e^a-f^a repräsentierte Gruppe, wobei a^a die gleiche Bedeutung hat, wie oben definiert ist, e^a -S(O)- oder -S(O)₂- darstellt, und f^a Amino darstellt, welche(s) mit niedrigerem Alkyl oder niedrigerem Alkoxi substituiert sein kann/können, niedrigeres Alkyl, Trifluoromethyl, -(CH₂)_ma-b^a oder -N(R^4a)-(CH₂)_ma-b^a, wobei b^a die gleiche Bedeutung hat, wie oben definiert ist, R^4a ein Wasserstoffatom oder niedrigeres Alkyl darstellt, und m^a eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist; eine durch die Formel -a^a-g^a-h^a repräsentierte Gruppe, wobei a^a die gleiche Bedeutung hat, wie oben definiert ist, g^a -C(O)- oder -C(S)- darstellt, und h^a Amino darstellt, welche(s) mit niedrigerem Alkyl, Hydroxyl, niedrigerem Alkyl, niedrigere Alkoxi substituiert sein kann/können, -(CH₂)_n ^a-b^a oder -N(R^5a)-(CH₂)_n ^a-b^a wobei b^a die gleiche Bedeutung hat, wie oben definiert ist, R^5a ein Wasserstoffatom oder niedrigeres Alkyl darstellt, und n^a eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist; eine durch die Formel -a^a-N(R^6a)-g^a-i^a repräsentierte Gruppe, wobei a^a und g^a die gleichen Bedeutungen haben wie oben definiert ist, R^6a eine Wasserstoffatom oder niedrigeres Alkyl darstellt, und i^a ein Wasserstoffatom, niedrigeres Alkoxi oder f^a darstellt (wobei f^a die gleiche Bedeutung hat, wie oben definiert ist); eine durch die Formel -a^a-N(R^7a)-e^a-f^a repräsentierte Gruppe wobei a^a, e^a und f^a die gleichen Bedeutungen haben, wie oben definiert ist, und R^7a ein Wasserstoffatom oder niedrigeres Alkyl darstellt; eine durch die Formel -(CH₂)_p ^a-j^a-(CH₂)_q ^a-b^a repräsentierte Gruppe, wobei j^a ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom darstellt, b^a die gleiche Bedeutung hat, wie oben definiert ist, und p^a und q^a gleich oder unterschiedlich sein können, und jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 5 darstellen; eine durch die Formel -(CH₂)_u ^a-Ar^a repräsentierte Gruppe, wobei Ar^a Phenyl oder Heteroaryl darstellt, welche mit niedrigerem Alkyl, niedrigerem Alkoxi oder Halogen substituiert sein kann, und u^a 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist; eine durch die Formel -CONH-(CH₂)_u ^a-Ar^a repräsentierte Gruppe, wobei Ar^a und u^a die gleichen Bedeutungen haben wie oben definiert ist, eine durch die Formel -SO₂-(CH₂)_u ^a-Ar^a repräsentierte Gruppe, wobei Ar^a und u^a die gleichen Bedeutungen haben wie oben definiert ist, und so weiter.
Wenn in den vorher genannten Beispielen der Substituenten die Substituenten mit zwei Alkyl-Gruppen substituiertes Amino sind, können diese Alkyl-Gruppen (sich) so (ver)binden, dass ein 5- oder 6-gliedriger Ring gebildet wird. Wenn ferner A^a ein Stickstoff enthaltender Heterozylus ist, welcher Hydroxyl oder Mercapto aufweist, können diese Gruppen mittels Resonanz in Form einer Oxo- oder Thioxo-Gruppe vorliegen.
Der durch B^a repräsentierte "6-gliedrige ungesättigte Kohlenwasserstoffring oder ungesättigte 6-gliedrige Heterozyklus, der ein Stickstoffatom als ein Heteroatom enthält, welche(s) substituiert sein kann/können" ist Benzol oder Pyridin, welche teilweise hydrogeniert sein können, und ein oder zwei Substituenten am Ring aufweisen können. Wenn zwei Substituenten vorhanden sind, können sie gleich oder unterschiedlich sein.
Der durch C^a repräsentierte "5-gliedrige Heterozyklus, der ein oder zwei Stickstoffatome enthält, die substituiert sein können", ist Pyrrol, Pyrazol oder Imidazol, welche teilweise hydrogeniert sein können, und ein oder zwei Substituenten am Ring haben können. Wenn zwei Substituenten vorhanden sind, können diese gleich oder unterschiedlich sein.
Beispiele der Substituenten, die B^a und C^a aufweisen, können beispielsweise beinhalten: Halogen, Cyano, niedrigeres Alkyl, niedrigeres Alkoxi, Hydroxyl, Oxo, eine durch die Formel -C(O)-r^a repräsentierte Gruppe, wobei r^a ein Wasserstoffatom, Amino, welche(s) mit niedrigerem Alkyl substituiert sein kann, niedrigeres Alkyl, niedrigeres Alkoxi oder Hydroxyl, darstellt; Amino welches mit niedrigerem Alkyl substituiert sein kann, Trifluoromethyl und so weiter.
In der oben angegebenen allgemeinen Formel (Ia) bedeutet die niedrigere Alkyl-Gruppe in den Definitionen von R^1a und R^2a sowie die Substituenten, die A^a, B^a und C^a aufweisen können, eine lineare oder verzweigte Alkyl-Gruppe, welche 1 bis 6 Kohlenstoffatomatome aufweist. Beispiele hiervon beinhalten Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, n-Pentyl(amyl), Isopentyl, Neopentyl, tert-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 1,2-Dimethylpropyl, n-Hexyl, Isohexyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 1,1-Dimethylbutyl, 1,2-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-Methylpropyl, 1-Ethyl-2-Methylpropyl und so weiter. Von diesen sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl und Isobutyl bevorzugt, und Methyl, Ethyl, n-Propyl und Isopropyl sind von diesen am meisten bevorzugt.
Die niedrigere Cycloalkyl-Gruppe in den Definitionen der Substituenten, welche A^a aufweisen kann, ist eine Cycloalkyl-Gruppe, welche 3 bis 8 Kohlenstoffatomatome aufweist, und Beispiele hiervon beinhalten Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und so weiter.
Die niedrigere Alkoxi-Gruppe in den Definitionen der Substituenten, welche A^a, B^a und C^a aufweisen können, bedeutet niedrigeres Alkoxi, welches von dem vorher genannten niedrigeren Alkyl, wie Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, -n-Butoxy, Isobutoxy und tert-Butoxy abgeleitet ist. Unter diesen sind Methoxy und Ethoxy am meisten bevorzugt. Das niedrigere Alkylthio bedeutet niedrigeres Alkylthio, welches von dem vorher genannten niedrigeren Alkyl abgeleitet ist. Beispiele des Halogenatoms beinhalten ein Fluor-Atom, ein Chlor-Atom, ein Brom-Atom und so weiter.
Unter diesen beinhalten besonders bevorzugte Zusammensetzungen:

1) N-(3-Cyano-4-Methyl-1H-Indol-7-yl)-3-Cyano-Benzol-Sulfonamid
2) N-(3-Cyano-4-Methyl-1H-Indol-7-yl)-6-Chloro-3-Pyridin-Sulfonamid
3) N-(3-Brom-5-Methyl-1H-Indol-7-yl)-4-Sulfamoyl-Benzol-Sulfonamid
4) N-(5-Brom-3-Chlor-1H-Indol-7-yl)-6-Amino-3-Pyridin-Sulfonamid
5) N-(3-Brom-5-Methyl-1H-Indol-7-yl)-3-Cyano-Benzol-Sulfonamid
6) N-(4-Brom-1H-Indol-7-yl)-4-Cyano-Benzol-Sulfonamid
7) N-(4-Chlor-1H-Indol-7-yl)-6-Amino-3-Pyridin-Sulfonamid
8) N-(3-Brom-4-Chlor-1H-Indol-7-yl)-6-Amino-3-Pyridin-Sulfonamid
9) N-(3-Brom-5-Methyl-1H-Indol-7-yl)-5-Cyano-2-Thiophen-Sulfonamid
10) N-(4-Brom-3-Chlor-1H-Indol-7-yl)-2-Amino-5-Pyrimidin-Sulfonamid
11) N-(3-Chlor-1H-Indol-7-yl)-4-Sulfamoyl-Benzol-Sulfonamid und so weiter.

Das durch die allgemeine Formel (I^a) repräsentierte Sulfonamid-Derivat kann mit einer Säure oder einer Base ein Salz bilden. Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch Salze der durch die allgemeine Formel (I^a) repräsentierten Zusammensetzungen. Beispiele des Salzes mit einer Säure beinhalten Salze mit anorganischen Säuren, wie Hydrochloride, Hydrobromide und Sulfate, und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Succinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Methanesulfonsäure und p-Toluolsulfonsäure, und Beispiele des Salzes mit einer Base beinhalten anorganische Salze, wie Natrium-Salze, Kalium-Salze und Calcium-Salze und Salze mit arganischen Basen, wie Triethylamin, Arginin und Lysin.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet der durch Q^b repräsentierte "aromatische Ring, der ein oder zwei Stickstoffatome haben kann" einen aromatischen Kohlenwasserstoff oder einen 6-gliedrigen aromatischen Heterozyklus, welcher ein oder zwei Stickstoffatome enthält. Beispiele des in Q^b enthaltenen aromatischen Rings beinhalten Benzol, Pyridin, Pyrimidin, Pyrazin, Pyridazin und so weiter. Ferner ist der durch M repräsentierte "C5-C12 ungesättigte monozyklische oder polyzyklische Ring, welcher 1 bis 4 Heteroatome haben kann, welche aus einem Stickstoffatom, einem Sauerstoffatom und einem Schwefelatom ausgewählt sind" ein ungesättigter monozyklischer oder polyzyklischer Ring, welcher sich eine Doppelbindung mit Q^b teilt. Beispiele hiervon beinhalten aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Naphthalin, ungesättigte Kohlenwasserstoffe, wie Cyclopenten, Cyclohexen, Cyclohepten, Cycloocten, Cyclopentadien, Cycloheptadien und Cyclooctadien, und ungesättigte Heterozyklen, wie Tetrahydro-Pyridin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Oxazol, Isoxazol, Thiazol, Isothiazol, Pyrazol, Imidazol, Triazol, Pyridin, Pyrimidin, Pyrazin, Pyridazin, Triazin, Indol, Isoindol, Chinolin, Isochinolin, Indazolidin, Naphthyridin, Benzofuran, Benzopyran, Benzothiophen, Benzimidazol, Benzoxazol, Benzothiazol, Pyrrolo-Pyridin, Pyridopyrimidin und Imidazo-Pyridin. Ferner bedeutet der Expression" Q^b und M^b können sich ein Stickstoffatom teilen" den Fall, dass ein Stickstoffatom an den Kondensations-Stellen der beiden Ringe enthalten ist. Beispiele des auf diese Weise gebildeten Rings enthalten Indazolidin, Imidazo[1,2-a]Pyridin, Imidazo[1,5-a]Pyridin, Pyrazolo[1,5-a]Pyrimidin und so weiter.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet das C1-C4-Alkyl in R^1b, R^4b und R^5b oder das C1-C4-Alkyl in dem C1-C4-Alkyl, welches mit einem Halogenatom in A^b, D^b, R^1b, R^2b, R^3b, R^6b, R^7b, R^8b, R^9b, R^10b, R^11b, R^12b, R^13b, R^14b, R^15b, G^1b, G^2b substituiert sein kann, und Gruppe A bedeutet eine lineare oder verzweigte Alkyl-Gruppe, welche 1 bis 4 Kohlenstoffatomatome aufweist, und Beispiele hiervon beinhalten Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl und tert-Butyl. Der Ausdruck "mit einem Halogenatom substituiert sein kann" bedeutet, dass diese Alkyl-Gruppen mit einem Halogenatom substituiert sein können, welches aus einem Fluor-Atom, einem Chlor-Atom, einem Brom-Atom und einem Iod-Atom ausgewählt ist. Beispiele beinhalten Monofluoromethyl, Monochloromethyl, Difluormethyl, Trifluormethyl, 1- oder 2-Monofluorethyl, 1- oder 2-Monochlorethyl, 1- oder 2-Monobromethyl, 1,2-Difluorethyl, 1,2-Dichloroethyl, 1,1,2,2,2-Pentafluoroethyl, 3,3,3-Trifluorpropyl und so weiter. Unter diesen sind Monofluormethyl, Difluormethyl, Trifluormethyl, 1- oder 2-Monofluorethyl, 1,2-Difluorethyl, 1,1,2,2,2-Pentafluoroethyl und so weiter bevorzugt.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet das C1-C4-Alkoxi in dem C1-C4-Alkoxi, welches mit einem Halogenatom in A^b, D^b und Gruppe A substituiert sein kann, ein lineares oder verzweigtes Alkoxi, welches 1 bis 4 Kohlenstoffatomatome aufweist. Beispiele hiervon beinhalten Methoxy, Ethoxy, n-Propyloxy, Isopropyloxy, n-Butyloxy, Isobutyloxy, sec-Butyloxy und tert-Butyloxy. Der Ausdruck "mit einem Halogenatom substituiert sein kann" bedeutet, dass das Alkoxi mit einem Halogenatom substituiert sein kann, welches aus einem Fluor-Atom, einem Chlor-Atom, einem Brom-Atom und einem Iod-Atom ausgewählt ist. Beispiele beinhalten Monofluoromethoxy, Difluoromethoxy, Trifluoromethoxy, 1- oder 2-Monofluoroethoxy, 1- oder 2-Monochloroethoxy, 1- oder 2-Monobromoethoxy, 1,2-Difluoroethoxy, 1,1,2,2,2-Pentafluoroethoxy, 3,3,3-Trifluoropropyloxy und so weiter. Unter diesen sind Monofluoromethoxy, Difluoromethoxy, Trifluoromethoxy, 1- oder 2-Monofluoroethoxy, 1,2-Difluoroethoxy, 1,1,2,2,2-Pentafluoroethoxy und so weiter bevorzugt.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet das C2-C4-Alkenyl oder -Alkinyl welches im A^b und D^b vorhanden ist, Alkenyl oder Alkinyl, welches 2 bis 4 Kohlenstoffatomatome aufweist. Beispiele hiervon beinhalten Vinyl, Allyl, 2- oder 3-Butenyl, 1,3-Butadienyl, Ethynyl, 2-Propynyl, 2-Methylethynyl, 2- oder 3-Butynyl und so weiter.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet das Aryl, welches in B^b und Gruppe A vorhanden ist einen aromatischen Kohlenwasserstoff. Beispiele hiervon beinhalten Phenyl, Naphthyl und so weiter. Ferner ist das Heteroaryl ein monozyklischer oder polyzyklischer Ring, welcher ein oder mehrere aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählte Atome enthält. Beispiele hiervon beinhalten Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Triazolyl, Furyl, Thienyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, Thiadiazolyl, Pyridyl, Pyrimidyl, Pyrazyl, Indolyl, Indolizinyl, Benzoimidazolyl, Benzothiazolyl, Benzoxazolyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Chinazolinyl, Phthalazinyl und so weiter.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "R^8b und R^9b können einen 5- oder 6-gliedrigen Ring zusammen mit einem Stickstoffatom bilden, an welches sie binden, und der Ring kann ferner ein Stickstoffatom, ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom enthalten" in den Definitionen von R^8b und R^9b, dass R^8b und R^9b zusammen mit dem Stickstoffatom, an welches sie binden, Pyrrolidinyl, Piperidinyl, Morpholino, Thiomorpholino, Piperazinyl oder dergleichen bilden können.
In der vorliegenden Erfindung bedeuten das Alkyl in dem Aminosulfonyl, welches substituiert sein kann mit Mono- oder Di(C1-C4-Alkyl), (C1-C4-Alkyl)-S(O)_s ^b-(C1-C4-Alkylen), C1-C4-Alkyl oder Phenylsulfonylamino, welches substituiert sein kann, und das C1-C4-Alkyl, welches mit C1-C4-Alkyl substituiert sein kann in Gruppe A die gleichen Alkyl-Gruppen, welche oben definiert sind. Beispiele des Alkylens beinhalten Methylen, Ethylen, Propylen, Butylen, Methylmethylen, 1- oder 2-Methylethylen, 1-, 2- oder 3-Methylpropylen, Dimethylmethylen und so weiter.
Ferner bedeutet das C1-C8-Alkanoyl-Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, Isobutyryl, Valeryl, Benzoyl oder dergleichen.
In der vorliegenden Erfindung ist die in J^b vorhandene Schutzgruppe in der "Aminogruppe, welche eine Schutzgruppe haben kann", nicht speziell begrenzt, so lange die Gruppe gemäß üblicher organischer Synthese als eine Schutzgruppe für Amino bekannt ist. Beispiele hiervon beinhalten Benzyloxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl, Formyl, Acetyl, Chloroacetyl, 2,2,2-Trichloroethyl, Benzyliden, Benzhydryl, Trityl und so weiter. Ferner sind die Schutzgruppe in der Carboxy, die eine Schutzgruppe haben kann, und die Schutzgruppe der Carboxy in R^16b nicht speziell begrenzt, solange die Gruppen als eine Schutzgruppe für Carboxy gemäß üblicher organischer Synthese bekannt sind. Beispiele hiervon beinhalten Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, t-Butyl, Methoxymethyl, 2,2,2-Trichloroethyl, Pivaloyloxymethyl, Benzyl und so weiter.
In der vorliegenden Erfindung beinhalten Beispiele des Substituenten für den Ausdruck "die substituiert sein können" oder "die einen Substituenten haben können" ein Halogenatom, C1-C4-Alkyl oder -Alkoxi, die/das mit einem Halogenatom substituiert sein kann/können, Hydroxyl, Hydroxy(C1-C4-Alkyl), Amino, die mit Mono- oder Di-(C1-C4-Alkyl) substituiert sein können, C2-C4-Alkenyl oder Alkinyl, Cyano, C1-C8-Acyl, Aminosulfonyl, die mit Mono- oder Di-(C1-C4-Alkyl) substituiert sein kann/können, Carboxy; (C1-C4-Alkoxi)-Carbonyl, Carbamoyl, das/die mit Mono- oder Di-(C1-C4-Alkyl) substituiert sein kann/können, und so weiter.
Die heterozyklischen Zusammensetzungen, welche (das) durch die allgemeine Formel (I^b) repräsentierte Sulfonamid enthalten, können mit einer Säure oder einer Base ein Salz bilden. Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch Salze der durch die allgemeine Formel (I^b) repräsentierten Zusammensetzungen. Beispiele des Salzes mit einer Säure beinhalten Salze mit anorganischen Säuren, wie Hydrochloride, Hydrobromide und Sulfate, und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Succinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Methanesulfonsäure und p-Toluolsulfonsäure. Ferner beinhalten Beispiele des Salzes mit einer Base anorganische Salze, wie Natrium-Salze, Kalium-Salze und Calcium-Salze und Salze mit organischen Basen, wie Triethylamin, Arginin und Lysin.
Hydrate, sowie optische Isomere dieser Zusammensetzungen, wenn vorhanden, sind selbstverständlich alle im Umfang der Zusammensetzungen beinhaltet. Ferner zeigen Zusammensetzungen, welche aus diesen Zusammensetzungen durch Stoffwechsel, wie Oxidation, Reduktion, Hydrolyse und Konjugation in vivo gebildet werden, und welche Angiogenese-Inhibierungswirkung zeigen, sind ebenfalls beinhaltet. Ferner beinhaltet die vorliegende Erfindung auch Zusammensetzungen, welche zum Erzeugen der Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung (einen) Stoffwechsel, wie Oxidation, Reduktion und Hydrolyse in vivo durchlaufen.
Die Zusammensetzungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können mittels verschiedener Verfahren erzeugt werden. Beispielsweise sind einige der Verfahren speziell in der Japanischen Patent-Offenlegungs-Veröffentlichungen (Kokai) mit den Nummern 7-165708 and 8-231505 offenbart.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird spezifischer mit Bezug auf die folgenden Beispiele erklärt werden.
[Referenz-Beispiel 1] Einfluss von Zusammensetzung A auf (die) Expression von Integrin-α2
Menschliche Nabelschnur-Vene/Ader("vene")-Endothel-Zellen (HUVEC) wurden aus menschlicher Nabelschnur isoliert und in EGM Medium (2% FCS, Hydrocortisonfrei, Clonetics) kultiviert. Die Zellen wurden in einem Typ-I-Collagen-beschichteten Kolben (Sumilon) subkultiviert, und die vierte bis sechste Subkultur wurde verwendet. Der Anti-Menschen-Integrin-α2-Antikörper (A2-IIE10) wurde von Upstate Biotechnology Inc. erworben. Der Anti-Menschen-CD31-Antikörper (JC/70A) und ein FITC-markiertes F(ab')₂-Fragment von Hasen-Anti-Maus-Immunoglobulin wurde von Dako erworben.
Mit den Zellen wurde ein 25-cm² Zellkultur-Kolben beimpft, und (sie wurden) bei 37°C in einem CO₂-Inkubator kultiviert. Nach 3 Stunden wurde das Medium durch das gleiche Medium, welches die Zusammensetzung A (5, 50, 500 ng/ml) enthält, ersetzt, und für 48 Stunden weiter kultiviert. Die Zellen wurden eingesammelt, und 2 × 10⁵ Zellen wurden in 100 μl PBS (0,1% BSA, 0,05% NaN₃) aufgeschwemmt. 1 μg des primären Antikörpers wurden zugefügt, und die Zellen wurden bei 4°C für 30 Minuten inkubiert, mit PBS gewaschen und dann mit dem FITC-markierten sekundären Antikörper für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, und dann mit ZellFix (Becton Dickinson) immobilisiert. Der Fuoreszenz-Wert von 2 × 10⁴ Zellen von jeder Probe/Sonde wurde unter Verwendung von FACS Calibur (Becton Dickinson) gemessen. Die Expressions-Menge der Zelloberflächen-Moleküle wurde durch Korrigieren des Fuoreszenz-Wertes jeder Probe/Sonde unter Verwendung des Fuoreszenz-Werts der Kontroll-Probe/Sonde, welche den primären Antikörper nicht enthielt ermittelt (folgende Gleichung).

RMFI (relative mittlere Fuoreszenz-Intensität) = Probe/Sonden-MFI (mittlere Fuoreszenz-Intensität)/Hintergrund-MFI

Wie in 1 gezeigt, verminderte Zusammensetzung A (50, 500 ng/ml) die Integrin-α2-Expressions-Menge bei HUVEC.
[Referenz-Beispiel 2] Einfluss von Anti-Integrin-α2-Antikörper und Zusammensetzung A auf Rohr-Bildung
Type-I-Collagen-Gel wurde in jede Vertiefung einer 24-Vertiefungen-Platte platziert und geliert, und in einem Serum-freien Medium (Human Endothelial-SFM Basal Growth Medium, "Menschen-Endothel-SFM Basalwachstumsmedium", GIBCO BRL), welches 10 ng/ml EGF (GIBCO BRL) 5 und 20 ng/ml bFGF (GIBCO BRL) oder 20 ng/ml VEGF (Wako Pure Chemical Industries) enthält, gelöstes HUVEC wurde bei einer Dichte von 1 bis 1,2 × 10⁵ Zellen/Vertiefung beimpft. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C kultiviert, und zum Gelieren mit Typ-I-Collagen-Gel überschichtet. Dann wurde das vorher genannte Serum-freie Medium (welches EGF und bFGF oder VEGF enthält), welches eine Droge (Anti-Integrin-α2-Antikörper oder Zusammensetzung A) enthält, zugefügt, und die Zellen wurden bei 37°C für 4 Tage weiter kultiviert. Für die Einwirkung des Anti-Integrin-α2-Antikörpers wurde das Experiment unter Verwendung einer 96-Vertiefungen-Platte ausgeführt.
Nach dem Kultivieren wurden die Zellen mit MTT gefärbt, und die von HUVEC gebildeten Röhren wurden unter einem Mikroskop photographiert. Die Photographie wurde mittels eines Scanners in elektronische Form überführt, und die Rohr-Bildung mittels HUVEC wurde mittels Messens der Längen der Röhren unter Verwendung der Bild-Analyse-Software, Mac SCOPE 2.56 (MITANI) quantifiziert.
Wie in 2 gezeigt, wurde herausgefunden, dass der Anti-Integrin-α2-Antikörper die Rohr-Bildung von durch bFGF induziertem HUVEC inhibierte, was darauf hindeutet, dass Integrin-α2 an der durch bFGF induzierten Rohr-Bildung beteiligt ist. Wie in 3 gezeigt, inhibierte ferner Zusammensetzung A die Rohr-Bildung von durch bFGF oder VEGF induziertem HUVEC. Gemeinsam mit den Resultaten von Referenz-Beispiel 2, wurde in Betracht gezogen, dass Zusammensetzung A die Rohr-Bildung durch Inhibieren der Integrin-α2-Expression inhibierte.
[Beispiel 1] Korrelation der Tumor-Volumenzuwachs-Hemmwirkung und Blutplättchen-Integrin-α2-Expressions-Hemmwirkung von Zusammensetzung A
100 μl Suspension von KP-1 (menschlicher Pankreaskrebzellstamm) in PBS (5 × 10⁷ Zellen /ml) wurde in die Subcutis einer Maus (SLC KSN, weiblich, Charge No. 085605376) transplantiert. Von ("from") eine(r) Woche nach der Transplantation, wurde eine wässrige Lösung von 0,5% Methylcellulose (Übertragungsmittel, "vehicle") oder 100 oder 200 mg/kg Zusammensetzung A (Suspension in 0,5% Methylcellulose) zweimal täglich oral verabreicht. Das Körpergewicht und das Tumor-Volumen wurde in einem Tagesrhythmus gemessen. Die Maus wurde mit Diethylether anästhesiert, und es wurde Augenfundus-Blut unter Verwendung einer Kapillarröhre in einem Tagesrhythmus abgenommen. Es wurden 4 μl Blut mit 396 μl PBS verdünnt, welches 0,0038% wässriger Natriumcitrat-Lösung enthielt. FITC-markierte Anti-Maus-CD49b Antikörper (Pharmingen, Cat. No. 09794D, Charge No. M006073) wurde 30-fach mit PBS verdünnt, welches 0,1% BSA enthielt. 10 μl des Antikörpers wurde zu 90 μl des verdünnten Bluts zugefügt. Der Mischung wurde gestattet, bei Raumtemperatur für 60 Minuten zu reagieren, und sie wurde durch ein Filter (FALCON, Cat. No. 2235) gegeben. Der Rückstand wurde mit 900 μl PBS versetzt, und eine Blutplättchen-Fraktion wurde basierend auf vorwärts gestreutem Licht und seitwärts gestreutem Licht unter Verwendung eines Flusszytometers (Becton Dickinson, FACS Calibur) abgetrennt, und die Fuoreszenz-Intensität der Blutplättchen wurde gemessen.
Wie in 4 gezeigt, inhibierte Zusammensetzung A den KP-1-Tumor-Volumenzuwachs bei Dosen von 100 mg/kg und 200 mg/kg. Gemeinsam mit den Resulten von Referenz-Beispiel 1 und 2 wurde es in Betracht gezogen, dass Zusammensetzung A die Rohr-Bildung durch Inhibieren der Integrin-α2-Expression inhibierte, und die durch den Tumor induzierte Angiogenese inhibierte, was dazu führte, dass der Tumor-Volumenzuwachs inhibiert wurde.
Wie in 5 gezeigt, verminderte Zusammensetzung A gleichzeitig die in Blutplättchen gemessene Integrin-α2-Expressions-Menge. Die Abnahme der Integrin-α2-Expressions-Menge in Blutplättchen wurde bei Dosen von 100 mg/kg und 200 mg/kg beobachtet, bei welchen Inhibierung des Tumor-Volumemzuwachses beobachtet wurde. Daher wurde gezeigt, dass die Integrin-α2-Expressions-Menge in Blutplättchen als ein Ersatz-Marker des den Tumor-Volumenzuwachs inhibierenden Einflusses von Zusammensetzung A verwendet werden könnte/konnte.
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird es möglich, (die) Effizienz einer Droge, beispielsweise eines Angiogenesis-Inhibitors, welche ihre Drogen-Effizienz durch Inhibieren der Integrin-Expression zeigt, unter Verwendung (der) Integrin-Expressions-Menge in Blutplättchen als einem Ersatz-Marker zu überwachen ("monitor"). Da Blutplättchen als eine Probe/Sonde leicht gesammelt werden können, wird ein effizientes Überwachen möglich.

Claims

Verfahren zum Überprüfen des Einflusses einer Droge auf die Integrin-Expression, das aus einem Schritt besteht, bei dem die Integrin-Expressions-Menge in von einem Patienten gewonnenem Blutplättchen gemessen wird, dem die Droge verabreicht wurde, und aus einem Schritt, bei dem der Einfluss der Droge auf die Integrin-Expression von von Blutplättchen verschiedenen Zellen, basierend auf dem Rückgang der gemessenen Expressionsmenge gemessen wird, wobei des Integrin-α2-Integrin ist und die Zellen Zellen eines Gewebes sind, in dem Angiogenese auftreten kann, oder Tumorzellen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Integrin-Expressionsmenge mittels eines immunochemischen Verfahrens gemessen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem das immunochemische Verfahren ein Flusscytometrieverfahren ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Integrin-Expressionsmenge gemessen wird, indem die Menge der das Integrin kodierenden mRNS gemessen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem die mRNS-Menge mittels quantitativer PCR gemessen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Droge eine Sulfonamidverbindung ist, die durch die allgemeine Formel (I) repräsentiert wird:
in der B einen C6-C10-Arylring oder einen 6-10-gliedrigen Heteroarylring darstellt, die jeweils substituiert und teilweise gesättigt sein können; K eine Einfachbindung darstellt, -CH=CH- oder -(CR^4bR^5b)_m ^b-, wobei R^4b und R^5b gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder C1-C4-Alkyl darstellen und m^b eine ganze Zahl 1 oder 2 ist, R¹ ein Wasserstoffatom oder C1-C6-Alkyl darstellt, Z eine Einfachbindung oder -CO-NH- darstellt, und R einen C6-C10-Arylring oder einen 6-10-gliedrigen Heteroarylring darstellt, die jeweils substituiert und teilweise gesättigt sein können, oder ein pharmazeutisch verwendbares Salz davon oder ein Hydrat davon ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem R Indol, Chinolin oder Isochinolin darstellt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Droge eine durch die allgemeine Formel (I^a) repräsentierte Sulfonamidverbindung ist
in der A^a einen monozyklischen oder bizyklischen Ring darstellt, der substituiert sein kann, B^a einen 6-gliedrigen ungesättigten Kohlenwasserstoffring oder einen ungesättigten 6-gliedrigen Heterozyklus darstellt, der als Heteroatom ein Stickstoffatom enthält, wobei jeder substituiert sein kann; C^a stellt einen 5-gliedrigen Heterozyklus darstellt, der ein oder zwei Stickstoffatome enthält, und der substituiert sein kann, R^1a ein Wasserstoffatom oder C1-C6-Alkyl darstellt, W^a eine Einfachbindung oder -CH=CH- darstellt Y^a ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom darstellt, Z^a -N(R^2a)- darstellt, wobei R^2a ein Wasserstoffatom oder C1-C6-Alkyl oder ein Stickstoffatom darstellt, oder ein pharmakologisch verwendbares Salz davon oder ein Hydrat davon ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem W^a eine Einfachbindung darstellt.
Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem W^a eine Einfachbindung darstellt, Z^a -NH- darstellt und Y^a ein Kohlenstoffatom darstellt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, bei dem B^a Benzol oder Pyridin darstellt, die substituiert sein können.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, bei dem C^a Pyrrol darstellt, das substituiert sein kann.
Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem A^a Benzol oder Pyridin darstellt, die substituiert sein können, B^a Benzol darstellt, das substituiert sein kann, C^a Pyrrol darstellt, das substituiert sein kann, W^a eine Einfachbindung darstellt und Z^a -NH- darstellt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Droge eine durch die allgemeine Formel (I^b) repräsentierte heterozyklische, Sulfonamid enthaltende Verbindung ist
wobei A^b ein Wasserstoffatom, Halogenatom, Hydroxyl, C1-C4-Alkyl oder -Alkoxi, die mit einem Halogenatom substituiert sein können, Cyano, -(CO)_k ^bNR^2bR^3b wobei R^2b und R^3b gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder C1-C4-Alkyl, das mit einem Halogenatom substituiert sein kann, und k^b 0 oder 1 ist, C2-C4-Alkenyl oder- Alkinyl, die substituiert sein können, oder Phenyl oder Phenoxi, die einen aus der unten genannten Gruppe A ausgewählten Substituenten haben können, darstellt; B^b Aryl oder monozyklisches Heteroaryl darstellt, die einen aus der unten genannten Gruppe A ausgewählten Substituenten haben können, oder
wobei Q^b einen aromatischen Ring darstellt, der ein oder zwei Stickstoffatome haben kann; M^b einen C5-C12 ungesättigten monozyklischen oder polyzyklischen Ring darstellt, der eine Doppelbindung mit Q^b teilt und der ein bis vier Heteroatome haben kann, die aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefelatom ausgewählt sind, Q^b und M^b können ein Stickstoffatom teilen und Q^b und M^b können einen aus der unten genannten Gruppe A ausgewählten Substituenten haben, K^b eine Einfachbindung oder -(CR^4bR^5b)m^b- darstellt, wobei R^4b und R^5b gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder C1-C4-Alkyl darstellen, und m^b eine ganze Zahl 1 oder 2 ist, T^b, W^b, X^b und Y^b gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils =C(D^b)- darstellen, wobei D^b ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, Hydroxyl, C1-C4-Alkyl oder -Alkoxi, die mit einem Halogenatom substituiert sein können, Cyano, -(CO)_n ^bNR^6bR^7b, wobei R^6b und R^7b gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder C1-C4-Alkyl, das mit einem Halogenatom substituiert sein kann, und n^b 0 oder ist, oder C2-C4-Alkenyl oder -Alkinyl, die substituiert sein können, oder ein Stickstoffatom darstellt; U^b und V^b gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils =(CD^b)- darstellen, wobei D^b die selbe Bedeutung hat, wie oben definiert, ein Stickstoffatom, -CH₂- ein Sauerstoffatom oder -CO-; Z^b eine Einfachbindung oder -CO-NH- darstellt, R^1b ein Halogenatom oder C1-C4-Alkyl darstellt, ---- eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung darstellt: Gruppe A: Halogenatom, Hydroxyl, C1-C4-Alkyl oder -Alkoxi, die mit einem Halogenatom substituiert sein können, Cyano -R^8bR^9bN(NH)_pb-, wobei R^8b und R^9b gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder C1-C4-Alkyl, das mit einem Halogenatom substituiert sein kann, darstellen, und p^b 0 oder 1 ist, und R^8b und R^9b zusammen mit einem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden können, und dieser Ring kann zusätzlich ein Stickstoffatom, Sauerstoffatom oder Schwefelatom enthalten und kann substituiert sein; Aminosulfonyl, das mit Mono- oder Di-(C1-C4-Alkyl) substituiert sein kann, C1-C8-Acyl, das substituiert sein kann, (C1-C4-Alkyl)-S(O)_s ^b-(C1-C4-Alkylen), wobei s^b eine ganze Zahl 0, 1 oder 2 ist, C1-C4-Alkyl oder Phenylsulfonylamino, die substituiert sein können, (CO)_q ^bNR^10bR^11b, wobei R^10b und R^11b gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder C1-C4-Alkyl darstellen, das mit einem Halogenatom substituiert sein kann, oder Amino, das mit C1-C4-Alkyl substituiert sein kann, und q^b ist 0 oder 1, oder Aryl oder Heteroaryl, die substituiert sein können, oder ein pharmazeutisch verwendbares Salz davon oder ein Hydrat davon ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei U^b und V^b jeweils =(CD^b)-, wobei D^b dieselbe Bedeutung hat, wie oben definiert, oder ein Stickstoffatom, darstellen.
Verfahren gemäß Anspruch 14 oder 15, wobei Z^b eine Einfachbindung darstellt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei mindestens einer unter T^b, U^b, V^b, W^b, X^b und Y^b ein Stickstoffatom darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, bei dem A^b ein Halogenatom, C1-C4-Alkyl oder -Alkoxi, die mit einem Halogenatom substituiert sein können, Cyano, -(CO)_r ^bNR^12bR^13b, wobei R^12b und R^13b gleich oder unterschiedlich sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder C1-C4-Alkyl, die mit einem Halogenatom substituiert sein können, darstellen, und r^b 0 oder 1 ist, oder C2-C4-Alkenyl oder -Alkinyl, die mit einem Halogenatom substituiert sein können, darstellt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei lediglich einer unter T^b, U^b, V^b, W^b, X^b und Y^b ein Stickstoffatom darstellt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, wobei lediglich einer unter T^b, W^b, X^b und Y^b ein Stickstoffatom darstellt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die von Blutplättchen verschiedenen Zellen Zellen eines Gewebes sind, in dem Angiogenese auftreten kann, und die Inhibierung der Integrin-Expression als Angiogenese-Inhibierungswirkung bestimmt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die von Blutplättchen verschiedenen Zellen Tumorzellen sind, und die Inhibierung der Integrin-Expression als Inhibierungswirkung des Tumorwachstums bestimmt wird.