DE60213798T2

DE60213798T2 - Carbolinderivate als pdev inhibitoren

Info

Publication number: DE60213798T2
Application number: DE60213798T
Authority: DE
Inventors: W. Mark Seattle ORME; SCOTT Jason Indianapolis SAWYER; Claude-Marie GlaxoSmithKline Alain DAUGAN; Agnes Bombrun; Francoise GlaxoSmithKline GELLIBERT; M. Lisa Woodinville SCHULTZE; F. Raymond Fishers BROWN; Luc Romain GOSMINI
Original assignee: Lilly Icos LLC
Current assignee: Lilly Icos LLC
Priority date: 2001-06-21
Filing date: 2002-05-02
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2022-05-03
Also published as: ES2269679T3; MXPA03011167A; DE60213798D1; CA2445189A1; WO2003000691A1; ATE335742T1; US20040171830A1; EP1397361B1; JP2005500316A; US6984641B2; EP1397361A1; JP4339679B2; CA2445189C

Description

GEBIET UND HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft eine Reihe von Verbindungen, Verfahren zur Herstellung der Verbindungen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Verbindungen enthalten, und ihre Verwendung als therapeutische Mittel. Insbesondere betrifft die Erfindung Verbindungen, die potente und selektive Inhibitoren von für cyclisches Guanosin-3',5'-monophosphat spezifischer Phosphodiesterase (cGMP-spezifischer PDE), insbesondere PDE5, sind und Nützlichkeit in einer Vielzahl von therapeutischen Bereichen haben, in denen eine solche Hemmung als günstig angesehen wird, einschließlich der Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen und erektiler Dysfunktion.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf zahlreiche β-Carbolinverbindungen gerichtet, die potente und selektive Inhibitoren von PDE5 sind. Zusätzlich können spezifisch hierin offenbarte Verbindungen zusätzliche fakultative Substituenten enthalten.
Zum Beispiel kann die „Alkyl"-Gruppe, zusätzlich zu hierin offenbarten Alkyl-Substituenten, geradkettige und verzweigte Kohlenwasserstoffgruppen sein, die die angegebene Anzahl von Kohlenstoffatomen enthalten, typischerweise Methyl-, Ethyl- und geradkettige und verzweigte Propyl- und Butylgruppen. Die Kohlenwasserstoffgruppe kann bis zu 16 Kohlenstoffatome enthalten. Der Begriff „Alkyl" schließt „überbrücktes Alkyl" ein, d.h. eine bicyclische oder polycyclische Kohlenwasserstoffgruppe, zum Beispiel Norbornyl, Adamantyl, Bicyclo[2.2.2]octyl, Bicyclo[2.2.1]heptyl, Bicyclo[3.2.1]octyl oder Decahydronaphthyl, und „Cycloalkyl", d.h. eine cyclische C₃-C₈-Kohlenwasserstoffgruppe, z.B. Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclohexyl und Cyclopentyl.
In ähnlicher Weise kann eine offenbarte „Aryl"-Gruppe unsubstituiert oder zum Beispiel mit einem oder mehreren, und insbesondere einem bis drei, Halo, Alkyl, Hydroxy, Hydroxyalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Haloalkyl, Nitro, Amino, Alkylamino, Acylamino, Alkylthio, Alkylsulfinyl und Alkylsulfonyl substituiert sein. Beispiele für zusätzliche Arylgruppen schließen Naphthyl, Tetrahydronaphthyl, 2-Chlorphenyl, 3-Chlorphenyl, 4-Chlorphenyl, 2-Methylphenyl, 4-Methoxyphenyl, 3-Trifluormethylphenyl, 4-Nitrophenyl und dergleichen ein.
Eine offenbarte „Aryl"-Gruppe kann auch eine „Heteroaryl"-Gruppe sein, unsubstituiert oder zum Beispiel mit einem oder mehreren, und insbesondere einem bis drei, Substituenten substituiert, wie Halo, Alkyl, Hydroxy, Hydroxyalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Haloalkyl, Nitro, Amino, Alkylamino, Acylamino, Alkylthio, Alkylsulfinyl und Alkylsulfonyl. Beispiele für Heteroarylgruppen schließen Thienyl, Furyl, Pyridyl, Oxazolyl, Chinolyl, Isochinolyl, Indolyl, Triazolyl, Isothiazolyl, Isooxazolyl, Imidazolyl, Benzothiazolyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Thiazolyl und Thiadiazolyl ein und ähnliche monocyclische und bicyclische Ringsysteme, die ein oder zwei aromatische Ringe enthalten und wenigstens ein Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatom in einem aromatischen Ring enthalten.
Ein offenbarter aliphatischer Heterocyclus kann ein Heterocyclus sein, bezeichnet als „Het", der definiert ist als monocyclische, bicyclische und tricyclische Gruppen, die ein oder mehrere Heteroatome enthalten, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel besteht, fakultativ eine Oxogruppe (=O) enthaltend, die an den Ring gebunden ist. Nicht-beschränkende Beispiele für Het-Gruppen schließen 1,3-Dioxolan, 2- Pyrazolin, Pyrazolidin, Pyrrolidin, Piperazin, ein Pyrrolin, 2H-Pyran, 4H-Pyran, Morpholin, Thiopholin, Piperidin, 1,4-Dithian und 1,4-Dioxan ein.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere asymmetrische Zentren enthalten und können daher als Stereoisomere vorkommen. Die vorliegende Erfindung schließt sowohl Mischungen als auch separate individuelle Stereoisomere der Verbindungen der vorliegenden Erfindung ein. Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in tautomeren Formen vorkommen und die Erfindung schließt sowohl Mischungen als auch separate individuelle Tautomere derselben ein.
Pharmazeutisch annehmbare Salze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können Säureadditionssalze sein, die mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren gebildet werden. Beispiele für geeignete Salze schließen die Hydrochlorid-, Hydrobromid-, Sulfat-, Bisulfat-, Phosphat-, Hydrogenphosphat-, Acetat-, Benzoat-, Succinat-, Fumarat-, Maleat-, Lactat-, Citrat-, Tartrat-, Gluconat-, Methansulfonat-, Benzolsulfonat- und p-Toluolsulfonatsalze ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch pharmazeutisch annehmbare Metallsalze, insbesondere Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze, mit Basen bereitstellen. Beispiele schließen die Natrium-, Kalium-, Magnesium- und Calciumsalze ein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung bereitgestellt, ausgewählt aus:
Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind potente und selektive Inhibitoren von cGMP-spezifischer PDE5. Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind von Interesse zur Verwendung in der Therapie, spezifisch zur Behandlung einer Vielzahl von Zuständen, bei denen selektive Hemmung von PDE5 als günstig angesehen wird.
Phosphodiesterasen (PDEs) katalysieren die Hydrolyse von cyclischen Nukleotiden, wie etwa cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) und cyclischem Guanosinmonophosphat (cGMP). Die PDEs sind in wenigstens sieben Isoenzym-Familien einklassifiziert worden und sind in vielen Geweben vorhanden (J. A. Beavo, Physiol. Rev., 75, S. 725 (1995)).
PDE5-Inhibition ist ein besonders attraktives Ziel. Ein potenter und selektiver Inhibitor von PDE5 liefert gefäßerweiternde, entspannende und diuretische Wirkungen, die alle bei der Behandlung verschiedene Erkrankungszustände günstig sind. Forschung in diesem Bereich hat zu mehreren Klassen von Inhibitoren geführt, die auf der cGMP-Basisstruktur beruhen (E. Sybertz et al., Expert. Opin. Ther. Pat., 7, S. 631 (1997)).
WO-A-0015639 offenbart Carbolin-Derivate als c-GMP-Phosphodiesterase-Inhibitoren.
WO-A-9743287 offenbart Carbolin-Derivate.
WO-A-9703985 offenbart Inhibitoren von für cyclisches GMP spezifischer Phosphodiesterase.
WO-A-9519978 offenbart tetracyclische Derivate.
US-A-6143746 offenbart tetracyclische Inhibitoren von für cyclisches GMP spezifischer Phosphodiesterase.
Die biochemischen, physiologischen und klinischen Wirkungen von PDE5-Inhibitoren legen daher deren Nützlichkeit bei einer Vielzahl von Erkrankungszuständen nahe, bei denen die Modulation von Glattmuskel-, Nieren-, Hämostase-, Entzündungs- und/oder endokriner Funktion wünschenswert ist. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind daher nützlich bei der Behandlung einer Reihe von Erkrankungen, einschließlich stabiler, instabiler und varianter (Prinzmetal) Angina, Bluthochdruck, pulmonalem Hochdruck, kongestivem Herzversagen, akutem Atemnotsyndrom, akutem und chronischem Nierenversagen, Atherosklerose, Zuständen verringerter Blutgefäßdurchlässigkeit (z.B. postperkutane transluminale Koronar- oder Carotidangioplastie oder Transplantatstenose nach Bypassoperation), peripherer Gefäßerkrankung, Gefäßstörungen, wie etwa Raynaud-Krankheit, Thrombocythämie, entzündlicher Erkrankungen, Schlaganfall, Bronchitis, chronischem Asthma, allergischem Asthma, allergischer Rhinitis, Glaucom, Osteoporose, Frühgeburt, gutartiger Prostatahypertrophie, peptischem Ulcus, männlicher erektiler Dysfunktion, weiblicher sexueller Dysfunktion und Erkrankungen, die durch Störungen der Darmbeweglichkeit gekennzeichnet sind (z.B. Reizdarmsyndrom).
Eine besonders wichtige Verwendung ist die Behandlung von männlicher erektiler Dysfunktion, die eine Form von Impotenz ist und ein häufiges medizinisches Problem ist. Impotenz kann definiert werden als das Fehlen der Kraft, beim Mann, zu kopulieren und kann eine Unfähigkeit umfassen, Peniserektion oder Ejakulation oder beides zu erreichen. Das Auftreten erektiler Dysfunktion steigt im Alter an, wobei etwa 50% der Männer über 40 an einem bestimmten Grad an erektiler Dysfunktion leiden.
Zusätzlich ist eine weitere wichtige Verwendung die Behandlung weiblicher sexueller Erregungsstörung. Weibliche sexuelle Erregungsstörungen sind definiert als eine wiederkehrende Unfähigkeit, eine angemessene Gleit-/Anschwellreaktion sexueller Erregung bis zum Abschluß der sexuellen Aktivität zu erreichen oder zu halten. Die Erregungsreaktion besteht aus Vasokongestion in der Scheide, Scheidenschmierung und Expansion und Anschwellen der äußeren Genitalien.
Man glaubt daher, daß Verbindungen der vorliegenden Erfindung nützlich sind bei der Behandlung männlicher erektiler Dysfunktion und weiblicher sexueller Erregungsstörung. Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung, oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon, oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine der beiden Einheiten enthält, zur Herstellung eines Arzneimittels zur kurativen oder prophylaktischen Behandlung erektiler Dysfunktion in einem männlichen Tier und Erregungsstörung in einem weiblichen Tier, einschließlich Menschen.
Der Begriff „Behandlung" schließt Verhindern, Vermindern, Anhalten oder Umkehren des Fortschreitens oder der Schwere des Zustands oder der Symptome, der/die behandelt werden soll/sollen, ein. Als solcher schließt der Begriff „Behandlung" sowohl medizinische therapeutische und/oder prophylaktische Verabreichung, wie geeignet, ein.
Man sollte auch verstehen, daß „eine Verbindung der vorliegenden Erfindung", oder ein physiologisch annehmbares Salz oder Solvat davon, als die reine Verbindung oder als eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine der Einheiten enthält, verabreicht werden kann.
Obgleich die Verbindungen der Erfindung primär für die Behandlung sexueller Dysfunktion bei Menschen in Betracht gezogen werden, wie etwa männlicher erektiler Dysfunktion und weiblicher Erregungsstörung, können sie auch zur Behandlung anderer Erkrankungszustände verwendet werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei der Behandlung von stabiler, instabiler und varianter (Prinzmetal) Angina, Bluthochdruck, pulmonalem Hochdruck, chronischer obstruktiver Lungenerkrankung, malignem Hochdruck, Phäochromocytom, kongestivem Herzversagen, akutem Atemnotsyndrom, akutem und chronischem Nierenversagen, Atherosklerose, Zuständen verringerter Blutgefäßdurchlässigkeit (z.B. post-PTCA oder Transplantatstenose nach Bypassoperation), peripherer Gefäßerkrankung, Gefäßstörungen, wie etwa Raynaud-Krankheit, Thrombocythämie, entzündlichen Erkrankungen, Prophylaxe von Myocardinfarkt, Prophylaxe von Schlaganfall, Schlaganfall, Bronchitis, chronischem Asthma, allergischem Asthma, allergischer Rhinitis, Glaucom, Osteoporose, peptischem Ulcus, postperkutaner transluminaler Koronarangioplastie, Carotidangioplastie, Frühgeburt, gutartiger Prostatahypertrophie, männlicher und weiblicher erektiler Dysfunktion oder Erkrankungen, die durch Störungen der Darmbeweglichkeit gekennzeichnet sind (z.B. IBS).
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der obengenannten Zustände und Störungen bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung der obengenannten Zustände und Störungen in einem menschlichen oder nicht-menschlichen tierischen Körper bereit, welches die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung an besagten Körper umfaßt.
Verbindungen der Erfindung können über jeden geeigneten Weg verabreicht werden, zum Beispiel durch orale, bukkale, Inhalations-, sublinguale, rektale, vaginale, transurethrale, nasale, topische, perkutane, d.h. transdermale, oder parenterale (einschließlich intravenöser, intramuskulärer, subkutaner und intrakoronarer) Verabreichung. Parenterale Verabreichung kann unter Verwendung einer Nadel und Spritze oder unter Verwendung einer Hochdrucktechnik, wie POWDERJECT^®, durchgeführt werden.
Orale Verabreichung einer Verbindung der Erfindung ist der bevorzugte Weg. Orale Verabreichung ist am bequemsten und vermeidet die Nachteile, die mit anderen Verabreichungswegen verbunden sind. Für Patienten, die an einer Schluckstörung oder an Beeinträchtigung der Wirkstoffabsorption nach oraler Verabreichung leiden, kann der Wirkstoff parenteral, z.B. sublingual oder bukkal, verabreicht werden.
Verbindungen und pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen diejenigen ein, bei denen der aktive Inhaltsstoff in einer wirksamen Menge verabreicht wird, um seinen beabsichtigten Zweck zu erreichen. Genauer gesagt bedeutet eine „therapeutisch wirksame Menge" eine Menge, die darin wirksam ist, die Entwicklung der existierenden Symptome der zu behandelnden Person zu verhindern oder diese Symptome zu lindern. Die Bestimmung der wirksamen Mengen liegt innerhalb der Fähigkeiten der Fachleute, insbesondere im Lichte der hierin bereitgestellten detaillierten Offenbarung.
Eine „therapeutisch wirksame Dosis" bezieht sich auf diejenige Menge der Verbindung, die dazu führt, die gewünschte Wirkung zu erzielen. Toxizität und therapeutische Wirksamkeit solcher Verbindungen können mit pharmazeutischen Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, z.B. zur Bestimmung der LD₅₀ (der Dosis, die für 50% der Population letal ist) und der ED₅₀ (der Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist). Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index, der als das Verhältnis zwischen LD₅₀ und ED₅₀ ausgedrückt wird. Verbindungen, die hohe therapeutische Indizes zeigen, sind bevorzugt. Die aus solchen Daten erhaltenen Daten können verwendet werden bei der Formulierung eines Dosierungsbereichs zur Verwendung bei Menschen. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereiches von zirkulierenden Konzentrationen, die die ED₅₀ mit wenig oder keiner Toxizität einschließen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs in Abhängigkeit von der eingesetzten Dosierungsform und dem verwendeten Verabreichungsweg variieren.
Die exakte Formulierung, der Verabreichungsweg und die Dosierung können vom einzelnen Arzt angesichts des Zustandes des Patienten ausgewählt werden. Dosierungsmenge und -intervall können individuell eingestellt werden, um Plasmaspiegel der aktiven Einheit zu liefern, die ausreichend sind, um die therapeutischen Wirkungen aufrechtzuerhalten.
Die verabreichte Menge an Zusammensetzung hängt ab von der zu behandelnden Person, vom Gewicht der Person, von der Schwere des Leidens, der Art der Verabreichung und der Beurteilung des verschreibenden Arztes.
Genauer liegen orale Dosierungen einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, zur Verabreichung an einen Menschen bei der kurativen und prophylaktischen Behandlung der oben identifizierten Zustände und Störungen, bei etwa 0,5 bis etwa 1000 mg täglich für einen durchschnittlichen erwachsenen Patienten (70 kg). Somit enthalten einzelne Tabletten oder Kapseln, für einen typischen erwachsenen Patienten, 0,2 bis 500 mg aktive Verbindung, in einem geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Vehikel oder Trägerstoff zur Verabreichung in einzelnen oder mehreren Dosen, einmal oder mehrmals pro Tag. Dosierungen für intravenöse, bukkale oder sublinguale Verabreichung liegen typischerweise bei 0,1 bis 500 mg pro Einzeldosis, nach Erfordernis. In der Praxis bestimmt der Arzt das aktuelle Dosierungsregime, das für einen individuellen Patienten am geeignetsten ist, und die Dosierung variiert mit dem Alter, dem Gewicht und der Reaktion des bestimmten Patienten. Die obigen Dosierungen sind beispielhaft für den durchschnittlichen Fall, es kann aber individuelle Fälle geben, in denen höhere oder niedrigere Dosierungen angebracht sind, und solche liegen innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung.
Für die menschliche Verwendung kann eine Verbindung der vorliegenden Erfindung allein verabreicht werden, wird aber im allgemeinen in Vermischung mit einem pharmazeutischen Trägerstoff verabreicht, der im Hinblick auf den beabsichtigten Verabreichungsweg und die pharmazeutische Standardpraxis ausgewählt wird. Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können somit in einer herkömmlichen Art und Weise unter Verwendung eines oder mehrerer physiologisch annehmbarer Trägerstoffe formuliert werden, die Füllstoffe und Hilfsstoffe umfassen, die die Verarbeitung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu Zubereitungen erleichtern, die pharmazeutisch verwendet werden können.
Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf eine herkömmliche Art und Weise hergestellt werden, z.B. mit herkömmlichen Misch-, Lösungs-, Granulier-, Drageeherstellungs-, Zerreib-, Emulgier-, Einkapselungs-, Einschließungs- oder Lyophilisierungsverfahren. Die richtige Formulierung hängt vom ausgewählten Verabreichungsweg ab. Wenn eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung oral verabreicht wird, liegt die Zusammensetzung typischerweise in Form einer/eines Tablette, Kapsel, Pulvers, Lösung oder Elixiers vor. Wenn sie in Tablettenform verabreicht wird, kann die Zusammensetzung zusätzlich einen festen Trägerstoff enthalten, wie etwa eine Gelatine oder ein Adjuvans. Die Tablette, die Kapsel und das Pulver enthalten etwa 5% bis etwa 95% Verbindung der vorliegenden Erfindung und vorzugsweise von etwa 25% bis etwa 90% Verbindung der vorliegenden Erfindung. Wenn sie in flüssiger Form verabreicht wird, kann ein flüssiger Trägerstoff zugesetzt werden, wie etwa Wasser, Petroleum oder Öle tierischen oder pflanzlichen Ursprungs. Die flüssige Form der Zusammensetzung kann weiter physiologische Kochsalzlösung, Dextrose- oder andere Saccharidlösungen oder Glykole enthalten. Wenn sie in flüssiger Form verabreicht wird, enthält die Zusammensetzung etwa 0,5 bis etwa 90 Gew.-% einer Verbindung der vorliegenden Erfindung und vorzugsweise etwa 1% bis etwa 50% einer Verbindung der vorliegenden Erfindung.
Wenn eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung durch intravenöse, kutane oder subkutane Injektion verabreicht wird, liegt die Zusammensetzung in Form einer pyrogenfreien, parenteral annehmbaren wäßrigen Lösung vor. Die Herstellung solcher parenteral annehmbaren Lösungen, die pH, Isotonizität, Stabilität und dergleichen angemessen berücksichtigt, liegt innerhalb des Fachwissens. Eine bevorzugte Zusammensetzung zur intravenösen, kutanen oder subkutanen Injektion enthält typischerweise, zusätzlich zu einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, ein isotonisches Vehikel.
Für orale Verabreichung können die Verbindungen leicht formuliert werden, indem eine Verbindung der vorliegenden Erfindung mit aus dem Stand der Technik gut bekannten pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoffen zusammengebracht wird. Solche Trägerstoffe ermöglichen, die vorliegenden Verbindungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gels, Sirupe, Aufschlämmungen, Suspensionen und dergleichen zur oralen Aufnahme durch einen zu behandelnden Patienten zu formulieren. Pharmazeutische Zubereitungen für orale Verwendung können erhalten werden, indem eine Verbindung der vorliegenden Erfindung mit einem festen Füllstoff zugegeben wird, fakultativ eine resultierende Mischung vermahlen wird und die Mischung von Granülen, nach Zugabe geeigneter Hilfsstoffe, falls gewünscht, verarbeitet wird, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Füllstoffe schließen zum Beispiel Füller und Cellulosezubereitungen ein. Falls gewünscht können Desintegrationsmittel zugesetzt werden.
Für Verabreichung durch Inhalation werden Verbindungen der vorliegenden Verbindung geeigneterweise in Form einer Aerosolspraypräsentation aus unter Druck stehenden Packungen oder einem Vernebelungsgerät unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels zugeführt. Im Falle eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellen eines Ventils, um eine abgemessene Menge zuzuführen, bestimmt werden. Kapseln und Patronen, z.B. Gelatine, zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können formuliert werden, die ein Pulvergemisch aus der Verbindung und einer geeigneten Pulverbasis, wie etwa Lactose oder Stärke, enthalten.
Die Verbindungen können für parenterale Verabreichung durch Injektion, z.B. durch Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion, formuliert werden. Formulierungen für Injektion können in Dosiseinheitsform, z.B. in Ampullen, oder in Mehrfachdosisbehältern, mit einem zusätzlichen Konservierungsstoff, präsentiert werden. Die Zusammensetzungen können solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Vehikeln annehmen und können Formulationshilfsstoffe, wie etwa Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispergiermittel enthalten.
Pharmazeutische Formulierungen für parenterale Verabreichung schließen wäßrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form ein. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösemittel oder Vehikel schließen Fettöle oder synthetische Fettsäureester ein. Wäßrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen. Fakultativ kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen und die Herstellung hochkonzentrierter Lösungen ermöglichen, enthalten. Alternativ kann eine vorliegende Zusammensetzung in Pulverform für Konstitution mit einem geeigneten Vehikel, z.B. sterilem pyrogenfreien Wasser, vor Gebrauch vorliegen.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in rektalen Zusammensetzungen formuliert werden, wie etwa Suppositorien oder Retentionseinläufe, die z.B. herkömmliche Suppositoriengrundstoffe enthalten. Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als eine Depotzubereitung formuliert werden. Solche langwirkenden Formulierungen können durch Implantation (zum Beispiel subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. So können die Verbindungen zum Beispiel mit geeigneten Polymeren oder hydrophoben Materialien (zum Beispiel als eine Emulsion in einem annehmbaren Öl) oder Ionenaustauschharzen oder als kaum lösliche Derivate, zum Beispiel als ein kaum lösliches Salz, formuliert werden.
Viele der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können als Salze mit pharmazeutisch kompatiblen Gegenionen bereitgestellt werden. Solche pharmazeutisch annehmbaren Basenadditionssalze sind diejenigen Salze, die die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der freien Säuren beibehalten und die durch Reaktion mit geeigneten anorganischen oder organischen Basen erhalten werden.
Insbesondere kann eine Verbindung der vorliegenden Erfindung oral, bukkal oder sublingual in Form von Tabletten, die Füllstoffe, wie etwa Stärke oder Lactose, enthalten, oder in Kapseln oder Ovuli, entweder allein oder in Vermischung mit Füllstoffen, oder in Form von Elixieren oder Suspensionen, die Geschmacksstoffe oder Färbemittel enthalten, verabreicht werden. Solche flüssigen Zubereitungen können mit pharmazeutisch annehmbaren Zusatzstoffen, wie etwa Suspensionsmitteln, hergestellt werden. Eine Verbindung kann auch parenteral injiziert werden, zum Beispiel intravenös, intramuskulär, subkutan oder intrakoronar. Für parenterale Verabreichung wird die Verbindung am besten in Form einer sterilen wäßrigen Lösung verwendet, die weitere Substanzen enthalten kann, zum Beispiel Salze oder Monosaccharide, wie etwa Mannitol oder Glucose, um die Lösung mit Blut isotonisch zu machen.
Für Veterinärgebrauch wird eine Verbindung der vorliegenden Erfindung oder ein ungiftiges Salz davon als eine geeignet annehmbare Formulierung gemäß normaler tierärztlicher Praxis verabreicht. Der Tierarzt kann das Dosierungsregime und den Verabreichungsweg, das/der für ein bestimmtes Tier am geeignetsten ist, leicht bestimmen.
So stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine Verbindung der vorliegenden Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsstoff oder Trägerstoff dafür umfaßt. Durch die vorliegende Erfindung wird weiter ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt, die eine Verbindung der vorliegenden Erfindung umfaßt, wobei das Verfahren umfaßt, daß eine Verbindung der vorliegenden Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsstoff oder Trägerstoff dafür vermischt wird.
In einer besonderen Ausführungsform schließt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur kurativen oder prophylaktischen Behandlung erektiler Dysfunktion in einem männlichem Tier oder Erregungsstörung in einem weiblichem Tier, einschließlich Menschen, ein, die eine Verbindung der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsstoff oder Trägerstoff umfaßt.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können mit jeder im Stand der Technik bekannten Methode oder mit den folgenden Verfahren, die einen Teil der vorliegenden Erfindung bilden, hergestellt werden. Insbesondere können Verbindungen der vorliegenden Erfindung gemäß den Syntheseschemata hergestellt werden, die in den folgenden Beispielen veranschaulicht sind.
Man sollte verstehen, daß Schutzgruppen gemäß allgemeinen Prinzipien der synthetischen organischen Chemie eingesetzt werden können, um Verbindungen der vorliegenden Erfindung bereitzustellen. Schutzgruppenbildende Reagentien, wie Benzylchlorformiat und Trichlorethylchlorformiat, sind den Fachleuten gut bekannt, siehe zum Bespiel T. W. Greene et al., „Protective Groups in Organic Synthesis, Third Edition", John Wiley and Sons, Inc., NY, NY (1999). Diese Schutzgruppen werden, wenn erforderlich, durch geeignete basische, saure oder hydrogenolytische Bedingungen, die den Fachleuten bekannt sind, abgespalten. Demgemäß können Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die hierin nicht spezifisch exemplifiziert sind, von Fachleuten hergestellt werden.
Zusätzlich können Verbindungen der vorliegenden Erfindung in andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung umgewandelt werden. So kann zum Beispiel ein bestimmter Substituent interkonvertiert werden, um eine weitere substituierte Verbindung der vorliegenden Erfindung herzustellen. Beispiele für geeignete Interkonversionen schließen OR^a zu Hydroxy mit geeigneten Mitteln (z.B. unter Verwendung eines Reduktionsmittels, wie etwa SnCl₂, oder eines Palladium-Katalysators, wie Palladium-auf-Kohlenstoff) oder Amino zu substituiertem Amino, wie etwa Acylamino oder Sulfonylamino, unter Verwendung von standardmäßigen Acylierungs- oder Sulfonylierungsbedingungen ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können als individuelle Stereoisomere oder als eine razemische Mischung hergestellt werden. Individuelle Stereoisomere der Verbindungen der Erfindung können aus Razematen durch Trennung unter Verwendung von im Stand der Technik für die Trennung razemischer Mischungen in deren konstituierende Stereoisomere bekannten Methoden hergestellt werden, zum Beispiel durch Verwendung von HPLC auf einer chiralen Säure, wie etwa Hypersil-Naphthylharnstoff, oder unter Verwendung der Trennung von Salzen von Stereoisomeren. Verbindungen der Erfindung können in Assoziation mit Lösemittelmolekülen durch Kristallisation aus, oder Verdampfung von, einem geeigneten Lösemittel isoliert werden.
Die pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionsalze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die ein basisches Zentrum enthalten, können auf eine herkömmliche Art und Weise hergestellt werden. Zum Beispiel kann eine Lösung der freien Base mit einer geeigneten Säure, entweder rein oder in einer geeigneten Lösung, behandelt und das resultierende Salz entweder durch Filtration oder durch Verdampfung des Reaktionslösemittels unter Vakuum isoliert werden. Pharmazeutisch annehmbare Basenadditionssalze können in einer analogen Art und Weise durch Behandeln einer Lösung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung mit einer geeigneten Base erhalten werden. Beide Arten von Salz können unter Verwendung von Ionenaustauschharztechniken gebildet oder interkonvertiert werden. So wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung oder eines Salzes oder Solvates (z.B. Hydrates) bereitgestellt, gefolgt von (i) Salzbildung oder (ii) Solvatbildung (z.B. Hydratbildung).
Viele der folgenden Beispiele wurden aus der Verbindung von Strukturformel (I), d.h. 1-Benzo[1,3]dioxol-5-yl-2,3,4,9-tetrahydro-1H-β-carbolin, hergestellt. Die Synthese von Verbindung (I) ist offenbart in U.S.-Patent Nr. 6,117,881 (Bombrun), das hierin durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit miteinbezogen ist. Weitere Beispiele wurden aus der Verbindung von Strukturformel (II) hergestellt. Die Synthese von Verbindung (II) ist offenbart in U.S.-Patent Nr. 5,859,006 (Daugan), das hierin durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit miteinbezogen ist. Verbindungen, die analog sind zu Verbindungen (I) und (II), aber unterschiedliche Substituentengruppen aufweisen, können in einer identischen oder ähnlichen Art und Weise wie Verbindung (I) und (II) durch Einsetzen geeigneter Ausgangsmaterialien synthetisiert werden.
Beispiel 1 (5aR,10R)-10-Benzo[1,3]dioxol-5-yl-7,8-dimethyl-5,5a,8,9,10,11-hexahydro-7H-7,8,9a,11-tetraazabenzo[b]fluoren-6-on
Beispiel 1 wurde hergestellt aus Verbindung (II) unter Verwendung der folgenden Synthesesequenz. Im allgemeinen wurde das Carbamat-Zwischenprodukt 1 an der C₄-Position durch überschüssiges Hydrazin unter thermischen Reaktionsbedingungen reduziert, um Bishydrazin-Zwischenprodukt 2 zu liefern. Die Methode von Winterfield et al. Arch. Pharmaz, 304, S. 216 (1971), wurde verwendet, um die Cyclisierung von Zwischenprodukt 2 zum 2,3,5-Triazin-1-on, Beispiel 1, zu fördern.
Darstellung des cis-β-Carbolincarbamat-Zwischenproduktes 1
Methylchlorformiat (ClCO₂Me, 4,8 ml, 62 mmol) wurde tropfenweise zu einer Suspension von Verbindung (II) (20 g, 53 mmol) und N-Methylmorpholin (NMM, 14,2 ml, 129 mmol) in THF, Tetrahydrofuran, (150 ml) bei 0°C unter einer Stickstoffdecke zugegeben. Die Mischung wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt, dann für 3 Tage gerührt. Die resultierende Mischung wurde mit Ethylacetat (200 ml) verdünnt, mit Salzlösung (150 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösemittel wurde unter verringertem Druck abgezogen, um Zwischenprodukt 1 als einen bernsteinfarbenen Schaum zu liefern (21 g, 96%): TLC R_f (1:9/Ethylacetat/Chloroform) = 0,70. ¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 10,83 (s, 1H), 7,52 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,29 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,09 (t, J = 6,8 Hz, 1H), 7,01 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,67 (s, 1H), 6,54 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 4,2 Hz, 2H), 5,32 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 3,76 (s, 1H), 3,33 (s, 7H), 2,99–2,97 (m, 1H) ppm; API MS m/z 409 [C₂₂H₂₀N₂O₆ + H]⁺.
Darstellung des cis-β-Carbolinbishydrazin-Zwischenproduktes 2
Natriummethoxid (NaOMe, 22 ml, 113 mmol, 30% Lösung in Methanol) wurde tropfenweise zu einer Mischung von Zwischenprodukt 1 (14,0 g, 34 mmol) und 1,2-Dimethylhydrazin-Dihydrochlorid (9,1 g, 69 mmol) in Ethoxyethanol (70 ml) zugegeben, und die Mischung wurde bei Rückfluß unter einer Stickstoffdecke für 15 Stunden erhitzt. Die Suspension wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und die orangen Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration entfernt. Das Filtrat wurde unter verringertem Druck konzentriert, um ein dunkelrotes Öl zu liefern, das durch Flashsäulenchromatographie unter Elution mit Ethylacetat/Chloroform (1:19) gereinigt wurde, um Zwischenprodukt 2 als einen gelben Schaum zu liefern, der ohne weitere Reinigung verwendet wurde (2,62 g, 17%): TLC R_f (1:9 Ethylacetat/Chloroform) = 0,26; API MS m/z 351 [C₂₄H₃₀N₆O₃ + H]⁺.
Darstellung von Beispiel 1
Natriummethoxid (3,2 ml, 17 mmol, 30% Lösung in Methanol) wurde tropfenweise einer Mischung von Zwischenprodukt 2 (2,6 g, 5,6 mmol) und 2-Ethoxyethanol (20 ml) zugegeben, dann wurde die resultierende Mischung bei Rückfluß unter einer Stickstoffdecke für 66 Stunden erhitzt. Die Suspension wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, dann unter verringertem Druck konzentriert, um ein oranges Öl zu liefern, das durch Flashsäulenchromatographie unter Elution mit Ethylacetat/Chloroform (1:19) gereinigt wurde, um das Rohprodukt als einen bernsteinfarbenen Schaum zu liefern. Dieser Rückstand wurde weiter durch eine Aufschlämmung in Wasser/Methanol (3:1), gefolgt von Vakuumfiltration, gereinigt, um Beispiel 1 als ein gelbbraunes Pulver zu liefern (0,192 g, 8%): mp 207–213°C; TLC R_f (1:4 Ethylacetat/Chloroform) = 0,46.
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 10,22 (s, 1H), 7,45 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,19 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,00–6,88 (m, 5H), 6,02 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 4,65 (s, 1H), 3,77 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 3,50–3,46 (m, 2H), 3,34 (s, 6H), 3,22 (d, J = 14,2 Hz, 1H), 2,78–2,70 (m, 1H) ppm; CI MS m/z 391 [C₂₂H₂₂N₄O₃ + H]⁺; [α]_d ^25°C = +10,0° (c = 0,5, Chloroform). Analyse berechnet für C₂₂H₂₂N₄O₃·0,25 H₂O: C, 66,91; H, 5,74; N, 14,19. Gefunden: C, 66,67; H, 5,66; N, 13,79. Es wurde durch mehrere DEPT-Experimente und durch eine Reihe von NOE-Differenzexperimenten bestätigt, daß die relative Stereochemie von Beispiel 1 das gewünschte cis-Isomer war: eine positive NOE-Verstärkung vom C12a-Proton bei 3,77 ppm zum C6-Proton bei 4,65 ppm; eine positive NOE-Verstärkung vom C6-Proton bei 4,65 ppm zum C12a-Proton bei 3,77 ppm. HPLC-Analyse (Aquasil-C18-Säule, 100 × 4,6 mm, Retentionszeit = 12,0 Minuten und 18,3 Minuten; 45% Acetonitril/55% 0,03% TFA in Wasser; Durchfluß = 0,75 ml/Minute; Detektor @ 254 nm; 25°C) zeigte zwei Peaks, 6,0% des trans-Isomers bzw. 94,0% des cis-Isomers, und mit einer Gesamtreinheit von 100%.
Die Verbindungen der Beispiele 2–23 wurden in einer Art und Weise hergestellt, die ähnlich ist zu den Synthesen, die in Beispiel 1 in U.S.-Patent Nr. 5,859,006 und in U.S.-Patent Nr. 6,117,881 beschrieben sind.
Beispiel 2 2-Benzyl-6-(4-methoxyphenyl)-6,7,12,12a-tetrahydropyrazino[1',2':1,6]pyrido[3,4-b]indol-1,3-dion
Beispiel 3 (+–,cis)-10-Benzo[1,3]dioxol-5-yl-5a,6,10,11-tetrahydro-5H-7-oxa-9a,11-diazabenzo[b]fluoren-9-on
Beispiel 4 (+–,cis)-10-(4-Methoxyphenyl)-5a,6,10,11-tetrahydro-5H-7-oxa-9a,11-diazabenzo[b]fluoren-9-on
Beispiel 5 (+–,cis)-6-Benzo[1,3]dioxol-5-yl-11-hydroxy-8-oxa-5,6,8,9,11a,12-hexahydroindolo[3,2-b]-chinolizin-10-carbonsäuremethylester
Beispiel 6 (+–,trans)-6-Benzo[1,3]dioxol-5-yl-5,6,9,10,11a,12-hexahydroindolo[3,2-b]chinolizin-8,11-dion
Beispiel 7 (6R,11aS)-10-Benzo[1,3]dioxol-5-yl-5,5a,10,11-tetrahydro-7-oxa-9a,11-diazabenzo[b]fluoren-6,9-dion
Beispiel 8 6,7,12,12b-Tetrahydro-1H-indolo[2,3-a]-chinolizin-2,4-dion
Beispiel 9
Beispiel 10
Beispiel 11
Beispiel 12
Beispiel 13 14-Methyl-8,13,13b,14-tetrahydro-7H-indolo[2',3':3,4]pyrido[2,1-b]chinazolin-5-on
Beispiel 14 5,13-Dihydro-6H-6a,10,12,13-tetraazaindeno[2,1-a]-anthracen-7-on
Beispiel 15 2-Methoxy-5,7,8,13,13b,14-hexahydroindolo[2',3':3,4]pyrido[1,2-b]isochinolin-3-ol
Beispiel 16 7,8,13,13b-Tetrahydro-5H-5,6a,13-triazaindeno[1,2-c]phenanthren-6-on
Beispiel 17 7-Oxo-5,7,11b,12-tetrahydro-6H-6a,12-diazaindeno[1,2-a]fluoren-3-carbonsäureethylester
Beispiel 18
Beispiel 19 1-(3-Hydroxybenzyl)-2,3,4,9-tetrahydro-1H-β-carbolin-1-carbonsäure
Die Verbindungen der Beispiele 20–23 und ähnliche Verbindungen können aus Verbindung (I) und einer Verbindung (III) hergestellt werden.
worin X OH oder Halo ist. Die Reaktion wird in Gegenwart von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDCI) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) in einem geeigneten organischen Lösemittel, wie etwa Dimethylformamid (DMF) oder Dichlormethan (CH₂Cl₂), für mehrere Stunden, z.B. 8 Stunden bis 2 Tage, durchgeführt. Ein Heteroaryl- oder anderes Arylringsystem kann statt des Phenylrings von Verbindung (III) verwendet werden, und das Heteroaryl- oder Arylringsystem kann fakultativ substituiert sein.
Beispiel 20
Beispiel 21
Beispiel 22
Beispiel 23
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zu Tabletten für orale Verabreichung formuliert werden. Zum Beispiel kann eine Verbindung der vorliegenden Erfindung mit einem polymeren Trägerstoff durch die Copräzipitationsmethode, die in WO 96/38131 angegeben ist, die hierin durch Bezugnahme miteinbezogen ist, in eine Dispersion hinein ausgebildet werden. Die copräzipitierte Dispersion kann mit Hilfsstoffen vermischt, dann zu Tabletten verpreßt werden, die fakultativ filmbeschichtet werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurden auf eine Fähigkeit, PDE5 zu hemmen, getestet. Die Fähigkeit einer Verbindung, PDE5-Aktivität zu hemmen, steht im Zusammenhang mit dem IC₅₀-Wert für die Verbindung, d.h. der Inhibitorkonzentration, die für 50% Hemmung der Enzymaktivität erforderlich ist. Die IC₅₀-Werte für Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurden unter Verwendung von rekombinanter menschlicher PDE5 bestimmt.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeigen typischerweise einen IC₅₀-Wert gegen rekombinante menschliche PDE5 von weniger als etwa 50 μM und vorzugsweise weniger als etwa 25 μM und bevorzugter weniger als 15 μM. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeigen typischerweise einen IC₅₀-Wert gegen rekombinante menschliche PDE5 von weniger als etwa 1 μM und oft weniger als etwa 0,05 μM. Um den vollen Vorteil der vorliegenden Erfindung zu erreichen, hat ein vorliegender PDE5-Inhibitor eine IC₅₀ von etwa 0,1 nM bis etwa 15 μM.
Die Herstellung rekombinanter menschlicher PDEs und die IC₅₀-Bestimmungen können mit im Stand der Technik gut bekannten Methoden durchgeführt werden. Beispielhafte Methoden sind wie folgt beschrieben:
EXPRESSION VON MENSCHLICHEN PDEs
Expression in Saccharomyces cerevisae (Hefe)
Rekombinante Produktion von menschlicher PDE1B, PDE2, PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE4D, PDE5 und PDE7 wurde in ähnlicher Weise zu derjenigen durchgeführt, die in Beispiel 7 von U.S.-Patent Nr. 5,702,936 beschrieben ist, das hierin durch Bezugnahme miteinbezogen wird, mit der Ausnahme, daß der eingesetzte Hefetransformationsvektor, der vom Basis-ADH2-Plasmid abgeleitet ist, beschrieben in Price et al., Methods in Enzymology, 185, S. 308–318 (1990), Hefe-ADH2-Promotor- und -Terminatorsequenzen enthielt und der Saccharomyces cerevisae-Wirt der Protease-defizitäre Stamm BJ2-54 war, hinterlegt am 31. August 1998 bei der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, unter Zugangsnummer ATCC 74465. Transformierte Wirtszellen wurden in 2 × SC-leu-Medium, pH 6,2, mit Spurenmetallen und Vitaminen, angezogen. Nach 24 Stunden wurde YEP-Medium enthaltendes Glycerol bis zu einer Endkonzentration von 2 × YET/3% Glycerol zugegeben. Ungefähr 24 Std. später wurden Zellen geerntet, gewaschen und bei –70°C aufbewahrt.
ZUBEREITUNGEN MENSCHLICHER PHOSPHODIESTERASE
Bestimmungen der Phosphodiesterase-Aktivität
Phosphodiesterase-Aktivität der Zubereitungen wurde wie folgt bestimmt. PDE-Tests, die eine Kohletrenntechnik einsetzten, wurden durchgeführt, im wesentlichen wie beschrieben in Loughney et al. (1996). In diesem Test wandelt PDE-Aktivität [32P]cAMP oder [32P]cGMP in das entsprechende [32P]5'-AMP oder [32P]5'-GMP im Verhältnis zur vorliegenden Menge der PDE-Aktivität um. Das [32P]5'-AMP oder [32P]5'-GMP wurde dann durch die Wirkung von Schlangengift-5'-Nukleotidase in freies [32P]Phosphat und nicht-markiertes Adenosin oder Guanosin umgewandelt. Daher ist die Menge an freigesetztem [32P]Phosphat proportional zur Enzymaktivität. Der Test wurde bei 30°C in einer 100 μl Reaktionsmischung durchgeführt, die (Endkonzentrationen) 40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 μM ZnSO₄, 5 mM MgCl₂ und 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) enthielt. PDE-Enzym war in Mengen vorhanden, die < 30% Gesamthydrolyse des Substrats lieferten (lineare Testbedingungen). Der Test wurde durch Zugabe von Substrat (1 mM [32P]cAMP oder -cGMP) initiiert und die Mischung wurde für 12 Minuten inkubiert. Fünfundsiebzig (75) μg Crotalus atrox-Gift wurde dann zugegeben und die Inkubation wurde für 3 Minuten fortgesetzt (15 Minuten insgesamt). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 200 μl Aktivkohle (25 mg/ml Suspension in 0,1 M NaH₂PO₄, pH 4) gestoppt. Nach Zentrifugation (750 × g für 3 Minuten), um die Kohle absetzen zu lassen, wurde eine Probe des Überstandes für Radioaktivitätsbestimmung in einem Szintillationszähler abgenommen und die PDE-Aktivität wurde berechnet.
Reinigung von PDE5 aus S. cerevisiae
Zellpellets (29 g) wurden auf Eis mit einem gleichen Volumen Lysepuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM MgCl₂, 0,25 mM DTT, 1 mM Benzamidin und 10 μM ZnSO₄) aufgetaut. Zellen wurden in einem Mikrofluidizer^® (Microfluidics Corp.) unter Verwendung von Stickstoff bei 20.000 psi lysiert. Das Lysat wurde zentrifugiert und durch 0,45 μm-Einwegfilter filtriert. Das Filtrat wurde auf eine 150 ml-Säule aus Q SEPHAROSE^® Fast-Flow (Pharmacia) aufgebracht. Die Säule wurde mit 1,5 Volumenteilen Puffer A (20 mM Bis-Tris-Propan, pH 6,8, 1 mM MgCl₂, 0,25 mM DTT, 10 μM ZnSO₄) gewaschen und mit einem Stufengradienten von 125 mM NaCl in Puffer A, gefolgt von einem linearen Gradienten von 125–1000 mM NaCl in Puffer A eluiert. Aktive Fraktionen aus dem linearen Gradienten wurden auf eine 180 ml-Hydroxyapatitsäule in Puffer B (20 mM Bis-Tris-Propan (pH 6,8), 1 mM MgCl₂, 0,25 mM DTT, 10 μM ZnSO₄ und 250 mM KCl) aufgebracht. Nach dem Beladen wurde die Säule mit 2 Volumenteilen Puffer B gewaschen und mit einem linearen Gradienten von 0–125 mM Kaliumphosphat in Puffer B eluiert. Aktive Fraktionen wurden gepoolt, mit 60% Ammoniumsulfat ausgefällt und in Puffer C (20 mM Bis-Tris-Propan, pH 6,8, 125 mM NaCl, 0,5 mM DTT, und 10 μM ZnSO₄) resuspendiert. Der Pool wurde auf eine 140 ml-Säule SEPHACRYL^® S-300 HR aufgebracht und mit Puffer C eluiert. Aktive Fraktionen wurden auf 50% Glycerol verdünnt und bei –20°C aufbewahrt.
Die resultierenden Zubereitungen waren nach SDS-PAGE etwa 85% rein. Diese Zubereitungen hatten spezifische Aktivitäten von etwa 3 μmol cGMP hydrolysiert pro Minute pro Milligramm Protein.
Hemmende Wirkung auf cGMP-PDE
cGMP-PDE-Aktivität von Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung eines einstufigen Tests gemessen, der von Wells et al., Biochim. Biophys. Acta, 384, 430 (1975) adaptiert worden war. Das Reaktionsmedium enthielt 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM Magnesiumacetat, 250 μg/ml 5'-Nukleotidase, 1 mM EGTA und 0,15 μm 8-[H³]-cGMP. Sofern nicht anders angegeben, war das verwendete Enzym eine menschliche rekombinante PDE5 (ICOS Corp., Bothell, Washington).
Verbindungen der Erfindung wurden in DMSO gelöst, wobei sie letztendlich mit 2% im Test vorlagen. Die Inkubationszeit betrug 30 Minuten, während derer die Gesamtsubstratumwandlung 30% nicht überstieg.
Die IC₅₀-Werte für die untersuchten Verbindungen wurden aus Konzentrations-Reaktions-Kurven bestimmt, die typischerweise Konzentrationen verwenden, die von 10 nM bis 10 μM reichten. Tests gegen andere PDE-Enzyme unter Verwendung von Standardmethodik zeigten, daß Verbindungen der Erfindung selektiv auf das cGMP-spezifische PDE-Enzym sind.
Biologische Daten
Es wurde festgestellt, daß die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung typischerweise einen IC₅₀-Wert von weniger als 500 nM (d.h. 0,5 μM) zeigen. In-vitro-Testdaten für repräsentative Verbindungen der Erfindung sind in der folgenden Tabelle angegeben:

¹⁾ gegen Rinderaorta

Offensichtlich können viele Modifikationen und Variationen der Erfindung, wie hierin zuvor dargelegt, vorgenommen werden, ohne vom Geist und Schutzumfang derselben abzuweichen, und daher sollten nur solche Beschränkungen auferlegt werden, wie sie durch die beigefügten Ansprüche angegeben sind.

Claims

Verbindung, ausgewählt aus:
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung nach Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Trägerstoff umfasst.
Verbindung oder Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2 zur Verwendung als ein therapeutisches Mittel.
Verbindung oder Zusammensetzung nach Anspruch 3 zur Verwendung in einem Verfahren zur kurativen oder prophylaktischen Behandlung eines männlichen oder weiblichen Tieres auf einen Zustand, bei dem die Hemmung einer CGMP-spezifischen PDE von therapeutischem Nutzen ist.
Verbindung oder Zusammensetzung nach Anspruch 3 zur Verwendung in einem Verfahren zur kurativen oder prophylaktischen Behandlung eines Zustandes, bei dem die Hemmung einer cGMP-spezifischen PDE von therapeutischem Nutzen ist, in einem menschlichen oder nicht-menschlichen tierischen Körper.
Verbindung oder Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Zustand männliche erektile Dysfunktion ist.
Verbindung oder Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Zustand weibliche Erregungsstörung ist.
Verbindung oder Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Zustand ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus stabiler Angina, instabiler Angina, varianter Angina, Bluthochdruck, pulmonalem Bluthochdruck, chronischer obstruktiver Lungenerkrankung, malignem Bluthochdruck, Phäochromocytom, posttraumatischer Lungeninsuffizienz, kongestivem Herzversagen, akutem Nierenversagen, chronischem Nierenversagen, Atherosklerose, einem Zustand verringerter Blutgefäßdurchlässigkeit, einer peripheren Gefäßerkrankung, einer Gefäßstörung, Thrombocythämie, einer entzündlichen Erkrankung, Myocardinfarkt, Schlaganfall, Bronchitis, chronischem Asthma, allergischem Asthma, allergischer Rhinitis, Glaukom, peptischem Ulcus, einer Darmmotilitätsstörung, postperkutaner transluminaler Koronarangioplastik, Carotidangioplastik, Transplantatstenose nach chirurgischem Bypasseingriff, Osteoporose, Frühgeburt, gutartiger Prostatahypertrophie oder Reizdarmsyndrom.
Verbindung oder Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung eine orale Behandlung ist.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Arzneimittels für die kurative oder prophylaktische Behandlung männlicher erektiler Dysfunktion oder weiblicher Erregungsstörung.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Arzneimittels für die kurative oder prophylaktische Behandlung von stabiler Angina, instabiler Angina, varianter Angina, Bluthochdruck, pulmonalem Bluthochdruck, chronischer obstruktiver Lungenerkrankung, malignem Bluthochdruck, Phäochromocytom, posttraumatischer Lungeninsuffizienz, kongestivem Herzversagen, akutem Nierenversagen, chronischem Nierenversagen, Atherosklerose, einem Zustand verringerter Blutgefäßdurchlässigkeit, einer peripheren Gefäßerkrankung, einer Gefäßstörung, Thrombocythämie, einer entzündlichen Erkrankung, Myocardinfarkt, Schlaganfall, Bronchitis, chronischem Asthma, allergischem Asthma, allergischer Rhinitis, Glaukom, peptischem Ulcus, einer Darmmotilitätsstörung, postperkutaner transluminaler Koronarangioplastik, Carotidangioplastik, Transplantatstenose nach chirurgischem Bypasseingriff, Osteoporose, Frühgeburt, gutartiger Prostatahypertrophie oder Reizdarmsyndrom in einem menschlichen oder nicht-menschlichen tierischen Körper.
Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung eine orale Behandlung ist.