DE602005002836T2

DE602005002836T2 - Diagnoseverfahren für erkrankungen unter verwendung von copeptin

Info

Publication number: DE602005002836T2
Application number: DE200560002836
Authority: DE
Inventors: Andreas Bergmann; Joachim Struck
Original assignee: BRAHMS GmbH
Current assignee: BRAHMS GmbH
Priority date: 2004-08-19
Filing date: 2005-08-19
Publication date: 2008-07-31
Anticipated expiration: 2025-08-20
Also published as: HK1114171A1; JP2011227095A; DE602005002836D1; EP1628136A1; CN102539789A; CN101010591A; US7807397B2; AR050215A1; ES2296224T3; WO2006018315A1; CN102539789B; US20090221009A1; EP1738178B1; EP1738178A1; US20170242037A1; JP4932714B2; MXPA06014775A; US20110008911A1; HK1172690A1; JP2008510151A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Copeptin und/oder seinen Fragmenten und/oder seinen Splicingvarianten und/oder Kombinationen und/oder Derivaten davon in der medizinischen Diagnose als humoraler Biomarker für Gesundheitsstörungen, die mit nicht-physiologischen Änderungen der Vasopressin-Freisetzung aus der Neurohypophyse verbundwen sind oder dadurch bewirkt werden, wie zum Beispiel Herzerkrankungen, Nierenerkrankungen, Entzündungserkrankungen und Sepsis sowie Erkrankungen/Gesundheitsstörungen des zentralen Nervensystems sowie neurodegenerative Erkrankungen und andere, wie sie nachfolgend erwähnt werden.
Im folgenden Text werden alle Biomoleküle und Fragmente, Varianten und Kombinationen davon, wie sie oben erwähnt wurden, die das gemeinsame Merkmal teilen, dass sie Copeptin-Immunreaktivität zeigen, in der vorliegenden Anmeldung als "Copeptin" bezeichnen.
Copeptin wird gemäß der vorliegenden Erfindung als Biomarker verwendet, insbesondere als humoraler Biomarker, der dazu verwendet werden kann, Gesundheitsstörungen zu diagnostizieren, die mit nicht-physiologischen Veränderungen, insbesondere Erhöhungen, der Vasopressin-Freisetzung aus der Neurohypophyse verbunden sind oder dadurch bewirkt werden, wie beispielsweise kardiovaskuläre Erkrankungen, wie chronische oder Stauungs-Herzinsuffizenz, Herzstillstand, Herzschock, Herzinfarkt, akuter Myokardinfarkt, arterieller Hochdruck, Herzchirurgie, Zirrhose, pulmonäre Erkrankungen, Nieren(renale)-Erkrankungen, wie die polyzystische Nierenkrankheit, Diabetes insipidus, Formen der Hyponatriämie, Formen des Syndroms einer unzureichenden Sekretion des antidiuretischen Hormons, Hämorrhagie, ödembildende Zustände, Entzündungserkrankungen, Trauma, Verbrennungen, infektiöse Komplikationen davon sowie Sepsis, schwere Sepsis und septischer Schock, sowie Erkrankungen/Gesundheitsstörungen des zentralen Nervensystems (ZNS) sowie neurodegenerative Erkrankungen.
Wenn, in der vorliegenden Anmeldung, eine Verwendung als Biomarker erwähnt wird, bedeutet das die Bestimmung des Biomarkers in in vitro-Proben von biologischen Fluiden (d. h. ex vivo), wie beispielsweise in Blut, Serum oder Plasma und Zerebrospinal-Liquor (cerebrospinal fluid; CSF). Für jeden Fachmann beinhaltet das ganz klar, dass nur solche physiologisch auftretenden "Copeptin"-Moleküle bestimmt werden sollen, die tatsächlich in derartigen Proben vorhanden sein können. In einer Probe einer Körperflüssigkeit können verschiedene unterschiedliche Spezies mit im Wesentlichen identischer Immunreaktivität vorhanden sein, die sich beispielsweise in ihrer Länge und/oder durch das Vorliegen und/oder den Typ und/oder dem Grad ihrer posttranslationalen Modifikationen unterscheiden, zum Beispiel durch ihre Glykosylierung und/oder Phosphorylierung. Angesichts der inhärenten Möglichkeit, dass jeder gegebene Assay mehr als eine Art von Molekül erkennen kann, wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform die Bestimmung von Copeptin verstanden als Bestimmung einer Copeptin-Immunreaktivität, und zwar besonders bevorzugt als Immunreaktivität, wie sie mit einem Assay gemessen wird, wie er nachfolgend beschrieben wird.
Soweit sich die Verwendung der vorliegenden Erfindung auch auf die Herstellung von Assay-Komponenten und Reagenzien erstreckt, die in Verbindung mit der Bestimmung von Copeptin als Biomarker nützlich sind, oder auch auf Wirkbestandteile in Pharmazeutika, können irgendwelche geeigneten Copeptin-Peptide oder Derivate, einschließlich von Fusionsprodukten und Modifikationen mit zum Beispiel einer verminderten Homologie mit dem natürlich auftretenden Copeptin oder mit einer modifizierten Stabilität, verwendet werden, ohne dass eine Einschränkung auf natürlich auftretende Copeptin-Produkte besteht.
Der Begriff Copeptin gemäß der vorliegenden Erfindung erstreckt sich folglich auch auf Aminosäuresequenzen mit zum Beispiel nur 75% Homologie, vorzugsweise wenigstens 80% Homologie, stärker bevorzugt wenigstens 90% Homologie zu Copeptin.
Begriffe wie "Diagnose" oder "diagnostisch" werden in dieser Beschreibung als Gattungsbegriffe verwendet, die, wenn sie nicht anders definiert werden, nicht nur eine Diagnose im Sinne des Nachweises einer spezifischen Erkrankung bezeichnen sollen, sondern auch ein Screenen von symptomfreien oder Hochrisiko-Populationen, bei denen ein Risiko für bestimmte Erkrankungen besteht, oder für die vermutet wird, dass sie bestimmte Erkrankungen haben, insbesondere zum frühen Nachweis, zur Überwachung von unbehandelten oder behandelten Patienten und zum Überwachen des Verlaufs einer Therapie und zur Prognose/Frühprognose sowie zur Überlebensprognose.
Die Erfindung betrifft ferner Kits, wie sie beansprucht werden.
Vasodilatorische Zustände bei Schock sind lebensbedrohende Situationen. Der periphäre Blutdruck vermindert sich drastisch und normalisiert sich häufig nach Verabreichung von Catecholaminen nicht. Die häufigste Form des Schocks ist der septische Schock, der gleichzeitig die ernsteste Form der Sepsis darstellt. Ferner kann sich ein vasodilatorischer Schock nach einer schweren Herzchirurgie, einem hämorrhagischen oder Herzschock oder nach einer Vergiftung durch Medikamente oder Toxine zeigen [1, 2].
Eine Reihe von Peptiden, die überwiegend auf dem autocrinen/paracrinen Weg wirken, sind an der Regulierung des Blutdrucks beteiligt. Von den folgenden Molekülen ist bekannt, dass sie eine vasodilatorische Funktion aufweisen: z. B. Adrenomedullin, das Calcitonin-Gen-verwandte Peptid (CGRP) und das atriale natriuretische Peptid (ANP). Vasokonstrikti ve Wirkungen zeigen beispielsweise die folgenden Moleküle: Endothelin, Angiotensin II und Vasopressin (auch bekannt als Arginin-Vasopressin, antidiuretisches Hormon (ADH)).
Vasopressin ist ein Spaltprodukt eines größeren Vorläufermoleküls ("VP-Prohormon"; seine Polypeptidsequenz ist in 3 oder als SEQ ID NO: 4 gezeigt), das überwiegend in den Neuronen des Hypothalamus gebildet wird [20]. Nach der Synthese wird das VP-Prohormon im Golgi-Apparat glykosyliert, in sekretorische Vesikel verpackt und durch Prohormon-Convertase SP3 in die drei Peptide Vasopressin, Neurophysin und Copeptin gespalten. Nach der axonalen Wanderung zu den Nervenenden der Hypophyse werden die Peptide auf bestimmte Stimuli hin (z. B. hohe Osmolarität, Abnahme des Blutvolumens oder unterschiedliche Hormone) aus den Vesikeln sekretiert.
Der hervorstechenste physiologische Effekt von Vasopressin ist die Zurückhaltung von Körperwasser (Antidiurese). Die Wirkung von Vasopressin im Sinne einer physiologischen Erhöhung des Blutdrucks ist bei gesunden Individuen weniger ausgeprägt als beim septischen Schock. Weitere physiologische Funktionen von Vasopressin sind die Regulierung der Hypophysen-Nebennieren-Achse (ACTH, Cortisol), die Stimulation der Aktivität des Magen-Darm-Trakts sowie der Aggregation von Blutplättchen [1; Zahlen in Klammern beziehen sich auf die beigefügte Liste von Literaturstellen].
Bei der Pathogenese von Schock spielt Vasopressin eine zentrale Rolle: in experimentellen Schockmodellen wurde gezeigt, dass die Plasmakonzentrationen von Vasopressin innerhalb von 15 Minuten nach der Stimulation um drei Größenordnungen über die Normalkonzentration ansteigen [4]. Nach der raschen Freisetzung von Vasopressin, das in der Hypophyse gespeichert ist, nehmen die Vasopressin-Konzentrationen während des weiteren Verlaufs des Schocksyndroms drastisch ab, wie bei Patienten mit septischem Schock beobachtet wurde [5–7]. Diese Beobachtung war die Grundlage für das Konzept einer Vasopressin-Substitutionstherapie für die Behandlung von septischem Schock, das erfolgreich getestet wurde [8–10]. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass eine endogene Vasopressin-Abnahme zum Zustand des septischen Schocks beiträgt [5].
Vasopressin wurde auch als Marker für die Prognose der überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten mit Herzstillstand [11] diskutiert und es wurde folglich auch zur Behandlung derartiger Patienten verwendet [12].
Eine pathophysiologische überexpression von Vasopressin oder VP-Prohormon wurde für verschiedene Krebstypen gezeigt, wie beispielsweise Prostata-, Hoden-Krebs, Eierstock- und Pankreas-Krebs, Hypophysenadenome und Gangliome, olfaktorische Neuroblastome, Brust- und Darmtumoren, Nasopharyngeal-Karzinom, Kopf- und Halskrebs, Phäochromozytom und Tumoren gastrointestinaler Herkunft, Schuppenzell-Karzinome, Adenokarzinome und Großzellkarzinome [13, 24, 25, 26]. Vasopressin, das bei Krebs produziert oder freigesetzt wird, ist als pathophysiologisch gebildet zu betrachten, d. h. auf anormalem physiologischem Wegen gebildet (von geänderten pathologischen Geweben), die von der normalen physiologischen Vasopressin-Produktion zu unterscheiden sind.
Bei Erkrankungen, wie sie oben erwähnt wurden, wird Vasopressin aus einem Organ (der Neurohypophyse) freigesetzt, das sein normaler Ursprung ist, wenn auch in nicht-physiologischen Mengen.
Copeptin – das auch als C-terminales Glykoprotein bekannt ist – umfasst 39 Aminosäuren, seine Zuckereinheit und weist ein Molekulargewicht von etwa 2000 Da auf [15–17]. Die Glykosylierung befindet sich in Position 131 des Vorläufer-VP-Prohormons (s. SEQ ID NO: 4). Die biologische Funktion von Copeptin bleibt unklar.
Die direkte Bestimmung von Vasopressin als humoraler diagnostischer Marker in Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Serum oder Plasma als solche, ist für die Routinediagnostik nicht geeignet. Mehr als 90% des Vasopressins sind an Blutplättchen gebunden und stehen daher für die Messungen nicht zur Verfügung [21]. Somit spiegelt das freie Vasopressin im Plasma nicht die wahre Vasopressin-Menge wieder, die in den Blutstrom freigesetzt wurde. Die Bindung von Vasopressin an Blutplättchen führt zu unterschiedlichen Ergebnissen, und zwar in Abhängigkeit von der Menge an Plättchen, die in die Messung eingehen, die in Abhängigkeit von der Zentrifugation, die zur Gewinnung des Plasmas angewandt wurde, variabel ist [22]. Ein weiteres Hindernis liegt in der Tatsache, dass eine höhere Vasopressin-Menge beobachtet wird, wenn man die Blutprobe bei Raumtemperatur vor dem Zentrifugieren stehen läßt. Diese Wirkungen und die kurze Halbwertszeit von Vasopressin in vivo (24 Minuten, [14]) sowie in Plasmaproben ex vivo, selbst bei einer Lagerung von –20°C [23] hat bisher die Verwendung von Vasopressin in der Routinediagnostik behindert. Aufgrund der kurzen Halbwertszeit ist es bei der Routinediagnostik nicht möglich, Proben zu nehmen, das Plasma zu gewinnen, die Probe in das Labor zu transportieren und im Labor die Diagnostik durchzuführen, einschließlich der erforderlichen Tests, bevor Vasopressin ein kritisches Nachweisniveau erreicht.
Ferner ist aufgrund der niedrigen in vivo-Stabilität von Vasopressin und den variablen Ergebnissen aufgrund der Bindung an Blutplättchen und der Freisetzung von diesen die Verwendung als Biomarker extrem eingeschränkt, und zwar selbst bei einer optimierten Probenlogistik, da sich der Einfluss des Abbaus rapide zeigt.
Yamaji et al., J. of Clin. Endocrinology and Metabolism, Vol. 59, Nr. 3, Seiten 505 bis 512 beschreiben, dass Neurophysine und der Vorläufer Pro-Pressophysin geeignete Marker für Erkrankungen darstellen, die unter die Definition von Anspruch 1 fallen. Der immunologische Nachweis von Copeptin wird nicht erwähnt.
WO 2004/006860 beschreibt einen Antikörper, der an Copeptin bindet, zielt jedoch auf den immunologischen Nachweis von Vasopressin-Vorläufern ab.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, die Effekte der nachteiligen Halbwertszeit von Vasopressin und der variablen Ergebnisse bei Messungen zu überwinden und ein Verfahren, eine Verwendung und einen Kit für den Nachweis und die Bestimmung der Moleküle zu entwickeln, die mit der Freisetzung von Vasopressin assoziiert sind, und zwar spezieller von Copeptin, und zwar zur Diagnose von kardiovaskulären Erkrankungen und Sepsis.
Diese Aufgabe konnte auf der Grundlage überraschender Befunde erreicht werden, dass bestimmte Fragmente des VP-Prohormons – d. h. des Vorläufers von Vasopressin – und zwar insbesondere Copeptin als ein Werkzeug für die Bestimmung der physiologischen Freisetzung von Vasopressin verwendet werden können, und zwar insbesondere in Körperflüssigkeiten, bei der Diagnose und bei der Überwachung von kardiovaskulären Erkrankungen und Sepsis.
Die Erzeugung der Fragmente, und zwar insbesondere von Copeptiden, korreliert mit der Freisetzung von Vasopressin, da sich alle von dem gleichen Vorläufer ableiten.
Ferner wurde gefunden, dass die Stabilität der Vorläufer-Proteine, Fragmente und/oder Kombinationen davon ex vivo überraschend hoch war und die Fragmente, insbesondere Copeptin, für Routinezwecke vollständig geeignet sind.
Diese Verknüpfung zwischen den Fragmenten wie Copeptin und anderen Fragmenten der Vorläufer-Peptide macht sie geeignet als diagnostische Werkzeuge für alle Erkrankungen, bei denen Vasopressin eine Rolle spielt. Insbesondere kann Copeptin daher bei der medizinischen Diagnose zur Diagnose und zur Überwachung einer Vielzahl von Erkrankungen verwendet werden, insbesondere von kardiovaskulären Erkrankungen und systemischen Entzündungen, insbesondere Sepsis.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Verwendung von Copeptin zur Diagnose von Erkrankungen, zur Verlaufskontrolle und Prognose der oben erwähnten Erkrankungen, bei denen Vasopressin eine Rolle spielt.
Zur Unterstützung der Bestimmung der Krankheit können klinische Daten zusätzlich berücksichtigt werden.
Es ist möglich, Aminosäuresequenzen zu nutzen, die eine wenigstens 75%ige Homologie, vorzugsweise 80%ige Homologie und am stärksten bevorzugt eine wenigstens 90%ige Homologie zu Copeptin gemäß der vorliegenden Erfindung aufweisen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden gemäß den nachfolgenden Beispielen zwei Abschnitte (PATV17; PLAY17) der humanen Vasopressin-Neurophysin 2-Copeptin-Vorläufer-Aminosäuresequenz als immunologische Bindungsstellen ausgewählt, die von spezifischen Antikörpern erkannt werden sollten:
Zu Eichzwecken und zur Herstellung von Standardlösungen wurde ein Peptid, das die beiden erwähnten Bindungsstellen aufweist, verwendet (PAY33):
Die immunologischen Bindungsstellen PATV17 und PLAY17, die von spezifischen Antikörpern erkannt werden sollen, wurden so ausgewählt, dass sie die angenommene Glykosylierungsstelle des Copeptins in Position 131 nicht beinhalten. Das Vorhandensein oder Fehlen einer posttranslationalen Modifikation (Glykosylierung) des bestimmten Copeptids sollte daher keinen entscheidenden Einfluss auf die Erkennung von Copeptin in einem Assay aufweisen, der derartige Antikörper nutzt. Der Begriff "Copeptin" umschließt daher das "nackte" Copeptin-Peptid sowie posttranslational modifizierte Formen dieses Peptids.
Wenn jedes der oben erwähnten Peptide wie nachfolgend beschrieben synthetisiert wurde, wurde an jede Copeptin-Aminosäuresequenz ein aminoterminaler Cysteinrest angefügt, und die Peptide wurden chemisch als lösliche Proteine nach den Verfahren synthetisiert, die dem Fachmann bekannt sind. Sie wurden gereinigt und mittels Massenspektroskopie und Umkehrphasen-HPLC qualitätskontrolliert und in bestimmten Teilmengen lyophilisiert (Jerini AG, Berlin, Deutschland).
Die synthetisierten Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung wurden dazu verwendet, Antigene herzustellen, und dann Tieren injiziert, um Antikörper gegen Copeptin gemäß der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Es können zu diesem Zwecke unterschiedliche Verfahren zur Anwendung kommen, die einem Fachmann bekannt sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wurden die Peptide PATV17 und PLAY17 mit dem Trägerprotein Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) über MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester) konjugiert, und zwar nach den Verfahren von Pierce, Rockford, IL, USA. Antikörper gegen die oben erwähnten Peptide wurden in Schafen erzeugt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden gegen die oben erwähnten Peptide polyklonale Antikörper erzeugt. Die Antikörper wurden nach bekannten Verfahren gereinigt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurde das vorzugsweise durch eine ligandenspezifische Affinitätschromatographie bewirkt, bei der man die Peptide über ihren aminoterminalen Cysteinrest an SulfoLink-Gel von Pierce (Boston, USA) kuppelte, und zwar nach dem Verfahren von Pierce. Bei einer bevorzugten Ausführungsform waren die Antikörper mit einem Marker markiert, um ihren Nachweis zu ermöglichen. Der verwendete Marker ist vorzugsweise ein lumineszierender Marker, und bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform wurde der Antikörper mit einem chemilumineszierenden Marker markiert, und gemäß einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform waren die Antikörper gegen PATV17 (0413-pAK) und PLAY17 (0417-pAK) mit einem chemilumineszierenden Marker markiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die Verwendung der erzeugten Antikörper zum Nachweis von Copeptin gemäß der vorliegenden Erfindung in Proben von Körperflüssigkeiten, sowie einen Kit, der eine bestimmte Menge an Antikörpern umfasst, die spezifisch im Hinblick auf den Nachweis von Molekülen gemäß der vorliegenden Erfindung sind. Es können unterschiedliche Assays dazu verwendet werden, die Moleküle nachzuweisen, wie sie dem Fachmann bekannt sind, die kompetitive oder Sandwich-Immunoassays in manuellen, automatisierten oder Point-of-Care-Testformaten umfassen, wobei unterschiedliche Arten von Markern zur Anwendung kommen.
Verfahren zum Nachweis der Bindung des Antikörpers an das entsprechende Molekül sind ebenfalls den Fachleuten bekannt. Alle derartigen bekannten Assayformate können im Kontext der Bestimmung von Copeptin verwendet werden. Es liegt beispielsweise im Bereich der vorliegenden Erfindung, Copeptin mit Hilfe einer Schnelltestvorrichtung zu bestimmen, beispielsweise vom immunchromatographischen Typ, und zwar als sog. POC(Point of Care)-Test. Die Bestimmung von Copeptin kann auch mit einem homogenen Assay des sog. KRYPTOR^®-Typs unter Anwendung der sog. TRACE^®-Technologie durchgeführt werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschreibt die Verwendung von Antikörpern, die gegen die oben erwähnten Peptide erzeugt wurden, und zwar 0413-pAK und 0417-pAK, insbesondere für einen Zweiseiten-Immunoassay vom Sandwich-Typ. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung beschreibt die Verwendung dieser Antikörper für den Nachweis und die Bestimmung der Konzentration der Moleküle der vorliegenden Erfindung, und zwar insbesondere von Copeptin in verschiedenen Körperflüssigkeiten und anderen Biomaterialien. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann Copeptin in Konzentrationen über 50 pg/ml Körperflüssigkeit nachgewiesen werden (1).
Gemäß einer Ausführungsform beruht die Erfindung auf der entdeckten Langzeitstabilität von Copeptin ex vivo in Plasma und Serum (Tabelle 2) und nutzt diese. In Plasma und Serum waren die Copeptin-Spiegel selbst nach zwei Tagen Lagerung bei Raumtemperatur überraschend stabil. Somit ist Copeptin bei weitem geeigneter für diagnostische Zwecke als Vasopressin.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschreibt die Verwendung von Antikörpern, die gegen PLAY17 und PATV17 erzeugt wurden, zum Nachweis von Copeptin in gesunden Personen, in Patienten mit Sepsis, mit Herzinfarkt und erhöhtem arteriellen Blutdruck (2) sowie zur Bestimmung der Schwere von chronischer oder Stauungs-Herzinsuffizienz (CHF) (4).
Die Erfindung gestattet ferner die Bestimmung des Vorhandenseins und der Stabilität der erfindungsgemäßen Moleküle, und zwar insbesondere von Copeptin, in Körperflüssigkeiten, sowie die Bestimmung des Unterschieds der Peptid-Konzentration in gesunden Kontrollen und in Patienten mit ver schiedenen Erkrankungen, die die oben erwähnten einschließen (2; 4). Der Median von gesunden Kontrollpersonen liegt bei etwa 13 pg/ml.
Die Erfindung beschreibt ferner eine signifikante Veränderung der Konzentration des humoralen Biomarkers Copeptin in Körperflüssigkeiten bei Krankheit, wobei die Krankheiten die obigen umfassen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund einer hochsignifikanten Veränderung, d. h. eines etwa 10fachen Anstiegs der Copeptin-Konzentration im Plasma von Sepsis-Patienten (Median 150,5 pg/ml) und bei Herzinfarkt (Median 129,5 pg/ml), und eines etwa 35fachen Anstiegs bei Patienten mit erhöhtem arteriellen Blutdruck (Median 459,5 pg/ml).
Bei Patienten mit CHF korrelieren die gemessenen Copeptinspiegel gut mit der Schwere der Krankheit, die allgemein unter Verwendung des funktionellen Klassifikationssystems der New York Heart Association (NYHA) bewertet wird, wobei die NYHA-Klassen I bis IV den folgenden typischen funktionellen Kapazitäten entsprechen: NYHA-Klasse I – asymptomatisch; NYHA-Klasse II – Symptome bei mäßiger Betätigung; NYHA-Klasse III – Symptome bei geringster Betätigung; NYHA-Klasse IV – Symptome (Atemnot) im Ruhezustand. Bei einer Studie, bei der die Copeptin-Spiegel in Plasmaproben einer Gesamtheit von 348 CHF-Patienten bestimmt wurden (25 in NYHA-Klasse I; 124 in NYHA-Klasse II; 127 in NYHA-Klasse III; 72 in NYHA-Klasse IV; vergleiche Tabelle 1), zeigten die Mediane für die unterschiedlichen Klassen eine klare Tendenz (siehe die nachfolgende Tabelle 1).
Die Erfindung stellt auch ein diagnostisches in vitro-Verfahren sowie Kits, wie sie beansprucht werden, für die oben erwähnten Erkrankungen bereit, wobei insbesondere einer oder mehrere Copeptin-Antikörper verwendet werden.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Standardkurve für den Sandwich-Immunoassay zur Bestimmung der Copeptin-Immunreaktivität unter Verwendung von PAY33 als Standardmaterial.
2 zeigt die Konzentration der Copeptin-Immunreaktivität in Proben von gesunden Personen und von unterschiedlichen Patientengruppen (Sepsis, Herzinfarkt oder erhöhter arterieller Blutdruck).
3 zeigt die Aminosäuresequenz des Vasopressin-Prohormons (Ein-Buchstaben-Code; vergleiche auch SEQ ID NO: 4).
4 zeigt die Konzentrationen der Copeptin-Immunreaktivität in Proben von Patienten mit CHF (chronischer Herzinsuffizienz), die nach dem NYHA-Klassifikationssystem klassifiziert wurden.
Materialien, Verfahren und Messungen
Beispiel 1
Peptid-Synthese
Peptide wurden nach Standardarbeitsweisen, die dem Fachmann bekannt sind, synthetisiert, und ihre Qualität wurde durch Massenspektrometrie und Umkehrphasen-HPLC kontrolliert, und sie wurden in Teilmengen lyophilisiert (Jerini AG, Berlin, Deutschland). Die Aminosäuresequenzen der Peptide sind die folgenden (Zahlen beziehen sich auf die entsprechenden Positionen in den humanen-Pro-Vasopressin-Neurophysin 2-Copeptin-Vorläufern (Positionen 132–147 und 149–164): PATV 17 (132–147 + N-terminaler Cysteinrest):
PLAY 17 (149–164 + N-terminaler Cysteinrest):
Standard-Peptid PAY 33 (132–164)
Beispiel 2
Konjugation und Immunisierung
Peptide der Sequenzen mit den IDs 1–2 wurden mittels MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester) mit dem Trägerprotein KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) konjugiert gemäß den Protokollen für "NHS-Ester-maleimide-crosslinkers" von PIERCE, Rockford, IL, USA. Schafe wurden immunisiert, indem sie 100 μg Konjugat erhielten (μg gemäß dem Peptidgehalt des Konjugats) sowie anschließend 50 μg des Konjugats alle 4 Wochen (Menge bezogen auf den Peptidgehalt des Konjugats). Beginnend im Monat 4 nach der Immunisierung wurden alle vier Wochen 700 ml Blut von jedem Schaf abgenommen, und Antiserum wurde durch Zentrifugation gewonnen. Konjugation, Immunisierungen und die Produktion von Antiseren erfolgte durch MicroPharm, Carmerthenshire, UK.
Beispiel 3
Reinigung von Antikörpern
Die polyklonalen Antikörper aus Schafen wurden gereinigt unter Verwendung einer ligandenspezifischen Affinitätsreinigung. Für diesen Schritt wurden die Peptide PATV 17 und PLAY 17 an SulfoLink-Gel, das von Pierce (Boston, USA) geliefert wurde, gebunden. Die Bindung erfolgte nach dem Protokoll von Pierce. 5 mg Peptid wurden pro 5 ml Gel zugesetzt.
Kurz gefasst wurden Kolonnen dreimal mit 10 ml Elutionspuffer (50 mM Citronensäure, pH 2,2) und Bindepuffer (100 mM Natriumphosphat, 0,1% Tween, pH 6,8) gewaschen. 100 ml Schaf-Antiserum wurden unter Verwendung eines Filters mit einem Durchmesser von 0,2 μm filtriert und dem Kolonnenmaterial zugesetzt, das aus der Kolonnne in einen Becher mit 10 ml Bindepuffer überführt worden war. Das Material wurde über Nacht bei Raumtemperatur durch leichte Rotation inkubiert. Das Material wurde in leere Kolonnen überführt (NAP 25, Pharmacia, geleert). Die Eluate wurden verworfen. Anschließend wurden die Kolonnen mit 250 ml Protein-freiem Bindepuffer gewaschen (Proteingehalt des gewaschenen Eluats < 0,02 A 280 nm). Den gewaschenen Kolonnen wurde Elutionspuffer zugesetzt, und es wurden Fraktionen von 1 ml gesammelt. Der Proteingehalt jeder Fraktion wurde nach dem BCA-Verfahren bestimmt (gemäß dem Protokoll von PIERCE, Rockford, IL, USA). Fraktionen mit einem Proteingehalt > 0,8 mg/ml wurden vereinigt. Nach der Bestimmung des Proteingehalts wurden 39 mg anti-PATV 17-Antikörper 0413-pAk und 103 mg anti-PLAY 17-Antikörper 0417-pAk gewonnen.
Beispiel 4
Markierung
Der anti-PLAY 17-Antikörper 0417-pAk wurde wie folgt behandelt: 500 μl der erzeugten Affinitäts-gereinigten Antikörper wurden über eine NAP-5 Gelfiltrationkolonne (Pharmacia) gemäß dem Protokoll von Pharmacia in 1 ml 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 8.0) umgepuffert. Die Protein-Konzentration der Antikörperlösung betrug 1,5 mg/ml.
Zur Markierung mit einem chemilumineszierenden Marker wurden 10 μl MA70-Akridinium-NHS-Ester (1 mg/ml; Hoechst Behring) zu 67 μl Antikörperlösung zugesetzt und es wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 423 μl 1 M Glycin zugesetzt, und es wurde 10 Minuten inkubiert. Die Lösung wurde in 1 ml Lösemittel A (50 mM Kaliumphosphat, 100 mM NaCl, pH 7,4) umgepuffert, und zwar unter Verwendung einer NAP-5 Gel-Filtrationskolonne gemäß den Protokollen von Pharmacia. Für die endgültige Eliminierung von ungebundenem Marker erfolgte eine Gel-Filtrations-HPLC (Säule: Waters Protein Pak SW300). Die Probe wurde zugegeben und bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/Minute in Lösemittel A chromatographiert. Der Durchfluss wurde kontinuierlich mit einem UV-Messgerät bei der Wellenlänge von 280 und 368 nm überwacht, um den Grad der Markierung zu bestimmen. Das Absorptionsverhältnis 368/280 nm von markiertem Antikörper betrug 0,1. Die Fraktionen, die monomere Antikörper enthielten, wurden gesammelt (Retentionszeit 8–10 Minuten) und in 3 ml 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 5% Rinderserumalbumin, 0,1% Natriumazid, pH 7,4, aufgenommen.
Beispiel 5
Kupplung
Der anti-PATV 17-Antikörper 0413-pAk wurde an bestrahlten 5 ml-Polystyrolröhrchen immobilisiert (Greiner, Deutschland). Für diese Prozedur wurde die Antikörperlösung auf eine Proteinkonzentration von 6,6 μg/ml mit 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,8 verdünnt. Pro Röhrchen wurden 300 μl der verdünnten Proteinlösung pipettiert. Diese wurden 20 Stunden bei 22°C inkubiert, und die Lösung wurde entfernt. Dann wurden jedem Röhrchen 4,2 ml 10 mM Natriumphosphat, 2% Karion FP, 0,3% Rinderserumalbumin, pH 6,5 zugesetzt. Nach 20 Stunden wurde die Lösung entfernt, und die Röhrchen wurden in einem Vakuumtrockner getrocknet.
Beispiel 6
Immunoassay
Es wurde der folgende Assay-Puffer verwendet: 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 5% Rinderserumalbumin, 0,1% unspezifierte Schaf-IgG, 0,1% Natriumazid, pH 7,4.
Die Copeptin-Konzentration von EDTA-Plasma von gesunden Personen und Patienten mit unterschiedlichen Erkrankungen/Erkrankungen, die oben erwähnt wurden, wurde bestimmt, und zwar insbesondere von Herzerkrankungen und Kreislauferkrankungen.
Als Standardmaterial wurde das chemische synthetisierte Peptid (Peptid PAY 33) verwendet, das den Positionen 132–164 des Vasopressin-Neurophysin 2-Copeptin-Vorläufers entspricht. Der Standard wurde im normalen Pferdeserum (Sigma) verdünnt.
In die Teströhrchen wurden 100 μl Standard oder Probe sowie 100 μl Assay-Puffer pipettiert. Die Röhrchen wurden zwei Stunden bei 22°C unter leichtem Rotieren inkubiert. Nach einem 4-maligem Waschen mit 1 ml Waschpuffer (0,1 Tween 20) wurde der Überstand verworfen. Dann wurden 200 μl Assay-Puffer, die 1 Million RLU (relative Lichteinheiten) des MA70-markierten Antikörpers enthielten, zugesetzt, und es wurde für weitere zwei Stunden bei einer leichten Rotation bei 22°C inkubiert. Nach einem 4-maligen Waschen mit 1 ml Waschpuffer (0,1% Tween 20) wurde die an das Röhrchen gebundene Chemilumineszenz in einem Luminometer bestimmt (Berthold, LB952T, Grundreagenzien B.R.A.H.M.S AG). Unter Verwendung der Software MultiCalc (Spline Fit) wurden die Konzentrationen der Proben bestimmt.
Beispiel 7
Bestimmung der Copeptin-Konzentration
Der Begriff Copeptin-Immunreaktivität beschreibt die Menge an Substrat, die mit dem entwickelten Sandwich-Immunoassay nachgewiesen wird. Der Sandwich-Immunoassay verwendet Antikörper, die gegen die Positionen 132–147 und 149–164 des Vasopressin-Neurophysin 2-Copeptin-Vorläufers erzeugt wurden, zum Nachweis des Substrats. Eine typische Standard kurve für den entwickelten Assay ist in 1 beschrieben. Unter Verwendung des Assays können Konzentrationen von mehr als 50 pg/ml Copeptinreaktivität in Plasma oder Serum quantitativ bestimmt werden.
Beispiel 8
Konzentration der Copeptin-Immunreaktivität bei gesunden Personen und im Krankheitszustand
Serum und Plasma von gesunden Personen und von Patienten, die an verschiedenen Krankheiten litten, die Sepsis, Herzinfarkt und erhöhten arteriellen Blutdruck umfassten, wurden analysiert (2): Die Copeptin-Immunreaktivität wurde bestimmt. Verglichen mit gesunden Personen war die Copeptin-Immunoreaktivität bei Krankheit überraschend erhöht. Gesunde Personen zeigten einen Median von etwa 13 pg/ml, Sepsis-Patienten einen Median von etwa 150 pg/ml, bei Herzinfarkt betrug der Median etwa 129 pg/ml, und bei einem erhöhten arteriellen Blutdruck betrug der Median etwa 459 pg/ml.
Beispiel 9
Konzentration der Copeptin-Immunreaktivität bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz (CHF) der NYHA-Klassen I bis IV

In Serum- und Plasmaproben einer Gesamtheit von 348 CHF-Patienten (25 in NYHA-Klasse I; 124 in NYHA-Klasse II; 127 in NYHA-Klasse III; 72 in NYHA-Klasse IV; vergleiche Tabelle 1) wurden unter Verwendung des oben beschriebenen Assays die Copeptin-Spiegel bestimmt. Die Ergebnisse sind in Diagrammform in 4 gezeigt. Wie zu erkennen ist, zeigten die Mediane der Copeptin-Konzentration in pg/ml für die unterschiedlichen Klassen eine klare Tendenz zum Anstieg, indem der Median für Patienten der NYHA-Klasse I zu 20,30 pg/ml ermittelt wurde, bei Klasse II zu 33,25 pg/ml, bei Klasse III zu 49,60 pg/ml, und bei Klasse IV zu 85,80 pg/ml (vergleiche die statistischen Daten in der nachfolgenden Tabelle 1). Tabelle 1

	NYHA I	NYHA II	NYHA III	NYHA IV
Zahl der Werte	25	124	127	72
Median	20,30	33,25	49,60	85,80
Mittel	27,00	45,32	63,91	184,7
Untere 95% CI des Mittels	17,45	38,79	55,29	118,9
Obere 95% CI des Mittels	36,56	51,86	72,54	250,5

CI = Konfidenz-Intervall

Das Ergebnis, dass es eine enge Korrelation der Schwere von CHF mit den Copeptin-Spiegeln in Plasma gibt, macht Copeptin zu einem Biomarker-Kandidaten zur Verwendung bei der Diagnose (positive oder negative Diagnose) von CHF, zur Überwachung des Verlaufs und der Entwicklung von CHF und zur Überwachung und Kontrolle einer CHF-Therapie. Ferner kann, angesichts gegenwärtiger Versuche, die Nützlichkeit von Vasopressin-Rezeptorantagonisten bei der Therapie der Herzinsuffizienz zu bewerten [27], die Bestimmung von Copeptin in Serum- oder Plasma-Proben von Patienten mit Herzinsuffizienz die Identifikation solcher Patienten gestatten, die stärker als andere von einer Behandlung mit Vasopressin-Rezeptorantagonisten profitieren würden.
Beispiel 10
Stabilität der Copeptin-Immunreaktivität

Die Copeptin-Immunreaktivität in Plasma und Serum erwies sich als überraschend stabil (Tabelle 2). Tabelle 2 zeigt die ex vivo-Stabilität von endogenem immunreaktivem Copeptin in Serum und Plasma von Sepsis-Patienten. TABELLE 2

Probe	Lagerung (Tage/Temperatur)	Wiederfindung (%)
Serum (n = 3)	1 Tag/4°C 2 Tage/4°C 1 Tag/RT 2 Tage/RT	98,0% 99,2% 94,1% 103,7
Plasma (n = 5)	1 Tag/4°C 2 Tage/4°C 1 Tag/RT 2 Tage/RT	103,4% 101,6% 99,9% 104,9%

Selbst nach zwei Tagen Lagerung bei Raumtemperatur (RT) konnte keine Abnahme der Immunreaktivität festgestellt werden.
Somit ist die ex vivo-Stabilität der Copeptin-Immunreaktivität überraschend deutlich erhöht im Vergleich mit Vasopressin.
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27. Thibonnier M., Vasopressin receptor antagonists in heart failure, Current Opinion in Pharmacology 2003, 3: 683–687. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Diagnostisches in vitro-Verfahren zur Diagnose und zur Überwachung von Gesundheitsstörungen, die mit nicht-physiologischen Änderungen der Vasopressinfreisetzung aus der Neurohypophyse assoziiert sind oder davon bewirkt werden, indem man in einer Probe einer Körperflüssigkeit des Patienten die Menge von Copeptin oder von pathophysiologisch auftretenden Splicingvarianten, Fragmenten oder posttranslational-modifizierten Formen von Copeptin bestimmt, die eine Copeptin-Immunreaktivität aufweisen, und man die bestimmte Menge an Copeptin oder Copeptin-Immunreaktivität mit dem Vorliegen und/oder Verlauf und/oder der Stärke und/oder der Prognose einer derartigen Gesundheitsstörungen assoziiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannte Gesundheitsstörung, die durch nicht-physiologische Änderungen der Vasopressinfreisetzung aus der Neurohypophyse assoziiert ist oder dadurch hervorgerufen wird, ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus kardiovaskulären Erkrankungen, insbesondere chronischer Herzinsuffizienz oder Stauungsherzinsuffizienz, Herzstillstand, Radialschock, Herzinfakt, akutem Myocardinfakt, arteriellem Bluthochdruck, Herzchirurgie; Zirrhose; Lungenerkrankungen; Nierenerkrankungen wie beispielsweise polycystischer Nierenerkrankung; Diabetes insipidus; Formen von Hyponatriämie, Formen des Syndroms einer unzureichenden Sekretion von antidiuretischem Hormon; Hämorrhagie, Ödem-bildenden Zuständen, entzündlichen Erkrankungen, Trauma, Verbrennungen, infektiöse Komplikationen davon sowie Sepsis, schwere Sepsis und septischer Schock; sowie Erkrankungen/Gesundheitsstörungen des zentralen Nervensystems (CNS).
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Copeptin-Immunreaktivität eine Immunreaktivität ist, die unter Verwendung eines Sandwich-Immunoassays bestimmbar ist, für den ein erster spezifischer Binder verwendet wird, der eine Aminosäuresequenz erkennt, die in SEQ ID NO: 1 vorhanden ist, sowie ein zweiter spezifischer Binder, der eine Aminosäuresequenz erkennt, die in SEQ ID NO: 2 vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die genannten spezifischen Binder polyklonale und/oder monoklonale Antikörper sind.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei der genannte Immunoassay ein heterogener Immunoassay ist, bei dem ein erster immobilisierter spezifischer Binder und ein zweiter solubilisierter spezifischer Binder verwendet wird, der ein nachweisbares Label trägt oder der durch Reaktion mit einem mit einem Label versehenen Markierungsmolekül selektiv markiert werden kann.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei der Immunoassay ein homogener Immunoassay ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die biologische Flüssigkeit ausgewählt ist aus Serum, Plasma, Blut oder Liquor cverebrospinalis (Cerebrospinalfluid; CSF).
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die genannte Erkrankung ausgewählt ist aus Sepsis, Herzinfakt, chronischer Herzinsuffizienz und erhöhtem arteriellem Blutdruck.
Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, der Reagenzien für einen Immunoassay aufweist, die umfassen – wenigstens einen ersten Antikörper, der eine erste Aminosäuresequenz erkennt, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 vorhanden ist, und – wenigstens einen zweiten Antikörper, der eine andere, zweite Aminosäuresequenz erkennt, die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 vorhanden ist, – wobei wenigstens einer der genannten ersten oder zweiten Antikörper ein nachweisbares Label trägt.
Kit nach Anspruch 9, wobei einer von den genannten ersten oder zweiten Antikörper auf einer Oberfläche immobilisiert ist.
Kit nach Anspruch 9 oder 10, der außerdem ein Peptid umfasst, das als Standard und zu Eichzwecken einzusetzen ist.
Kit nach Anspruch 11, wobei das genannte Peptid die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 aufweist.