DE602005005355T2

DE602005005355T2 - 9-Chloro-15-deoxyprostaglandinderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung als Medikamente

Info

Publication number: DE602005005355T2
Application number: DE602005005355T
Authority: DE
Inventors: Werner Skuballa; Bernd Buchmann; Bernhard Lindenthal; Gernot Langer; Luisella Toschi; William J. Belmont GUILFORD; Daryl Mill Valley FAULDS; Judy Emeryville LI
Original assignee: Bayer Schering Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2005-11-21
Filing date: 2005-11-21
Publication date: 2009-03-26
Anticipated expiration: 2025-11-22
Also published as: CR10006A; GT200800066A; TW200738611A; DK1816121T3; EP1816121A1; AR057900A1; EA200801211A1; EP1816121B1; BRPI0618756A2; IL190596A0; JP2009516665A; KR20080068877A; DE602005005355D1; AU2006314733A1; PL1816121T3; DOP2006000257A; NO20082838L; UY29925A1; WO2007057232A1; CN101312946A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft 9-Chlor-Prostaglandinderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als Arzneimittel.
Es ist schon lange bekannt, dass Prostaglandine die Schlüsselmoleküle bei den Prozessen der weiblichen Reproduktionsbiologie wie z. B. die Regulation der Ovulation, der Fertilisation, der Nidation, der Dezidualisierung (z. B. Plazentabildung) und der Menstruation sind. Prostaglandine spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei den pathologischen Veränderungen im reproduktiven Trakt, einschließlich der Menorrhagie, Dysmenorrhoe, Endometriose und Krebs. Bisher ist der Mechanismus, durch den Prostaglandine diese Veränderungen bewirken, noch nicht vollständig geklärt. Neuere Erkenntnisse weisen darauf hin, dass Prostaglandine, ihre Rezeptoren und deren Signaltransduktionswege an Prozessen wie Angiogenese, Apoptose und Proliferation beteiligt sind.
Die Wirkungen der Prostaglandine werden durch ihre G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die auf der Zelloberfläche lokalisiert sind, vermittelt. Von besonderem Interesse ist das Prostaglandin E₂(PGE₂), das unterschiedlichste zelluläre Wirkungen erzielt, indem es an funktionell verschiedene Rezeptorensubtypen, nämlich die EP₁-, EP₂-, EP₃- und EP₄-Rezeptoren, bindet. So konnte gezeigt werden, dass die reproduktiven Funktionen bei EP₂-Knockout-Mäusen (EP₂) beeinträchtigt sind, und dass diese Tiere eine kleinere „Wurfanzahl" haben (Matsumoto et al., 2001, Biology of Reproduction 64, 1557–1565). Ebenso konnte gezeigt werden, dass diese EP₂-Knockout-Mäuse (Hizaki et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1999 Aug 31; 96(18): 10501–10506) eine deutlich verminderte Kumulusexpansion und starke Subfertilität zeigen, was die Bedeutung des Prostaglandin-EP₂-Rezeptors für diesen Prozess demonstriert. Der EP₂-Rezeptors stellt demnach ein wichtiges Ziel für die Entwicklung von Arzneimitteln für die Regulation der weiblichen Fertilität dar. Die 4 Subklassen des EP₂-Rezeptors eröffnen die Möglichkeit zur gezielten Entwicklung selektiv wirksamer PGE₂-Verbindungen. Bisher sind allerdings kaum selektive EP₂-Rezeptor-Liganden bekannt, die meisten bekannten Verbindungen binden auch an die anderen EP₂-Rezeptor-Subtypen wie beispielsweise an den EP₄-Rezeptor.
In dem europäischen Patent EP 1306087 werden EP₂-Rezeptoragonisten beschrieben, die ihre Verwendung bei der Behandlung der erektilen Dysfunktion finden. Die gleiche Strukturklasse wird in dem europäischen Patent EP 860430 beschrieben, ihre Verwendung für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von immunologischen Erkrankungen, Asthma und Abort wird beansprucht. Die Anmeldung WO 04/32965 beschreibt die EP₂-Rezeptoragonisten, die für die Behandlung und Prävention von Erkrankungen verwendet werden, die durch einen durch Ischämie verursachten Organausfall verursacht werden. In der WO 04/009117 werden EP₂- und EP₄-Rezeptoragonisten für die Behandlung von Erkrankungen beschrieben, die durch die Uteruskontraktion, beispielsweise Menstruationsbeschwerden verursacht werden.
In den Anmeldungen WO 03/74483 und WO 03/09872 werden Agonisten beschrieben, die gleichermaßen an den EP₂- und an den EP₄-Rezeptor binden (Ono Pharmaceuticals).
Die Agonisten des EP₂- und des EP₄-Rezeptors werden häufig im Zusammenhang mit der Behandlung von Osteoporose beschrieben ( WO 99/19300 , US 2003/0166631 , WO 03/77910 , WO 03/45371 , WO 03/74483 und WO 03/09872 ) und für die Glaukombehandlung ( WO 04/37813 , WO 04/37786 , WO 04/19938 , WO 03/103772 , WO 03/103664 , US 6747037 , US 6410591 , WO 03/40123 , WO 03/47513 , WO 03/47417 .
In der Patentanmeldung WO 04/12656 werden EP₂-Rezeptoragonisten im Zusammenhang mit Inflammation beansprucht.
In der Patentanmeldung WO 03/77919 werden EP₄-Rezeptoragonisten für die Behandlung der Fertilität beansprucht. Selektive EP₂-Rezeptoragonisten, die die Prozesse regulieren, die letztendlich für die Nidation und Dezidualisierung und somit zur Förderung der Fertilität beitragen, sind bisher noch nicht beschrieben.
Daraus ergibt sich die Aufgabe, stabile, selektive und wirksame Verbindungen, die an den EP₂-Rezeptor binden, für die Entwicklung neuer Arzneimittel zur Verfügung zu stellen.
Durch die bereits erwähnten europäischen Patente der Firma Ono Pharmaceuticals ( EP 0030377 und EP 1306087 ) sind Prostaglandinderivate mit einem Chloratom in 9-Stellung bekannt. Die in diesen Patenten beanspruchten Verbindungen enthalten jedoch unter anderem eine Hydroxygruppe in der unteren Seitenkette, z. B. in der 15- oder 16-Position.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass Verbindungen der allgemeinen Formel I,
wobei
R¹ eine CH₂OH-, -COOR²-, -CONHR²- oder -CONHR³-Gruppe,
R² ein Wasserstoff,
ein C₁-C₁₀-Alkylrest, der gerade oder verzweigt, gegebenenfalls ein- bis mehrfach gesättigt oder ungesättigt ist und gegebenenfalls ein- bis mehrfach substituiert ist durch Halogen, C₁-C₄-Alkoxy, substituiertes C₃-C₁₀-Aryl oder gegebenenfalls substituiertes C₃-C₁₀-Aroyl, Di-C₁-C₅-alkylamino oder Tri-C₁-C₅-alkylamino,
ein C₃-C₁₀-Cycloalkyl, das gegebenenfalls substitu iert ist durch C₁-C₄-Alkyl,
ein C₃-C₁₀-Aryl, das gegebenenfalls substituiert ist mit Phenyl, 1-Naphthyl, 2-Naphthyl, das wiederum in 3- und in 4-Stellung durch Fluor, Chlor, Alkoxy oder Trifluormethyl oder in 4-Stellung durch Hydroxy, Halogen, Phenyl, ein oder mehrere C₁-C₄-Alkylgruppen, Chlormethyl, Fluormethyl, Trifluormethyl, Carboxy-, Hydroxy- oder C₁-C₄-Alkoxy substituiert sein kann, oder ein C₃-C₇-Heterocycloalkyl,
R³ R eine C₁-C₁₅-Carbonsäure oder C₁-C₁₅-Sulfonsäure,
A eine cis-CH=CH- oder -CH₂-CH₂-Gruppe,
B eine trans-CH=CH- oder -CH₂-CH₂-Gruppe,
W ein C₂-C₆-Alkylen,
R⁴ eine Hydroxygruppe, ein Rest O-R⁶ oder O-R⁷, wobei R⁶ ein Tetrahydropyranyl-, Tetrahydrofuranyl-, Trimethylsilyl-, tert.-Butyldimethylsilyl-, tert.-Butyldiphenylsilyl- oder Tribenzylsilylrest und R⁷ eine C₁-C₁₅-Carbonsäure ist,
R⁵ ein Wasserstoff, eine C₁-C₁₀-Alkyl- oder C₁-C₁₀-Alkenylgruppe,
n die Zahl 1–4
bedeuten, sowie deren Salze und deren Cyclodextrinclathrate mit physiologisch verträgliche Basen,
die bekannten Nachteile überwinden und durch das Weglassen der Hydroxygruppe eine bessere Selektivität zum EP₂-Rezeptor sowie bessere Wirksamkeit und längere Wirkdauer erzielt werden kann.
Alkylgruppen sind gerade oder verzweigte Alkylgruppen, gesättigte und ungesättigte Alkylreste mit 1-10 C-Atomen. Beispielsweise genannt seien Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Isobutyl-, tert.-Butyl-, Pentyl-, Neopentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Decyl-, Butenyl-, Isobutenyl-, Propenyl-, Pentenyl-, Benzyl-, m- und p-Chlorbenzylgruppen.
Die Alkylgruppen können gegebenenfalls ein- bis mehrfach substituiert sein durch Halogenatome, z. B. Fluor, Chlor oder Brom,
durch Alkoxygruppen wie beispielsweise Methoxy, Ethoxy, gegebenenfalls durch substituierte Aryl- bzw. Aroylgruppen, z. B. Phenyl,
oder durch Dialkylamino, z. B. Dimethylamino, Diethylamino, Dimethylaminopropyl und Trialkylammonium, wobei die einfache Substitution bevorzugt sein soll.
Als Arylgruppen kommen sowohl substituierte als auch unsubstituierte Arylgruppen in Betracht, wie beispielsweise Phenyl, 1-Naphthyl und 2-Naphthyl, die jeweils substituiert sein können durch 1-3 Halogenatome, eine Phenylgruppe, 1-3 Alkylgruppen mit jeweils 1-4 C-Atomen, eine Chlormethyl-, Fluormethyl-, Trifluormethyl-, Carboxy-, Hydroxy- oder Alkoxygruppe mit 1-4 C-Atomen.
Die Cycloalkylgruppe kann im Ring 3-10 Kohlenstoffatome enthalten. Die Ringe können durch Alkylgruppen mit 1-4 Kohlenstoffatomen substituiert sein. Beispielsweise seien genannt Cyclopentyl, Cyclohexyl, Methylcyclohexyl und Adamantyl. Als heterocyclische Gruppen kommen 5- und 6-gliedrige Heterocyclen in Frage, die wenigstens 1 Heteroatom, vorzugsweise Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthalten. Beispielsweise seien genannt 2-Furyl, 2-Thienyl, 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 4-Pyridyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Pyrimidinyl, Pyridazinyl, Pyrazinyl, 3-Furyl, 3-Thienyl, 2-Tetrazolyl.
Als Säurerest kommen physiologisch verträgliche Säurereste in Frage. Bevorzugte Säuren sind organische Carbonsäuren und Sulfonsäuren mit 1-15 Kohlenstoffatomen, die der aliphatischen, cycloaliphatischen, aromatischen und heterocyclischen Reihe angehören. Als Beispiele für die Substituenten seien C₁-C₁₅-Alkyl-, Hydroxy-, C₁-C₁₅-Alkoxy-, Oxo- oder Aminogruppen oder Halogenatome erwähnt. Beispielsweise seien folgende Carbonsäuren genannt: Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Isobuttersäure, Valeriansäure, Isovaleriansäure, Capronsäure, Önanthsäure, Caprylsäure, Pelargonsäure, Caprinsäure, Undecylsäure, Laurinsäure, Tridecylsäure, Myristinsäure, Pentadecylsäure, Trimethylessigsäure, Diethylessigsäure, tert.-Butylessigsäure, Cyclopropylessigsäure, Cyclopentylessigsäure, Cyclohexylessigsäure, Cyclopropancarbonsäure, Cyclohexancarbonsäure, Phenylessigsäure, Phenoxyessigsäure, Methoxyessigsäure, Ethoxyessigsäure, Mono-, Di- und Trichloressigsäure, Aminoessigsäure, Diethylaminoessigsäure, Piperidinoessigsäure, Morpholinoessigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Adipinsäure, Benzoesäure, mit Halogen-, Trifluormethyl-, Hydroxy-, Alkoxy- oder Carboxygruppen substituierte Benzoesäuren, Nicotinsäure, Isonicotinsäure, Furan-2-carbonsäure, Cyclopentylpropionsäure. Als Sulfonsäuren kommen beispielsweise Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Isopropansulfonsäure, β-Chlorethansulfonsäure, Butansulfonsäure, Cyclopentansulfonsäure, Cyclohexansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, p-Chlorbenzolsulfonsäure, N,N-Dimethylaminosulfonsäure, N,N-Diethylaminosulfonsäure, N,N-Bis-(β-chlorethyl)-aminosulfonsäure, N,N-Diisobutylaminosulfonsäure, N,N-Dibutylaminosulfonsäure, Pyrrolidino-, Piperidino-, Piperazino-, N-Methylpiperazino- und Morpholinosulfonsäure in Frage.
Die Hydroxygruppe kann funktionell abgewandelt sein, beispielsweise durch Veretherung oder Veresterung.
Als Etherreste kommen die dem Fachmann bekannten Reste in Betracht. Bevorzugt sind leicht abspaltbare Etherreste, wie beispielsweise der Tetrahydropyranyl, Tetrahydrofuranyl, Trimethylsilyl, tert.-Butyldimethylsilyl, tert.-Butyldiphenylsilyl- oder Tribenzylsilylreste.
Als Acylreste kommen die Carbonsäuren, die unter R⁷ genannt sind, in Frage. Namentlich genannt seien beispielsweise Acetyl, Propionyl, Butyryl und Benzoyl.
Zur Salzbildung sind anorganische und organische Basen geeignet, wie sie dem Fachmann zur Bildung physiologisch verträglicher Salze bekannt sind. Beispielsweise seien Alkalihydroxide, wie Natrium- und Kaliumhydroxid, Erdalkalihydroxide, wie Calciumhydroxid, Ammoniak, Amine, wie Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, N-Methylglucamin, Morpholin, Tris-(hydroxymethyl)-methylamin genannt.
Als besonders wirksam haben sich die Verbindungen der allgemeinen Formel I erwiesen, wobei
R¹ eine CH₂OH-, -COOR²-, -CONHR²- oder -CONHR³-Gruppe,
R² ein Wasserstoff oder
ein C₁-C₁₀-Alkylrest, der gerade oder verzweigt, gegebenenfalls ein- bis mehrfach gesättigt oder ungesättigt ist und gegebenenfalls einfach substituiert ist durch Fluor, Chlor oder Brom, durch C₁-C₄-Alkoxy, substituiertes C₃-C₁₀-Aryl oder gegebenenfalls substituiertes C₃-C₁₀-Aroyl, Di-C₁-C₅-Alkylamino oder Tri-C₁-C₅-Alkylamino,
ein C₅-C₆-Cycloalkyl, das gegebenenfalls substituiert ist durch C₁-C₄-Alkyl,
ein C₃-C₁₀-Arylrest, der gegebenenfalls substituiert ist mit Phenyl, das in 3- oder 4-Stellung substituiert sein kann durch Fluor, Chlor, Alkoxy oder Trifluormethyl oder in 4-Stellung durch Hydroxy,
ein C₅-C₆-Heterocycloalkyl, das ein- oder mehrfach durch Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel unterbrochen sein kann,
R³ eine C₁-C₁₀-Carbonsäure oder C₁-C₁₀-Sulfonsäure,
A eine cis-CH=CH- oder -CH₂-CH₂-Gruppe,
B eine trans-CH=CH- oder -CH₂-CH₂-Gruppe,
W ein C₂-C₆-Alkylen,
R⁴ eine Hydroxygruppe,
R⁵ ein Wasserstoff, eine C₁-C₆-Alkyl- oder C₁-C₁₀-Alkenylgruppe und
n die Zahl 1–4
bedeuten.
Als ganz besonders wirksam haben sich die Verbindungen der allgemeinen Formel I erwiesen, wobei
R¹ eine -CH₂OH-, -COOR²-, -CONHR^2- oder -CONHR₃-Gruppe,
R² ein Wasserstoff oder ein C₁-C₄-Alkyl, das gegebenenfalls mit Phenyl substituiert ist,
ein C₅-C₆-Cycloalkyl,
ein C₃-C₆-Aryl, das gegebenenfalls mit Phenyl substituiert ist,
R³ eine C₁-C₆-Carbonsäure oder C₁-C₆-Sulfonsäure,
A eine cis-CH=CH- oder -CH₂-CH₂-Gruppe,
B eine trans-CH=CH- oder -CH₂-CH₂-Gruppe,
W ein C₂-Alkylen,
R⁴ eine Hydroxygruppe,
R⁵ ein Wasserstoff, gesättigtes C₁-C₄-Alkyl- oder C₁-C₅-Alkenyl und
n die Zahl 1–4
bedeuten.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Prostanderivate der allgemeinen Formel I, dadurch gekennzeichnet, dass ein Aldehyd der allgemeinen Formel II,
worin R¹ die Bedeutung der Reste -COOR², -CONHR³ aufweist sowie A und R⁴ die oben angegebenen Bedeutungen haben, wobei die freie OH-Gruppe in R⁴ geschützt ist,
mit dem Carbanion des Sulfons der allgemeinen Formel III
umgesetzt wird. Das erhaltene Hydroxysulfon wird nach Acetylierung reduktiv zum Olefin eliminiert und gegebenenfalls anschließend die in beliebiger Reihenfolge geschützten Hydroxygruppen entschützt und gegebenenfalls verestert, verethert und/oder Doppelbindungen hydriert und/oder eine veresterte Carboxylgruppe (R¹ = COOR²) und/oder eine freie Carboxylgruppe (COOR² mit R² = H) verestert und/oder eine freie Carboxylgruppe (COOR² mit R² = H) in ein Amid (R¹ = CONR²)) überführt und/oder eine freie oder veresterte Carboxylgruppe (R¹ = CONHR³) reduziert.
Die Umsetzung des Aldehyds der allgemeinen Formel II mit dem aus dem Sulfon III erzeugten Carbanions erfolgt in an sich bekannter Weise mit einem inerten Lösungsmittel wie beispielsweise Tetrahydrofuran oder Diethylether bei Temperaturen zwischen –100°C und 24°C, vorzugsweise –100°C bis –70°C. Die Erzeugung des Carbanions des Sulfons III erfolgt auf übliche Art mit einer Base wie beispielsweise Buthyllithium, Methyllithium, Kalium-tert.-butylat, Natriumhydrid, Lithiumdiisopropylamid, vorzugsweise Butyllithium. Die Carbanionbildung wird bei Temperaturen von –78°C bis 25°C, vorzugsweise bei –78°C vorgenommen.
Die Acetylierung der erzeugten Hydroxygruppe erfolgt in bekannter Weise mit Essigsäureanhydrid, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, beispielsweise Pyridin, bei Temperaturen zwischen –78°C und 25°C.
Die reduktive Eliminierung des intermediären Acetoxysulfons zum trans-Olefin der allgemeinen Formel I erfolgt mit Magnesiumpulver in Methanol unter Zusatz einer katalytischen Menge Chlortrimethylsilan. Die Reaktion wird bei Temperaturen zwischen 0°C und 60°C, vorzugsweise zwischen 15°C und 25°C durchgeführt. Alternativ kann die reduktive Eliminierung auch mit Natriumamalgam durchgeführt werden.
Die Reduktion zu den Verbindungen der allgemeinen Formel I mit R¹ in der Bedeutung einer -CH₂OH-Gruppe wird mit einem für die Reduktion von Estern oder Carbonsäuren geeigneten Reduktionsmittel wie beispielsweise Lithiumaluminiumhydrid, Diisobutylaluminiumhydrid durchgeführt. Als Lösungsmittel kommen Diethylether, Tetrahydrofuran, Dimethoxyethan, Toluol in Frage. Die Reduktion wird bei Temperaturen von –30°C bis zur Siedetemperatur des verwendeten Lösungsmittels, vorzugsweise 0°C bis 30°C, vorgenommen.
Die Freisetzung der funktionell abgewandelten Hydroxygruppen erfolgt nach bekannten Methoden. Beispielsweise wird die Abspaltung von Hydroxyschutzgruppen, wie beispielsweise des Tetrahydropyranylrestes, in einer wässrigen Lösung einer organischen Säure, wie z. B. Oxalsäure, Essigsäure, Propionsäure u. a., oder in einer wässrigen Lösung einer anorganischen Säure, wie z. B. Salzsäure, durchgeführt. Zur Verbesserung der Löslichkeit wird zweckmäßigerweise ein mit Wasser mischbares inertes organisches Lösungsmittel zugesetzt. Geeignete organische Lösungsmittel sind z. B. Alkohole, wie Methanol und Ethanol, und Ether, wie Dimethoxyethan, Dioxan und Tetrahydrofuran. Tetrahydrofuran wird bevorzugt angewendet. Die Abspaltung wird vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 20°C und 80°C durchgeführt.
Die Verseifung der Acylgruppen erfolgt beispielsweise mit Alkali- oder Erdalkalicarbonaten oder -hydroxiden in einem Alkohol oder in der wässrigen Lösung eines Alkohols. Als Alkohole kommen aliphatische Alkohole in Betracht, wie z. B. Methanol, Ethanol, Butanol, vorzugs weise Methanol. Als Alkalicarbonate und -hydroxide seien Kalium- und Natriumsalze genannt. Bevorzugt sind die Kaliumsalze.
Als Erdalkalicarbonate und -hydroxide sind beispielsweise Calciumcarbonat, Calciumhydroxid und Bariumcarbonat geeignet. Die Umsetzung erfolgt bei –10°C bis +70°C, vorzugsweise bei +25°C.
Die Einführung der Estergruppe -COOR² für R¹, beispielsweise bei welcher R² eine Alkylgruppe mit 1-10 C-Atomen darstellt, erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Methoden. Die 1-Carboxy-Verbindungen werden beispielsweise mit Diazokohlenwasserstoffen in an sich bekannter Weise umgesetzt. Die Veresterung mit Diazokohlenwasserstoffen erfolgt z. B. dadurch, dass man eine Lösung des Diazokohlenwasserstoffes in einem inerten Lösungsmittel, vorzugsweise in Diethylether, mit der 1-Carboxyverbindung in dem gleichen oder in einem anderen inerten Lösungsmittel, wie z. B. Methylenchlorid, vermischt. Nach beendeter Umsetzung in 1 bis 30 Minuten wird das Lösungsmittel entfernt und der Ester in üblicher Weise gereinigt. Diazoalkane sind entweder bekannt oder können nach bekannten Methoden hergestellt werden (Org. Reactions Bd. 8, Seiten 389–394 (1954)).
Die Einführung der Estergruppe COOR² für R¹, bei welcher R² eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe darstellt, erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Methoden. Beispielsweise werden die 1-Carboxyverbindungen mit den entsprechenden Arylhydroxyverbindungen mit Dicyclohexylcarbodiimid in Gegenwart einer geeigneten Base, beispielsweise Pyridin, DMAP, Triethylamin, in einem inerten Lösungsmittel umgesetzt. Als Lösungsmittel kommen Methylenchlorid, Ethylenchlorid, Chloroform, Essigester, Tetrahydrofuran, vorzugsweise Chloroform in Frage. Die Reaktion wird bei Temperaturen zwischen –30°C und +50°C, vorzugsweise bei 10°C, durchgeführt.
Sollten im Primärprodukt enthaltene C=C-Doppelbindungen reduziert werden, erfolgt die Hydrierung nach an sich bekannten Methoden.
Die Hydrierung der 5,6-Doppelbindung wird in an sich bekannter Weise bei tiefen Temperaturen, vorzugsweise bei etwa –20°C, in einer Wasserstoffatmosphäre in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators durchgeführt. Als Katalysator ist zum Beispiel 10% Palladium auf Kohle geeignet.
Werden sowohl die 5,6- als auch die 13,14-Doppelbindung hydriert, so arbeitet man bei höherer Temperatur, vorzugsweise bei etwa 20°C.
Die Prostaglandinderivate der allgemeinen Formel I mit R² in der Bedeutung eines Wasserstoffatoms können mit geeigneten Mengen der entsprechenden anorganischen Basen unter Neutralisierung in ein Salz überführt werden. Beispielsweise erhält man beim Lösen der entsprechenden Prostaglandin-Säuren in Wasser, das die stöchiometrische Menge der Base enthält, nach Abdampfen des Wassers oder nach Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, z. B. Alkohol oder Aceton, das feste organische Salz.
Zur Herstellung eines Aminsalzes, die in üblicher Weise erfolgt, wird die Prostaglandin-Säure z. B. in einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise Ethanol, Aceton, Diethylether, Acetonitril oder Benzol gelöst und mindestens die stöchiometrische Menge des Amins dieser Lösung zugesetzt. Dabei fällt das Salz gewöhnlich in fester Form an oder wird nach Verdampfen des Lösungsmittels in üblicher Weise isoliert.
Die Einführung der Amidgruppe -CONHR³ für R¹ erfolgt nach dem Fachmann bekannten Methoden. Die Carbonsäuren der allgemeinen Formel I (R² = H) werden zunächst in Gegenwart eines tertiären Amins, wie beispielsweise Triethylamin, mit Chlorameisensäureisobutylester in das gemischte Anhydrid überführt. Die Umsetzung des gemischten Anhydrids mit dem Alkalisalz des entsprechenden Amids oder mit Ammoniak (R³ = H) erfolgt in einem inerten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, wie beispielsweise Tetrahydrofuran, Dimethoxyethan, Dimethylformamid, Hexamethylphosphorsäuretriamid, bei Temperaturen zwischen –30°C und +60°C, vorzugsweise bei 0°C bis 30°C.
Eine weitere Möglichkeit für die Einführung der Amidgruppe -CONHR³ für R¹ besteht in der Umsetzung einer 1-Carbonsäure der allgemeinen Formel I (R² = H), in der freie Hydroxygruppen gegebenenfalls intermediär geschützt sind, mit Verbindungen der allgemeinen Formel IV, O = C = N-R³ IVworin R³ die oben angegebene Bedeutung hat.
Die Umsetzung der Verbindung der allgemeinen Formel I (R² = H) mit einem Isocyanat der allgemeinen Formel IV erfolgt gegebenenfalls unter Zusatz eines tertiären Amins, wie z. B. Triethylamin oder Pyridin. Die Umsetzung kann ohne Lösungsmittel oder in einem inerten Lösungsmittel, vorzugsweise Acetonitril, Tetrahydrofuran, Aceton, Dimethylacetamid, Methylenchlorid, Diethylether, Toluol, bei Temperaturen zwischen –80°C bis 100°C, vorzugsweise bei 0°C bis 30°C, vorgenommen werden.
Enthält das Ausgangsprodukt OH-Gruppen im Prostanrest, so werden diese OH-Gruppen auch zur Reaktion gebracht. Werden letztlich Endprodukte gewünscht, die freie Hydroxylgruppen im Prostanrest enthalten, geht man zweckmäßigerweise von Ausgangsprodukten aus, in denen diese durch vorzugsweise leicht abspaltbare Ether- oder Acylreste intermediär geschützt sind.
Die als Ausgangsmaterial dienenden Aldehyde der allgemeinen Formel II sind bekannt oder können beispielsweise hergestellt werden, indem man in an sich bekannter Weise die 13,14-Doppelbindung eines 9-Halogenprostaglandins der allgemeinen Formel V, vorzugsweise mit R¹ in der Bedeutung einer -COOCH₃ Gruppe, selektiv mit tert.-Butylhydroperoxid und Titan-IV-isopropylat im Methylenchlorid bei –20°C epoxidiert.
Die sich nun anschließende Epoxidspaltung mit Periodsäure in Diethylether und gegebenenfalls Schutz der 11-Hydroxygruppe, beispielsweise mit Dihydropyran, liefert den Aldehyd der allgemeinen Formel II.
Das als Ausgangsmaterial dienende Sulfon der allgemeinen Formel III ist aus Cycloalkylcarbonsäuren der allgemeinen Formel VII, worin n die oben angegebene Bedeutung aufweist, durch Alkylierung mit einem Alkylhalogenid der allgemeinen Formel VIII herstellbar, worin R⁵ die oben angegebene Bedeutung aufweist und Halogen Iod, Chlor oder Brom sein kann.
Nach Veresterung von IX mit Methyliodid und Kaliumcarbonat in Aceton wird der erhaltene Methylester mit Lithiumaluminiumhydrid in Diethylether zum Alkohol reduziert. Die Oxidation des Alkohols mit SO₂-Pyridin-Komplex in Gegenwart von Triethylamin in einer Mischung aus Dimethylsulfoxid und Methylenchlorid liefert den Aldehyd der allgemeinen Formel X. Die sich nun anschließende Wittig-Horner-Reaktion und gegebenenfalls Hydrierung der Doppelbindung zu XI führt nach Reduktion mit Diisobutylaluminiumhydrid zum Alkohol der allgemeinen Formel XII. Die Hydrierung der Doppelbindung kann aber auch nach Reduktion des Esters XI zum Alkohol XII, mit W in der Bedeutung einer Doppelbindung, durchgeführt werden.
Die sich nun anschließende Substitution der Hydroxygruppe erfolgt nach intermediärer Tosylierung durch Umsetzung mit Thiophenol in Toluol. Der so erhaltene Thioether XIII wird schließlich in einer wässrigen Methanollösung zum Sulfon der allgemeinen Formel III oxidiert.
Im Vergleich zu Prostaglandin E₂ zeichnen sich die neuen EP₂-Agonisten durch größere Selektivität und Stabilität aus. Die neuen Prostaglandin-Analoga des EP₂-Typs sind beispielsweise zur Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen, zu denen Fertilitätsstörungen, infektiöse Erkrankungen, Krebs, virale Infektionen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, erhöhter Augeninnendruck, Glaukoma, Erkrankungen des Knochenapparates, angiogenetischer Erkrankungen, Störungen der Uteruskontraktion, Schmerz und nephrologische Erkrankungen zählen, geeignet.
Unter Fertilitätsstörungen sind die Erkrankungen zu verstehen, die dazu führen, dass keine Ovulation erfolgt, dass der ovulierte Eizell/Kumulus Zellkomplex nicht fertilisierbar ist, dass es nicht zur Nidation einer befruchteten Eizelle kommt und keine Dezidualisierung stattfindet, unter infektiösen Erkrankungen sind durch unizelluläre Parasiten hervorgerufene Erkrankungen, unter Krebs solide Tumoren und Leukämie, unter viralen Infektionen Cytomegalus-Infektionen, Hepatitis, Hepatitis B und C und HIV Erkrankungen, unter Herz-Kreislauf-Erkrankungen ischämische Reperfusionserkrankung, Stenosen, Arteriosklerosen und Restenosen, unter angiogenetischen Erkrankungen z. B. Endometriose, unter erhöhtem Augeninnendruck Glaukom, unter Störungen der Uteruskontraktion z. B. Menstruationsbeschwerden, unter Erkrankungen des Knochenapparates Osteoporose und unter nephrologischen Erkrankungen Glomerulonephritis zu verstehen.
Zur Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Arzneimittel werden diese in die Form eines pharmazeutischen Präparats gebracht, das neben dem Wirkstoff für die enterale oder parenterale Applikation geeignete pharmazeutische, organische oder anorganische inerte Trägermaterialien, wie zum Beispiel, Wasser, Gelatine, Gummi arabicum, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Polyalkylenglykole enthält. Die pharmazeutischen Präparate können in fester Form, zum Beispiel als Tabletten, Dragees, Suppositorien, Kapseln oder in flüssiger Form, zum Beispiel als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, vorliegen. Gegebenenfalls enthalten sie darüber hinaus Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs- oder Netzmittel oder Emulgatoren; Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks oder Puffer.
Diese pharmazeutischen Präparate sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Zur Inhalation werden zweckmäßigerweise Aerosollösungen hergestellt.
Für die orale Anwendung sind insbesondere Tabletten, Dragees oder Kapseln mit Talkum und/oder Kohlenhydratträger oder -binder, wie zum Beispiel Lactose, Mais- oder Kartoffelstärke, geeignet. Die Anwendung kann auch in flüssiger Form erfolgen, wie zum Beispiel als Saft, dem gegebenenfalls ein Süßstoff beigefügt ist.
Für die parenterale Verabreichung werden sterile, injizierbare, wässrige oder ölige Lösungen benutzt. Besonders geeignet sind Injektionslösungen oder Suspensionen, insbesondere wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in polyethoxyliertem Rizinusöl, geeignet.
Für die vaginale Applikation sind z. B. Zäpfchen geeignet und üblich.
Als Trägersysteme können auch grenzflächenaktive Hilfsstoffe wie Salze der Gallensäuren oder tierische oder pflanzliche Phospholipide, aber auch Mischungen davon, sowie Liposomen oder deren Bestandteile verwendet werden.
Die enteralen, parenteralen, vaginalen und oralen Applikationen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden einem deren bedürftigen Patienten in einer wirksamen Menge verabreicht. Mit "wirksamer Menge" ist eine Menge bzw. Dosierung gemeint, die zur Behandlung oder Prävention einer bestimmten Erkrankung erforderlich ist, wobei sich diese Menge bzw. Dosierung nach im Stand der Technik bekannten Methoden ohne größere experimentelle Anstrengungen bestimmen läßt.
Die Dosierung der Wirkstoffe kann je nach Verabfolgungsweg, Alter und Gewicht des Patienten, Art und Schwere der zu behandelnden Erkrankung und ähnlichen Faktoren variieren. Die tägliche Dosis beträgt 0,5–1000 mg, vorzugsweise 50–200 mg, wobei die Dosis als einmal zu verabreichende Einzeldosis oder unterteilt in 2 oder mehreren Tagesdosen gegeben werden kann.
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel zur Behandlung der oben aufgeführten Erkrankungen, die mindestens eine Verbindung gemäß der allgemeinen Formel I enthalten, sowie Arzneimittel mit geeigneten Formulierungs- und Trägerstoffen.
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I), zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen, zu denen Fertilitätsstörungen, infektiöse Erkrankungen, Krebs, virale Infektionen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, erhöhter Augeninnendruck, Glaukoma, Erkrankungen des Knochenapparates, angiogenetische Erkrankungen, Störungen der Uteruskontraktion, Schmerz und nephrologische Erkrankungen zählen.
Unter Fertilitätsstörungen sind die Erkrankungen zu verstehen, die dazu führen, dass keine Ovulation erfolgt, da ovulierte Eizell/Kumulus-Zellkomplexe nicht fertilisiert werden können, dass es nicht zur Nidation einer befruchteten Eizelle kommt und keine Dezidualisierung stattfindet, unter infektiösen Erkrankungen sind durch unizelluläre Parasiten hervorgerufene Erkrankungen, unter Krebs solide Tumoren und Leukämie, unter viralen Infektionen Cytomegalus-Infektionen, Hepatitis, Hepatitis B und C und HIV Erkrankungen, unter Herz-Kreislauf-Erkrankungen ischämische Reperfusionserkrankung, Stenosen, Arteriosklerosen und Restenosen, unter angiogenetischen Erkrankungen z. B. Endometriose, unter erhöhtem Augeninnendruck Glaukom, unter Störungen der Uteruskontraktion z. B. Menstruationsbeschwerden, unter Erkrankungen des Knochenapparates Osteoporose und unter nephrologischen Erkrankungen Glomerulonephritis zu verstehen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I binden an den EP₂-Rezeptor und haben agonistische Wirkung. Die Bindung von PGE₂ an den EP₂-Subtyp des humanen PGE2-Rezeptors induziert die Aktivierung membranständiger Adenylatzyklasen und führt zur Bildung von cAMP.
1 zeigt im zellulären Agonismustest eine sehr hohe Wirksamkeit (EC50 < 9,5 × 10e-10M), ohne jegliche Inhibition im Antagonismustest (IC₅₀ > 2 × 10e-5M).
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen als EP₂-Rezeptoragonisten.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I haben profertile Wirkung. Im präovulatorischen antralen Follikel ist die Eizelle von Kumulus-Zellen umgeben, die einen dichten Zellkranz um die Eizelle bilden. Nach dem Peak des lutenisierenden Hormons (LH-Peak)) wird eine Reihe von Prozessen aktiviert, die eine starke morphologische Veränderung dieses Zellkranzes aus Kumulus-Zellen zur Folge hat. Hierbei bilden die Kumulus-Zellen eine extrazelluläre Matrix, die zur sogenannten Kumulusexpansion führt (Vanderhyden et al. Dev Biol. 1990 Aug; 140(2): 307–317). Diese Kumulusexpansion ist ein wichtiger Bestandteil des ovulatorischen Prozesses und der nachfolgenden Möglichkeit zur Fertilsation.
Bei der Kumulusexpansion sind Prostaglandine und hier das Prostaglandin E₂, dessen Synthese durch den LH-Peak induziert wird, von entscheidender Bedeutung. Prostanoid-EP₂-Knockout-Mäuse (Hizaki et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Aug 31; 96(18): 10501–6) zeigen eine deutlich verminderte Kumulusexpansion und starke Subfertilität, was die Bedeutung des Prostanoid-EP₂-Rezeptors für diesen Prozess demonstriert.
Der EP₂-Agonist führt konzentrationsabhängig zu einer starken Expansion des Kumulus-Komplexes. Die durch die Testsubstanz induzierte Kumulusexpansion ist in Konzentrationen von 0,5 μM und 1 μM Äquivalent zu der Kumulusexpansion, die durch den natürlichen EP₂-Rezeptoragonisten PGE₂ in einer Konzentration von 1 μM induziert wird (n = 16 Kumulus-Eizell-Komplexe pro Gruppe; siehe 1).
Der EP₂-Agonist führt konzentrationsabhängig zu einer signifikanten Erhöhung der ovulierten Eizellen. Diese signifikante Erhöhung der ovulierten Eizellen tritt bereits bei einer Gabe von jeweils 0,00015 mg/Tier auf und zeigt, dass selbst bei einer standardmäßig zur Ovulation verwendeten Dosis von HCG eine Steigerung der Anzahl der ovulierten Eizellen möglich ist (n = 11–12 Tiere pro Gruppe; **p < 0,005 und *p < 0,05), 2).
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen für die Behandlung von Fertilitätsstörungen wie beeinträchtigte oder fehlende Ovulation, gestörte Fertilisation des Eizell/Kumulus Zellkomplexes, gestörte Implantation und gestörte Dezidualisierung.
Prostaglandine spielen eine wichtige Rolle bei der Angiogenese (Sales, Jabbour, 2003, Reproduction 126, 559–567).
Endometriose ist eine chronische Erkrankung, die durch Störungen der Blutgefäße verursacht wird. Circa 10% der Frauen leiden regelmäßig an starken Blutungen während der Menstruation, verursacht durch Änderungen der Blutgefäße des Endometriums. Zusätzlich wurden strukturelle Unterschiede in den Blutgefäßen beobachtet, wie zum Beispiel die unvollständige Ausbildung der glatten Muskelzellschicht (Abberton et al. 1999, Hum. Reprod. 14, 1072–1079). Da der Blutverlust während der Menstruation zum Teil durch die Konstriktion der Blutgefässe geregelt wird, ist es naheliegend, dass die Defekte der glatten Muskulatur wesentlich zur Blutung beitragen.
Prostaglandine und über den EP₂-Rezeptor vermittelte Effekte spielen ebenfalls bei der hormonellen Regulation endometriotischer Läsionen eine Rolle (Sun et al. 2003, Endocrinology 144, 3934–3942)
Zunehmende Befunde deuten darauf hin, dass die Endometriose mit einer signifikanten entzündlichen Reaktion assoziiert ist, die durch aktivierte Makrophagen und Lymphozyten und erhöhte Konzentrationen an Cytokinen, Chemokinen und Wachstumsfaktoren vermittelt werden kann. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese entzündlichen Prozesse einige der mit Endometriose assoziierten klinischen Merkmale vermitteln. Es ist bekannt, dass die Peritonealflüssigkeit von Frauen mit Endometriose mehr inflammatorische Zellen und die damit assoziierten Cytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren enthält (Murphy AA. Clinical aspects of endometriosis. Ann NY Acad Sci. März 2002; 955: 1–10). Das Ergebnis ist eine Umgebung, die die Implantation und die Proliferation fördert.
Prostaglandine, und hier Prostaglandin E₂, reduzieren die Expression von inflammatorischen Cytokinen wie TNFα aus aktivierten Makrophagen. Prostanoid-EP₂-Knockout-Mäuse (Shinomiya S et al. Regulation of TNFα and IL-10 production by prostaglandins I2 and E2: studies with prostaglandin receptor-deficient mice and prostaglandin E-receptor subtype-selective agonists (Bioch Phar 2001; 61, 1153) reagierten nicht auf EP₂-Agonisten, was zeigt, wie wichtig der Prostanoid-EP₂-Rezeptor für diesen Prozess ist.
Tabelle 1 zeigt, dass ein EP₂-Agonist zu einer Inhibierung bei den im Kulturüberstand gemessenen Cytokinkonzentrationen führt. Der EP₂-Agonist bewirkt außerdem eine signifikante Verminderung von TNFα, wie aus 3 hervorgeht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Substanzen der allgemeinen Formel I für die Behandlung von Endometriose.
Prostaglandine spielen eine wichtige Rolle bei der Uteruskontraktion, zu starke Kontraktionen sind verantwortlich für Menstruationsbeschwerden (Sales, Jabbour, 2003, Reproduction 126, 559–567).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Substanzen der allgemeinen Formel I für die Behandlung von Menstruationsbeschwerden.
EP₂-Rezeptor-Agonisten spielen außerdem eine bedeutende Rolle bei der Regulation des Augeninnendrucks. Es konnte gezeigt werden, dass vor allem EP₂-Rezeptoren in den Gefäßen des Balkenwerks (Trabecular Meshwork = TM) des Auges angereichert sind. Tränen verlassen das Auge über das TM und der Schlemm-Kanal, und EP₂-Rezeptor- Agonisten beeinflussen die Dynamik der Tränenflüssigkeit, indem sie den Ausfluss der Tränenfüßigkeit stimulieren und so zu einer Erniedrigung des Innen-Augendrucks führen (W. Kamphuis et al. Current Eye Res. 2004, 29, 17–26). Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen für die Behandlung von erhöhtem Augeninnendruck wie u. a. beim Glaukom.
Prostaglandine spielen auch eine wichtige Rolle bei den Prozessen, die dem Knochenschwund entgegenwirken. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen für die Behandlung von Knochenschwund.
Prostaglandine spielen auch eine wichtige Rolle bei den Prozessen, die den Blutdruck regulieren. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen für die Behandlung von Bluthochdruck.
Prostaglandine beeinflussen auch die Produktion von Cytokinen. Multiple Sklerose (MS) wird als eine systemische, durch T-Lymphozyten vermittelte Autoimmunkrankheit angesehen, deren Zielgewebe das zentrale Nervensystem ist. Die Cytokin-Freisetzungsprofile der T-Lymphozyten können entweder zur T-Helfer-1- oder zur T-Helfer-2-(Th-1- oder Th-2-)Linie tendieren. Th-1-Zellen sezernieren Cytokine wie Interferon-gamma (INF-γ) und induzieren eine zellvermittelte Immunreaktion, während Th-2-Zellen IL-4, IL-5 und IL-10 sezernieren und eine humorale oder antikörpervermittelte Reaktion induzieren (Mossman et al. 1989, Annual Rev Immunol. 7: 145–173). Die Expression von INF-γ ist mit MS assoziiert, und bei Anwendung einer mehrere Faktoren in Betracht ziehenden Skala als Maß für die Behinderung findet man eine signifikante Korrelation zwischen der Expression von INF-γ als Reaktion auf PLP-Peptide und MBP-Peptide mit der Krankheit (Hirsch et al. 1985, J. Clin Immunol Nov; 5(6): 386–389; Moldovan et al. 2003, J. Neuroimmunol. Aug; 141(1–2): 132–140). Wichtig ist, dass klinische Studien zeigen, dass die Verabreichung von INF-γ bei MS-Patienten zu Verschlimmerungen führt (Panitch et al., Lancet, Apr 18; (8538): 893–895).
Aus der Tabelle 2 geht hervor, dass der EP₂-Agonist zu einer Inhibierung der INF-γ-Expression aus aktivierten T-Zellen von humanen Spendern im Assay mit aktivierten T-Zellen führt. In der Tabelle 3 ist die Herunterregulierung von mit Th-1-assoziierten Cytokinen in Gegenwart eines EP₂-Agonisten in einem Assay mit von aktivierten Monozyten humaner Spender gewonnenen dendritischen Zellen gezeigt. Daher wird angenommen, dass der EP₂-Agonist die Expression von INF-γ in MS-Patienten reduzieren sollte, einmal, indem er die INF-γ-Expression direkt inhibiert, und außerdem durch ein Wegleiten der durch dendritischen Zellen vermittelten Polarisierung von CD4+-T-Zellen von der INF-γ-exprimierenden Th-1-Linie.
Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie einer aus der aus multipler Sklerose, sekundärer progressiver multipler Sklerose, Psoriasis, rheumatoider Arthritis, Morbus Crohn und Alopecia areata bestehenden Gruppe ausgewählten Autoimmunerkrankung.
Soweit die Herstellung der Ausgangsverbindungen nicht beschrieben wird, sind diese bekannt oder analog zu bekannten Verbindungen oder hier beschriebenen Verfahren herstellbar. Es ist ebenfalls möglich, alle hier beschriebenen Umsetzungen in Parallel-Reaktoren oder mittels kombinatorischer Arbeitstechniken durchzuführen.
Die Isomerengemische können nach üblichen Methoden wie beispielsweise Kristallisation, Chromatographie oder Salzbildung in die Enantiomeren bzw. E/Z-Isomeren aufgetrennt werden.
Die Herstellung der Salze erfolgt in üblicher Weise, indem man eine Lösung der Verbindung der Formel I mit der äquivalenten Menge oder einem Überschuss einer Base oder Säure, die gegebenenfalls in Lösung ist, versetzt und den Niederschlag abtrennt oder in üblicher Weise die Lösung aufarbeitet.
Die Erfindung betrifft damit auch Arzneimittel auf Basis der Verbindungen der allgemeinen Formel I und der üblichen Hilfs- oder Trägerstoffe.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne dass damit eine Begrenzung vorgenommen wird.
Herstellungsbeispiele
Beispiel 1
(5Z,13E)-(9R,11R)-9-Chlor-11-[(2H)-tetrahydropyran-2-yloxy]-17,17-tetramethylen-20-nor-5,13-prostadiensäuremethylester
Zu einer Lösung von 290 mg 1-Phenylsulfonyl-4,4-(trimethylen)hexan in 2,4 ml Tetrahydrofuran werden bei –78°C unter Stickstoff 0,68 ml einer 1,6 M Butyllithiumlösung in Hexan getropft und 1,5 Stunden bei –78°C nachgerührt. Diese Lösung wird dann bei –100°C zu einer Lösung aus 315 mg Aldehyd (gemäß Beispiel 1c) in 2,4 ml Tetrahydrofuran getropft. Anschließend wird 30 Min. bei –100°C und 1 Std. bei –78°C gerührt. Nun werden 0,16 ml Essigsäureanhydrid zum Reaktionsgemisch gegeben, und das Gemisch wird innerhalb 1 Std. auf Raumtemperatur erwärmt. Das Reaktionsgemisch wird mit Ammoniumchloridlösung versetzt, 3 × mit Essigester extrahiert, die vereinigten organischen Phasen werden 1 × mit Wasser und 1 × mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Das Zwischenprodukt wird in 6 ml Methanol gelöst und unter Stickstoff mit 160 mg Magnesium-Pulver versetzt. Anschließend wird 15 Min. bei Raumtemperatur nachgerührt. Nun wird 1 Tropfen Chlortrimethylsilan zum Reaktionsgemisch gegeben und weitere 3 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird auf 5 ml eiskalte Ammoniumchlorid-Lösung gegeben, 3 × mit Essigester extrahiert, die vereinigten organischen Phasen 1 × mit Wasser und 1 × mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Nach Chromatografie an Kieselgel mit Hexan-Essigester (8:2) werden 140 mg des Esters erhalten.
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 0,75 (3H), 1,4-2,4 (30H), 3,44 (1H), 3,66 (3H), 3,8-4,15 (3H), 4,63 (1H), 5,15-5,65 (4H)
Der Ausgangsaldehyd wird wie folgt hergestellt:
1a) (5Z)-(9R,11R,13RS,14RS,15S)-9-Chlor-11,15-dihydroxy-16,16-dimethyl-13,14-epoxy-5-prostensäuremethylester
Zu einer Lösung aus 6,52 g (5Z,13E)-(9R,11R,15R)-9-Chlor-11,15-dihydroxy-16,16-dimethyl-5,13-prostadiensäuremethylester in 33 ml Methylenchlorid werden bei –20°C und unter Stickstoff 4,7 ml Titan-IV-isopropylat getropft, und es wird 30 Min. bei –20°C gerührt. Nun wird das Reaktionsgemisch mit 6 ml tert.-Butylhydroperoxid versetzt. Anschließend wird eine Lösung aus 10 g Eisensulfat und 20 g Citronensäure in 100 ml Wasser hinzugefügt und 3 × mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden 1 × mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Nach Chromatographie an Kieselgel mit Methylenchlorid/Essigester (0–40%) werden 3,55 g des Epoxids als farbloses Öl erhalten.
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 0,75-1,05 (9H), 1,1-2,4 (18H), 2,9-3,0 (2H), 3,2 (1H), 3,65 (3H), 4,0-4,15 (2H), 4,63 (1H), 5,3-5,55 (2H)
1b) (5Z)-(9R,11R)-9-Chlor-11-hydroxy-14,15,16,17,18,19,20-heptanor-12-oxo-5-prostensäuremethylester
5 g Periodsäure werden unter Stickstoff in 360 ml Ether 1 Std. kräftig gerührt. 125 ml dieser Lösung werden zu einer Lösung aus 2 g des Epoxids in 5 ml Ether gegeben und bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Nach 1 Std. werden weitere 125 ml Periodsäure-Lösung zum Reaktionsgemisch gegeben, und nach 2 Std. wird der Rest der Periodsäure-Lösung hinzugefügt. Nach Filtration wird das Filtrat 1 × mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung, 1 × mit Wasser und 1 × mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 1,9 g des Aldehyds.
1c) (5Z)-(9R,11R)-9-Chlor-11-[(2H)-tetrahydropyran-2-yloxy]-14,15,16,17,18,19,20-heptanor-12-oxo-5-prostensäuremethylester
1,9 g des Aldehyds werden in 20 ml Methylenchlorid gelöst, mit 1,6 ml Dihydropyran und 8,8 mg pTsOH versetzt und 30 Min. gerührt. Anschließend wird mit Ether verdünnt, 1 × mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 1 × mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Nach 2maliger Chromatographie an Kieselgel [1. Säule: Methylenchlorid/Essigester (2–10%), 2. Säule: Hexan/Essigester (0–20%)] werden 720 mg des Tetrahydropyranylethers erhalten.
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 1,35-2,7 (17H), 3,65 (3H), 3,4-4,1 (3H), 4,58 (2H), 5,3-5,55 (2H), 9,75 (1H)
Herstellung des Sulfons
1d) 2,2-(Trimethylen)-butancarbonsäure
Zu 275 ml Buthyllithium (1 M in Hexan) wird bei –10°C unter Stickstoff eine Lösung aus 61,6 ml Diisopropylamin in 180 ml Tetrahydrofuran getropft, und es wird 30 Min. bei –10°C nachgerührt. Bei –20°C werden 19,1 ml Cyclobutancarbonsäure zum Reaktionsgemisch getropft und es wird 4 Stunden nachgerührt, dabei erwärmt sich das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur. Die Suspension wird auf 300 ml Eiswasser gegossen, mit 2 N Salzsäure auf pH 1 eingestellt, 4 × mit je 300 ml Ether extrahiert, und die vereinigten organischen Phasen wird werden 1 × mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 30,1 g der Carbonsäure.
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 0,88 (3H), 1,75-1,95 (6H), 2,4 (2H)
1e) 2,2-Trimethylenbutan-1-al
Zu einer Lösung aus 25,6 g 1d in 300 ml Aceton werden bei Raumtemperatur unter Stickstoff 62,2 g Kaliumcarbonat und 28 ml Methyliodid gegeben, und es wird 12 Stunden nachgerührt. Anschließend wird der Niederschlag abgesaugt, und das Filtrat bei Raumtemperatur im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wird in 500 ml Ether gelöst und 1 × mit Wasser und 1 × mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, und die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird im Vakuum bei 110°C und 85 mbar destilliert (Siedepunkt: 85–90°C). Ausbeute: 24,5 g des Esters.
20 g des Esters werden in 40 ml Ether gelöst, diese Lösung wird bei 0°C unter Stickstoff zu einer Suspension von 4,8 g Lithiumaluminiumhydrid in 390 ml Ether getropft, und es wird eine Stunde bei 0°C und 1 Stunde bei Raumtemperatur nachgerührt. Das überschüssige Lithiumaluminiumhydrid wird bei 0°C sehr vorsichtig mit 11 ml Wasser, 11 ml 15%iger Natronlauge und wieder mit 30 ml Wasser zerstört. Nach 20minütigem Rühren erfolgt eine Filtration, anschließend wird ausgiebig mit Ether gewaschen, und das Filtrat wird über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 16,3 g des Alkohols.
Zu einer Lösung von 8 g Alkohol in 450 ml Methylenchlorid und 100 ml Dimethylsulfoxid werden bei Raumtemperatur unter Stickstoff 48 ml Triethylamin und 22,27 g SO₃-Pyridin-Komplex gegeben. Es wird 1 Stunde gerührt, anschließend mit 300 ml gesättigter Ammoniumchlorid-Lösung versetzt und nochmals 15 Min. gerührt. Nun wird mit 1,5 l Ether verdünnt, die Phasen werden getrennt und die organische Phase wird 2 × mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 9,5 g des Aldehyds.
1f) 4,4-(Trimethylen)-2-hexencarbonsäureethylester
Zu einer Suspension von 3,39 g Natriumhydrid in 60 ml Tetrahydrofuran wird bei 0°C unter Stickstoff eine Lösung von 18,3 ml Phosphonoessigsäuretriethylester in 20 ml Tetrahydrofuran getropft, und es wird 30 Min. bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird der Aldehyd (hergestellt in 1e) bei 0°C zum Reaktionsgemisch getropft, und es wird 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nun wird mit gesättigter Ammoniumchlorid-Lösung gequenscht, 3 × mit Ether extrahiert, und die vereinigten organischen Phasen werden 1 × mit Wasser und 1 × mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Nach Chromatographie an Kieselgel mit Hexan/Ether (0–10%) werden 9,81 g des Esters erhalten.
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 0,71 (3H), 1,27 (3H), 1,65 (2H), 1,78-2,1 (6H), 4,18 (2H), 5,75 (1H), 6,97 (1H)
1g) 4,4-(Trimethylen)hexan-1-o
Zu einer Lösung von 7,8 g des nach 1f) hergestellten Esters in 65 ml Methylenchlorid werden bei –70°C unter Stickstoff langsam 78,5 ml DIBAH getropft. Nach 30 Min. werden langsam 20 ml Isopropanol und anschließend 36 ml Wasser zum Reaktionsgemisch getropft. Es wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, der Niederschlag wird abgesaugt und gut mit Methylenchlorid gewaschen und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Nach Chromatographie an Kieselgel mit Hexan/Essigester (0–40%) werden 5,4 g des Allylalkohols erhalten.
5 g des Allylalkohols werden in 200 ml Essigester gelöst, mit 500 mg Pd/C versetzt und danach erfolgt eine Filtration und es wird über Celite abgesaugt und gut mit Essigester gewaschen. Nach Einengen des Filtrates im Vakuum werden 4,5 g des primären Alkohols erhalten.
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 0,8 (3H), 1,2-1,9 (12H), 3,6 (2H)
1h) 1-Phenylthio-4,4-(trimethylen)hexan
Zu einer Mischung aus 4,4 g des nach 1g) hergestellten Alkohols, 25 ml Toluol, 997 mg Ammoniumtetrabutylbromid und 46 ml 2 N NaOH wird bei 0°C unter Stickstoff eine Lösung von 6,19 g p-Toluolsulfonylchlorid in 7,4 ml Toluol getropft, und die Mischung wird 2 Stunden nachgerührt. Anschließend werden die Phasen getrennt, und die organische Phase wird 3 × mit Wasser und 1 × mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Nach Chromatographie an Kieselgel mit Hexan/Ether (0–20%) werden 4,6 g des Thioethers erhalten.
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 0,75 (3), 1,39 (2H), 1,45-1,88 (10H), 2,88 (2H), 7,15-7,53 (5H)
1i) 1-Phenylsulfonyl-4,4-(trimethylen)hexan
Zu einer Lösung von 4,6 g des nach 1h) hergestellten Produkts in 70 ml Methanol wird bei 0–10°C unter Stickstoff eine Lösung von 18 g Ozon in 70 ml Wasser getropft, und es wird 2 Stunden nachgerührt. Anschließend wird mit 100 ml Wasser verdünnt und 4 × mit Essigester extrahiert, und die vereinigten organischen Phasen werden 1 × mit Wasser, 2 × mit gesättigter Thiosulfat-Lösung und 1 × mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Nach Chromatographie an Kieselgel mit Hexan/Essigester (0–20%) werden 2,55 g des Sulfons erhalten.
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 0,7 (3H), 1,3-1,85 (12H), 3,08 (2H), 7,5-7,7 (3H), 7,9 (2H)
Beispiel 2
(5Z,13E)-(9R,11R)-9-Chlor-11-hydroxy-17,17-tetramethylen-20-nor-5,13-prostadiensäure-methylester
Zu einer Lösung von 140 mg des in Beispiel 1 hergestellten Produktes in 1,5 ml Methanol werden bei 0°C unter Stickstoff 2,5 mg pTsOH gegeben, und es wird 3 Stunden gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch auf 3 ml gesättigte Natriumcarbonat-Lösung gegossen und 3 × mit Essigester extrahiert, und die vereinigten organischen Phasen werden 1 × mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Nach Chromatographie an Kieselgel mit Hexan/Essigester (0–50%) erhält man 105 mg des Alkohol.
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 0,75 (3H), 1,38-2,4 (24H), 3,65 (3H), 3,9-4,13 (2H), 5,2-5,63 (4H)
Beispiel 3
(5Z,13E)-(9R,11R)-9-Chlor-11-hydroxy-17,17-tetramethylen-20-nor-5,13-prostadiensäure
Zu einer Lösung von 68 mg des in Beispiel 2 hergestellten Alkohols in 1 ml Methanol werden unter Stickstoff 0,2 ml 2 N Natronlauge gegeben, und es wird 5 Stunden nachgerührt. Anschließend wird mit 1 ml Wasser verdünnt, mit 2 N Salzsäure auf pH 3 eingestellt, 3 × mit Essigester extrahiert, und die vereinigten organischen Phasen werden 1 × mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Nach Chromatographie an Kieselgel mit Hexan/Essigester (50–80%) werden 50,3 mg der Carbonsäure erhalten.
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 0,75 (3H), 1,38-2,4 (24H), 3,9-4,1 (2H), 5,2-5,62 (4H)
Biologische Beispiele:
1. Nachweis des Antagonismus des humanen Prostaglandin-E₂-(Subtyp EP₂) Rezeptorsignals
1.1 Nachweisprinzip
Die Bindung von PGE₂ an den EP₂-Subtyp des humanen PGE₂-Rezeptors induziert die Aktivierung membranständiger Adenylatzyklasen und führt zur Bildung von cAMP. In Gegenwart des Phosphodiesteraseinhibitors IBMX wird das durch diese Stimulation akkumulierte und mittels Zell-Lyse freigesetzte cAMP in einem kompetitiven Nachweisverfahren eingesetzt. In diesem Test konkurriert das cAMP im Lysat mit cAMP-XL665 um die Bindung eines mit Eu-Kryptat markierten Anti-cAMP-Antikörpers.
Dabei entsteht in Abwesenheit von zellulärem cAMP ein maximales Signal, welches auf der Kopplung dieses Antikörpers an das cAMP-XL665-Molekül beruht. Dadurch entsteht nach Anregung bei 337 nm ein auf FREI (fluorescence resonance energy transfer) basierendes, langanhaltendes Emmisionssignal bei 665 nm (und bei 620 nM). Beide Signale werden in einem geeigneten Messgerät zeitlich versetzt, d. h. nach Abklingen der Hintergrundfluoreszenz gemessen. Jegliche Erhöhung des durch Prostaglandin-E₂-Gabe bedingten niedrigen FREI-Signals (gemessen als Well-Ratio-Veränderung = Emmision_665nm/Emmision_620nm·10000) zeigt die Wirkung von Antagonisten.
1.2. Nachweisverfahren
1.2.1 Test auf Antagonismus (Angaben pro Vertiefung einer 384-Loch-Platte):
Die in einer Testplatte und 30% DMSO vorgelegten Substanzlösungen (0,75 μl) werden in 16 μl einer KRSB + IBMX-Stimulationslösung gelöst (1 × Krebs-Ringer-Hydrogencarbonatpuffer; Sigma-Aldrich # K-4002; inklusive 750 μM 3-Isobutyl-1-methylxanthin Sigma-Aldrich # I-7018), anschließend werden 15 μl davon in eine medienfreie Zellkulturplatte überführt, die kurz zuvor mit KRSB gewaschen worden war.
Nach einer 30minütigen Vorinkubation bei Raumtemperatur (RT) werden 5 μl einer 4×PGE₂-Lösung (11 nM) zugegeben und in Gegenwart des Agonisten für weitere 60 min bei RT inkubiert (Volumen: –20 μl), bevor die Reaktion anschließend durch Zugabe von 5 μl Lysepuffer gestoppt und für weitere 20 min bei RT inkubiert wird (Volumen: –25 μl). Das Zell-Lysat wird anschließend in eine Messplatte überführt und entsprechend den Herstellerangaben (cyclic AMP kit Cisbio International # 62AMPPEC) gemessen.
1.2.2 Test auf Agonismus (Angaben pro Vertiefung einer 384-Loch-Platte):
Die in einer in einer Testplatte und 30% DMSO vorgelegten Substanzlösungen (0,75 μl) werden in 16 μl einer KRSB + IBMX-Stimulationslösung gelöst (1 × Krebs-Ringer-Hydrogencarbonatpuffer; Sigma-Aldrich # K-4002; inklusive 750 μM 3-Isobutyl-1-methylxanthin Sigma-Aldrich # I-7018), anschließend werden 15 μl davon in eine medienfreie Zellkulturplatte überführt, die kurz zuvor mit KRSB gewaschen worden war.
Nach einer 60minütigen Inkubation bei Raumtemperatur (RT; Volumen: –15 μl) wird die Reaktion anschließend durch Zugabe von 5 μl Lysepuffer gestoppt und für weitere 20 min bei RT inkubiert (Volumen: –20 μl). Das Zell-Lysat wird anschließend in eine Messplatte überführt und entsprechend den Herstellerangaben (cyclic AMP kit Cisbio International # 62AMPPEC) gemessen.
Die Testverbindung zeigte im zellulären Agonismustest eine sehr hohe Wirksamkeit (EC₅₀ < 9,5 × 10e-10M), ohne jegliche Inhibition im Antagonismustest (IC₅₀ > 2 × 10e-5M).
2. Der EP₂-Subtyp des PGE₂-Rezeptors und die präovulatorische Kumulusexpansion
2.1. Hintergrund:
Im prä-ovulatorischen antralen Follikel ist die Eizelle von Kumulus-Zellen umgeben, die einen dichten Zellkranz um die Eizelle bilden. Nach dem LH-Peak (Lutenisierendes Hormon) wird eine Reihe von Prozessen aktiviert, die eine starke morphologische Veränderung dieses Zellkranzes aus Kumulus-Zellen zur Folge hat. Hierbei bilden die Kumulus-Zellen eine extrazelluläre Matrix, die zur sogenannten Kumulusexpansion führt (Vanderhyden et al. Dev Biol. 1990 Aug; 140(2): 307–317). Diese Kumulusexpansion ist ein wichtiger Bestandteil des ovulatorischen Prozesses und der nachfolgenden Möglichkeit zur Fertilisation.
Bei der Kumulusexpansion sind Prostaglandine und hier das Prostaglandin E₂, dessen Synthese durch den LH-Peak induziert wird, von entscheidender Bedeutung. Prostanoid-EP₂-Knockout-Mäuse (Hizaki et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Aug 31; 96(18): 10501–6) zeigen eine deutlich verminderte Kumulus Expansion und starke Subfertilität, was die Bedeutung des Prostanoid-EP₂-Rezeptors für diesen Prozess demonstriert.
2.2. Kumulusexpansions-Test in vitro
In immaturen weiblichen Mäusen (Stamm: CD1 (ICR) von Charles River) wird in einem Alter von 20–24 Tagen die Follikulogenese durch eine einmalige Gabe (intraperitoneal) von 7,5 I.E. PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropine; Sigma G-4877, Lot 68H0909) induziert. 47–50 Stunden nach der Injektion werden die Ovarien entnommen und die Kumulus-Eizell-Komplexe entnommen. Der Kumulus-Komplex ist in diesem Stadium noch nicht expandiert.
Die Kumulus-Eizell-Komplexe werden nun für 20–24 Stunden mit Prostaglandin E₂ (PGE₂) (1 μM), Vehikel Kontrolle (Ethanol) oder Testsubstanzen inkubiert. Medium: alpha-MEM-Medium mit 0,1 mM IBMX, Pyruvat (0,23 mM) Glutamin (2 mM), Pen/Strep 100 IU/ml Pen. und 100 μg/ml Strep.) und HSA (8 mg/ml)). Danach wird die Kumulusexpansion durch die Einteilung in vier Stadien (nach Vanderhyden et al. Dev Biol. 1990 Aug; 140(2): 307–317) festgestellt.
Die Testsubstanz führt konzentrationsabhängig zu einer starken Expansion des Kumulus Komplexes. Die durch die Testsubstanz induzierte Kumulus-Expansion ist in Konzentrationen von 0,5 μM und 1 μM equivalent zu der Kumulusexpansion, die durch den natürlichen EP₂-Rezeptoragonisten PGE₂ in einer Konzentration von 1 μM induziert wird (n = 16 Kumulus-Eizell-Komplexe pro Gruppe; siehe 1).
2.3. Ovulationstest in vivo:
In immaturen weiblichen Mäusen (Stamm: (B6D2F1) von Charles River) wird in einem Alter von 16–20 Tagen die Follikulogenese durch eine einmalige Gabe (intraperitoneal) von 10 I.E. PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropine; Sigma G-4877, Lot 68H0909) induziert. 47–50 Stunden nach der PMSG-Stimulierung wird mit einer Gabe von 10 IU HCG (Human Chorion Gonadotropin) die finale Follikelreifung und Ovulation induziert. Die Testsubstanz wird 10 Stunden, 5 Stunden und 0 Stunden vor der HCG Gabe (s. c. in Benzylbenzoat/Rhizinusöl 1 + 4 v/v) appliziert. Vierzehn Stunden nach der HCG-Gabe erfolgt die Autopsie, und die Anzahl der ovulierten Eizellen im Eileiter wird bestimmt.
Der EP₂-Agonist führt konzentrationsabhängig zu einer signifikanten Erhöhung der ovulierten Eizellen. Diese signifikante Erhöhung der ovulierten Eizellen tritt bereits bei einer Gabe von jeweils 0,00015 mg/Tier auf und zeigt, dass selbst bei einer standardmäßig zur Ovulation verwendeten Dosis von HCG eine Steigerung der Anzahl der ovulierten Eizellen möglich ist (n = 11–12 Tiere pro Gruppe; **p < 0,005 und *p < 0,05).
3. Der EP₂-Subtyp des PGE₂-Rezeptors und der Cytokin-Freisetzungsassay
3.1. Hintergrund
Zunehmende Befunde deuten darauf hin, dass die Endometriose mit einer signifikanten entzündlichen Reaktion assoziiert ist, die durch aktivierte Makrophagen und Lymphozyten und erhöhte Konzentrationen an Cytokinen, Chemokinen und Wachstumsfaktoren vermittelt werden kann. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese entzündlichen Prozesse einige der mit Endometriose assoziierten klinischen Merkmale vermitteln. Es ist bekannt, dass die Peritonealflüssigkeit von Frauen mit Endometriose mehr inflammatorische Zellen und die damit assoziierten Cytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren enthält (Murphy AA. Clinical aspects of endometriosis. Ann NY Acad Sci. März 2002; 955: 1–10). Das Ergebnis ist eine Umgebung, die die Implantation und die Proliferation fördert.
Prostaglandine, und hier Prostaglandin E₂, reduzieren die Expression von inflammatorischen Cytokinen wie TNFα aus aktivierten Makrophagen. Prostanoid-EP₂-Knockout-Mäuse (Shinomiya S et al., Bioch Phar 2001; 61: 1153) reagierten nicht auf EP₂-Agonisten, was zeigt, wie wichtig der Prostanoid-EP₂-Rezeptor für diesen Prozess ist.
3.2. Cytokin-Freisetzungsassay in vitro
Von Monozyten humaner Spender gewonnene dendritische Zellen werden 6 Tage lang in RPMI-1640 mit 10% fetalem Rinderserum in Gegenwart von 10 ng/ml IL-4 und 200 ng/ml GM-CSF kultiviert. Die Zellen werden mit verschiedenen Aktivierungsstimuli aktiviert: 10 ng/ml LPS (Sigma), 5 μg/ml rekombinantem humanen CD-40-Linganden (R & D Systems) oder 5 μM humaner CpG-DNA (HyCult Biotechnology) in Gegenwart von Prostaglandin E₂ (PGE₂) (1 μM), Vehikelkontrolle (DMSO) oder Testsubstanzen (1 μM) über 18 Stunden. Die Konzentrationen an TNFα im Zellkulturüberstand individueller Spender werden mit kommerziellen ELISA-Kits gemessen. Die Testsubstanzen bewirken eine Inhibierung der in den Kulturüberstanden gemessenen Cytokinkonzentrationen, wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist.
3.3. Cytokin-Freisetzungsassay ex vitro
Die Testsubstanz oder Vehikelkontrolle wird Behandlungsgruppen von CD-1-Mäusen mit einem Gewicht von jeweils 30–35 g (n = 5) introperitoneal verabreicht. Zwanzig Minuten später werden die Mäuse getötet, die Milzen werden entnommen und die Splenozyten werden in RPMI + 10% fetalem Rinderserum kultiviert. Die Zellen werden mit PHA und ConA in Abwesenheit von Testsubstanz aktiviert und 18 Stunden lang kultiviert. Die Konzentrationen an TNFα im Zellkulturüberstand individueller Mäuse werden mit kommerziellen ELISA-Kits gemessen. Der EP₂-Agonist bewirkt eine signifikante Abnahme der TNFα-Konzentration, wie aus 3 hervorgeht.
4. Nachweis der Inhibierung der Th-1-Cytokinfreisetzung von T-Lymphozyten
4.1. Prinzip
Die Aktivierung einer humannen T-Lymphozyte durch eine antigenpräsentierende Zelle und Antigen durch den T-Zellen-Rezeptor wird unter experimentellen Bedingungen durch das Lektin Concanavilin A (ConA) nachgestellt. Es ist bekannt, dass sich ConA an den T-Zellen-Rezeptor bindet und die Zelle dazu anregt, verschiedene Cytokine freizusetzen. Eine der von Th-1 freigesetzten Cytokine ist INF-γ. Die Biochemie und die biologischen Wirkungen von INF-γ wurden in Übersichtsartikeln umfassend diskutiert.
4.2. Nachweisverfahren
INF-γ ist ein Dimer des exprimierten 143-Aminosäure-Proteins. Enzym-linked Immunosorbant Assays (ELISA) auf der Basis von INF-γ-spezifischen Antikörpern sind im Handel erhältlich. Standards und Proben werden in die Vertiefungen einer Mikroplatte pipettiert. Ein für humanes INF-γ spezifischer Antikörper wird in die Vertiefungen gegeben. Den Vertiefungen wird ein Substat zugesetzt, und es entwickelt sich Farbe entsprechend der Menge an gebundenem INF-γ. Gemessen wird die Intensität der Farbe.
4.3. Vorschrift
Von humanen Spendern werden mit einem Ficoll-Dichtegradienten Lymphozyten aus periphärem Blut isoliert, und die verbliebenen roten Blutkörperchen werden durch selektive Lyse entfernt. Die Lymphozyten werden zu ungefähr 10⁶ Zellen pro ml in RPMI1640 mit zusätzlichen 10% an fetalem Rinderserum kultiviert. Die Zellkulturen werden wie oben beschrieben mit 2 μg/ml an ConA aktiviert. Während der ConA-Aktivierung wird Testsubstanz in verschiedenen Verdünnungen zugesetzt. Die Zellen werden ungefähr 18 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Während der Aktivierung freigesetztes INF-γ wird durch ELISA gemessen.
5. Nachweis der Inhibierung der Cytokinfreisetzung aus von humanen Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen
5.1. Prinzip
Dendritische Zellen (DZ) sind die wirksamsten antigenpräsentierenden Zellen und spielen eine zentrale Rolle bei der Immunreaktion. Nach der Stimulierung durch Toll-like Rezeptoren (TLR) exprimieren DZ proinflammatorische Cytokine und Chemokine und setzen diese frei, und sie können die Aktivierung und Proliferation naive T-Zellen induzieren. Durch die Bindung eines EP₂-Agonisten an den EP-Rezeptor der DZ wird die durch den TLR4-Liganden (LPS) stimulierte Freisetzung von Interkeukin 12 (IL-12) inhibiert. Die Bindung eines EP₂-Agonisten an den EP-Rezeptor der DZ inhibiert nicht die durch den TLR4-Liganden (LPS) stimulierte Freisetzung von Interkeukin 10 (IL-10) inhibiert. Ein EP₂-Agonist lenkt also die CD4-T-Zellen-Differenzierung weg von der Th-Linie.
5.2. Nachweiseverfahren
Bei IL-12 handelt es sich um ein 75-kDa-Glycoprotein-Heterodimer (p70), das aus zwei über eine Disulfidbrücke verbundenen, genetisch nicht miteinander verwandten Untereinheiten aufgebaut ist. Auf für IL-12 p70 spezifischen Antikörpern basierende Enzyme-linked Immunosorbant Assays (ELISA) sind im Handel erhältlich. Standards und Proben werden in die Vertiefungen einer Mikroplatte pipettiert. Ein für humanes IL-12 spezifischer Antikörper wird in die Vertiefungen gegeben. Den Vertiefungen wird ein Substat zugesetzt, und es entwickelt sich Farbe entsprechend der Menge an gebundenem IL-12. Gemessen wird die Intensität der Farbe.
IL-10, das zunächst als Cytokine Synthesis Inhibitory Factor (CSIF) bezeichnet wurde, wurde ursprünglich als ein Produkt von Th-2-Klonen identifiziert, das die Produktion von Cytokinen durch Th-1-Klone als Reaktion auf eine Stimulierung durch Antigen in Gegenwart von antigenpräsentierenden Zellen unterdrückt. Bei IL-10 handelt es sich um ein aus zwei identischen 160-Aminisäure-Untereinheiten bestehendes Dimer. Auf für IL-10 spezifischen Antikörpern basierende Enzyme-linked Immunosorbant Assays (ELISA) sind im Handel erhältlich. Standards und Proben werden in die Vertiefungen einer Mikroplatte pipettiert. Ein für humanes IL-10 spezifischer Antikörper wird in die Vertiefungen gegeben. Den Vertiefungen wird ein Substat zugesetzt, und es entwickelt sich Farbe entsprechend der Menge an gebundenem IL-10. Gemessen wird die Intensität der Farbe.
5.3. Vorschrift
Von humanen Spendern werden mit einem Ficoll-Dichtegradienten von humanen Monozyten gewonnene dendritische Zellen isoliert, und die verbliebenen roten Blutkörperchen werden durch selektive Lyse entfernt. Für die Abtrennung von humanen Zellen auf der Basis der Expression des CD14-Antigens werden CD14-MicroBeads eingesetzt. Die dendritischen Zellen werden zu ungefähr 1,5 × 10⁶ Zellen pro ml in RPMI 1640 mit fetalem Rinderserum, 200 ng/ml GM-CSF (Leukin) und 10 ng/ml IL-4 kultiviert. Die Zellen werden 3 Tage lang wachsen gelassen, und dann wird das Medium gewechselt. Die Zellkulturen werden mit 10 ng/ml LPS aktiviert. Während der LPS-Stimulierung werden 1 μM Substanz (EP₂-Agonist) und 1 μM PGE₂ zugesetzt. Die Zellen werden ungefähr 18 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Während der Aktivierung freigesetztes IL-12 und IL-10 wird durch ELISA gemessen.
Tabellen:
Tabelle 1 zeigt die Wirkung von Testsubstanz auf die TNFα-Freisetzung aus aktivierten monozytischen Zellen in vitro. Die Testsubstanz wird in einer Konzenrtation von 18 mM verabreicht. Dei Zellen werden 18 Stunden lang aktiviert. Die Testsubstanz zeigt bei der Th-1-Cytokinfreisetzung aus T-Lymphozyten eine sehr hohe dosisabhängigeinhibitorische Aktivität.
Aus der Tabelle 2 geht die Wirkung von Testsubstanz auf die Th-1-Cytokinfreisetzung aus T-Lymphozyten hervor. Die Testsubstanz wird Zellen während ihrer Aktivierung durch ConA dosisabhängig (0–20 nM) zugesetzt, die Zellen werden 18 Stunden lang inkubiert.
Aus den Tabellen 3a) und b) geht die Wirkung von Testsubstanz auf die Inhibierung der Cytokinfreisetzung aus von humanen Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen hervor. Testsubstanz oder PGE₂ wird in einer Konzentration von 1 μM während der Stimulierung von Zellen mit LPS zugesetzt. Die Zellen werden 18 Stunden lang inkubiert. Die Testverbindung zeigt eine hohe immunmodulatorische Aktivität beim Cytokinfreisetzungsassay mit von humanen Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen (DZ) und eine Unterdrückung des Th-1-fördernden IL-12 (3a), während es das Th-2-fördernden IL-12 nicht beeinflußte bzw. sogar erhöhte (3b).
Abbildungen:
1 zeigt die durch die Testsubstanz induzierte Kumulusexpansion in Konzentrationen von 0,5 μM und 1 μM. Diese Expansion ist equivalent zu der Kumulusexpansion, die durch den natürlichen EP₂-Rezeptoragonisten PGE₂ in einer Konzentration von 1 μM induziert wird (n = 16 Kumulus-Eizell-Komplexe pro Gruppe)
2 zeigt die durch die Testsubstanz induziert Ovulation in vivo. Die Testsubstanz wird in den Konzentrationen von 0,00015; 0,0015 und 0,015 mg/Tier 10, 5 und 0 Stunden vor HCG verabreicht.

3 zeigt die Wirkung der Testsubstanz auf die ex-vivo-Aktivierung von Mäuse-Splenozyten. Die Zellen werden mit PHA oder ConA aktiviert. Die Testsubstanz wird intraperitoneal in Konzentrationen von 1 und 2 μg/Tier verabreicht, 20 min bevor die Tiere getötet werden. Tabelle 1: Inhibierung der TNFα-Freisetzung aus aktivierten monozytischen Zellen

Testsubstanz + LPS	Spender 4 (TNFα pg/ml)	Spender 6 (TNFα pg/ml)
Vehikel	3566,9	10750,1
PGE₂	0,0	174,8
Testsubstanz	643,6	753,7

Testsubstanz + CD40-Ligand	Spender 3 (TNFα pg/ml)	Spender 4 (TNFα pg/ml)	Spender 6 (TNFα pg/ml)
Vehikel	567,1	546,3	541,8
PGE₂	147,9	87,0	54,2
Testsubstanz	274,3	226,8	142,4

Testsubstanz + CpG	Spender 1 (TNFα pg/ml)	Spender 3 (TNFα pg/ml)	Spender 6 (TNFα pg/ml)
Vehikel	2155,6	1340,7	467,8
PGE₂	104,5	70,0	106,2
Testsubstanz	291,3	599,4	115,9

Tabelle 2: Inhibierung der Th-1-Cytokinfreisetzung aus T-Lymphozyten

	Prozentuale Inhibierung unterhalb einer unbehandelten, mit ConA stimulierten Kontrolle (± Standardabweichung)
Testsubstanz [nM]	Spender 1	Spender 2
0	0 ± 6	0 ± 13
0,5	5 ± 5	7 ± 22
1,12	8 ± 4	28 ± 27
2,5	33 ± 13	36 ± 14
5	52 ± 11	56 ± 7
10	70 ± 8	74 ± 3
20	84 ± 1	81 ± 6

Tabelle 3a: Inhibierung der Cytokinfreisetzung aus von humanen Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen, Messung von IL-12 (pg/ml)

	Prozentuale Inhibierung unterhalb einer unbehandelten, mit LPS stimulierten Kontrolle
Spender	Testsubstanz [1 μM]	PGE₂ [1 μM]
1	64	78
2	7	44
3	38	84
4	29	29

Tabelle 3b: Inhibierung der Cytokinfreisetzung aus von humanen Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen, Messung von IL-10 (pg/ml)

	Prozentuale Inhibierung unterhalb einer unbehandelten, mit LPS stimulierten Kontrolle
Spender	Testsubstanz [1 μM]	PGE₂ [1 μM]
1	144	103
2	168	134
3	153	107

Claims

Verbindungen der allgemeinen Formel I,
wobei R¹ eine CH₂OH-, -COOR²-, -CONHR²- oder -CONHR³-Gruppe, R² ein Wasserstoff, ein C₁-C₁₀-Alkylrest, der gerade oder verzweigt, gegebenenfalls ein- bis mehrfach gesättigt oder ungesättigt ist und gegebenenfalls ein- bis mehrfach substituiert ist durch Halogen, C₁-C₄-Alkoxy, substituiertes C₃-C₁₀-Aryl oder gegebenenfalls substituiertes C₃-C₁₀-Aroyl, Di-C₁-C₅-alkylamino oder Tri-C₁-C₅-alkylamino, ein C₃-C₁₀-Cycloalkyl, das gegebenenfalls substituiert ist durch C₁-C₄-Alkyl, ein C₃-C₁₀-Aryl, das gegebenenfalls substituiert ist mit Phenyl, 1-Naphthyl, 2-Naphthyl, das wiederum in S- und in 4-Stellung durch Fluor, Chlor, Alkoxy oder Trifluormethyl oder in 4-Stellung durch Hydroxy, Halogen, Phenyl, ein oder mehrere C₁-C₄-Alkylgruppen, Chlormethyl, Fluormethyl, Trifluormethyl, Carboxy-, Hydroxy- oder C₁-C₄-Alkoxy substituiert sein kann, oder ein C₃-C₇-Heterocycloalkyl, R³ eine C₁-C₁₅-Carbonsäure oder C₁-C₁₅-Sulfonsäure, A eine cis-CH=CH- oder -CH₂-CH₂-Gruppe, B eine trans-CH=CH- oder -CH₂-CH₂-Gruppe, W ein C₂-C₆-Alkylen, R⁴ eine Hydroxygruppe, ein Rest O-R⁶ oder O-R⁷, wobei R⁶ ein Tetrahydropyranyl-, Tetrahydrofuranyl-, Trimethylsilyl-, tert.-Butyldimethylsilyl-, tert.-Butyldi phenylsilyl- oder Tribenzylsilylrest und R⁷ eine C₁-C₁₅-Carbonsäure ist, R⁵ ein Wasserstoff, eine C₁-C₁₀-Alkyl- oder C₁-C₁₀-Alkenylgruppe und n die Zahl 1–4 bedeuten, sowie deren Salze und deren Cyclodextrinclathrate mit physiologisch verträgliche Basen.
Verbindungen gemäß Anspruch 1, wobei R¹ eine CH₂OH-, -COOR²-, -CONHR²- oder -CONHR³-Gruppe, R² ein Wasserstoff oder ein C₁-C₁₀-Alkylrest, der gerade oder verzweigt, gegebenenfalls ein- bis mehrfach gesättigt oder ungesättigt ist und gegebenenfalls einfach substituiert ist durch Fluor, Chlor oder Brom, durch C₁-C₄-Alkoxy, substituiertes C₃-C₁₀-Aryl oder gegebenenfalls substituiertes C₃-C₁₀-Aroyl, Di-C₁-C₅-Alkylamino oder Tri-C₁-C₅-Alkylamino, ein C₅-C₆-Cycloalkyl, das gegebenenfalls substituiert ist durch C₁-C₄-Alkyl, ein C₃-C₁₀-Arylrest, der gegebenenfalls substituiert ist mit Phenyl, das in 3- oder 4 Stellung substituiert sein kann durch Fluor, Chlor, Alkoxy oder Trifluormethyl oder in 4-Stellung durch Hydroxy, ein C₅-C₆-Heterocycloalkyl, das ein- oder mehrfach durch Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel unterbrochen sein kann, R³ R eine C₁-C₁₀-Carbonsäure oder C₁-C₁₀-Sulfonsäure, A eine cis-CH=CH- oder -CH₂-CH₂-Gruppe, B eine trans-CH=CH- oder -CH₂-CH₂-Gruppe, W ein C₂-C₆-Alkylen, R⁴ eine Hydroxygruppe, R⁵ ein Wasserstoff, eine C₁-C₆-Alkyl- oder C₁-C₁₀-Alkenylgruppe und n die Zahl 1–4 bedeuten.
Verbindungen gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei R¹ eine -CH₂OH-, -COOR²-, -CONHR^2- oder -CONHR³-Gruppe, R² ein Wasserstoff oder ein C₁-C₄-Alkyl, das gegebenenfalls mit Phenyl substituiert ist, ein C₅-C₆-Cycloalkyl, ein C₃-C₆-Aryl, das gegebenenfalls mit Phenyl substituiert ist, R³ eine C₁-C₆-Carbonsäure oder C₁-C₆-Sulfonsäure, A eine cis-CH=CH- oder -CH₂-CH₂-Gruppe, B eine trans-CH=CH- oder -CH₂-CH₂-Gruppe, W ein C₂-Alkylen, R⁴ eine Hydroxygruppe, R⁵ ein Wasserstoff, gesättigtes C₁-C₄-Alkyl- oder C₁-C₅-Alkenyl und n die Zahl 1–4 bedeuten.
Arzneimittel, die mindestens eine der Verbindungen der Formel I enthalten, gemäß den Ansprüchen 1–3.
Arzneimittel gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Prostaglandinderivat der allgemeinen Formel I in einer wirksamen Menge enthalten ist.
Verbindungen gemäß Anspruch 1–3 und Arzneimittel gemäß den Ansprüchen 4 und 5 mit geeigneten Formulierungs- und Trägerstoffen.
Prostaglandinderivat der allgemeinen Formel I gemäß den Ansprüchen 1–3 zur Verwendung als Arzneimittel.
Arzneimittel gemäß Anspruch 7 zur Förderung der Fertilität.
Arzneimittel gemäß Anspruch 7 zur in vitro Fertilisation.
Arzneimittel gemäß Anspruch 7 zur Ovulationsförderung.
Arzneimittel gemäß Anspruch 7 zur Behebung gestörter Kumulusexpansion und deren Folgen.
Arzneimittel gemäß Anspruch 7 zur Behandlung von Erkrankungen.
Arzneimittel gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Erkrankung um Fertilitätsstörungen handelt
Arzneimittel gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Erkrankung um Menstruationsbeschwerden handelt.
Arzneimittel gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Erkrankung um Endometriose handelt.
Arzneimittel gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Erkrankung um erhöhten Augeninnendruck handelt.
Arzneimittel gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Erkrankung um Osteoporose handelt.
Arzneimittel gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Erkrankung um erhöhten Blutdruck handelt.
Arzneimittel gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Erkrankung um eine Autoimmunkrankheit handelt.
Arzneimittel gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Autoimmunkrankheit ausgewählt ist aus der aus multipler Sklerose, sekundärer progressiver multipler Sklerose, Psoriasis, rheumatoider Arthritis, Morbus Crohn und Alopecia areata bestehenden Gruppe.
Arzneimittel gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Autoimmunkrankheit um multiple Sklerose handelt.
Prostaglandinderivate der allgemeinen Formel I gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 in Form eines pharmazeutischen Präparates für die enterale, parenterale, vaginale und orale Applikation.
Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Aldehyd der allgemeinen Formel II
wobei R¹ die Bedeutung der Reste -COOR², -CONHR³ aufweist sowie A und R⁴ die oben angegebenen Bedeutungen haben, wobei die freie OH-Gruppe in R⁴ geschützt ist, mit dem Carbanion des Sulfons der allgemeinen Formel III
umgesetzt wird und das erhaltene Hydroxysulfon nach Acetylierung reduktiv zum Olefin eliminiert und gegebenenfalls anschließend die in beliebiger Reihenfolge geschützten Hydroxygruppen entschützt und gegebenenfalls verestert, verethert und/oder Doppelbindungen hydriert und/oder eine veresterte Carboxylgruppe (R¹ = COOR²) und/oder eine freie Carboxylgruppe (COOR² mit R² = H) verestert und/oder eine freie Carboxylgruppe (COOR² mit R² = H) in ein Amid (R¹ = CONR²)) überführt und/oder eine freie oder veresterte Carboxylgruppe (R¹ = CONHR³) reduziert wird.