DE602004008903T2

DE602004008903T2 - Verfahren zur Gewinnung von Paclitaxel aus Taxuspflanzen

Info

Publication number: DE602004008903T2
Application number: DE602004008903T
Authority: DE
Inventors: Bruno Gabetta; Gianfranco Zini
Original assignee: Indena SpA
Current assignee: Indena SpA
Priority date: 2004-07-13
Filing date: 2004-07-13
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2024-07-14
Also published as: ATE372993T1; CN100546986C; DK1616868T3; KR20060005958A; PT1616868E; RU2007101233A; EP1616868B1; RU2373198C2; CN1984896A; AU2005261970B2; HK1101822A1; EP1616868A1; IL180643A; JP4890455B2; PL1616868T3; SI1616868T1; ES2293129T3; CY1107803T1; WO2006005429A1; AU2005261970A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zum Gewinnen von Paclitaxel aus Paclitaxel enthaltenden Pflanzen. Insbesondere ist die Erfindung auf Verfahren zum Extrahieren von Paclitaxel aus Pflanzen der Taxaceae-Familie gerichtet, die Pflanzen der Gattung Taxus, wie Taxus media, einschließt, das eine Reihe von Säulenchromatographieschritten, die von der Kristallisation von Paclitaxel gefolgt werden, einbezieht.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Paclitaxel ist eine Antikrebsverbindung, die hauptsächlich aus der Rinde von dem Taxus brevifolia-Baum (Pazifische Eibe) abgeleitet ist. In den 60er-Jahren begann das Nationale Krebs-Institut eine Untersuchung von Pflanzenextrakten, die Antikrebs- oder anti-neoplastische Wirksamkeiten zeigen. Von dem Rohextrakt der Rinde von dem Taxus brevifolia wurde gefunden, dass er eine Vielzahl von Tumoren hemmt. 1971 wurde Paclitaxel isoliert und von M. C. Wani et al. (J. Am. Chem. Soc. 93, 2325 (1971)) beschrieben, der die Struktur von Paclitaxel unter Anwendung chemischer Verfahren und Röntgenkristallographieanalyse definierte. 1979 zeigten Schiff und Mitarbeiter den neuartigen Wirkungsmechanismus von Paclitaxel. Dieser Mechanismus schließt das Binden an Mikroröhren und Verhindern von ihrer Depolymerisation unter Bedingungen, wo Depolymerisation normalerweise stattfinden würde, ein. Paclitaxel wird gegenwärtig bei der Behandlung von Eierstock-, Brust- und nicht kleinzelligem Lungenkrebs verwendet.
Obwohl Paclitaxel ein Naturprodukt ist, das hauptsächlich aus der Rinde der Pazifischen Eibe (T. brevifolia) extra hiert wird, wird es auch in anderen Mitgliedern der Taxaceae-Familie, einschließlich T. canadensis und T. yunnanensis, gefunden. Paclitaxel liegt auch in den auf der Erdoberfläche gebildeten Teilen und Wurzeln von anderen Eibespezies vor, einschließlich der Europäischen Eibe (T. baccata), deren Nadeln Paclitaxel enthalten, und analogen Asiatischen Eiben (T. wallichiana und T. chinensis), und Eibenbäumen, die für Zierzwecke kultiviert wurden. Von den nachstehenden Arten von Taxus-Kulturvariäteten wurde auch gefunden, dass sie Paclitaxel enthalten:
Taxus media, T.x media „Henryi", T.x media „Runyan", T. cuspidata, T.x media „Halloran", T.x media „Hatfield", T.x media „Hicksii", T.x media „Tauntonii", T.x media „Dark Green Spreader", T.x media „Wardii", T.x media „Brownii", T.x media „Densiformis", T.x media „Nigra", T.x cuspidata „Brevifolia" oder T. cuspidata „Spreader".
Alle von diesen Arten enthalten Paclitaxel in sehr begrenzten Mengen. Zum Beispiel enthält die Rinde der T. brevifolia- und T. yunnanensis-Bäume etwa 0,02% Paclitaxel und die Nadeln und Wurzeln von T. media Hicksii-Sträuchern enthalten zwischen etwa 0,005% bis etwa 0,1% Paclitaxel.
Daher ist es von großem Interesse, effiziente Verfahren zum Extrahieren von Paclitaxel mit hoher Reinheit aus Pflanzenmaterial zu entwickeln. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Extrahieren von Paclitaxel mit hoher Reinheit aus Pflanzenmaterial unter Anwendung von Chromatographie, gefolgt von Kristallisation des Paclitaxels, bereit.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Deshalb ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Gewinnen von Paclitaxel mit hoher Reinheit aus Paclitaxel enthaltenden Pflanzen bereitzustellen. Diese Verfahren haben die Vorteile des Absicherns der Stabilität von Paclitaxel, was die Anwendung von verschiedenen Taxus-Kulturvariäteten oder Teil davon erlaubt, unabhängig von dem Gehalt an Paclitaxel, und das Erlauben der maximalen Wiedergewinnung des in der Biomasse vorliegenden Paclitaxels. Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren stellen verschiedene Vorteile gegenüber vorangehenden Verfahren bereit. Zum Beispiel ist es bekannt, dass Paclitaxel durch Abbaureaktionen, wie Epimerisierung in Position 7, Entacetylierung in Position 10 und Abtrennung der Seitenkette in Position 13, beeinträchtigt werden kann. Diese Abbaureaktionen, die sowohl die Qualität als auch Ausbeute des isolierten Paclitaxels beeinflussen, erwachsen aus dem Erhitzen, insbesondere in Medien, die große Mengen alkoholischer Lösungsmittel enthalten. In den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren werden Alkohole in begrenzten Mengen und unter verdünnten Bedingungen verwendet und im Allgemeinen ist kein Erwärmen während des Reaktionsverfahrens einbezogen. Folglich verstärken die hierin beschriebenen Verfahren die Stabilität von Paclitaxel.
Weiterhin können die hierin beschriebenen Verfahren verschiedene Arten von Pflanzenteilen als Ausgangsmaterial verwenden. Insbesondere kann das in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausgangsmaterial die Blätter, Stängel, Zweige, Rinde, Wurzeln allein oder Gemische davon aus einer Paclitaxel enthaltenden Pflanze sein. Das Ausgangsmaterial kann unabhängig von dem Verhältnis der Pflanzenteile, der Beschaffenheit der Taxus-Kulturvariätet und dem Gehalt an Paclitaxel ausgewählt werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren stellen die gleiche Verfahrenswirksamkeit bereit und sichern eine konstante und hohe Qualität von Paclitaxel. Auch erlauben die hierin beschriebenen Verfahren hohe Ausbeuten an Paclitaxel.
Diese Verfahren umfassen das Herstellen eines Paclitaxelextrakts durch Extrahieren von Paclitaxel aus einem Pflanzenmaterial. Paclitaxel wird von dem Paclitaxelextrakt unter Anwendung von Säulenchromatographiesystemen getrennt, wobei jedes Säulenchromatographiesystem eine stationäre Phase und ein Elutionslösungsmittel umfasst, und Kristallisieren des in mindestens einer, in dem Endchromatographieschritt erhaltenen Fraktion enthaltenen Paclitaxels umfasst. In einigen Ausführungsformen wird das Paclitaxel von allen, aus dem Endchromatographieschritt erhaltenen Fraktionen kristallisiert. Die erhaltenen Paclitaxelkristalle können getrocknet werden. Wie vorstehend beschrieben, können verschiedene Biomassen als Ausgangspflanzenmaterial verwendet werden. Wenn Taxusmedien ganze Pflanzen als Biomasse verwenden, ist das Pflanzenmaterial typischerweise aus etwa 40 bis etwa 60 Gewichtsprozent (Gewicht/Gewicht) oberirdischen Teilen und etwa 60 bis etwa 40 Gewichtsprozent (Gewicht/Gewicht) Wurzeln zusammengesetzt. Zusätzlich können die stationäre Phase und das Elutionslösungsmittel zwischen verschiedenen Systemen differieren.
In den erfindungsgemäßen Verfahren wird Paclitaxel aus einem Pflanzenmaterial extrahiert, um einen Paclitaxelextrakt zu bilden. Paclitaxel kann aus dem Pflanzenmaterial unter Anwendung eines Lösungsmittels, wie einer Kombination von Wasser und einem organischen Lösungsmittel, extrahiert werden. Säulenchromatographiesysteme werden zum Abtrennen des Paclitaxels aus dem Paclitaxelextrakt durch Gewinnen mindestens einer Paclitaxel enthaltenden Fraktion nach jeder chromatographischen Trennung und gegebenenfalls Unterziehen der mindestens einen Fraktion vermindertem Druck, um das Elutionslösungsmittel zu entfernen, verwendet. Wenn mehr als eine Fraktion nach jeder Abtrennung gesammelt wird, können mindestens einige der Paclitaxel enthaltenden Fraktionen vor dem Entfernen des Lösungsmittels aus dieser Kombination vereinigt werden. Zusätzlich kann Kristallisieren über einen 24-Stunden-Zeitraum stattfinden und es kann bei Raumtemperatur stattfinden. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Extrahieren von Paclitaxel aus Taxus media durch Extrahieren des Pflanzenmaterials mit einer wässrigen, etwa 40 bis etwa 60 Volumenprozent (Volumen/Volumen) Aceton umfassenden Lösung bei Raumtemperatur bereit.
In einer Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren Herstellen eines Paclitaxelextrakts durch Extrahieren von Paclitaxel aus einem Pflanzenmaterial und dann Abtrennen von Paclitaxel aus dem Paclitaxelextrakt unter Verwendung eines ersten Säulenchromatographiesystems, umfassend eine erste stationäre Phase und ein erstes Elutionslösungsmittel, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten. Paclitaxel wird dann von der mindestens einen Fraktion, unter Verwendung eines zweiten Säulenchromatographiesystems, umfassend eine zweite stationäre Phase und ein zweites Elutionslösungsmittel, abgetrennt, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten. Anschließend wird Paclitaxel von der mindestens einen Fraktion unter Anwendung eines dritten Säulenchromatographiesystems abgetrennt, umfassend eine dritte stationäre Phase und ein drittes Elutionslösungsmittel, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten. Weiterhin wird Paclitaxel von der mindestens einen Fraktion unter Anwendung eines vierten Säulenchromatographiesystems abgetrennt, umfassend eine vierte stationäre Phase und ein viertes Elutionslösungsmittel, um mindestens Cephalomannin zu entfernen und mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten. Das Paclitaxel wird dann von der mindestens einen Fraktion unter Anwendung eines kristallisierenden Lösungsmittels kristallisiert, um Paclitaxelkristalle zu erhalten.
In einer weiteren Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren das Herstellen von Paclitaxelextrakt durch Extrahieren von Paclitaxel aus einem Pflanzenmaterial. Paclitaxel wird dann von dem Paclitaxelextrakt durch Anwenden eines ersten Säulenchromatographiesystems, umfassend eine erste stationäre Phase, und ein erstes Elutionslösungsmittel, abgetrennt, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten und das Elutionsmittel von der mindestens einen Fraktion zu entfernen, um einen ersten Rückstand zu bilden. Anschließend wird Paclitaxel von dem ersten Rückstand durch Anwenden eines zweiten Säulenchromatographiesystems, umfassend eine zweite stationäre Phase und ein zweites Elutionslösungsmittel, abgetrennt, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion aus dem ersten Rückstand zu erhalten, und dann wird das zweite Elutionslösungsmittel von der mindestens einen Fraktion entfernt, um einen zweiten Rückstand zu bilden. Anschließend wird Paclitaxel von dem zweiten Rückstand durch Anwendung eines dritten Säulenchromatographiesystems, umfassend eine dritte stationäre Phase und ein drittes Elutionslösungsmittel, abgetrennt, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion aus dem zweiten Rückstand zu erhalten. Und dann wird das dritte Elutionslösungsmittel von der mindestens einen Fraktion entfernt, um einen dritten Rückstand zu bilden. Paclitaxel wird dann aus dem dritten Rückstand durch Anwenden eines vierten Säulenchromatographiesystems, umfassend eine vierte stationäre Phase und ein viertes Elutionslösungsmittel, abgetrennt, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion von dem dritten Rückstand zu erhalten, und dann wird das vierte Elutionslösungsmittel von dem dritten Rückstand entfernt, um einen vierten Rückstand zu bilden. Das Paclitaxel wird dann aus dem vierten Rückstand unter Anwendung eines Kristallisationslösungsmittels kristallisiert, um Paclitaxelkristalle zu erhalten.
In einer weiteren Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren Herstellen eines Pflanzenmaterialextrakts aus den Taxus media durch Extrahieren des Pflanzenmaterials mit einem wässrigen Lösungsmittel, umfassend etwa 40 bis etwa 60 Volumenprozent (Volumen/Volumen) Aceton bei Raumtemperatur, und dann Herstellen eines Paclitaxelextrakts durch Extrahieren von Paclitaxel aus dem Pflanzenmaterialextrakt. Paclitaxel wird dann von dem Paclitaxelextrakt, umfassend Anwenden eines ersten Chromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase, und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Dichlormethan allein oder ein Gemisch von Dichlormethan und Methanol, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten, abgetrennt. Die mindestens eine Fraktion wird dann vermindertem Druck unterzogen, um das Dichlormethan und/oder Methanol zu entfernen. Paclitaxel wird dann von der mindestens einen Fraktion durch Anwenden eines zweiten Chromatographiesystems, umfassend neutrales Aluminiumoxid als eine stationäre Phase, und als ein Elutionslösungsmittel, umfassend Aceton, abgetrennt, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten, und dann die mindestens eine Fraktion vermindertem Druck unterzogen, um das Aceton zu entfernen. Anschließend wird Paclitaxel von der mindestens einen Fraktion durch Anwenden eines dritten Säulenchromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase, und ein Elutionslösungsmittel, umfassend ein Gemisch von n-Hexan und Aceton, abgetrennt, und, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten, und dann die mindestens eine Fraktion vermindertem Druck unterzogen, um das n-Hexan und Aceton zu entfernen. Darüber hinaus wird Paclitaxel von der mindestens einen Fraktion durch Anwenden eines vierten Säulenchromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase, und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Essigsäure-t-butylester, abgetrennt, um mindestens Cephalomannin zu entfernen und um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten, und die mindestens eine Fraktion vermindertem Druck unterzogen, um Essigsäure-t-butylester zu entfernen. Die mindestens eine Fraktion wird über einen Zeitraum von 24 Stunden unter Verwendung eines Gemisches von Cyclohexan und Aceton als das Kristallisationslösungsmittel bei Raumtemperatur kristallisiert, um Paclitaxelkristalle zu erhalten. Anschließend werden die Paclitaxelkristalle unter Vakuum für 48 Stunden getrocknet.
In einer weiteren Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren Herstellen eines Pflanzenmaterialextrakts aus dem Taxus media durch Extrahieren des Pflanzenmaterials mit einem wässrigen Lösungsmittel, umfassend etwa 40 bis etwa 60 Volumenprozent (Volumen/Volumen) Aceton bei Raumtemperatur, und dann Herstellen eines Paclitaxelextrakts durch Extrahieren von Paclitaxel aus dem Pflanzenmaterialextrakt. Paclitaxel wird dann von dem Paclitaxelextrakt durch Anwenden eines ersten Chromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase, und Elutionslösungsmittel, umfassend Dichlormethan und Methanol, abgetrennt, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten, und dann wird die mindestens eine Fraktion vermindertem Druck unterzogen, um einen Rückstand zu erhalten, und dann der Rückstand in Aceton gelöst, um eine Aceton-Rückstandszusammensetzung zu erhalten. Anschließend wird Paclitaxel von der Aceton-Rückstandszusammensetzung, durch Anwenden eines zweiten Säulenchromatographiesystems, umfassend neutrales Aluminiumoxid als eine stationäre Phase, und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Aceton, abgetrennt, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten. Die mindestens eine Fraktion wird vermindertem Druck unterzogen, um das Aceton zu entfernen. Paclitaxel wird dann von der mindestens einen Fraktion durch Anwenden eines dritten Säulenchromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase, und ein Elutionslösungsmittel, umfassend n-Hexan und Aceton, abgetrennt, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten, und die mindestens eine Fraktion wird vermindertem Druck unterzogen, um das n-Hexan und Aceton zu entfernen. Paclitaxel wird von der mindestens einen Fraktion durch Anwenden eines vierten Säulenchromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase, und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Essigsäure-t-butylester, abgetrennt, um mindestens Cephalomannin zu entfernen und um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten, und Unterziehen der mindestens einen Fraktion vermindertem Druck, um den Essigsäure-t-butylester zu entfernen. Die mindestens eine Fraktion wird über einen Zeitraum von 24 Stunden unter Anwendung eines Gemisches von Cyclohexan und Aceton als Kristall isationslösungsmittel bei Raumtemperatur kristallisiert, um Paclitaxelkristalle zu erhalten. Die Paclitaxelkristalle werden unter Vakuum für 48 Stunden getrocknet.
In einer Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren Herstellen eines Pflanzenmaterialextrakts aus dem Taxus media durch Extrahieren des Pflanzenmaterials mit einer wässrigen Lösung, umfassend etwa 40 bis etwa 60 Volumenprozent (Volumen/Volumen) Aceton bei Raumtemperatur, und Herstellen eines Paclitaxelextrakts durch Extrahieren von Paclitaxel aus dem Pflanzenmaterialextrakt. Paclitaxel wird von dem Paclitaxelextrakt durch Anwenden eines ersten Chromatographiesystems, umfassend neutrales Aluminiumoxid als eine stationäre Phase, und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Dichlormethan und Methanol, abgetrennt, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten, und die mindestens eine Fraktion wird vermindertem Druck unterzogen, um das Dichlormethan und Methanol zu entfernen. Das Paclitaxel wird von der mindestens einen Fraktion durch Anwenden eines zweiten Säulenchromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase, und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Dichlormethan und Methanol, abgetrennt, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten, und die mindestens eine Fraktion wird vermindertem Druck unterzogen, um einen Rückstand zu erhalten, und Auflösen des Rückstands in Aceton, um eine Aceton-Rückstandszusammensetzung zu erhalten. Anschließend wird Paclitaxel von der Aceton-Rückstandszusammensetzung durch Anwenden eines dritten Säulenchromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase, und ein Elutionslösungsmittel, umfassend n-Hexan und Aceton, abgetrennt, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten, und die mindestens eine Fraktion wird vermindertem Druck unterzogen, um das Gemisch von n-Hexan und Aceton zu entfernen. Anschließend wird Paclitaxel von der mindestens einen Fraktion durch Anwenden eines vierten Säulenchromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase, und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Essigsäure-t-butylester, abgetrennt, um mindestens Cephalomannin zu entfernen und um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten, und die mindestens eine Fraktion wird vermindertem Druck unterzogen, um Essigsäure-t-butylester zu entfernen. Anschließend wird die mindestens eine Fraktion über einen Zeitraum von 24 Stunden unter Verwendung eines Gemisches von Cyclohexan und Aceton als Kristallisationslösungsmittel bei Raumtemperatur kristallisiert, um Paclitaxelkristalle zu erhalten. Die Paclitaxelkristalle werden unter Vakuum für 48 Stunden getrocknet.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 ist ein Fließdiagramm, das eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren angibt.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG IM EINZELNEN
Die erfindungsgemäßen Verfahren schließen ein Verfahren zum Gewinnen von Paclitaxel aus Paclitaxel enthaltenden Pflanzen ein. 1 zeigt ein Fließdiagramm, das die Schritte einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren umreißt.
Schritt A umfasst Herstellen eines Paclitaxelextrakts durch Extrahieren von Paclitaxel von einem Paclitaxel enthaltenden Pflanzenmaterial. Das Paclitaxel wird dann von den anderen Bestandteilen in dem Paclitaxelextrakt in Schritten B-E unter Anwendung von Säulenchromatographie-Abtrennungssystemen abgetrennt. Jeder mit (i) markierte Schritt beinhaltet das Abtrennen von Paclitaxel von dem Paclitaxelextrakt oder chromatographischer Fraktion unter Verwendung eines Säulenchromatographiesystems, umfassend eine stationäre Phase und ein Elutionslösungsmittel, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten. Jeder mit (ii) markierte Schritt umfasst Entfernen des Elutionslösungsmittels von der mindestens einen, in dem vorangehenden Chromatographieschritt erhaltenen Fraktion. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die mindestens eine Fraktion vermindertem Druck unterzogen, um das Elutionslösungsmittel zu entfernen. Markierungen (a) und (b) in 1 bezeichnen alternative Abtrennwege. Wenn zum Beispiel Weg (a) für jeden Abtrennschritt gefolgt wird, wird das Elutions lösungsmittel nicht von der mindestens einen Fraktion von Paclitaxel entfernt. Im Gegensatz dazu, wenn Weg (b) für jeden Abtrennungsschritt verwendet wird, wird das Elutionslösungsmittel von der mindestens einen Fraktion von Paclitaxel entfernt. In bestimmten Ausführungsformen kann Weg (a) für bestimmte Abtrennschritte gefolgt werden, und Weg (b) kann von anderen Abtrennungsschritten gefolgt werden. Zum Beispiel kann in Schritt B Weg (b) eingeschlagen werden, sodass das Elutionslösungsmittel von der in Schritt B erhaltenen Fraktion entfernt wird, während in Schritt C, Weg (a) genommen wird, sodass die Fraktion direkt Abtrennung in Schritt D unterzogen wird, ohne Entfernung des Elutionslösungsmittels von Schritt C. Schritt F beinhaltet das Kristallisieren der mindestens einen, aus dem Endchromatographieschritt erhaltenen Fraktion. In einer speziellen Ausführungsform wird die mindestens eine, von Schritt E(ii) erhaltene Fraktion in Schritt F kristallisiert. Obwohl nur vier Chromatographieschritte in 1 gezeigt werden, gibt es zusätzliche Chromatographieschritte vor der Kristallisation. Der Kristallisationsschritt kann von einem Trocknungsschritt gefolgt werden.
Das Pflanzenmaterial
Das Ausgangsmaterial zur Verwendung in Schritt A der vorliegenden Erfindung ist Paclitaxel enthaltendes Pflanzenmaterial. Geeignetes Pflanzenmaterial kann aus den Pflanzenteilen der Taxaceae-Familie, d.h. Taxus-Pflanze, erhalten werden. Vorzugsweise wird das Pflanzenmaterial aus Taxus media hergestellt. Geeignete Arten von Taxus media schließen Taxus media "Hill", T.x media „Henryi", T.x media „Runyan", T. cuspidata, T.x media „Halloran", T.x media „Hatfield", T.x media „Hicksii", T.x media „Tauntonii", T.x media „Dark Green Spreader", T.x media „Wardii", T.x media „Brownii", T.x media „Densiformis", T.x media „Nigra", T.x cuspidata „Brevifolia" oder T. cuspidata „Spreader" ein.
Weiterhin kann das Pflanzenmaterial aus verschiedenen Teilen einer Taxus-Pflanze, wie frischen oder trockenen Wurzeln, Blättern, Zweigen, Samen, Rinde, Stamm oder Gemischen davon, hergestellt werden. Vorzugsweise wird das Pflanzenmaterial aus etwa 40 bis etwa 60 Gewicht/Gewicht-Prozent oberirdischen Teilen und etwa 60 bis etwa 40 Gewicht/Gewicht-Prozent Wurzeln hergestellt. Das Pflanzenmaterial wird aus einem Paclitaxel enthaltenden Pflanzenteil durch zum Beispiel Extrahieren, Zerstoßen oder Schneiden erhalten. In einer speziellen Ausführungsform wird das zu extrahierende Pflanzenmaterial unter Verwendung einer Blattzerkleinerungslinie, ausgestattet zum Beispiel mit einem Netz mit 10 mm Durchmesser, vermahlen. In einer Ausführungsform wird das Pflanzenmaterial unter Verwendung von mindestens einem Extraktionslösungsmittel extrahiert. Geeignete Lösungsmittel schließen wässrige Lösungsmittel, wie wässrige organische Lösungsmittel, zum Beispiel Aceton in Wasser, ein. Vorzugsweise wird ein Gemisch von etwa 40 bis etwa 60 Volumenprozent Aceton und etwa 60 bis etwa 40 Volumenprozent Wasser verwendet. Wässriges Aceton kann den Abbau von Paclitaxel verhindern. Vorzugsweise findet Extraktion bei Raumtemperatur statt. Die Extraktion bei Raumtemperatur kann den Abbau von Paclitaxel verhindern.
Extraktion von Paclitaxel und Abkömmlingen
Vor dem ersten Chromatographieschritt, zum Beispiel Schritt B, wird ein Extrakt von Paclitaxel wie in Schritt A hergestellt. In einer Ausführungsform wird der Paclitaxelextrakt durch Extrahieren des Paclitaxels von dem Pflanzenmaterial mit einem Lösungsmittel hergestellt. In einer speziellen Ausführungsform wird der Paclitaxelextrakt durch Behandeln eines wässrigen Acetonextrakts von dem Pflanzenmaterial hergestellt. Geeignete Extraktionslösungsmittel schließen ohne Begrenzung aliphatische Ester, wie Essigsäureethylester, oder chlorierte Lösungsmittel, wie Chloroform oder Dichlormethan, ein. Ein bevorzugtes Extraktionslösungsmittel ist Dichlor methan. In einer speziellen Ausführungsform wird, bevor das Paclitaxel mit einem der vorstehenden Lösungsmittel extrahiert wird, der wässrige Acetonextrakt unter Vakuum aufkonzentriert, um das Aceton zu entfernen. Das Konzentrat kann dann mit einem Lösungsmittel verdünnt werden. Dieses Verdünnungslösungsmittel kann Methylalkohol oder andere wasserlösliche alkoholische Lösungsmittel, wie Ethyl- oder Propylalkohol, einschließen. Paclitaxel wird dann von dem verdünnten Konzentrat unter Anwendung eines Extraktionslösungsmittels, wie Dichlormethan, und den anderen vorstehend erörterten Extraktionslösungsmitteln extrahiert. Ein Paclitaxelextrakt wird gebildet.
In einer Ausführungsform wird der Paclitaxelextrakt unter Vakuum aufkonzentriert, um die Lösungsmittel zu entfernen. Der konzentrierte Paclitaxelextrakt enthält Paclitaxel und seine Abkömmlinge, Chlorophylle, Fette, Lignane, Flavonoide, Phenole und verschieden polare Verunreinigungen. Abkömmlinge schließen zum Beispiel Cephalomannin, N-Debenzoyl-N-hexanoylpaclitaxel, N-Debenzoyl-N-hexanoyl-methyl-paclitaxel, N-Debenzoyl-N-phenylacetyl-paclitaxel, N-Debenzoyl-N-cinnamoyl-paclitaxel und 2-Debenzoyl-2-tigloyl-paclitaxel ein. Jedes von diesen kann von dem entsprechenden 7-Epi-, 10-Desacetyl- und 7-O-Xylosylderivat begleitet werden. Die entsprechenden letzteren Derivate von Paclitaxel liegen auch vor. Die Nicht-Paclitaxel-Bestandteile oder Verunreinigungen können durch Anwendung von, wie vorstehend erörterten, Chromatographietechniken entfernt werden.
Reinigung von Paclitaxel durch Chromatographie
Paclitaxel wird von dem Paclitaxelextrakt durch die Anwendung von mindestens 4 Säulenchromatographieschritten, die in 1 als Schritte B-E bezeichnet werden, abgetrennt. Schritte B(i)-E(i) schließen jeweils die Anwendung eines Chromatographiesystems, umfassend eine stationäre Phase und ein eluierendes Lösungsmittel, ein. Jedes System kann die gleiche Vorrichtung mit einer verschiedenen stationären Phase und Elutionslösungsmittel sein. Geeignete stationäre Phasen schließen ohne Begrenzung neutrales Aluminiumoxid und Kieselgel ein. Mögliche Elutionslösungsmittel schließen ohne Begrenzung Aceton, Dichlormethan, Methanol, n-Hexan, Essigsäure-t-butylester, Chloroform und Essigsäureethylester ein.
Jeder Chromatographieschritt schließt das Anwenden eines Säulenchromatographiesystems, umfassend eine stationäre Phase und ein Elutionslösungsmittel, ein, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten. Mindestens eine Fraktion kann eine Kombination von aus einem Chromatographieschritt erhaltenen Mehrfachfraktionen einschließen. Zum Beispiel kann mehr als eine Fraktion aus einem Chromatographieschritt erhalten werden. Diese Fraktionen werden dann vereinigt und der nächste Chromatographieschritt wird an den vereinigten Fraktionen ausgeführt.
In einer Ausführungsform wird das Elutionslösungsmittel von mindestens einer Fraktion entfernt. Mindestens eine Fraktion kann vermindertem Druck in Schritten B(ii)-E(ii) unterzogen werden, um das Elutionslösungsmittel zu entfernen. Das Entfernen des Lösungsmittels kann gerade einen Teil des Lösungsmittels einschließen, nicht notwendigerweise das gesamte Lösungsmittel, in der mindestens einen Fraktion.
In einer Ausführungsform trennt der erste Chromatographieschritt, Schritt B(i), im Allgemeinen Fette, Chlorophylle, phenolische Stoffe mit niederem Molekulargewicht und sehr polare Verunreinigungen von dem Paclitaxel. In dem zweiten Chromatographieschritt, Schritt C(i), werden im Allgemeinen zusätzliche Verunreinigungen, insbesondere Flavonoide und Lignane, von dem Paclitaxel getrennt. Der dritte Chromatographieschritt, Schritt D(i), trennt im Allgemeinen andere Taxane von dem Paclitaxel. Solche Taxane schließen die vorstehend erwähnten Taxanderivate, insbesondere Cephalomannin, und geringe Mengen der anderen Taxane, wie jene vorstehend erörterten, ein. Der vierte Chromatographieschritt, Schritt E(i), trennt den Abkömmling Cephalomannin von dem Paclitaxel. Geeig nete stationäre Phasen zum Entfernen des Cephalomannin schließen Kieselgel ein. Beispiele für verwendbare Elutionslösungsmittel schließen Essigsäure-t-butylester, Essigsäure-i-butylester, Ameisensäure-n-butylester, Ameisensäure-i-butylester, Ameisensäure-t-butylester und Ameisensäure-s-butylester ein. Siehe US-Patent Nr. 6 333 419 , dessen Inhalt hierin durch Hinweis in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist.
In einer Ausführungsform umfasst das erste Säulenchromatographiesystem eine stationäre Phase, umfassend Kieselgel und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Methylenchlorid, gefolgt von einem Gemisch von Methylenchlorid-Methanol in einem Verhältnis von 99:1 oder 98:2 Volumen/Volumen. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das zweite Säulenchromatographiesystem eine stationäre Phase, umfassend neutrales Aluminiumoxid und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Aceton. In einer noch weiteren Ausführungsform umfasst das dritte Säulenchromatographiesystem eine stationäre Phase, umfassend Kieselgel und ein Elutionslösungsmittel, umfassend n-Hexan und Aceton, in einem Verhältnis von 4:1 Volumen/Volumen. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das vierte Säulenchromatographiesystem eine stationäre Phase, umfassend Kieselgel und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Essigsäure-t-butylester.
Gegebenenfalls ist es auch möglich, die Verunreinigungen in einer anderen Reihenfolge zu entfernen. Zum Beispiel kann das Entfernen von phenolischen Stoffen über Aluminiumoxid vor der Entfernung der Chlorophylle und Fette unter Anwendung von Kieselgel als stationäre Phase ausgeführt werden.
Kristallisation von Paclitaxel
Gemäß dem End-Chromatographieschritt wird die mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion, die von dem Schritt erhalten wird, in Schritt F unter Verwendung eines Kristallisationslösungsmittels kristallisiert, um Paclitaxelkristalle zu erhalten. Geeignete Kristallisationslösungsmittel schließen Cyclohexan, Aceton, n-Hexan, i-Hexan, n-Heptan, Essigsäure-t-butylester und Gemische davon ein. Vorzugsweise wird ein Gemisch von Cyclohexan und Aceton in einem Verhältnis von 1:1 verwendet. In einer Ausführungsform findet die Kristallisation bei Raumtemperatur statt. Im Allgemeinen findet die Kristallisation über einen Zeitraum von 24 Stunden statt. Jedoch kann die Kristallisation auch über andere Zeiträume stattfinden. Nach der Kristallisation werden dann die Paclitaxelkristalle unter Vakuum bei einer Temperatur, wie zwischen etwa 50°C und etwa 60°C, getrocknet. Vorzugsweise werden die Kristalle für etwa 48 Stunden getrocknet.
BEISPIEL 1
Eine Tonne getrocknetes und vermahlenes Pflanzenmaterial, erhalten von dem T. media Hicksii, zusammengesetzt aus etwa 500 kg Wurzeln und etwa 500 kg Blättern und Zweigen, wurde bei Raumtemperatur mit 15 000 Litern von 50 %igem wässrigem Aceton extrahiert. Der Extrakt wurde unter Vakuum auf etwa 300 Liter aufkonzentriert. Dann wurden 150 Liter Methanol zugegeben und fünf Extraktionen mit 200 Liter Dichlormethan wurden ausgeführt. Die vereinigten organischen Schichten wurden unter Vakuum aufkonzentriert, bis ein weicher Rückstand erhalten wurde, der in Dichlormethan erneut aufgelöst und über 180 kg Kieselgel Säulen-chromatographiert wurde. Etwa 2 700 Liter Dichlormethan wurden durch die Säule eluiert und verworfen.
Paclitaxel wurde dann mit einem Gemisch von Dichlormethan-Methanol 99:1 (Volumen/Volumen) eluiert. Die Lösung wurde dann unter Vakuum eingedampft, um einen weichen Rückstand zu erhalten. Der Rückstand wurde in 8 Liter Aceton gelöst, um einen Acetonrückstand zu erhalten, der durch eine Säule, enthaltend 30 kg neutrales Aluminiumoxid, geleitet wurde, unter Eluieren mit dem gleichen Lösungsmittel. Die Paclitaxel enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und unter Vakuum auf 8 Liter aufkonzentriert.
Die Acetonlösung wurde dann auf eine Säule, enthaltend 180 kg Kieselgel, gepackt mit dem Gemisch von n-Hexan-Aceton, 4:1, beladen. Die Elution mit diesem Elutionsmittel liefert Paclitaxel, frei von den meisten der anderen Taxanen, ausgenommen Cephalomannin. Die Paclitaxel enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und unter Vakuum auf 5 Liter aufkonzentriert.
Die Lösung wurde dann über 180 kg Kieselgel, eingefüllt mit Essigsäure-t-butylester, unter Elution mit diesem Lösungsmittel chromatographiert. Die Paclitaxel enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und unter Vakuum eingedampft, bis ein weicher Rückstand erhalten wurde. Weitere Elution der Säule mit Essigsäure-t-butylester entfernte mindestens Cephalomannin. Der weiche Rückstand (etwa 300 g), enthaltend Paclitaxel, wurde in 2 Liter Aceton gelöst, mit 1,2 Liter Cyclohexan verdünnt und kristallisieren lassen. Nach Filtration und Trocknen bei 50°C für 48 Stunden wurden 255 g Paclitaxel mit einer Reinheit größer als 99% erhalten.
BEISPIEL 2
Einhundert Kilogramm getrocknetes und vermahlenes Pflanzenmaterial von Taxus media, „Dark green Spreader", ganze Pflanzen, zusammengesetzt aus etwa 40 kg Wurzeln und etwa 60 kg Blättern und Zweigen, wurden bei Raumtemperatur mit 1 500 Litern 50%igem wässrigem Aceton extrahiert. Der Extrakt wurde unter Vakuum auf 30 Liter aufkonzentriert. Dann wurden 15 Liter Methanol zugegeben und fünf Extraktionen mit 20 Liter Dichlormethan wurden ausgeführt. Die Dichlormethanextrakte wurden vereinigt und unter Vakuum auf 15 Liter aufkonzentriert.
Methanol wurde zugegeben und die Lösung wurde durch eine Säule, enthaltend 13 kg neutrales Aluminiumoxid unter Flution mit Dichlormethan-Methanol 99:1 Volumen/Volumen geleitet. Die Paclitaxel enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter Vakuum auf 5 Liter aufkonzentriert.
Die konzentrierte Lösung wurde auf eine Säule, enthaltend 9 kg Kieselgel, geladen und mit Dichlormethan-Methanol 99:1 Volumen/Volumen eluiert. Nach der Elution von polaren Verunreinigungen wurden 220 Liter Paclitaxel enthaltende Fraktionen gesammelt, vereinigt und unter Vakuum eingedampft, um einen weichen Rückstand (190 g) zu erhalten.
Der Rückstand wurde in 400 ml Aceton gelöst, um einen Acetonrückstand zu bilden, der über 9 kg Kieselgel durch Flution mit n-Hexan-Aceton 4:1 Säulen-chromatographiert wurde. Die Paclitaxel enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und erneut durch Säulenchromatographie über Kieselgel durch Elution mit Essigsäure-t-butylester, wie in Beispiel 2 beschrieben, gereinigt. Nach Kristallisation aus dem Gemisch mit Cyclohexan-Aceton 1:1 und Trocknen bei 55°C wurden 18,5 g Paclitaxel mit einer Reinheit größer als 99% erhalten.

Claims

Verfahren zum Gewinnen von Paclitaxel aus Paclitaxel enthaltenden Pflanzen, umfassend: (a) Herstellen eines Paclitaxelextrakts durch Extrahieren von Paclitaxel aus einem Pflanzenmaterial; (b) Abtrennen von Paclitaxel aus dem Paclitaxelextrakt unter Verwendung eines ersten Säulenchromatographiesystems, umfassend eine erste stationäre Phase und ein erstes Elutionslösungsmittel, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; (c) Abtrennen von Paclitaxel aus der mindestens einen in Schritt (b) erhaltenen Fraktion unter Verwendung eines zweiten Säulenchromatographiesystems, umfassend eine zweite stationäre Phase und ein zweites Elutionslösungsmittel, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; (d) Abtrennen von Paclitaxel aus der mindestens einen in Schritt (c) erhaltenen Fraktion unter Verwendung eines dritten Säulenchromatographiesystems, umfassend eine dritte stationäre Phase und ein drittes Elutionslösungsmittel, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; (e) Abtrennen von Paclitaxel aus der mindestens einen in Schritt (d) erhaltenen Fraktion unter Verwendung eines vierten Säulenchromatographiesystems, umfassend eine vierte stationäre Phase und ein viertes Elutionslösungsmittel, um mindestens Cephalomannin zu entfernen und um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; und (f) Kristallisieren des in der mindestens einen in Schritt (e) erhaltenen Fraktion enthaltenen Paclitaxels unter Verwendung eines Kristallisationslösungsmittels, um Paclitaxelkristalle zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend Trocknen der in Schritt (f) erhaltenen Paclitaxelkristalle.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Pflanzenmaterial aus Pflanzenteilen erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Pflanzenmaterialextrakt durch Extrahieren des Pflanzenmaterials, umfassend 40 bis 60 Gewicht/Gewicht Prozent oberirdische Teile und 60 bis 40 Gewicht/Gewicht Prozent Wurzeln, hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Pflanzenmaterial Pflanzenmaterial umfasst, das aus Taxus media, T.x media „Henryi", T.x media „Runyan", T. cuspidata, T.x media „Halloran", T.x media „Hatfield", T.x media „Hicksii", T.x media „Tauntonii", T.x media „Dark Green Spreader", T.x media „Wardii", T.x media „Brownii", T.x media „Densiformis", T.x media „Nigra", T.x cuspidata „Brevifolia" oder T. cuspidata „Spreader" erhalten wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zweite stationäre Phase neutrales Aluminiumoxid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste, dritte oder vierte stationäre Phase Kieselgel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste, zweite oder dritte Elutionslösungsmittel Aceton, Dichlormethan, Metha nol, n-Hexan, Essigsäure-t-butylester, Chloroform oder Essigsäureethylester umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste Elutionslösungsmittel Dichlormethan und Methanol umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zweite Elutionslösungsmittel Aceton umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das dritte Elutionslösungsmittel n-Hexan und Aceton umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das vierte Elutionslösungsmittel Essigsäure-t-butylester, Essigsäure-i-butylester, Ameisensäure-n-butylester, Ameisensäure-i-butylester, Ameisensäure-t-butylester oder Ameisensäure-s-butylester umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kristallisationslösungmittel Cyclohexan und Aceton umfasst.
Verfahren zum Gewinnen von Paclitaxel aus Paclitaxel enthaltenden Pflanzen, umfassend: (a) Herstellen eines Paclitaxelextrakts durch Extrahieren von Paclitaxel aus einem Pflanzenmaterial; (b) Abtrennen von Paclitaxel aus dem Paclitaxelextrakt, umfassend: (i) Verwendung eines ersten Säulenchromatographiesystems, umfassend eine erste stationäre Phase und ein erstes Elutionslösungsmittel, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; und (ii) Entfernen des ersten Elutionslösungsmittels aus der mindestens einen, in Schritt (b)(i) erhaltenen Fraktion, um einen ersten Rückstand zu bilden; (c) Abtrennen von Paclitaxel aus dem in Schritt (b)(ii) erhaltenen ersten Rückstand, umfassend: (i) Verwendung eines zweiten Säulenchromatographiesystems, umfassend eine zweite stationäre Phase und ein zweites Elutionslösungsmittel, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion aus dem ersten Rückstand zu erhalten; und (ii) Entfernen des zweiten Elutionslösungsmittels aus der mindestens einen in Schritt (c)(i) erhaltenen Fraktion, um einen zweiten Rückstand zu bilden; (d) Abtrennen von Paclitaxel aus dem in Schritt (c)(ii) erhaltenen zweiten Rückstand, umfassend: (i) Verwendung eines dritten Säulenchromatographiesystems, umfassend eine dritte stationäre Phase und ein drittes Elutionslösungsmittel, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion aus dem zweiten Rückstand zu erhalten; und (ii) Entfernen des dritten Elutionslösungsmittels aus der mindestens einen in Schritt (d)(i) erhaltenen Fraktion, um einen dritten Rückstand zu bilden; (e) Abtrennen von Paclitaxel aus dem in Schritt (d)(ii) erhaltenen dritten Rückstand, umfassend: (i) Verwendung eines vierten Säulenchromatographiesystems, umfassend eine vierte stationäre Phase und ein viertes Elutionslösungsmittel, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion aus dem dritten Rückstand zu erhalten; und (ii) Entfernen des vierten Elutionslösungsmittels aus dem dritten, in Schritt (e)(i) erhaltenen Rückstand, um einen vierten Rückstand zu bilden; und (f) Kristallisieren von Paclitaxel aus dem vierten, in Schritt (e)(ii) erhaltenen Rückstand unter Verwendung eines Kristallisationslösungsmittels, um Paclitaxelkristalle zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei in Schritt (e) mindestens Cephalomannin aus dem dritten Rückstand entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das erste Elutionslösungsmittel durch Unterziehen der mindestens einen in Schritt (b)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das zweite Elutionslösungsmittel durch Unterziehen der mindestens einen in Schritt (c)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das dritte Elutionslösungsmittel durch Unterziehen der mindestens einen in Schritt (d)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das vierte Elutionslösungsmittel durch Unterziehen der mindestens einen in Schritt (e)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, weiterhin umfassend Trocknen der in Schritt (f) erhaltenen Paclitaxelkristalle.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Paclitaxelkristalle unter Vakuum getrocknet werden.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Paclitaxel aus dem Pflanzenmaterial unter Verwendung eines ersten wässrigen Lösungsmittels entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das erste wässrige Lösungsmittel Wasser und Aceton umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei Schritt (a) bei Raumtemperatur stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei mehr als eine Fraktion in Schritt (b)(i) erhalten wird und mindestens einige der Fraktionen vor dem Entfernen des ersten Elutionslösungsmittels in Schritt (b)(ii) vereinigt werden.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei mehr als eine Fraktion in Schritt (c)(i) erhalten wird und mindestens einige der Fraktionen vor dem Entfernen des zweiten Elutionslösungsmittels in Schritt (c)(ii) vereinigt werden.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei mehr als eine Fraktion in Schritt (d)(i) erhalten wird und mindestens einige der Fraktionen vor dem Entfernen des dritten Elutionslösungsmittels in Schritt (d)(ii) vereinigt werden.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei mehr als eine Fraktion in Schritt (e)(i) erhalten wird und mindestens einige der Fraktionen vor dem Entfernen des vierten Elutionslösungsmittels in Schritt (e)(ii) vereinigt werden.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Kristallisieren von Schritt (f) über einen Zeitraum von 24 Stunden stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Kristallisieren von Schritt (f) bei Raumtemperatur stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Pflanzenmaterial aus Pflanzenteilen erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei der Pflanzenmaterialextrakt durch Extrahieren des Pflanzenmaterials aus Pflanzenteilen, umfassend etwa 40 bis etwa 60 Gewicht/Gewicht Prozent oberirdische Teile und etwa 60 bis etwa 40 Gewicht/Gewicht Prozent Wurzeln, hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Pflanzenmaterial aus Taxus media, T.x media „Henryi", T.x media „Runyan", T. cuspidata, T.x media „Halloran", T.x media „Hatfield", T.x media „Hicksii", T.x media „Tauntonii", T.x media „Dark Green Spreader", T.x media „Wardii", T.x media „Brownii", T.x media „Densiformis", T.x media „Nigra", T.x cuspidata „Brevifolia" oder T. cuspidata „Spreader" erhaltenes Pflanzenmaterial umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die zweite stationäre Phase neutrales Aluminiumoxid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die erste, dritte oder vierte stationäre Phase Kieselgel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das erste, zweite oder dritte Elutionslösungsmittel Aceton, Dichlormethan, Methanol, n-Hexan, Essigsäure-t-butylester, Chloroform oder Essigsäureethylester umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das erste Elutionslösungsmittel Dichlormethan und Methanol umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das zweite Elutionslösungsmittel Aceton umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das dritte Elutionslösungsmittel n-Hexan und Aceton umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das vierte Elutionslösungsmittel Essigsäure-t-butylester, Essigsäure-i-butylester, Ameisensäure-n-butylester, Ameisensäure-i-butylester, Ameisensäure-t-butylester oder Ameisensäure-s-butylester umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Kristallisationslösungsmittel Cyclohexan und Aceton umfasst.
Verfahren zum Gewinnen von Paclitaxel aus Taxus media, umfassend: (a) Herstellen eines Pflanzenmaterialextrakts aus Taxus media durch Extrahieren des Pflanzenmaterials mit einem wässrigen Lösungsmittel, umfassend 40 bis 60 Volumen/Volumen Prozent Aceton bei Raumtemperatur; (b) Herstellen eines Paclitaxelextrakts durch Extrahieren von Paclitaxel aus dem in (a) erhaltenen Pflanzenmaterialextrakt; (c) Abtrennen von Paclitaxel aus dem Paclitaxelextrakt, umfassend: (i) Verwendung eines ersten Chromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Dichlormethan allein oder ein Gemisch von Dichlormethan und Methanol, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; und (ii) Unterziehen der mindestens einen in Schritt (c)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck, um das Dichlormethan und/oder Methanol zu entfernen; (d) Abtrennen von Paclitaxel aus der mindestens einen in Schritt (c)(ii) erhaltenen Fraktion, umfassend: (i) Verwendung eines zweiten Säulenchromatographiesystems, umfassend neutrales Aluminiumoxid als eine stationäre Phase, und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Aceton, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; und (ii) Unterziehen der mindestens einen in Schritt (d)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck, um das Aceton zu entfernen; (e) Abtrennen von Paclitaxel aus der mindestens einen in Schritt (d)(ii) erhaltenen Fraktion, umfassend: (i) Verwendung eines dritten Säulenchromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase und ein Elutionslösungsmittel, umfassend ein Gemisch von n-Hexan und Aceton, und um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; und (ii) Unterziehen der mindestens einen in Schritt (e)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck, um das n-Hexan und Aceton zu entfernen; (f) Abtrennen von Paclitaxel aus der mindestens einen in Schritt (e)(ii) erhaltenen Fraktion, umfassend: (i) Verwendung eines vierten Säulenchromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase, und ein Elutionslö sungsmittel, umfassend Essigsäure-t-butylester, um mindestens Cephalomannin zu entfernen und um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; und (ii) Unterziehen der mindestens einen in Schritt (f)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck, um den Essigsäure-t-butylester zu entfernen; (g) Kristallisieren der mindestens einen in Schritt (f)(ii) erhaltenen Fraktion über einen Zeitraum von 24 Stunden unter Verwendung eines Gemisches von Cyclohexan und Aceton als dem Kristallisationslösungsmittel bei Raumtemperatur, um Paclitaxelkristalle zu erhalten; und (h) Trocknen der in (g) erhaltenen Paclitaxelkristalle unter Vakuum für 48 Stunden.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei die Herstellung des Paclitaxelextrakts in Schritt (b) weiterhin umfasst: (a) Aufkonzentrieren des Pflanzenmaterialextrakts unter vermindertem Druck, um das Aceton zu entfernen, um ein Konzentrat zu bilden; (b) Verdünnen des Konzentrats mit Methylalkohol; (c) Extrahieren des Konzentrats mit Dichlormethan, um einen Dichlormethanextrakt zu bilden; und (d) Aufkonzentrieren des Dichlormethanextrakts unter vermindertem Druck, um den Paclitaxelextrakt zu bilden.
Verfahren zum Gewinnen von Paclitaxel aus Taxus media, umfassend: (a) Herstellen eines Pflanzenmaterialextrakts aus Taxus media durch Extrahieren des Pflanzenmaterials mit einem wässrigen Lösungsmittel, umfassend etwa 40 bis etwa 60 Volumen/Volumen Prozent Aceton bei Raumtemperatur; (b) Herstellen eines Paclitaxelextrakts durch Extrahieren von Paclitaxel aus dem in (a) erhaltenen Pflanzenmaterialextrakt; (c) Abtrennen von Paclitaxel aus dem Paclitaxelextrakt, umfassend: (i) Verwendung eines ersten Chromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase und Elutionslösungsmittel, umfassend Dichlormethan und Methanol, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; (ii) Unterziehen der mindestens einen in Schritt (c)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck, um einen Rückstand zu erhalten, und (iii) Auflösen des in Schritt (c)(ii) erhaltenen Rückstands in Aceton, um eine Aceton-Rückstandszusammensetzung zu erhalten; (d) Abtrennen von Paclitaxel aus der in Schritt (c)(iii) erhaltenen Aceton-Rückstandszusammensetzung, umfassend: (i) Verwendung eines zweiten Säulenchromatographiesystems, umfassend neutrales Aluminiumoxid als eine stationäre Phase und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Aceton, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; und (ii) Unterziehen der mindestens einen in Schritt (d)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck, um das Aceton zu entfernen, (e) Abtrennen von Paclitaxel aus der mindestens einen in Schritt (d)(ii) erhaltenen Fraktion, umfassend: (i) Verwendung eines dritten Säulenchromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase und ein Elutionslösungsmittel, umfassend n-Hexan und Aceton, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; und (ii) Unterziehen der mindestens einen in Schritt (e)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck, um das n-Hexan und Aceton zu entfernen; (f) Abtrennen von Paclitaxel aus der mindestens einen in Schritt (e)(ii) erhaltenen Fraktion, umfassend: (i) Verwendung eines vierten Säulenchromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase, und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Essigsäure-t-butylester, um mindestens Cephalomannin zu entfernen und um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; und (ii) Unterziehen der mindestens einen in Schritt (f)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck, um den Essigsäure-t-butylester zu entfernen; (g) Kristallisieren der mindestens einen in Schritt (f)(ii) erhaltenen Fraktion über einen Zeitraum von 24 Stunden unter Verwendung eines Gemisches von Cyclohexan und Aceton als dem Kristallisationslösungsmittel bei Raumtemperatur, um Paclitaxelkristalle zu erhalten; und (h) Trocknen der in (g) erhaltenen Paclitaxelkristalle unter Vakuum für 48 Stunden.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei der Taxus media T. media Hicksii umfasst.
Verfahren zum Gewinnen von Paclitaxel aus Taxus media, umfassend: (a) Herstellen eines Pflanzenmaterialextrakts aus Taxus media durch Extrahieren des Pflanzenmaterials mit ei ner wässrigen Lösung, umfassend etwa 40 bis etwa 60 Volumen/Volumen Prozent Aceton bei Raumtemperatur; (b) Herstellen eines Paclitaxelextrakts durch Extrahieren von Paclitaxel aus dem in (a) erhaltenen Pflanzenmaterialextrakt; (c) Abtrennen von Paclitaxel aus dem Paclitaxelextrakt, umfassend: (i) Verwendung eines ersten Chromatographiesystems, umfassend neutrales Aluminiumoxid als eine stationäre Phase und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Dichlormethan und Methanol, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; und (ii) Unterziehen der mindestens einen in Schritt (c)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck, um das Dichlormethan und Methanol zu entfernen; (d) Abtrennen von Paclitaxel aus der mindestens einen, in Schritt (c)(ii) erhaltenen Fraktion, umfassend: (i) Verwendung eines zweiten Chromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Dichlormethan und Methanol, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; (ii) Unterziehen der mindestens einen in Schritt (d)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck, um einen Rückstand zu erhalten, und (iii) Auflösen des in Schritt (d)(ii) erhaltenen Rückstands in Aceton, um eine Aceton-Rückstandszusammensetzung zu erhalten; (e) Abtrennen von Paclitaxel aus der in Schritt (d)(iii) erhaltenen Aceton-Rückstandszusammensetzung, umfassend: (i) Verwendung eines dritten Säulenchromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase und ein Elutionslösungsmittel, umfassend n-Hexan und Aceton, um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; und (ii) Unterziehen der mindestens einen in Schritt (e)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck, um das Gemisch von n-Hexan und Aceton zu entfernen; (f) Abtrennen von Paclitaxel aus der mindestens einen in Schritt (e)(ii) erhaltenen Fraktion, umfassend: (i) Verwendung eines vierten Säulenchromatographiesystems, umfassend Kieselgel als eine stationäre Phase und ein Elutionslösungsmittel, umfassend Essigsäure-t-butylester, um mindestens Cephalomannin zu entfernen und um mindestens eine Paclitaxel enthaltende Fraktion zu erhalten; und (ii) Unterziehen der mindestens einen in Schritt (f)(i) erhaltenen Fraktion vermindertem Druck, um den Essigsäure-t-butylester zu entfernen; (g) Kristallisieren der mindestens einen in Schritt (f)(ii) erhaltenen Fraktion über einen Zeitraum von 24 Stunden unter Verwendung eines Gemisches von Cyclohexan und Aceton als dem Kristallisationslösungsmittel bei Raumtemperatur, um Paclitaxelkristalle zu erhalten; und (h) Trocknen der in (g) erhaltenen Paclitaxelkristalle unter Vakuum für 48 Stunden.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei der Taxus media T. media „Dark Green Spreader" umfasst.