DE602004007319T2

DE602004007319T2 - Schnelles multispektrales konfokales Rastermikroskop

Info

Publication number: DE602004007319T2
Application number: DE602004007319T
Authority: DE
Inventors: Colin Sunderland Eberhardt; Jafer Sunderland Sheblee; Ken Sunderland Bell
Original assignee: Visitech International Ltd
Current assignee: Visitech International Ltd
Priority date: 2003-04-08
Filing date: 2004-04-07
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2024-04-08
Also published as: EP1467235B1; EP1467235A1; GB0308072D0; US20050225850A1; ES2289385T3; PT1467235E; DK1467235T3; DE602004007319D1; ATE366425T1; US7221503B2

Description

Beschreibung des Standes der Technik
Die Aufnahme eines akusto-optischen Deflektors bei der Durchführung der Zeilenabtastung eines Laserflecks in einem konfokalen Lasermikroskop erzeugt eine Einheit, die mit hoher Geschwindigkeit und hoher Flexibilität arbeiten kann, d.h. mit einer variablen Abtastamplitude, und die für verschiedene Arten konfokaler Mikroskopie geeignet ist. Infolge einer raschen Zeilen- und Bildabtastung ist es damit möglich, in einer sehr kurzen Zeitspanne eine Anzahl dünner Bildabschnitte elektronisch zu kombinieren, um ein Bild mit verbesserter Tiefenschärfe zu erzeugen. Solche Sammlungen von Bildabschnitten werden einfach in eine dreidimensionale Rekonstruktion des ursprünglichen Objektvolumens umgewandelt, wodurch räumliche Beziehungen zwischen den Objektkomponenten rasch visuell dargestellt und gemessen werden können.
1 stellt ein Beispiel eines konfokalen Laserabtastmikroskops dar, bei dem ein akusto-optischer Deflektor verwendet wird, um die Zeilenabtastung eines Laserflecks durchzuführen. Ein solches konfokales Laserabtastmikroskop ist in EP-A-0 284 136 offenbart. Ein Laserlichtstrahl 1 durchläuft ein optisches Strahlerweiterungssystem 2 und 3, gefolgt von einem Strahlteiler 4, einem akusto-optischen Deflektor 5 mit einer plano-zylindrischen Linse 5.1 und einer plano-konvexen Linse 5.2, beide an der Eingangs- und Ausgangsseite, einer Linse 6, einem Deflektor 7, der ein Spiegelgalvanometer sein kann, einer Linse 8, einer Viertelwellenplatte 16 sowie einem Objektiv 9 zum Fokussieren des Laserstrahls 18 auf ein Objekt. In einer Objektebene 10 ist ferner ein nicht dargestelltes Objekt auf einer stationären Objektbühne angeordnet. Das reflektierte Licht 19 durchquert einen Rückführweg, der bis zu dem Strahlteiler 4 mit dem Ausgangsweg identisch ist, wonach er in ein Polarisierungsfilter 11, ein weiteres Objektiv 13, ein räumliches Filter 14, eine Linse 17, ein Passband- oder Sperrfilter 12, und schließlich einen Detektor 15 aufgeteilt ist.
2 gibt ein weiteres Beispiel an. Ein dichromatischer Spiegel 20 ist in den Strahlengang zwischen der plano-zylindrischen Linse 5.1 und der Linse 6 eingegliedert worden. Der Spiegel überträgt das (kurzwellige) Laserlicht und lenkt das langwellige Rückführlicht, das beispielsweise aus Fluereszenz stammt, ab. Man beachte, dass eine einfache Änderung der Geometrie die Anwendung eines dichromatischen Spiegels ermöglicht, der das (kurzwellige) Laserlicht reflektiert und das langwellige Rückführlicht überträgt. Dieses Licht passiert eine Korrekturlinse 21 und wird mit einem Objektiv 22 auf ein räumliches Filter 23 fokussiert, das ein Schlitzfilter ist, weshalb dieses System konfokale Eigenschaften aufweist. Auf diese Weise wird ein Zeilendetektor mit einer darauf folgenden Linse 24 und einem Detektor 26 gebildet. Zwischen der Linse 24 und dem Detektor 26 sind ein oder mehrere Passband- oder Sperrfilter 25 eingebaut, welche die gleiche Funktion wie die des Passband- oder Sperrfilters 12 aufweist/aufweisen. Bei dieser Ausführungsform kann das Rückführlicht, das eine andere Wellenlänge aufweist als die des Ausgangslichts, vorteilhafterweise darauf überprüft werden, ob der akustooptische Deflektor einen zu geringen Wirkungsgrad für dieses Licht hat, d.h. eine zu große Dämpfung bzw. Abschwächung ergibt.
Hintergrund der Erfindung
Bei biologischen Objekten, die auto-fluoreszierend sind oder die mit fluoreszierenden Sonden versehen worden sind, besteht eine häufige Anforderung darin, multispektrale Komponentenbilder von dem Objekt zu extrahieren, welche eine Untersuchung der räumlichen Beziehungen zwischen den verschiedenartig markierten Komponenten ermöglicht. Lebende biologische Objekte beinhalten dynamische Prozesse, die durch Fluoreszenz markiert werden können, so dass durch Wiederholen der gleichen multispektralen Abtastung des Objekts die zeitliche Dynamik dieser Prozesse ebenfalls untersucht werden kann. Bei all diesen Arten von Experimenten ist es wichtig, über die Fähigkeit zu verfügen, während des Abtastvorgangs rasch Erregungs-Wellenlängen zu schalten, und die Erfindung zielt darauf ab, ein Verfahren zur Bewerkstelligung einer schnellen Mehrfach-Wellenlängenabtastung in einem konfokalen Laserabtastmikroskop auf der Basis eines akusto-optischen Deflektors bereitzustellen, der eine schnelle Mehrfach-Wellenlängenabtastung liefert.
US-B-6449039 bezieht sich auf ein konfokales Zwei-Photon- oder Mehr-Photon-Laserabtastmikroskop, das auf einer AOD-Abtasttechnologie beruht, die kurz gepulste Laserquellen einsetzt. Bei dieser Art von Mikroskop ist die Drehung des AOD (und Spiegels/Prismas) erforderlich, um eine wirksame Übertragung der Beleuchtung durch das AOD bei IR-nahen Wellenlängen, die für diese Art konfokaler Mikroskopie erforderlich sind, zu erzielen. Mit den kurzen Impulsen, die bei dieser Art von Mikroskop eingesetzt werden, ist kein schnelles Umschalten oder Ändern der Eingangswellenlängen möglich, und der Linseneffekt wird demgemäß bei dieser Bezugsschrift nicht behandelt.
Abriss der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein konfokales Laserabtastmikroskop, wie es in Anspruch 1 oder in Anspruch 2 definiert ist, und auf ein Verfahren zum Erzielen einer schnellen Mehrfach-Wellenlängenabtastung in einem konfokalen Laserabtastmikroskop auf der Basis eines akustooptischen Deflektors, wie es in Anspruch 18 oder 19 definiert ist. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Es zeigen:
1 ein Beispiel eines konfokalen Laserabtastmikroskops nach dem Stand der Technik, bei dem ein akustooptischer Deflektor verwendet wird, um die Zeilenabtastung eines Laserflecks durchzuführen,
2 ein weiteres Beispiel eines konfokalen Laserabtastmikroskops nach dem Stand der Technik,
3 ein Diagramm zur Erläuterung des Bereichs anwendbarer Ablenkwinkel, die bei einem in einem konfokalen Laserabtastmikroskop gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzten akusto-optischen Deflektor (AOD) erhältlich sind,
4 ein Diagramm zur Erläuterung der Verbesserung des Winkelabtastbereichs, wenn ein akusto-optischer Deflektor mechanisch um seine Mittelachse gedreht wird, gemäß der vorliegenden Erfindung.
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen Wenn ein akusto-optischer Deflektor als Ablenkelement in einem Abtastsystem verwendet wird, bestehen eine Anzahl von Nachteilen, die in Betracht zu ziehen sind.
Infolge der dispersiven Natur des akusto-optischen Deflektors durchläuft das Rückführlicht einer anderen Wellenlänge (beispielsweise Fluoreszenz) als der des Laserlichts nicht mehr das räumliche Filter. Das räumliche Filter kann durch drei piezoelektrische Kristalle bewegt werden, einer für jede der drei Achsen des XYZ-Koordinatensystems, und kann auf eine Art und Weise gesteuert werden, die diesen Effekt eliminiert.
Aufgrund der Übergangszeit über einer Apertur eines akusto-optischen Deflektors bei einer Änderung der akustischen Wellenfrequenz erzeugt ein akusto-optischer Deflektor einen zylindrischen "Linsen"effekt, der durch den Unterschied der Ablenkwinkel der auftreffenden Wellenlänge an den zwei Enden der Apertur des akusto-optischen Deflektors bewirkt wird. Die Differenz des Ablenkwinkels zwischen den Enden der Apertur des akusto-optischen Deflektors nimmt mit zunehmenden Ablenk-Abtastraten zu, da die Übergangszeit über der Apertur des akusto-optischen Deflektors konstant ist.
Die Bragg-Gleichung (Wellenlänge = 2 × akustische Frequenz × sin(Ablenkwinkel)) bechreibt, wie der Ablenkwinkel von der Wellenlänge eines durch einen akusto-optischen Deflektor passierenden Lichtstrahls abhängt. Der absolute Ablenkwinkel und die Differenz der Ablenkwinkel des Lichtstrahls an den Enden der Apertur des akusto-optischen Deflektors nimmt mit zunehmender Wellenlänge des Lichtstrahls zu, wenn ein den akusto-optischen Deflektor antreibender Oszillator einem konstant wiederholten Muster von Frequenz-Zeit-Ablenkungen (frequency sweeps) folgt.
Ohne Versuche, den oben beschriebenen Linseneffekt zu korrigieren, beeinflussen Änderungen der Wellenlänge des beleuchtenden Lichtstrahls und Änderungen in der Abtastrate die Position und Größe des abgetasteten Bereichs am Abtastobjekt und verschlechtern auch die Bildqualität aufgrund der Einführung eines Astigmatismus in den Strahlengang. Die Erfindung bietet verschiedene Verfahren zum Ausgleichen des Linseneffekts.
Gemäß einer ersten Ausführungsform umfaßt ein Verfahren zum Bewerkstelligen einer schnellen Mehrfach-Wellenlängenabtastung in einem konfokalen Laserabtastmikroskop auf der Basis eines akusto-optischen Deflektors gemäß der Erfindung: dynamisches Einstellen eines Strahlengangs des akustooptischen Deflektors basierend auf einem konfokalen Mikroskop durch mechanische Mittel gemäß einer ausgewählten Wellenlänge des Laserlichtstrahls durch Einstellen der Position einer Astigmatismus-Ausgleichslinse, die dem akusto-optischen Deflektor zugeordnet ist, und der Position einer Kollimierlinse derart, dass eine Bewegung der Astigmatismus-Ausgleichslinse, die dem akusto-optischen Deflektor zugeordnet ist, und der Position einer Kollimierlinse derart, dass eine Bewegung der Astigmatismus-Ausgleichslinse dem Astigmatismus entgegenwirkt, der durch Änderungen in der Eingangsstrahl-Wellenlänge oder in der Ablenk-Abtastrate induziert wird, und so, dass eine Bewegung der Kollimierlinse einer etwaigen Brennweitenänderung infolge der Neupositionierung der Astigmatismus-Ausgleichslinse entgegenwirkt, womit Astigmatismus- und Kollimieränderungen infolge der Änderung der Eingangsstrahl-Wellenlänge ausgeglichen werden und erfasste Bilder eines Objekts durch elektronische Mittel so modifiziert werden, dass eine Ausrichtung der Abtastzeilen des Bildes bei allen Wellenlängen eingehalten wird.
Ein konfokales Laserabtastmikroskop gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung umfasst: Mittel, die eine Laserlichtquelle umfassen, zum Emittieren von Laserlichtstrahlen mit unterschiedlichen Wellenlängen, einen Strahlengang zum Richten der Laserlichtstrahlen von dem Laserlichtstrahl-Emittiermittel zu einer Objektstufe zum Haltern eines Objekts, wobei der Strahlengang umfasst: einen ersten Deflektor mit einem akusto-optischen Deflektor zum Ausführen einer Zeilenabtastung, mindestens ein Objektiv zum Fokussieren des Laserlichtstrahls auf das Objekt an der Objektstufe, einen zweiten Deflektor, der zwischen dem akusto-optischen Deflektor und dem mindestens einen Objektiv positioniert ist, um eine Frame- bzw. Bildabtastung durchzuführen, wobei der zweite Deflektor und das mindestens eine Objektiv so positioniert sind, dass die von dem Objekt zurückgeführten Lichtstrahlen dem gleichen Strahlengang folgen wie die auf das Objekt fokussierten Laserlichtstrahlen bis zu dem zweiten Deflektor und einschließlich diesem, mindestens einen Detektor, der in dem Rückführlicht-Strahlengang stromab des zweiten Deflektors positioniert ist, um die zurückgeführten Lichtstrahlen von dem Objekt zu erfassen, wobei das Objekt durch die Laserlichtstrahlen von dem Laserlichtstrahl-Emittiermittel abgetastet werden kann, und Messungen mit dem mindestens einen Detektor vorgenommen werden können, um Bilder des Objekts zu erhalten, sowie ein elektronisches Steuer- und Bilderzeugungssystem, welches das Laserlichtstrahl-Emittiermittel so steuern kann, dass es individuelle Laserlichtstrahlen sequentiell mit ausgewählten Wellenlängen emittiert und Antriebsparameter des akustooptischen Deflektors durch dynamisches Steuern der Startfrequenz und der Endfrequenz des akusto-optischen Deflektors dynamisch so regeln kann, dass eine konstante Zeilenabtastposition bei allen Eingangsstrahl-Wellenlängen eingehalten wird, wobei dynamisch die Frequenzänderungsrate des Antriebssignals zu dem akusto-optischen Deflektor derart gesteuert wird, dass ein konstanter Objektiveffekt bei allen Eingangsstrahl-Wellenlängen erhalten wird, um eine Ausrichtung der Abtastzeilen des Bildes bei allen Wellenlängen einzuhalten.
Eine erste Ausführungsform beschreibt somit einen Ausgleich für die vorher beschriebenen Astigmatismus- und Fokussiereffekte unter Anwendung mechanischer Mittel zur Änderung der Position der optischen Korrekturkomponenten in dem Strahlengang. Eine Astigmatismuslinse wird in eine Position bewegt, um Astigmatismusänderungen zu korrigieren, und eine Kollimierlinse wird so bewegt, dass sie sicherstellt, dass der in ein Endobjektiv eintretende Strahl durch dieses Objektiv auf die gleiche Brennebene in dem abgetasteten Objekt fokussiert wird. Weitere Änderungen der Position des Bildes, die durch die Änderungen in der Abtastzeilenposition am Objekt infolge von Ablenkwinkeländerungen mit Wellenlängenänderungen verursacht werden, werden unter Anwendung von Software durch Schwenken Zoomen und Ausschneiden der aufgezeichneten Bilddaten ausgeglichen, um eine identische Bildgröße und -position für alle Wellenlängen beizubehalten.
Eine Korrektur des Astigmatismus und eine Kollimierung durch mechanische Mittel ist oft zu langsam, um ein rasches Umschalten der Eingangsstrahl-Wellenlängen zu ermöglichen, die bei der biologischen Forschung erwünscht ist. Für die Untersuchung der Dynamik bei biologischen Objekten ist vorzuziehen, über eine Wellenlängenumschaltung auf einer Basisabtastzeile zu verfügen, wobei die Abtastzeilenfrequenzen typischerweise im Bereich von -zig Kilohertz liegen.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Bewerkstelligen einer schnellen Mehrfach-Wellenlängenabtastung in einem auf einem akusto-optischen Deflektor basierenden konfokalen Laserabtastmikroskop das dynamische Steuern der Startfrequenz und Endfrequenz des akusto-optischen Deflektors derart, dass eine konstante Zeilenabtastposition bei allen Eingangsstrahl-Wellenlängen eingehalten wird, und das dynamische Steuern der Frequenzänderungsrate des Antriebssignals zu dem akustooptischen Deflektor derart, dass ein konstanter Linseneffekt bei allen Eingangsstrahl-Wellenlängen erhalten wird, um eine Ausrichtung von Abtastzeilen eines Bildes eines Objekts bei allen Wellenlängen einzuhalten.
Ein konfokales Laserabtastmikroskop gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung umfasst: Mittel, die eine Laserlichtquelle umfassen, zum Emittieren von Laserlichtstrahlen mit unterschiedlichen Wellenlägen, einen Strahlengang zum Richten der Laserlichtstrahlen von dem Laserlichtstrahl-Emittiermittel zu einer Objektstufe zum Haltern eines Objekts, wobei der Strahlengang umfasst: einen ersten Deflektor mit einem akusto-optischen Deflektor zum Ausführen einer Zeilenabtastung, mindestens ein Objektiv zum Fokussieren des Laserlichtstrahls auf das Objekt an der Objektstufe, einen zweiten Deflektor, der zwischen dem akusto-optischen Deflektor und dem mindestens einen Objektiv positioniert ist, um eine Frame- bzw. Bildabtastung durchzuführen, wobei der zweite Deflektor und das mindestens eine Objektiv so positioniert sind, dass die von dem Objekt zurückgeführten Lichtstrahlen dem gleichen Strahlengang folgen wie die auf das Objekt fokussierten Laserlichtstrahlen bis zu dem zweiten Deflektor und einschließlich diesem, eine Kollimierlinse, die zwischen dem ersten Deflektor und dem zweiten Deflektor positioniert ist, mindestens einen Detektor, der in dem Rückführlicht-Strahlengang stromab des zweiten Deflektors positioniert ist, um die zurückgeführten Lichtstrahlen von dem Objekt zu erfassen, wobei das Objekt durch die Laserlichtstrahlen von dem Laserlichtstrahl- Emittiermittel abgetastet werden kann und Messungen mit dem mindestens einen Detektor vorgenommen werden können, um Bilder des Objekts zu erhalten, und ein elektronisches Steuer- und Bilderzeugungssystem, welches das Laserlichtstrahl-Emittiermittels so steuern kann, dass es Laserlichtstrahlen unterschiedlicher ausgewählter Wellenlängen emittiert, und den Strahlengang durch mechanische Mittel gemäß der ausgewählten Wellenlänge der Laserlichtstrahlen durch Einstellen der Position der Asugmatismus-Ausgleichslinse und der Position der Kollimierlinse dynamisch so einstellen kann, dass eine Bewegung der Astigmatismus-Ausgleichslinse dem Astigmatismus entgegenwirkt, der durch Änderungen in der Eingangsstrahl-Wellenlänge induziert wird, oder so, dass eine Ablenk-Abtastrate und eine Bewegung der Kollimierlinse einer etwaigen Brennweitenänderung infolge der Neupositionierung der Astigmatismus-Ausgleichslinse entgegenwirken, womit der Astigmatismus und Änderungen der Kollimierung infolge von Änderungen in der Eingangsstrahl-Wellenlänge und/oder der Ablenk-Abtastrate ausgeglichen werden, und die erhaltenen Bilder des Objekts durch elektronische Mittel modifiziert werden können, um eine Ausrichtung der Abtastzeilen des Bildes bei allen Wellenlängen einzuhalten.
Die zweite Ausführungsform beschreibt so ein Verfahren zum Bewerkstelligen schneller Korrekturen des Linseneffekts in einem akusto-optischen Deflektor, was ein rasches Umschalten von Eingangsstrahl-Wellenlängen ermöglicht, so dass sukzessive Abtastungen entlang einer Zeile in dem Objekt mit verschiedenen Wellenlängen vorgenommen werden können, ohne die Abtastfrequenz zu verringern.
Der Ablenkbereich für einen bestimmten Eingangsstrahl ist von der Wellenlänge abhängig, wobei längere Wellenlängen über einen breiteren Bereich von Ablenkwinkeln gemäß der Bragg'schen Gleichungen abgetastet werden. Falls ein Experiment die Anwendung eines breiten Bereichs von Beleuchtungswellenlängen erfordert, kann das nutzbare Gesichtsfeld durch diesen Effekt eingeschränkt werden.
Gemäß einer dritten Ausführungsform, die auf der ersten und zweiten Ausführungsform basiert, umfasst ein Verfahren zum Bewerkstelligen einer schnellen Mehrfach-Wellenlängenabtastung in einem auf einem akusto-optischen Deflektor basierenden konfokalen Laserabtastmikroskop gemäß der vorliegenden Erfindung ein elektronisches Steuer- und Bilderzeugungssystem, welches Antriebsparameter des akustooptischen Deflektors gemäß einer ausgewählten Wellenlänge eines Laserlichtstrahls dynamisch anpassen kann, um eine Ausrichtung der Abtastzeilen des Bildes bei allen Wellenlängen einzuhalten, und ein mechanisches Schwenken des akusto-optischen Deflektors um seine Mittelachse, um die unterschiedlichen Ablenkwinkel und -bereiche der verwendeten Lichtstrahlwellenlängen auszugleichen.
Ein konfokales Laserabtastmikroskop gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung umfasst zusätzlich zu den Merkmalen der ersten und zweiten Ausführungsform einen Spiegel 27, der so positioniert ist, dass er das auftreffende Licht auf die Eingangsapertur des akusto-optischen Deflektors 5 richtet. Der Spiegel 27 und der akusto-optische Deflektor 5 sind auf einer gemeinsamen Basis 28 angebracht und derart angeordnet, dass sie sich zusammen um die Mittelachse dieses akusto-optischen Deflektors 5 drehen können, wie in 4 gezeigt ist. Die zentrale Dreh-/Schwenkachse des akustooptischen Deflektors 5 ist orthogonal zu der Ebene, in der der auftreffende Strahl durch den akusto-optischen Deflektor abgelenkt wird.
Das elektronische Steuer- und Bilderzeugungssystem dieser Ausführungsform ist außerdem geeignet, ein mechanisches Mittel zu steuern, um das Schwenken des akustooptischen Deflektors um die zentrale Dreh-/Schwenkachse auszuführen, um die Abtastungen mit unterschiedlichen Wellenlängen aufeinander auszurichten.
Die dritte Ausführungsform beschreibt so ein Verfahren zum Bewerkstelligen schneller Korrekturen des Linseneffekts in einem akusto-optischen Deflektor, was ein rasches Umschalten von Eingangsstrahl-Wellenlängen ermöglicht, so dass aufeinanderfolgende Abtastungen entlang einer Zeile in dem Objekt mit verschiedenen Wellenlängen vorgenommen werden können, ohne die Abtastfrequenz zu verringern, und auch ein Verfahren zum Erweitern des nutzbaren Ablenkbereichs des akusto-optischen Deflektors über einen Bereich von Lichtstrahl-Wellenlängen durch Schwenken des akusto-optischen Deflektors zusammen mit dem Spiegel 27.
In der ersten Ausführungsform werden mechanische Mittel eingesetzt-, um eine Astigmatismus- und Kollimierlinse zu vorbestimmten Positionen für jede Eingangsstrahl-Wellenlänge durch ein elektronisches Steuersystem zu bewegen. Solche mechanische Mittel können durch Elektromotoren verschiedener Typen, wie z.B. Wechselstrom-, Gleichstrom- und Schrittschalt-Typen oder durch elektro-mechanische Aktuatoren wie z.B. piezoelektrische Kristalle bereitgestellt werden. Die Position der Astigmatismuslinse hat eine annähernd lineare Beziehung mit der Wellenlänge des Eingangsstrahls, da sie die Änderung der Ablenkwinkel aufgrund von Änderungen der Wellenlänge des Eingangsstrahls korrigiert. Die Position der Kollimierlinse wird experimentell für jede Wellenlänge bestimmt, da diese Linse etwaige Brennpunktänderungen über Positionsänderungen der kompensierenden optischen Elemente kompensiert.
Das elektronische Steuersystem kann auch Steuersignale berechnen, die zum Synchronisieren der Auswahl einer Eingangsstrahlwellenlänge geeignet sind, und auch zum Synchronisieren einer Intensitätsmodulation und/oder zum Ausblenden des Eingangsstrahls während einem gewählten Teil des Abtastmusters. Positionsänderungen im Bild werden durch Schwenken, Zoomen und Beschneiden der aufgezeichneten Bilddaten durch Software in einem zugeordneten Bilderzeugungssystem korrigiert.
In der zweiten Ausführungsform stellt ein elektronisches Steuersystem eine dynamische Steuerung der Startfrequenz, der Endfrequenz und der Frequenzänderungsrate des Antriebssignals für den akusto-optischen Deflektor bereit, so dass eine konstante Zeilenabtastposition und ein konstanter Linseneffekt bei allen Eingangsstrahl-Wellenlängen eingehalten werden kann.
Aus der Bragg'schen Gleichung ist bekannt, dass zur Einhaltung des gleichen Ablenkwinkels für irgendeine gewählte Eingangsstrahl-Wellenlänge die akustische Gitterbeabstandung sich proportional ändern muß, wobei diese durch Änderung der Frequenz eines Oszillators, der den akusto-optischen Deflektor antreibt, bewerkstelligt wird. Die Antriebsoszillatorfrequenz wird über einem Wertebereich abgetastet, um die Abtastung des Laserstrahls entlang einer Zeile zu bewirken. Das Anpassen bzw. Einstellen des Bereichs der Abtastfrequenzen gemäß der Bragg'schen Gleichung für jede Eingangsstrahl-Wellenlänge ermöglicht es, eine identische Zeile von Fleckpositionen mit jeder dieser Wellenlängen abzutasten.
Die Antriebsoszillator-Start- und -Endfrequenzen werden aus den bekannten Ablenkcharakteristika des akusto-optischen Deflektors für die Eingangsstrahl-Wellenlängen berechnet und werden dynamisch ausgewählt, um eine identische optische Abtastung bei jeder Wellenlänge des Eingangsstrahls einzuhalten und folglich einen konstanten Linseneffekt bei jeder Eingangstrahl-Wellenlänge beizubehalten. Somit kann das optische System für eine Linseneinstellbedingung optimiert werden, wobei diese Bedingung dynamisch für alle Abtastraten und Eingangsstrahl-Wellenlängen durch eine Software-Computersteuerung der Antriebsparameter des akusto-optischen Deflektors beibehalten werden kann.
Um eine identische Abtastrate über identisch positionierte Pixel in dem abgetasteten Objekt für irgendeine Eingangsstrahl-Wellenlänge einzuhalten, erfordert dies, dass die Ablenkwinkel eines akusto-optischen Deflektors zu Beginn und zum Ende jedes Abtastvorgangs die gleichen bei allen Eingangsstrahl-Wellenlängen sein sollten.
Aus der Bragg'schen Gleichung ergibt sich, dass der Ablenkwinkel des durch einen akusto-optischen Deflektor passierenden Lichts direkt proportional zu der Wellenlänge des Lichtstrahls zunimmt, wenn die akustische Antriebsfrequenz und folglich die akustische Wellenlänge konstant gehalten werden.
Wenn wir die maximal verfügbare akustische Frequenz zum Antrieb des akusto-optischen Deflektors (AOD) als die maximale Ablenkung (entsprechend einem Rand, z.B. dem rechten, des abgetasteten Bereichs) für die kürzeste Wellenlänge, die abgelenkt werden muß, definieren, und ebenso die minimal verfügbare akustische Frequenz zum Antrieb des AOD, welche die minimale Ablenkung bereitstellt (entsprechend dem anderen Rand, z.B. dem linken, des abgetasteten Bereichs) für die längste Lichtwellenlänge, die abgelenkt werden muß, definieren, dann kann jeder Bereich von abgetasteten Zeilenlängen zwischen den linken und rechten Rändern des abgetasteten Bereichs mit diesen oder irgendwelchen Zwischenwellenlängen dupliziert werden. Die notwendigen akustischen Frequenzen zur Bereitstellung einer erforderlichen Abtastzeilenlänge und -position innerhalb des Bereichs bei irgendeiner anderen erforderlichen Wellenlänge können in Proportion zu der Wellenlänge des abzulenkenden Lichts berechnet werden.
Gemäß 3 ist lambda1 die längste abzulenkende Lichtwellenlänge und lambda2 ist die kürzeste abzulenkende Lichtwellenlänge. f1 ist die maximal verfügbare akustische Frequenz von einem AOD-Antriebsoszillator, und f2 ist die minimal verfügbare akustische Frequenz von dem AOD-Antriebsoszillator.
Bei irgendeiner abzulenkenden Zwischen-Lichtwellenlänge (lambdaN) ist der Ablenkwinkel für den rechten Rand (bei einer akustischen Frequenz f1) proportional zu lambdaN/lambda2, und der Ablenkwinkel für den linken Rand (bei einer akustischen Frequenz f2) ist proportional zu lambdaN/lambda1.
Der Bereich nutzbarer Ablenkwinkel, der mit dem Bereich von Lichtwellenlängen übereinstimmt, liegt zwischen den Ablenkwinkeln Φ1 und Φ2. Daher ist die akustische Frequenz zum Antreiben einer gewählten Lichtwellenlänge lambdaN zu dem linken Rand proportional zu dem Verhältnis von (maximale Wellenlänge lambda1/gewählte Wellenlänge lambdaN).
Desgleichen ist die akustische Frequenz zum Antrieb einer gewählten Lichtwellenlänge zum rechten Rand proportional zu dem Verhältnis von (minimale Wellenlänge lambda2/gewählte Wellenlänge lambdaN).
Die Kenntnis der Eingangssteuerspannung zu den akustischen Antriebsfrequenz-Übertragungseigenschaften des Antriebsoszillators für den AOD gestattet es dem elektronischen Prozessor, die Abtaststeuerspannungen zu berechnen und auszugeben, die zur Erzeugung der erforderlichen Frequenzabtastungen nötig sind, welche die Lichtstrahlablenkung in dem AOD steuern. Der elektronische Prozessor kann auch Steuersignale berechnen, die zum Synchronisieren der Auswahl der Eingangsstrahl-Wellenlänge geeignet sind, und auch zum Synchronisieren der Modulation oder der Unterdrückung des Eingangsstrahls während irgendeinem gewählten Abschnitt der Abtastwellenform.
Die Erfindung bietet die Möglichkeit, die Position der optischen Zeilenabtastung sehr rasch zu steuern, was aufeinanderfolgende Bildabtastungen ermöglicht, und sogar aufeinanderfolgende Zeilenabtastungen, die bei unterschiedlichen Eingangsstrahl-Wellenlängen vorgenommen werden können. Dies ermöglicht die Durchführung schneller mehrfarbiger Abtastungen, wobei Eingangsstrahl-Wellenlängen sequentiell bei wiederholten Abtastvorgängen der gleichen Abtastzeile umgeschaltet werden, und dann die gleiche oder eine andere Sequenz von Eingangsstrahl-Wellenlängen bei der nächsten und den darauffolgenden Abtastzeilen wiederholt wird. Für noch schnellere Ansichten der Probe unter einer Mehrfarben-Eingangsstrahlabtastung können die Eingangsstrahl-Wellenlängen sequentiell für benachbarte Abtastzeilen geschaltet werden, diese zusätzliche Steigerung der Bilderfassungsgeschwindigkeit wird aber auf Kosten der räumlichen Auflösung und Ausrichtung der Bilder bei jeder Eingangsstrahlwellenlänge gewonnen.
In einer vorteilhaften Ausführungsform treibt ein programmierbarer Spannungsrampengenerator eine Steuereingabe eines spannungsgesteuerten Frequenzoszillators an, welcher den akusto-optischen Deflektor antreibt. Somit liefert der programmierbare Spannungsrampengenerator, in dem die Startspannung, die Endspannung und die Rate der Spannungsänderung einer (typischen) klassischen Sägezahn-Wellenform definiert wird, das geeignete Oszillatorsignal an den akusto-optischen Deflektor, um den Laserstrahl über dem Objekt abzutasten. Diese Spannungsparameter können dynamisch zu jeder Zeit abgeändert werden, so dass Ablenkungsänderungen aufgrund von Änderungen in der Eingangsstrahl-Wellenlänge in der kürzesten praktizierbaren Zeit ausgeglichen werden können, wobei dies nur durch die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Akustikwelle in dem akusto-optischen Deflektor und die Dimensionen der Apertur des akusto-optischen Deflektors begrenzt ist. Diese Änderungen können externe Ereignisse wie z.B. das Schalten der Eingangsstrahlwellenlänge synchronisieren oder durch diese synchronisiert werden. Beispielsweise kann ein fein abstimmbares akusto-optisches Filter (AOTF) am Ausgang eines Mehrzeilenlasers mit der Rücklaufperiode der Sägezahn-Wellenform synchronisiert werden. Die Verwendung eines AOTF bietet auch ein einfaches und wirksames Mittel zum Modulieren oder Unterdrücken der Laserintensität für die Zeitspanne, während der das Antriebssignal des akusto-optischen Deflektors in einen neuen Abtastzustand wird, typischerweise, aber nicht exklusiv während der Rücklaufzeit zu Beginn einer neuen Abtastzeile oder eines neuen Abtast-Frames bzw. Abtast-Bildes. Da akustooptische Deflektoren (AOD's) auch die Fähigkeit aufweisen, die Intensität des Eingangslichtstrahls bei seinem Durchgang durch den AOD zu modulieren, kann der AOD auch als Mittel zum Modulieren und zum Unterdrücken bzw. Abschalten der Eingangsstrahlintensität verwendet werden.
In der dritten Ausführungsform stellt das elektronische Steuersystem eine dynamische Steuerung der Startfrequenz, der Endfrequenz und der Rate einer Frequenzänderung des Antriebssignals am akusto-optischen Deflektor der Art bereit, dass ein konstanter Linseneffekt bei allen Eingangsstrahl-Wellenlängen beibehalten wird. Der akusto-optische Deflektor und der auf seine Fläche auftreffende Strahl werden um die Mittelachse des akusto-optischen Deflektors gedreht, womit die Überlappung bei Abtastvorgängen zwischen unterschiedlichen Lichtstrahl-Wellenlängen erhöht wird.
Aus der Bezugnahme auf 3 ist zu erkennen, dass die resultierende Abtastung für eine Wellenlänge lambda1 einen breiteren Bereich von Winkeln abtastet und eine Winkelversetzung im Vergleich zu der resultierenden Abtastung für die Wellenlänge lambda1 über dem gleichen akustischen Frequenzbereich aufweist. Wenn ein Experiment die Anwendung eines breiten Bereichs von Lichtstrahlwellenlängen erfordert, muß der gemeinsame Abtastbereich für alle Lichtstrahl-Wellenlängen verwendet werden, was einen reduzierten Gesamt-Abtastbereich ergibt.
Um den sich überlappenden Abtastbereich zu vergrößern, kann der Strahlengang durch den akusto-optischen Deflektor um dessen Mittelachse gedreht werden. Um diese Drehung zu bewerkstelligen, wird das auf den akusto-optischen Deflektor 5 auftreffende Licht durch einen unter 45 Grad zu der Eingangsapertur des akusto-optischen Deflektors ausgerichteten Spiegel 27 geleitet. Dieser Spiegel ist an der gleichen Halterung 28 wie der akusto-optische Deflektor 5 angebracht oder direkt oder auf andere Art mit dem Deflektor verbunden, und beide können um die Mittelachse des akusto-optischen Deflektors gedreht/geschwenkt werden.
In 4 veranschaulicht Teil (a) das ursprüngliche Problem, bei dem Licht von zwei unterschiedlichen Wellenlängen durch den gleichen Bereich akustischer Frequenzen abgelenkt wird, was in zwei Ablenkungsbereiche ergibt, die versetzt sind und sich im Winkelbereich voneinander unterscheiden. Teil (b) veranschaulicht ein System, durch das das auf den akusto-optischen Deflektor auftreffende Licht von einem Spiegel gelenkt wird. Eine Drehung des Montagegestells bzw. der Halterung, welche sowohl den Spiegel als auch den akusto-optischen Deflektor aufnimmt, ergibt eine Winkelversetzung des aus dem akusto-optischen Deflektor austretenden Lichts. Solche mechanischen Mittel können durch Elektromotoren verschiedener Arten wie z.B. Wechselstrom-, Gleichstrom- und Schrittschaltmotoren, oder durch elektromechanische Aktuatoren wie z.B. piezoelektrische Kristalle bereitgestellt werden. Teil (c) veranschaulicht, wie diese Drehung genutzt werden kann, um den Überlappungsbereich der beiden unterschiedlichen, in Teil (a) dargestellten Wellenlängen zu vergrößern.
In 4 ist in Teil (c) zu erkennen, dass die mechanische Drehung des Spiegels und des akusto-optischen Deflektors eine Vergrößerung des Überlappungsbereichs der beiden unterschiedlichen Lichtstrahlwellenlängen ergibt, der Gesamt-Abtastbereich jeder Wellenlänge ist jedoch nicht der gleiche, da eine Kombination aus mechanischer Drehung und einer Einstellung bzw. Anpassung von Frequenzabtastungen für jede Wellenlänge, wie sie in der zweiten Ausführungsform eingesetzt werden, erforderlich sind, um den gleichen Abtastvorgang bei jeder Lichtstrahlwellenlänge auszuführen.
Jede der drei beschriebenen Ausführungsformen kann ferner stromab des Trennungspunkts des Rückführ-Strahlengangs von dem Eingangs-Strahlengang durch den Strahlteiler 4 oder den dichromatischen Spiegel 20 angepaßt werden, um den Rückführ-Lichtstrahlengang mittels zusätzlicher Strahlteiler, dichromatischer Spiegel oder Kombinationen von beiden aufzuteilen. Jeder resultierende Strahl kann auf einen von mehreren Detektoren gerichtet werden, wobei jeder Detektor ein räumliches Filter, ein Objektiv und eine den Strahlengang des einzelnen Detektors duplizierende Linse aufweist, wie in 1 und 2 gezeigt ist, außer dass ein Passband- oder Sperrfilter für jeden Strahlengang des Detektors unterschiedlich sein kann, und daher kann diese Mehrzahl von Detektoren dazu verwendet werden, spektrale Information aus dem Rückführ-Lichtstrahl zu extrahieren.
Zusätzliche Vorteile dieser Erfindung können auch die folgenden umfassen:
Der Abtastbereich des Objekts ist identisch für alle Wellenlängen, so dass keine Abtastung des Objekts außerhalb des interessierenden Bereichs stattfindet, und keine Ausbleichungseffekte in benachbarten Bereichen des Objekts verursacht werden.
Pixel, die mit verschiedenen Eingangswellenlängen von dem gleichen Objekt entnommen werden, haben identische Positionen und Verweilzeiten, was die Anwendung des konfokalen Mikroskops auf Techniken wie FREI (Fluorescence Resonance Energy Transfer), FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging), FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), eine Bildzuteilung (image ratioing) etc. vereinfacht.

Claims

Konfokales Laser-Abtastmikroskop, umfassend: Mittel, die eine Laserlichtquelle (1) umfassen, zum Emittieren von Laserlichtstrahlen mit unterschiedlichen Wellenlängen, einen Strahlengang zum Richten der Laserlichtstrahlen von dem Laserlichtstrahl-Emittiermittel zu einer Objektstufe zum Haltern eines Objekts, wobei der Strahlengang umfaßt: einen ersten Deflektor mit einem akusto-optischen Deflektor (5) zum Ausführen einer Zeilenabtastung, mindestens ein Objektiv (9) zum Fokussieren des Laserlichtstrahls auf das Objekt an der Objektstufe, einen zweiten Deflektor (7), der zwischen dem akusto-optischen Deflektor (5) und dem mindestens einen Objektiv (9) positioniert ist, um eine Frame- bzw. Bildabtastung durchzuführen, wobei der zweite Deflektor (7) und das mindestens eine Objektiv (9) so positioniert sind, dass die von dem Objekt zurückgeführten Lichtstrahlen (19) dem gleichen Strahlengang folgen wie die auf das Objekt fokussierten Laserlichtstrahlen bis zu dem zweiten Deflektor (7) und einschließlich diesem, mindestens einen Detektor (15; 26), der in dem Rückführlichtstrahlengang stromab des zweiten Deflektors (7) positioniert ist, um die zurückgeführten Lichtstrahlen von dem Objekt zu erfassen, wobei das Objekt durch die Laserlichtstrahlen von dem Laserlichtstrahl-Emittiermittel abgetastet werden kann und Messungen mit dem mindestens einen Detektor (15; 26) vorgenommen werden können, um Bilder des Objekts zu erhalten, und ein elektronisches Steuer- und Bilderzeugungssystem, welches das Laserlichtstrahl-Emittiermittel so steuern kann, dass es individuelle Laserlichtstrahlen sequentiell mit ausgewählten Wellenlängen emittiert, und Antriebsparameter des akusto-optischen Deflektors (5) durch dynamisches Steuern der Startfrequenz und der Endfrequenz des akusto-optischen Deflektors dynamisch so regeln kann, dass eine konstante Zeilenabtastposition bei allen Eingangsstrahl-Wellenlängen eingehalten wird, und durch dynamisches Steuern der Frequenzänderungsrate des Antriebssignals zu dem akustooptischen Deflektor derart, dass ein konstanter Objektiveffekt bei allen Eingangsstrahl-Wellenlängen erhalten wird, um eine Ausrichtung der Abtastzeilen des Bildes bei allen Wellenlängen einzuhalten.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop, umfassend: Mittel, die eine Laserlichtquelle (1) umfassen, zum Emittieren von Laserlichtstrahlen mit unterschiedlichen Wellenlängen, einen Strahlengang zum Richten der Laserlichtstrahlen von dem Laserlichtstrahl-Emittiermittel zu einer Objektstufe zum Haltern eines Objekts, wobei der Strahlengang umfaßt: einen ersten Deflektor mit einem akusto-optischen Deflektor (5) zum Ausführen einer Zeilenabtastung, mindestens ein Objektiv (9) zum Fokussieren des Laserlichtstrahls auf das Objekt an der Objektstufe, einen zweiten Deflektor (7), der zwischen dem akusto-optischen Deflektor (5) und dem mindestens einen Objektiv (9) positioniert ist, um eine Frame- bzw. Bildabtastung durchzuführen, wobei der zweite Deflektor (7) und das mindestens eine Objektiv (9) so positioniert sind, dass die von dem Objekt zurückgeführten Lichtstrahlen (19) dem gleichen Strahlengang folgen wie die auf das Objekt fokussierten Laserlichtstrahlen bis zu dem zweiten Deflektor (7) und einschließlich diesem, eine Kollimierlinse (6), die zwischen dem ersten Deflektor und dem zweiten Deflektor (7) positioniert ist, mindestens einen Detektor (15; 26), der in dem Rückführlichtstrahlengang stromab des zweiten Deflektors (7) positioniert ist, um die zurückgeführten Lichtstrahlen von dem Objekt zu erfassen, wobei das Objekt durch die Laserlichtstrahlen von dem Laserlichtstrahl-Emittiermittel abgetastet werden kann und Messungen mit dem mindestens einen Detektor (15; 26) vorgenommen werden können, um Bilder des Objekts zu erhalten, und ein elektronisches Steuer- und Bilderzeugungssystem, welches das Laserlichtstrahl-Emittiermittel so steuern kann, dass es Laserlichtstrahlen unterschiedlicher ausgewählter Wellenlängen emittiert, und den Strahlengang durch mechanische Mittel gemäß der ausgewählten Wellenlänge der Laserlichtstrahlen durch Einstellen der Position der Astigmatismus-Ausgleichslinse (5.2) und der Position der Kollimierlinse (6) dynamisch so einstellen kann, dass eine Bewegung der Astigmatismus-Ausgleichslinse (5.2) dem Astigmatismus entgegenwirkt, der durch Änderungen in der Eingangsstrahl-Wellenlänge induziert wird, oder so, dass eine Ablenk-Abtastrate und eine Bewegung der Kollimierlinse (6) einer etwaigen Brennweitenänderung infolge der Neupositionierung der Astigmatismus-Ausgleichslinse (5.2) entgegenwirken, womit der Astigmatismus und Änderungen der Kollimierung infolge von Änderungen in der Eingangsstrahl-Wellenlänge und/oder der Ablenk-Abtastrate ausgeglichen werden, und die erhaltenen Bilder des Objekts durch elektronische Mittel modifiziert werden können, um eine Ausrichtung der Abtastzeilen des Bildes bei allen Wellenlängen einzuhalten.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, ferner mit: einem Spiegel (27), der so positioniert ist, dass er das auftreffende Licht in die Eingangsapertur des akustooptischen Deflektors (5) richtet, und der Spiegel (27) und der akusto-optische Deflektor (5) so montiert und angeordnet sind, dass sie sich um die Mittelachse des akusto-optischen Deflektors (5) drehen können, und das elektronische Steuer- und Bilderzeugungssystem ferner den Spiegel (27) und den akusto-optischen Deflektor (5) entsprechend der ausgewählten Wellenlänge der Laserlichtstrahlen drehen/schwenken kann, um die Überlappung bei Abtast-Ablenkwinkeln zwischen unterschiedlichen Lichtwellenlängen zu erhöhen.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Strahlengang ferner umfasst: eine Linse (8), die zwischen dem Objektiv (9) und dem zweiten Deflektor (7) positioniert ist, um die Lichtstrahlen von dem Objektiv (9) auf den zweiten Deflektor (7) zu richten, und mindestens ein räumliches Filter (14; 23), das in dem Rückführlicht-Strahlengang zwischen dem zweiten Deflektor (7) und dem mindestens einen Detektor (15; 26) positioniert ist, um eine konfokale Bilderzeugung durchzuführen, wodurch eine Frame- bzw. Bild-Abtastbewegung, die von dem zweiten Deflektor (7) ausgeführt wird, eliminiert werden kann, wodurch das Rückführlicht auf das mindestens eine räumliche Filter (14; 23) fokussiert werden kann.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei ein erster Strahlteiler (4) oder dichromatischer Spiegel in den Strahlengang zwischen dem akusto-optischen Deflektor (5) und dem Laserlichtstrahl-Emittiermittel eingefügt ist, um den Rückführlichtstrahl aufzuspalten und ihn auf den mindestens einen Detektor (15) zu richten, wobei der Strahlengang so aufgebaut ist, dass der Rückführlichtstrahl dem gleichen Strahlengang folgt wie der Laserlichtstrahl bis zum ersten Strahlteiler (4) oder zum dichromatischen Spiegel, wodurch die von dem akusto-optischen Deflektor (5) eingeführte Zeilenabtastbewegung eliminiert wird.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung bei Fluoreszenzmikroskopie oder bei anderen Formen der Mikroskopie, bei denen die Wellenlänge des Rückführstrahls (19) sich von derjenigen der von dem Laserlichtstrahl-Emittiermittel emittierten Laserstrahlen unterscheidet, wobei ein räumliches Filter (14) an einer Anordnung dreier piezoelektrischer Kristalle angebracht ist und entsprechend in einem 3D-Koordinatensystem bewegt werden kann, wodurch die Wirkung der dispersiven Natur des akusto-optischen Deflektors (5) auf das Rückführlicht einer unterchiedlichen Wellenlänge, das unter einem anderen Winkel abgelenkt wird als das reflektierte Laserlicht, eliminiert wird, und wobei ein entsprechend angepasstes Paßband- oder Sperrfilter (12) in den Rückführlicht-Strahlengang eingegliedert ist, um das reflektierte Laserlicht herauszufiltern.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, zur Verwendung bei der Fluoreszenz- oder anderen Formen der Mikroskopie, bei der die Wellenlänge des Rückführstrahls (19) sich von derjenigen des Laserlichtstrahls (18) unterscheidet, wobei ein dichromatischer Spiegel (20) in den Strahlengang zwischen dem akusto-optischen Deflektor (5) und dem zweiten Deflektor (7) eingefügt ist, um den Rückführlichtstrahl mit unterschiedlichen Wellenlängen stromab des zweiten Deflektors abzulenken und ihn über ein Objektiv (22) und ein anschließendes räumliches Filter (23) auf einen nachfolgenden Detektor (26) zu richten, wobei das anschließende räumliche Filter (23) ein Schlitzfilter ist, welches einen Zeilendetektor mit dem anschließenden Detektor (26) bildet.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop nach Anspruch 5 oder 7, wobei der Rückführlichtstrahl mittels eines zusätzlichen Strahlteilers oder eines dichromatischen Spiegels oder mehrerer zusätzlicher Strahlteiler oder dichromatischer Spiegel, die in den Rückführstrahlengang eingefügt sind, nachdem der Rückführstrahlengang von dem Eingangsstrahlengang durch den ersten Strahlteiler (4) oder dichromatischen Spiegel (20) getrennt wurde, in mehrere Lichtstrahlen unterteilt werden kann, wobei jeder resultierende Strahl auf einen oder mehrere Detektoren gerichtet werden kann und jeder Detektor ein räumliches Filter, ein Objektiv und eine den einzelnen Detektor-Strahlengang duplizierende Linse aufweist, außer dass ein Passband oder Sperrfilter für jeden Detektor anders sein kann.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das elektronische Steuer- und Bilderzeugungssystem eine Synchronisierung der ausgewählten Laserstrahl-Wellenlänge mit dem Rücklauf oder einem anderen ausgewählten Zeitpunkt bei den Zeilenabtastungen durch Anlegen von Steuersignalen an ein stromab der Laserlichtquelle (1) angebrachtes Wellenlängen-Auswahlmittel bereitstellen kann, so dass die durch das Wellenlängen-Auswahlmittel passierenden Laserlichtstrahlen bei ihrem Durchgang in oder durch den Strahlengang so gesteuert werden, dass nur die ausgewählte Wellenlänge den Strahlengang durchlaufen kann.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das elektronische Steuer- und Bilderzeugungssystem eine Synchronisierung der Intensitätsmodulation oder der Dunkelabtastung bzw. Unterdrückung des Laserlichtquellenstrahls am Rücklauf oder einem anderen ausgewählten Zeitpunkt in den Zeilenabtastungen durch Anlegen von Steuersignalen an ein stromab der Laserlichtquelle (1) angebrachtes Intensitäts-Modulationsmittel bereitstellen kann, so dass die das Intensitätsmodulationsmittel passierenden Laserlichtstrahlen bei ihrem Durchgang in oder durch den Strahlengang so gesteuert werden, dass die Intensität der Lichtstrahlen moduliert oder ausgetastet werden kann.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop nach Anspruch 9, wobei das Wellenlängen-Auswahlmittel ein akusto-optisch feinregelbares Filter (AOTF) umfasst.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop nach Anspruch 10, wobei das Intensitätsmodulationsmittel ein feinregelbares akustooptisches Filter (AOTF) und/oder den akusto-optischen Deflektor (5) umfasst.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das elektronische Steuer- und Bilderzeugungssystem eine hartverdrahtete Logik, einen Digitalsignalprozessor, einen Mikroprozessor, einen Computer oder eine ähnliche Rechnervorrichtung aufweist.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Laserlichtquelle (1) einen Mehrfachzeilenlaser, einen feinregelbaren Laser und/oder eine Anordnung von Lasern umfasst, welche mit verschiedenen Wellenlängen emittieren, sowie eine optische Konfiguration, die kolineare Laserstrahlen liefert.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der zweite Reflektor (7) ein Spiegelgalvanometer umfasst.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Lichtstrahlen an den Strahlengang mittels einer starren oder flexiblen optischen Lichtführung gekoppelt sind.
Konfokales Laser-Abtastmikroskop nach Anspruch 16, wobei die optische Lichtführung eine Optikfaser ist.
Verfahren zum Bewerkstelligen einer schnellen Mehrfach-Wellenlängenabtastung bei einem akusto-optischen Deflektor basierend auf einem konfokalen Laserabtastmikroskop gemäß Anspruch 1, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: dynamisches Steuern der Startfrequenz und Endfrequenz des akusto-optischen Deflektors derart, dass eine konstante Zeilenabtastposition bei allen Eingangsstrahl-Wellenlängen eingehalten wird, und durch dynamisches Steuern der Frequenzänderungsrate des Antriebssignals zu dem akustooptischen Deflektor derart, dass ein konstanter Linseneffekt bei allen Eingangsstrahl-Wellenlängen erhalten wird, um eine Ausrichtung von Abtastzeilen eines Bildes eines Objekts bei allen Wellenlängen einzuhalten.
Verfahren zum Durchführen einer schnellen Mehrfach-Wellenlängenabtastung in einem akusto-optischen Deflektor basierend auf einem konfokalen Laserabtastmikroskop gemäß Anspruch 2, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: dynamisches Einstellen eines Strahlengangs des akustooptischen Deflektors basierend auf einem konfokalen Mikroskop durch mechanische Mittel gemäß einer ausgewählten Wellenlänge des Laserlichtstrahls durch Einstellen der Position einer Astigmatismus-Ausgleichslinse (5.2), die dem akusto-optischen Deflektor zugeordnet ist, und der Position einer Kollimierlinse (6) derart, dass eine Bewegung der Astigmatismus-Ausgleichslinse (5.2) dem Astigmatismus entgegenwirkt, der durch Änderungen in der Eingangsstrahl-Wellenlänge oder in der Ablenk-Abtastrate induziert wird, und so, dass eine Bewegung der Kollimierlinse (6) einer etwaigen Brennweitenänderung infolge der Neupositionierung der Astigmatismus-Ausgleichslinse (5.2) entgegenwirkt, womit Astigmatismus- und Kollimieränderungen infolge der Änderung der Eingangsstrahl-Wellenlänge ausgeglichen werden und erfasste Bilder eines Objekts durch elektronische Mittel so modifiziert werden, dass eine Ausrichtung der Abtastzeilen des Bildes bei allen Wellenlängen eingehalten wird.
Verfahren zum Durchführen einer schnellen Mehrfach-Wellenlängenabtastung in einem akusto-optischen Deflektor basierend auf einem konfokalen Laserabtastmikroskop nach Anspruch 18 oder 19, ferner umfassend: mechanisches Drehen/Schwenken des akusto-optischen Deflektors um seine Mittelachse, um die unterschiedlichen Ablenkwinkel und -bereiche der verwendeten Lichtwellenlängen auszugleichen.