DE20216583U1

DE20216583U1 - Mikroskop und Durchflusszytometer

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Publication number: DE20216583U1
Application number: DE20216583U
Authority: DE
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2001-12-20
Filing date: 2002-10-25
Publication date: 2003-01-23
Anticipated expiration: 2012-10-26
Also published as: US20030123144A1; US6867899B2

Description

Mikroskop und Durchflusszytometer

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einer Lichtquelle, die Licht zur Beleuchtung einer Probe emittiert, und mit einem Spektrometer, das von der Probe ausgehendes Detektionslicht empfängt.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Durchflusszytometer mit einer Lichtquelle, die Licht zur Beleuchtung einer Probe emittiert, und einem Spektrometer, das von der Probe ausgehendes Detektionslicht empfängt.

In der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.

Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.

Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw.

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Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt idealer Weise einen Mäander beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position, diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u.s.w.). Um eine schichtweise Bilddatennahme zu ermöglichen, wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht verschoben und so die nächste abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.

Aus der Deutschen Offenlegungsschrift DE 41 11 903 A1 ist ein Verfahren zur Erzeugung und Korrelation lichtmikroskopischer Bilder mit nach Wellenlängen aufgelösten Messdaten von Proben durch ein- oder zweimalige Abtastung einzelner Elemente der abzubildenden Probenfläche mit einem konfokalen, scannenden Lichtmikroskop bekannt. Das Verfahren umfasst das Einkoppeln eines Teiles des Lichtes aus dem Abbildungsstrahlengang in ein Spektrometer und Korrelation der Bildinformation mit den spektroskopischen Daten durch Abspeicherung der spektroskopischen Daten in einem zweidimensionalen Bereich, wobei eine Dimension zur Speicherung des gemessenen Spektrums der einzelnen Elemente verwendet wird und die zweite Dimension mittels der von den abgerasterten Elementen remittierten Lichtintensität oder eines aus der Gesamtinformation des Probenbildes mittels Bildverarbeitung gewonnenen Kriteriums angesteuert wird. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt in der vollen Ausnutzung der Möglichkeiten eines konfokalen, scannenden Lichtmikroskops und der verschiedenen spektroskopischen Verfahren.

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Aus der Amerikanischen Patentschrift 6,134,002 ist ein konfokales Scanmikroskop und ein Verfahren zur schnellen Erzeugung von spektral aufgelösten Bildern bekannt, wobei mindestens zwei Punkte der Probe gleichzeitig abgerastert werden.

Die in den genannten Schriften offenbarten Vorrichtungen und Verfahren haben den Nachteil, dass das jeweils aufgenommene Spektrum, das aus dem von der Probe ausgehenden Licht erzeugt wird, in einem sehr breiten Bereich von mehreren zehn Nanometern um die Wellenlänge des Beleuchtungslichtes unvollständig ist. Dies ist darauf zurückzuführen, dass dichroitische oder tripledichroitische Strahlteiler eingesetzt werden, um einerseits das Licht einer Lichtquelle zur Probe zu lenken und andererseits das von der Probe ausgehende Detektionslicht in einen Detektionsstrahlengang zu führen, wobei das im Detektionslicht durch Streuung und Reflexion ungewollt noch vorhandene Beleuchtungslicht ausgeblendet werden muss; dies ist mit dichroitischen oder triple-dichroitischen Strahlteilern, die als Bandpass- oder Kantenfilter ausgeführt sind, nur unter Inkaufnahme des beschriebenen Informationsverlustes im Spektrum möglich, da die spektralen Kanten der Strahlteiler nicht mit unendlicher Steilheit sondern mit Anstiegen, die sich üblicherweise über einige Nanometer erstrecken, herstellbar sind. Auch die Verwendung von teildurchlässigen Neutralteilern zur Separation von Beleuchtungs- und Detektionslicht löst, da die Leistung des Fluoreszenzlichtes deutlich schwächer ist als die des reflektierten Anregungslichts, nicht das geschilderte Problem, sondern führt nur zu einer Verfälschung des Spektrums.

Ganz besonders nachteilig zeigen sich die bekannten Scanmikroskope bei Anwendungen, die die Analyse von Proben, die gleichzeitig mit mehreren Farbstoffen markiert sind, zum Inhalt haben, da das Beleuchtungslicht bei diesen Experimenten zwei, drei oder mehr Wellenlängen aufweist, so dass die geschilderten Probleme in noch viel extremerem und störenderem Maße zum Tragen kommen.

Aus der Deutschen Offenlegungsschrift DE 199 06 757 ist eine optische Anordnung im Strahlengang einer zur Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle, vorzugsweise im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning-

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Mikroskops, mit mindestens einem spektral selektiven Element zum Einkoppeln des Anregungslichts mindestens einer Lichtquelle in das Mikroskop und zum Ausblenden des am Objekt gestreuten und reflektierten Anregungslichts bzw. der Anregungswellenlänge aus dem über den Detektionsstrahlengang vom Objekt kommenden Licht, bekannt. Die optische Anordnung ist zur variablen Ausgestaltung bei einfachster Konstruktion dadurch gekennzeichnet, dass durch das spektral selektive Element Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlänge ausblendbar ist. Alternativ ist eine solche optische Anordnung dadurch gekennzeichnet, dass das spektral selektive Element auf die auszublendende Anregungswellenlänge einstellbar ist. Das spektral selektive Element kann als AOD (acousto optical deflector) oder als AOTF (acousto optical tunable filter) ausgebildet sein. In einer bevorzugen Ausgestaltung ist ein Scanmikroskop offenbart, dass die dispersiven Eigenschaften des spektral selektiven Elements ausnutzt und detektiert.

Dieses Scanmikroskop hat den Nachteil einer sehr geringen spektralen Auflösung, da die Dispersionseigenschaften üblicher akustooptischer Elemente, wie AOD (acousto optical deflector) oder AOTF (acousto optical tunable filter), weder linear, noch ausreichend groß sind, um bei vernünftiger Baugröße eine ausreichende Auffächerung zu erzielen.

Bei Durchflusszytometem ergeben sich analog die gleichen Probleme, wobei die Probe aus einer durch eine Düse zu einem Strahl geformten Flüssigkeit besteht.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop vorzuschlagen, das eine verbesserte, weitgehend lückenlose und fehlerfreie, hochauflösende Spektralanalyse des von einer mikroskopischen Probe ausgehenden Detektionslichtes ermöglicht.

Obige Aufgabe wird durch ein Mikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine optische Anordnung mit einem akustooptisches Bauteil vorgesehen ist, die das Licht der Lichtquelle zur Probe leitet und das von der

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Probe ausgehende Detektionslicht spektral unaufgespalten einem Spektrometer zuführt.

Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung ein Durchflusszytometer anzugeben, das eine verbesserte, weitgehend lückenlose und fehlerfreie, hochauflösende Spektralanalyse des Detektionslichtes ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch ein Durchflusszytometer gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine optische Anordnung mit einem akustooptisches Bauteil vorgesehen ist, die das Licht der Lichtquelle zur Probe leitet und das von der Probe ausgehende Detektionslicht einem Spektrometer zuführt.

Die Erfindung hat den Vorteil, dass eine hochauflösende, weitgehend lückenfreie und schnelle spektrale Analyse des von einer Probe ausgehenden Detektionslichtes ermöglicht ist. Ganz besonders vorteilhaft ist die Erfindung bei mehrfarbiger Probenbeleuchtung und bei Experimenten, die auf einen schnellen Wechsel der Beleuchtungswellenlänge angewiesen sind. Die Erfindung ermöglicht eine schnelle, nahezu unverfälschte Aufnahme des Emissionsspektrums einer Probe.

In einer bevorzugen Ausgestaltung beinhaltet die optische Anordnung ein Kompensationselement, das eine von dem akustooptischen Bauteil erzeugte spektrale Aufspaltung des von der Probe ausgehenden Lichtes kompensiert.

Hervorgerufen wird die spektrale Aufspaltung bei manchen akustooptischen Bauteilen durch die Anordnung der Grenzflächen, so dass eine Prismenwirkung auf den Detektionslichtstrahl auftritt. Ganz besonders vorteilhaft ist eine Ausführungsform, bei der das optische Kompensationselement sowohl eine ungewollte Prismenwirkung, als auch eine Doppelbrechung kompensiert. Hierbei beinhaltet das optische Kompensationselement vorzugsweise ein weiteres akustooptisches Bauteil. In einer ganz besonders vorteilhaften Ausführungsvariante weist das weitere akustooptische Bauteil die gleiche äußere Form und die gleiche Kristallstruktur auf wie das erste akustooptische Bauteil. Das weitere akustooptische Bauteil und das erste akustooptische Bauteil sind bezüglich der Ausbreitungsrichtung des auf das erste akustooptische Bauteil treffenden Detektionslichtstrahls

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gegeneinander um 180 Grad verdreht orientiert. In der Regel ist das so orientierte weitere akustooptische Bauteil seitlich zu der durch die Ausbreitungsrichtung des auf das erste akustooptische Bauteil treffenden Detektionslichtstrahls definierten Achse versetzt, damit der Detektionslichtstrahl auf das weitere akustooptische Bauteil trifft. Der Abstand vom ersten akustooptischem Bauteil zum weiteren akustooptische Bauteil ist in dieser Ausführung möglichst klein gewählt, um eine zu große räumliche Aufspaltung des Detektionslichtstrahls zwischen akustooptischem Bauteil und dem weiteren akustooptischen Bauteil zu vermeiden. Räumliche Aufspaltungen in der Größenordnung von einem halben Strahldurchmesser sind akzeptabel.

Ganz besonders vorteilhaft ist eine Ausgestaltung, bei der das akustooptische Bauteil ein AOTF (acusto optical tunable filter) oder ein AOD (akustooptischer Deflektor) oder ein AOBS (acousto optical beam splitter) ist.

Mit Hilfe des akustooptischen Bauteils ist Licht der Lichtquelle mit der optischen Anordnung zumindest teilweise aus dem Detektionslicht ausblendbar. Diese Ausführung ist besonders bei Mehrfarbbeleuchtung von Proben mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen vorteilhaft. Die Unterdrückung der Anregungswellenlängen durch das akustooptische Bauteil ist so gut, dass, selbst bei Verwendung gleichzeitig mehrerer Anregungswellenlängen, diese nicht störend im Spektrum auftreten. Zusätzliche Sperrfilter sind nicht notwendig.

Da man keine &ldquor;Kantenfiltercharakteristik" hat, ist es sogar möglich, Fluoreszenzen zu detektieren, die unterhalb der Anregungswellenlänge (Anti-Stokes-Fluoreszenz) auftreten.

Das akustooptische Bauteil schneidet in einer bevorzugen Ausgestaltung nur ein etwa 2 nm breites Band je Anregungswellenlänge aus dem Emissionsspektrum heraus. Diese kleine Lücke stört den Beobachter im Allgemeinen nicht. Die Breite dieser Lücke liegt bei kleineren Spektrometem schon im Bereich die Auflösungsgrenze. Für die spätere Wiedergabe per Computer können die Lücken leicht softwaremäßig durch Interpolation

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geschlossen werden.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltung werden auch die beschriebenen kleinen Lücken durch zweimaliges Abrasteren der Probe mit um die Breite der ausgeschnittenen Bänder verschobenen Anregungswellenlängen und durch Vereinigen der gemessenen Emissionsspektren vollständig vermieden. Hierbei ist von besonderem Vorteil ,dass das akustooptische Bauteil sehr schnell umschaltbar ist.

In einer bevorzugen Ausgestaltung ist aus dem Licht zur Beleuchtung der Anteil zumindest einer auswählbaren Wellenlänge mit der optischen Anordnung ausblendbar. Die Wellenlänge des ausblendenden Lichtes kann insbesondere bei einem Mikroskop, ganz besonders vorteilhaft bei einem Scanmikroskop, auch während des Abrastern erfolgen.

In einer bevorzugen Ausgestaltung ist eine Strahlablenkeinrichtung vorgesehen, die das Licht zur Beleuchtung zeilenweise über die Probe führt. Ganz besonders vorteilhaft ist eine Variante, in der die Wellenlänge des Lichtes zur Beleuchtung zeilenweise umschaltbar ist. Eine wechselnde Beleuchtung der Probe insbesondere während des Abrastems bei einem Scanmikroskop mit verschiedenen Anregungswellenlängen ist erst durch die Erfindung ermöglicht, da ein Wechseln der Wellenlänge des Beleuchtungslichtes bei den bekannten Anordnungen ein manuelles Wechseln der Strahlteiler verlangt, was für ein sinnvolles Abrastern, insbesondere bei lebenden Proben, viel zu langsam ist.

In einer bevorzugen Ausgestaltung ist das Mikroskop als Scanmikroskop oder als konfokales Scanmikroskop ausgebildet.

Eine besondere Variante der Erfindung beinhaltet eine Lichtleitfaser , die Detektionslicht von der optischen Anordnung empfängt und zu dem Spektrometer leitet.

Vorzugsweise wird das Detektionslicht dem Spektrometer spektral unaufgespalten zugeführt.

Das von der Probe ausgehende Detektionslicht kann insbesondere

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Fluoreszenzlicht sein.

In einer bevorzugen Ausgestaltung weist das Licht der Lichtquelle mehrere Wellenlängen auf, wobei ein Anteil zumindest einer auswählbaren Wellenlänge aus dem Licht zur Beleuchtung mit der optischen Anordnung, ausblendbar ist. In einer Ausführungsform ist ein Anteil zumindest einer auswählbaren Wellenlänge des Lichtes zur Beleuchtung mit der optischen Anordnung abschwächbar.

Bei der Probe kann es sich insbesondere um biologische Proben oder Biochips handeln.

Mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop ist die FRET-Effizienz von speziell markierten Proben (fluorescence resonance energy transfer) messbar. Die je nach Umgebung der zu untersuchenden Strukturen unterschiedliche FRET-Shift ist mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop einfach und effizient messbar und lässt Rückschlüsse auf die Zusammensetzung und das Verhalten der untersuchten Probe zu.

In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und
wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende
Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:

Fig. 1 Ein erfindungsgemäßes Mikroskop,

Fig. 2 das Transmissionsspektrum eines idealen Strahlteilers für

Beleuchtungslicht einer Wellenlänge,

Fig. 3 das Transmissionsspektrum eines akustooptischen

Bauteils für Beleuchtungslicht einer Wellenlänge,

Fig. 4 das Transmissionsspektrum eines realen Triple-Dichroiten

Fig. 5 das Transmissionsspektrum eines akustooptischen

Bauteils für Beleuchtungslicht von drei Wellenlängen,

Fig. 6 das Bildfeld eines erfindungsgemäßen Mikroskops in

Bezug auf spezielle Proben und

Fig. 7 eine weiteres das Bildfeld eines erfindungsgemäßen

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Mikroskops.

Fig. 1 zeigt ein erfindungsgemäßes Mikroskop 2, das als konfokales Scanmikroskop ausgeführt ist, mit einer Lichtquelle 4, die zwei Laser 1, 3, deren Emissionslichtstrahlen 5, 7, die unterschiedliche Wellenlängen aufweisen, beinhaltet, wobei die Emissionslichtstrahlen 5, 7 mit einem dichroitischen Strahlvereiniger 9 zu einem Beleuchtungslichtstrahl 11 vereinigt werden. Das Scanmikroskop weist ein akustooptisches Bauteil 13 auf, das als AOTF 15 ausgeführt ist. Der Beleuchtungslichtstrahl 11 wird von einem Umlenkspiegel 12 zum akustooptischen Bauteil 13 reflektiert. Vom akustooptischen Bauteil 13 gelangt der Beleuchtungslichtstrahl 11 auf eine Strahlablenkeinrichtung 17, die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 19 beinhaltet, und den Beleuchtungslichtstrahl 11 durch die Scanoptik 21, die Tubusoptik 23 und das Objektiv 25 über bzw. durch die Probe 27 führt. Der von der Probe kommende Detektionslichtstrahl 29 durchläuft in umgekehrter Richtung die Scanoptik 21, die Tubusoptik 23 und das Objektiv 25 und gelangt über den Scanspiegel 19 zum akustooptischen Bauteil 13, das den Detektionslichtstrahl 29 einem Kompensationselement 31, das als weiteres akustooptisches Bauteil 33 ausgeführt ist, zuführt. Nach Durchlaufen des Kompensationselements 31 trifft der Detektionslichtstrahl 29 auf ein Spiegelpaar aus einem ersten Spiegel 35 und einem zweiten Spiegel 37. Das Spiegelpaar dient dazu, den Detektionslichtstrahl 29 auf die gewünschte Strahlachse, nämlich die Strahlachse, die der Detektionslichtstrahl 29 beim Austreten aus der Strahlablenkeinrichtung 17 definiert, zu bringen. Das Spiegelpaar leitet den Detektionslichtstrahl 29 einem Spektrometer 39 zu, das den Detektionslichtstrahl 29 spektral analysiert und das Spektrum in Form von elektrischen Signalen einem PC 45 zuführt, der das Spektrum in einer grafischen Darstellung 47 auf einem Display 49 anzeigt. Der Beleuchtungslichtstrahl 11 ist in der Zeichnung als durchgezogene Linie und der Detektionslichtstrahl 29 als gestrichelte Linie dargestellt. Das bei einem konfokalen Scanmikroskop üblicherweise vorgesehene Beleuchtungspinhole 41 und das Detektionspinhole 43 sind der Vollständigkeit halber schematisch eingezeichnet. Weggelassen sind wegen der besseren Anschaulichkeit

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hingegen einige optische Elemente zur Führung und Formung der Lichtstrahlen. Diese sind einem auf diesem Gebiet tätigen Fachmann hinlänglich bekannt. Das akustooptische Bauteil 13, das zum Selektieren der Anteile des Beleuchtungslichtstrahles der ausgewählten Wellenlängen dient, ist als AOTF 15 ausgestaltet, der von einer akustischen Welle durchlaufen ist. Die akustische Welle wird von einem elektrisch angesteuerten Piezo-Schallerzeuger 51 generiert. Die Ansteuerung erfolgt über den PC 45. Der PC 45 steuert auch das Kompensationselement 31 über einen weiteren elektrisch angesteuerten Piezo-Schallerzeuger 53. Die HF-Frequenzen des Piezo-Schallerzeugers 51 sind so gewählt, dass nur die Anteile der gewünschten Wellenlängen des Beleuchtungslichtstrahls 11 zur Strahlablenkeinrichtung 17 gelangen. Die übrigen, von der akustischen Anregung nicht beeinflussten Anteile des Beleuchtungslichtstrahls 11 werden in eine Strahlfalle 55 gelenkt. Durch Variation der Amplitude der akustischen Welle ist die Leistung des Lichtes der gewünschten Wellenlängen des Beleuchtungslichtstrahls 11 auswählbar. Kristallschnitt und Orientierung des akustooptischen Bauteils 13 sind dabei so gewählt, dass bei gleicher Einkoppelrichtung verschiedene Wellenlängen in die gleiche Richtung abgelenkt werden. Das weitere akustooptische Bauteil 33 ist ebenfalls als AOTF ausgeführt. Die HF-Frequenz der weiteren elektromagnetischen Hochfrequenzwelle ist derart gewählt, dass die Anteile des Detektionslichtstrahles 29, die die Wellenlänge des Beleuchtungslichtstrahles 11 aufweisen, ausgeblendet werden. Zum Auswählen der HF-Frequenzen ist der PC 45 vorgesehen. Der PC 45 steuert entsprechend der Benutzervorgabe die Hochfrequenzquelle für die Ansteuerung des Piezo-Schallerzeugers 51 und die weitere Hochfrequenzquelle für die Ansteuerung des Piezo-Schallerzeugers 53. Der Benutzer nimmt Einstellungen mit Hilfe einer nicht gezeigten Computermaus und einer ebenfalls nicht gezeigten Tastatur vor. Die Strahlablenkeinrichtung 17 ist derart mit dem PC 45 gekoppelt, dass, falls der Benutzer es wünscht, die Wellenlänge des Beleuchtungslichtstrahles 11 zeilenweise umschaltbar ist.

Fig. 2 zeigt das Transmissionsspektrum 67 eines idealen Strahlteilers um Beleuchtungslicht einer Wellenlänge zur Probe zu reflektieren und das von der

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Probe ausgehende Detektionslicht zum Spektrometer passieren zu lassen. Auf der Abszisse 61 ist die Wellenlänge in Nanometem aufgetragen; auf der Ordinate 63 die Transmissivität des Strahlteilers in Bruchteilen von 1. Idealer Weise reflektiert der Strahlteiler das Beleuchtungslicht von in diesem Beispiel 480 nm vollständig und transmittiert das durch die Stokesshift zu höheren Wellenlängen verschobene Fluoreszenzlicht, das als Detektionslicht von der Probe ausgeht. Die Kante 65 ist idealer Weise unendlich steil.

Fig. 3 zeigt im Vergleich zu Fig. 2 das Transmissionsspektrum 69 eines akustooptischen Bauteils, das als AOTF bzw. AOBS ausgeführt ist, für Beleuchtungslicht einer Wellenlänge. Hinsichtlich der Kantensteilheit entspricht das Verhalten des akustooptischen Bauteils nahezu dem eines idealen Strahlteilers.

Fig. 4 zeigt das Transmissionsspektrum 71 eines realen Triple-Dichroiten, wie er aus dem Stand der Technik bekannt ist, für Beleuchtungslicht von drei Wellenlängen, von in diesem Beispiel 480nm, 543 nm und 625 nm. Es ist deutlich zu erkennen, dass die Transmissivität nicht nur für die genannten Beleuchtungswellenlängen, sondern für breite Wellenlängenbänder 73, 75, 77 eingeschränkt ist. Im Bereich dieser Wellenlängenbänder 73, 75, 77 wird kein Detektionslicht transmittiert, so dass die gemessenen Spektren des Detektionslichtes in diesen Bereichen Lücken aufweisen. Darüber hinaus ist das Transmissionsverhalten außerhalb der Wellenlängenbänder 73, 75, 77 unregelmäßig, was zu Verfälschungen im gemessenen Wellenlängenspektrum des Detektionslichtes führt.

Fig. 5 zeigt das Transmissionsspektrum 79 eines akustooptischen Bauteils für Beleuchtungslicht von drei Wellenlängen (in diesem Beispiel 480nm, 543 nm und 625 nm) als Vergleich zu dem aus dem Stand der Technik bekannten Transmissionsspektrum 71 eines realen Triple-Dichroiten. Es ist deutlich zu erkennen, dass die Wellenlängenbänder 81, 83 und 85 wesentlich schmaler sind, als die des Triple-Dichroiten. Außerdem ist die Transmissivität außerhalb der Wellenlängenbänder 81, 83 und 85 konstant bei ca. 90 %. Hinsichtlich der Kantensteilheit ist das Verhalten des akustooptischen Bauteils deutlich gegenüber dem eines Triple-Dichroiten verbessert.

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Fig. 6 zeigt das Bildfeld eines erfindungsgemäßen Mikroskops in Bezug auf Proben, die für Untersuchungen, die auf FRET (fluorescence resonance energy transfer) beruhen, markiert sind. Die Probe 87 wird an verschiedenen Punkten 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 der Probe beleuchtet. Die Punkte wurden so ausgewählt, dass sie auf in der Probe befindlichen Zellen 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115 liegen. Zunächst erfolgt die Beleuchtung mit einer Wellenlänge 430 nm, dann nach ca. 10 &mgr;&egr; die Beleuchtung derselben Stellen mit Beleuchtungslicht von 514 nm Wellenlänge, wobei ständig dieselben Punkte 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 im Bild nacheinander beleuchtet werden. Aus der Beobachtung der zeitlich spektralen Veränderung der Spektren lassen sich Rückschlüsse auf die Struktur und die Eigenschaften der Probe ziehen.

Fig. 7 zeigt das Bildfeld eines erfindungsgemäßen Mikroskops in Bezug Proben, die für Untersuchungen, die auf FRET (fluorescence resonance energy transfer) beruhen, markiert sind. Im Bereich 117, 119, 121, werden die Zellen 123, 125, 127 in der zu untersuchenden Probe 129 beinhalten, mit Beleuchtungslicht der Wellenlänge von 488 nm beleuchtet, um das Donator-Spektrum aufzunehmen. Gleichzeitig wird der Bereich außerhalb der Bereiche 117, 119, 121 mit Beleuchtungslicht der Wellenlänge von 543 nm beleuchtet, um das Akzeptor-Spektrum aufzunehmen. Die simultane Aufnahme von Donor-Spektrum, Akzeptor-Spektrum und FRET-Spektrum ermöglicht durch Beobachtung der FRET-Shift Rückschlüsse auf die Struktur und die Eigenschaften der Probe ziehen

Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich

der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.

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Bezugszeichenliste:

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25

1	Laser
2	Mikroskop
3	Laser
4	Lichtquelle
5	Emissionslichtstrahl
7	Emissionslichtstrahl
9	Strahlvereiniger
11	Beleuchtungslichtstrahl
12	Umlenkspiegel
13	akustooptisches Bauteil
15	AOTF
17	Strahlablenkeinrichtung
19	Scanspiegel
21	Scanoptik
23	Tubusoptik
25	Objektiv
27	Probe
29	Detektionslichtstrahl
31	Kompensationselement
33	weiteres akustooptisches Bauteil
35	erster Spiegel
37	zweiter Spiegel
39	Spektrometer

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	41	Beleuchtungspinhole
	43	Detektionspinhole
	45	PC
	47	grafische Darstellung
5	49	Display
	51	Piezo-Schallerzeuger
	53	weiterer Piezo-Schallerzeuger
	55	Strahlfalle
	61	Abszisse
10	63	Ordinate
	65	Kante
	67	Transmissionsspektrum
	69	Transmissionsspektrum
	71	Transmissionsspektrum
15	73	Wellenlängenband
	75	Wellenlängenband
	77	Wellenlängenband
	79	Transmissionsspektrum
	81	Wellenlängenband
20	83	Wellenlängenband
	85	Wellenlängenband
	87	Probe
	89	Punkt
	91	Punkt
25	93	Punkt
	Hf	&phgr;&phgr; &phgr;&phgr;&phgr;&phgr;&phgr;&phgr; &phgr;&phgr; ·
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95	Punkt
97	Punkt
99	Punkt
101	Punkt
5 103	Zelle
105	Zelle
107	Zelle
109	Zelle
111	Zelle
10 113	Zelle
115	Zelle
117	Bereich
119	Bereich
121	Bereich
15 123	Zelle
125	Zelle
127	Zelle
129	Probe

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Claims

1. Mikroskop mit einer Lichtquelle, die Licht zur Beleuchtung einer Probe emittiert, und mit einem Spektrometer, das von der Probe ausgehendes Detektionslicht empfängt, dadurch gekennzeichnet, dass eine optische Anordnung mit einem akustooptisches Bauteil vorgesehen ist, die das Licht der Lichtquelle zur Probe leitet und das von der Probe ausgehende Detektionslicht spektral unaufgespalten dem Spektrometer zuführt.

2. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Anordnung ein Kompensationselement beinhaltet, das eine von dem akustooptischen Bauteil erzeugte spektrale Aufspaltung des von der Probe ausgehenden Lichtes kompensiert.

3. Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Kompensationselement ein weiteres akustooptisches Bauteil ist.

4. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das akustooptische Bauteil ein AOTF (acusto optical tunable filter) oder ein AOD (akustooptischer Deflektor) ist.

5. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Licht der Lichtquelle mit der optischen Anordnung zumindest teilweise aus dem Detektionslicht ausblendbar ist.

6. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das von der Probe ausgehende Detektionslicht Fluoreszenzlicht ist.

7. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht der Lichtquelle mehrere Wellenlängen aufweist.

8. Mikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Licht zur Beleuchtung der Anteil zumindest einer auswählbaren Wellenlänge mit der optischen Anordnung ausblendbar ist.

9. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Lichtleitfaser vorgesehen ist, die Detektionslicht von der optischen Anordnung empfängt und zu dem Spektrometer leitet.

10. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Strahlablenkeinrichtung vorgesehen ist, die das Licht zur Beleuchtung zeilenweise über die Probe führt.

11. Mikroskop nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlänge des Lichtes zur Beleuchtung zeilenweise umschaltbar ist.

12. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop ein Scanmikroskop ist.

13. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop ein konfokales Scanmikroskop ist.

14. Durchflusszytometer mit einer Lichtquelle, die Licht zur Beleuchtung einer Probe emittiert, und einem Spektrometer, das von der Probe ausgehendes Detektionslicht empfängt, dadurch gekennzeichnet, dass eine optische Anordnung mit einem akustooptisches Bauteil vorgesehen ist, die das Licht der Lichtquelle zur Probe leitet und das von der Probe ausgehende Detektionslicht dem Spektrometer zuführt.

15. Durchflusszytometer nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Anordnung ein Kompensationselement beinhaltet, das eine von dem akustooptischen Bauteil erzeugte spektrale Aufspaltung des von der Probe ausgehenden Lichtes kompensiert.

16. Durchflusszytometer nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Kompensationselement ein weiteres akustooptisches Bauteil ist.

17. Durchflusszytometer nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das akustooptische Bauteil ein AOTF (acusto optical tunable filter) oder ein AOD (akustooptischer Deflektor) ist.

18. Durchflusszytometer nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass Licht der Lichtquelle mit der optischen Anordnung zumindest teilweise aus dem Detektionslicht ausblendbar ist.

19. Durchflusszytometer nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das von der Probe ausgehende Detektionslicht Fluoreszenzlicht ist.

20. Durchflusszytometer nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht der Lichtquelle mehrere Wellenlängen aufweist.

21. Durchflusszytometer nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Licht der Lichtquelle der Anteil zumindest einer auswählbaren Wellenlänge mit der optischen Anordnung ausblendbar ist.

22. Durchflusszytometer nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Licht der Lichtquelle der Anteil zumindest einer auswählbaren Wellenlänge mit der optischen Anordnung abschwächbar ist.