DE60131284T2 - Methode zum nachweis von mikroorganismen - Google Patents

Description

• GEBIET DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung betrifft generell ein Verfahren zum Detektieren, Spezifizieren und/oder Identifizieren von Mikroorganismen in einer Probe. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen des Gesamt-Mikrobengehalts in einer Probe durch Detektieren der Anwesenheit von Nukleotidsequenzen bereit, welche mit der gesamten oder einem Teil der 16S-rDNA oder ihrer korrespondierenden 16S-rRNA oder ihrem Homolog, funktionellem Äquivalent oder Derivat assoziiert sind. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen können als Indikator von einem beliebigen Mikroorganismus verwendet werden und stellen daher eine universelle Zielsequenz dar, welche für den Gesamt-Mikrobengehalt in einer Probe indikativ ist. Die universelle Zielsequenz kann ebenso variiert sein, um sie gattungs- oder speziespezifisch zu machen oder um das universelle Ziel zum Fangen von mikrobieller DNA oder RNA zu verwenden, welche danach durch Sequenzanalyse oder genetische Sondentechnologie analysiert werden kann. Die universelle Zielsequenz ist unter anderem geeignet zum Entwerfen von universellen Primern und Sonden zum Amplifizieren einer beliebigen Mikroben-abgeleiteten genomischen Sequenz, als Mittel zum Detektieren und Spezifizieren der Gesamt-Mikroorganismen und um Mikroorganismen in einer Probe auf der Gattungs- oder Speziesebene zu identifizieren. Derartige Verwendungen ermöglichen verbesserte Verfahren des Umweltschutzs, der Biovermittlung, medizinischen Diagnose und industriellen Mikrobiologie. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter die universelle Zielsequenz in isolierter Form und/oder Primer oder Sonden fähig zum Hybridisieren damit und Kits für die Detektion des Gesamt-Mikrobengehalts in einer Probe.
• HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Bibliographische Details der Veröffentlichungen, auf die durch den Autor in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, sind am Ende der Beschreibung zusammengestellt.
• Bezugnahme auf einen beliebigen Stand der Technik in dieser Beschreibung wird nicht und sollte nicht genommen werden als Anerkennung oder beliebige Form der Annahme, dass dieser Stand der Technik Teil der gebräuchlichen allgemeinen Kenntnis in Australien oder einem beliebigen anderen Land bildet.
• Die sich schnell verbessernde DNA-Technologie erleichtert außerordentlich Forschung und Entwicklung in einem Bereich von Disziplinen, welche die medizinische Industrie und die Verbund-Gesundheitsindustrie, den landwirtschaftlichen Sektor und den Gartenbausektor und das Screenen von verwandten genomischen Sequenzen in Umweltproben einschließt. Von besonderer Wichtigkeit ist die Anwendung von molekularen Ansätzen zur Charakterisierung von bakteriellen Gemeinschaften. Derartige Ansätze überwinden die Beschränkungen, welche durch kulturvermittelte Techniken zum Detektieren von Mikroorganismen bewirkt werden. Es ist bekannt, dass die unkultivierbare Fraktion einer mikrobiellen Population einen Hauptbestandteil von allen mikrobiellen Gemeinschaften (1, 2, 3) darstellt.
• Es ist bekannt, dass kulturabhängige Verfahren zum Spezifizieren von bakteriellen Anzahlen beeinflusst werden, da Bakterien nur kultiviert werden können, wenn ihre metabolischen und physiologischen Erfordernisse in vitro reproduziert werden können. Diese Techniken können mehrere Tage in Anspruch nehmen, um ein Ergebnis zu ergeben, und sind deshalb in Situationen ungeeignet, wenn schnelle diagnostische Entscheidungen benötigt werden. Wenn komplexe anspruchsvolle mikrobielle Gemeinschaften untersucht werden wie zum Beispiel die Vielzahl von mikrobiellen Habitaten in der Mundhöhle, kann Spezifizieren von Bakterien durch traditionelle mikrobielle Kulturtechniken ebenso fehlerhafte Ergebnisse liefern.
• Fluoreszenzbasierte Verfahren zum Detektieren von Bakterien können ebenso zum Spezifizieren von Bakterien verwendet werden. Zum Beispiel kann Flusszytometrie zum schnellen und automatisierten Zählen von reinen Kulturen angewendet werden, welche in industriellen Anwendungen wie zum Beispiel der Nahrungs- und Biotechnologieindustrie verwendet werden. Jedoch sind die meisten Bakterien optisch zu ähnlich, um sie einander gegenüber aufzulösen oder gegenüber von Trümmern, wenn Flusszytometrie verwendet wird, ohne die Zielbakterien durch fluoreszierende Markierungstechniken wie zum Beispiel fluoreszierende Antikörper oder fluoreszierende Farbstoffe künstlich zu modifizieren (4). Die fluoreszierende DNA-Färbung Diamidinophenylindol (5) kann zum Beispiel zum Spezifizieren von komplexen bakteriellen Populationen verwendet werden. Unterschiede jedoch in der bakteriellen Zellgröße, Koaggregation von Bakterien und die Anwesenheit von verschiedenen kontaminierenden Matrizen (z. B. Schlamm, Nahrung, Dentalplaque, Dentin) können bewirken, dass eine wichtige Zählung schwierig, wenn nicht problematisch wird, wie auch mit einer Direkt- oder Fluoreszenzmikroskopie (4).
• Eine schnelle Spezifizierung von Bakterien kann ebenso erzielt werden, wenn eine Anzahl von molekularen Ansätzen (1, 2, 3, 6) verwendet wird. Generell werden jedoch viele Primer zum Detektieren der interessierenden Bakterien benötigt. Techniken wie zum Beispiel eine kompetitive PCR (7, 8) sind arbeitsintensiv und benötigen die Analyse von Ergebnissen von vielen Reaktionen für eine jede Testprobe. Es gibt deshalb einen Bedarf, verbesserte molekulare Ansätze zur Mikrobendetektion und -spezifizierung zu entwickeln. Lu et al. (Journal of Clinical Microbiology, 38. 2076–2080, 2000) konstruierten früher universelle Primer zur Detektion von gemeinen bakteriellen Pathogenen in der cerebrospinalen Flüssigkeit. Boivin-Jahns et al. (Applied and Environmental Microbiology 62, 3405–3412, 1996) verwendeten ebenso universelle Primer, um die bakterielle Diversität in einer tiefen Lehmschicht zu untersuchen. Greisen et al. (Journal of Clinical Microbiology, 32, 335–351, 1994) verwendeten PCR-primer und -Sonden, um pathogene Bakterien zu detektieren, welche diejenigen der cerebrospinalen Flüssigkeit einschließen, und Cilia et al. (Mol. Biol. Evol. 13, 451–461, 1996) beschreibt das phylogenetische Signal, welches aus 16S-rRNA-Sequenzen erhalten wurde. Gutiérrez et al (Journal of Applied Microbiology, 83, 518–523, 1997) verwendeten einen quantitativen PCR-ELISA zur Spezifizierung von Bakterien in Milch.
• Echtzeit-PCR wie zum Beispiel das TaqMan-System (Eingetragene Marke) entwickelt von Applied Biosystems basiert auf der Freisetzung und Detektion einer fluorogenen Sonde während einer jeden Runde der DNA-Amplifikation. Es ermöglicht die schnelle Detektion und DNA-Quantifizierung ohne post-PCR-Verarbeitung wie zum Beispiel Gelelektrophorese und radioaktive Hybridisierung (9). Des Weiteren erhöht das eingebaute 96-Lochformat die Probenanzahl außerordentlich, welche simultan analysiert werden können. Corless et al. (Journal of Clinical Microbiology, 38, 1747–1752, 2000) verwendeten dieses System zusammen mit einem Satz von universellen Primern, um die Kontamination und Empfindlichkeit der Echtzeit-PCR zu untersuchen. Das Verfahren verwendet die 5'-Exonukleaseaktivität einer Taq-Polymerase (AmpliTaq Gold, PE Biosystems (Foster City, CA, USA) während der Primerverlängerung zum Spalten einer doppelmarkierten fluorogenen Sonde, welche mit der Ziel-DNA zwischen den PCR-Primern hybridisiert wird. Vor der Spaltung wird ein Reporterfarbstoff wie zum Beispiel 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) am 5'-Ende der Sonde durch 6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) durch einen Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer gequencht. Nach dem Verdau wird FAM freigesetzt. Die resultierende Fluoreszenz wird kontinuierlich in Echtzeit bei 518 nm während der log-Phase der Produktakkumulation gemessen und ist proportional zur Kopienzahl der Zielsequenz.
• Bei der Arbeit, welche zu der vorliegenden Erfindung führte, haben die Erfinder einen Satz von Oligonukleotiden in Form von Primern und Sonden entwickelt, welche eine Detektion und Quantifizierung der gesamtbakteriellen Last innerhalb einer Probe universell erlauben. Die Primer und Sonden werden auf 16S-rDNA oder ihre 16S-rRNA gerichtet und werden praktischerweise mit Echtzeit-PCR oder einer ähnlichen oder verwandten Technologie zum Detektieren und Spezifizieren eines beliebigen Mikroorganismus' verwendet, welcher kein Eucarya oder Archea ist. Die Entwicklung eines universellen Primer-Sondensatzes erlaubt die schnelle und genaue Bestimmung von einer mikrobiellen Last ohne Erfordernis der Entwicklung von spezifischen Primern für bestimmte Mikroorganismen. Jedoch können derartige spezifische Primer zusätzlich zum Identifizieren von Mikroorganismen auf der Gattungs- oder Speziesebene verwendet werden. Die vorliegende Erfindung stellt weiter Nuklein und Extraktionsverfahren bereit, welche unter anderem beim Screenen der Gesamt-Biota auf die Anwesenheit von Mikroorganismen geeignet sind.
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Überall in dieser Beschreibung, wenn es der Zusammenhang nicht anders erfordert, wird unter dem Wort "umfassen" oder Variationen wie zum Beispiel "umfasst" oder "umfassend" verstanden, dass es den Einschluss eines festgestellten Elements oder einer Ganzzahl oder Gruppe von Elementen oder Ganzzahlen impliziert, aber nicht den Ausschluss von einem beliebigen anderen Element oder einer Ganzzahl oder Gruppe von Elementen oder Ganzzahlen.
• Nukleotid- und Aminosäuresequenzen beziehen sich auf eine Sequenz-Identifikationsnummer (SEQ ID NO:). Die SEQ ID NOs: entsprechen numerisch den Sequenzidentifikatoren <400>1, <400>2 etc. Eine Sequenzliste wird nach den Ansprüchen bereitgestellt.
• Die vorliegende Erfindung stellt den Entwurf und Auswertung eines Satzes von universellen Primern und Sonden für die Amplifikation von 16S-rDNA oder 16S-rRNA von Mikroorganismen wie in den Ansprüchen definiert bereit, um die gesamtbakterielle Last unter anderem durch eine Echtzeit-PCR oder ähnliche oder verwandte Technologie zu schätzen. Die universellen Primer und Sonden ermöglichen eine breite Spezifität in Bezug auf den Bereich von Mikroorganismen, welche detektiert werden können, während Eucarya oder Archea nicht detektiert werden. Ein DNA-Standard, welcher diejenigen Bakterien repräsentiert, welche am wahrscheinlichsten in einem gegebenen Habitat überwiegen, ist geeignet zu einer genaueren Bestimmung der gesamtbakteriellen Last. Die universellen Primer und Sonden für ein gesamtes mikrobenabgeleitetes genomisches Material können modifiziert sein, um die Identifizierung und Spezifizierung von mikrobiellen Gattungen oder Spezies zu ermöglichen. Alternativ oder zusätzlich können die universellen Primer/Sonden als eine Falle für eine mikrobielle 16S-rDNA oder 16S-rRNA verwendet werden, welche dann sequenziert werden können oder durch gattungs- oder speziespezifische Sonden oder Primer abgefragt werden können. Ein Nukleinsäure-Extraktionsverfahren wird ebenso in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Die universellen Primer und Sonden haben eine Reihe von Verwendungen in der medizinischen, landwirtschaftlichen und anderen kommerziellen Industrie.
• Folglich beabsichtigt ein erfindungsgemäßer Aspekt ein Verfahren zum Bestimmen des Gesamt-Mikrobengehalt in einer Probe, wobei das Verfahren Amplifizieren einer Ziel-Nukleotidsequenz umfasst, welche im Wesentlichen bei zwei oder mehr Mikroorganismenspezies konserviert ist, wobei die Amplifikation für eine Zeitdauer und unter Bedingungen hinreichend ist, um einen Gehalt eines Amplifikationsprodukts zu erzeugen, welcher zum Mikroorganismengehalt in der Probe proportional ist.
• Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt ein Verfahren zum Bestimmen des Gesamt-Mikrobengehalt in einer Probe bereit, wobei das Verfahren Amplifizieren einer Ziel-Nukleotidsequenz umfassend oder assoziiert mit 16S-rDNA oder 16S-rRNA oder einem Homolog oder Derivat oder funktionellem Äquivalent davon umfasst, wobei die Amplifikation für eine Zeitdauer und unter Bedingungen hinreichend ist, um einen Gehalt eines Amplifikationsprodukts zu erzeugen, welcher zum Mikroorganismengehalt in der Probe proportional ist.
• Noch ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt ist auf ein Verfahren zum Bestimmen des Gesamt-Mikrobengehalt in einer Probe gerichtet, wobei das Verfahren, welches Unterziehen einer Nukleotidsequenz, welche 16S-rDNA oder 16S-rRNA definiert oder damit assoziiert ist, einer Echtzeit-PCR oder äquivalenten Technologie für eine Zeitdauer und unter Bedingungen umfasst, um einen Gehalt eines Amplifikationsprodukts zu erzeugen, welcher zum Mikroorganismengehalt in der Probe proportional ist.
• Noch ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt einen Komplex bereit umfassend Vorwärts- und Rückwärtsprimer, welche mit komplementären Strängen einer Zielsequenz hybridisiert sind, umfassend die gesamte oder einen Teil einer 16S-rDNA oder 16S-rRNA oder ein Homolog oder Derivat oder funktionelles Äquivalent davon und eine Oligonukleotidsonde, welche an ihrem 5'-Ende durch ein fluorogenes Reportermolekül und an ihrem 3'-Ende durch ein Molekül markiert ist, welches zum Quenchen des fluorogenen Moleküls fähig ist, wobei die Oligonukleotidsonde mit einem Anteil der 16S-rDNA oder 16S-rRNA hybridisiert, welcher zwischen den Vorwärts- und Rückwärtsprimern verschachtelt ist.
• Noch ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt beabsichtigt ein Verfahren zum Bestimmen des Gesamt-Mikrobengehalts in einer Probe, wobei das Verfahren Unterziehen einer DNA in der Probe einer Echtzeit-PCR umfasst, welche einen Primer-Sondensatz verwendet, welcher Primer umfasst, welche ausgewählt sind, um DNA zu amplifizieren umfassend oder assoziiert mit 16S-rDNA oder 16S-rRNA oder einem Homolog oder Derivat oder funktionellem Äquivalent davon, und eine Sonde, welche mit einer Nukleotidsequenz verschachtelt zwischen den Primern hybridisiert, wobei die Sonde an ihrem 5'-Ende durch ein fluorogenes Reportermolekül und an ihrem 3'-Ende durch ein Molekül fähig zum Quenchen des fluorogenen Moleküls markiert ist, wobei die Amplifikation für eine Zeitdauer und unter Bedingungen stattfindet, um einen Gehalt eines Amplifikationsprodukts zu erzeugen, welcher zum Mikroorganismengehalt in der Probe proportional ist.
• Noch ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt ein Verfahren zum Identifizieren eines bestimmten Mikroorganismus' oder der Prävalenz einer bestimmten Mikroorganismengattung oder -spezies in einer Probe bereit, wobei das Verfahren Gewinnen einer DNA oder RNA in der Probe durch einen Primer (durch Primer) mit einer Nukleotidsequenz umfasst, welche komplementär zu einer Nukleotidsequenz innerhalb einer 16S-rDNA oder 16S-rRNA ist, und dann Unterziehen der gewonnenen DNA oder RNA einer Nukleotidsequenzierung und/oder Abfrage durch eine gattungs- oder speziespezifische Sonde und dann Bestimmen des Mikroorganismus' durch die bestimmte Sequenz oder Muster von Sondenabfragen.
• Noch ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt ist auf ein Kit in einer kompartimentierten Form gerichtet, wobei das Kit ein Kompartiment umfasst, welches eingerichtet ist, dass es ein oder mehrere Primer enthält, welche fähig zur Teilnahme an einer Amplifikationsreaktion von DNA umfassend oder assoziiert mit 16S-rDNA oder 16S-rRNA sind, ein anderes Kompartiment, welches eine Sonde umfasst, welche an ihrem 5'-Ende durch ein fluorogenes Reportermolekül und an ihrem 3'-Ende durch ein Molekül fähig zum Quenchen des fluorogenen Moleküls markiert ist, und gegebenenfalls ein anderes Kompartiment, welches eingerichtet ist, Reagenzien zum Durchführen einer Amplifikationsreaktion zu enthalten, und gegebenenfalls ein Kompartiment, welches für eine Nukleinsäureextraktion von Zellen eingerichtet ist.
• Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt beabsichtigt ein Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäurematerial aus einer Probe, welche mikrobielle Zellen umfasst, wobei das Verfahren Unterziehen einer konzentrierten Probe der Zellen einem enzymatischen Abbau und Lysieren der Zellen in Anwesenheit von SDS und dann Reinigen des Nukleinsäurematerials umfasst.
• Ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt stellt weiterhin ein Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäurematerial aus einer Probe bereit, welche mikrobielle Zellen umfasst, wobei das Verfahren Unterziehen einer konzentrierten Probe der Zellen einer druckvermittelten Zerreißung, einem enzymatischen Abbau und dann Lysieren der Zellen in Anwesenheit von SDS und dann Reinigen des Nukleinsäurematerials umfasst.
• Noch ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt beabsichtigt ein Verfahren zum Bestimmen der Mikroorganismen in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst:
  gegebenenfalls Unterziehen einer konzentrierten Probe der Zellen einer druckvermittelten Zerreißung gefolgt von einem enzymatischen Abbau und dann Lysieren der Zellen in Anwesenheit von SDS und dann Reinigen des Nukleinsäurematerials,
  Amplifizieren des Nukleinsäurematerials in Anwesenheit von Vorwärts- und Rückwärtsprimern fähig zum Hybridisieren mit einer konservierten Nukleotidsequenz innerhalb einer 16S-rDNA oder 16S-rRNA,
  gegebenenfalls Detektieren der Anwesenheit von amplifiziertem Produkt in Anwesenheit einer Sonde markiert mit einem Reportermolekül und Bestimmen des Gesamt-Mikrobengehalts, und
  gegebenenfalls Isolieren des amplifizierten Produkts und entweder Sequenzieren des isolierten Produkts oder Unterziehen des amplifizierten Produkts einer genetischen Abfrage zum Identifizieren der vorliegenden Mikroorganismengattung oder -spezies.
• KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
• 1 ist eine Darstellung, welche Konservierung von Sequenzen zeigt, welche im universellen Primer-Sondensatz von den 16S rDNAs von Bakterien verwendet werden, wobei die meisten Gruppen von Procarya repräsentiert sind, welche in Bergey's Manual of Determinative Bakteriology [Bergeys Handbuch der bestimmenden Bakteriologie] (12) definiert sind. (A) Abgleich von rDNAs, welche Konservierung von einem 19-bp-Vorwärtsprimer (dargestellt in fett) zeigen. (B) Abgleich von rDNAs, welche Konservierung von einer 23-bp-Sondensequenz (dargestellt in fett) zeigen. (C) Abgleich von rDNAs, welche Konservierung von einem 26-bp-Rückwärtsprimer (dargestellt in fett) zeigen.
• 2 ist eine graphische Darstellung, welche die Standardkurve zeigt, wobei E.-coli-DNA verwendet wurde.
• 3 ist eine graphische Darstellung, welche die Empfindlichkeit der universellen Sonde und Primern beim Detektieren von E.-coli-DNA zeigt, wobei Echtzeit-PCR verwendet wurde. Gereinigte E.-coli-DNA wurde als das Template in Mengen von 2380 pg, 238 pg, 23,8 pg, 2,38 pg, 238 fg, 23,8 fg verwendet, was C_T-Werte (threshold cylce = Schwellenzykluswerte) im Bereich von 16,9 bis 36,3 repräsentiert, wobei der Abschnitt der Größe des fluoreszierenden Signals (ΔR_n) mit der horizontalen Schwellenlinie in fett den C_T-Wert für eine gegebene Probe repräsentiert. Das fluoreszierende Signal bei C_T 37,7 entspricht der Kontrolle ohne Template und repräsentiert eine bakterielle DNA-Kontamination in den kommerziell bereitgestellten Reagenzien.
• 4 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirkung von Beschallung von bakteriellen Zellen auf die Isolierung von DNA zeigt.
• 5A ist eine photographische Darstellung, welche die Anwesenheit von Nukleasen in P. gingivalis zeigt. (1) Gefrorene/getaute Probe, (2) Gefrorene/getaute-gekochte Probe, (3) Gefrorene/getaute Probe, welche mit Mutanolysin behandelt wurde, (4) Gefrorene/getaute-gekochte Probe, welche mit Mutanolysin behandelt wurde, (5) Probe, welche für 3 min beschallt wurde, (6) Probe, welche für 6 min beschallt wurde, (7) Probe, welche für 3 min beschallt und mit Mutanolysin behandelt wurde, und (8) Probe, welche für 6 min beschallt und mit Mutanolysin behandelt wurde.
• 5B ist eine photographische Darstellung, welche Abbau von DNA durch eine gefrorene/getaute Probe von P. gingivalis zeigt. (1) Fusobacterium-nucleatum-DNA, (2) Lactobacillus-acidophilus-DNA, (3) Porphyromonas-gingivalis-DNA, (4) Prevotellamelaninogenica-DNA, (5) Streptococcus-mutans-DNA, (6) Peptostreptococcus-micros-DNA, (7) Porphyromonas-endodontalis-DNA und (8) Escherichia-coli-DNA.
• 6A ist eine graphische Darstellung, welche die kritische Rolle von Nukleasen und die Wirkung von ZnCl₂ auf die Quantifizierung von P. gingivalis und P. gingivalis + S. mutans zeigt.
• 6B ist eine graphische Darstellung, welche die kritische Rolle von Nukleasen und die Wirkung von ZnCl₂ auf die Quantifizierung von P gingivalis und P. gingivalis + E. coli zeigt.
• 7 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirkung des Entfernens von ZnCl₂ und Natriumdodecylsulfat (SDS) auf der DNA-Quantifizierung zeigt, wobei unverdünnte Proben verwendet wurden.
• 8 ist eine graphische Darstellung, welche die interne positive Kontrolle zeigt, wobei ein B.-tryoni-dsX-Geninsert im pGEM-T-Easy-Vektorsystem verwendet wurde (pGEM ist eine eingetragene Marke).
• 9A ist eine photographische Darstellung, welche Isolierung von DNA zeigt, wobei ATL-Puffer und ein Zweischritt-DEPC-Verfahren verwendet wurde: Bakterien, welche als Streptokokkenen identifiziert wurden. (1) S. mitis, wobei ATL-Puffer verwendet wurde, (2) S. intermedius, wobei ATL-Puffer verwendet wurde, (3) S. intermedius, wobei ATL-Puffer verwendet wurde, (4) S. costellatus, wobei ATL-Puffer verwendet wurde, (5) S. mitis, wobei ein Zweischritt–DEPC-Verfahren verwendet wurde, (6) S. intermedius, wobei ein Zweischritt–DEPC-Verfahren verwendet wurde, (7) S. intermedius, wobei ein Zweischritt–DEPC-Verfahren verwendet wurde, und (8) S. costellatus, wobei ein Zweischritt–DEPC-Verfahren verwendet wurde.
• 9B ist eine photographische Darstellung, welche Isolierung von DNA zeigt, wobei ATL-Puffer und Zweischritt-DEPC Verfahren verwendet wurden: Bakterien, welche als Actinomyces identifiziert wurden. (1) A. viscosus durch ATL-Verfahren, (2) A. viscosus durch Zweischritt-DEPC-Verfahren, (3) A. georgiae durch ATL-Verfahren, und (4) A. georgiae durch Zweischritt-DEPC-Verfahren.
• DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
• Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Identifizierung einer Nukleotidsequenz assoziiert mit oder umfassend die 16S-rDNA oder 16S-rRNA oder sein Homolog, funktionelles Äquivalent oder Derivat, welches unter allen prokaryotischen Mikroorganismen konserviert ist. Die Identifizierung dieser konservierten Nukleotidsequenzen ermöglicht die Detektion und Quantifizierung des Gesamt-Mikrobengehalts in einer Probe. Der Begriff "funktionelles Äquivalent" in diesem Zusammenhang schließt andere konservierte Sequenzen ein, welche ebenso zum Bestimmen des Gesamt-Mikrobengehalt verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung stellt Primer und Sonden bereit, welche auf diesen konservierten Sequenzen basieren, welche "universell" in dem Sinn sind, dass sie zum Hybridisieren und/oder Amplifizieren von mikrobiellen Nukleinsäuremolekülen ohne eine wesentliche Kreuzreaktion mit DNA von Eucarya oder Archea fähig sind. Die universellen Primer oder Sonden können ebenso modifziert sein, um sie gattungs- oder speziespezifisch zu machen oder in Verbindung mit anderen gattungs- oder speziespezifischen Primern oder Sonden zu verwenden, wie zum Beispiel zum Abfragen von amplifiziertem Nukleinsäurematerial. Die universellen Primer und Sonden können ebenso als eine "Falle" für ein prokaryotisches Nukleinsäurematerial verwendet werden, welches unter anderem sequenziert werden kann, um beim Identifizieren eines bestimmten Mikroorganismus' oder der Bestimmung der Prävalenz eines bestimmten Mikroorganismus' auf der Gattungs- oder Speziesebene zu helfen.
• Folglich beabsichtigt ein erfindungsgemäßer Aspekt ein Verfahren zum Bestimmen des Gesamt-Mikrobengehalt in einer Probe, wobei das Verfahren Amplifizieren einer Ziel-Nukleotidsequenz umfasst, welche im Wesentlichen bei zwei oder mehr Mikroorganismenspezies konserviert ist, wobei die Amplifikation für eine Zeitdauer und unter Bedingungen hinreichend ist, um einen Gehalt eines Amplifikationsprodukts zu erzeugen, welcher zum Mikroorganismengehalt in der Probe proportional ist.
• Bezug auf "Bestimmen" des Mikrobengehalts schließt Schätzen, Quantifizieren, Rechnen oder anderweitige Ableitung eines Mikrobengehalts ein. Auf den Mikrobengehalt wird generell als der Gesamt-Mikrobengehalt bezuggenommen und schließt Mikroorganismen ein, welche kultiviert werden können, als auch Mikroorganismen, welche nicht kultiviert werden können. Der Gesamt-Mikrobengehalt wird praktischerweise ausgedrückt als Anzahl von mikrobiellen Zellen bezogen auf ein bestimmtes Volumen, Nass- oder Trockengewicht von mikrobiellen Zellen bezogen auf ein bestimmtes Volumen oder als anderer geeigneter Indikator der Gesamtzellzahl in einer Probe. Praktischerweise wird die Zellzahl ausgedrückt pro Milliliter, pro Mikroliter oder pro 25 oder 50 Mikroliter. Die Mikroorganismenzahl kann ebenso indirekt bestimmt werden wie zum Beispiel durch Korrespondenz zu einer bestimmten DNA-Menge. Zum Beispiel entsprechen 0,496 Picogramm von E.-coli-DNA annähernd 100 E.-coli-Zellen in der Probe. Der Begriff "Bestimmen" kann ebenso die Identifizierung eines bestimmten Mikroorganismus' oder Ermitteln der Prävalenz eines bestimmten Mikroorganismus' auf der Gattungs- oder Speziesebene sein. Dies kann zum Beispiel durch eine Nukleotidsequenz und/oder Nukleinsäureabfrage durch Spezies- oder gattungsspezifische Sonden durchgeführt werden.
• Der Begriff "Mikroorganismus" wird in seinem weitesten Sinn verwendet und schließt gramnegative aerobe Bakterien, grampositive aerobe Bakterien, gramnegative mikroaerophile Bakterien, grampositive mikroaerophile Bakterien, gramnegative fakultative anaerobe Bakterien, grampositive fakultative anaerobe Bakterien, gramnegative anaerobe Bakterien, grampositive anaerobe Bakterien, grampositive asporogene Bakterien und Actinomycetes ein. Praktischerweise schließt der Bezug hierin auf einen Mikroorganismus ein Mitglied der Gruppe von Procarya wie gelistet in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology [Bergeys Handbuch der bestimmenden Bakteriologie] (12) ein. Der Begriff "Mikroorganismus" oder "mikrobiell" betrifft generell ein Bakterium oder bakteriell und welches nicht ein Mitglied von Eucarya oder Archea ist.
• Obwohl die vorliegende Erfindung insbesondere auf diejenigen Mikroorganismen gerichtet ist, welche in Tabelle 3 gelistet sind, erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf eine beliebige mikrobiellen Zelle, welche die konservierte Ziel-Nukleotidsequenz trägt.
• Der Begriff "Probe" wird in seinem weitesten Sinn verwendet, so dass er biologische, medizinische, landwirtschaftliche, industrielle und Umweltproben einschließt. Zum Beispiel können Proben aus Kulturflüssigkeit, Biopsie-Flüssigkeit oder Gewebe von menschlichen, tierischen oder Insektenquellen, Proben aus natürlichen Umwelten wie zum Beispiel Boden, einem Fluss, heissen Mineralquellen, einer Pflanze, antarktischen Proben, Luftproben oder extraterrestrischen Proben als auch Proben von industriellen Stätten wie zum Beispiel Abfallplätzen und Bereichen mit Kontamination mit vergossenem Öl oder aromatischen oder komplexen Molekülen und Pestizidkontamination stammen. Die Probe kann ebenso Nahrung, Nahrungsbestandteile, Nahrungsderivate und/oder Nahrungsinhaltsstoffe umfassen einschließend Nahrungsprodukte, welche in der Molkereiindustrie hergestellt werden, wie zum Beispiel Milch. Die Probe kann flüssig, fest, eine Aufschlämmung, Luft, Dampf, Tröpfchen oder Aerosol oder eine Kombination von beliebigen der obigen sein.
• Die Ziel-Nukleotidsequenz ist generell eine Ziel-DNA- oder -RNA-Sequenz. Wenn das Ziel eine RNA-Sequenz ist, dann kann diese Sequenz Gegenstand einer reversen Transkription sein, um eine komplementäre DNA-Sequenz (cDNA) zu erzeugen. Praktischerweise ist die Ziel-Nukleotidsequenz DNA und ist unter zwei oder mehr Mikroorganismenspezies konserviert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Zielsequenz ribosomale DNA (rDNA) wie zum Beispiel eine 16S-rDNA, ist aber nicht darauf beschränkt, oder ist ribosomale RNA (rRNA) wie zum Beispiel 16S-rRNA, ist aber nicht darauf beschränkt. In bezug auf die letzteren sind geeignete mikrobielle Zellen beliebige Zellen, welche eine konservierte Sequenz umfassen umfassend oder assoziiert mit 16S-rDNA oder 16S-rRNA. Ein Bezug hierein auf "16S-rDNA" oder "16S-rRNA" schließt einen Bezug auf beliebige Homologe oder Derivate davon als auch funktionelle Äquivalente davon ein. Ein "Homolog" von 16S-rDNA schließt RNA-Formen ein wie zum Beispiel 16S-rRNA oder umgekehrt.
• Folglich stellt ein bevorzugter erfindungsgemäßer Aspekt ein Verfahren zum Bestimmen des Gesamt-Mikrobengehalt in einer Probe bereit, wobei das Verfahren Amplifizieren einer Ziel-Nukleotidsequenz umfassend oder assoziiert mit 16S-rDNA oder 16S-rRNA oder einem Homolog oder Derivat oder funktionellem Äquivalent davon umfasst, wobei die Amplifikation für eine Zeitdauer und unter Bedingungen hinreichend ist, um einen Gehalt eines Amplifikationsprodukts zu erzeugen, welcher zum Mikroorganismengehalt in der Probe proportional ist.
• Obwohl die vorliegende Erfindung direkt auf einem einzelsträngigen Template von einem nichtamplifizierten Nukleinsäuremolekül ausgeführt werden kann, stammt in einer bevorzugten Ausführungsform das Template-Nukleinsäuremolekül von einem Nukleinsäuremolekül, welches einer Amplifikation unterzogen wurde. Eine beliebige Amplifikationsreaktion einschließend PCR, "rolling-circle"-Amplifikation und Qβ-Replikase-basierte Amplifikation kann neben anderen Verfahren verwendet werden.
• Die bevorzugten Amplifikationsbedingungen sind diejenigen, welche zu einer Echtzeit-PCR in Echtzeit führen. Das Amplifikationsprodukt wird dann auf eine bestimmte Menge eingestellt, worauf hierin als die Schwellenkonzentration (C_T) bezuggenommen wird. Die C_T ist zur Gesamt-Zielsequenz (z. B. 16S-rDNA) proportional und daher zu einem gesamtbakteriellen Gehalt proportional. Generell wird eine Standardkurve basiert auf dem C_T und bekannten DNA-Mengen in pg durch Bestimmen des Gehalts von Amplifikationsprodukt unter Bedingungen hergestellt, welche ein C_T ergeben, dies bestimmt dann die Menge einer mikrobiellen Zielsequenz und folglich mikrobielle Gehalte. Die Verwendung von Echtzeit-PCR wird bevorzugt, aber die vorliegende Erfindung erlaubt die Verwendung von einer verwandten Technologie.
• Folglich ist ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt auf ein Verfahren zum Bestimmen des Gesamt-Mikrobengehalt in einer Probe gerichtet, wobei das Verfahren, welches Unterziehen einer Nukleotidsequenz, welche 16S-rDNA oder 16S-rRNA oder ein Homolog oder Derivat oder funktionelles Äquivalent davon definiert oder damit assoziiert ist, einer Echtzeit-PCR für eine Zeitdauer und unter Bedingungen umfasst, um einen Gehalt eines Amplifikationsprodukts zu erzeugen, welcher zum Mikroorganismengehalt in der Probe proportional ist.
• Vorzugsweise wird der Gehalt an Amplifikationsprodukt durch C_T definiert.
• Die Zeit und Bedingungen für die Amplifikation wie zum Beispiel Echtzeit-PCR ist derartig, dass in einer bevorzugten Ausführungsform C_T aufgezeichnet wird. Diese Bedingungen sind dieselben wie für die Herstellung einer Standardkurve.
• In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Amplifikation mit einem Primersatz (vorwärts und rückwärts) und einem Sondenoligonukleotid markiert mit einem fluorogenen Reportermolekül an seinem 5'-Ende und einem Quenchmolekül an seinem 3'-Ende durchgeführt. Das Quenchmolekül verhindert eine Emission von einem Signal vom fluorogenen Reportermolekül. Das Sondenoligonukleotid hybridisiert mit einer Region der Zielsequenz zwischen den Regionen, an welche die Vorwärts- und Rückwärtsprimer hybridisieren. Da die Polymerase sich entlang des Strangs bewegt, an welchem das Sondenoligonukleotid hybridisiert hat, wird das 5'-Ende der Sonde durch die Exonukleaseaktivität der Polymerase abgespalten, was daher eine Emission des fluorogenen Signals aufgrund der Trennung der Quenchergruppe erlaubt.
• In einer anderen Ausführungsform stellt deshalb die vorliegende Erfindung einen Komplex bereit umfassend Vorwärts- und Rückwärtsprimer, welche mit komplementären Strängen einer Zielsequenz hybridisiert sind, umfassend die gesamte oder einen Teil einer 16S-rDNA oder 16S-rRNA oder ein Homolog oder Derivat oder funktionelles Äquivalent davon und eine Oligonukleotidsonde, welche an ihrem 5'-Ende durch ein fluorogenes Reportermolekül und an ihrem 3'-Ende durch ein Molekül markiert ist, welches zum Quenchen des fluorogenen Moleküls fähig ist, wobei die Oligonukleotidsonde mit einem Anteil der 16S-rDNA oder 16S-rRNA hybridisiert, welcher zwischen den Vorwärts- und Rückwärtsprimern verschachtelt ist.
• Die bevorzugten erfindungsgemäßen Primer und Sonden zeigen wenigstens eine der folgenden Eigenschaften:
• (i) umfassen eine Schmelztemperatur (T_m) von DNA zwischen etwa 58°C und etwa 60°C für Primer und etwa 68°C und 70°C für die Sonde,
• (ii) umfassen einen GC-Gehalt von zwischen etwa 30 und 80%,
• (iii) umfassen nicht mehr als drei aufeinanderfolgende Gs im Primer oder der Sonde,
• (iv) umfassen nicht mehr als 2 GCs in den letzten 5 Nukleotiden am 3'-Ende des Primers,
• (v) umfassen kein G am 5'-Ende der Sonde,
• (vi) die Selektion der Sonde sollte vom Strang mit mehr Cs als Gs erfolgen, und
• (vii) die Amplikonlänge sollte zwischen etwa 50 und etwa 150 bp liegen.
• In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist der Primer-Sondensatz wie folgt:
  Universeller Vorwärtsprimer: TCCTACGGGAGGCAGCAGT (SEQ ID NO: 1)
  Universeller Rückwärtsprimer: GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT (SEQ ID NO: 2)
  Universelle Sonde: CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC (SEQ ID NO: 3).
• Folglich beabsichtigt ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt ein Verfahren zum Bestimmen des Gesamt-Mikrobengehalts in einer Probe, wobei das Verfahren Unterziehen einer DNA in der Probe einer Echtzeit-PCR umfasst, welche einen Primer-Sondensatz verwendet, welcher Primer umfasst, welche ausgewählt sind, um DNA zu amplifizieren umfassend oder assoziiert mit 16S-rDNA oder 16S-rRNA oder einem Homolog oder Derivat oder funktionellem Äquivalent davon, und eine Sonde, welche mit einer Nukleotidsequenz verschachtelt zwischen den Primers hybridisiert, wobei die Sonde an ihrem 5'-Ende durch ein fluorogenes Reportermolekül und an ihrem 3'-Ende durch ein Molekül fähig zu Quenchen des fluorogenen Moleküls markiert ist, wobei die Amplifikation für eine Zeitdauer und unter Bedingungen stattfindet, um einen Gehalt eines Amplifikationsprodukts zu erzeugen, welcher zum Mikroorganismengehalt in der Probe proportional ist.
• Vorzugsweise werden die Vorwärts- und Rückwärtsprimer und die Sonde durch diejenigen von SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 3 definiert, oder die Vorwärts- und Rückwärtsprimer und die Sonde, welche mit einer komplementären Form von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 3 unter niedrigen Stringenzbedingungen hybridisieren, und/oder welche wenigstens etwa 70% Ähnlichkeit mit SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 oder ihren komplementären Formen zeigen. Die Sonde ist praktischerweise an ihrem 5'-Ende mit einem Reportermolekül wie zum Beispiel einem fluoreszierenden Farbstoff, zum Beispiel 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) markiert, ist aber nicht darauf beschränkt. Das 3'-Ende ist praktischerweise mit einem Quenchmolekül markiert wie zum Beispiel 6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA), ist aber nicht darauf beschränkt.
• Der Begriff "Ähnlichkeit" wie hierin verwendet schließt eine exakte Identität zwischen verglichenen Sequenzen auf der Nukleotidebene ein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Nukleotidsequenz-Vergleiche auf der Ebene der Identität gemacht, statt auf der Ebene der Ähnlichkeit.
• Begriffe, welche zum Beschreiben von Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehr Polynukleotiden verwendet werden, schließen "Referenzsequenz", "Vergleichsfenster", "Sequenzähnlichkeit", "Sequenzidentität", "Prozentwert der Sequenzähnlichkeit", "Prozentwert der Sequenzidentität", "im Wesentlichen ähnlich" und "wesentliche Identität" ein. Eine "Referenzsequenz" ist wenigstens 12, aber häufig 15 bis 18 Monomereinheiten lang. Weil zwei Polynukleotide jeweils umfassen können (1) eine Sequenz (d. h. nur einen Anteil der vollständigen Polynukleotidsequenz), welche zwischen den zwei Polynukleotiden ähnlich ist, und (2) eine Sequenz, welche zwischen den zwei Polynukleotiden divergent ist, werden Sequenzvergleiche zwischen zwei (oder mehr) Polynukleotiden typischerweise durch Vergleichen von Sequenzen der zwei Polynukleotide über einem "Vergleichsfenster" durchgeführt, um lokale Regionen einer Sequenzähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen. Ein "Vergleichsfenster" bezieht sich auf ein konzeptuelles Segment von typischerweise 12 benachbarten Nukleotiden, welche mit einer Referenzsequenz verglichen werden. Das Vergleichsfenster kann Hinzufügungen oder Deletionen (d. h. Lücken) von etwa 20% oder weniger verglichen mit der Referenzsequenz (welche keine Hinzufügungen oder Deletionen umfasst) für einen optimalen Abgleich der zwei Sequenzen umfassen. Ein optimaler Abgleich von Sequenzen zum Abgleichen eines Vergleichsfensters kann durch computerisierte Implementierungen von Algorithmen durchgeführt werden (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Softwarepack Ausgabe 7.0, Genetische Computergruppe, 575 Science Drive Madison, WI, USA) oder durch Inspektion und den besten Abgleich (d. h. was zur höchsten prozentualen Homologie über dem Vergleichsfenster führt), welcher durch ein beliebiges der verschiedenen ausgewählten Verfahren erzeugt wird. Bezug kann ebenso auf die BLAST-Familie von Programmen wie zum Beispiel offenbart von Altschul et al. (18) genommen werden. Eine detaillierte Diskussion der Sequenzanalyse kann in Kapitel 19.3 von Ausubel et al. (19) gefunden werden.
• Die Begriffe "Sequenzähnlichkeit" und "Sequenzidentität" wie hierin verwendet beziehen sich darauf, dass Sequenzen identisch sind oder auf einer Nukleotid-zu-Nukleotid-Basis über einem Vergleichsfenster funktionell oder strukturell ähnlich sind. Daher wird ein "Prozentwert von Sequenzidentität" zum Beispiel durch Vergleichen von zwei optimal abgeglichenen Sequenzen über dem Vergleichsfenster berechnet, wobei die Anzahl von Positionen bestimmt wird, bei welchen die identische Nukleinsäurebase (z. B. A, T, C, G, I) in beiden Sequenzen auftritt, um die Anzahl von passenden Positionen zu ergeben, die Anzahl von passenden Positionen durch die Gesamtzahl von Positionen im Vergleichsfenster (d. h. der Fenstergröße) geteilt wird und das Ergebnis mit 100 multipliziert wird, um den Prozentwert der Sequenzidentität zu ergeben. Für die erfindungsgemäßen Zwecke wird unter "Sequenzidentität" der "Trefferprozentwert" verstanden, welcher zum Beispiel durch GAP im Wisconsin Genetics Softwarepack oder anderen Programmen wie zum Beispiel dem DNASIS-Computerprogramm (Version 2.5 für Windows, verfügbar von Hitachi Software Engineering Co. Ltd., South San Francisco, Kalifornien, USA) berechnet wird, wobei Standardvoreinstellungen wie im Referenzhandbuch verwendet werden, welches der Software beigefügt war. Ähnliche Kommentare passen in Bezug auf die Sequenzähnlichkeit.
• Ein Bezug hierin auf eine niedrigen Stringenz schließt ein und umfasst von wenigstens etwa 0 bis wenigstens etwa 15% v/v Formamid und von wenigstens etwa 1 M bis wenigstens etwa 2 M Salz zur Hybridisierung und wenigstens etwa 1 M bis wenigstens etwa 2 M Salz für die Waschbedingungen. Generell ist niedrige Stringenz wenigstens von etwa 25–30°C bis etwa 42°C. Die Temperatur kann verändert werden, und höhere Temperaturen können verwendet werden, um Formamid zu ersetzen und/oder alternative Stringenzbedingungen zu ergeben. Alternative Stringenzbedingungen können wenn notwendig angewendet werden, wie zum Beispiel eine mittlere Stringenz, welche von wenigstens etwa 16% v/v bis wenigstens etwa 30% v/v Formamid und von wenigstens etwa 0,5 M bis wenigstens etwa 0,9 M Salz zur Hybridisierung und wenigstens etwa 0,5 M bis wenigstens etwa 0,9 M Salz für die Waschbedingungen einschließt und umfasst, oder hohe Stringenz, welche von wenigstens etwa 31% v/v bis wenigstens etwa 50% v/v Formamid und von wenigstens etwa 0,01 M bis wenigstens etwa 0,15 M Salz zur Hybridisierung und wenigstens etwa 0,01 M bis wenigstens etwa 0,15 M Salz für die Waschbedingungen einschließt und umfasst. Im Allgemeinen wird Waschen ausgeführt bei T_m = 69,3 + 0,41(G + C)% (20). Jedoch wird die T_m einer Duplex-DNA mit jeder Erhöhung der Anzahl von nicht zusammenpassenden Basenpaaren von 1% um 1°C vermindert (21). Formamid ist in diesen Hybridisierungsbedingungen optional. Folglich werden besonders bevorzugte Stringenzgrade wie folgt definiert: niedrige Stringenz ist 6 × (SSC) Puffer, 0,1% w/v Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 25–42°C, eine moderate Stringenz ist 2 × SSC-Puffer, 0,1% w/v SDS bei einer Temperatur im Bereich 20°C bis 65°C, hohe Stringenz ist 0,1 × SSC-Puffer, 0,1% w/v SDS bei einer Temperatur mit einer wenigstens 65°C.
• Die Primer und Sonden können modifiziert sein, damit diese gattungs- oder speziespezifisch sind. Alternativ oder zusätzlich können weitere Primer oder Sonden verwendet werden, um eine Mikroorganismengattung oder -spezies zum Beispiel durch Primer/Sondenabfrage spezifisch zu definieren. In bezug auf das Vorstehende kann der universelle Primer/Sondensatz als eine Falle für 16S-rDNA/rRNA oder ihre Homologe, Äquivalente oder Derivate verwendet werden, welche dann einer Identifizierung der Gattung oder Spezies des Mikroorganismus' oder des vorwiegenden Mikroorganismus' unterzogen werden. Eine gewisse teilweise Vorselektion kann ebenso durchgeführt werden, um die Probe zum Beispiel zu bestimmten Typen von Mikroorganismen wie zum Beispiel Aerobier, Anaerobier oder Mikroben mit bestimmten Nährstoff-Erfordernissen oder Merkmalen oder Antibiotikum-resistenten Mikroben zu verschieben.
• Folglich beabsichtigt ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt ein Verfahren zum Identifizieren eines bestimmten Mikroorganismus' oder der Prävalenz einer bestimmten Mikroorganismengattung oder -spezies in einer Probe, wobei das Verfahren Gewinnen einer DNA oder RNA in der Probe durch einen Primer mit einer Nukleotidsequenz umfasst, welche komplementär zu einer Nukleotidsequenz innerhalb einer 16S-rDNA oder 16S-rRNA ist, und dann Unterziehen der gewonnenen DNA oder RNA einer Nukleotidsequenzierung und/oder Abfrage durch eine gattungs- oder speziespezifische Sonde und dann Bestimmen des Mikroorganismus' durch die bestimmte Sequenz oder Muster von Sondenabfragen.
• In einer verwandten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Identifizieren eines Mikroorganismus' durch seine Gattung in einer Probe bereitgestellt, wobei das Verfahren Unterziehen einer DNA in der Probe einer Echtzeit-PCR umfasst, welche einen Primer-Sondensatz verwendet, welcher Primer umfasst, welche ausgewählt sind, um DNA umfassend oder assoziiert mit 16S-rDNA oder 16S-rRNA zu amplifizieren, und eine Sonde, welche mit einer Nukleotidsequenz verschachtelt zwischen den Primern hybridisiert, wobei die Sonde entweder spezifisch für den Mikroorganismus ist, welcher identifiziert werden soll oder welcher danach durch eine gattungsspezifische Sonde identifiziert wird.
• In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Primer ebenso eine gattungsspezifische Sonde.
• In einer besonders geeigneten Ausführungsform wird der Primer/Sondensatz als Falle für Nukleinsäurematerial verwendet, welches dann kloniert und sequenziert wird, um die Gattung oder Spezies der vorwiegenden Mikrobe zu bestimmen. Eine Entscheidung kann dann gemacht werden, um die vorwiegende Mikrobe zu studieren oder zu kultivieren. Dies ist besonders geeignet beim Studium von anaeroben Bakterien, welche anspruchsvolle Kulturerfordernisse haben, welche dann schwierig zu kultivieren sind. Dies ist sogar besonders geeignet zum Isolieren und Identifizieren von anaeroben Bakterien von Dentalplaques, welche schwierig zu kultivieren sind, wenn konventionelle Verfahren verwendet werden. DNA oder RNA kann extrahiert werden, einer PCR durch die universellen Primer unterzogen werden, und dann kann das amplifizierte Fragment isoliert und sequenziert werden, und der Organismus kann durch BLAST/GAP oder andere Computeranalyse identifiziert werden.
• Ein Bezug hierin auf einen "Primer" oder eine "Sonde" soll nicht als eine beliebige Beschränkung auf die Struktur, Größe oder Funktion genommen werden. Der Primer kann als ein Amplifikationsmolekül verwendet werden oder kann als eine Sonde für Hybridisierungszwecke verwendet werden. Die bevorzugte Form des Moleküls ist ein Primer für die Amplifikation.
• Ein Bezug hierin auf einen "Nukleinsäureprimer" schließt einen Bezug zu einer Sequenz von Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden ein, welche wenigstens 3 Nukleotide umfasst. Generell umfasst der Nukleinsäureprimer von etwa 3 bis etwa 100 Nukleotide, vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 50 Nukleotide und noch stärker bevorzugt von etwa 5 bis etwa 25 Nukleotide. Auf einen Primer mit weniger als 50 Nukleotiden kann hierin ebenso als ein "Oligonukleotidprimer" bezuggenommen werden. Die erfindungsgemäßen Primer können synthetisch hergestellt werden zum Beispiel durch das schrittweise Hinzugeben von Nukleotiden oder können Fragmente, Teile, Anteile oder Verlängerungsprodukte von anderen Nukleinsäuremolekülen sein. Der Begriff "Primer" wird in seinem allgemeinsten Sinn verwendet, um eine beliebige Länge von Nukleotiden einzuschließen, welche, wenn sie für Amplifikationszwecke verwendet werden, eine freie 3'-Hydroxylgruppe für die Initiation von einer DNA-Synthese durch eine DNA-Polymerase bereitstellen können. Eine DNA-Synthese führt zur Verlängerung des Primers, um ein Primerverlängerungsprodukt komplementär zum Nukleinsäurestrang herzustellen, an welchen der Primer hybridisiert hat. Der Primer oder die Sonde kann ebenso als eine Fänger- oder Verankerungsgruppe von Ziel-DNA oder -RNA berücksichtigt werden.
• Die Verlängerung des hybridisierten Primers, um ein Verlängerungsprodukt herzustellen, wird hierin durch den Begriff "Amplifikation" eingeschlossen. Eine Amplifikation tritt generell in Zyklen von Denaturierung gefolgt von einer Primerhybridisierung und -verlängerung auf. Die vorliegende Erfindung umfasst von etwa 1 Zyklus bis etwa 120 Zyklen, vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 70 Zyklen und noch stärker bevorzugt von etwa 5 bis etwa 40 Zyklen einschließend etwa 10, 15, 20, 25 und 30 Zyklen.
• In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Herstellung der Probe in Anwesenheit eines Nukleaseinhibitors durchgeführt.
• Der Test kann auf eine beliebige Anzahl von Weisen durchgeführt werden. Zum Beispiel wird eine immobilisierte Form des Tests beabsichtigt. In einer Ausführungsform wird ein generischer Primer auf einem festen Träger immobilisiert, um Ziel-DNA/-RNA zu fangen. Vorwärts- und Rückwärtsprimer und die Sonde in der löslichen Phase werden dann zum Durchführen der Echtzeit-PCR oder einer verwandten oder äquivalenten Technologie verwendet. In einer alternativen Ausführungsform wird einer der Vorwärts- oder Rückwärtsprimer als das Fängermolekül verwendet.
• In Übereinstimmung mit diesem erfindungsgemäßen Aspekt wird eine Nukleinsäureprobe, welche auf die Anwesenheit von Bakterien getestet werden soll, in eine Kammer, in ein Loch oder anderes Gefäß gebracht, welches ein immobilisiertes Nukleinsäure-Fängermolekül umfasst. Die Fängermoleküle umfassen eine Nukleotidsequenz im Wesentlichen komplementär zu einem Anteil von entweder der Ziel-Nukleotidsequenz oder einer Nukleotidsequenz innerhalb eines Nukleinsäuremoleküls, welches die Zielsequenz umfasst. Die Begriffe "Fängermolekül" und "Primer" können austauschbar verwendet werden.
• Das Fängermolekül kann auf der Festphase durch ein beliebiges passendes Mittel immobilisiert werden. Die Festphase kann eine beliebige Struktur mit einer Oberfläche sein, welche zum Ankern eines Nukleinsäureprimers oder eines anderen Fängermoleküls derivatisiert werden kann. Vorzugsweise ist die Festphase ein planares Material wie zum Beispiel die Seite eines Mikrotiterlochs oder die Seite eines Messstabs.
• Das verankerte Nukleinsäuremolekül muss generell ein Ziel-Nukleinsäuremolekül durch Hybridisierung fangen und gegebenenfalls an einer Amplifikationsreaktion teilnehmen können. Alternativ fängt das verankerte Nukleinsäuremolekül amplifizierte Nukleinsäuremoleküle.
• Verfahren zum Binden von Nukleinsäuremolekülen an feste Träger sind im Stand der Technik gut bekannt. Verfahren zum Binden des Primers an die Festphase schließen Amidbindung, Amidatbindung, Thioetherbindung und die Einführung von Aminogruppen auf die Festphase ein. Beispiele von Bindung an eine Festphase können in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/AU92/00587 [ WO 93/09250 ] gefunden werden.
• Der verankerte Primer kann ebenso mit einem der Primer in der Lösungsphase an der Amplifikation teilnehmen. Alternativ wird ein "generischer" Primer am festen Träger verankert, um das Nukleinsäuremolekül zu amplifizieren, welches eine Zielsequenz umfasst. Eine spezifische Amplifikation der Zielsequenz kann dann durch Primer in der Lösungsphase erzielt werden. In Beziehung zur letzteren Ausführungsform würde die Lösung zwei Primer in der Lösungsphase und eine markierte Sonde enthalten.
• Verankerte Primer können ebenso als Falle für Ziel-DNA oder -RNA für nachfolgendes Klonieren und/oder Sequenzieren (generell nach Amplifikation) und/oder Abfrage durch Sonden oder Primer zum Identifizieren einer Mikroorganismengattung oder -spezies oder den vorwiegenden Mikroorganismus verwendet werden.
• Das erfindungsgemäße Verfahren stellt ein wirksames, kostenwirksames und genaues Mittel zum Detektieren bestimmter Nukleinsäuremoleküle und dadurch Quantifizieren einer bakteriellen Last bereit.
• Wie oben festgestellt sind die universellen erfindungsgemäßen Primer und Sonden ebenso als eine Falle für ein gesamtes mikrobenabgeleitetes Zielmaterial geeignet. Derartiges gefangenes Material kann dann sequenziert oder kloniert und sequenziert und/oder einer Primer/Sondenabfrage unterzogen werden. Folglich stellt die vorliegende Erfindung die Fähigkeit bereit, um Bakterien in Proben zu detektieren, welche schwierig zu kultivieren sind und welche bei aller Praxis undetektiert bleiben würden oder in Lebendkultur-Zählverfahren unterschätzt würden, oder alternativ Bakterien, welche sich in einem aggregierten oder koaggregierten Stadium befinden oder mit Matrixmaterial kontaminiert sind, wie zum Beispiel in kariösen Dentinproben, wo fluoreszierende Detektion und/oder mikroskopische Spezifizierung ebenso unpraktisch sind. Des Weiteren ermöglicht die Anwendung der universellen erfindungsgemäßen Primer und Sonden eine schnelle Differenzierung von Bakterien von Virusinfektionen innerhalb der beschränkten Zeitvorgaben, welche manchmal in lebensbedrohlichen klinischen Situationen droht. Dies ist besonders nützlich, zum Beispiel bei der Diagnose einer Enzephalitis und Unterscheidung zwischen einer mikrobiellen und viralen Enzephalitis. Auf dem Gebiet der klinischen Mikrobiologie ermöglicht die vorliegende Erfindung das Fangen und Identifizieren des überwiegenden Bakteriums bei einer Infektion, was zu effizienteren Behandlungsprotokollen führt. Alle Anwendungen des gegenständlichen Verfahrens werden von der vorliegenden Erfindung umfasst.
• Die vorliegende Erfindung ist anwendbar in einem Industriebereich einschließend die medizinische, landwirtschaftliche und industrielle Industrie mit spezifischen Verwendungen einschließend Umweltschutz, Biovermittlung, medizinische Diagnose, Wasserqualitätskontrolle oder Nahrungsqualitätskontrolle.
• Noch ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt ist auf ein Kit in einer kompartimentierten Form gerichtet, wobei das Kit ein Kompartiment umfasst, welches eingerichtet ist, dass es ein oder mehrere Primer enthält, welche fähig zur Teilnahme an einer Amplifikationsreaktion von DNA umfassend oder assoziiert mit 16S-rDNA oder 16S-rRNA sind, ein anderes Kompartiment, welches eine Sonde umfasst, welche an ihrem 5'-Ende durch ein fluorogenes Reportermolekül und an ihrem 3'-Ende durch ein Molekül fähig zum Quenchen des fluorogenen Moleküls markiert ist, und gegebenenfalls ein anderes Kompartiment, welches eingerichtet ist, Reagenzien zum Durchführen einer Amplifikationsreaktion zu enthalten, und gegebenenfalls ein Kompartiment, welches für eine Nukleinsäureextraktion von Zellen eingerichtet ist.
• In einer alternativen Ausführungsform umfasst das Kit eine Mikrotiterplatte mit zwei oder mehr Löchern und mit den Reagenzien, welche die Primer in den Löchern einschließen.
• Ein oder mehrere der Primer können ebenso in den Kompartimenten immobilisiert sein.
• Das Kit kann praktischerweise für eine automatisierte oder halb-automatisierte Verwendung eingerichtet sein.
• Das Kit kann ebenso ein Kompartiment für eine Nukleinsäureextraktion umfassen.
• Das Kit kann ebenso ein Array von Primern oder Sonden umfassen, um eine Detektion nicht nur von Procarya zu erlauben, sondern ebenso andere Mikroorganismen oder spezifische Bakterien.
• Die vorliegende Erfindung weiter stellt ein Extraktionsverfahren zum Extrahieren von Nukleinsäurematerial für eine Amplifikation durch den universellen Primer/Sondensatz bereit.
• Folglich beabsichtigt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäurematerial aus einer Probe, welche mikrobielle Zellen umfasst, wobei das Verfahren Unterziehen einer konzentrierten Probe der Zellen einem enzymatischen Abbau und Lysieren der Zellen in Anwesenheit von SDS und dann Reinigen des Nukleinsäurematerials umfasst.
• Vorzugsweise umfasst die enzymatische Behandlung Behandlung mit einer Proteinase K und Lysozym und/oder Mutanolysin oder ihren Äquivalenten. Vorzugsweise werden die lysierten Zellen ebenso mit einer RNase behandelt. Praktischerweise wird DNA oder RNA dann spezifisch isoliert.
• Auf dieses Verfahren wird als Einzelschritt-DEPC-Verfahren bezuggenommen.
• Weiter wird ein Zweischritt-DEPC-Verfahren durch die vorliegende Erfindung beabsichtigt, und dieses könnte einen druckvermittelten Zelllyseschritt (wie zum Beispiel durch Beschallung) einschließen oder Inkubation auf Eis in Anwesenheit von DEPC vor einer enzymatischen Behandlung.
• Folglich stellt die vorliegende Erfindung weiter ein Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäurematerial aus einer Probe bereit, welche mikrobielle Zellen umfasst, wobei das Verfahren Unterziehen einer konzentrierten Probe der Zellen einer druckvermittelten Zerreißung oder Inkubation auf Eis in Anwesenheit von DEPC vor einem enzymatischen Abbau und dann Lysieren der Zellen in Anwesenheit von SDS und dann Reinigen des Nukleinsäurematerials umfasst.
• Vorzugsweise ist die druckvermittelte Zerreißung Beschallung. Die bevorzugten anderen Aspekte von diesem Zweischrittverfahren sind dieselben wie im Einschrittverfahren.
• In einer bevorzugten bestimmten Ausführungsform wird das Ein- oder Zweischrittextraktionsverfahren in Kombination mit dem universellen Primer/Sondensatz zum Spezifizieren und gegebenenfalls identifizieren bestimmter Bakterien in einer Probe verwendet.
• Folglich beabsichtigt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Mikroorganismen in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst:
  gegebenenfalls Unterziehen einer konzentrierten Probe der Zellen einer druckvermittelten Zerreißung oder Inkubation auf Eis in Anwesenheit von DEPC gefolgt von einem enzymatischen Abbau und dann Lysieren der Zellen in Anwesenheit von SDS und dann Reinigen des Nukleinsäurematerials,
  Amplifizieren des Nukleinsäurematerials in Anwesenheit von Vorwärts- und Rückwärtsprimern fähig zum Hybridisieren mit einer konservierten Nukleotidsequenz innerhalb einer 16S-rDNA oder 16S-rRNA,
  gegebenenfalls Detektieren der Anwesenheit von amplifiziertem Produkt in Anwesenheit einer Sonde markiert mit einem Reportermolekül und Bestimmen des Gesamt-Mikrobengehalts, und
  gegebenenfalls Isolieren des amplifizierten Produkts und entweder Sequenzieren des isolierten Produkts oder Unterziehen des amplifizierten Produkts einer genetischen Abfrage zum Identifizieren der vorliegenden Mikroorganismengattung oder -spezies.
• Die vorliegende Erfindung wird weiter von den folgenden nichtbeschränkten Beispielen beschrieben.
• BEISPIEL 1
• Bakterienstämme und Kulturbedingungen
• Escherichia-coli-Stämme JM109, NM522 und XL 1 blue (Stratagene, La Jolla, CA, USA) waren aus früheren Studien verfügbar. Staphylococcus-aureus-Stämme ATCC 12600, ATCC 9144, ATCC 12598, ATCC BM 10458 und ATCC BM 1014, Staphylococcusepidermidis-Stämme ATCC 35983 und ATCC 14990, Staphylococcus hemolyticus ATCC 29970 und S.-hemolyticus-Infiltratonskeratitis-Isolat, Staphylococcus schleferi ATCC 43808, Pseudomonas-aeruginosa-Stämme ATCC 19660, ATCC 15442, ATCC 6294 und ATCC 6206, Pseudomonas-fluorescens-Infiltratonskeratitisisolat, Pseudomonas-putida-Linsen-Salinenisolat, Pseudomonas-stutzeri-Infiltrationsisolat, Pseudomonas-alcaligens-Laborisolat, Pseudomonas-Spezies und Serratia marcescens ATCC 274 wurden durch das Co-operative Research Centre for Eye Research and Technology [Kooperatives Forschungszentrum für Augenforschung und Technologie] bereitgestellt, Universität von Neu-Südwales, Australien. Alle Escherichia-, Staphylococcus-, Pseudomonas- und Serratia-Spezies wuchsen in Luria-Bertani-Brühe bei 37°C. Streptococcus mutans LT 11 und Streptococcus sanguis ATCC 10556 wuchsen bei 37°C auf Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (Oxoid, Basingstoke, UK) unter 95% N₂ gewachsen/5% v/v CO₂, Fusobacterium nucleatum ATCC 25586, Fusobacterium necrophorum ATCC 25286, Actinomyces israelii ATCC 12102 und Actinomyces naeslundii ATCC 12104 wurden von der American Type Culture Collection [Amerikanische Muster-Kultursammlung] (Rockville, MD, USA) erhalten und wuchsen bei 37°C in einer Gehirn-Herz-Infusionsbrühe in einer anaeroben Kammer (85% v/v N₂, 5% v/v CO₂, 10% v/v H₂). Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, Prevotella melaninogenica ATCC 25845, Prevotella loescheii ATCC 15930, Peptostreptococcus micros ATCC 33270 und Peptostreptococcus anaerobius ATCC 27337 wurden von der American Type Culture Collection [Amerikanische Muster-Kultursammlung] (Rockville, MD, USA) erhalten und wuchsen bei 37°C in CDC-Brühe (1% v/v Trypticase-Peptone, DIFCO Becton Dickinson, MD, USA, 1% v/v Trypticase-Sojabrühe, DIFCO Becton Dickinson, MD, USA, 0,5% w/v Natriumchlorid, 1% w/v Hefeextrakt, Oxoid, Basingstoke, UK, 0,04% w/v L-Cystein, Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) enthaltend 1% w/v Hemin, 0,4% w/v Menadion und 2% v/v Pferdeserum in einer anaeroben Kammer (85% v/v N₂, 5% v/v CO₂, 10% v/v H₂). Porphyromonas endodontalis ATCC 35406 American Type Culture Collection [Amerikanische Muster- Kultursammlung] Rockville, MD, USA) wuchs ebenso in einer anaeroben Kammer. Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 und Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 von der IDR-Kultursammlung wuchsen bei 37°C in MRS-Brühe (Oxoid, Basingstoke, UK) unter mikroaerophilen Bedingungen (95% v/v N₂, 5% v/v CO₂).
• BEISPIEL 2
• Quelle von kariösem Dentin
• Zwanzig kariöse Zähne wurden nach einer Information von zufällig ausgewählten Patienten mit ihrer Zustimmung erhalten, welche sich mit Schmerzen vorstellten und eine Extraktion wünschten, um ihre Symptome zu lindern. Patienten wurden von der Studie ausgeschlossen, wenn sie eine Vorgeschichte einer signifikanten medizinischen Erkrankung oder einer antimikrobiellen Therapie innerhalb der letzten vier Monate angegeben hatten. Nichtwiederhergestellte Zähne mit einer Kronen-Zahnschmelz- und Dentinkaries wurden für den Einschluß in die Studie auf Basis von klinischen diagnostischen Tests ausgewählt, welche zeigten, dass sie vital mit klinischen Symptomen von einer reveriblen Pulpitis waren (Schmerz und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber heissen und kalten Stimuli).
• Sofort nach Extraktion wurde jeder Zahn in einen Behälter mit reduzierter Transportflüssigkeit (RTF) (24) gebracht und auf eine anaerobe Kammer bei 37°C übertragen, welches 85% N₂, 5% CO₂ und 10% H₂ v/v/v enthielt. Oberflächlicher Plaque und Trümmer, welche die kariöse Läsion überdecken, wurden entfernt, und die Oberfläche wurde mehrere Male mit RTF gespült. Unter Verwendung von scharfen sterilen Zahnbohrern wurde das ganze erweichte und kariöse Dentin in Form von kleinen Fragmenten von einem jeden Zahn gesammelt. Die Probennahme war innerhalb von 20 min nach der Zahnextraktion beendet.
• BEISPIEL 3
• Bestimmung von koloniebildenden Einheiten in kariösem Dentin
• Das kariöse Dentin, welches aus einem jeden Zahn einzeln extrahiert wurde, wurde gewogen, und eine Standardsuspension von 10 mg Nassgewicht Dentin (ml RTF)^–1 wurde bei 37°C in einer anaeroben Kammer hergestellt (siehe Beispiel 2). Die Dentinfragmente wurden homogen in RTF erst durch Vortexten für 20 s und dann durch Homogenisieren per Hand in einem 2-ml-Glasmomogenisator für 30 s dispergiert. Proben (100 μl) von seriellen 10^–3- bis 10^–6-Verdünnungen dieser Suspensionen wurden in RTF hergestellt und doppelt auf Trypticase-Sojaagar (Oxoid) platiert, welcher 1 μg Menadion ml^–1, 5 μg Haemin ml^–1, 400, μg L-Cystein ml^–1 (Sigma) und 5% v/v Pferdeblut (Amyl Medien) enthielt (10). Die Platten wurden bei 37°C in einer anaeroben Kammer für 14 Tage inkubiert, welche 85% N₂, 5% CO₂ und 10% H₂ v/v/v enthielt, und die Anzahl von koloniebildenden Einheiten wurde gezählt, um die gesamtmikrobielle Last (mg Nassgewicht von Dentin)^–1 zu bestimmen. Die unbenutzten dispergierten kariösen Dentinproben wurden bei –80°C gefroren.
• BEISPIEL 4
• Bestimmung von lebensfähigen Bakterien aus in-vitro-Kulturen
• Zähler für lebende Zellen von Kulturen von E. coli, P. aeruginosa und S. aureus wurden durch Platieren von 100 μl einer 10^–6-Verdünnung der geeigneten Kultur, welche in LB-Brühe auf LB-Agarplatten gewachsen war, und Zählen der Kolonien nach einer aeroben Inkubation für 24 h bei 37°C bestimmt.
• BEISPIEL 5
• DNA-Extraktion aus bakteriellen Kulturen
• DNA wurde aus einzelnen Bakterienspezies isoliert, wobei entweder das QIAamp-DNA-Mini-Kit (QIAGEN, Clifton-hill, VIC) gemäß den Instruktionen der Herstellers oder das Gefrier-Kochverfahren verwendet wurde. Im letzteren Fall wurden bakterielle Zellen aus einer 250-μl-Kultur durch Zentrifugation (14.000 × g für 2 min bei Raumtemperatur) erhalten und in 45 μl 10 mM Phosphatpuffer pH 6,7 vor dem Gefrieren bei –20°C resuspendiert. Die gefrorenen Zellen wurden dann in einem kochenden Wasserbad für 10 min erwärmt.
• BEISPIEL 6
• Extraktion von einer anaeroben bakteriellen DNA aus kariösem Dentin
• Gefrorene Suspensionen von homogenisiertem kariösen Dentin wurden auf Eis getaut, und 80 μl-Proben wurden gezogen und mit 100 μl ATL-Puffer (Qiagen) und 400 μg Proteinase K (Qiagen) versetzt. Die Proben wurden für 10 s gevortext und dann bei 56°C für 40 min inkubiert, wobei periodisch alle 10 min für 10 s gevortext wurde, um eine vollständige Lyse der Zellen zu ermöglichen. Es wurde gefunden, dass man mit diesem Verfahren DNA sowohl aus gramnegativen als auch grampositiven anaeroben Bakterien DNA extrahieren kann, was in Übereinstimmung mit dem Befund steht, dass die Zellwandintegrität von grampositiven Anaerobiern beinträchtigt wird, wenn die Bakterien gegenüber Sauerstoff exponiert werden (11). Andere mikroaerophile oder fakultative grampositive Bakterien, welche Streptokokkenen, Lactobacillen und Actinomyces einschließen, wurden nicht durch dieses Verfahren lysiert. Nach dem Hinzugeben von 200 μg RNase (Sigma) wurden die Proben für weitere 10 min bei 37°C inkubiert. Die DNA, welche frei von kontaminierender RNA war, wurde dann gereinigt, wobei das QIAmp-DNA-Mini-Kit (Qiagen) gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet wurde.
• BEISPIEL 7
• Quellen von anderer bakteriellen DNA
• DNA von Legionella pneumophila Serogruppe 4 ATCC 33156, Serogruppe 5 ATCC 33216, Serogruppe 6 ATCC 33215, Serogruppe 1 Knoxville 1 ATCC 33153, Philadelphia-1 als auch Legionella anisa, Legionella bozemanii Serogruppe 2, Legionella Iondineensis, Legionella maceachemii und Legionella waltersii wurden von The Infectious Diseases Laborstories [Labor für Infektionskrankheiten], Institute of Medical and Veterinary Science [Institut für medizinische und Veterinär-Wissenschaft], Südaustralien, bereitgestellt, und diejenige von Mycobacterium tuberculosis H37RV durch The Microbiology Laborstory [Mikrobiologisches Labor], Westmead-Krankenhaus, Neusüdwales, Australien.
• BEISPIEL 8
• DNA-Sequenzanalyse
• Die 16S-rDNA Sequenzen, welche die meisten der Gruppen von Bakterien repräsentiert, welche in Bergey's Manual (eingetragene Marke) of Determinative Bacteriology [Bergeys Handbuch der bestimmenden Bakteriologie] (12) dargestellt sind, welche zur Konstruktion eines universellen Primer-Sondensatzes analysiert wurden schlossen ein (GenBank-Zugriffsnummer in Klammern): Bacteroides forsythus (AB035460), P. gin givalis (POYRR16SC), P. melaninogenica (PVORR16SF), Cytophaga baltica (CBA5972), Campylobacter jejuni (CAJRRDAD), Helicobacter pylon (HPU00679), Treponema denticola (AF139203), T. pallidum (TRPRG16S), Leptothrix mobilis (LM16SRR), Thiomicrospira denitrificans (TDE243144), Neisseria meningitidis (AF059671), Actinobacillus actinomycetemcomitans (ACNRRNAJ), Haemophilus influenzae (HIDNA5483), E. coli (ECAT1177T), Salmonella typhi (STRNA16), Vibrio cholerae (VC16SRRNA), Coxiella burnetii (D89791), L. pneumophilia (LP16SRNA), P. aeruginosa (PARN16S), Caulobacter vibrioides (CVI009957), Rhodospirillum rubrum (RR16S107R), Nitrobacter winogradskyi (NIT16SRA), Wolbachia-Spezies (WSP010275), Myxococcus xanthus (MXA233930), Corynebacterium diphtheriae (CD16SRDNA), M. tuberculosis (MTRRNOP), Streptomyces coelicolor (SC16SRNA), A. odontolyticus (AO16SRD), Bacillus subtilis (AB016721), S. aureus (SA16SRRN), Listeria monocytogenes (S55472), Enterococcus faecalis (AB012212), L. acidophilus (LBARR16SAZ), S. mutans (SM16SRNA), Chlostridium botulinum (CBA16S), P. micros (PEP16SRR8), Veillonella dispar (VDRRNA16S), F. nucleatum (X55401), Chlamydia trachomatis (D89067) und Mykoplasma pneumoniae (AF132741). Die 16S-rDNA-Sequenzen wurden abgeglichen, wobei das GCG-Programm Pileup (22) verwendet wurde, auf welches über den Australian National Genomic Information Service [Australischer nationaler genomischer Informationsdienst] zugegriffen wurde (ANGIS, http://www.angis.org.au). Identitätsregionen wurden manuell für den Entwurf der universellen Sonde und Primer (1A, 1B, 1C) beurteilt und dann auf eine mögliche Kreuzhybridisierung mit anderen bakteriellen Genen überprüft, wobei das Datenbankähnlichkeitssuchprogramm BLAST (23) verwendet wurde, auf welches ebenso über ANGIS zugegriffen wurde. Die Primer-Express-Software, welche von Applied Biosystems zum Bestimmen der geeigneten Primer/Sondenkombinationen bereitgestellt wurde, war nur von beschränktem Wert bei dieser Aufgabe und wurde nur verwendet, um auf Primer-Dimere oder interne Haarnadel-Konfigurationen zu prüfen. Nach dem Entwurf wurden die Sonden- und Primersequenzen (Tabelle 1) durch Applied Biosystems synthetisiert.
• BEISPIEL 9
• PCR-Bedingungen
• Amplifikation und Detektion von DNA durch Echtzeit-PCR wurde mit dem ABI-PRISM-7700-Sequenzdetektionssystem (PE Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt, wobei 96-Loch-Platten mit optischer Qualität verwendet wurden. Zur Bestimmung der vorwiegend anaeroben gramnegativen bakteriellen Last in kariösen Dentin wurde die PCR-Reaktion dreifach in einem Gesamtvolumen von 25 μl ausgeführt, wobei entweder der TaqMan (eingetragene Marke) PCR-Core-Reagenzkit, PE Biosystems (Foster City, CA, USA), zu welchem 200 μM von jedem dNTP, 3,5 mM MgCl₂, 0,625 U AmpliTaq Gold in 1 × PCR-Puffer hinzugegeben wurde, welches von PE Biosystems (Foster City, CA, USA) geliefert wurde, wobei 300 nM Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 175 nM fluorogene Sonde verwendet wurde. Alternativ wurde der TaqMan (eingetragene Marke) Universal PCR Master Mix (PE Biosystems, Foster City, CA, USA) verwendet, welcher 100 nM von jedem der universellen Vorwärts- und Rückwärtsprimer und die fluorogene Sonde enthielt. Die Reaktionsbedingungen für eine DNA-Amplifikation waren 50°C für 2 min, 95°C für 10 min und 40 Zyklen von 95°C für 15 s und 60 C für 1 min. Die Daten wurden analysiert, wobei die Sequenzdetektionssystemsoftware von PE Biosystems (Foster City, CA, USA) verwendet wurde, und werden als Mittelwert von doppelten Proben präsentiert.
• BEISPIEL 10
• DNA-Isolierungsverfahren
• (i) Beschallung: Bakterielle Zellen, welche bei 14.000 × g für 2 min bei Raumtemperatur pelletiert wurden, wurden in 10 mM Phosphatpuffer pH 6,7 resuspendiert, welcher Glas-Beads enthielt, und sie wurden für 5 min, 10 min und 15 min mit 75 Watt Leistung beschallt, wobei ein Branson-Ultraschallgerät Modell 250 verwendet wurde. Aliquots wurden nach jedem Zeitintervall gesammelt.
• (ii) Gefrier-Tauverfahren: Das Zellpellet wurde in 10 mM Phosphatpuffer pH 6,7 resuspendiert, bei –20°C gefroren, und nach dem Tauen wurde ein Aliquot für die PCR-Reaktion verwendet.
• (iii) Gefrier-Kochverfahren: Bakterielle Zellen, welche bei 14.000 × g für 2 min bei Raumtemperatur pelletiert wurden, wurden in 10 mM Phosphatpuffer pH 6,7 resuspendiert, bei –20°C gefroren und für 10 min in kochendes Wasser gebracht, bevor sie für die PCR-Reaktion verwendet wurden.
• (iv) Enzymatisches Verfahren: Bakterielle Zellen, welche bei 14.000 × g für 2 min bei Raumtemperatur pelletiert wurden, wurden in 10 mM Phosphatpuffer pH 6,7 resuspendiert, welcher Lysozym und Mutanolysin (jeweils mit 1 mg/ml Endkonzentration) enthielt, und bei 60°C für 30 min inkubiert und mit SDS (1% w/v Endkonzentration) lysiert.
• (v) QIAmp-DNA-Mini-Kit-Verfahren: Gesamtzell-DNA wurde aus bakteriellen Kulturen mit dem QIAmp-DNA-Mini-Kit (QIAGEN) gemäß den Instruktionen des Herstellers extrahiert.
• (vi) ZnCl₂/EDTA/DEPC-Verfahren: Bakterielle Zellen, welche bei 14.000 × g für 2 min bei Raumtemperatur pelletiert wurden, wurden in 10 mM Phosphatpuffer pH 6,7 resuspendiert, welcher Lysozym und Mutanolysin (jeweils mit 1 mg/ml-Endkonzentration) und 5 mM ZnCl₂ oder 100 mM EDTA oder 20 mM DEPC enthielt. Nach Inkubation für 30 min bei 60°C wurden die Zellen mit 1% w/v SDS (Endkonzentration) lysiert. DNA wurde aus bakteriellen Kulturen mit dem QIAmp-DNA-Mini-Kit gemäß den Instruktionen des Herstellers gereinigt.
• BEISPIEL 11
• Schutz vor Nukleasen
• Eine gereinigte Präparation von DNA und P.-gingivalis-Zellextrakt wurden bei 60°C für 30 min in Anwesenheit oder Abwesenheit von ZnCl₂ (5 mM) oder EDTA (100 mM) oder DEPC (20 mM) oder Kaninchenmuskelaktin (1 μg/ml) oder Dipyridyl (2 mM/5 mM) inkubiert, um ihre Wirkung als Nukleaseinhibitoren zu beurteilen. Ein Aliquot wurde auf 1% w/v Agarosegel-Elektrophorese überprüft.
• BEISPIEL 12
• Entwurf von universellen Primern und Sonde
• Applied Biosystems hat eine Anzahl von Richtlinien für den Entwurf von Primern und Sonden herausgegeben. Dies schließen die Tatsache ein, dass die Schmelztemperatur (T_m) der DNA zwischen 58–60°C für die Primer und 68–70°C für die Sonde sein sollte, der G + C-Gehalt zwischen 30–80% sein sollte, es sollte keine Sequenz von mehr als drei aufeinanderfolgend Gs entweder in den Primern oder der Sonde sein, es sollten nicht mehr als zwei GCs innerhalb der letzten fünf Nukleotiden am 3'-Ende der Primer sein, es sollte kein G am 5'-Ende der Sonde sein, die Selektion der Sonde sollte von dem Strang mit mehr Cs als Gs durchgeführt werden, und die Amplikonlänge sollte zwischen 50–150 bp liegen.
• Die Erfinder haben dann einen Satz von universellen Primern und eine Sonde entworfen, welche auf der Sequenz von 16S-rDNA basiert, welche im Wesentlichen wenigstens mit den meisten der Richtlinien des Satzes von Applied Biosystems entsprechen würde und ebenso einen breiten Bereich von Bakterienspezies detektieren würde. Die Erfinder konnten nicht alle dieser Kriterien erfüllen. Die endgültige Wahl der Erfinder für einen universellen Primer-Sondensatz wich jedoch nur auf zwei Arten vom Ideal ab. Dies waren die Länge des Amplikons und die Anzahl von GCs in den letzten fünf Nukleotiden des Vorwärtsprimers. Der Primer-Sondensatz, welcher entworfen wurde, um als ein universelles Detektionssystem für die Procarya durch Echtzeit-PCR zu wirken, erzeugte ein 466-bp-Amplikon, welches die Reste 331 bis 797 auf dem E.-coli-16S-rRNA-Gen überspannt (Tabelle 1). Die ausgewählte Sonden- und Primersequenzen sind in allen Gruppen von Procarya hoch konserviert (12), für welche repräsentative bakterielle 16S-rRNA Gene abgeglichen wurden (1).
• Obwohl der Mehrfachabgleich der ausgewählten bakteriellen 16S-rRNA-Sequenzen zwei Fehlpassungen im Vorwärtsprimer von F. nucleatum (wobei die Nukleotide unbekannt sind) als auch eine Deletion im 5'-Ende des Vorwärtsprimers von P. micros zeigt, wurden diese Diskrepanzen während einer Echtzeit-PCR toleriert, da beide Gattungen quantifiziert werden konnten, wenn der universelle Primer-Sondensatz verwendet wurde (Tabelle 2).
• Zur Bestätigung der Spezifität für Procarya durchsuchten die Erfinder eine Anzahl von verfügbaren Eucarya- und Archea-Datenbanken, welche über ANGIS verfügbar waren. Der BLAST-Suchergebnisse zeigten nur einen signifikanten Treffer – eine spezifische Brustkrebs-Zelllinie (BT029), welche nur durch den Rückwärtsprimer detektiert wurde. Jedoch wurde die menschliche DNA-Probe, welche von Applied Biosystems in ihrem beta-Aktindetektionskit geliefert wurde, nicht durch den Primer-Sondensatz amplifiziert und ergab ein vollkommen negatives Ergebnis.
• BEISPIEL 13
• Empfindlichkeit des universellen Primer-Sondensatzes bei der Detektion von E.-coli-rDNA
• Die Technologie von TaqMan (eingetragene Marke) bestimmt den PCR-Zyklus, bei welchem die Erhöhung der Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs eine Schwelle erreicht. Dies ist als den Schwellenzyklus (threshold cylce C_T) bekannt und ist proportional zur Menge von Ziel-DNA und daher der Bakterienzahl in der Probe. Die Erfinder erstellten einen Standardgraphen, welcher auf der Detektion von E.-coli-rDNA basiert, wobei eine E.-coli-Zelle theoretisch der Detektion von 4,96 fg DNA entspricht (2). Wenn E. coli als Standard verwendet wurde, wurden zwischen 238 fg von E.-coli-DNA (korrespondierend 48 E.-coli-Zellen) und 2,38 ng von E.-coli-DNA (korrespondierend 4,8 × 10⁵ E.-coli-Zellen) konsistent detektiert. Jedoch zieht dies nicht die Anzahl von rDNA-Kopien auf dem E.-coli-Genom in Betracht. Die Beschränkung auf die niedrigere Detektionsgrenze (d. h. zwischen 4,8 Zellen und 48 Zellen) variiert mit der Verwendung vom TaqMan (eingetragene Marke) PCR-Core-Reagentienkit oder des TaqMan (eingetragene Marke) Universal PCR Master Mix, welcher von PE Biosystems (Foster City, CA, USA) geliefert wurde. Dies liegt vermutlich an einer bakteriellen DNA-Kontamination entweder in der Enzympräparation oder in den chemischen Reagenzien, welche für die PCR (13–16) verwendet wurden, eine Beobachtung, welche in dieser Studie durch Detektion verifiziert wurde, wobei der universelle Primer-Sondensatz von rDNA in Reagenzmischungen und negativen Kontrollen verwendet wurde, welche keine hinzugegebene E.-coli-DNA enthielten (3). Obwohl 40 PCR-Zyklen mit dem universellen Primer-Sondensatz möglich waren, wurde in der Nicht-Templatekontrolle das fluoreszierende Signal konsistent um ein C_T von 33 und 38 detektiert.
• BEISPIEL 14
• Detektion über einen breiten Bereich und relative Bestimmung einer Bakterienzahl
• Um die relative gesamtbakterielle Last für eine gegebene Spezies zu bestimmen, haben die Erfinder den C_T-Wert für die Testprobe mit einem Standardgraphen verglichen, welcher von bekannten Mengen von E.-coli-DNA abgeleitet wurde (2). Der Standardgraph wurde vorzugsweise aus Daten hergestellt, welche gleichzeitig wie die Testproben gesammelt wurden, um als eine interne Kontrolle zu wirken. Durch Verwenden der Standardkurve konnte sowohl die relative Konzentration von DNA in der Probe als auch die relative Anzahl von Bakterien für alle ausgewählten Spezies bestimmt werden, welche die bedeutenden Gruppen von Bakterien repräsentieren, welche in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology [Bergeys Handbuch der bestimmenden Bakteriologie] (12) [Tabelle 2] gelistet werden. Für alle diese Spezies war die Varianz klein bei einem Wert von 2,00 × 10² (Bereich 1,98–2,06 × 10²) Bakterien pro pg DNA, wenn E.-coli-DNA als ein Standard verwendet wurde. Dies zeigte, dass die DNA-Quelle nicht den Detektionsgrad beeinflusste und dass der Primer-Sondensatz ebenso beim Detektieren der DNA ungeachtet der Spezies wirksam war, von welcher sie extrahiert wurde. Ähnliche Schlussfolgerungen konnten gezogen werden, wenn verschiedene Stämme von einer derselben Spezies durch Echtzeit-PCR detektiert wurden (Tabelle 3).
• BEISPIEL 15
• Wirkung der Quelle von Standard-DNA auf der Messung von einer relativen DNA-Konzentration
• Vergleich mit einem DNA-Standard, welcher von demjenigen von E. coli verschieden ist, sollte zu Unterschieden in der relativen Menge von DNA führen, welche aufgrund von Variationen in der rDNA-Kopienzahl detektiert wird, als auch die Multiplizikationswirkung, welche die Generationszeit (t_d) auf diese Anzahl haben kann. Um dies zu bestätigen, wurde ein Vergleich zwischen den drei schnell wachsenden aerobe Bakterien S. aureus, E. coli und P. aeruginosa mit t_d in vitro in der Größenordnung von 20–50 min und zwei langsam wachsenden obligate oralen Anaerobiern P. melaninogenica und P. endodontalis mit t_d in vitro in der Größenordnung von 5–15 h gemacht. Die relative Menge von DNA, welche durch Echtzeit-PCR geschätzt wurde, wobei jede der 5 DNAs als Standard verwendet wurde, war auf die DNA-Menge bezogen, welche bei A₂₆₀ nm (auf 100% gesetzt) bestimmt wurde. Jedenfalls würde erwartet, dass ein Vergleich von entsprechender DNA durch Echtzeit-PCR mit der bekannten Menge von hinzugegebener DNA annähernd 100% sein würde. In zwei Fällen war dies nicht der Fall. Sowohl für P. aeruginosa als auch P. melaninogenica wurde annähernd die doppelte DNA-Menge detektiert. Dies war teilweise durch die Tatsache verursacht, dass die relativen DNA-Mengen durch die Sequenzdetektionssystem-Software Version 1.6.3 berechnet wurden, welche von Applied Biosystems geliefert wurde, basiert auf dem willkürlichen Setzen der horizontalen Schwellenlinie, welche zum Bestimmen des C_T (wie in 3 zu sehen) verwendet wurde. Die horizontale Schwellenlinie wurde deshalb so eingestellt, dass diese zwei Werte so nahe wie möglich an 100% gebracht wurden, und die relative Menge von DNA wurde neu berechnet (Tabelle 4).
• Wie erwartet wurde eine Variation in der relativen Menge von DNA beobachtet, wenn sich die Standard-DNA von derjenigen der ausgewerteten Spezies unterschied (Tabelle 4). Jedoch wurde ein signifikanter Fehler (> 3-fach) nur beobachtet, wenn die schnell wachsenden aeroben Bakterien mit den DNA-Standards der langsam wachsenden obligaten Anaerobier verglichen wurden (Überschätzung), oder wenn umgekehrt die obligaten Anaerobier mit der DNA der schnellen wachsenden Aerobier verglichen wurden (Unterschätzung) (Tabelle 4).
• Einer der Werte, derjenige der Menge der detektierten S.-aureus-DNA, welche die P.-melaninogenica-DNA verwendete, war annähernd zweifach größer als erwartet. Jedoch wurde dieser Wert von einem niedrigen C_T-Wert gerechnet, wobei signifikante Fehler aufgrund der logarithmischen Skala der Abszisse im Graphen von C_T gegen (DNA) auftreten können. Bei extremen hohen und niedrigen C_T-Werten kann ein Fehler von 2 in der Schätzung der relativen Menge von DNA auftreten. Indem dieser inhärente Fehler von 2 in Betracht gezogen wurde und indem danach einer der 25 Werte für die relative Menge von DNA um einen Faktor von zwei verändert wurde (Tabelle 4 – siehe Fußnote ⧧), erlauben die Daten in Tabelle 4 eine Schätzung des Verhältnises der Kopienzahl der 16S-rRNA-Operons in den verschiedenen Spezies. Ein mittleres Verhältnis von 23:13:10:2:1 (zur nächsten Ganzzahl) für die Kopienanzahlen in S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, P. endodontalis bzw. P. melaninogenica war eine Passung der modifizierten Daten. Dies impliziert, dass die schnell wachsenden Aerobier S. aureus, E. coli und P. aeruginosa annähernd das doppelte bekannte chromosomale Komplement von 16S-rRNA-Operons besaßen. Die Daten sagten ebenso vorher, dass die obligaten Anaerobier nur eine oder zwei 16S-rRNA-Operons pro Chromosom besitzen. Die exakten Kopienanzahlen sind gegenwärtig unbekannt.
• BEISPIEL 16
• Vergleich von Lebendzellzahlen und der relativen Schätzung von Bakterien in einer künstlichen in-vitro-Mischung, wobei Echtzeit-PCR verwendet wurde
• Um die Gültigkeit der Verwendung des universellen Primer-Sondensatzes zum Schätzen der Bakterien-Gesamtzahl in einer gemischten Kultur zu bestimmen, ließ man die drei Bakterien E. coli, P. aeruginosa und S. aureus getrennt in vitro zur stationären Phase wachsen, und gleiche Volumina der drei Kulturen (2 ml) wurden zusammengemischt. Die Anzahl von koloniebildenden E.-coli-, P.-aeruginosa- und S.-aureus-Einheiten in der stationären Phase wurden durch eine serielle Verdünnung auf Agarplatten bestimmt und mit der relativen bakteriellen Last verglichen, welche durch Echtzeit-PCR bestimmt wurde, wobei der universelle Primer-Sondensatz und E.-coli- DNA als Standard verwendet wurde. Eine Überinstimmung in der Schätzung von bakteriellen Zählern wurde ungeachtet des verwendeten Verfahrens registriert (Tabelle 5), trotz der Tatsache, dass die Kopienzahl der 16S-rRNA-Operons in einem einzelnen Chromosom von E. coli 7 ist, während sie in P. aeruginosa 4 ist und in S. aureus 9 ist, und der Erwartung, dass P. aeruginosa gegen die E.-coli-Standard-DNA unterschätzt und S. aureus überschätzt würde.
• BEISPIEL 17
• Vergleich der Anzahl von anaeroben Bakterien in kariösem Dentin durch eine Echtzeit-PCR mit dem Zähler für die gesamten anaeroben Kolonien
• Der Wert der Verwendung des universellen Sonden- und Primersatzes beim Schätzen der anaeroben bakteriellen Last in einem kariösen Dentin wurde in zwanzig klinischen Proben bestimmt, welche DNA von P. melaninogenica ATCC 25845 von anaerob gewachsenen Zellen als Standard verwenden. Ein Vergleich wurde mit dem Zähler für die gesamten anaeroben Kolonien für jede der Proben gemacht. Der Mittelwert von anaeroben Bakterien, welcher durch Echtzeit-PCR bestimmt wurde, war 3,6 × 10⁸ (mg Dentin)^–1 (Bereich 1,1 × 10⁸–1,1 × 10⁹ [mg Dentin]^–1), während derjenige für den Gesamt-Lebenzellzähler 1,1 × 10 (mg Dentin)^–1 (Bereich 2,0 × 10⁶–3,7 × 10⁷ [mg Dentin]^–1) war. Die Ergebnisse zeigten, dass die kulturbasierte Technik die gesamtbakterielle Last in einem kariösen Dentin unterschätzt hat, da die Anzahl von anaeroben Bakterien, welche in den Proben durch Echtzeit-PCR detektiert wurden, im Mittel 40-fach größer waren, als diejenigen, welche durch Kolonienzähler detektiert wurden, trotz der Tatsache, dass die letzteren ebenso die fakultativen grampositiven Bakterien enthielten (Tabelle 6).
• BEISPIEL 18
• Beschallung von bakteriellen Zellen zur Isolierung von bakterieller DNA
• Um einen DNA-Verlust auszuschließen, wenn ein Mehrschritt-Probenpräparationsprotokoll verwendet wurde, wurden bakterielle Zellsuspensionen beschallt, um DNA aus Zellen zur Quantifizierung frei zu setzen, wobei Echtzeit-PCR verwendet wurde. DNA wurde wirksamer freigesetzt, wenn die Zellen unter Verwendung von Glas-Beads beschallt wurden. Beschallte S. mutans und P. gingivalis wurden auf geeignete Konzentration verdünnt und im ABI-PRISM-7700-Sequenzdetektionssystem auf DNA-Quantifizierung überprüft, wobei der universelle Primer-Sondensatz verwendet wurde. Die Wirkung der Beschallung wurde mit einer DNA-Isolierung verglichen, welche Gefrieren-Tauen oder Gefrieren-Kochen verwendet. Wie in 4 zu sehen, setzte das Gefrier-Kochtechnik-Verfahren die meiste DNA frei. Erhöhte Beschallungszeiten hatten wenig Wirkung auf die DNA-Ausbeute von S. mutans, hatten aber eine negative Wirkung auf die P.-gingivalis Ausbeute.
• BEISPIEL 19
• Anwesenheit von Nukleasen in P. gingivalis beobachtet mit Agarosegel-Elektrophorese
• Die Anwesenheit von Nukleasen in P. gingivalis wurde überprüft, wobei 1% w/v Agarosegel-Elektrophorese verwendet wurde. Exogene gereinigte P.-gingivalis-DNA wurde für 30 min bei 50°C mit jeder der DNA-Isolierungsfraktionen inkubiert, welche in 5A gezeigt werden, und nach dem Laden auf einem 1%igen w/v Agarosegel konnte intakte DNA nur nach Kochen der gefrorenen Kultur detektiert werden, wie in 5A zu sehen.
• BEISPIEL 20
• Die kritische Rolle von Nukleasen und die Wirkung von ZnCl₂ auf die Quantifizierung in einzelnen und gemischten bakteriellen Populationen
• DNA, welche aus P. gingivalis in der Abwesenheit oder Anwesenheit von E. coli oder S. mutans isoliert wurde, wurde im ABI-PRISM-7700-Sequenzdetektionssystem auf DNA-Quantifizierung überprüft, wobei der universelle Primer-Sondensatz und eine geeignete Verdünnung der Probe verwendet wurde. Eine signifikante Verbesserung der DNA-Quantifizierung war in einzelnen und gemischten bakteriellen Populationen in Anwesenheit von 5 mM ZnCl₂ offensichtlich (6a, 6b).
• BEISPIEL 21
• Wirkung des Entfernen von ZnCl₂ und SDS auf die Quantifizierung bei Verwendung unverdünnter Proben
• Zum Eliminieren der Interferenz von ZnCl₂ und SDS in unverdünnten oder niedrig verdünnten Proben war es notwendig, den Nukleaseinhibitor bzw. das Zelllysemittel zu entfernen, bevor die DNA-Proben im ABI-PRISM-7700-Sequenzdetektionssystem analysiert wurden. Ein P.-gingivalis-Zellpellet resuspendiert in 10 mM Phosphatpuffer pH 6,7 enthaltend Lysozym und Mutanolysin (jeweils mit 1 mg/ml-Endkonzentration) und 5 mM ZnCl₂ wurde für 30 min bei 60°C inkubiert und dann mit 1% w/v SDS lysiert, bevor die DNA mit dem QIAamp-DNA-Mini-Kit gereinigt wurde. DNA-Quantifizierung konnte nicht in unverdünnten Proben durchgeführt werden. Dies wurde möglicherweise durch hohe Konzentrationen von ZnCl₂ in den unverdünnten Proben verursacht, welches mit der PCR-Reaktion interferieren könnte. Eine DNA-Reinigung, welche das QIAamp-Mini-Kit verwendete, erbrachte die in 7 gezeigte quantifizierte DNA-Menge.
• BEISPIEL 22
• Interne positive Kontrolle, welche das B.-tryoni-dsX-Geninsert im pGEM (eingetragene Marke) T-Easy-Vektorsystem verwendet
• Eine exogene interne positive Kontrolle für TaqMan (eingetragene Marke) wurde entworfen, welche mit dem ABI-PRISM-7700-Sequenzdetektionssystem zur Bestimmung der Effizienz der DNA-Ausbeute nach der Probenpräparation verwendet werden soll und zur Untersuchung der Wirkung von beliebigen PCR-Inhibitoren in der Reaktion. Der Vorwärtsprimer 5'GGAAGGTAAGTTGCATTTCAGCA3' [SEQ ID NO: 4], Rückwärtsprimer 5'GCGTACTTATCATGGTAAATTAAGTCAATT3' [SEQ ID NO: 5] und die fluorogene Sonde VIC-TCCCGTTACAAAATCGTGTTTACATCGTATACTCG [SEQ ID NO: 6] wurden auf Basis der veröffentlichten Sequenz des dsX-Gens von Bactrocerra tryoni (GenBank-Zugriffsnr. AF040077) entworfen, wobei die Primer-Express-Software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) verwendet wurde. Die Sondensequenz für diese interne positive Kontrolle (IPC-BT-PG) war mit dem fluoreszierenden Farbstoff VIC am 5'-Ende markiert, um die IPC (interne positive Kontrolle) von den speziespezifischen und universellen Sonden zu unterscheiden, welche mit dem fluoreszierenden Farbstoff FAM am 5'-Ende markiert waren.
• Das B.-tryoni-dsX-Geninsert in pGEM (eingetragene Marke) T-Easy wurde durch PCR bestätigt und erzeugte ein 89-bp-Amplikon wie es auf 2% w/v Agarosegel-Elektrophorese gesehen wurde. Das chimäre Plasmid gab ebenso ein fluoreszierendes Signal im ABI-PRISM-7700-Sequenzdetektionssystem, was eine interne Position der Sonde im Amplikon bestätigte (8).
• BEISPIEL 23
• Isolierung von P.-gingivalis-DNA in Anwesenheit von der internen positiven Kontrolle
• Das P.-gingivalis-Zellpellet (aus 250 μl Kultur zentrifugiert bei 14.000 × g für 2 min bei Raumtemperatur) wurde in 10 mM Phosphatpuffer pH 6,7 resuspendiert, welcher Lysozym und Mutanolysin (jeweils mit 1 mg/ml Endkonzentration), 5 mM ZnCl₂ und die interne positive Kontrolle (B.-tryoni-dsX Geninsert in pGEM (eingetragene Marke) T-Easy-Vektorsystem) enthielt, und wurde für 30 min bei 60°C inkubiert und dann mit 1% w/v SDS lysiert. Dieselbe Menge von Kulturpellet wurde ebenso in 10 mM Phosphatpuffer pH 6,7 resuspendiert, welcher die interne positive Kontrolle enthielt, und bei –20°C gefroren gehalten. Die gefrorene Probe wurde für 10 min gekocht. Nach Verdünnen der Probe wurde ein Aliquot in dem ABI-PRISM-7700-Sequenzdetektionssystem überprüft. Eine größere DNA-Menge (niedrigerer C_T-Wert) wurde für P. gingivalis und die interne positive Kontrolle geschätzt, wenn die Proben entweder gekocht oder in Phosphatpuffer isoliert wurden, welcher 5 mM ZnCl₂ enthält (wie in Tabelle 7 zu sehen), während P.-gingivalis-DNA und die interne positive Kontrolle abgebaut wurden (höherer C_T-Wert), wenn die Nukleasen in der Gefrier-getauten Probe aktiv waren, oder in 10 mM Phosphatpuffer. Die interne positive Kontrolle könnte deshalb zum Bestimmen der Effizienz der DNA-Ausbeute verwendet werden, welche der Probenpräparation folgt.
• BEISPIEL 24
• Validierung der Echtzeit-PCR-Schatzung von Porphyromonas gingivalis in einer paradontalen Plaqueprobe durch sequenzbasierte Identifizierung
• Durch Verwendung von Echtzeit-PCR wurde der Beitrag von Porphyromonas gingivalis im Vergleich zur gesamtbakteriellen Last einer paradontale Plaqueprobe aus einer erkrankten Stelle mit einem P.-gingivalis-spezifischen und einem universellen Primer-Sondensatz geschätzt.
• Die Erfinder verwendeten ein einzelnes universelles Primerpaar, um ein 466-bp-DNA-Fragment aus der DNA zu amplifizieren, welche aus einer erkrankten Stelle einer menschlichen paradontalen Plaqueprobe isoliert wurde. Die verwendeten Primer und Sonden sind in Tabelle 1 gegeben. Von den 57 analysierten Klonen wurden Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus, Prevotella tannerae, Rothia dentocariosa auf Speziesebene identifiziert, wobei Prevotella, Fusobakterien, Catonella, Clostridien, Desulfobulbus, Campylobacter, Capnocytophaga und Treponema auf Gattungsebene identifiziert wurden. Ein Überwiegen von P. gingivalis (29,8%) zusammen mit Fusobakterien (31,6%) gefolgt von B. forsythus (10,5%), Prevotella (7%) und Treponema (3,5%) ist bei der sequenzbasierten Identifizierung offensichtlich (Tabelle 14A). Alle anderen Spezies wurden durch einen Klon aus 57 analysierten Klonen repräsentiert. DNA, welche aus derselben Plaqueprobe isoliert wurde, wurde analysiert, wobei Echtzeit-PCR-Technologie verwendet wurde, um die Anzahl von P. gingivalis (wobei ein P.-gingivalis-Primer-Sondensatz, SEQ ID NOS: 7, 8 und 9 verwendet wurde) in Vergleich zur Gesamtlast (wobei ein universeller Primer-Sondensatz verwendet wurde) zu schätzen. P.-gingivalis-Zellen (1,4 × 10¹¹) gegen Gesamtlast (4,8 × 10¹¹) in dieser Plaqueprobe aus einer erkrankten Stelle zeigte, dass P. gingivalis 29% der Gesamtlast dargestellte (Tabelle 14B). Dieses Beispiel zeigt den Wert der universellen Primer, um mikrobielle 16S-rDNA für eine nachfolgende Analyse durch Sequenzieren zu fangen. Diese Daten liegen sehr nahe an den Daten der sequenzbasierten Identifizierung und validieren die beiden Ergebnisse. Deshalb hilft die Verwendung von Echtzeit-PCR-Technologie beim Schätzen der Last von P. gingivalis in einer paradontalen Plaqueprobe bei einer klinischen Behandlung außerordentlich.
• BEISPIEL 25
• Inhibition von Nukleaseaktivität und Entfernen von PCR-Inhibitoren verbessert die Effizienz der Bakterienquantifizierung durch Echtzeit-PCR
• Verfahren zum Extrahieren und Stabilisieren von DNA aus Vertretern einer gemischten oralen Flora und umfassend die mikroaerophilen grampositiven Organismen Streptococcus mutans, Lactobacillus acidophilus und Actinomyces israelii, das grampositive anaerobe Peptostreptococcus micros und die gramnegativen Anaerobier Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis und Prevotella melaninogenica wurden zur Quantifizierung durch Verwendung von Echtzeit-PCR ausgewertet.
• Während DNA leicht aus den gramnegativen Organismen und dem anaeroben P. micros extrahiert wurde, benötigten mikroaerophile grampositive Spezies einen Verdau bei 56°C mit einer Kombination von Lysozym, Mutanolysin und Proteinase K. Es wurde angemerkt, dass P. gingivalis ein wirksames breites Spektrum von DNAase-Aktivität freisetzte, welche einen extensiven Abbau von DNA aus allen Testspezies als auch von einer internen positiven Kontrolle bewirkte, welche von der Taufliege B. tyroni abgeleitet wurde. Inhibitoren von DNAsen waren differenziell wirksam und gegenüber den Hydrolasen, welche für eine DNA-Freisetzung aus grampositiven Organismen notwendig waren, unterschiedlich inhibitorisch wirksam. Ein Konsensusverfahren für diese disparate Gruppe von Organismen war es, mit dem Nukleaseinhibitor Diethylpyrocarbonat (DEPC) vorzubehandeln, mit Hydrolasen zu verdauen und Natriumdodecylsulfat (SDS) hinzuzugeben, um DNA von den gramnegativen und grampositiven Organismen frei zu setzen. Eine nachfolgende Reinigung der DNA zum Entfernen des hinzugegebenen DEPC und SDS und anderen möglichen PCR-Inhibitoren war ebenso notwendig, um die DNA und folglich die Bakterienzahl in einer Probe genau zu quantifizieren. Die Effizienz der DNA-Ausbeute, welche der Probenpräparation folgte, wurde durch Einschließen einer bekannten Menge von einer exogenen DNA (von B. tyroni) beurteilt, welche in der Probe als eine interne positive Kontrolle wirkte. Dieser Standard stellt ebenso eine Kontrolle für andere Kombinationen von Mikroorganismen bereit, wobei unerkannte Nukleaseaktivitäten gegenüber DEPC resistent sein können.
• Die folgenden Verfahren und Materialien wurden verwendet.
• (I) Konstruktion einer internen positiven Kontrolle für eine Echtzeit-PCR
• Ein chimäres Plasmid wurde konstruiert, um als eine interne positive Kontrolle zu wirken. Der Teil der DNA im chimären Plasmid, welcher durch Echtzeit-PCR detektiert wurde, stammte von der Queensland-Taufliege Bactrocerra tryoni, welche aus gefrorenen (–80°C) Vorräten beim Fruit Fly Research Center [Taufliegenforschungszentrum], Universität Sydney, NSW, Australien erhalten wurde. Genomische DNA wurde aus 30 Fliegen extrahiert (17), und die Region zwischen den Nukleotiden 37 und 126 des dsX-Gens (GenBank-Zugriffsnr. AF040077) wurde durch PCR amplifiziert (FTS-320 Thermal Sequencer, Corbett Research, NSW, Australien), wobei 4 μg B.-tryoni-DNA, 100 nM von jedem der Vorwärts- und Rückwärtsprimer, welche für eine Echtzeit-PCR-Detektion von diesem DNA-Segment entworfen wurden (Tabelle 1), 200 μM von jedem Desoxyribonukleotidtriphosphat, 3,5 mM MgCl₂ und 2,5 U AmpliTaq Gold in 1 × PCR-Puffer (Applied Biosystems) verwendet wurde. Die PCR-Reaktion wurde in einem Volumen von 50 μl bei 95°C für 10 min ausgeführt, gefolgt von 40 Zyklen bei 95°C für 15 s und 60°C für 1 min. Das PCR-Amplikon (89 bp) wurde aus dem gesamten 50-μl-Reaktionsvolumen gereinigt, wobei das Wizard (eingetragene Marke) PCR-Preps-DNA-Reinigungssystem (Promega Corporation, Madison, Wi) verwendet wurde. Das gereinigte PCR-Produkt wurde in den pGEM (eingetragene Marke) T-Easy-Vektor (Promega Corporation) gemäß den Instruktionen des Herstellers kloniert. Kompetente E. coli XL blue 1 wurden durch Elektroporation (2,45 V) mit dem chimären Plasmid transformiert, wobei ein Bio-Rad Gen-Pulser verwendet wurde. Rekombinanten wurden auf LB-Agarplatten selektiert, welche 100 μg Ampicillin pro ml, 1 mM Isopropyl-β-D-I-thiogalactosid und 100 μg 5-Brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal) pro ml enthielten. Die chimären Plasmide, welche das 89-bp-PCR-Amplikon für das dsX-Gen trugen, wurden isoliert, wobei das Wizard (eingetragene Marke) Plus-SV-Minipreps-DNA-Reinigungsystem (Promega Corporation) verwendet wurde, und wurden IPC-BT genannt.
• (ii) Entwerfen von Primer-Sondensätzen
• Für die speziespezifische Quantifizierung von Porphyromonas gingivalis wurde ein Primer-Sondensatz anhand der 16S-rDNA Datenbank entworfen, auf welche über die Australian National Genomic Information Service [Australischer nationaler genomischer Informationsdienst] (ANGIS, http://www.angis.org.au) zugegriffen wurde. Der P.-gingivalis-speziespezifische Primer-Sondensatz (SEQ ID NOS: 7 und 8) (Tabelle 1) erzeugte ein 150-bp-Amplikon, welches die Nukleotide 589 bis 739 in der P.-gingivalis-16S-rDNA-Sequenz (GenBank-Zugriffsnr. 116492) mit einer internen Stelle für die doppelmarkierte fluorogene Sonde (SEQ ID NO: 9) überspannt. Der Primer-Sondensatz erfüllt die von Applied Biosystems (Foster City, Ca.) empfohlenen Richtlinien.
• Der Entwurf universeller Primer-Sonde war wie oben angegeben. Der universelle Primer-Sondensatz (Tabelle 1) erzeugte ein 466-bp-Amplikon, welches die Reste 331 bis 797 auf dem E.-coli-16Sr-RNA-Gen (GenBank-Zugriffsnr. ECAT1177T) mit einer internen Stelle für die doppelmarkierte fluorogene Sonde überspannt.
• Ein Primer-Sondensatz wurde ebenso entworfen, um die Detektion der exogen hinzugegebenen internen positive Kontrolle IPC-BT zu ermöglichen. Der Primer-Sondensatz (Tabelle 1) wurde aufgrund der Sequenz vom dsX-Gen von B. tryoni entworfen, wobei die Primer-Expression-Software (Applied Biosystems) verwendet wurde. Der Primer-Sondensatz amplifizierte eine 89-bp-Region, welche die Nukleotide 37 bis 126 auf der dsX-Gen überspannt. Die Sondensequenz für die IPC-BT war mit dem fluoreszierenden Reporterfarbstoff VIC am 5'-Ende markiert, um es von den speziespezifischen und universellen Sonden zu unterscheiden, welche am 5'-Ende mit dem fluoreszierenden Reporterfarbstoff FAM (Tabelle 1) markiert waren.
• (iii) DNA-Isolierungsverfahren
• Verschiedene Verfahren zum Freisetzen von DNA aus lysierenden Bakterien wurden beurteilt. Diese schlossen ein:
• (a) Beschallung:
• P. gingivalis oder S. mutans (~ 10⁹ Zellen) wurden durch Zentrifugation geerntet (14.000 g, 2 min, 18–20°C) und in 200 μl 10 mM Phosphatpuffer pH 6,7 resuspendiert, welcher 50 mg Glas-Beads (0,10–0,11 mm Durchmesser) vor der Beschallung für 5, 10 oder 15 min bei 75 W enthielt, wobei ein Branson-Ultraschallgerät (Modell 250, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, Ct) verwendet wurde. Aliquots (50 μl), welche nach jeden Zeitintervall gesammelt und 1000-fach verdünnt wurden, wurden für eine Echtzeit-PCR verwendet. Die DNA-Quantifizierung machte Gebrauch vom universellen Primer-Sondensatz (Tabelle 1) und basierte auf einem Standardgraphen, welcher durch bekannte Mengen von E.-coli-DNA wie früher beschrieben erzeugt wurde.
• (b) Gefrier-Tauverfahren:
• P. gingivalis oder S. mutans (~10⁹ Zellen) wurden durch Zentrifugation geerntet (14.000 g, 2 min, 18–20°C) und in 200 μl 10 mM Phosphatpuffer pH 6,7 resuspendiert und bei –20°C gefroren. Nach Tauen wurde die Probe 100-fach verdünnt, und ein 5-μl-Aliquot wurde für eine Echtzeit-PCR verwendet. Die DNA-Quantifizierung machte Gebrauch vom universellen Primer-Sondensatz wie in (a) oben beschrieben.
• (c) Gefrier-Kochverfahren:
• P.-gingivalis- oder S.-mutans-Zellen (~10⁹ Zellen) wurden geerntet, resuspendiert und bei –20°C (2–16 h) gefroren, wie oben beschrieben, bevor sie für 10 min gekocht wurden. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur (18–20°C) wurden die Proben 100-fach verdünnt, und 5-μl-Aliquots wurden für eine Echtzeit-PCR verwendet, wobei der universelle Primer-Sondensatz wie in (a) beschrieben verwendet wurde.
• (d) Enzymatisches Verfahren:
• P. gingivalis allein oder gemischt entweder mit S. mutans oder E. coli (–2,5 × 10⁸ von jeder Bakterienspezies) wurden durch Zentrifugation geerntet (14.000 g, 2 min, 18–20°C) und resuspendiert entweder in 45 μl (für P.-gingivalis-Zellen allein) oder 90 μl (für P. gingivalis in Kombination mit S.-mutans- oder E.-coli- Zellen) 10 mM Phosphatpuffer pH 6,7, welcher 1 mg Lysozym mM und 1 mg Mutanolysin ml^–1 enthielt. Nach Inkubation für 30 min bei 60°C wurden die Bakterien in Anwesenheit von 1% w/v SDS lysiert, bevor sie 100-fach verdünnt wurden, und 5-μl-Aliquots wurden für eine Echtzeit-PCR verwendet. Die DNA-Quantifizierung machte Gebrauch vom universellen Primer-Sondensatz wie in (a) beschrieben.
• (e) ZnCl₂-Verfahren
• P. gingivalis allein oder gemischt entweder mit S. mutans oder E. coli (~2,5 × 10⁸ von jeder Bakterienspezies) wurden geerntet und wie in (d) beschrieben in Anwesenheit von 5 mM ZnCl₂ resuspendiert Nach Inkubation für 30 min bei 60°C wurden die Zellen in Anwesenheit von 1% w/v SDS lysiert, bevor sie 100-fach verdünnt wurden, und 5-μl-Aliquots wurden für eine Echtzeit-PCR verwendet. Die DNA-Quantifizierung machte Gebrauch vom universellen Primer-Sondensatz wie in (a) beschrieben.
• (f) Isolierung von DNA, welche ATL-Puffer vom QIAamp-DNA-MiniKit verwendet:
• Bakterielle Kulturen (~5 × 10⁸ von jeder Bakterienspezies) wurden bei 13000 × rpm für 5 min in einer Eifuge Pico (Heraeus) pelletiert. Zellpellets wurden in 180 μl ATL-Puffer (Qiagen) und 400 μg Proteinase K (Qiagen) resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden bei 56°C für 40 min inkubiert, wobei periodisch alle 10 min für 10 s gevortextend wurde. RNase (200 μg) wurde hinzugegeben, gefolgt von einer weiteren Inkubation für 10 min bei 37°C. Die DNA wurde gereinigt, wobei das QIAamp-DNA-Mini-Kit (Qiagen) gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet wurde.
• (g) Isolierung von DNA durch ein Einschritt-DEPC-Verfahren:
• Bakterielle Kulturen (~5 × 10⁸ von jeder Bakterienspezies) wurden bei 13000 × rpm für 5 min in einer Eifuge Pico (Heraeus) pelletiert. Das Zellpellet wurde in 200 μl Puffer resuspendiert, welcher 10 mM Natriumphosphat pH 6,7, 20 mM DEPC, Lysozym (5 mg pro ml [Endkonz.]), Mutanolysin (1000 U pro 0,48 mg pro ml [Endkonz.]) und 400 μg Proteinase K (Qiagen) enthielt. Die Zellsuspensionen wurden bei 56°C für 40 min inkubiert, wobei periodisch alle 10 min für 10 s. gevortextend wurde. Die Zellen wurden mit SDS lysiert (1% w/v [Endkonz.]). RNase (200 μg) wurde hinzugegeben, gefolgt von einer weiteren Inkubation für 10 min bei 37°C. Die DNA wurde gereinigt, wobei das QIAamp-DNA-Mini-Kit (Qiagen) gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet wurde.
• (h) Isolierung von DNA in gemischten bakteriellen Kulturen durch ein Einschritt-DEPC-Verfahren:
• Bakterielle Kulturen (~5 × 10⁸ von jeder Bakterienspezies) wurden bei 13000 × rpm für 5 min in einer Eifuge Pico (Heraeus) pelletiert. Die Zellpellets wurde in 200 μl Puffer resuspendiert, welcher 10 mM Natriumphosphat pH 6,7, 20 mM DEPC, Lysozym (5 mg Protein pro ml [Endkonz.]), Mutanolysin (1000 U pro 0,48 mg pro ml [Endkonz.]), 400 μg Proteinase K (Qiagen) enthielt. Die Zellsuspensionen wurden bei 56°C für 40 min inkubiert, wobei periodisch alle 10 min für 10 s gevortextend wurde. Die Zellen wurden mit SDS lysiert (1% w/v [Endkonz.]). RNase (200 μg) wurde hinzugegeben, gefolgt von einer weiteren Inkubation für 10 min bei 37°C. Die DNA wurde gereinigt, wobei das QIAamp-DNA-Mini-Kit (Qiagen) gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet wurde.
• (i) Isolierung von DNA durch ein Zweischritt-DEPC-Verfahren:
• Bakterielle Kulturen (~ 5 × 10⁸ von jeder Bakterienspezies) wurden bei 13000 × rpm für 5 min in einer Eifuge Pico (Heraeus) pelletiert. Die Zellpellets wurde in 144 μl Puffer (10 mM Natriumphosphat pH 6,7) enthaltend 27,8 mM DEPC resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden für 10 min auf Eis inkubiert oder im Pulsmodus oder kontinuierlichem Modus für 6 min bei 75 W beschallt, wobei ein Branson-Ultraschallgerät (Modell 250, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, Ct) verwendet wurde, gefolgt von Hinzugeben von 56 μl Enzymmischung: [Lysozym (5 mg Protein pro ml [Endkonz.]), Mutanolysin (1000 U pro 0,48 mg Protein pro ml [Endkonz.]) und enthaltend 400 μg Proteinase K (Qiagen)]. Die Zellsuspensionen wurden bei 56°C für 40 min inkubiert, wobei periodisch alle 10 min für 10 s gevortextend wurde. Die Zellen wurden mit SDS lysiert (1% w/v [Endkonz.]). RNase (200 μg) wurde hinzugegeben, gefolgt von einer weiteren Inkubation für 10 min bei 37°C. Die DNA wurde gereinigt, wobei das QIAamp-DNA-Mini-Kit (Qiagen) gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet wurde.
• (iv) Detektion von Nukleaseaktivität
• Exogene P.-gingivalis-DNA (300–400 ng) gereinigt unter Verwendung von QIAmp-DNA-Mini-Kits (siehe (f) oben) wurde vor Inkubation bei 50°C für 30 min zu Proben hinzugegeben, welche 300–400 ng DNA enthielten, welche durch Lysieren von Bakterien gemäß allen Verfahren, welche in (a)–(c) oben beschrieben wurden, hergestellt wurde. Exogene DNA von Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella melaninogenica und Peptostreptococcus micros und Escherichia coli (hergestellt unter Verwendung von ATL-Puffer und QIAmp-DNA-Mini-Kit) und Streptococcus mutans (hergestellt unter Verwendung eines Einschritt-DEPC-Verfahren) wurden für 30 min bei 50°C mit P.-gingivalis-Gefrier-Tau-Extrakt (Verfahren beschrieben in (b)) inkubiert. Der Grad des DNA-Abbaus wurde nach einer Elektrophorese von Proben auf 1% w/v Agarosegelen visuell bestimmt.
• (v) ZnCl2 als ein PCR-Inhibitor
• Um zu bestimmen, ob ZnCl₂ als ein Inhibitor von Echtzeit-PCR wirkte, wurde DNA aus zwei Sätzen von doppelten Proben von P. gingivalis extrahiert (~5 × 10⁸ und ~5 × 10⁷ Zellen), wobei das Protokoll beschrieben in (e) oben verwendet wurde. Eine Probe von jedem Satz von doppelten DNA-Proben wurde gereinigt, wobei ein QIAmp-DNA-Mini-Kit (QIAGEN) verwendet wurde. Alle Proben wurden danach verdünnt, so dass sie theoretisch dieselbe DNA-Menge enthalten, bevor sie einer Analyse durch Echtzeit-PCR unterzogen wurden, wobei der universelle Primer-Sondensatz verwendet wurde.
• (vi) Isolierung von P.-gingivalis-DNA in Anwesenheit der internen positiven Kontrolle
• DNA wurde aus P. gingivalis (~2,5 × 10⁸ Zellen) in Anwesenheit von 1 μl IPC-BT extrahiert, wobei das Protokoll beschrieben in (e) oben verwendet wurde. Nach einer geeignete Verdünnung wurde die Menge von P.-gingivalis-DNA und IPC-BT-DNA bestimmt, wobei das spezifische P.-gingivalis- bzw. IPC-BT-Primer-Sondensatz verwendet wurde.
• (vii) Bedingungen für Echtzeit-PCR
• Amplifikation und Detektion von DNA durch Echtzeit-PCR machte von dem ABI-PRISM-7700-Sequenzdetektionssystem (Applied Biosystems, Foster City, Ca.) Gebrauch, wobei ein 96-Lochplatten-Format verwendet wurde. Die PCR wurde doppelt in einem 25-μl-Reaktionsvolumen ausgeführt, welches 300 nM von jedem der universellen Primer und 100 nM der universellen Sonde oder 100 nM von jedem der Primer und der Sonde für die interne positive Kontrolle (Tabelle 1) enthielt, wobei das TaqMan (eingetragene Marke) PCR-Kernreagenzien-Kit (Applied Biosystems) verwendet wurde. Die Reaktionsbedingungen für DNA-Amplifikation waren 95°C für 10 min und 40 Zyklen von 95°C für 15 s und 60°C für 1 min. Die Daten wurde analysiert, wobei die Sequenzdetektionssoftware Version 1.6.3 geliefert von Applied Biosystems verwendet wurde.
• (viii) Lebendzähler
• P. gingivalis wurde in einer CDC-Brühe unter anaeroben Bedingungen bei 37°C für vier Tage wachsen gelassen, und S. mutans wurde 16–18 h in BHI-Brühe bei 37°C unter 5% CO₂ wachsen gelassen. Eine P.-gingivalis-Kultur (100 μl) verdünnt in CDC-Brühe bis auf eine Verdünnung von 10^–6 wurde auf CDC-Agar platiert und unter anaeroben Bedingungen bei 37°C für vier Tage inkubiert, und Kolonien wurden gezählt. Eine S.-mutans-Kultur (100 μl) verdünnt in BHI-Brühe bis auf eine Verdünnung von 10^–6 wurde auf BHI-Agar platiert und unter 5% CO₂ bei 37°C für 16–18 h inkubiert, und Kolonien wurden gezählt.
• Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten.
• (1) Herstellung von bakteriellen Zellen für die Isolierung von DNA
• Um die gesamte bakterielle DNA zu erhalten, wurden die bakteriellen Zellsuspensionen beschallt, um die DNA für die Quantifizierung freizusetzen, wobei eine Echtzeit-PCR verwendet wurde. DNA wurde wirksamer freigesetzt, wenn die Zellen unter Verwendung von Glas-Beads beschallt wurden. Die Wirkung der Beschallung wurde mit DNA-Isolierungen, welche Gefrier-Tau- und Gefrier-Kochverfahren verwenden, verglichen. Das Gefrier-Tauverfahren setzte die wenigste DNA aus P.-gingivalis-Zellen als auch aus S.-mutans-Zellen frei, während das Gefrier-Kochverfahren die meiste DNA aus P.-gingivalis-Zellen freisetzte, im Gegensatz zu S.-mutans-Zellen. Dies zeigte, dass Kochen der Proben ein wirksames Verfahren zum Freisetzen von DNA aus gramnegativen Bakterien sein könnte, nicht aber aus grampositive Bakterien. Auf der anderen Seite hatte die Erhöhung der Beschallungszeit von 5 auf 15 Minuten eine schädliche Wirkung auf der Quantifizierung von P.-gingivalis-DNA mit keiner signifikanten Veränderung bei der Quantifizierung von S.-mutans-DNA.
• (II) Anwesenheit von Nukleasen in P. gingivalis
• Agarosegel-Elektrophorese (1% w/v) bestätigte die Anwesenheit von Nukleasen in P. gin givalis. Exogene P.-gingivalis-DNA wurde vollständig abgebaut und konnte nicht gefunden werden, wenn sie für 30 min bei 50°C in Anwesenheit von einer gefrier-getauten P.-gingivalis-Kultur inkubiert wurde. Jedoch wurde unter denselben Bedingungen intakte DNA nach Kochen der gefrorenen P.-gingivalis-Kultur detektiert. Ein Abbau von einer exogenen P.-gingivalis-DNA in Anwesenheit einer gefrier-getauten P.-gingivalis-Kultur konnte durch Hinzugeben von 5 mM ZnCl₂ vor Inkubieren der Proben für 30 min bei 50°C verhindert werden. Exogene DNA von Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella melaninogenica und Peptostreptococcus micros und Streptococcus mutans wurde in Anwesenheit von einer gefrier-getauten P.-gingivalis-Kultur vollständig abgebaut ( 5B).
• (III) Schutz gegen Nukleaseabbau durch 5 mM ZnCl₂ unter Verwendung des ABI-PRISM-Sequenzdetektionssystems (ABI-SDS).
• DNA, welche aus P.-gingivalis-Zellen in Anwesenheit von E.-coli-Zellen oder S.-mutans-Zellen isoliert wurde. wurde auf dem ABI-SDS quantifiziert, wobei der universelle Primer-Sondensatz verwendet wurde. Eine signifikante Erhöhung der quantifizierten DNA-Menge war für einzelne und gemischte bakterielle Populationen offensichtlich, wenn die Proben in Anwesenheit von 5 mM ZnCl₂ hergestellt wurden.
• (IV) Wirkung von ZnCl2 als ein PCR-Inhibitor
• Wenn DNA in Anwesenheit von 5 mM ZnCl₂ isoliert wurde und 100-fach verdünnt wurde, bevor 5 μl auf ABI-SDS verwendet wurde, inhibierte ZnCl₂ die PCR-Reaktion nicht. Wie in den Ergebnissen für die unvermischte Kultur zu sehen war, verursachte eine Endkonzentration von ZnCl₂ bis 0,005 mM in der PCR-Reaktion eine minimale Interferenz mit der Amplifikationsreaktion, und es gab keine signifikante Veränderung in der quantifizierten DNA-Menge vor und nach der Verwendung des QIAmp-DNA-Mini-Kits. Jedoch führte eine 10-fache Verdünnung der DNA (wie im Falle von einer 10-fach verdünnten Kultur) vor der Verwendung von 5 μl auf ABI-SDS zu einer Endkonzentration von 0,05 mM ZnCl₂ in der PCR-Reaktion, was die Amplifikation von P.-gingivalis-DNA verhinderte.
• (V) Die interne positive Kontrolle (IPC-BT)
• Das Hinzugeben eines chimären Plasmids, welches einzigartige nichtbakterielle DNA enthielt, zu gemischten Bakterienproben erlaubte sowohl die Bestimmung der Effizienz der DNA-Ausbeute nach der Probenpräparation als auch die Detektion von möglichen PCR-Inhibitoren in der Reaktionsmischung während einer Echtzeit-PCR. Ein B.-tryoni-dsX-Geninsert in pGEM (eingetragene Marke) T-Easy wurde durch PCR bestätigt, welches ein 89-bp-Amplikon erzeugte, welches auf 2% w/v Agarosegel-Elektrophorese visualisiert wurde.
• (VI) Isolierung von P.-gingivalis-DNA in Anwesenheit von IPC-BT
• Aufgrund einer Beschränkung der Software konnte der Standardgraph, welcher durch FAM-markierte Sonden (P. gingivalis oder universell) erzeugt wurde, nicht zum Quantifizieren von IPC-BT verwendet werden, da der Reporterfarbstoff auf der Sonde zur Detektion von IPC-BT VIC-markiert ist. Dies erforderte, dass die Ergebnisse als C_T-Werte ausgedrückt wurden. Eine Isolierung von P.-gingivalis-DNA in Anwesenheit der internen positiven Kontrolle und die Wirkung von Nukleasen auf die Quantifizierung (ausgedrückt als C_T-Werte) wird in Tabelle 8 gezeigt. P.-gingivalis-DNA und IPC-BT wurden gleichzeitig durch die Wirkung der bakteriellen Nukleasen abgebaut, welche in der Probe vorhanden war, wenn DNA durch ein Gefrier-Tauverfahren isoliert wurde, oder in Abwesenheit von ZnCl₂ (höherer CT-Wert). Auf der anderen Seite schützte Isolierung von DNA durch das Gefrier-Kochverfahren oder das ZnCl₂-Verfahren gegen Abbau von DNA durch die Nukleasen (niedrigerer CT-Wert). Multiplexen derselben Proben zeigte keine signifikanten Variation in den Gehalten von P.-gingivalis-DNA und IPC-BT ausgedrückt als C_T-Werte (Tabelle 8).
• (VII) Isolierung von DNA unter Verwendung von ATL-Puffer aus dem QIAamp-DNA-Mini-Kit
• ATL-Puffer aus dem QIAamp-DNA-Mini-Kit konnte DNA von den gramnegativen Bakterien Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella melaninogenica und dem anaeroben grampositiven Bakterium Peptostreptococcus micros gewinnen. Jedoch war die DNA-Ausbeute von Streptococcus mutans, Actinomyces israelii und Lactobacillus acidophilus fast vernachlässigbar (Tabelle 9).
• (VIII) Isolierung von DNA durch ein Einschritt-DEPC-Verfahren
• Wie gesehen werden kann (Tabelle 10), wird Porphyromonas-gingivalis-DNA in Abwesenheit von DEPC signifikant abgebaut. Die Ausbeute von DNA von Streptococcus mutans verbesserte sich um mehr als 10-fach aufgrund der Zellwandbehandlung. Jedoch sank die DNA-Menge, welche von Peptostreptococcus micros gewonnen wurde, etwa 5-fach in Anwesenheit von DEPC. Die DNA-Ausbeute von den verbleibenen Bakterien in dieser Gruppe verblieb vergleichsweise unbeeinflusst.
• (IX) Vergleich von einem Lebendzähler von P.-gingivalis- und S.-mutans-Zellen basierend auf Isolierung durch ein Einschritt-DEPC-Verfahren
• Die Wirksamkeit der DNA-Gewinnung durch das ATL-Verfahren und dem Einschritt-DEPC-Verfahren und der Zahl der P.-gingivalis-Zellen berechnet auf Basis dieser Werte war vergleichbar. Jedoch war der Lebendzähler 10-fach kleiner als die relative Anzahl der Zellen geschätzt auf Basis einer Echtzeit-PCR. Für S. mutans war die Zahl der lebenden Zellen pro ml mit der Zahl der Zellen pro ml vergleichbar, welche auf Basis von Echtzeit-PCR geschätzt wurde (Tabelle 11).
• (X) Isolation von DNA aus gemischten bakteriellen Kulturen durch ein Einschritt-DEPC-Verfahren
• Bei Abwesenheit von DEPC wurde in gemischten Kulturen eine niedrigere Ausbeute von DNA verglichen mit der Anwesenheit von DEPC während der DNA-Isolation (Tabelle 12) beobachtet.
• (XI) Isolation von DNA durch ein Zweischritt-DEPC-Verfahren
• Eine Inkubation von bakteriellen Suspension in Anwesenheit von DEPC vor einer Zellwandbehandlung mit Enzymen verbessert die Ausbeute von DNA von Peptostreptococcus micros (vergleiche die Daten in Tabelle 10 mit denen in Tabelle 13). Eine Beschallung mit einem Puls von 6 min (im Gegensatz zu einer kontinuierlichen Beschallung) verbesserte die Ausbeute von A.-israelii-DNA dreifach, und die DNA-Menge, welche von allen anderen Bakterien gewonnen wurde, war vergleichbar (vergleiche die Daten in Tabelle 10 mit denen in Tabelle 13).
• BEISPIEL 26
• Sequenzbasierte Identifizierung von Bakterien aus der dentalen Plaqueflora
• Die vorliegende Erfindung involviert die Kultur von Bakterien aus dentalen Plaques und Bestimmen, dass diese leicht durch Standard-Kulturtechniken identifiziert werden könnten. DNA wurde durch das Zweischritt-DEPC-Verfahren isoliert und einer PCR unterzogen, wobei die universellen Primer verwendet wurden. Das amplifizierte Produkt wurde isoliert und sequenziert und einer BLAST/GAP-Analyse unterzogen.
• Insbesondere wurde DNA aus bakteriellen Kulturen isoliert, wobei das Zweischritt-DEPC-Verfahren verwendet wurde. Man ließ eine PCR-Reaktion laufen, wobei der universelle Primersatz verwendet wurde. Das amplifizierte 466-bp-Produkt wurde gereinigt und sequenziert, wobei der universelle Primersatz verwendet wurde. Die DNA-Sequenz (431 bp für 4-2, 400 bp für 2-2-1 and 1-2-1, 386 bp für 6-5 und 10-34 und 382 bp für 4-2-1) wurde mit BLAST untersucht, wobei die NR-Nukleindatenbank über WebANGIS verwendet wurde. Bakterielle Sequenzen mit hohem Score wurden dem GAP-Programm unterzogen, um die % Ähnlichkeit und % Identität zu bestätigen. Die Identifizierung der Kultur basierte auf mehr als 98,5–99% identischen Sequenzen (wie durch die Identifikationsnummer spezifiziert), wobei die Amplikonlänge für jede Kultur wie angegeben verwendet wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 15 gezeigt. Weiterhin wird die Isolierung von Streptococcus- und Actinomyces-DNA in den 9A und 9B gezeigt.
• Der Fachmann wird anerkennen, dass die hierin beschriebene Erfindung anders als hierin spezifisch beschrieben variiert und modifiziert werden kann. Es versteht sich, dass die Erfindung alle derartigen Variationen und Modifikationen einschließt. Die Erfindung schließt ebenso alle Schritte, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen ein, auf welche in dieser Beschreibung Bezug genommen oder hingewiesen wurde, einzeln oder gemeinschaftlich, und alle Kombinationen von zwei oder mehr der genannten Schritte oder Merkmale. TABELLE 1 Primer und Sonden

  
• 6-FAM:6-Carboxyfluorescin
• TAMRA: 6-Carboxytetramethylrhodamin
• VIC: Farbstoff im Eigentum von Applied Biosystems




TABELLE 5 Spezifizierung von bakteriellen Zellzahlen durch einen Lebendzellzähler und Echtzeit-PCR.

Bakterienkultur	Zähler für lebende Zellen [Zellen (ml Kultur)–1]	Relative Schätzung der Zellzahlen durch Echtzeit-PCR ϯ [Zellen (ml Kultur)–1]
E. coli	6,5 × 108	6,7 × 108
P. aeruginosa	3,3 × 109	4,2 × 109
S. aureus	1,3 × 108	2,5 × 109
Gemischte Kultur⧧	1,5 × 109§	1,3 × 109

• * Die Daten sind das Mittel von Doppelbestimmungen. Variation zwischen Doppelwerten war ≤ 55,2%.
• ϯ Basierend auf dem Standardgraphen, welcher anhand von E.-coli-DNA erzeugt innerhalb des Bereichs von 238 fg-2,38 ng wurde. Der Mittelwert von Doppelbestimmungen für jeweils zwei DNA-Verdünnungen wird gezeigt.
• Variation zwischen Doppelwerten überstieg 3,0% nicht, außer für eine unterstrichene Verdünnung, wobei die Variation 8,8% betrug.
• ⧧ Die gemischte Kultur bestand aus gleichen Volumina von E.-coli-, P.-aeruginosa- und S.-aureus-Kulturen.
• § Geschätzt von den Lebendzellzahlen gemessen in jeder der drei Kulturen.
TABELLE 6 Echtzeit-PCR-Schätzung von anaeroben Bakterien in einem kariösen Dentin verglichen mit der Gesamtlast lebensfähiger Anaerobier*

Probe	Schätzung der gramnegativen Bakterien durch Echtzeit-PCR [Zellen(mg dentin)–1]	Lebende koloniebildende Einheiten [CFU(mg dentin)–1]	Verhältnis § [Zellen/CFU]
1	3,4 × 108	9,0 × 106	38
2	4,5 × 108	5,5 × 108	82
3	4,8 × 108	9,8 × 106	49
4	1,3 × 108	4,8 × 106	27
5	3,8 × 108	1,2 × 107	32
6	5,5 × 108	1,2 × 107	46
7	1,4 × 108	6,9 × 106	21
8	1,1 × 108	2,0 × 106	55
9	1,9 × 108	1,5 × 107	13
10	3,7 × 108	2,2 × 107	17
11	1,4 × 108	3,1 × 106	45
12	3,6 × 108	5,9 × 106	61
13	1,5 × 108	2,2 × 106	68
14	1,1 × 109	1,2 × 107	92
15	2,6 × 108	1,4 × 107	19
16	25 × 108	1,5 × 107	17
17	28 × 108	8,2 × 106
18	65 × 108	1,6 × 107
19	2,5 × 108	5,6 × 106
20	67 × 108	3,7 × 107

• * Das Verfahrens zur DNA-Extraktion lysiert anaerobe gramnegative und grampositive Bakterien, aber keine fakultativen grampositiven Bakterien.
• ϯ Basierend auf einem Standardgraphen, welcher anhand von P.-melaninogenica-DNA erzeugt innerhalb des Bereichs von 82,9 fg-8,29 ng wurde, wobei 2,36 fg P.-melaninogenica-DNA eine Zelle repräsentieren. Die Daten sind das Mittel von Dreifachbestimmungen. Der Standardabweichung von den Mittelwerten variiert um < 1,0%, außer für die unterstrichen, worin die Variation im Bereich von 1,7–4,4% liegt.
• ⧧ Die Daten sind das Mittel von Doppelbestimmungen. Variation zwischen Doppelwerten betrug < 10,0%.
• § Das Verhältnis repräsentiert den n-fachen Anstieg bei den anaeroben Bakterien, welche durch Echtzeit-PCR über dem Gesamt-Kolonienzähler detektiert werden, welcher fakultative grampositive Bakterien einschließt.
TABELLE 7

Probenbedingungen	CT-Wert P.-gingivalis-DNA	CT-Wert Interne positive Kontrolle
Gefrieren/Tauen	24	26,2
Gefrieren/Kochen	16	16,6
Enzymatisch	21,5	20,4
Enzymatisch + 5 mM ZnCl2 10 mM Phosphat + 5 mM ZnCl2	16,5	17,2

TABELLE 8 Isolierung von P.-gingivalis-DNA in Anwesenheit von einer internen positiven Kontrolle (IPC-BT)^a

	CT b-Wert (FAM)c		CT b-Wert (VIC)d
DNA-Isolations-verfahren	P.-gingivalis-DNA	Multiplexe	IPC-BT-DNA	Multiplexe
Gefrieren/Tauen	23,52	22,6	27,6	27,6
Gefieren/Kochen	16,3	16,6	16,3	15,9
Enzymatisch	20,9	19,8	21,6	21,9
Enzymatisch + ZnCl2	16,05	15,5	16,8	16

• ^a Eingabewert der internen positiven Kontrolle (IPC-BT) lag bei C_T: 16
• ^b Schwellenzyklus: Höhere C_T-Werte zeigen eine niedrige DNA-Menge an und niedrigere C_T zeigen eine hohe DNA-Menge an
• ^c Nur Reporterfarbstoff FAM wurde gelesen
• ^d Nur Reporterfarbstoff VIC wurde gelesen
• ^e Dasselbe PCR-Reaktionsloch enthielt die Primer- und Sondensätze für P. gingivalis als auch IPC-BT
TABELLE 9 Schätzung von DNA nach einer Extraktion in ATL-Puffer aus dem QIAmp-DNA-Mini-Kit (Echtzeit-PCR-Quantifizierung)

Bakterien	DNA-Menge (pg)
Fusobacterium nucleatum	507
Porphyromonas endodontalis	251
Porphyromonas gin givalis	921
Prevotella melaninogenica	270
Peptostreptococcus micros	83,8
Streptococcus mutans	41,2
Lactobacillus acidophilus	25,0
Actinomyces israelii	0,269

TABELLE 10 Schätzung von DNA nach einem Einschritt-DEPC-Verfahren (Echtzeit-PCR-Quantifizierung)

Bakterien	DNA-Menge (pg)
	ohne DEPC	mit DEPC
Fusobacterium nucleatum	457	295
Porphyromonas endodontalis	255	193
Porphyromonas gingivalis	8,59	371
Prevotella melaninogenica	114	124
Peptostreptococcus micros	63,9	18,2
Streptococcus mutans	708	550
Lactobacillus acidophilus	115	76,7
Actinomyces israelii	1,83	1,53

TABELLE 11 Vergleich von einem Lebendzähler von P.-gingivalis- und S.-mutans-Zellen mit einer relativen Menge von Zellen, welche durch Echtzeit-PCR geschätzt wurden, und einer gerechneten Zellzahl, welche auf DNA-Messung bei A260 als eine Maßnahme zur Gewinnung von DNA basiert

Kultur	Lebendzählera pro ml	Relative Zellzahlb pro ml basierend auf Echtzeit-PCR		Zellzahl pro ml basierend auf A260
		ATL-Verfahren	Einschritt-DEPC-Verfahren	ATL-Verfahren	Einschritt-DEPC-Verfahren
P. gingivalis	1,75 × 108	4,1 × 109	3,4 × 109	4,8 × 109	5,6 × 109
		Einschritt-DEPC-Verfahren		Einschritt-DEPC-Verfahren
S. mutans	5,4 × 109	6,0 × 109		9,3 × 109

• ^a P.-gingivalis-Kultur, welche auf einer CDC-Agar-Platte unter anaeroben Bedingungen gewachsen war, und S.-mutans-Kultur gewachsen auf einer BHI-Agarplatte unter 5% CO₂.
• ^b Verwendung von P.-gingivalis-DNA als einen Standardgraphen (Bereich von 3600 pg bis 0,36 pg), wobei 100 P.-gingivalis-Zellen = 0,250 pg DNA und 100 S.-mutans-Zellen = 0,237 pg DNA berücksichtigt wurden.
TABELLE 12 Schätzung von DNA in gemischten bakteriellen Kultur nach Extraktion durch ein Einschritt-DEPC-Verfahren (Echtzeit-PCR Quantifizierung)

Bakterien	DNA-Menge (pg) Reaktion unter Verwendung von Universalprimer-Sonde		DNA-Menge (pg) Reaktion unter Verwendung von P. gingivalis Primer-Sonde
	ohne DEPC	mit DEPC	ohne DEPC	mit DEPC
Fusobacterium nucleatum + Porphyromonas gingivalis	107	392	35,9	188
Prevotella melaninogenica + Porphyromonas gingivales	90	323	44,2	232
Streptococcus mutans + Porphyromonas gingivalis	474	493	59,4	249

TABELLE 13 Schätzung von DNA nach Extraktion durch ein Zweischritt-DEPC-Verfahren (Echtzeit-PCR Quantifizierung)

Bakterien	DNA-Menge (pg) nach Extraktion
	auf Eis	mit Pulsbeschallung	kontinuierliche Beschallung
Fusobacterium nucleatum	319	276	123
Porphyromonas endodontalis	198	153	122
Porphyromonas gingivalis	327	312	410
Prevotella melaninogenica	58,3	82,2	67,8
Peptostreptococcus micros	66,7	59,4	64,7
Streptococcus mutans	471	437	361
Lactobacillus acidophilus	85,5	80,5	44,4
Actinomyces israelii	2,47	4,74	3,01

TABELLE 14A Relative Schätzung von P.-gingivalis-Zellen und Gesamt-Bakterien in einer Plaqueprobe aus einer erkrankten Stelle

Bedingung	Plaque Nr.	Geschätzte relative Zellzahl pro ml Plaqueprobe		% P. gingivalis
		P. gingivalis	Gesamtlast
Plaqueprobe von einer erkrankten Stelle	45	1,4 × 1011	4,8 × 1011	29

• P.-gingivalis-DNA (3600 pg-0,36 pg) wurde als Standardgraph für eine relative Schätzung von DNA in Plaqueproben verwendet.
• 100 P.-gingivalis-Zellen = 0,250 pg DNA. TABELLE 14B Diversität von Spezies in 57 Klonen, welche aufgrund von sequenzbasierter Identifizierung analysiert wurden, wobei ein 466-bp-DN-Segment verwendet wurden, welches unter Verwendung von universellen Primern amplifiziert wurde.

  Bakterien	Speziesnummer	%
  P. gingivalis	17	29.8
  Fusobacterien	18	31,6
  B. forsythus	6	10,5
  Prevotella	4	7
  Treponema	2	3,5
  Campylobacter	1	1,8
  Capnocytophaga	1	1,8
  Desufobulbus	1	1,8
  Catonella (clostridium) ähnlich	1	1,8
  Streptococcus	1	1,8
  Clostridium	1	1,8
  Porphyromonas ähnlich	1	1,8
  Rothia dentocariosa	1	1,8
  Flexistipes ähnlich	1	1,8
  Unkultiviertes Bakterium	1	1,8

  TABELLE 15 Sequenzbasierte Identifizierung von Bakterien aus der Dentalplaqueflora

  Kultur	Bakterienspezies mit hohem Score	% Ähnlichkeit	% Identität
  4-2	S. mitis SM16SRR1	99,3	99,3
  	S. costellatus AF104677	94	94
  	S. anginosus AF306833	94	94
  	S. intermedius AF104673	94,4	94,4
  2-2-1	S. mitis SM16SRR1	94,5	93,7
  	S. costellatus AF104677	98,24	97,49
  	S. anginosus AF306833	98,74	97,99
  	S. intermedius AF104673	99,50	98,74
  6-5	S. mitis SM16SRR1	94,8	94,5
  	S. costellatus AF104677	98,7	98,4
  	S. anginosus AF306833	99,2	98,96
  	S. intermedius AF104673	100	99,74
  10-34	S. mitis SM16SRR1	94,56	94,3
  	S. costellatus AF104677	100	99,74
  	S. anginosus AF306833	98,45	98,19
  	S. interredius AF104673	98,7	98,45
  1-2-1	Acinomyces-Spezies oraler Klon AF385553	99,24	98,49
  	A. viscosus AVRRNA16S	98,99	98,24
  	A. naeslundii ANE234051	98,995	97,99
  	A. meyeri AMRNAR16S	92,68	91,92
  	A. georgiae AG16SRRNA	92,93	92,17
  	A. odontolyticus AOD234041	91,41	90,68
  4-2-1	Acinomyces-Spezies oraler Klon	93,42	93,16
  	A. viscosus AVRRNA16S	93,16	92,90
  	A. naeslundii ANE234051	93,95	93,42
  	A. meyeri AMRNAR16S	98,42	98,16
  	A. georgiae AG16SRRNA	99,74	99,47
  	A. odontolyticus AOD234041	97,63	97,37

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Claims (24)

1. Verfahren zum Bestimmen des Gesamtmikrobengehalts in einer Probe, wobei das Verfahren Amplifizieren einer Zielsequenz ausgewählt aus 16s rDNA und 16s rRNA umfasst, wobei das Amplifizieren ein Oligonukleotid als einen Vorwärtsprimer verwendet, welches wenigstens die Sequenz angegeben in SEQ ID NO: 1 umfasst, und wobei das Amplifizieren ein Oligonukleotid als einen Rückwärtsprimer verwendet, welches wenigstens die Sequenz angegeben in SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei die Amplifikation für eine Dauer und unter Bedingungen durchgeführt wird, welche ausreichend sind, um einen Gehalt eines Amplifikationsprodukts zu erzeugen, welcher zum Mikroorganismengehalt in der Probe proportional ist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Amplifikationsprodukt detektiert wird, wobei ein Oligonukleotidid als eine Sonde verwendet wird, welches eine Nukleotidsequenz angegeben in SEQ ID NO: 3 oder eine Nukleotidsequenz mit wenigstens 70% Ähnlichkeit dazu umfasst oder fähig ist, mit SEQ ID NO: 3 oder ihrem Komplement unter niedrigen Stringenzbedingungen zu hybridisieren.
3. Verfahren zum Identifizieren eines Mikroorganismus' durch seine Gattung in einer Probe, wobei das Verfahren Amplifizieren einer Zielsequenz gemäß Anspruch 1 umfasst, wobei die Sequenz DNA ist, welche 16s rDNA oder 16s rRNA oder ein Homolog oder Derivat oder funktionelles Äquivalent davon umfasst oder damit assoziiert ist, und wobei eine Sonde verwendet wird, welche mit einer Nukleotidsequenz hybridisiert, welche zwischen den Primern verschachtelt ist, wobei die Sonde entweder spezifisch für den Mikroorganismus ist, welcher identifiziert werden soll, oder welcher nachher durch eine gattungsspezifische Sonde identifiziert wird.
4. Verfahren zum Identifizieren eines bestimmten Mikroorganismus' oder der Prävalenz einer bestimmten Mikroorganismengattung oder -spezies in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst Gewinnen von DNA oder RNA aus der Probe, wobei die Primer wie in Anspruch 1 definiert verwendet werden, und dann Unterziehen der gewonnenen DNA oder RNA einer Nukleotidsequenzierung und/oder Abfrage durch eine gattungs- oder speziesspezifische Sonde und dann Bestimmen des Mikroorganismus' durch die bestimmte Sequenz oder das Muster der Sondenabfrage.
5. Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei die gattungsspezifische Sonde ebenso eine speziespezifische Sonde ist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Sonde durch SEQ ID NO: 3 definiert ist.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Probe eine biologische, medizinische, landwirtschaftliche, industrielle oder Umweltprobe ist.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die medizinische Probe eine Kulturflüssigkeit, eine Biopsie-Flüssigkeit oder ein Gewebe, ein Abstrich oder eine Probe aus der Mundhöhle ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die biologische Probe von einem Tier oder einem Insekt oder einer Pflanze stammt.
10. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Umweltprobe aus Boden, einem Fluss, heissen Mineralquellen, einer Pflanze, antarktischen Proben, Luftproben oder extraterrestrischen Proben als auch Proben von industriellen Stätten wie zum Beispiel Abfallplätzen und Bereichen mit Kontamination mit vergossenem Öl oder aromatischen oder komplexen Molekülen und Pestizidkontamination stammt.
11. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Probe Nahrung, Nahrungsbestandteile, Nahrungsderivate und/oder Nahrungsinhaltsstoffe umfasst einschließend Nahrungsprodukte, welche in der Molkereiindustrie hergestellt werden, wie zum Beispiel Milch.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei die Probe flüssig, fest, eine Aufschlämmung, Luft, Dampf, Tropfen, Aerosol oder eine Kombination davon ist.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 12, wobei die Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 12, wobei die Amplifikation durch Echtzeit-PCR durchgeführt wird.
15. Primerpaar bestehend aus einem isolierten Nukleinsäuremolekül, welches aus einer Nukleotidsequenz angegeben in SEQ ID NO: 1 oder einer komplementären Form davon besteht, und einem isolierten Nukleinsäuremolekül, welches aus einer Nukleotidsequenz angegeben in SEQ ID NO: 2 oder einer komplementären Form davon besteht.
16. Primersondensatz, welcher das Primerpaar gemäß Anspruch 15 und eine Sonde bestehend aus einer Nukleotidsequenz angegeben in SEQ ID NO: 3 oder einer komplementären Form davon umfasst.
17. Primersondensatz gemäß Anspruch 16, wobei das 5'-Ende der Sonde mit einem Reportermolekül markiert ist und das 3'-Ende der Sonde mit einem Quenchmolekül markiert ist.
18. Verwendung des Primerpaars gemäß Anspruch 15 oder des Primersondensatzes gemäß Anspruch 16 zur Bestimmung von einem Gesamtmikrobengehalt in einer Probe.
19. Kit in einer kompartimentierten Form umfassend ein Kompartiment, welches ein isoliertes Nukleinsäuremolekül enthält, welches aus einer Nukleotidsequenz angegeben in SEQ ID NO: 1 oder einer komplementären Form davon besteht und welches ein isoliertes Nukleinsäuremolekül enthält, welches aus einer Nukleotidsequenz angegeben in SEQ ID NO: 2 oder einer komplementären Form davon besteht, ein anderes Kompartiment, welches eine Sonde umfasst, welche an ihrem 5'-Ende durch ein fluorogenes Reportermolekül und an ihrem 3'-Ende durch ein Molekül markiert ist, welches zum Quenchen des fluorogenen Moleküls fähig ist, und gegebenenfalls ein weiteres Kompartiment, welches so eingerichtet ist, dass es Reagenzien zum Durchführen einer Amplifikationsreaktion enthält.
20. Kit gemäß Anspruch 19, wobei die Sonde aus einer Nukleotidsequenz, welche in SEQ ID NO: 3 angegeben ist, oder einer komplementären Form davon besteht.
21. Komplex umfassend einen Vorwärtsprimer mit SEQ ID NO: 1 und einen Rückwärtsprimer mit SEQ ID NO: 2, welche mit komplementären Strängen einer Zielsequenz hybridisiert sind, wobei die Zielsequenz die gesamte 16s rDNA oder 16s rRNA oder einen Teil davon umfasst, und eine Sonde mit SEQ ID NO: 3, welche mit einem Anteil der 16s rDNA oder 16s rRNA hybridisiert ist, welcher zwischen dem Vorwärts- und Rückwärtsprimer verschachtelt ist.
22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Probe mikrobielle Zellen umfasst und die Probe konzentriert wird, einem enzymatischen Abbau, einer Zelllyse der Zellen in Anwesenheit von SDS und einer Reinigung des Nukleinsäurematerials unterzogen wird.
23. Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Probe einem druckvermittelten Aufschluß oder einer Inkubation auf Eis in Anwesenheit von DEPC vor dem enzymatischen Abbau und der Lyse unterzogen wird.
24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 oder 22 oder 23, wobei das Verfahren gegebenenfalls Detektieren der Anwesenheit von amplifiziertem Produkt in Anwesenheit einer Sonde, welche mit einem Reportermolekül markiert ist, und Bestimmen des Gesamtmikrobengehalts und gegebenenfalls Isolieren des amplifizierten Produkts und entweder Sequenzieren des isolierten Produkts oder Unterziehen des amplifizierten Produkts einer genetischen Abfrage zum Identifizieren der vorhandenen Mikroorganismengattung oder -spezies umfasst.