DE60131413T2

DE60131413T2 - Verfahren zum auffinden von peptiden zur verwendung in der immuntherapie

Info

Publication number: DE60131413T2
Application number: DE60131413T
Authority: DE
Inventors: Kostas Kosmatopoulos; Sophie Tourdot; Antonio Scardino; David Alexandre Gross
Original assignee: Institut Gustave Roussy (IGR); Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut Gustave Roussy (IGR); Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2000-07-21
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2008-09-04
Anticipated expiration: 2021-07-21
Also published as: DE60131413D1; PT1309860E; US20040072240A1; DK1309860T3; CA2416761A1; EP1309860A2; WO2002008716A2; WO2002008716A3; AU2001278555A1; US20090269363A1; EP1309860B1; US7976843B2; CA2416761C; FR2812087B1; ATE378590T1; ES2296778T3; US7425606B2; FR2812087A1

Description

Die Peptid-Vakzination oder -Immuntherapie ist ein therapeutischer Ansatz, der derzeit Gegenstand eines großen Interesses im Rahmen der Prävention oder der Behandlung von viralen Pathologien oder Krebspathologien ist. Ihr Prinzip beruht auf der Immunisierung durch Peptide, die T-Epitope von viralen oder tumoralen Antigenen reproduzieren, welche von cytotoxischen T-Zellen (CTL), im Allgemeinen vom CD8+-Typ, erkannt werden, die eine Hauptrolle bei der Eliminierung der Zellen spielen, die diese Antigene an ihrer Oberfläche exprimieren.
Man wird sich erinnern, dass die CTL nicht die ganzen Proteinantigene erkennen, sondern Peptidfragmente dieser, die 8 bis 10 Aminosäuren umfassen, die von den Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes-Klasse I (MHC I), die an der Oberfläche verschiedener Zellen exprimiert werden, präsentiert werden. Die Präsentation dieser Peptide resultiert aus einem komplexen Prozess, der als „Prozessierung des Antigens" („apprêtement de l'antigène") bezeichnet wird, der 3 Hauptstufen impliziert:

– den cytosolischen Abbau der Antigenproteine durch einen Multienzymkomplex, der Proteasom genannt wird;
– die Translokation der Peptide, die aus diesem Abbau stammen, in das endoplasmatische Retikulum (ER) durch die TAP-Transporter;
– die Assoziation dieser Peptide mit den 2 MHC I-Ketten, um stabile MHC I/Peptid-Komplexe zu bilden, die an die Zelloberfläche exportiert werden;

Die MHC I/Peptid-Komplexe Wechselwirken mit den Rezeptoren für das Antigen (TCR), die den T-Lymphozyten entsprechen. Diese Wechselwirkung induziert die Stimulation dieser Lymphozyten und ihre Zellteilung (klonale Proliferation), die zu der Erzeugung der Effektorlymphozyten führt, die denselben TCR tragen, welche die Eliminierung des Aggressors, gegen dessen Antigene die Immunantwort induziert wurde, sicherstellen werden.
Im Verlauf des Prozessierungsverfahrens erfolgt eine Selektion der Peptide, die zu einer Präsentationshierarchie durch den MHC I an der Oberfläche der Zelle führt. Die Repräsentation der Epitope an der Zelloberfläche wird insbesondere von der Stabilität des Antigenproteins im Cytosol, den Stellen und der Häufigkeit der Spaltungen, die durch das Proteasom durchgeführt werden, der Wirksamkeit der Translokation im ER durch die TAP-Transporter und insbesondere von der Fähigkeit der Peptide, an verschiedenen Molekülen des MHC I zu binden und stabile Peptid/MHC I-Komplexe zu bilden, abhängen.
Die Peptide, die vorzugsweise durch den MHC am Ende des Prozessierungsverfahrens präsentiert werden, bilden immundominante Epitope, die die Hauptteilnehmer an der CTL-Reaktion auf native Antigene sind, aus denen sie hervorgegangen sind. Dagegen bilden die Peptide, die nur schwach präsentiert werden, subdominante/kryptische Epitope, die nur wenig oder gar nicht an dieser Reaktion bzw. Antwort beteiligt sind.
Es wurde vorgeschlagen, Peptide, die diesen, durch den MHC I präsentierten, entsprechen, zu verwenden, um eine Schutzantwort, insbesondere gegen virale oder tumorale Antigene, zu induzieren.
So wurde gezeigt, dass Vakzine, die auf immundominanten Peptiden basieren, im Allgemeinen auf der Basis ihrer starken Affinität für die MHC I-Moleküle ausgewählt wurden, in zahlreichen experimentellen Mäusemodellen und neuerdings bei den Menschen einen antiviralen oder antitumoralen Schutz gewährleisten können [SCHULTZ et at., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 991 (1991); KAST et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2283, (1991); MARCHAND et al., Int. J. Cancer, 80, 219, (1999); ROSENBERG et al., Nature Med., 4, 321, (1998)].
Unterdessen wurde kürzlich auch gezeigt, dass die Vakzination bzw. Impfung mit immundominanten Peptiden sich in einigen Fällen als unwirksam erweisen könnte. Während der chronischen Infektion mit einem Virus, dessen Mutationsgrad erhöht ist, wie z. B. HIV oder HBV, begünstigt so der Selektionsdruck, der durch die natürliche antivirale CTL-Reaktion auferlegt wird, das Überleben von Varianten, die in der Sequenz ihrer immundominanten Peptide mutiert sind. Diese Varianten werden durch CTL, die für immundominante Epitope spezifische sind, nicht mehr erkannt [KLENERMAN et al., Nature, 369, 403, (1994); BERTOLETTI et al., Nature, 369, 407, (1994); MOSKOPHIDIS und ZINKERNAGEL, J. Virol., 69, 2187, (1995); BORROW et al., Nat. Med., 3, 205, (1997); GOULDER et al., Nat. Med., 3, 212, (1997)].
Auch im Fall von Tumoren, die erhöhte Konzentrationen an Proteinen exprimieren, die auch in normalen Geweben exprimiert werden und die „Autoantigene" bilden, kann sich ein Toleranzphänomen entwickeln. Diese Toleranz betrifft hauptsächlich die immundominanten Epitope mit starker Affinität für MHC. Die Stimulation des Repertoires an CTL, das spezifisch für diese Epitope ist, scheint nicht der beste Weg zu sein, um einen wirksamen antitumoralen Schutz zu erhalten.
So wurde die Verwendung von subdominanten/kryptischen Epitopen mit schwacher Affinität für den MHC vorgeschlagen. Im Fall der antiviralen Vakzination können diese Epitope, die keinem ähnlichen Selektionsdruck unterliegen, wie immundominante Epitope, nützliche Ziele darstellen, um Viren des Wildtyps sowie ihre Varianten zu eliminieren. Im Fall der antitumoralen Vakzination sind Epitope mit schwacher Affinität wenig oder nicht an der Entwicklung der Toleranz beteiligt, das Repertoire an antitumoralen spezifischen CTL dieser Epitope könnte für eine in vivo-Rekrutierung verfügbar bleiben.
Während früherer Arbeiten hat die Gruppe der Erfinder [OUKKA et al., J. Immunol., 157, 3039, (1996)] gezeigt, dass es möglich ist, subdominante/kryptische Peptide als antivirale Vakzination zu verwenden. Sie haben auch beobachtet, dass die Wirksamkeit eines durch subdominante/kryptische Epitope induzierten Schutzes derjenigen unterlegen ist, die mit der Vakzination durch das dominante Peptid erhalten wird, dass sie aber erhöht werden kann, indem diese Peptide durch Erhöhung ihrer Affinität für den MHC I immunogener gemacht werden [TOURDOT et al., J. Immunol., 159, 2391, (1997)].
Die übliche Strategie zur Erhöhung der Immunogenität von viralen oder tumoralen Epitopen besteht darin, ihre Affinität für den MHC I und/oder die Stabilität des Komplexes Peptid/MHC I durch Substitution bzw. Austausch von Aminosäuren zu erhöhen. Es wurde in der Tat beobachtet, dass die Peptide, die fähig sind, mit einem gegebenen MHC-Allel einen Komplex zu bilden, das Vorliegen von konservierten Aminosäureresten in bestimmten Positionen gemeinsam haben. So wurde für jedes Allel des MHC I ein spezifisches Verankerungsmotiv identifiziert, das Aminosäuren impliziert, die als „primäre Verankerungsreste" bezeichnet werden. Es wurde auch gezeigt, dass Reste, die außerhalb der Verankerungsstellen liegen (sekundäre Verankerungsreste) eine günstige oder ungünstige Wirkung auf die Affinität des Peptids für den MHC ausüben können; das Vorliegen dieser sekundären Verankerungsreste erlaubt es, zu erklären, dass im Inneren der Peptide, die dasselbe spezifische Verankerungsmotiv eines gegebenen MHC I besitzen, eine große Variabilität in der Fixierungsaffinität existiert und dass Peptide, die das vollständige primäre Verankerungsmotiv nicht haben, durch die MHC I-Moleküle präsentiert werden können und für diese Moleküle eine starke Affinität besitzen.
So ist es zahlreichen Arbeitsgruppen gelungen, die Immunogenität von Peptiden, die als potentielle virale oder tumorale Immunogene identifiziert wurden, zu verstärken, indem sie ihre Affinität für den MHC I erhöhten LIPFORD et al. [Vaccine, 13, 313, (1995)] haben zum Beispiel für die Maus gezeigt, dass die Substitution bzw. der Austausch von D durch I in Position 2 des Peptids auf dem Epitop 50–57 von Ag 136.1 des Papillomavirus, präsentiert durch das Molekül K^b, die Stabilität der mit dem Molekül K^b gebildeten Komplexe erhöht und das Epitop in vivo immunogen macht, dass die induzierten CTL, die durch das Papillomavirus transformierten Zellen erkennen. BRISTOL et al. [J. Immunol., 160, 2433, (1998)] zeigten auch, dass der Ersatz des Restes V in der C-terminalen Position des Epitops 4–12 des mutierten Oncogens Ras p21 durch I oder L, die die spezifischen Verankerungsaminosäuren in Position 9 des Moleküls K^d sind, die Induktion einer spezifischen CTL-Antwort bei den BALG/c-Mäusen erlaubte. HUDRISIER et al. [Mol. Immunol., 32, 895, (1995)] haben die Reste des Peptids SMIENLEYM (SEQ ID NO: 1) identifiziert, die in die Bindung an das Molekül D^b eingreifen, und haben eine Reihe von Peptiden mit starker Affinität produziert, und zwar Derivate der Sequenz X¹AIX⁴NAEAL (SEQ ID NO: 2), worin X¹ = Y oder K und X⁴ = E oder K.
POGUE et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 8166, (1995)] haben beim Menschen Aminosäuren in verschiedenen Position des immunogenen Epitops 767–484 der inversen Transkriptase des HIV-1-Virus, präsentiert durch das Molekül HLA A2.1 mit starker Affinität, substituiert und gezeigt, dass die Substitution durch Y oder F im Rest in Position 1, die schon starke Affinität des Peptids und seine Fähigkeit CTL ausgehend von PBL von seropositiven Spender, die das Allel HLA A2.1 besitzen, erhöht. PARKHURST et al. [J. Immunol., 157, 2539, (1996)] haben einzelne Substitutionen in den Positionen 1, 2, 3 oder doppelte Substitutio nen in den Positionen 1 und 2 oder 2 und 3 in den immunogenen Epitopen gpl00 209, gp100 280 und gp100 154 von Ag gp100, assoziiert mit Melanom, durchgeführt und haben gezeigt, dass die modifizierten Epitope gp100 209 2M und gp100 280 9V eine stärkere Affinität als das nicht-modifizierte Epitop haben. BAKKER et al. [Int. J. Cancer, 70, 302, (1997)] haben durch Substitution an einer der Verankerungspositionen (Position 2) oder außerhalb der Verankerungspositionen (Position 8) Varianten des Epitops gp100 154, die eine stärkere Affinität als das native Epitop besitzen, erhalten. SAROBE et al. [J. Clin. Invest., 102, 1239, (1998)] haben eine immunogene Variante des Epitops C7A des Kernproteins des HCV-Virus, das durch HLA A2.1 präsentiert wird, erhalten. VALMORI et al. [J. Immunol., 160, 1750, (1988)] haben ein Derivat mit starker Affinität des Epitops 26–35 des Antigens von Melanom MART-1, präsentiert durch HLA A2.1, erhalten. MICHELETTI et al. [Eur. J. Immunol. 1999, 29, 2579] haben einfache oder doppelte Substitutionen bzw. Austausche in den Positionen 1 und/oder 3 des Peptids CLG durchgeführt, das von dem Protein LMP-2 des EBV-Virus stammt. In seiner nativen Form hat dieses Peptid eine starke Affinität für das Molekül des MHC und ist immunogen. Die Autoren haben beobachtet, dass die Varianten A3 und Y1-A3, die von dem Peptid CLG stammen, eine stärkere Affinität als das native Peptid haben und eine stärkere immunologische Reaktion stimulieren.
Es scheint somit möglich, die Immunogenität von subdominanten/kryptischen Epitopen zu erhöhen, um sie als Immuntherapie zu verwenden. Allerdings erfordert dies eine vorherige Identifizierung dieser Epitope. Nun bleibt dies gerade aufgrund ihrer schwachen Immunogenität problematisch.
Mit dem Ziel, dieses Problem zu lindern, haben die Erfinder untersucht, ob es möglich wäre, allgemeine Regeln für den Austausch bzw. die Substitution von Aminosäuren zu definieren, die es erlauben würden, die Affinität und somit die Immunogenität der Mehrzahl der tumoralen Epitope, die durch MHC (durch die Moleküle HLA A2.1) präsentiert werden, zu erhöhen und sie haben untersucht, ob sie die spezifischen Verankerungsaminosäuren dieses Moleküls besitzen oder nicht, und zwar allgemein unabhängig von ihrer Ursprungssequenz.
Die Erfinder haben so festgestellt, dass die einzige Substitution bzw. der alleinige Austausch der N-terminalen Aminosäure durch einen Tyrosinrest, ungeachtet der nativen Sequenz des Peptids, die Affinität dieses Peptids für die HLA-Moleküle der Klasse I und insbesondere für das Molekül HLA A2.1 erhöht und die Stabilität des gebildeten Komplexes Peptid/MHC I erhöht und das in einem Verhältnisanteil, der umso bedeutender ist, je schwacher die Affinität des nativen Peptids war. Sie haben außerdem beobachtet, dass die so modifizierten Peptide die antigene Spezifität der natürlichen Peptide konservierten und immunogen wurden und fähig waren, in vivo ein CTL-Repertoire zu rekrutieren, das für das entsprechende native Peptid spezifisch ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von subdominanten/kryptischen Epitopen, die durch das Klasse I-Molekül HLA A2.1 präsentiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens die folgenden Stufen umfasst:

a) Auswahl aus der Sequenz eines Proteins, gegen das man eine cytotoxische T-Antwort induzieren möchte, wenigstens einer Peptidsequenz mit 8 bis 11 Aminosäuren, die das primäre Verankerungsmotiv des Moleküls HLA A2.1 ganz oder einen Teil davon besitzt und eine solche ist, dass der Komplex dieses Peptids mit dem Molekül HLA A2.1 eine DC50 von unter 2 Stunden besitzt;
b) für jede ausgewählte Sequenz Herstellung eines varianten Peptids, das von der genannten Sequenz durch Substitution bzw. Ersatz der N-terminalen Aminosäure durch einen Tyrosinrest abgeleitet wird;
c) Bestimmung der Immunogenität jedes varianten Peptids, das in Stufe b) erhalten wurde, durch Selektion jedes immunogenen Peptids unter diesen, das eine spezifische CTL-Antwort gegenüber Targetzellen erzeugt, die das Protein exprimieren, das aus der in Stufe a) ausgewählten Peptidsequenz stammt, und Identifizierung der Peptidsequenz, von der das immunogene Peptid abgeleitet ist.

Im Rahmen der Beschreibung der vorliegenden Erfindung versteht man unter „immunogenem Peptid" ein Peptid, das fähig ist, eine spezifische CTL-Antwort zu induzieren, und unter „nicht-immunogenem Peptid" ein Peptid, das unfähig ist, eine spezifische CTL-Antwort zu induzieren.
Die Wahl der Peptidsequenzen, die fähig sind, Epitope zu bilden, die durch ein Klasse I-HLA-Molekül, HLA A2.1, präsentiert werden, kann in klassischer Weise durch Analyse der Peptidsequenz des gewählten Proteins erfolgen, um die Peptide auszuwählen, die das ganze primäre Verankerungsmotiv eines Moleküls HLA A2.1 oder einen Teil davon besitzen (L in Position 2 und/oder V/L in C-terminaler Position). Man wird selbstverständlich die Peptide, die als Immunogene bekannt sind, eliminieren. Gegebenenfalls wird man eine komplementäre Auswahl der Peptide durchführen können, deren potentielle Bindungsfähigkeit an HLA A2.1, die durch Computeranalyse vorausgesagt wurde, am schwächsten zu sein scheint. Algorithmen, die zu diesem Zweck verwendbar sind, sind an sich bekannt; man kann z. B. zwei nennen, die von PARKER et al. [J. Immunol., 152, 163, (1994)] beschrieben wurden.
Diese Analyse wird vorteilhafterweise durch die experimentelle Bestimmung der Bindungsaffinität des Peptids für HLA A2.1 und der Bestimmung der Stabilität des Komplexes Peptid/HLA A2.1 vervollständigt werden können. Nicht-immunogene Peptide weisen am häufigsten eine schwache Affinität für Klasse I-HLA auf und/oder bilden mit diesem einen wenig stabilen Komplex. Verfahren zur Bestimmung der Affinität des Peptids für HLA A2.1 und der Stabilität des gebildeten Komplexes sind an sich bekannt. Man wird z. B. das von FIRAT et al. [Eur. J. Immunol., 29, 3112, (1999)] beschriebene nennen.
Die Affinität eines Peptids für Klasse I-HLA, insbesondere HLA A2.1, wird am häufigsten im Bezug zu einer eines Referenzpeptids in Form der relativen Affinität definiert. Die relative Affinität ist als das Verhältnis der Konzentration des Peptids, das die Bildung einer bestimmten Menge des Komplexes Peptid/Klasse I-HLA erlaubt, zu der Konzentration des Referenzpeptids, das unter denselben Bedingungen die Bildung derselben Menge an Peptid/Klasse I-HLA erlaubt. In diesem Fall gilt, je höher die relative Affinität ist, desto schwächer wird die Affinität der Bindung des Peptids für Klasse I-HLA sein.
Zum Beispiel werden für einen Komplex Peptid/HLA A2.1, nimmt man das Peptid mit der Sequenz IVGAETFYV (SEQ ID NO: 3) als Peptidreferenz, mehr als 84% der nicht-immunogenen Peptide häufig eine relative Affinität von über 10 haben.
Die Stabilität des Komplexes Peptid/HLA A2.1 wird oft durch DC50 definiert, welches die Zeit darstellt, die zur Dissoziation von 50% der gebildeten Komplexe notwendig ist. Im Allgemeinen ist diese Zeit für die nicht-immunogenen Peptide unter 2 Stunden. [VAN DER BURG et al., J. Immunol., 156, 3308 (1996)].
Wenn ein durch HLA A2.1 präsentiertes Peptid eine relative Affinität (bezüglich HIVpol 589) von über 10 und einen DC50-Wert von unter 2 Stunden besitzt, wird es sehr wahrscheinlich nicht-immunogen sein.
Die Immunogenität der Peptide, die in der Stufe c) zurückgehalten werden, wird in einfacher Weise z. B. durch klassische Verfahren der Bestimmung der Fähigkeit des Peptids, in vivo, ex vivo oder in vitro, eine spezifische CTL-Antwort gegenüber Targetzellen, die das Protein exprimieren, von dem es stammt, zu erzeugen, verifiziert werden.
Sobald diese Wahl durchgeführt ist, werden die varianten Peptide, die von Sequenzen abgeleitet sind, die durch Substitution der N-terminalen Aminosäure durch einen Tyrosinrest erhalten werden, sehr leicht hergestellt werden, und zwar insbesondere durch Peptidsynthese nach klassischen Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Vor der Detektion der Immungenität dieser varianten Peptide, die in Stufe c) des Verfahrens gemäß der Erfindung durchgeführt wird, umfasst das Verfahren eine Vorselektion der varianten Peptide durch die Bestimmung der relativen Affinität des Peptids für ein Molekül HLA A2.1 und/oder der Stabilität des gebildeten Komplexes Peptid/Klasse I-HLA und eine Selektion der varianten Peptide, die eine relative Affinität für HLA A2.1 aufweisen, die unter der der nativen Peptide ist, von denen sie abgeleitet sind, und/oder die einen DC50-Wert von über 2 Stunden aufweisen.
Jedes Peptid, das diesen Kriterien entspricht, kann dann getestet werden, um zu untersuchen, ob es ein spezifisches CTL-Repertoire des nicht-immunogenen nativen Peptids, von dem es abgeleitet ist, induzieren kann und ob es fähig ist, insbesondere die Lyse der Targetzellen, die das native Protein exprimieren, von dem dieses nicht-immunogene Peptid stammt, nach sich zu ziehen.
Wenn dieser Test positiv ist, kann man davon ausgehen, dass dieses nicht-immunogene native Peptid ein subdominantes/kryptisches Epitop, präsentiert durch HLA A2.1, des genannten Antigens darstellt.
Die Durchführung des obigen Verfahrens hat es den Erfindern erlaubt, neue subdominante/kryptische Epitope, die durch HLA A2.1 präsentiert werden, des Tumorantigens HER-2/neu, der katalytischen Untereinheit der Telomerase (TERT) und des HIV-1-Virus zu identifizieren.
Diese subdominanten/kryptischen Epitope sind die Folgenden:
Für HER-2/neu:
das Peptid HER-2/neu 650: PLTSIISAV (SEQ ID NO: 4)
das Peptid HER-2/neu 466: ALIHHNTHL (SEQ ID NO: 5)
das Peptid HER-2/neu 402: TLEEITGYL (SEQ ID NO: 6)
das Peptid HER-2/neu 391: PLQPEQLQV (SEQ ID NO: 7)
Für HIV-1:
das Peptid gagp24-212: EMMTACQGV (SEQ ID NO: 8)
das Peptid po179: LLDTGADDTV (SEQ ID NO: 9)
Für die katalytische Untereinheit der Telomerase (TERT):
das Peptid mhp 572: RLFFYRKSV (SEQ ID NO: 10)
das Peptid mhp 988: DLQVNSLQTV (SEQ ID NO: 11)
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch immunogene Peptidepitope, die von subdominanten/kryptischen Epitopen abgeleitet sind, die durch Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung identifiziert werden können, und insbesondere subdominante/kryptische Epitope von HER/neu, des HIV-1-Virus und der katalytischen Untereinheit der Telomerase (TERT), die oben genannt wurden.
Ein peptidisches immunogenes Epitop gemäß der Erfindung kann durch verschiedene Modifikationen der Peptidsequenz des subdominanten/kryptischen Epitops, von dem es stammt, erhalten werden. In ganz vorteilhafter Weise umfassen diese Modifikationen wenigstens den Austausch der N-terminalen Aminosäure durch einen Tyrosinrest. Es kann sich insbesondere um ein variantes Peptid handeln, das am Ende der Stufe c) des Verfahrens gemäß der Erfindung ausgewählt wurde oder gegebenenfalls ganz von dem stammen, das andere Sequenzmodifikationen umfasst, die es möglich machen, dass seine Immunogenität zunimmt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Zusammensetzungen, die wenigstens ein immungenes Peptidepitop gemäß Anspruch 4 umfassen.
Die immunogenen Peptidepitope gemäß der Erfindung sind in allen Immuntherapie-Behandlungen verwendbar, für die es wünschenswert ist, eine CTL-Reaktion zu induzieren, die gegen die subdominanten/kryptischen Epitope gerichtet ist, und sie sind insbesondere im Rahmen der antiviralen oder antitumoralen Therapie einsetzbar.
Vorteilhafterweise handelt es um Multiepitopzusammensetzungen, die fähig sind, eine polyspezifische CTL-Antwort zu erzeugen und die zu diesem Ziel auch ein anderes immungenes Epitop oder mehrere andere immunogene Epitope umfassen. Es kann sich um ein anderes subdominantes/kryptisches Epitop oder um mehrere andere subdominante/kryptische Epitope und/oder ein immundominantes Epitop oder mehrere immundominante Epitope handeln. Diese Epitope können von demselben Antigen oder von zwei oder mehreren unterschiedlichen Antigenen stammen.
Vorteilhafterweise können Multiepitopzusammensetzungen gemäß der Erfindung auch wenigstens ein Epitop umfassen, das durch ein Molekül des MHC II präsentiert wird und das fähig ist, eine T-Hilfsantwort zu induzieren. Sie können außerdem, um in größerem Umfang bei einer Population verwendbar zu sein, deren Individuen unterschiedliche HLA-Allele tragen, ein oder mehrere Epitope umfassen, das/die durch andere Moleküle des MHC I als HLA A2 präsentiert wird/werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung umfasst sie wenigstens ein chimäres Polypeptid, das eine Kopie oder mehrere Kopien eines immunogenen Peptidepitops gemäß der Erfindung umfasst. Im Fall einer Multiepitopzusammensetzung umfasst das genannte chimäre Polypeptid außerdem eine Kopie oder mehrere Kopien wenigstens eines anderen immunogenen Epitops.
Ein derartiges chimäres Polypeptid kann in einfacher Weise durch an sich bekannte Verfahren und insbesondere durch die klassischen Techniken der DNA-Rekombination erhalten werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Nucleinsäuremolekül, das für ein chimäres Polypeptid gemäß der Erfindung codiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines immunogenen Peptidepitops gemäß Anspruch 4, einer Zusammensetzung oder eines Nucleinsäuremoleküls gemäß der Erfindung zum Erhalt eines Medikaments und insbesondere eines Medikaments, das zur antiviralen oder antitumoralen Immuntherapie bestimmt ist.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Medikamente, die als Wirkstoff wenigstens ein immunogenes Peptidepitop gemäß Anspruch 4 umfassen, eine Zusammensetzung oder ein Nucleinsäuremolekül gemäß der Erfindung.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die genannten Medikamente Vakzine.
Medikamente gemäß der Erfindung können außerdem übliche Exzipientien sowie Adjuvantien, die üblicherweise in der Immuntherapie verwendet werden und die die Verabreichung des Wirkstoffs erleichtern, seine Immunogenität erhöhen können usw., umfassen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die Ergänzung der Beschreibung die folgt, die sich auf nicht-beschränkende Beispiele zur Identifizierung neuer Peptide und neuer Antigene, die potentiell in der Immuntherapie einsetzbar sind, bezieht, durch Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung besser verständlich.
BEISPIEL 1: BEZIEHUNG ZWISCHEN DER AFFINITÄT, DER STABILITÄT DER KOMPLEXE HLA A2.1/PEPTID UND DER IMMUNOGENITÄT DER VIRALEN UND TUMORALEN PEPTIDE
Fünfunddreißig Peptide, die von viralen Antigenen stammen (HBV, HIV, Flu), und die von Tumoren stammen (HER-2/neu, Melanom gp100, Tyrosinase, Mart-1), wurden auf ihre Fähigkeit getestet, an das Molekül HLA A2.1 zu binden und es zu stabilisieren: diese Peptide sind in der folgenden Tabelle I dargestellt. Tabelle I
22 dieser Peptide (in Tabelle I mit einem Sternchen gekennzeichnet) sind bereits als Epitope bekannt, die durch HLA A2.1 präsentiert werden und eine cytotoxische CTL-Antwort beim Menschen erzeugen; die 13 anderen Peptide, die noch nicht als Epitope beschrieben wurden, wurden als Funktion von zwei Kriterien ausgewählt: das Vorliegen von primären Verankerungsmotiven von HLA A2.1 (L in Position 2 und V/L in C-terminaler Position) und ein schwacher Bindungsscore, und zwar nach einer Evaluierung, die durch das BIMAS-Programm durchgeführt wurde [PARKER et al., J. Immunol., 152, 163, (1994)].
Die Affinität für HLA A2.1 und die Stabilität des Komplexes Peptid/HLA A2.1 wurden durch Strömungscytometrie evaluiert und die Immunogenität wurde durch Erzeugung von CTL bei transgenen HHD-Mäusen evaluiert [PASCOLO et al., J. Exp. Med., 185, 2043, (1997)].
Die verwendeten Protokolle sind die Folgenden [FIRAT et al., Eur. J. Immunol., 29, 3112, (1999)]:
Affinität:
Humane T2-Zellen, die bezüglich der TAP-Transporter defizient sind, [FIRAT et al., Eur. J. Immunol., 29, 3112, (1999)] (3 × 10⁵ Zellen/ml) werden bei 37°C während 16 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen jedes zu testenden Peptids in dem RPMI-1640-Medium ohne Serum, supplementiert mit 100 ng/ml humanem β2-Mikroglobulin inkubiert. Dann werden sie zweimal gewaschen und mit dem monoklonalen Antikörper BB7.2 [PARHAM et al., Hum. Immunol. 3, 4, 277–299, (1981)], der für das Molekül HLA A2.1 spezifisch ist, markiert und dann mit dem Ziege-anti-Maus-Ig-Antikörper, der an Fluoresceinisothionat (FITC) gekoppelt ist, markiert.
Die Zellen werden dann durch Strömungscytometrie analysiert. Für jede Peptidkonzentration wird die spezifische Fluoreszenz von HLA A2.1 als %-Wert der Fluoreszenz, die mit 100 μM eines Referenzpeptids (HIVpol 589; IVGAETFYV (SEQ ID NO: 3)) erhalten wird, berechnet. Die relative Affinität (RA) ist als Verhältnis der Konzentration jedes Peptids, die 20% der Fluoreszenz induziert, die mit 100 μM des Referenzpeptids erhalten wird, zu der Konzentration des Referenzpeptids, die 20% der Fluoreszenz induziert, die mit 100 μM des Referenzpeptids erhalten wird, definiert. Je schwächer die relative Affinität ist, desto stärker bindet das Peptid an HLA A2.1. Die mittlere RA für jedes Peptid wird ausgehend von wenigestens drei unabhängigen Experimenten bestimmt. In allen Experimenten werden 20% der maximalen Fluoreszenz für 1 bis 3 μM des Referenzpeptids erhalten.
Stabilität:
T2-Zellen (10⁶/ml) werden während einer Nacht bei 37°C mit 100 μM jedes zu testenden Peptids in RPMI 1640-Medium ohne Serum, das mit 100 ng/ml humanem β2-Mikroglobulin supplementiert war, inkubiert. Dann werden sie in vier Wiederaufnahmen gewaschen, um die freien Peptide zu eliminieren, mit Brefeldin A (SIGMA; 10 μg/ml) während einer Stunde inkubiert, um die Expression der HLA A2.1-Moleküle, die neu synthetisiert wurden, an ihrer Oberfläche zu verhindern, gewaschen und während 0, 2, 4, 6 oder 8 Stunden inkubiert. Für jede Inkubationszeit werden die Zellen dann, wie es oben angegeben ist, mit dem Antikörper BB7.2 markiert und durch Strömungscytometrie analysiert, um die Menge des Komplexes Peptid/HLA A2.1, der an ihrer Oberfläche vorliegt, zu evaluieren. Diese Menge wird durch die folgende Formel evaluiert: (mittlere Fluoreszenz der mit dem Peptid vorinkubierten T2-Zellen – mittlere Fluoreszenz der unter ähnlichen Bedingungen in Abwesenheit von Peptid behandelten T2-Zellen). Der DC50-Wert (Komplexdissoziation: DC) ist als die Zeit definiert, die für den Verlust von 50% der stabilisierten Komplexe HLA A2.1/Peptid bei t = 0 erforderlich ist.
Immunogenität
Die verwendeten HHD-Mäuse sind β2m/-, D^b-/- und verwendet wurde ein Monoketten-HLA A2.1, das aus den Domänen α1 und α2 von HLA A2.1 und den Domänen α3 und dem intracellulären Teil von D^b bestand, gebunden durch seinen N-Terminus an den C-Terminus von humanem β2-m durch ein Peptid aus 15 Aminosäuren.
Die Mäuse erhielten eine subkutane Injektion in die Schwanzbasis mit 100 μg jedes zu testenden Peptids, das in Freunds unvollständigem Adjuvans emulgiert war, in Gegenwart von 140 μg eines T-Hilfsepitops, das vom „Kern"-Antigen von HBV stammte (128–140, Sequenz TPPAYRPPNAPIL (SEQ ID NO: 63)).
Nach 11 Tagen wurden die den Mäusen entnommenden Milzzellen (5 × 10⁷ Zellen in 10 ml) in vitro mit dem zu testenden Peptid (10 μM) stimuliert. Am 6. Tag der Kultur wurden die ansprechenden Populationen getestet, um eine spezifische Cytotoxizität zu bestimmen. In bestimmten Fällen wurden die ansprechenden Zellen in vitro erneut in Intervallen von einer Woche mit 2 × 10⁶ HHD-Milzzellen, die bestrahlt worden waren (3000 rad), und 10 μM Peptid in Gegenwart von 20 UI/ml rekombinantem IL2 erneut stimuliert.
Die Zellen RMA-HHD und RMAS-HHD wurden als Targets zur Untersuchung der Cytotoxizität verwendet. Diese Zellen wurden durch Transfektion von murinen RMA-Zellen und ihrer varianten RMAS-Zellen, die bezüglich TAP defizient sind, mit der Konstruktion HHD erhalten, wie es von PASCOLO et al. [J. Exp. Med., 185, 2043, (1997)] beschrieben ist. Sie wurden durch Viren infiziert, die die unterschiedlichen Antigene exprimieren, von denen die zu testenden Peptide stammten.
Die verwendeten Viren sind die Folgenden: das rekombinante Virus des Vakzins, exprimierend VIHgag VVTG1144 (vac-VIHgag), beschrieben in JOHNSON [J. Immunol., 147, 1512, (1991)]; das rekombinante Virus des Vakzins, das HER-2/neu VT39 exprimiert (vac-neu) (Therion Biologics); das Virus des Vakzins vac-gp100, beschrieben von YANG [J. Immunol. 164, 4204, (2000)]; ein Virus des Vakzins vom Wildtyp (vac-WT); und das Virus flu PR8 der Influenza, beschrieben durch VIRELIZIER [J. Immunol., 115, 2, 434–439, (1975)]. Für Virusinfektionen wurden die Zellen RMA-HHD während 16 Stunden mit dem Virus des Vakzins (10 KbE/Zelle), rekombinant oder wild, oder mit dem Virus flu PR8 (50 HAU) während 2 Stunden inkubiert.
Die Targetzellen wurden mit 150 μCi⁵¹Cr während 90 Minuten markiert, dann dreimal gewaschen und auf Platten mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden verteilt (10⁴ Zellen/Vertiefung in 100 μl RPMI 1640 + 3% fötales Kälberserum).
Die nicht-infizierten RMA-HHD- oder RMAS-HHD-Zellen wurden mit 1 μM zu testendem Peptid bei 37°C während 90 Minuten beladen.
Dann wurden 100 μl Effektorzellen in verschiedenen Konzentrationen in die Vertiefungen gegeben und die Platten wurden 4 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 100 μl Überstand gesammelt und die Radioaktivität wird in einem γ-Zähler gemessen.
Die prozentuale spezifische Lyse wurde durch die folgende Formel errechnet: [(Experimentelle Freisetzung von ⁵¹Cr-spontane Freisetzung von ⁵¹Cr)/(maximale Freisetzung von ⁵¹Cr-spontane Freisetzung von ⁵¹Cr)] × 100. In allen Experimenten war die spontane Freisetzung unter 20% der maximalen Freisetzung, die durch 3N HCl induziert wurde.

Als Funktion ihrer Fähigkeit, an das Molekül HLA A2.1 zu binden und dieses zu stabilisieren und ihrer Immunogenität wurden die 34 Peptide in drei unterschiedliche Gruppen eingeteilt; die Resultate dieser Klassifizierung sind in Tabelle II dargestellt. Tabelle II

PEPTIDE	RA	DC50 (STUNDEN)	RESPONDER*/GESAMTZAHL DER MÄUSE
GRUPPE I
HIVgag 76	1,0	> 8	7/10
Flu M58	0,2	> 8	4/6
HBVpol 575	2,5	> 8	6/8
HBVpol 765	2,0	4	ND
Mart-127	2,2	2–4	4/5
gp100 177	0.5	> 6	3/5
gp100 178	0,3	6–3	4/6
gp100 154	2,3	6–8	7/9
gp100 570	1,0	4–6	6/9
gp100 209	1,3	4	4/6
gp100 476	10,0	6	8/10
gp100 457	1,6	2–4	416
HER-2/neu 799	1,0	6–8	3/4
HER-2/neu 369	2,3	4	12/13
HER-2/neu 789	1,6	6–8	4/6
HER-2/neu 48	1,7	> 8	5/6
HER-2/neu 773	1,7	6	2/3
HER-2/neu 5	2,3	> 8	5/6
HER-2/neu 689	2	4	5/6
Gruppe II
Tyrosinase 1	> 60,0	2–4	4/23
Mart-132	21,1	4	0/10
HER-2/neu 851	24,0	4	1/12
HER-2/neu 661	> 60,0	2–4	0/6
HER-2/neu 1023	19,6	4	5/10
Gruppe III
HBVpol 28	5,3	< 2	0/6
HBVpol 594	4,2	< 2	0/6
HBVpal 985	43,3	< 2	0/6
Tyrosinase 224	> 50,0	< 2	0/6
Tyrosinase 207	> 50,0	2	0/6
HER-2/neu 650	1,4	< 2	0/6
HER-2/neu 466	4,8	2	0/6
HER-2/neu 402	19,0	< 2	0/6
HER-2/neu 391	> 70,0	2	0/6
HER-2/neu 971	> 70,0	2	0/6

* Man beobachtet, dass die Mäuse, die mit spezifischer Cytotoxizität gegen gepulste Targets durch ein Peptid ansprechen, über 15% der Toxizität gegenüber nicht-geladenen Targets ist.

Die erste Gruppe besteht aus 19 Peptiden, die eine RA ≤ 10 und einen DC50-Wert > 2 Stunden haben. Sie entsprechen den Epitopen von Virus- oder Tumorantigenen (mit Ausnahme von HBVpol 765 und HER-2/neu 48) und lösen eine CTL-Antwort bei einem erhöhten prozentualen Anteil (60 bis 92%) der HHD-Mäuse aus.
Die zweite Gruppe von fünf Peptiden mit einer RA > 10 und einem DC50-Wert > 2 Stunden umfasst drei bekannte Epitope und ein potentielles Epitop (HER-2/neu 661). Zwei von ihnen sind nicht-immunogen (Mart-1 32, HER-2/neu 661), während HER-2/neu 851 und Tyrosinase 1 eine Antwort bei einem schwachen prozentualen Anteil der HHD-Mäuse (8% bzw. 17%) induzieren.
Zu der dritten Gruppe gehören zehn Peptide mit einem DC50-Wert < 2 Stunden und mit einer variablen RA. Sie entsprechen keinen bekannten Epitopen (mit Ausnahme von HER-2/neu 971) und sie sind bei HHD-Mäusen nicht immunogen, selbst wenn sie eine erhöhte RA haben, wie HBVpol 28, HBVpol 594, HER-2/neu 650 und HER-2/neu 466.
Aus diesen Resultaten können die folgenden Schlussfolgerungen gezogen werden: (i) sekundäre Verankerungsmotive beeinflussen die HLA A2.1-Bindung stark, da Peptide mit den primären HLA A2.1-Verankerungsresten ein sehr großes Spektrum der Affinitäten aufweisen, (ii) die Bindungsaffinität steht nicht immer in Korrelation mit der Fähigkeit, das Molekül HLA A2.1 zu stabilisieren. Die Peptide Mart-1 32 und HER-2/neu 851 sind schwache Bindemittel, allerdings bilden sie stabile Komplexe Peptid/HLA A2.1. Dagegen sind die Peptide HBVpol 28, HBVpol 594, HER-2/neu 650 und HER-2/neu 466 kräftige Bindemittel, aber sie bilden instabile Komplexe mit dem Molekül HLA A2.1, (iii) die Immunogenität der Peptide hängt in erster Linie von ihrer Fähigkeit, das Molekül HLA A2.1 zu stabilisieren, ab. Peptide mit einem DC50-Wert < 2 Stunden sind niemals immunogen, selbst wenn sie eine starke Bindungsaffinität haben. Unterdessen reicht eine Stabilität des HLA A2.1, die durch ein Peptid induziert wird, nicht aus, um eine Immunogenität sicherzustellen. In der Tat können Peptide mit einem DC50-Wert > 2 Stunden nicht immunogen sein (Mart-1 32 und HER-2/neu 661) oder sehr schwach immunogen sein (Tyrosinase 1 und HER-2/neu 851), wenn sie eine schwache Bindungsaffinität aufweisen.
Es scheint demnach, dass es notwendig ist, gleichzeitig die Bindungsaffinität und die Fähigkeit, das Molekül HLA A2.1 zu stabilisieren, zu verbessern, damit die Peptide eine starke CTL-Antwort erzeugen.
BEISPIEL 2: EFFEKT DES ERSATZES DES RESTES IN POSITION P1 DURCH EIN TYROSIN AUF DIE AFFINITÄT UND DIE STABILITÄT DES KOMPLEXES HLA A2.1/PEPTID.
Varianten von 33 Peptiden, die in Beispiel 1 beschrieben wurden, die in dem Ersatz der ersten N-terminalen Aminosäure durch ein Tyrosin resultieren (Substitution P1Y), wurden synthetisiert. Diese Varianten wurden bezüglich ihrer Affinität für das Molekül HLA A2.1 und ihrer Fähigkeit, den gebildeten Komplex zu stabilisieren, getestet.

Die Resultate sind in Tabelle III angegeben. Tabelle III

(Peptid	RA WT/RA Y1	DC50 Y1-DC50 WT
HIVgag 76	↑ 3,0	= 0
Flu M58	↑ 2,4	= 0
HBVpol 575	↑ 2,6	= 0
HBVpol 765	↑ 40,4	↑ 4
Mart-127	↑ 2	= 0
gp100 177	= 0,6	↑ 2
gp100 178	= 0,8	↑ 2
gp100 154	= 0,8	↓ 2
gp100 570	↑ 13,4	↑ > 2
gp100 209	= 1,7	↑ 2
gp100 476	↑ 4,2	↑ 2
gp100 457	↑ 2,3	↑ > 2
HER-2/neu 369	↑ 3,9	↑ > 2
HER-2/neu 799	↑ 3,9	↑ > 2
HER-2/neu 789	↑ 2,1	= 0
HER-2/neu 48	↑ 3,0	= 0
HER-2/neu 773	↑ 2,0	↑ 2
HER-2/neu 5	= 1,1	= 0
HER-2/neu 689	↑ 3,1	↑ > 2
Tyrosinase 1	↑ > 3,7	↑ > 2
Mart-1 32	↑ 16,2	↑ 2
HER-2/neu 851	↑ 3,0	↑ 2
HER-2/neu 661	↑ > 1,5	↑ 2
HBVpol 28	↑ 2,3	↑ > 2
HBVpol 594	↑ 14,8	↑ > 6
HBVpol 985	↑ 13,7	↑ > 6
Tyrosinase 224	↑ > 5,1	↑ > 2
Tyrosinase 207	↑ > 6,4	↑ > 4
HER-2/neu 650	↑ 6,0	↑ > 4
HER-2/neu 466	↑ 3,3	↑ > 4
HER-2/neu 402	↑ 5,2	↑ > 2
HER-2/neu 391	↑ 55,5	↑ > 6
HER-2/neu 971	↑ 11,6	↑ 2

Diese Resultate zeigen, dass der Austausch bzw. der Ersatz P1Y die Bindung aller Peptide mit schwacher Affinität erhöht und die Stabilisierung von HLA A2.1 für alle schwach stabilisierenden Peptide (Gruppen II und III in Tabelle II) begünstigt. Die Affinitätserhöhung, gemessen durch das Verhältnis zwischen der RA des modifizierten Peptids und des natürlichen Peptids, ist mindestens 1,5 und geht bis 55,5, während die Erhöhung der Stabilisierung von HLA A2.1, gemessen durch die Differenz zwischen dem DC50-Wert des modifizieren Peptids und des natürlichen Peptids, mindestens 2 Stunden ist und bis zu 6 Stunden geht. Die RA aller modifizierten Peptide, ausgenommen eines unter ihnen (HER-2/neu 661 Y1), liegt unter 10 und ihr DC-Wert ist > 4 Stunden. Für die Peptide Tyrosinase 1 und HER-2/neu 661 erzeugt die Modifikation P1Y keine Peptide mit einer sehr starken Affinität. Dies ist durch das Vorliegen von sekundären Verankerungsresten P3–P8/9, die für die Bindung von HLA A2.1 ungünstig sind, in diesen Peptiden bedingt.
Die Wirkung der Substitution P1Y ist nicht auf die Peptide mit schwacher Affinität beschränkt, sondern wird auch bei der Mehrzahl der Peptide mit starker Affinität (Gruppe I der Tabelle II) beobachtet. Lediglich zwei der neuzehn Peptide mit starker Affinität verbesserten weder ihre Bindungsaffinität noch ihre Stabilisierungsfähigkeit (gp100 154 und HER-2/neu 5). Es muss betont werden, dass eine Erhöhung der Affinität von der Natur des Restes in Position 1 des nativen Peptids unabhängig ist und dass sie selbst dann beobachtet wird, wenn der substituierte Rest kein Rest ist, der für die Bindung mit HLA A2.1 ungünstig ist. Lediglich vier der 19 Peptide, die ein Verhältnis RA des natürlichen Peptids/RA des modifizierten Peptids von über 3 haben, sind ein Rest, der in P1 ungünstig ist (P für HER-2/neu 391, HER-2/neu 650 und HBVpol 594, E für HER-2/neu 971). Die Affinitätserhöhung dieser vier Peptide ist jedenfalls sehr bedeutend: sie liegt zwischen 6 und 55,5.
Unterdessen wird die Affinität selbst dann erhöht, wenn Y einen anderen günstigen Rest wie F ersetzt (HBVpol 575 und Tyrosinase 207).
Diese Resultate zeigen, dass eine Substitution P1Y die Bindung an HLA A2.1 und die Stabilisierungsfähigkeit des gebildeten Komplexes für fast alle an HLA A2.1 gebundenen Peptide erhöht. Dieser Effekt ist für die nicht-immunogenen Peptide mit schwacher Affinität für HLA A2.1 noch ausgeprägter.
BEISPIEL 3: GEKREUZTE ERKENNUNG DER NATÜRLICHEN PEPTIDE UND IHRER P1Y-VARIANTEN DURCH SPEZIFISCHE CTL
Die Erhöhung der Affinität für HLA A2.1 ist die erste Bedingung, um Peptide mit schwacher Affinität immunogen zu machen. Es ist jedoch auch notwendig, dass ihre Konformation in dem Komplex mit HLA A2.1 nicht-modifiziert wird und dass ihre antigene Spezifität konserviert wird. Wenn dies der Fall ist, müssen CTL, die bei den HHD-Mäusen, die mit dem nativen Peptid geimpft wurden, erzeugt werden, dieses und seine Variante P1Y mit derselben Wirksamkeit erkennen. Darüber hinaus müssen die Varianten P1Y in der Lage sein, in vivo das Repertoire der CTL, die für das natürliche Peptid spezifisch sind, zu rekrutieren.
Die Erkennung der Varianten P1Y durch für das natürliche Peptid spezifische CTL wurde zunächst untersucht. CTL, die bei HHD-Mäusen induziert wurden, welche mit den Peptiden HIVgag 76, HBVpol 575, gp100 154, gp100 457, gp100 476, gp100 570, gp100 177 oder HER-2/neu 369 sensibilisiert worden waren, wurden bezüglich ihrer Fähigkeit, Target-RMAS-HHD, die entweder mit den natürlichen Peptiden (WT) oder mit den entsprechenden P1V-Varianten (P1Y) beladen waren, zu töten, getestet.
1 stellt die Resultate dar (% Lyse als Funktion des Verhältnisses Effektorzellen/Targetzellen), die mit acht unterschiedlichen Peptiden erhalten wurden.

RMAS-HHD-Zellen, beladen mit dem natürlichen Peptid:
RMAS-HHD-Zellen, beladen mit dem Peptid P1Y:
RMAS-HHD-Zellen, nicht-beladen:
.

Diese Resultate zeigen, dass die CTL, die bei den HHD-Mäusen induziert wurden, welche mit den Peptiden HIVgag 76, HBVpol 575, gp100 154, gp100 457, gp100 476, gp100 570, gp100 177 und HER-2/neu 369 sensibilisiert worden waren, die RMAS-HHD-Zellen, die mit dem natürlichen Peptid oder mit seiner Variante P1Y beladen waren, mit derselben Wirksamkeit töten.
Die P1Y-Varianten sind auch fähig, in vivo die CTL, die für das natürliche Peptid spezifisch sind, zu rekrutieren. Milzzellen von HHD-Mäusen, die mit den P1Y-Varianten HIVgag 76Y1, HBVpol 575Y1, gp100 154Y1, gp100 457Y1; gp100 476Y1, gp100 570Y1, gp100 177Y1 und HER-2/neu 369Y1 sensibilisiert worden waren, wurden auf ihre Fähigkeit, RMAS-HHD-Targets, die entweder mit den P1Y-Varianten (P1Y) oder mit den Peptiden des Wildtyps (WT) beladen waren, zu töten, untersucht.
Die Resultate (% Lyse als Funktion des Verhältnisses Effektorzellen/Targetzellen) sind in 2 dargestellt:

Diese Resultate zeigen, dass die Varianten P1Y CTL erzeugen, die die RMAS-HHD-Targets, die mit dem varianten Peptid oder dem entsprechenden natürlichen Peptid beladen sind, töten.
Außerdem induzieren alle diese varianten Peptide, ausgenommen gp100 154Y1, CTL bei einem erhöhten prozentualen Anteil von HHD-Mäusen, was die entsprechenden natürlichen Peptide nicht tun. Drei bis acht HHD-Mäuse wurden für jedes Peptid getestet und eine CTL-Antwort wurde bei 100% der Mäuse, die mit HIVgag 76Y1, HBVpol 575Y1, gp100 476Y1, gp100 570Y1 und HER-2/neu 369Y1 sensibilisiert worden waren, und bei 75% der Mäuse, die mit gp100 457Y1, gp100 177Y1 und gp100 154Y1 sensibilisiert worden waren, induziert.
Darüber hinaus erkannten die CTL, die durch die P1Y-Varianten induziert worden waren, diese Varianten und die natürlichen entsprechenden Peptide mit vergleichbaren Affinitäten.
Die CTL, die bei den Mäusen erzeugt worden waren, die mit den P1Y-Varianten HER-2/neu 369Y1, HIVgag 76Y1 und gp100 154Y1 sensibilisiert worden waren, wurden bezüglich ihrer Fähigkeit, Target-RMAs-HHD, die mit verschiedenen Konzentrationen des varianten Peptids P1Y oder des entsprechenden Wild-Peptids beladen worden waren, getestet.
Die Resultate (% Lyse in Funktion des Verhältnisses Effektorzellen/Targetzellen) werden durch die 3 dargestellt:

RMAS-HHD-Zellen, beladen mit dem natürlichen Peptid:
RMAS-HHD-Zellen, beladen mit dem Peptid P1Y:

Diese Resultate zeigen, dass die CTL, die durch Varianten P1Y bzw. die P1Y-Varianten induziert werden, eine Cytolyse ergeben, die gleich der Hälfte der maximalen Cytolyse ist, und zwar für ähnliche Mengen an variantem P1Y-Peptid und natürlichem Peptid.
Um eine Verwendung der P1Y-Varianten in der Immuntherapie ins Auge zu fassen, ist es darüber hinaus erforderlich, dass die CTL, die durch diese Varianten induziert werden, Epitope des Antigens, von dem sie abgeleitet sind, die natürlich prozessiert wurden, erkennen.
CTL, die bei Mäusen erzeugt wurden, welche durch HIVgag 761Y1, HER-2/neu 369Y1, HER-2/neu 5Y1, gp100 476Y1 und flu M58Y1 sensibilisiert waren, wurden untersucht, um ihre Fähigkeit, RMA-HHD-Zellen zu töten, welche durch die rekombinanten Viren vac-HIVgag, vac-neu, vac-gp100 oder flu PR8 infiziert waren und in endogener Art die entsprechenden viralen Antigene exprimierten, oder die mit dem Wildtypvirus vac-WT infiziert waren.
Die Resultate (% Lyse als Funktion des Verhältnisses Effektorzellen/Targetzellen) sind in 4 dargestellt:

RMA-HHD-Zellen, die mit vac-WT infiziert sind
;
RMA-HHD-Zellen, die mit vac-HIVgag infiziert sind
;
RMA-HHD-Zellen, die mit vac-neu infiziert sind
;
RMA-HHD-Zellen, die mit vac-gp100 infiziert sind
;
RMA-HHD-Zellen, die mit flu PR8 infiziert sind
;

Diese Resultate zeigen, dass die CTL, die für P1Y-Varianten spezifisch sind, das natürlich gereifte Epitop erkennen, da sie mit dem entsprechenden Virus infizierte Targets, nicht aber die durch vac-wt infizierten Targets töten.
Es scheint demnach, dass die Substitution P1Y den zwei Kriterien genügt, die für die Induktion einer CTL-Antwort gegen irgendein Peptid mit schwacher Affinität für HLA A2.1 notwendig sind, wie auch immer seine Sequenz ist. Zunächst erhöht sie die Bindungsaffinität und die Stabilisierung der Peptide, die an HLA A2.1 gebunden sind, und an zweiter Stelle wechselwirkt sie nicht mit der Peptid/TCR-Wechselwirkung und modifiziert daher ihre antigene Spezifität nicht.
BEISPIEL 4: WIEDERHERSTELLUNG DER IMMUNOGENITÄT VON NICHT-IMMUNOGENEN PEPTIDEN MIT SCHWACHER AFFINITÄT FÜR HLA A2.1 DURCH EINE P1Y-SUBSTITUTION
Mäuse werden mit den P1Y-Varianten der Peptide HER-2/neu 402, HER-2/neu 466, HER-2/neu 650, HER-2/neu 391, Tyrosinase 207, HBVpol 594, HBVpol 28 und HBVpol 985 geimpft. Elf Tage später werden ihre Milzzellen in vitro mit dem entsprechenden natürlichen Peptid restimuliert und die erzeugten CTL werden gegen die RMAS-HHD-Targetzellen, die nicht beladen sind oder mit dem natürlichen Peptid beladen sind, getestet.
Die Resultate (% Lyse als Funktion des Verhältnisses Effektorzellen/Targetzellen) werden in 5 dargestellt:

RMAS-HHD-Zellen, beladen mit dem natürlichen Peptid:
RMAS-HHD-Zellen, nicht-beladen:
.

Für jedes Peptid ist die Anzahl von Mäusen, die reagieren, angegeben. Diese Resultate zeigen, dass die HHD-Mäuse, die mit P1Y-Varianten sensibilisiert wurden, für das natürliche Peptid spezifische CTL erzeugen. Außerdem ist der Prozentwert der Mäuse, die eine Antwort bzw. Reaktion liefern, relativ hoch. Er liegt zwischen 33 und 77%.
Diese Angaben beweisen, dass eine P1Y-Substitution eine allgemeine Strategie zur Erhöhung der Immunogenität von nicht-immunogenen Peptiden mit schwacher Affinität für HLA A2.1 darstellt.
BEISPIEL 5: IDENTIFIZIERUNG VON SUBDOMINANTEN/KRYPTISCHEN EPITOPEN MT HILFE VON P1Y-VARIANTEN
Die Möglichkeit, eine CTL-Antwort gegen Peptide mit schwacher Affinität für HLA A2.1 zu induzieren, erlaubt es, subdominante/kryptische virale oder tumorale Epitope, die für eine spezifische Immuntherapie nützlich sind, zu identifizieren.
Diese Möglichkeit wird nachfolgend durch das Beispiel von 3 unterschiedlichen Antigenen veranschaulicht: das tumorale Antigen HER 2/neu, das HIV-1-Virus und die katalytische Untereinheit der Telomerase (hTERT).
HER-2/neu-Epitope:
Das Peptid HER-2/neu 650 nimmt nicht an der CTL-Antwort teil, die für HER-2/neu spezifisch ist und die bei Patienten entwickelt wird, die einen Tumor HER-2/neu+ tragen. Es sind zwei Hypothesen möglich: entweder handelt es sich um ein Epitop, das nicht natürlich durch tumorale Zellen gereift ist, die HER-2/neu exprimieren, oder es handelt sich um ein subdominantes/kryptisches Epitop.
Wie in Beispiel 1 oben beschrieben ist, bildet das Peptid HER-2/neu 650 instabile HLA A2.1-/Peptid-Komplexe und ist demnach nicht immunogen.

1) Um zu untersuchen, ob das Peptid HER-2/neu 650 einem subdominantere/kryptischen Epitop entspricht, werden die CTL, die bei Mäusen erzeugt werden, welche durch die Variante HER2/neu 650Y1 sensibilisiert wurden, auf ihre Fähigkeit hin untersucht, durch vac-neu infizierte RMA-HHD-Zellen abzutöten.

Die Resultate (% Lyse als Funktion des Verhältnisses Effektorzellen/Targetzellen) sind in 6 dargestellt:

RMA-HHD-Zellen, infiziert mit vac-WT
;
RMA-HHD-Zellen, infiziert mit vac-neu
.

Diese Resultate zeigen, dass CTL, die für HER-2/neu 650 spezifisch sind, Targetzellen abtöten, die mit vac-neu infiziert sind, nicht aber Targetzellen, die mit vac-WT infiziert sind, was beweist, dass das Peptid HER-2/neu 650 ein subdominantes/kryptisches Epitop von HER-2/neu ist.
Die P1Y-Varianten der Peptide HER-2/neu 466, HER-2/neu 402, HER-2/neu 661 und HER-2/neu 391 wurden in der gleichen Art getestet; mit Ausnahme der Variante PY1 von HER-2/neu 661 sind die Resultate ähnlich denen, die für HER-2/neu 650 beobachtet werden.
Die Peptide HER-2/neu 466, HER-2/neu 402 und HER-2/neu 391 bilden somit auch subdominante/kryptische Epitope von HER-2/neu.
Was HER-2/neu 661 betrifft, bestätigen die erhaltenen Resultate diejenigen, die die schwache Erhöhung der Affinität betreffen, die in Beispiel 2 oben beschrieben wurden. Zusätzli che Modifikationen müssen durchgeführt werden, um die Verwendung dieses Peptids als Immuntherapie ins Auge zu fassen.

2) Die Immunogenität der Varianten HER-2/neu 466Y1, HER-2/neu 402Y1, HER-2/neu 650Y1 und HER-2/neu 391Y1 gemäß der Erfindung im Vergleich zu einem immundominanten Peptid wurde auch an humanen Zellen evaluiert und mit derjenigen des immundominanten Peptids HER-2/neu 369 verglichen.

Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PMBC) wurden von gesunden HLA A2.1-Spendern erhalten und in 2 ml RPMI 1640-Kulturmedium, supplementiert mit 10 nM Glutamin, 250 Einheiten/ml Penicillin-Streptomycin und 10% durch Wärme inaktiviertem humanem AB-Serum, resuspendiert und während 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die nicht-anhaftenden Zellen wurden gesammelt und die anhaftend bleibenden Zellen wurden mit dem zu testenden Peptid (5 μM) bei 37°C während 90 Minuten beladen und mit 3000 rad bestrahlt; sie wurden dann zur Eliminierung des freien Peptids gewaschen.
3 × 10⁶ nicht-anhaftende Zellen wurden zu einem Endvolumen von 2 ml zu Kulturmedium, supplementiert mit 50 N/ml rekombinantem IL-2, gegeben. Am siebten Tag wurden sie gesammelt, gewaschen und in dem Kulturmedium suspendiert und mit 5 × 10⁶ autologen anhaftenden Zellen, die vorher mit dem zu testenden Peptid beladen worden waren, wie es oben beschrieben ist, restimuliert. Am nächsten Tag wurden 150 IU/ml rekombinantes IL-2 zugefügt. Am neunten oder zehnten Tag wurden die Kulturen mit 300 IU/ml rekombinantem IL-2 komplementiert. Bei Bedarf wurde das Medium ausgetauscht, indem 1 ml Kulturüberstand entnommen wurde und durch 1 ml Kulturmedium, das 300 IU/ml rekombinantes IL-2 enthält, ersetzt wurde. Dieser Vorgang wird wenigstens dreimal in Intervallen von einer Woche wiederholt.
T2-Zellen, die mit dem nativen Peptid beladen wurden (1 μM Peptid, 37°C, 90 Minuten), das dem zu testenden P1Y-Peptid entspricht, wurden als Targets verwendet, um die Cytotoxizitat zu untersuchen.
Die Resultate (% Lyse als Funktion des Verhältnisses Effektorzellen/Targetzellen) für jedes der getesteten Peptide sind in 7 dargestellt:

T2-Zellen, beladen mit dem natürlichen Peptid:
T2-Zellen, nicht-beladen:
.

Diese Resultate zeigen, dass die P1Y-Substitution auch die Immunogenität gegenüber humanen Zellen erhöht.

3) Um zu verifizieren, ob die P1Y-Peptide humane CTL induzieren würden, die spezifisch für natürlich prozessierte tumorale Epitope sind, wurden CTL, die wie oben beschrieben, ausgehend von humanen PBMC von 3 unterschiedlichen Spender, stimuliert durch HER-2/neu 369 oder durch die Peptide HER-2/neu 466Y1, HER-2/neu 402, HER-2/neu 650 Y1 und HER-2/neu 391 Y1, auch bezüglich ihrer Fähigkeit, humane Tumorzellen HLA A2.1+, die in mehr oder weniger großer Menge das Epitop HER-2/neu exprimieren, zu töten, getestet.

Die als Zellziele verwendeten tumoralen Zellen sind die Folgenden:

– 4 Zelllinien HLA A2.1+/HER-2/Neu+: MC F-7 [ZAKS, Cancer Res.. 58, 4902, (1998)]; PUB/N (humane Tumorzelllinie von nicht kleinzelligem Lungenkrebs); HCT-116 [BROSSART, Cancer Res., 58, 732, (1998)]; LAW (humane Tumorlinie von Nierenkrebs);
– 2 Zelllinien HLA A2.1+/HER-2/neu-: ZR 75.1 [OSBORNE et al., Cancer Res., 139, 2422–2428, (1979)]; SUP/M2 [MORGAN et al., Blood, 73, 8, 2155–2164, (1989)];
– als Vergleich die Linie K562, die gegenüber einer Lyse durch die NK-Zellen empfindlich ist.

Die Expression des Tumorantigens HER-2/neu durch diese Zellen, evaluiert durch Immunfluoreszenz mit Hilfe eines monoklonalen anti-HER-2/neu-Antikörpers, wird durch die folgende Tabelle IV dargestellt. Tabelle IV

Zelllinie HER-2/neu (FI)

ZR75.1 0,12

SUP/M2 0,11

MCF-7 1,94

HCT-116 1,23

PUB/N 1,33

LAW 0,35
Die Resultate dieser Cytotoxizitäts-Assays (% Lyse als Funktion des Verhältnisses Effektorzellen/Targetzellen; Verhältnisse E/T: 40/1; 20/1) für jedes der getesteten Peptide sind in 8 dargestellt;

ZR75.1-Zellen:
SUP/M2-Zellen:
MCF-7-Zellen:
HCT-116-Zellen:
PUB/N-Zellen:
LAW-Zellen:

Es wird keine Cytotoxizität gegenüber den Zellen K562 beobachtet.
Diese Resultate zeigen, dass die CTL, die ausgehend von PMBC von 3 verschiedenen Spender, stimuliert durch die varianten Peptide P1Y, erhalten wurden, die die Zellen HER-2/neu+ MCF-7, PUB/N, HCT-116 und LAW lysieren, nicht aber die Zellen HER-2/neu-ZR75.1 und SUP/M2.
Es ist zu betonen, dass die Lyse auch im Fall der Zellen LAW, die das Antigen HER-2/neu nur schwach exprimieren, ebenso wirksam ist wie im Fall der Zellen MCF-7, PUB/N und HCT-116, die es auf einem erhöhten Niveau exprimieren. Dies zeigt, dass die Präsentation der Epitope mit schwacher Affinität keine Expression des Antigens auf einem erhöhten Niveau benötigt.
Epitope von HIV 1:
Die Substitution bzw. der Austausch P1Y wurde verwendet, um neue subdominante/kryptische Epitope von HIV 1 zu identifizieren.
17 Peptide von Gag, Pol, Env und Nef von HIV wurden aus der vollständigen Polypeptidsequenz von HIV 1 ausgewählt. Die Liste dieser Peptide ist in der folgenden Tabelle V dargestellt. Tabelle V

* Die Nummerierung der Aminosäuren basiert auf der Sequenz des Klons HIV 1 WEAU 1.60 (Zugangsnummer Genbank U21135). Diese Referenz wird einfach angegeben, um die Lokalisierung der Peptide dieser Tabelle bezüglich viraler Proteine anzugeben; die Sequenz dieser Peptide ist nicht immer vollständig identisch mit der der entsprechenden Peptide des Klons WEAU.
*** Die Häufigkeit wurde ausgehend von verfügbaren Isolaten auf der Basis der Angaben der „HIV Molecular Immunology Database" errechnet.

Die relative Affinität dieser Peptide für HLA A2.1 (Referenzpeptid I9V) und die Stabilität des Komplexes Peptid/HLA A2.1 wurden für das native Peptid und für seine Variante, die aus dem Ersatz der N-terminalen Aminosäure durch ein Tyrosin resultiert, bestimmt, wie es in Beispiel 1 oben beschrieben wurde.

Die Resultate sind in der folgenden Tabelle VI dargestellt. Tabelle VI

CD8-Epitopenpeptide		Native Peptide		P1Y-Peptide
CD8-Epitopenpeptide		RA	DC	RA	DC
GAG	591	2,2	> 6 h	5	> 6 h
	T9V	5,5	3,5 h	5,5	> 6 h
	E9V	21	< 2 h	1,7	> 6 h
POL	110V	10	< 2 h	1,5	4 h
	A9M	5	2 h	1,75	> 6 h
	V11V	4,5	2 h	2,5	3,5 h
	V9L	> 100	ND	8,6	< 2 h
	I9V	1	5 h	ND	ND
	P9L	> 100	ND	4,6	< 2 h
	E11Q	> 100	ND	> 100	ND
	E10L	> 100	ND	10	< 2 h
	19V	3,1	> 6 h	1,3	> 6 h
ENV	K9L	1,35	> 6 h	0,7	> 6 h
	K9L/T	0,65	> 6 h	0,4	> 6 h
	R9V	> 100	ND	5	ND
NEF	P10L	> 100	ND	5	ND
	A9L	> 100	ND	7	> 6 h

Die zwei Peptide gagp 24-212 (E9V) und pol 79 (L10V) haben eine schwache Affinität und ein schwaches Stabilisierungsvermögen (RA > 5 und DC < 2 Stunden); dagegen haben ihre P1Y-Varianten eine starke Affinität und ein starkes Stabilisierungsvermögen (RA < 5 und DC > 2 Stunden). Die Immunogenität der Peptide E9V und L10V und ihrer P1Y-Varianten wurde ebenfalls getestet. Die nativen Peptide sind nicht immunogen; dagegen sind ihre Varianten sowohl bei den HHD-Mäusen wie beim Menschen immunogen.
Außerdem wurden auch CTL, die ausgehend von humanen PBMC, die von 6 unterschiedlichen Spender stammten, erzeugt worden waren, die in vitro durch autologe Zellen, die mit dem varianten Peptid E9VY oder dem varianten Peptid L10VY beladen worden waren oder durch das immundominante native Peptid S9L stimuliert worden waren, auf ihr Vermögen RMA-HHH-Zellen (RMA-Zellen, die das native Molekül HLA A2.1 exprimieren), die durch ein rekombinantes Virus des Vakzins, das das Protein gag oder das Protein pol von HIV1(Isolat LAI) exprimiert, oder durch ein Virus des Kontrollvakzins vom Wildtyp infiziert waren, zu töten, untersucht.
Die Resultate sind in 9 dargestellt (auf der Abszisse % spezifische Lyse; auf der Ordinate das Verhältnis Effektorzellen/Targetzellen). Diese Resultate zeigen, dass die Peptide E9V und L10V natürlicherweise durch Zellen präsentiert werden, die HLA A2.1 und das virale Protein, von dem sie stammen (gag für E9V und pol für L10V), exprimieren.
Epitope der katalytischen Untereinheit der Telomerase (hTERT):
Die Substitution P1Y wurde verwendet, um zu bestimmen, ob die katalytische Untereinheit der Telomerase (hTERT) Epitope besitzt, die fähig sind, eine cytotoxische T-Antwort zu induzieren.
Es wurden 8 Peptide aus der Polypeptidsequenz der katalytischen Untereinheit der Telomerase (hTERT) ausgewählt.
Die relative Affinität dieser Peptide für HLA A2.1 und die Stabilität des Komplexes Peptid/HLA A2.1 wurden bestimmt, wie es in Beispiel 1 oben beschrieben ist (Referenzpeptid: HIVpol 589).
Die Resultate sind in Tabelle VII unten angegeben: Tabelle VII
Die zwei Peptide mhp 572 und mhp 988 haben eine schwache Affinität und ein schwaches Stabilisierungsvermögen (RA > 5 und DC 50 < 2 Stunden). Diese 2 Peptide sind außerdem der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase (hTERT) und der katalytischen Untereinheit der Maustelomerase (mTERT) gemeinsam. Die P1Y-Varianten dieser 2 Peptide, die aus dem Ersatz der N-terminalen Aminosäure durch ein Tyrosin resultieren, wurden hergestellt und ihre relative Affinität für HLA A2.1 und die Stabilität des Komplexes Peptid/HLA A2.1 wurden bestimmt.
Die Resultate, die in der folgenden Tabelle VIII angegeben sind, zeigen, dass diese Varianten mhp 572Y1 und mhp 988Y1 starke Affinität und starkes Stabilisierungsvermögen haben (RA < 5 und DC50 > 2 Stunden). Tabelle VIII
CTL, erzeugt aus humanen PBMC von verschiedenen Blutspendern, in vitro stimuliert durch autologe Dendritenzellen, die mit dem varianten Peptid mhp 572Y1 oder dem varianten Peptid mhp 988Y1 beladen waren, wurden bezüglich ihrer Fähigkeit, die humanen Tumorzellen HLA A2.1/hTERT+ abzutöten, untersucht: U266 [VONDERHEIDE, Immunity, 10, 11, (1999)] oder HSS HLA A2.1-/hTERT+: [VONDERHEIDE, Immunity, 10, 11, (1999)].
Die Resultate (% Lyse als Funktion des Verhältnisses Effektorzellen/Targetzellen; Verhältnisse FIT: 40/1; 20/1; 10/1) sind in 10 dargestellt: man beobachtet keine Lyse für die HSS-Tumorzellen, die HLA A2.1 nicht exprimieren; dagegen beobachtet man eine starke Lyse im Fall der Tumorzellen U266, die gleichzeitig die katalytische Untereinheit der Telomerase (HIRT) und HLA A2.1 exprimieren.
Diese Resultate zeigen, dass die Peptide mhp 572 und mhp 988 natürlicherweise durch die humanen Tumorzellen präsentiert werden und dass immunogene Derivate dieser Peptide potentiell in der Antitumor-Immuntherapie verwendbar sind.
BEISPIEL 6: ANTITUMORAKTIVITÄT DER P1Y-VARIANTEN
I. Derivate des Epitops der katalytischen Untereinheit der Telomerase (hTERT)
P1Y-Varianten (mhp 572Y1 und mhp 988Y1), die wie in Beispiel 2 beschrieben erhalten wurden, wurden bezüglich ihres Vermögens, in vivo eine Antitumorschutzantwort mit immundominanten Peptiden (mp 797 und mp 545) zu induzieren, getestet.
Zehn HHD-Mäuse, die wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt worden waren, wurden mit zwei Injektionen mit einem Intervall von zwei Wochen mit unterschiedlichen Peptiden, die von Synt:em (Nîmes, Frankreich) synthetisiert worden waren, geimpft.
Sieben Tage nach der letzten Injektion wurden den Mäusen, die mit den Peptiden mhp 572Y1, mhp 988Y1, mp 797 und mp 545 geimpft worden waren, EL-4/HHD Tumorzellen implantiert [PASCOLO et al., J. Exp. Med., 185, 2043–2051 (1997)].
Die Wirksamkeit des Antitumorschutzes wird evaluiert, indem die Größe der Tumoren 28 Tage nach ihrer Implantation gemessen wird (11 A₁ und 11 A₂: Größe der Tumoren als Funktion der zur Impfung verwendeten Peptide), und auch durch das Überleben der Mäuse mit Implantat (11 B: % Überleben als Funktion der Tage nach der Implantation der Tumorzellen).
Die Resultate sind in den 11 A₁, 11 A₂ und 11 B dargestellt: man beobachte, dass am Tag 28 die Tumoren 490 ± 144 mm² bzw. 653 ± 148 mm² bei den nicht-behandelten Mäusen (Kontrolle) und mit dem Peptid mp 797 behandelten Mäusen messen, 421 ± 170 mm² bzw. 489 ± 209 mm² bei den nicht-behandelten Mäusen (Kontrolle) und bei den mit dem Peptid mp 545 behandelten Mäusen messen, dass aber die Gruppe von Mäusen, die mit den Peptiden mhp 572Y1 und mhp 988Y1 geimpft waren, die Tumoren 232 ± 244 mm² bzw. 190 ± 207 mm² (11 A₁) oder 213 ± 160 mm² (11 A₂) messen und dass 4 Mäuse, die mit mhp 572Y1 bzw. mhp 988Y1 geimpft waren, keine Tumoren am T28 aufweisen.
Alle nicht-geimpften Mäuse waren am T50 tot (11 B:
)
Für die mit den Peptiden mp 797 und mp 545 geimpften Mäuse (11 B:
und
) beobachtet man eine Mortalität ab T40 und die letzte Maus starb an T50.
Die Mortalität ist in der Gruppe von Mäusen, die mit mhp 572Y1 und mhp 988Y1 geimpft wurden, deutlich reduziert (11 B:
und
). Sie tritt am T40 auf und 4 Mäuse (40%) sind am T80 noch am Leben (11 B:
,
).
II. Derivate des Epitops HER-2/neu
P1Y-Varianten (HER-2/neu 650Y1, HER-2/neu 402Y1), erhalten wie in Beispiel 2 beschrieben, werden auf ihre Fähigkeit, in vivo eine Antitumorschutzantwort mit den immundominanten Peptiden (HER-2/neu 369, HER-2/neu 48) zu induzieren, untersucht.
Zehn HHD-Mäuse, erzeugt wie in Beispiel 1 beschrieben, werden mit zwei Injektionen in einem Intervall von zwei Wochen mit diesen verschiedenen Peptiden, synthetisiert durch Synt:em (Nîmes, Frankreich), geimpft.
HER-2/HHD/neu-Zellen werden erhalten, indem die Tumorzellen EL-4(HD mit cDNA, die für das Molekül HER-2/neu codiert, transfiziert werden.
Sieben Tage nach der letzten Injektion erhielten die Mäuse, die mit den Peptiden HER-2/neu 650Y1, HER-2/neu 402Y1, HER-2/neu 369 und HER-2/neu 48 geimpft worden waren, eine Implantierung mit den Tumorzellen EL-4/HHD/neu.
Die Wirksamkeit des Antitumorschutzes wurde evaluiert, indem die Größe der Tumoren 28 Tage nach Implantierung (12 A: Größe der Tumoren als Funktion der für die Vakzination verwendeten Peptide) gemessen wurde und das Überleben der Mäuse mit Implantierungen (12 B: Prozentwert an Überlebenden als Funktion der Anzahl der Tage nach Implantierung bzw. Implantation der Tumorzellen) bestimmt wurde.
Die Resultate zeigen, dass die Tumore am Tag T28 560 ± 93 mm², 474 ± 234 mm² und 564 ± 174 mm² bei den nicht-behandelten Mäusen (Kontrolle) bzw. bei den mit den Peptiden HER-2/neu 369 und HER-2/neu 48 behandelten Mäusen maßen, dass aber die Tumore in der Gruppe von Mäusen, die mit den Peptiden HER-2/neu 402Y1 und HER-2/neu 650Y1 geimpft worden waren, 323 ± 116 mm² bzw. 100 ± 99 mm² maßen und dass 4 Mäuse, die mit HER-2/neu 650Y1 geimpft worden waren, am T28 keine Tumoren aufwiesen.
Alle nicht-vakzinierten Mäuse waren am Tag T40 tot (12 B:
)
Für alle mit den Peptiden HER-2/neu 369 und HER-2/neu 48 geimpften Mäuse (12 B:
und
) trat die Mortalität nur am T32 auf und die letzte Maus starb am T52.
Die Mortalität ist in der Gruppe von Mäusen, die mit HER-2/neu 402Y1 und HER-2/neu 650Y1 geimpft waren, deutlich verringert (12 B:
und
). Sie wird nur ab T46 beobachtet und 3 Mäuse (30%) sind am T70 noch am Leben (12 B:
).
Die Gesamtheit dieser Resultate zeigt, dass nur die in P1 mit einem Tyrosin substituierten Formen der subdominanten/kryptischen Peptide (HER-2/neu 650Y1, HER-2/neu 402Y1, mhp 572Y1 und mhp 988Y1) fähig sind, in vivo eine wirksame Antitumorantwort zu erzeugen. Es scheint somit interessant zu sein, subdominante/kryptische Peptide in ihrer in P1 mit einem Tyrosin ausgetauschten Form bzw. substituierten Form in der Antitumor-Immuntherapie zu verwenden.
BEISPIEL 7: ANTITUMORAKTIVITÄT, INDUZIERT DURCH VAKZINE AUS DNA, DIE FÜR MEHRERE DOMINANTE UND SUBDOMINANTE/KRYPTISCHE EPITOPE CODIERT, DIE VON HER-2/neu ABGELEITET sind
Um die relativen Misserfolge der bis heute ausschließlich mit Hilfe von tumoralen Peptiden klinisch durchgeführten Assays abzumildern, besteht ein neuer Ansatz in der Antitumor-Immuntherapie darin, multispezifische Antworten durch eine genetische Immunisierung mit einer Polyepitopkonstruktion durchzuführen, die aus acht dominanten und vier subdominan ten/kryptischen Derivaten, die von HER-2/neu abgeleitet sind und auf HLA A2.1 beschränkt sind, besteht.
Selektion der Epitope
Die acht dominanten Epitope (HER-2/neu 799, HER-2/neu 369, HER-2/neu 789, HER-2/neu 689, HER-2/neu 773, HER-2/neu 5, HER-2/neu 48 und HER-2/neu 1023) weisen eine hohe Affinität für HLA A2.1 auf (RA < 5 und DC₅₀ > 4 Stunden), außer HER-2/neu 1023, das als solches mit einer mittleren Bindungsaffinität angesehen wird (RA > 5, DC₅₀ > 4 Stunden) (siehe Tabelle II, Beispiel 1).
Die vier subdominanten/kryptischen Epitope (HER-2/neu 466, HER-2/neu 402, HER-2/neu 391 und HER-2/neu 650) (siehe Tabelle II, Beispiel 1) weisen eine sehr schwache Bindungsaffinität auf und sind bei den HHD-Mäusen und beim Menschen nicht-immunogen, während die P1Y-Varianten (HER-2/neu 466Y, HER-2/neu 402Y1, HER-2/neu 391Y und HER-2/neu 650Y1), die wie in Beispiel 2 beschrieben erhalten wurden, eine große Affinität für HLA A2.1 aufweisen (RA < 4 und DC₅₀ > 4 Stunden). Diese P1Y-Varianten sind in der folgenden Tabelle IX angegeben: Tabelle IX
Die Immunogenität der P1Y-Varianten und der immundominanten Epitope wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll getestet.
Mäuse wurden subkutan mit jedem der zwölf oben genannten Peptide in Gegenwart des Epitops Th Iab, das von dem „Kern"-Antigen von HBV stammt, geimpft. Elf Tage später wurden ihre Milzzellen in vitro mit dem zu testenden Peptid (1 μg) während 6 Tagen restimuliert und die erzeugten CTL wurden gegen die MAS-HHD-Zielzellen, die mit den Immunisierungspeptiden oder einem Kontrollpeptid beladen waren, getestet.
Die Resultate (% Lyse als Funktion des Verhältnisses Effektorzellen/Targetzellen) sind in 13 dargestellt:

RMAS-HHD-Zellen, mit dem Immunisierungspeptid beladen:
RMAS-HHD-Zellen, mit einem Kontrollpeptid beladen:
.

Wie erwartet, rufen alle diese Epitope eine CTL-Antwort hervor und die, die durch die P1Y-Varianten hervorgerufen wurden, sind für die entsprechenden natürlichen Peptide spezifisch.
Selektion einer Polyepitopkonstruktion
Die Polyepitopkonstruktion (pet-neu) umfasst eine fortlaufende Folge der vorher genannten 12 Epitope, das heißt:

– die acht dominanten Epitope (HER-2/neu 799, HER-2/neu 369, HER-2/neu 789, HER-2/neu 689, HER-2/neu 773, HER-2/neu 5, HER-2/neu 48 und HER-2/neu 1023), die als Targets der Lymphozyten, die die Tumore infiltrieren (LIT) bei Krebs der Lunge, der Eierstöcke, des Magens und von RCC beschrieben wurden, und
– die vier subdominanten/kryptischen P1Y-Varianten (HER-2/neu 466Y, HER-2/neu 402Y1, HER-2/neu 391Y und HER-2/neu 650Y1), die wie in Beispiel 2 beschrieben erhalten worden waren.

Die Verwendung der obigen Polyepitopkonstruktion wurde für die Expression beim Menschen optimiert und jedes potentielle Initiationscodon wurde soweit wie möglich von der Initiationsstelle konserviert, insbesondere wenn Kosack-Konsequenzen eingebaut wurden. Ein SV5-pk-Motiv wurde an das 3'-Ende der Konstruktion angefügt, um die Verwirklichung der Expression von pet-neu in den transfizierten COS-Zellen zu ermöglichen (Expression des Anti-PK-Antikörpers mit 14 Aminosäuren).
Ein Plasmid mit 3,0 kb, Vax1 (Invitrogen), wurde ausgewählt, in dem für die Replikation in E. coli oder für die Expression des rekombinanten Proteins in den Säugerzellen nicht notwendige Sequenzen weggenommen wurden, um die homologen DNA-Sequenzen im humanen Genom zu limitieren, und um die Möglichkeit einer chromosomalen Integration zu minimieren. Dieses Plasmid umfasst das Gen für Resistenz gegenüber Kanamycin eher als gegenüber Ampicillin, und zwar in dem Maße, in dem die Aminoglycoside weniger geeignet sind, um beim Menschen eine allergische Antwort hervorzurufen. Die Expression wird durch die Promotor-Aktivator-Sequenzen des humanen Cytomegalovirus (CMV) gesteuert. Eine Beendigung der Transkription und eine Polyadenylierung der wirksamen mRNA wurden erhalten, indem das Polyadenylierungssignal des Rinderwachstumshormons verwendet wurde.
Die DNA von pet-neu wird synthetisiert und in den Vektor pVax1 (Vax1/pet-neu) kloniert.
Die Polyepitopkonstruktion, wie sie oben beschrieben ist, weist die folgenden Eigenschaften auf:

a) sie erlaubt die Prozessierung (l'apprêtage) jedes Epitops an seinem C-terminalen Ende und
b) sie schafft keine neuen Verknüpfungspeptide mit erhöhter Affinität für das Molekül HLA A2.1.

Die Prozessierung (l'apprêtage) am C-terminalen Ende wird durch zwei Vorhersagemodelle für eine Spaltung des Proteasoms evaluiert (netChop1.0, www.cbs.dtu.dk/services/ NetChopPAPROC, www.uni-tuebingen.de/uni:bcm/kuttler/links/html). Eine Vorhersage einer Spaltung durch zwei Modelle ist notwendig, um zu beurteilen, dass ein Epitop prozessiert ist.
Die Affinität der neuen Verknüpfungspeptide wird wie in Beispiel 1 präzisiert durch das Vorhersagemodell BIMAS evaluiert [PARKER et al., J. Immunol., 152, 163, (1994)]. Unter den verschiedenen evaluierten Anordnungen wurde die Anordnung der 14, die SEQ ID NO: 70 entspricht, gewählt, denn sie entspricht am besten den zwei oben präzisierten Eigenschaften. Die Epitope HER-2/neu 773, HER-2/neu 1023, HER-2/neu5, HER-2/neu 466Y, HER-2/neu 391Y, HER-2/neu 650Y1 wurden als modifiziert vorausgesagt und nur fünf neue Verknüpfungspeptide mit einer erhöhten Affinität für das Molekül HLA A2.1 konnten erzeugt werden (p67₉, p94₉, p17₉, p91₁₀, p63₁₀); diese Peptide wurden durch ihre Position in der Sequenz pet-neu (Positionen: 67, 94, 17, 91 und 63) und ihre Länge (9 oder 10 Aminosäuren) definiert.
I. Immunogenität von Vax1/pet-neu bei transgenen HHD-Mäusen
A. Fähigkeit von Vax1/pet-neu, in vivo spezifische CTL zu induzieren.
Die Immunogenität von Vax1/pet-neu wurde wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht:
HHD-Mäuse, die wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt worden waren, wurden intramuskulär mit zwei Injektionen im Abstand von 15 Tagen mit Vax1/pet-neu (150 μg) immunisiert. Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden ihre Milzzellen in vitro mit B-Zellen, die durch LPS aktiviert und mit jedem der zwölf Peptide beladen worden waren, restimuliert.
Die Cytotoxizität wurde mit Hilfe von RMAS-HHD-Zellen (Targetzellen), die mit dem Peptid, das dem entspricht, mit dem die B-Zellen beladen worden waren, oder mit einem Kontrollpeptid beladen waren, evaluiert.
Die Resultate, die von einer statistisch entnommenen immunisierten HHD-Maus stammen, sind in 14 dargestellt (% Lyse als Funktion des Verhältnisses Effektorzellen/Targetzellen).

RMAS-HHD-Zellen, beladen mit dem Peptid, das für die Zellen B verwendet wurde:
RMAS-HHD-Zellen, beladen mit einem Kontrollpeptid:
.

Die CTL töten die RMAS-HHD-Zellen, die jeweils mit einem der zwölft Peptide beladen sind, obgleich für CTL, die für bestimmte Peptide spezifisch sind, eine Lyse der RMAS-HHD-Zellen, die mit einem Kontrollpeptid beladen sind, beobachtet wird (nicht-spezifische Lyse).
Die wichtigsten spezifischen Lysen (30% über dem Hintergrund) werden mit HER-2/neu 773, HER-2/neu 799, HER-2/neu 369, HER-2/neu 689, HER-2/neu 402Y1 und HER-2/neu 391Y erhalten.
B. Fähigkeit der CTL, endogenes HER-2/neu zu erkennen.
Die bei den mit Vax1/pet-neu geimpften HHD-Mäusen induzierten CTL wurden auf ihre Fähigkeit, spezifisch endogenes HER-2/neu zu erkennen, getestet.
Die Resultate sind in 15 gezeigt (% Lyse als Funktion des Verhältnisses Effektorzellen (E)/Targetzellen (T)).
Die CTL wurden wie in A oben beschrieben induziert und gegen die Targetzellen EL-4/HHD
), die in Beispiel 6 beschrieben sind, und die Targetzellen EL-4/HHD/neu
, die durch Transfizieren der Zellen EL-4/HHD mit der cDNA, die für HER-2/neu codiert, erhalten wurden, getestet.
Die CTL, die für zwölf Peptide von pet-neu spezifisch sind, erkannten und töteten die Ziele bzw. die Targets EL-4/HHD/neu, die HER-2/neu exprimieren, aber nicht die Targets EL-4/HHD, die als negative Kontrolle verwendet wurden.
Für alle drei getesteten Mäuse wurde eine äußerst starke spezifische Lyse (> 20% über dem Hintergrund) für HER-2/neu 1023, HER-2/neu 789, HER-2/neu 48, HER-2/neu 689, HER-2/neu 466Y, HER-2/neu 402Y1 und HER-2/neu 391Y erhalten.
C. Faktor, der an der Induktion der CTL beteiligt ist.
Die Induktion der CTL benötigt entweder die Sensibilisierung mit Vax1/pet-neu oder resultiert auch aus der Wiederholung der in vitro-Stimulationen der naiven Milzzellen.
Die Immunogenität von Vax1/pet-neu wurde wie in Beispiel 1 beschrieben getestet: Sechs Mäuse wurden entweder mit der Konstruktion Vax1/pet-neu oder mit dem Vektor Vax1 immunisiert. Ihre Milzzellen wurden in vitro wiederholt mit den B-Zellen, die durch LPS aktiviert worden waren, und mit jedem zu testenden Peptid beladen worden waren (Effektorzellen) stimuliert.
Die Targetzellen, die verwendet wurden, um die Spezifität der CTL gegenüber HER-2/neu zu untersuchen, sind die RMAS-HHD-Zellen und die Zellen EL-4/HHD/neu, die wie in Beispiel 6 beschrieben erhalten worden waren.
Die Cytotoxizität wurde nach der dritten Stimulation in vitro getestet. Die RMAS-HHD-Zellen, die mit dem Peptid, das demjenigen entspricht, mit dem die B-Zellen beladen waren, oder mit einem Kontrollpeptid beladen waren, und die Zellen EL-4/HHD/neu wurden als Targetzellen verwendet.
Die Resultate sind in 16 gezeigt [% spezifische Lyse (die Lyse der Targetzellen, die mit einem Kontrollpeptid beladen waren, ist abgeleitet) nach einer Immunisierung mit Vax-1
oder Vax1/pet-neu (
].
Die mit Vax1/pet-neu sensibilisierten Milzzellen führten zu CTL, die für die zwölf Peptide spezifisch waren. In überraschender Weise wurden die CTL gegen die Mehrheit der Peptide, ausgenommen HER-2/neu 369 und HER-2/neu 789, aus Milzzellen, die mit dem Vektor Vax1 sensibilisiert worden waren, erzeugt. Für einige Peptide (HER-2/neu 1023, HER-2/neu 48, HER-2/neu 799, HER-2/neu 773, HER-2/neu 391Y) ist die Cytotoxizität der CTL, die ausgehend von mit Vax1 sensibilisierten Milzzellen induziert worden waren, fast so erhöht wie die Cytotoxizität der CTL, die ausgehend von mit Vax1/pet-neu sensibilisierten Milzzellen induziert worden waren (16) A. Dies zeigt, dass die wiederholten in vitro-Stimulationen ausreichend sind, um die Induktion von CTL auszulösen.
Obgleich diese CTL mit den Peptiden beladene Targets eliminieren, sind sie doch noch unfähig, Targetzellen, die endogenes HER-2/neu (EL-4/HHD/neu) exprimieren, zu erkennen und zu eliminieren, ganz im Gegensatz zu CTL, die aus mit Vax1/pet-neu sensibilisierten Milzzellen induziert wurden (16) B.
Die Gesamtheit dieser Resultate zeigt, dass die CTL, die für HER-2/neu spezifisch sind, fähig sind, wirksam die Tumorzellen zu eliminieren, die das Antigen exprimieren, durch eine Vax1/pet-neu-Vakzination erzeugt werden.
II. Die Vax1/pet-neu-Vakzination induziert in vivo eine Antitumorimmunität.
Die in vitro erhaltenen Resultate haben dazu geführt, zu untersuchen, ob die Vax1/petneu-Vakzination bzw. -Impfung in vivo eine schützende Antitumorimmunität induziert.
A. Effekt auf das Wachstum der Tumoren und Spezifität des Antitumorschutzes.
Ein Subklon der Zellen EL-4/HHD/neu, die wie in Beispiel 6 erzeugt worden waren, der extrem tumorigen ist, wird nach drei in vivo-Selektionen in den HHD-Mäusen erhalten. Er exprimiert HHD und HER-2/neu auf demselben Level wie die Elternzellen.
HHD-Mäuse, die wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt worden waren, werden mit 2 Injektionen mit einem Intervall von zwei Wochen mit der Konstruktion Vaxl/pet-neu (17 A und 17 C) oder mit dem leeren Vektor Vax1 (17 B) immunisiert oder werden nicht immunisiert (17 D).
Eine Woche nach der letzten Immunisierung werden den obigen Mäusen 2 × 10⁴ EL-4/HHD/neu-Zellen (17 A, 17 B und 17 D) oder EL-4/HHD/Tel-Aml-Zellen, die erhalten wurden, indem die Zellen EL-4/HHD mit der cDNA transfiziert wurden, die für das rekombinante Protein Tel-Aml codiert, implantiert, um in vivo die Spezifität der schützenden Antitumorimmunität zu untersuchen.
Das Wachstum der Tumoren wird alle 5 bis 7 Tage bis zum T28, wenn alle nicht-geimpften Mäuse tot sind, evaluiert und die Mäuse der restlichen Gruppe werden bezüglich ihrer Mortalität überwacht.
Die Resultate sind in 17 gezeigt (Größe der Tumoren als Funktion der Zahl der Tage nach der Implantierung der Tumorzellen).
Alle nicht-geimpften Kontrollmäuse (17 D) oder mit Vax1 geimpften Mäuse (17 B) entwickeln Tumore, die am T17 auftreten und sehr schnell größer werden. Am T28 messen die Tumore 772 ± 268 mm² bzw. 404 ± 121 mm² bei den Kontrollmäusen bzw. den mit Vax1 behandelten Mäusen (p = 0,04).
In der Gruppe von Mäusen, die mit Vax1/pet-neu geimpft waren (17 A), zeigen dagegen 2 von 9 Mäusen am T28 keine Tumore, andernfalls treten am T23 Tumore auf und wachsen langsam. Die Größe der Tumoren ist 116 ± 66 mm² (p = 0,0001 zum Vergleich mit den nicht-behandelten Mäusen oder mit den mit Vax1 behandelten Mäusen).
Diese schützende in vivo-Antitumorimmunität ist für HER-2/neu spezifisch, und zwar aufgrund der Tatsache, dass die mit Vax1/pet-neu geimpften Mäuse nicht gegen den Tumor EL-4/HHD/Tel-Aml geschützt sind (17 C). In der Tat entwickeln alle Mäuse Tumore und ihre Größe ist am T28 578 ± 231 mm².
B. Wirkung auf das Überleben der Mäuse und Spezifität des Antitumorschutzes.
Die Wirkung des Antitumorschutzes, der durch die Impfung Vax1/pet-neu induziert wurde, wird bestätigt, indem das Überleben der Mäuse, die Tumore tragen, untersucht wird.
HHD-Mäuse werden geimpft und erhalten eine Implantierung, wie es in A beschrieben ist. Ihre Mortalität wird bis zum T55 beschrieben.
Die Resultate sind in 18 gezeigt (% Überleben als Funktion der Zahl an Tagen nach Implantierung der Tumorzellen).
Alle nicht-geimpften Mäuse sterben am T32
.
Für die mit Vax1 geimpften Mäuse
beginnt die Mortalität am T32 und die letzte Maus stirbt am T42 (p = 0,04 im Vergleich zu den nicht-geimpften Mäusen).
Die Mortalität ist in der Gruppe von Mäusen, die mit Vax1/pet-neu geimpft wurden, deutlich verringert
. Sie beginnt am T39 und 5 Mäuse (56%) sind am T55 noch am Leben (p = 0,0008 im Vergleich zu nicht-behandelten Mäusen und mit Vax1 behandelten Mäusen).
Diese Schutzimmunität ist für HER-2/neu spezifisch, da die Mortalität der Mäuse, die mit Vax1/pet-neu behandelt wurden und die eine Implantierung des Tumors EL4/HHD/Tel-Aml erhielten
, ähnlich der Mortalität der Mäuse ist, die mit Vax1 behandelt wurden und die eine Implantierung mit den Tumorzellen EL-4/HHD/neu erhielten
. SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Identifizierung von subdominanten/kryptischen Epitopen, die durch das Klasse I-Molekül HLA A2.1 präsentiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens die folgenden Stufen umfasst: a) Auswahl aus der Sequenz eines Proteins, gegen das man eine cytotoxische T-Antwort induzieren möchte, wenigstens einer Peptidsequenz mit 8 bis 11 Aminosäuren, die das primäre Verankerungsmotiv des Moleküls HLA A2.1 ganz oder einen Teil davon besitzt und eine solche ist, dass der Komplex dieses Peptids mit dem Molekül HLA A2.1 eine DC50 von unter 2 Stunden besitzt; b) für jede ausgewählte Sequenz Herstellung eines varianten Peptids, das von der genannten Sequenz durch Substitution der N-terminalen Aminosäure durch einen Tyrosinrest abgeleitet wird; c) Bestimmung der Immunogenität jedes varianten Peptids, das in Stufe b) erhalten wurde, durch Selektion jedes immunogenen Peptids unter diesen, das eine spezifische CTL-Antwort gegenüber Targetzellen erzeugt, die das Protein exprimieren, das aus der in Stufe a) ausgewählten Peptidsequenz stammt, und Identifizierung der Peptidsequenz, von der das immunogene Peptid abgeleitet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die in Stufe a) ausgewählte Peptidsequenz einem Peptid entspricht, das verglichen mit HIVpol 589 (SEQ ID NO: 3) eine relative Affinität für das Molekül HLA A2.1 von über 5, vorzugsweise über 10, besitzt.
Verfahren zur Bestimmung einer Sequenz eines immunogenen Peptids, das durch das Klasse I-Molekül HLA A2.1 präsentiert wird, die fähig ist, eine cytotoxische T-Antwort, die gegen ein nicht immunogenes Epitop eines Targetproteins gerichtet ist, zu induzieren, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es wenigstens die folgenden Stufen umfasst: a) Identifizierung eines subdominanten/kryptischen Epitops des Proteins, gegen das man eine cytotoxische T-Antwort induzieren möchte, durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, und b) Modifikation der Sequenz des genannten subdominanten/kryptischen Epitops durch Substitution der N-terminalen Aminosäure durch einen Tyrosinrest.
Immunogenes Peptid, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Substitution der N-terminalen Aminosäure durch einen Tyrosinrest abgeleitet ist von einem subdominanten/kryptischen Epitop, das durch HLA A2.1 präsentiert wird, ausgewählt aus: dem Peptid HER-2/neu 650: PLTSIISAV (SEQ ID NO: 4) dem Peptid HER-2/neu 466: ALIHHNTHL (SEQ ID NO: 5) dem Peptid HER-2/neu 402: TLEEITGYL (SEQ ID NO: 6) dem Peptid HER-2/neu 391: PLQPEQLQV (SEQ ID NO: 7) dem Peptid gagp24–212: EMMTACQGV (SEQ ID NO: 8) dem Peptid pol 79: LLDTGADDTV (SEQ ID NO: 9) dem Peptid mhp 572: RLFFYRKSV (SEQ ID NO: 10) dem Peptid mhp 988: DLQVNSLQTV (SEQ ID NO: 11).
Subdominantes/kryptisches Epitop, das durch HLA A2.1 präsentiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um das Peptid mhp 988: DLQVNSLQTV (SEQ ID NO: 11) handelt.
Zusammensetzung, umfassend wenigstens ein immunogenes Peptidepitop gemäß Anspruch 4.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie außerdem ein weiteres immunogenes Epitop oder mehrere andere immunogene Epitope umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein chimäres Polypeptid umfasst, das eine Kopie oder mehrere Kopien eines immunogenen Peptidepitops nach Anspruch 4 umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das chimäre Polypeptid außerdem eine Kopie oder mehrere Kopien eines anderen immunogenen Epitops oder mehrerer anderer immunogener Epitope umfasst.
Nucleinsäuremolekül, das für ein chimäres Polypeptid nach einem der Ansprüche 8 oder 9 codiert.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz umfasst, die für das Epitop HER-2/neu 650Y1: YLTSIISAV (SEQ ID NO: 69) das Epitop HER-2/neu 466Y: YLIHHNTHL (SEQ ID NO: 66) das Epitop HER-2/neu 402Y1: YLEEITGYL (SEQ ID NO: 67) das Epitop HER-2/neu 391Y: YLQPEQLQV (SEQ ID NO: 68) codiert.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem eine Sequenz umfasst, die codiert für: das Epitop HER-2/neu 799: QLMPYGCLL (SEQ ID NO: 27) das Epitop HER-2/neu 369: KIFGSLAFL (SEQ ID NO: 28) das Epitop HER-2/neu 789: CLTSTVQLV (SEQ ID NO: 24) das Epitop HER-2/neu 689: RLLQETELV (SEQ ID NO: 65) das Epitop HER-2/neu 773: VMAGVGSPYV (SEQ ID NO: 31) das Epitop HER-2/neu 5: ALCRWGLLL (SEQ ID NO: 30) das Epitop HER-2/neu 48: HLYQGCQVV (SEQ ID NO: 25) das Epitop HER-2/neu 1023: YLVPQQGFFC (SEQ ID NO: 64).
Medikament, das als Wirkstoff wenigstens ein immunogenes Peptidepitop nach Anspruch 4 oder wenigstens eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder wenigstens ein Nucleinsäuremolekül nach den Ansprüchen 10 bis 12 umfasst.
Medikament nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es für die antivirale oder antitumorale, präventive oder kurative Immuntherapie bestimmt ist.
Medikament nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Vakzin handelt.
Verwendung eines Peptidepitops nach Anspruch 4, einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder eines Nucleinsäuremoleküls nach den Ansprüchen 10 bis 12 zur Herstellung eines Medikaments, das für die antivirale oder antitumorale Immuntherapie bestimmt ist.