DE69910580T3

DE69910580T3 - Von der telomerase abgeleitete antigene peptide

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Publication number: DE69910580T3
Application number: DE1999610580
Authority: DE
Inventors: Gustav Gaudernack; Amund Jon ERIKSEN; Mona Moller; Marianne Klemp Ullernch. 70 GJERTSEN; Ingvil Saeterdal; Stein Saeboe-Larsen
Original assignee: Gemvax AS
Current assignee: Gemvax AS
Priority date: 1998-07-08
Filing date: 1999-06-30
Publication date: 2009-11-26
Anticipated expiration: 2019-07-01
Also published as: AR020601A1; PT1093381E; ES2200526T3; PT1362597E; EP2316476A3; HU230007B1; NO313834B1; DE69910580T2; DK1362597T3; DE69910580D1; JP5491315B2; CN1313773A; EP1362597B1; EP2316476A2; ATE458494T1; CA2336743A1; CN100376290C; EP2258383A2; EP1093381B1; CA2336743C

Description

Diese Erfindung betrifft Proteine oder Peptide, welche T-Zell-vermittelte Immunität hervorruft, und Krebsimpfstoffe und Zusammensetzungen für die Antikrebsbehandlung, die derartige Proteine oder Peptidfragmente umfassen. Diese Erfindung betrifft auch Arzneimittel, die die Proteine oder Peptide umfassen, und Verfahren zum Erzeugen von T-Lymphozyten, die in der Lage sind, Tumorzellen in einem Säugetier zu erkennen und zu zerstören.
Krebs entwickelt sich durch einen Mehrstufenprozess, der mehrere Mutationsereignisse einschließt. Diese Mutationen haben eine veränderte Expression/Wirkungsweise der Gene zur Folge, die zu zwei Kategorien gehören: Onkogene und Tumorsuppressorgene. Onkogene entstehen in der Natur aus Protoonkogenen durch Punktmutationen oder Translokationen, wodurch sie einen transformierten Zustand der Zelle zur Folge haben, die die Mutation beherbergt. Alle Onkogene codieren und funktionieren durch ein Protein. Protoonkogene sind normale Gene der Zelle, welche das Potential haben, Onkogene zu werden. In der Mehrheit der Fälle ist gezeigt worden, dass Protoonkogene Komponenten der Signaltransduktionswege sind. Onkogene wirken auf eine dominante Art und Weise. Tumorsuppressorgene wirken auf der anderen Seite auf eine rezessive Art und Weise, d. h. durch Verlust der Funktion, und tragen zur Onkogenese bei, wenn beide Allele, die das funktionelle Protein kodieren, verändert worden sind, wobei nicht funktionelle Genprodukte produziert werden.
Die konzertierte Aktion einer Kombination von veränderten Onkogenen und Tumorsuppressorgenen hat zelluläre Transformation und Entwicklung eines bösartigen Phänotypus zur Folge.
Derartige Zellen neigen jedoch zum Altern und haben eine beschränkte Lebensdauer. In der Mehrheit der Krebse erfordert die Immortalisation der Tumorzellen das Anschalten eines Enzymkomplexes, der Telomerase genannt wird. In den somatischen Zellen wird die katalytische Untereinheit dieses Enzyms normalerweise nicht exprimiert. Zusätzliche Ereignisse, wie die Wirkung von Proteinen, die durch einen Tumorvirus kodiert werden, oder die Demethylierung von ausgeschalteten Promotorstellen, können Expression eines funktionellen Telomerasekomplexes in Tumorzellen zur Folge haben.
Auf dem Gebiet der Krebsimmunologie des Menschen haben die letzten zwei Dekaden intensive Bemühungen gesehen, um ursprüngliche krebsspezifische Antigene zu charakterisieren. Insbesondere ist der Analyse von Antikörpern gegen Tumorantigene des Menschen Bemühung gewidmet worden. Der Stand der Technik legt nahe, dass derartige Antikörper zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken verwendet werden können, zum Beispiel in Verbindung mit einem Antikrebsmittel. Jedoch können Antikörper nur an Tumorantigene binden, die an der Oberfläche der Tumorzellen exponiert sind. Aus diesem Grund sind die Bemühungen, eine Krebsbehandlung zu erzeugen, die auf dem Immunsystem des Körpers beruht, weniger erfolgreich gewesen als erwartet.
Ein grundlegendes Merkmal des Immunsystems ist, dass es eigen von nichteigen unterscheiden kann und normalerweise nicht gegen eigene Moleküle reagiert. Es ist gezeigt worden, dass Rejektion von Geweben oder Organen, die von anderen Individuen transplantiert werden, eine Immunantwort auf die fremden Antigene an der Oberfläche der transplantierten Zellen ist. Die Immunantwort besteht allgemein aus einer humeralen Antwort, vermittelt durch Antikörper, und einer zellulären Antwort. Antikörper werden durch B-Lymphozyten produziert und sezerniert und erkennen typischerweise freies Antigen in der nativen Konformation. Sie können deshalb potentiell fast jede Stelle, die an der Antigenoberfläche exponiert ist, erkennen. Im Gegensatz zu Antikörpern erkennen T-Zellen, welche den zellulären Arm der Immunantwort vermitteln, Antigene nur im Zusammenhang mit MHC-Molekülen und nur nach passender Antigenverarbeitung. Diese Antigenverarbeitung besteht normalerweise aus der proteolytischen Fragmentierung des Proteins, was Peptide zur Folge hat, die in die Furche der MHC-Moleküle passen. Dies ermöglicht T-Zellen, auch Peptide zu erkennen, die sich von intrazellulären Antigenen ableiten.
T-Zellen können aberrante Peptide, die sich von irgendwo in der Tumorzelle ableiten, im Zusammenhang mit MHC-Molekülen an der Oberfläche der Tumorzelle erkennen. Die T-Zellen können anschließend aktiviert werden, um die Tumorzelle zu beseitigen, die das aberrante Peptid beherbergt. In experimentellen Modellen, die Mausetumoren einschließen, ist gezeigt worden, dass Punktmutationen in intrazellulären „Eigen”-Proteinen Tumorrejektionsantigene entstehen lassen können, die aus Peptiden bestehen, die sich in einer einzigen Aminosäure vom normalen Peptid unterscheiden. Die T-Zellen, die diese Peptide im Zusammenhang mit den Haupthistokompatibilitätsmolekülen (MHC) an der Oberfläche der Tumorzellen erkennen, sind in der Lage, die Tumorzellen zu töten und folglich den Tumor vom Wirt abzustoßen (Bonn et al., 1989, Cell, 58, 293–303).
MHC-Moleküle in Menschen werden normalerweise als HLA-Moleküle (humanes Leukozytenantigen, Histokompatibilitätsantigen) bezeichnet. Es gibt zwei Hauptklassen von HLA-Molekülen, Klasse I und Klasse II. HLA-Moleküle der Klasse I werden durch die Subloci HLA-A, -B und -C kodiert und aktivieren in erster Linie zytotoxische CD8⁺-T-Zellen. Die HLA-Moleküle der Klasse II auf der anderen Seite aktivieren in erster Linie CD4⁺-T-Zellen und werden durch die DR-, DP- und DQ-Subloci kodiert. Jedes Individuum hat normalerweise sechs verschiedene HLA-Moleküle der Klasse I, gewöhnlich zwei Allele von jeder der drei Untergruppen A, B und C, obwohl in einigen Fällen die Anzahl der verschiedenen HLA-Moleküle der Klasse I wegen des zweimaligen Auftretens desselben HLA-Allels verringert ist.
Die HLA-Genprodukte sind hochpolymorph. Verschiedene Individuen exprimieren eindeutige HLA-Moleküle, die sich von denen unterscheiden, die in anderen Individuen gefunden werden. Dies erklärt die Schwierigkeit des Findens von HLA-zusammenpassenden Organspendern bei Transplantationen. Die Bedeutung der genetischen Variation der HLA-Moleküle in der Immunbiologie wird durch ihre Rolle als Immunantwortgene widergespiegelt. Durch ihre Peptidbindungsfähigkeit regelt die Gegenwart oder Abwesenheit bestimmter HLA-Moleküle die Fähigkeit eines Individuums, auf spezifische Peptidepitope zu antworten. Als Folge bestimmen die HLA-Moleküle den Widerstand gegen oder die Anfälligkeit für eine Krankheit.
T-Zellen können die Entwicklung und das Wachstum von Krebs durch verschiedene Mechanismen hemmen. Zytotoxische T-Zellen, sowohl HLA-Klasse I beschränkte CD8⁺ als auch HLA-Klasse II beschränkte CD4⁺, können Tumorzellen direkt töten, die die passenden Tumorantigene präsentieren. Normalerweise werden CD4⁺-Helfer-T-Zellen für zytotoxische CD8⁺-T-Zell-Antworten benötigt, aber wenn das Peptidantigen durch ein passendes APC präsentiert wird, können zytotoxische CD8⁺-T-Zellen direkt aktiviert werden, welches eine schnellere, stärkere und wirksamere Antwort zur Folge hat.
Während die Peptide, die durch HLA-Moleküle der Klasse II dargestellt werden, von unterschiedlicher Länge (12–25 Aminosäuren) sind, müssen die Peptide, die durch HLA-Moleküle der Klasse I dargestellt werden, normalerweise genau neun Aminosäurereste lang sein, um in die HLA-Bindungsfurche der Klasse I zu passen. Ein längeres Peptid hat Nichtbindung zur Folge, wenn es nicht durch eine APC- oder Targetzelle, wie eine Krebszelle, innerlich verarbeitet werden kann, bevor es in der HLA-Furche der Klasse I präsentiert wird. Es ist nur von einer beschränkten Anzahl von Abweichungen von diesem Erfordernis von neun Aminosäuren berichtet worden, und in jenen Fällen ist die Länge des präsentierten Peptids entweder acht oder zehn Aminosäurereste lang gewesen.
Berichte darüber, wie MHC Peptide bindet, können in Hans-Georg Rammensee, Thomas Friede und Stefan Stevanovic (1995, Immunogenetics, 41, 178–228) und in Barinaga (1992, Science, 257, 880–881) gefunden werden. Male et al. (1987, Advanced Immunology, J. B. Lippincott Company, Philadelphia) bietet eine umfangreichere Erklärung des technischen Hintergrundes dieser Erfindung an.
In unserer Internationalen Anmeldung WO92/14756 beschrieben wir synthetische Peptide und Fragmente von Onkogenproteinprodukten, welche eine Punktmutation oder Translokationen aufweisen, verglichen mit ihrem Protoonkogen oder Tumorsuppressorgenprotein. Diese Peptide entsprechen dem, stimmen vollständig überein mit dem oder sind Fragmente des verarbeiteten Onkogenproteinfragments oder Tumorsuppressorgenfragments, wie durch Krebszellen oder andere antigenpräsentierende Zellen präsentiert, und werden als HLA-Peptidkomplex durch wenigstens ein Allel in jedem Individuum präsentiert. Es wurde auch gezeigt, dass diese Peptide spezifische T-Zell-Antworten auf das tatsächliche Onkogenproteinfragment induzieren, das durch die Zelle durch Verarbeitung produziert wird, und diese Peptide wurden im HLA-Molekül präsentiert. Insbesondere beschrieben wir Peptide, die sich vom p21-ras-Protein ableiten, welches Punktmutationen an bestimmten Aminosäurepositionen aufwies, nämlich an den Positionen 12, 13 und 61. Es ist gezeigt worden, dass diese Peptide beim Regulieren des Wachstums von Krebszellen in vitro wirksam sind. Ausserdem wurde gezeigt, dass die Peptide CD4⁺-T-Zellimmunität gegen Krebszellen, die das mutierte p21-ras-Onkogenprotein beherbergen, durch die Verabreichung derartiger Peptide in den Impfungs- oder Krebstherapieschemata hervorrufen. Später haben wir gezeigt, dass diese Peptide auch CD8⁺-T-Zellimmunität gegen Krebszellen, die das veränderte p21-ras-Onkogenprotein beherbergen, durch die vorstehend erwähnte Verabreichung (siehe M. K. Gjertsen et al., Int. J. Cancer, 1997, Bd. 72, S. 784) hervorrufen.
Jedoch sind die vorstehend beschriebenen Peptide nur in einer bestimmten Anzahl von Krebsen nützlich, nämlich in solchen, welche Onkogene mit Punktmutationen oder Translokationen in einem Protoonkogen oder Tumorsuppressorgen einschließen. Es gibt deshalb eine starke Notwendigkeit für eine Antikrebsbehandlung oder einen Impfstoff, welche/r gegen einen allgemeineren Bereich von Krebsen wirksam ist.
Allgemein sind Tumore hinsichtlich genetischer Veränderungen sehr heterogen, die in den Tumorzellen gefunden werden. Dies bedeutet, dass sich sowohl die potentielle therapeutische Wirkung als auch die prophylaktische Stärke eines Krebsimpfstoffs mit der Anzahl der Ziele erhöht, gegen die der Impfstoff in der Lage ist, T-Zellimmunität hervorzurufen. Ein Mehrfachzielimpfstoff verringert auch das Risiko neuer Tumorbildung durch Behandlungsescarevarianten vom Primärtumor.
Das Enzym Telomerase ist vor kurzem im Mittelpunkt des Interesses wegen seiner angenommenen Rolle bei der Verhinderung des zellulären Alterns gewesen. Die Telomerase ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, welche die telomeren DNA-Wiederholungen unter Verwendung einer RNA-Matrize synthetisiert, die als Untereinheit des Telomeraseholoenzyms besteht. Die DNA-Wiederholungen, die durch das Enzym synthetisiert werden, werden in Telomere eingebracht, welches spezialisierte DNA-Proteinstrukturen sind, die an den Enden der linearen DNA-Moleküle gefunden wurden, aus welchen jedes Chromosom besteht. Die Telomerase wurde zuerst im Ziliat Tetrahymena identifiziert (Greider und Blackburn, 1985, Cell 43, 405–413). Eine Sequenz der katalytischen Untereinheit der menschlichen Telomerase wurde vor kurzem von Meyerson et al. (1990, Cell 1197, 785–795) und von Nakamura et al. (1997, Science 277, 955–959) identifiziert, die das Gen jeweils hEST2 und hTRT nannten. Außerdem sind auch drei andere Proteine, welche mit der Telomeraseaktivität verbunden sind, identifiziert worden: p80 und p95 von Tetrahymena (Collins et al., 1995, Cell 81, 677–686) und TP1/TLP1, welches das Säugetier-Homologon von Tetrahymena p80 ist (Harrington et al., 1997, Science 275, 973–977; Nakayama et al., 1997, Cell 88, 875–884).
Die Telomerase wird in den meisten normalen Zellen im Körper nicht exprimiert. Die meisten somatischen Klone in den Menschen zeigen keine nachweisbare Telomeraseaktivität, aber Telomeraseaktivität wird in der Keimbahn und in einigen Stammzellkompartimenten nachgewiesen, welche Stellen aktiver Zellteilung sind (Harley et al., 1994, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 59, 307–315; Kim et al., 1994, Science 266, 2011–2015; Broccoli et al., 1995, PNAS USA 92, 9082–9086; Counter et al., 1995, Blood 85, 2315–2320; Hiyama et al., 1995, J. Immunol. 155, 3711–3715). Die Telomere der meisten Arten menschlicher somatischer Zellen verkürzen sich bei Zunahme des Alters des Organismus, was mit dem Fehlen an Telomeraseaktivität in diesen Zellen übereinstimmt. Gezüchtete menschliche Zellen zeigen auch Telomerverkürzung. Die Telomerverkürzung setzt sich in gezüchteten menschlichen Zellen fort, welche transformiert worden sind, bis die Telomere kritisch kurz geworden sind. An diesem Punkt, der Krisenpunkt genannt wird, werden wesentliche Mengen von Zellentod und karyotyper Instabilität beobachtet.
Unsterbliche Zellen, welche die Fähigkeit erworben haben, in Kultur unbegrenzt zu wachsen, gehen mit seltener Häufigkeit aus Krisenpopulationen hervor. Diese unsterblichen Zellen haben hohe Niveaus an Telomeraseaktivität und stabile Telomere. Telomeraseaktivität wird auch ohne weiteres in der großen Mehrheit menschlicher Tumorproben nachgewiesen, die bis jetzt analysiert wurden (Kim et al., 1994, Science 266, 2011–2015), einschließlich Eierstockkarzinom (Counter et al., 1994, PNAS USA 91, 2900–2904). Eine umfangreiche Übersicht wird von Shay und Bachetti bereitgestellt (1997, Eur. J. Cancer 33, 787–791). Folglich kann die Aktivierung von Telomerase die Barriere zur ununterbrochenen Zellteilung überwinden, die durch die Telomerlänge auferlegt wird. Zellen, die den normalen Alterungsmechanismus überwinden, können dies vermutlich wegen der Aktivität der Telomerase durch Stabilisieren der Telomerlänge tun.
Es ist lange bekannt, dass Viren, die in der Krebsentwicklung des Menschen verwickelt sind, wie das Epstein-Barr-Virus (EBV, das mit B-Zellmalignitäten und Nasenrachenraumkarzinomen in Verbindung gebracht wird) und das Humanpapillomavirus (HPV 16 und 18, die mit Zervixkarzinomen in Verbindung gebracht werden), die Fähigkeit haben, menschliche Zellen unsterblich zu machen. Es ist jetzt dargelegt worden, dass die Induktion der Telomeraseaktivität das Schlüsselelement bei diesem Prozess ist (Klingelhutz et al., 1996, Nature, 380, 79–82).
Die Telomerase ist deshalb ein potentielles Ziel zur Krebstherapie. Folglich sind Telomeraseinhibitoren als eine neue Klasse von Antikrebsarzneimitteln vorgeschlagen worden (berichtet in Sharma et al., 1997, Ann Oncol 8(11), 1063–1074; Axelrod, 1996, Nature Med 2(2), 158–159; Huminiecki, 1996, Acta Biochim Pol 43(3), 531–538). Es ist nahegelegt worden, dass die Identifizierung einer katalytischen Untereinheit der menschlichen Telomerase ein biochemisches Reagens zum Identifizieren derartiger Arzneimittel bereitstellen kann (Meyerson et al., 1990, Cell 1197, 785–795). Es ist auch nahegelegt worden, dass die Telomerase ein Marker zur Diagnose oder Prognose von Krebs ist (Soria und Rixe, 1997, Bull Cancer 84(10), 963–970; Dahse et al., 1997, Clin Chem 43(5), 708–714).
Soweit wir wissen, hat jedoch vorher niemand nahegelegt, dass die Telomerase als nützliches Ziel zur T-Zell-vermittelten Therapie dienen kann oder dass Telomerasepeptide oder -proteine zur Behandlung oder Prophylaxe von Krebs verwendet werden können.
Gemäß eines Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Peptids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Krebs bereitgestellt, wobei das Peptid aus einer Sequenz EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) besteht, wobei die Behandlung oder Prophylaxe die Erzeugung einer T-Zell-Antwort umfasst, wobei die Antwort gegen das Peptid EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) oder ein Fragment davon gerichtet ist, das wenigstens 8 Aminosäuren lang ist, das nach Verarbeitung durch eine Antigen-präsentierende Zelle produzierbar ist.
Gemäß eines anderen Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Nucleinsäure zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Krebs bereitgestellt, wobei die Nucleinsäure in der Lage ist, ein Peptid zu kodieren, das aus einer Sequenz EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) besteht, wobei die Behandlung oder Prophylaxe die Erzeugung einer T-Zell-Antwort umfasst, wobei die Antwort gegen das Peptid EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) oder ein Fragment davon gerichtet ist, das wenigstens 8 Aminosäuren lang ist, das nach Verarbeitung durch eine Antigen-präsentierende Zelle produzierbar ist.
Gemäß eines weiteren Gesichtspunkts der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung von T-Lymphozyten bereitgestellt, die in der Lage sind, Tumorzellen in einem Säugetier zu erkennen und zu zerstören, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Probe von T-Lymphozyten, die aus einem Säugetier entnommen wurden, in Gegenwart eines Peptids in einer Menge, die ausreichend ist, Telomerase-spezifische T-Lymphozyten zu erzeugen, wobei das Peptid aus einer Sequenz EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) besteht, wobei die Telomerase-spezifischen T-Lymphozyten eine Antwort gegen das Peptid EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) oder ein Fragment davon erzeugen, das wenigstens 8 Aminosäuren lang ist, das nach Verarbeitung durch eine Antigen-präsentierende Zelle produzierbar ist.
Gemäß eines weiteren Gesichtspunkts der Erfindung wird die Verwendung einer Kombination eines Telomerase-Peptids und eines Peptids bereitgestellt, das in der Lage ist, eine T-Zell-Antwort gegen ein Onkogen- oder eine Mutante eines Tumorsuppressorproteins oder -peptids zu induzieren, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Krebs, wobei das Telomerase-Peptid aus einer Sequenz EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) besteht, und die Behandlung oder Prophylaxe umfasst die Erzeugung einer T-Zell-Antwort, wobei sich die Antwort gegen das Peptid EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) oder ein Fragment davon richtet, das wenigstens 8 Aminosäuren lang ist, das nach Verarbeitung durch eine Antigen-präsentierende Zelle produzierbar ist.
Es wird hier ein Telomerase-Protein oder -Peptid zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Krebs offenbart.
Es wird hier auch eine Nucleinsäure zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Krebs offenbart, wobei die Nucleinsäure in der Lage ist, ein Telomerase-Protein oder -Peptid zu kodieren, wie vorstehend beschrieben.
Es wird hier auch ein Arzneimittel offenbart, das wenigstens ein Telomerase-Protein oder -Peptid oder -Nucleinsäure, wie vorstehend beschrieben, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Auch wird hier die Herstellung eines Arzneimittels offenbart, wie vorstehend beschrieben, wobei das Verfahren das Mischen wenigstens eines Telomerase-Proteins oder -Peptids oder -Nucleinsäure, wie vorstehend beschrieben, mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Es wird auch ein Arzneimittel offenbart, das eine Kombination von wenigstens einem Telomerase-Protein oder -Peptid, wie vorstehend beschrieben, und wenigstens ein Peptid, das in der Lage ist, eine T-Zell-Antwort gegen ein Onkogen- oder eine Mutante eines Tumorsuppressorproteins oder -peptids zu induzieren, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Auch hier wird ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels offenbart, wie vorstehend beschrieben, wobei das Verfahren das Mischen wenigstens eines Telomerase-Proteins oder -Peptids, wie vorstehend beschrieben, mit wenigstens einem Peptid, das in der Lage ist, eine T-Zell-Antwort gegen ein Onkogen- oder ein Tumorsuppressorprotein oder -peptid zu induzieren, und einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Auch hier wird die Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Krebs, eines Telomerase-Proteins oder -Peptids oder einer Nukleinsäure, die in der Lage ist, ein Telomerase-Protein oder -Peptid zu kodieren, offenbart.
Es wird auch ein Verfahren zur Erzeugung von T-Lymphozyten offenbart, die in der Lage sind, Tumorzellen in einem Säugetier zu erkennen und zu zerstören, wobei das Verfahren das Nehmen einer Probe von T-Lymphozyten aus einem Säugetier und das Kultivieren der T-Lymphozyten-Probe in Gegenwart eines Telomerase-Proteins oder -Peptids in einer Menge umfasst, die ausreichend ist, Telomerase-Protein oder -Peptid-spezifische T-Lymphozyten zu erzeugen.
Die Erfindung wird nachstehend nur beispielsweise genauer beschrieben.
In dieser Beschreibung zeigt die Bezeichnung A2, A1, A3 und B7 Peptide an, bei welchen es wahrscheinlich ist, dass sie durch HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3 und HLA-B7 präsentiert werden.
Wir stellen ein Telomerase-Peptid zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe von Krebs bereit, das aus SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3, SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 9 oder SEQ ID NR. 10 besteht. Das Peptid erzeugt eine T-Zell-Antwort gegen die Telomerase, wobei die Antwort gegen das Peptid EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) oder ein Fragment davon gerichtet ist, das wenigstens 8 Aminosäuren lang ist, das nach Verarbeitung durch eine Antigen-präsentierende Zelle produzierbar ist. Das Peptid kann zur Verwendung in einem Verfahren sein, das das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des Telomerase-Proteins oder -Peptids an ein Säugetier, vorzugsweise einen Menschen, das/der an Krebs leidet oder wahrscheinlich leidet, umfasst, so dass eine T-Zell-Antwort gegen die Telomerase im Säugetier induziert wird.
Telomerase-spezifische T Zellen können verwendet werden, um das Ziel auf Zellen zu richten, welche die Telomerase exprimieren. Weil die meisten Zellen im Körper eines Organismus keine Telomerase exprimieren, sind sie folglich unbeeinflusst. Jedoch wird das Ziel auf Tumorzellen, die die Telomerase exprimieren, gerichtet und zerstört. Weil die Telomeraseaktivität in der Mehrheit von Krebsen, die bis jetzt identifiziert wurden, nachgewiesen worden ist, erwarten wir, dass unsere Materialien und Verfahren weitverbreitete Nützlichkeit haben.
Krebse, welche zur Behandlung geeignet sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Brustkrebs, Prostatakrebs, Pankreaskrebs, Kolorektalkrebs, Lungenkrebs, malignes Melanom, Leukämien, Lymphome, Eierstockrebs, Zervixkrebs und Gallentraktkarzinome.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff Telomerase ein Ribonukleoproteinenzym, welches Telomer-verlängernde Aktivität aufweist. Das Telomerase-Protein, wie hier verwendet, bezeichnet jede Proteinkomponente der Telomerase und schließt jede Untereinheit mit katalytischer Aktivität ein.
Vorzugsweise ist das Telomerase-Protein ein Säugetier-Telomerase-Protein und am meisten bevorzugt ein menschliches Telomerase-Protein. Das menschliche Telomerase-Protein ist vorzugsweise die katalytische Untereinheit der Telomerase, die als hTRT von Nakamura et al. (1997, Science 277, 955–959) und hEST2 durch Meyerson et al. (1990, Cell 1197, 785–795) identifiziert wurde, deren cDNA-Sequenzen als GenBank Accessionsnummern AF015950 beziehungsweise AF018167 hinterlegt wurden.
Das Telomerase-Peptid ist so ausgewählt, dass es eine T-Zell-Antwort erzeugt, die direkt gegen das Telomerase-Protein (oder gegen das Telomerase-Protein, von welchem sich das Telomerase-Peptid ableitet) gerichtet ist. Insbesondere wird die T-Zell-Antwort so erzeugt, dass es eine Antwort gibt, die das Peptid EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) oder ein Fragment davon hervorruft, das wenigstens 8 Aminosäuren lang ist, das nach Verarbeitung durch eine Antigen-präsentierende Zelle produzierbar ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist die induzierte T-Zell-Antwort eine zytotoxische T-Zell-Antwort. Die zytotoxische T-Zell-Antwort kann eine CD4⁺-T-Zell-Antwort sein oder es kann eine CD8⁺-T-Zell-Antwort sein. In jedem Fall muss das Peptid in der Lage sein, als Komplex mit einem Klasse I- oder Klasse II-MHC-Protein auf der Oberfläche von Tumorzellen oder Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert zu werden, wobei die Antigenverarbeitung zuvor stattfindet, wenn erforderlich.
Das Telomerase-Peptid besteht aus der Sequenz der SEQ ID NR. 2, 3, 4, 9 oder 10.
Geeignete Peptide, welche in den Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden können, die hier beschrieben werden, bestehen aus der Sequenz der SEQ ID NR. 2, 3, 4, 9 oder 10. Abgesehen von diesen Sequenzen bilden die Peptide, die in 1 und 2 offenbart sind, keinen Teil der Erfindung.
Auch eingeschlossen sind Proteine und Peptide, die zusätzlich zur Sequenz der SEQ ID NR. 2, 3, 4, 9 oder 10 Aminosäuresequenzen aufweisen, die einer Aminosäure entsprechen, die in der Aminosäuresequenz von Säugetier-Homologen der Tetrahymena Telomerase-verbundenen Proteine p80 und p95 vorhanden sind, zum Beispiel die p80-Homologen TP1 und TLP1 (Harrington et al., 1997, Science 275, 973–977; Nakayama et al., 1997, Cell 88, 875–884).
Größere Peptidfragmente, die einige Aminosäuresubstitutionen entweder am N-terminalen Ende oder C-terminalen Ende tragen, zusätzlich zur Sequenz der SEQ ID NR. 2, 3, 4, 9 oder 10, sind auch eingeschlossen, weil festgestellt worden ist, dass derartige Peptide T-Zellklone mit der passenden Spezifität entstehen lassen können.
Die hier beschriebenen Peptide sind besonders zur Verwendung in einem Impfstoff geeignet, der in der Lage ist, entweder CD4⁺- oder CD8⁺-T-Zellimmunität sicher hervorzurufen:

(a) die Peptide werden synthetisch produziert und schließen deshalb keine transformierenden Krebsgene oder andere Stellen oder Materialien ein, welche schädliche Wirkungen produzieren können,
(b) die Peptide können alleine verwendet werden, um zelluläre Immunität zu induzieren,
(c) auf die Peptide kann das Ziel für eine bestimmte Art von T-Zell-Antwort ohne die Nebenwirkungen anderer unerwünschter Antworten gerichtet sein.

Die hier beschriebenen Telomerase-Peptide können in einer Menge im Bereich von 1 Mikrogramm (1 μg) bis 1 Gramm (1 g) an einen mittleren menschlichen Patienten oder ein Individuum, der/das zu impfen ist, verabreicht werden. Es ist bevorzugt, eine kleinere Dosis im Bereich von 1 Mikrogramm (1 μg) bis 1 Milligramm (1 mg) für jede Verabreichung zu verwenden.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das Telomerase-Peptid dem Patienten in Form eines Arzneimittels bereitgestellt. Das Telomerase-Peptid kann als Gemisch von Proteinen oder Gemisch von Proteinen und Peptiden oder Gemisch von Peptiden verabreicht werden. Das Arzneimittel kann zusätzlich die üblichen Zusatzstoffe, Verdünnungsmittel, Stabilisierungsmittel oder dergleichen, wie auf dem Fachgebiet bekannt, einschließen.
Auch offenbart sind Arzneimittel, welche ein oder mehr Telomerase-Peptide umfassen. Das Peptidgemisch kann eines der folgenden sein:

(a) ein Gemisch von Peptiden mit verschiedenen Sequenzen, die zum Beispiel verschiedenen Teilen einer Telomerase-Proteinsequenz entsprechen;
(b) ein Gemisch von Peptiden mit überlappenden Sequenzen, aber geeignet, um zu verschiedenen HLA-Allelen zu passen;
(c) ein Gemisch von beiden Gemischen (a) und (b);
(d) ein Gemisch mehrerer Gemische (a);
(e) ein Gemisch mehrerer Gemische (b);
(f) ein Gemisch mehrerer Gemische (a) und mehrerer Gemische (b).

Das Arzneimittel kann durch Mischen des/r Telomerase-Peptids/e mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel hergestellt werden.
Das Arzneimittel kann auch wenigstens ein Peptid einschließen, das in der Lage ist, eine T-Zell-Antwort gegen ein Onkogen- oder eine Mutante eines Tumorsuppressorproteins oder -peptids zu induzieren. In einer anderen Ausführungsform können die Telomerase-Peptide entweder gleichzeitig oder in einer fakultativen Reihenfolge mit diesen Peptiden verabreicht werden. Beispiele von Onkogenproteinen sind die p21-ras-Proteine H-ras, K-ras, abl, gip, gsp, ret und trk. Vorzugsweise ist das Onkogenprotein oder -peptid ein p21-ras-Protein oder -Peptid, zum Beispiel die in unserer Internationalen Anmeldung WO92/14756 beschriebenen p21-ras-Peptide. Tumorsuppressorproteine schließen p53 und Rb (Retinoblastom) ein. Ein derartiges Arzneimittel kann durch Mischen des/der Telomerase-Peptids/e mit den Mutanten der Tumorsuppressor- oder Onkogenproteine oder -peptide zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel hergestellt werden.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff Mutante auf eine Wildtypsequenz, welche eines oder mehrere des folgenden aufweist: Punktmutation (Transition oder Transversion), Deletion, Insertion, Duplikation, Translokation oder Inversion. Der Begriff Arzneimittel umfasst nicht nur eine Zusammensetzung, die zur Behandlung von Krebspatienten verwendbar ist, sondern schließt auch Zusammensetzungen ein, die in Verbindung mit der Prophylaxe, d. h. Impfstoffzusammensetzungen, nützlich sind.
Die Telomerase-Peptide werden einem menschlichen Individuum, das eine derartige Behandlung oder Prophylaxe benötigt, verabreicht. Die Verabreichung kann einmal oder mehrmals stattfinden, wie es geeignet ist, die gewünschte T-Zellimmunität zu etablieren und/oder beizubehalten. Die Peptide können zusammen, entweder gleichzeitig oder getrennt, mit Verbindungen, wie Zytokinen und/oder Wachstumsfaktoren, d. h. Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-12 (IL-12), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) oder dergleichen, verabreicht werden, um die Immunantwort zu verstärken, wie auf dem Fachgebiet bekannt. Die Telomerase-Peptide können in einem Impfstoff oder einer therapeutischen Zusammensetzung entweder alleine oder in Verbindung mit anderen Materialien verwendet werden. Zum Beispiel können das Peptid oder die Peptide in Form eines Lipopeptidkonjugats zugeführt werden, von welchem bekannt ist, dass es eine zytotoxische Hochaffinitäts-T-Zell-Antwort induziert (Deres, 1989, Nature 342).
Die vorstehend erwähnten Peptide als mögliche Bestandteile des Arzneimittels können in Form einer Nukleinsäure bereitgestellt werden, die das bestimmte Peptid kodiert. Folglich kann das Arzneimittel aus einem Peptid alleine oder in Verbindung mit einer Nukleinsäure bestehen, oder es kann aus Gemischen von Nukleinsäuren bestehen.
Die Telomerase-Peptide können einem Individuum in Form von DNA-Impfstoffen verabreicht werden. Die DNA, die das Telomerase-Peptid kodiert, kann in Form von klonierter Plasmid-DNA oder synthetischem Oligonukleotid vorhanden sein. Die DNA kann zusammen mit Zytokinen, wie IL-2 und/oder anderen costimulierenden Molekülen verabreicht werden. Die Zytokine und/oder costimulierenden Moleküle können selbst in Form von Plasmid- oder Oligonukleotid-DNA verabreicht werden.
Es ist gezeigt worden, dass die Antwort auf einen DNA-Impfstoff durch Gegenwart von Immunstimulanz-DNA-Sequenzen (ISS) erhöht wird. Diese können die Form von hexameren Motiven annehmen, die methyliertes CpG enthalten, gemäß der Formel:
5'-Purin-Purin-CG-Pyrimidin-Pyrimidin-3'. Unsere DNA-Impfstoffe können deshalb diese oder andere ISS in die DNA, die das Telomerase-Peptid kodiert, in die DNA, die das Zytokin oder andere costimulierende Moleküle kodiert, oder in beide einbringen. Ein Überblick der Vorteile der DNA-Impfung ist von Tighe et al. bereitgestellt (1998, Immunology Today 19(2), 89–97).
Wir beschreiben ein Peptid zur Verwendung bei der Behandlung eines Patienten, der an Krebs leidet, wobei die Verwendung das Hervorrufen von T-Zell-Antworten durch Stimulieren in vivo oder ex vivo mit dem Telomerase-Peptid umfasst. Das Telomerase-Peptid kann auch in einem Impfungsverfahren eines Patienten verwendet werden, um Resistenz gegen Krebs zu erhalten. Ein geeignetes Impfungsverfahren umfasst das Hervorrufen von T-Zell-Antworten durch Stimulieren in vivo oder ex vivo mit einem Telomerase-Peptid. Wir beschreiben auch ein Peptid zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe von Krebs, wobei das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des Telomerase-Peptids an ein Säugetier, das an Krebs leidet oder wahrscheinlich leidet, so dass eine T-Zell-Antwort gegen Telomerase im Säugetier induziert wird. Insbesondere richtet sich die T-Zell-Antwort gegen das Peptid EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) oder ein Fragment davon, das wenigstens 8 Aminosäuren lang ist, das nach Verarbeitung durch eine Antigen-präsentierende Zelle produzierbar ist.
Die hier beschriebenen Peptide können durch herkömmliche Verfahren zum Beispiel durch die verschiedenen auf dem Fachgebiet bekannten Peptidsyntheseverfahren hergestellt werden. Enzymatische Spaltung kann auch verwendet werden. Die Telomerase-Peptide können auch in Form von rekombinanten exprimierten Peptiden vorhanden sein.
Die Nukleinsäuren, die das Telomerase-Peptid kodieren, können durch Oligonukleotidsynthese hergestellt werden. Dies kann durch eines der verschiedenen Verfahren getan werden, die auf dem Fachgebiet verfügbar sind. Eine Telomerase-Protein kodierende Nukleinsäure kann unter Verwendung von herkömmlichem Genbankabsuchen von einer genomischen oder cDNA-Genbank kloniert werden. Die Sonde kann einem Teil einer Sequenz eines bekannten Telomerasegens entsprechen. In einer anderen Ausführungsform kann die Nukleinsäure unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erhalten werden. Die Nukleinsäure ist vorzugsweise DNA und kann geeigneterweise in einen Vektor kloniert werden. Subklone können unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme erzeugt werden. Die geklonte oder subgeklonte DNA kann in einem geeigneten Wirt, zum Beispiel einem bakteriellen Wirt, propagiert werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Wirt ein eukaryotischer Organismus, wie Hefe oder Baculovirus, sein. Das Telomerase-Peptid kann durch Expression in einem geeigneten Wirt produziert werden. In diesem Fall wird die DNA in einen Expressionsvektor kloniert. Verschiedene kommerzielle Expressionskits sind erhältlich. Die Verfahren beschrieben in Maniatis et al. (1991, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press) und Harlow und Lane (1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press) können zu diesen Zwecken verwendet werden.
Experimentelle Verfahren
Die Peptide wurden unter Verwendung der Durchfluss-Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert. N-a-Fmoc-Aminosäuren mit geeignetem Seitenkettenschutz wurden verwendet. Die Fmoc-Aminosäuren wurden zur Kupplung als Pentafluorphenylester oder unter Verwendung entweder der TBTU- oder Diisopropylcarbodiimid-Aktivierung vor dem Kuppeln aktiviert. 20% Piperidin in DMF wurde nach jeder Kupplung zum selektiven Entfernen von Fmoc verwendet. Spaltung vom Harz und abschließendes Entfernen des Seitenkettenschutzes wurde durch 95% TFA durchgeführt, die geeignete Scavenger enthielt. Die Peptide wurden durch Reversed Phase-HPLC (C18) gereinigt und analysiert. Die Identität der Peptide wurde unter Verwendung der Electrospraymassenspektroskopie (Finnigan mat SSQ710) bestätigt.
Damit ein Krebsimpfstoff und Verfahren für die spezifische Krebstherapie, die auf T-Zellimmunität beruht, wirksam sind, müssen drei Bedingungen erfüllt sein:

(a) das Peptid ist mindestens 8 Aminosäuren lang und ist ein Fragment eines Telomerase-Proteins und
(b) das Peptid ist in der Lage, entweder in seiner vollen Länge oder nach Verarbeitung durch eine Antigen-präsentierende Zelle T-Zell-Antworten zu induzieren.

Die folgenden experimentellen Verfahren können verwendet werden, um zu bestimmen, ob diese drei Bedingungen für ein bestimmtes Peptid erfüllt werden. Zuerst sollte bestimmt werden, ob das bestimmte Peptid T-Zellimmunantworten in vitro entstehen lässt. Es muss auch festgestellt werden, ob die synthetischen Peptide Peptidfragmenten entsprechen oder die synthetischen Peptide nach Verarbeitung in der Lage sind, Peptidfragmente zu ergeben, die Peptidfragmenten entsprechen, die in Krebszellen, die die Telomerase beherbergen, oder in Antigen-präsentierenden Zellen auftreten, die natürlich vorkommende Telomerase verarbeitet haben. Die Spezifität von T-Zellen, die in vivo durch Telomerase-Peptidimpfung induziert wurden, kann auch bestimmt werden.
Es ist erforderlich, festzustellen, ob die Telomerase exprimierenden Tumorzelllinien durch T-Zellklone getötet werden können, die aus peripherem Blut von Karzinompatienten nach Telomerase-Peptidimpfung erhalten wurden. T-Zellklone werden nach dem Klonieren von T-Zellblasten, die in den mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) vorliegen, von einem Karzinompatienten nach Telomerase-Peptidimpfung erhalten. Das Peptidimpfungsprotokoll schließt mehrere intrakutane in vivo-Injektionen von Peptiden mit GM-CSF oder einem anderen allgemein verwendeten Hilfsstoff ein. Das Klonieren der T-Zellen wird durch Ausplattieren von antwortenden T-Zellblasten mit 5 Blasten pro Vertiefung auf Terasaki-Platten durchgeführt. Jede Vertiefung enthält 2 × 10⁴ autogene, bestrahlte (30 Gy) PBMC als Feeder cells. Die Zellen werden mit dem Kandidatentelomerase-Peptid bei 25 mM und 5 U/ml rekombinantem Interleukin-2 (rIL-2) (Amersham, Aylesbury, UK) in einem Gesamtvolumen von 20 ml propagiert. Nach 9 Tagen werden T-Zellklone auf Platten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden (Costar, Cambridge, MA) mit 1 mg/ml Phythämagglutinin (PHA, Wellcome, Dartford, UK), 5 U/ml rIL-2 und allogene bestrahlte (30 Gy) PBMC (2 × 10⁵) pro Vertiefung als Feeder cells transferiert. Wachsende Klone werden in Platten mit 24 Vertiefungen mit PHA/rIL-2 und 1 × 10⁶ allogene bestrahlten PBMC als Feeder cells weiter ausgestrichen und nach 4 bis 7 Tagen auf Peptidspezifität abgesucht.
T-Zellklone werden für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Der Zelloberflächenphänotypus des T-Zellklons wird bestimmt, um festzustellen, ob der T-Zellklon CD4⁺- oder CD8⁺ ist. Der T-Zellklon wird mit autologen Tumorzellzielen bei verschiedenen Effektor-Ziel-Verhältnissen inkubiert, um zu bestimmen, ob Lyse von Tumorzellen auftritt. Die Lyse zeigt an, dass die T-Zelle Reaktivität aufweist, die gegen ein Tumor abgeleitetes Antigen, zum Beispiel Telomerase-Protein, gerichtet ist.
Um zu bestätigen, dass das erkannte Antigen mit Telomerase-Protein verbunden ist, und um das HLA-Klasse I- oder -Klasse II-Molekül, das das mutmaßliche Telomerase-Peptid dem T-Zellklon präsentiert, werden verschiedene Telomerase-exprimierende Tumorzelllinien, die ein oder mehrere HLA-Klasse I- oder -II-Moleküle gemeinsam mit solchen des Patienten tragen, als Targetzellen in Zytotoxizitätsassays verwendet. Targetzellen werden mit ⁵¹Cr- oder ³H-Thymidin (9,25 × 10⁴ Bq/ml) über Nacht markiert, einmal gewaschen und mit 5000 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert. T-Zellen werden bei verschiedenen Effektor-Ziel-Verhältnissen zugegeben, und die Platten werden 4 Stunden lang bei 37°C inkubiert und dann vor dem Zählen in einem Flüssigkeitsszintillationszähler (Packard Topcount) geerntet. Zum Beispiel können die Blasenkarzinom-Zelllinie T24 (12Val⁺, HLA-A1⁺, B35⁺), die Melanomzelllinie FMEX (12Val⁺, HLA-A2⁺, B35⁺) und die Kolonkarzinomzelllinie SW 480 (12Val⁺, HLA-A2⁺, B8⁺) oder eine andere Telomerase-positive Tumorzellinie als Targetzellen verwendet werden. Eine geeignete Zellinie, welche kein Telomerase-Protein exprimiert, kann als Kontrolle verwendet werden und sollte nicht lysiert sein. Lyse einer bestimmten Zelllinie zeigt an, dass der T-Zellklon, der getestet wird, ein endogen-verarbeitetes Telomeraseepitop im Zusammenhang mit dem HLA-Klasse I- oder -Klasse II-Untertyp, der durch diese Zelllinie exprimiert wird, erkennt.
Die HLA-Klasse I- oder -Klasse II-Restriktion eines T-Zellklons kann durch Blockierexperimente bestimmt werden. Monoklonale Antikörper gegen HLA-Klasse I-Antigene, zum Beispiel der monoklonale Pankreas-HLA-Klasse I-Antikörper W6/32, oder gegen Klasse II-Antigene, zum Beispiel monoklonale Antikörper, die gegen HLA-Klasse II-DR-, -DQ- und -DP-Antigene (B8/11, SPV-L3 und B7/21), können verwendet werden. Die T-Zellklonaktivität gegen die autologe Tumorzelllinie wird unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern bewertet, die gegen HLA-Klasse I- und -Klasse II-Moleküle gerichtet sind, bei einer Endkonzentration von 10 mg/ml bewertet. Die Assays werden, wie vorstehend beschrieben, in Platten mit 96 Vertiefungen dreifach durchgeführt, und die Targetzellen werden vor der Zugabe von T-Zellen 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert.
Die Feinspezifität eines T-Zellklons kann unter Verwendung von Peptid-pulsing-Experimenten bestimmt werden. Um das Telomerase-Peptid zu identifizieren, das durch einen T-Zellklon tatsächlich erkannt wird, wird eine Fülle von Nonamerpeptiden getestet. ⁵¹Cr- oder ³H-Thymidin markierte, mildsauer eluierte autologe Fibroblasten werden mit 2500 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und mit den Peptiden bei einer Konzentration von 1 mM zusammen mit b2-Mikroglobulin (2,5 mg/ml) in einem 5%-CO₂-Inkubator bei 37°C vor der Zugabe von T-Zellen pulsiert. Die Assays werden in Platten mit 96 Vertiefungen dreifach durchgeführt und 4 Stunden lang mit einem Effektor-Ziel-Verhältnis von 5 zu 1 inkubiert. Kontrollen können einen T-Zellklon einschließen, der alleine, mit APC in Abwesenheit von Peptiden oder mit einem irrelevanten Melanom-assoziierten Peptid MART-1/Melan-A gezüchtet wird.
Ein alternatives Protokoll zum Feststellen der Feinspezifität eines T-Zellklons kann auch verwendet werden. In diesem alternativen Protokoll wird die TAP-defiziente T2-Zelllinie als Antigen-präsentierende Zellen verwendet. Diese Zelllinie exprimiert nur kleine Mengen des HLA-A2-Antigens, aber erhöhte Mengen von HLA-Klasse I-Antigenen an der Zelloberfläche können durch Zugabe von b2-Mikroglobulin induziert werden. ³H-markierte Targetzellen werden mit den unterschiedlichen Testpeptiden und Kontrollepeptiden bei einer Konzentration von 1 mM zusammen mit b2-Mikroglobulin (2,5 mg/ml) eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Nach dem Pulsieren des Peptids werden die Targetzellen ausführlich gewaschen, gezählt und mit 2500 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen vor Zugabe der T-Zellen ausplattiert. Die Platten werden vor dem Ernten 4 Stunden lang bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Kontrollen schließen einen T-Zellklon ein, der alleine oder mit Targetzellen in Abwesenheit von Peptiden gezüchtet wird. Die Assays wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit einem Effektor-Ziel-Verhältnis von 20 zu 1 dreifach durchgeführt.
Die Sensitivität eines T-Zellklons gegenüber einem vorstehend identifizierten bestimmten Peptid kann auch unter Verwendung eines Dosis-Wirkungs-Experiments bestimmt werden. Peptid-sensibilisierte Fibroblasten können als Targetzellen verwendet werden. Die Targetzellen werden mit dem bestimmten Peptid, wie für die Bestimmung der Feinspezifität vorstehend beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Peptide bei unterschiedlichen Konzentrationen vor der Zugabe der T-Zellen zugegeben werden, gepulst. Die Kontrollen schließen Targetzellen alleine und mit dem irrelevanten Melanom-assoziierten Peptid Melan-A/Mart-1 gepulste Targetzellen ein.
Biologische Experimente/Beschreibung der Figuren:
1
1 (1) beschreibt die Induktion von Telomerase(hTERT)-reaktiven zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL's) in transgenen HLA-A2(A2/K^b)-Mäusen, die mit Telomerase-Peptiden mit der Sequenzidentität 9 und 10 immunisiert wurden. Ein geschnittenes Standard-HLA-A2-Influenza-Peptid (58–66) wurde als Kontrolle verwendet. Drei Gruppen von fünf Mäusen, denen jeweils zweiwöchentlich subkutane Injektionen von 10⁷ bestrahlten, Peptid-gepulsten (100 μg/ml) syngenen Milzzellen gegeben wurde. Eine Woche nach der zweiten Injektion, wurden die Mäuse getötet und ihre Milzen geerntet. Milzzellen wurden durch Standardverfahren präpariert, und Zellen von vorbereiteten Tieren wurden 5 Tage lang in vitro durch Cozüchten mit Peptid-gepulsten (10 μg/ml) bestrahlten autologen Milzzellen als Antigen-präsentierende Zellen vor dem Testen der Zytotoxizität gegen hTERT-exprimierende Targetzellen (Jurkat), die mit HLA-A2 (A2/K^b) in einem ⁵¹Cr-Releaseassay transfiziert wurden, erneut stimuliert.
Die Spalten auf der linken Seite von 1 zeigen das Töten von HLA-A2-transfizierten Jurkat-Zellen, die mit dem Kontrollepeptid (Grippe 58–66) gepulst wurden, durch T-Zellen, die nach Vorbereiten der Mäuse mit dem Peptid mit der Sequenzidentität 9 bei verschiedenen Effektor-Ziel-Verhältnissen erhalten wurden. Die spezifische Zytotoxizität über dem Hintergrund wurde bei allen Effektor-Ziel-Verhältnissen beobachtet. Die Spalten in der Mitte zeigen ähnliche Daten mit T-Zellen, die von Mäusen erhalten wurden, die mit dem Peptid mit Sequenzidentität 10 vorbereitet wurden. Merkliches Töten von Jurkat-Zellen wurde nur beobachtet, wenn Milzzellen von Telomerase-Peptid-gepulsten Mäusen als Effektorzellen verwendet wurden, folglich wurde, wenn Milzzellen von Influenza-Peptid-vorbereiteten Mäusen als Effektoren verwendet wurden, nur dann die Hintergrundmenge des Tötens von Jurkat-Zellen gesehen, wenn die Targetzellen mit einem irrelevanten Peptid (Melanocortin-Rezeptor 1-Peptid, MC1R244) gepulst wurden, wie aus den Spalten im rechten Teil von 1 offensichtlich wird. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Peptide mit der Sequenzidentität 9 und 10 in vivo immunogen sind und nach Immunisierung eine Immunantwort in einem Warmblüter hervorrufen können, das das gewöhnliche menschliche MHC-Molekül HLA-A2 trägt. Diese Feststellung zeigt an, dass die Peptide mit SEQ. ID. NR. 9 und 10 auch als Krebsimpfstoff bei Menschen verwendet werden können, die HLA-A2 und andere HLA-Klasse I-Moleküle tragen, die in der Lage sind, diese Peptide zu binden. Ausserdem legen diese Ergebnisse dar, dass hTERT, das durch die T-Zellen-Leukämielinie Jurkat exprimiert wird, durch die Proteolyse-Maschinerie der Zelllinie verarbeitet werden kann, um Peptidfragmente zu ergeben, die identisch mit den Peptiden mit Sequenzidentität 9 und 10 sind oder ihnen ähnlich sind. Zusammen zeigen diese Beobachtungen an, dass eine Immunantwort, die nach der Impfung von Krebspatienten oder Patienten mit dem Risiko, Krebs zu entwickeln, mit diesen Peptiden erhalten wurde, ein wirksames Töten von Tumorzellen zur Folge haben kann, die die hTERT-Untereinheit der Telomerase exprimieren.
1 stellt die Zytotoxizität von HLA-A2-transfizierten Jurkat-Zellen mit Effektorzellen, die von Mäusen erhalten wurden, die immunisiert wurden, wie in der Figur angezeigt, dar. Die Targetzellen wurden 1 Stunde lang bei 37°C mit ⁵¹Cr (0,1 μCi/100 μl Zellsuspension) markiert, zweimal gewaschen und vor dem Waschen 1 Stunde lang bei 37°C mit Peptid (1 μg/ml) gepulst. Zweitausend markierte, Peptid-gepulste Targetzellen wurden pro Vertiefung in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen und V-förmigem Boden gesät, und Effektorzellen (von 2,5 × 10⁴ bis 2 × 10⁵) wurden zu den Vertiefungen zugegeben. Die Kulturen wurden 4 Stunden lang bei 37°C inkubiert, und die Überstände wurden geerntet und in einem Gammazähler getestet. Die Ergebnisse in 1 sind als spezifische Zytotoxizität ausgedrückt, die durch die folgende Formel berechnet ist: (Cpm experimentell freigegeben – Cpm spontan freigegeben)/(Cpm gesamt – Cpm spontan freigegeben) × 100
2
2 (2) zeigt die Ergebnisse der in-vitro-Stimulierung von T-Zellen des peripheren Bluts von einem Patienten (TT) mit Kolonkrebs mit Telomerase(hTERT)-abgeleiteten Peptiden mit der Sequenzidentitätsnummer 2, 3, 4 und 7. Die Ergebnisse im Verhältnis zur SEQ ID NR. 7 sind nur zu Vergleichszwecken gezeigt. Die in-vitro-Kultur wurde wie folgt durchgeführt: Dreifache Ansätze von 10⁵ mononukleären Zellen wurden 6 Tage lang in X-VIVO 10-Medium, das mit 15% vereinigtem wärme-inaktiviertem menschlichem Serum ergänzt wurde, in einem befeuchteten Inkubator bei 5% CO₂ inkubiert. Die Peptide lagen in der ganzen Kultur bei einer Endkonzentration von 30 μg/ml im Medium vor. Kulturen ohne Peptid dienten als Kontrolle. Eine proliferative Antwort über den Hintergrundwerten wurde gesehen, wenn die T-Zellen mit dem Peptid mit der Sequenzidentität 4 stimuliert wurden. Diese Ergebnisse legen dar, dass Blut von einem Krebspatienten zirkulierende T-Zellen enthält, die für ein Peptid spezifisch sind, das sich von der Telomerase (hTERT) ableitet. Diese Ergebnisse legen dar, dass die enzymatische Untereinheit der Telomerase (hTERT) beim Menschen immunogen ist, und spontan Telomerase-spezifische T Zell-Antworten entstehen lassen kann, wenn sie durch einen im Patienten wachsenden Tumor überexprimiert wird. Ausserdem ist eine Komponente der Telomerase-spezifischen Antwort bei diesem Patienten gegen das hier beschriebene Peptid mit der SEQ ID NR. 4 gerichtet. Diese Feststellung zeigt an, dass das Peptid mit der SEQ ID NR. 4 auch als Krebsimpfstoff beim Menschen verwendet werden kann. Die Figur stellt die Ergebnisse von herkömmlichen T-Zellproliferationsassays dar, wo mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (10⁵) vor dem Ernten mit Peptiden, wie angezeigt, 7 Tage lang in dreifachen Ansätzen gezüchtet wurden. Um die Proliferationskapazität der Kulturen zu messen, wurde über Nacht vor dem Ernten ³H-Thymidin 3,7 × 10⁴ Bq/Vertiefung) zur Kultur zugegeben. Die Werte werden als durchschnittliche Zählungen pro Minute (Cpm) der dreifachen Ansätze angegeben.
3 und 4
Die 3 und 4 (3 und 4) zeigen die Reaktivität von Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TILs), die von einem Patienten mit vorgeschrittenem Pankreaskrebs erhalten wurden. Die T-Zellen wurden von einer Tumorbiopsie erhalten und wurden erfolgreich in vitro propagiert, um eine T-Zelllinie zu etablieren. Die T-Zelllinie war CD3⁺, CD4⁺, und CD8^– und proliferierte spezifisch als Antwort auf die Telomerase-Peptide. Die Ergebnisse in 3 zeigen T-Zellen, die die Peptide mit der SEQ ID NR. 2 und 3 erkennen, wenn Sie mit Kontrollen mit Medium alleine verglichen werden. Die Ergebnisse in 4 zeigen T-Zellen, die das Peptid mit der SEQ ID NR. 2 erkennen. Die TILs wurden durch Cozüchten mit rekombinantem menschlichem Interleukin 2 (rIL-2) expandiert und nach 14 Tagen unter Verwendung von Peptiden mit den Sequenzidentitätsnummern 2, 3, 4 und 7 in einem Standardproliferationsassay getestet. Die Ergebnisse im Verhältnis zur SEQ ID NR. 7 sind nur für Vergleichszwecke gezeigt. Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Sequenzidentitätsliste

Claims

Verwendung eines Peptids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Krebs, wobei das Peptid aus einer Sequenz EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) besteht, wobei die Behandlung oder Prophylaxe die Erzeugung einer T-Zell-Antwort umfasst, wobei die Antwort gegen das Peptid EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) oder ein Fragment davon gerichtet ist, das wenigstens 8 Aminosäuren lang ist, das nach Verarbeitung durch eine Antigen-präsentierende Zelle produzierbar ist.
Verwendung einer Nucleinsäure zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Krebs, wobei die Nucleinsäure in der Lage ist, ein Peptid zu kodieren, das aus einer Sequenz EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) besteht, wobei die Behandlung oder Prophylaxe die Erzeugung einer T-Zell-Antwort umfasst, wobei die Antwort gegen das Peptid EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) oder ein Fragment davon gerichtet ist, das wenigstens 8 Aminosäuren lang ist, das nach Verarbeitung durch eine Antigen-präsentierende Zelle produzierbar ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Behandlung oder Prophylaxe die Verabreichung einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge des Peptids an ein Säugetier umfasst, das an Krebs leidet oder wahrscheinlich leidet, so dass eine T-Zell-Antwort, die gegen die Telomerase gerichtet ist, im Säugetier induziert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die induzierte T-Zell- Antwort eine zytotoxische T-Zell-Antwort ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Medikament ein Arzneimittel, umfassend das Peptid oder die Nucleinsäure, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 5, wobei das Medikament wenigstens ein Peptid, das aus der Sequenz EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) besteht, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei das Medikament wenigstens eine Nucleinsäure, die in der Lage ist, ein Peptid zu kodieren, das aus der Sequenz EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) besteht, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 bis 7, wobei das Medikament das Peptid, das aus der Sequenz EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) besteht, und wenigstens ein Peptid, das in der Lage ist, eine T-Zell-Antwort, die gegen ein Onkogen- oder eine Mutante eines Tumorsuppressorproteins oder -peptids gerichtet ist, zu induzieren, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Onkogenprotein oder -peptid eine Mutante des p21-ras-Proteins oder -peptids ist, oder wobei das Tumorsuppressorprotein oder -peptid ein Retinoblastom- oder p53-Protein oder -peptid ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Krebs ausgewählt ist aus Brustkrebs, Prostatakrebs, Pankreaskrebs, kolorektalem Krebs, Lungenkrebs, malignem Melanom, Leukämie, Lymphomen, Ovarialkrebs, Zervixkrebs und Gallentraktkarzinomen.
Verfahren zur Erzeugung von T-Lymphozyten, die in der Lage sind, Tumorzellen in einem Säugetier zu erkennen und zu zerstören, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Probe von T-Lymphozyten, die aus einem Säugetier entnommen wurden, in Gegenwart eines Peptids in einer Menge, die ausreichend ist, Telomerase-spezifische T-Lymphozyten zu erzeugen, wobei das Peptid aus einer Sequenz EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) besteht, wobei die Telomerase-spezifischen T-Lymphozyten eine Antwort gegen das Peptid EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) oder ein Fragment davon erzeugen, das wenigstens 8 Aminosäuren lang ist, das nach Verarbeitung durch eine Antigen-präsentierende Zelle produzierbar ist.
Telomerase-spezifischer T-Lymphozyt, der mit einem Verfahren nach Anspruch 11 erzeugt wird.
Verwendung einer Kombination eines Telomerase-Peptids und eines Peptids, das in der Lage ist, eine T-Zell-Antwort gegen ein Onkogen- oder eine Mutante eines Tumorsuppressorproteins oder -peptids zu induzieren, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Krebs, wobei das Telomerase-Peptid aus einer Sequenz EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) besteht, und die Behandlung oder Prophylaxe umfasst die Erzeugung einer T-Zell-Antwort, wobei sich die Antwort gegen das Peptid EARPALLTSRLRFIPK (SEQ ID NR. 2), DGLRPIVNMDYVVGAR (SEQ ID NR. 3), GVPEYGCVVNLRKTVVNF (SEQ ID NR. 4), ILAKFLHWL (SEQ ID NR. 9) oder ELLRSFFYV (SEQ ID NR. 10) oder ein Fragment davon richtet, das wenigstens 8 Aminosäuren lang ist, das nach Verarbeitung durch eine Antigen-präsentierende Zelle produzierbar ist.