DE60105034T2

DE60105034T2 - Nukleotid sequenzen kodierend für das lysr2 gen

Info

Publication number: DE60105034T2
Application number: DE60105034T
Authority: DE
Inventors: Bettina Möckel; Mike Farwick; Thomas Hermann; Caroline Kreutzer; Walter Pfefferle
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-08-10
Filing date: 2001-06-15
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2021-06-16
Also published as: DE60105034D1; KR100824551B1; DE10110346A1; KR20030024841A

Description

Gegenstand der Erfindung sind isolierte coryneforme Bakterien, bei denen die Expression von Nucleotidsequenzen, die das lysR2-Gen kodieren, beseitigt ist, sowie ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin und L-Valin durch Beseitigen des lysR2-Gens. Das LysR2-Gen kodiert das LysR2-Protein, das ein Transkriptionsregulator der LysR-Familie ist.
Stand der Technik
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Valin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und vor allem in der Tierernährung Verwendung.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Aufgrund ihrer großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellungsverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch beispielsweise Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise werden Stämme erhalten, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren.
Seit einigen Jahren werden auch Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L- Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium angewendet.
M. Vrljic et al. (Molecular Microbiology, Blackwell Scientific, Oxford, GB, Bd. 22, Nr. 5, 1. Dezember 1996 (1996-12-01), Seiten 815–826, XP 000675794 ISSN: 0950-382X beschreiben einen corynebakteriellen Stamm, dem lysG fehlt, ein Mitglied der LysR-Familie von Regulatoren. Es liegt allerdings keine bedeutende Sequenzhomologie zwischen LysG und LysR vor, und der dort gezeigte Effekt auf die Lysin-Produktion wurde eher mit der Unterbrechung des Exportproteins LysE als mit der Unterbrechung von LysG in Verbindung gebracht.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder hatten die Aufgabe, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Lysin und L-Valin bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist:
ein isoliertes coryneformes Bakterium, bei dem die Expression eines Polynucleotids, das ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz hat, die zu wenigstens 90% identisch mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 ist, beseitigt ist, wobei das Polypeptid die Funktion eines Transkriptionsregulators der lysR-Familie hat.
Vorzugsweise hat das genannte Polypeptid die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2.
Vorzugsweise hat, das Polynucleotid

a) die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Nucleotidsequenz oder
b) wenigstens eine Sequenz, die der Sequenz a) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder optional
c) funktionsneutrale Sinnmutationen in a), die die Aktivität des Proteins/Polypeptids nicht modifizieren.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind:
ein Vektor, der das interne Fragment der in SEQ ID Nr. 3 dargelegten SEQ ID Nr. 1 umfasst, und coryneforme Bakterien, bei denen das lysR2-Gen insbesondere durch eine Insertion oder Deletion beseitigt ist.
Beschrieben werden Polynucleotide, die im Wesentlichen aus einer Polynucleotidsequenz bestehen, die erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank, die das vollständige Gen mit der Polynucleotidsequenz entsprechend SEQ ID Nr. 1 enthält, mit einer Sonde, die die Sequenz des genannten Polynucleotids gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein Fragment davon enthält, und Isolierung der genannten DNA-Sequenz.
Erfindungsgemäße Polynucleotidsequenzen sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um Nucleinsäuren oder Polynucleotide oder Gene, die das LysR2-Protein kodieren, in voller Länge zu isolieren oder um solche Nucleinsäuren oder Polynucleotide oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des lysR2-Gens haben. Sie sind außerdem für den Einbau in so genannte „Arrays", „Mikro-Arrays" oder „DNA-Chips" geeignet, um die entsprechenden Polynucleotide nachzuweisen und zu bestimmen.
Polynucleotidsequenzen gemäß der Beschreibung sind ferner als Primer geeignet, mit deren Hilfe DNA von Genen, die das LysR2-Protein kodieren, mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt werden kann.
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonucleotide umfassen wenigstens 25, 26, 27, 28, 29 oder 30, vorzugsweise wenigstens 20, 21, 22, 23 oder 24, besonders bevorzugt wenigstens 15, 16, 17, 18 oder 19 aufeinander folgende Nucleotide. Oligonucleotide mit einer Länge von wenigstens 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40 oder wenigstens 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Nucleotiden sind ebenfalls geeignet. Oligonucleotide mit einer Länge von wenigstens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nucleotiden sind bei Bedarf auch geeignet.
„Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt.
„Polynucleotid" bezieht sich im Allgemeinen auf Polyribonucleotide und Polydesoxyribonucleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann.
Unter „Polypeptiden" sind Peptide oder Proteine zu verstehen, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren umfassen.
Die Polypeptide schließen ein Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 2 mit der biologischen Aktivität des LysR2-Proteins und auch solche ein, die zu wenigstens 90%, besonders bevorzugt zu wenigstens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 2 sind und die genannte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L-Lysin und L-Valin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits die genannten Aminosäuren produzieren und in denen die das lysR2-Gen kodierenden Nukleotidsequenzen beseitigt werden.
Der Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Beseitigung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem beispielsweise ein schwacher Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet wird, das ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert oder das entsprechende Gen oder Allel oder Enzym (Protein) inaktiviert, und bei Bedarf diese Maßnahmen kombiniert werden.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Lysin und L-Valin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium, handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Spezies Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Spezies Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
oder daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten oder Stämme, wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum DM58-1
Corynebacterium glutamicum DG52-5
Corynebacterium glutamicum DSM 5715 und
Corynebacterium glutamicum DSM 12866
oder wie beispielsweise die L-Valin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum DSM 12455
Corynebacterium glutamicum FERM-P 9325
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 9324
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 1763.
Das lysR2-Gen von C. glutamicum, das LysR2-Protein kodiert, ist ein Transkriptionsregulator der LysR-Familie.
Zum Isolieren des LysR2-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehr- und Handbüchern beschrieben. Als Beispiele sind das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) zu nennen. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495–508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255–265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160–2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563–1575) angelegt wurde. Börmann et al. (Molecular Microbiology 6 (3), 317–326 (1992) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und Collins, 1980, Gene 11, 291–298).
Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences, 25, 807–818) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259–268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli-Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind, wie beispielsweise der Stamm DH5α (Jeffrey H. Miller: „A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992).
Die mit Hilfe von Cosmiden oder anderen λ-Vektoren klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige, für die DNA-Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert werden.
Methoden zur DNA-Sequenzierung werden unter anderem von Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA, 74: 5463–5467, 1977) beschrieben.
Die resultierenden DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen oder Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217–232 (1986)), dem von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829–1836 (1988)) oder dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97 (1998)) untersucht werden.
Auf diese Weise wurde die das lysR2-Gen kodierende DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ ID Nr. 1 in der vorliegenden Anmeldung beschrieben wird. Weiterhin wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID Nr. 2 ist die sich ergebende Aminosäuresequenz des lysR-2-Genproduktes dargestellt. Es ist bekannt, dass wirtseigene Enzyme die N-terminale Aminosäure Methionin oder Formylmethionin des gebildeten Proteins abspalten können.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID Nr. 1 durch die Degeneriertheit des genetischen Codes ergeben, sind ebenfalls bekannt. In gleicher Weise werden DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID Nr. 1 oder Teilen von SEQ ID Nr. 1 hybridisieren, beschrieben. In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche wie z. B. der Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als „Sinnmutationen" bekannt, die zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen, d. h. funktionsneutral sind. Ferner ist bekannt, dass Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Informationen hierzu findet die fachkundige Person unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751–757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene 77: 237–251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240–247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321–1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Es werden Aminosäuresequenzen beschrieben, die sich in entsprechender Weise aus SEQ ID Nr. 2 ergeben.
Schließlich werden DNA-Sequenzen beschrieben, die durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID Nr. 1 ergeben. Solche Oligonucleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nucleotiden.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybrisierung findet die fachkundige Person unter anderem im Handbuch „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255–260 (1991)). Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) findet die fachkundige Person unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Bei der Arbeit an der vorliegenden Erfindung konnte festgestellt werden, dass coryneforme Bakterien nach der Beseitigung des lysR2-Gens in verbesserter Weise L-Lysin und L-Valin produzieren.
Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression des lysR2-Gens oder die katalytischen Eigenschaften des Enzymproteins beseitigt werden. Bei Bedarf können beide Maßnahmen kombiniert werden.
Die Beseitigung der Genexpression kann durch geeignete Kultivierung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startcodon und Terminatoren. Informationen hierzu findet die fachkundige Person z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), bei Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)), Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).
Mutationen, die zu einer Veränderung oder Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele sind die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611–8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760–1762 (1997)) und Möckel („Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) zu nennen. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustauschs auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen oder Nichtsinnmutationen gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar (bp) in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen, in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Codonen führen typischerweise zu einem vollständigen Verlust der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung und des Gen-Ersatzes.
Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784–791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462–65 (1992)), pGEM-T (Progema corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biology Chemistry 269: 32678–84; US-Patent 5,487,993), pCR^®Blunt (Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534–541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510–4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der den zentralen Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067–1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 342–347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "Cross-over"-Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'-Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575–580 (1994)) zur Beseitigung des recA-Gens von C. glutamicum angewendet.
In 1 ist beispielhaft der Plasmidvektor pCR2.1lysR2int dargestellt, mit dessen Hilfe das LysR2-Gen unterbrochen oder beseitigt werden kann.
Bei der Methode des Gen-Ersatzes wird eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro gebildet. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten „Cross-over"-Ereignisses, das eine Integration bewirkt, und eines geeigneten zweiten „Cross-over"-Ereignisses, das eine Exzision im Zielgen oder in der Zielsequenz bewirkt, wird der Einbau der Mutation oder des Allels erreicht. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927 (1998)) angewendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion zu beseitigen.
In das lysR2-Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.
Darüber hinaus kann es für die Produktion von L-Lysin und L-Valin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des lysR2-Gens ein oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerose, des Pentosephosphatzyklus oder des Aminosäure-Exports zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.
Der Begriff „Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität von einem oder mehreren Enzymen (Proteinen) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem zum Beispiel die Kopiezahl des Gens oder der Gene erhöht, ein potenter Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet wird, das ein entsprechendes Enzym (Protein) mit hoher Aktivität kodiert, und bei Bedarf diese Maßnahmen kombiniert werden.
So können beispielsweise für die Herstellung von L-Lysin gleichzeitig ein oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• dem die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierenden Gen dapA (EP-B 0 197 335),
• dem Enolase kodierenden Gen eno (DE: 199 47 791.4),
• dem das zwf-Genprodukt kodierenden Gen zwf (JP-A-09224661),
• dem Pyruvatcarboxylase kodierenden Gen pyc (Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927 (1998)),
•) dem den Lysin-Export kodierenden Gen lysE (DE-A-195 48 222),
• dem eine Feedback-resistente Aspartatkinase kodierenden Gen lysC (EP-B-0387527; EP-A-0699759),
• dem das Zwa1-Protein kodierenden Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115) verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

So können beispielsweise für die Produktion von L-Valin gleichzeitig eines oder mehrere der Gene oder Allele, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• gleichzeitig dem die Acetohydroxysäuresynthase kodierenden ilvBN-Gen (Keilhauer et al., (1993) Journal of Bacteriology 175: 5595–5603), oder
• gleichzeitig dem die Dihydroxysäuredehydratase kodierenden ilvD-Gen (Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973–1979), oder
• gleichzeitig dem die Malat:Chinon-Oxidoreduktase kodierenden mqo-Gen (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395–403 (1998)) verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Außerdem kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Beseitigung des lysR2-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• dem Phosphoenolpyruvatcarboxykinase kodierenden Gen pck ( DE 199 50 409.1 , DSM 13047),
• dem Glucose-6-Phosphatisomerase kodierenden Gen pgi (US 09/396,478, DSM 12969),
• dem Pyruvatoxidase kodierenden Gen poxB (DE: 199 51 975.7, DSM 13114),
• dem das Zwa2-Protein kodierenden Gen zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113), zu beseitigen.

Schließlich kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Beseitigung des lysR2-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• dem Homoserindehydrogenase kodierenden Gen hom (EP-A-0131171),
• dem Homoserinkinase kodierenden Gen thrB (Peoples, O. W., et al., Molecular Microbiology 2 (1988): 63–72), und
• dem Aspartatdecarboxylase kodierenden Gen panD (EP-A-1006192), zu beseitigen.

Die Beseitigung der Homoserindehydrogenase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche wie beispielsweise durch den Austausch von L-Valin gegen L-Alanin, L-Glyin oder L-Leucin an Position 59 des Enzymproteins, durch den Austausch von L-Valin gegen L-Isoleucin, L-Valin oder L-Leucin an Position 104 des Enzymproteins und/oder durch den Austausch von L-Asparagin gegen L-Threonin oder L-Serin an Position 118 des Enzymproteins erreicht werden.
Die Beseitigung der Homoserinkinase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche wie beispielsweise durch den Austausch von L-Alanin gegen L-Valin, L-Glycin oder L-Leucin an Position 133 des Enzymproteins und/oder durch den Austausch von L-Prolin gegen L-Threonin, L-Isoleucin oder L-Serin an Position 138 des Enzymproteins erreicht werden.
Die Beseitigung der Aspartatdecarboxylase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche wie beispielsweise durch den Austausch von L-Alanin gegen L-Glycin, L-Valin oder L-Isoleucin an Position 36 des Enzymproteins erreicht werden.
Ferner kann es für die Produktion von L-Lysin und L-Valin vorteilhaft sein, neben der Beseitigung des lysR2-Gens unerwünschte Nebenreaktionen zu beseitigen (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im Batch-Verfahren (Batch-Kultur) oder im Fed-batch- (Zulaufverfahren) oder Repeated-Fed-Batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Valin, kultiviert werden. Eine Zusammenfassung bekannter Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) enthalten.
Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlenhydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerol und Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff sowie anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorläufer zugesetzt werden. Die genannten Ausgangsstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes gegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugeführt werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur können basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, zugegeben werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasgemische, wie z. B. Luft, in die Kultur eingebracht. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 20°C und 45° und vorzugsweise zwischen 25°C und 40°C. Die Kultur wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Diese Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann zum Beispiel wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167–1174) beschrieben durch Umkehrphasen-HPLC erfolgen.
Eine Reinkultur des folgenden Mikroorganismus wurde am 28. Juli 2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:

• Escherichia coli Stamm TOP10F/pCR2.1lysR2int als DSM 13617.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient der fermentativen Herstellung von L-Lysin und L-Valin.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalischen Phosphatasebehandlung wurden nach der Methode von Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.
Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien wie LB- oder TY-Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al. entnommen werden.
1. Beispiel
Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus C. glutamicum ATCC 13032
Chromosomale DNA von C. glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168–179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code-Nr. 27-0913-02) teilweise gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit Shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code-Nr. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84: 2160–2164), bezogen von Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code-Nr. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code-Nr. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit Shrimp alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.
Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code-Nr. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code-Nr. 200217) in Phagen verpackt.
Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563–1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) +100 μg/ml Ampicillin ausplattiert wurden. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37° wurden rekombinante Einzelklone selektiert.
2. Beispiel
Isolierung und Sequenzierung des lysR2-Gens
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produkt-Nr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Produkt-Nr. 27-0913-02) teilweise gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit Shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produkt-Nr. 1758250) dephosphoryliert. Nach einer Trennung durch Gelelektrophorese wurden die Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Produkt-Nr. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert.
Die DNA des Sequenzierungsvektors pZero-1, bezogen von Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Produkt-Nr. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenzierungsvektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U. S. A., 87: 4645–4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343–7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 μg/ml Zeocin ausplattiert.
Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Produkt-Nr. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Didesoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the Nation Academies of Sciences, U. S. A., 74: 5463–5467) mit Modifikationen nach Zimmerman et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Produkt-Nr. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die Trennung durch Gelelektrophorese und Analyse der Sequenzierungsreaktion erfolgte in einem „Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid"-Gel (29 : 1) (Produkt-Nr. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem „ABI Prism 377" Sequenzierungsgerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend mit dem Staden-Progammpaket (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) Version 97-0 verarbeitet. Die Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützten Kodierungsbereichsanalysen wurden mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) angefertigt. Weitere Analysen wurden mit dem „BLAST search program" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389–3402) anhand der nichtredundanten Datenbank des „National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA) durchgeführt.
Die erhaltene Nucleotidsequenz ist in SEQ ID Nr. 1 dargestellt. Eine Analyse der Nucleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 933 Basenpaaren, das als lysR2-Gen bezeichnet wurde. Das lysR2-Gen kodiert ein Polypeptid von 310 Aminosäuren.
3. Beispiel
Herstellung eines Integrationsvektors für die Integrationsmutagenese des lysR2-Gens
Aus dem Stamm ATCC 13032 wurde nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für C. glutamicum bekannten Sequenz des lysR2-Gens wurden die folgenden Oligonucleotide für die Polymerase-Kettenreaktion ausgewählt (siehe SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 5):
lysR2intA:
5'CCA TCG TCG CAG AAT TCA AC 3'
lysR2intB:
5'GCT TCT TCG GCT AAT GCA TC 3'
Die dargestellten Primer wurden von MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und die PCR-Reaktion wurde nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase der Firma Boehringer durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurde ein 439 bp großes internes Fragment des lysR2-Gens isoliert, das in der SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist.
Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit dem TOPO TA Cloning Kit von Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog Nummer K4500-01) in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9: 657–663) ligiert.
Anschließend wurde der E. coli Stamm TOP10F mit dem Ligationsansatz (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Bd. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) transformiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), der mit 25 mg/L Kanamycin angereichert worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit von Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wurde pCR2.1lysR2int genannt.
4. Beispiel
Integrationsmutagenese des lysR2-Gens in dem Lysinproduzenten DSM 5715 und in dem Valinproduzenten FERM BP-1763
Der im Beispiel 3 genannte Vektor pCR2.1lysR2int wurde nach der Elektroporationsmethode von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343–347 (1994)) in Corynebacterium glutamicum DSM 5715 und Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763 elektroporiert. Bei dem Stamm DSM 5715 handelt es sich um einen AEC-resistenten Lysin-Produzenten (EP-B-435 132). Bei dem Stamm FERM BP-1763 handelt es sich um einen Valin-Produzenten, der Isoleucin und Methionin benötigt (US-A-5,188,948). Der Vektor pCR2.1lysR2int kann in DSM 5715 oder FERM BP-1763 nicht selbstständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er sich ins Chromosom von DSM 5715 oder FERM BP-1763 integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom integriertem pCR2.1lysR2int erfolgte durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), der mit 15 mg/L Kanamycin angereichert worden war.
Für den Nachweis der Integration wurde das lysR2int-Fragment nach der Methode "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) mit dem Dig-Hybridisierungskit der Firma Boehringer markiert. Chromosomale DNA eines potenziellen Integranten wurde nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) isoliert und jeweils mit den Restriktionsenzymen SalI, SacI und HindIII gespalten. Die entstehenden Fragmente wurden mit Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und mit dem Dig-Hybridisierungskit der Firma Boehringer bei 68°C hybridisiert. Das in Beispiel 3 genannte Plasmid pCR2.1lysR2int war innerhalb des chromosomalen lysR2-Gens ins Chromosom von DSM 5715 und FERM BP-1763 inseriert worden. Die Stämme wurden als DSM5715::pCR2.1lysR2int und FERM BP-1763::pCR2.1lysR2int bezeichnet.
5. Beispiel
Herstellung von L-Lysin und L-Valin
Die im Beispiel 4 erhaltenen C. glutamicum und B. lactofermentum Stämme DSM5715::pCR2.1lysR2int und FERM BP-1763::pCR2.1lysR2int wurden in einem zur Produktion von L-Lysin und L-Valin geeigneten Nährmedium kultiviert, und der L-Lysin- und L-Valin-Gehalt wurde im Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurden die Stämme zunächst auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Kanamycin (25 mg/L) 24 Stunden lang bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet.

Medium CgIII

NaCl 2,5 g/L

Bacto-Pepton 10 g/L

Bacto-Yeast-Extrakt 10 g/L

Glucose (getrennt autoklaviert) 2% (w/v)

Der pH-Wert wurde auf pH 7,4 eingestellt

Diesem wurde Kanamycin (25 mg/L) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 24 Stunden lang bei 33°C bei 240 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM verwendet.

	Medium MM
CSL (Maisquellwasser)	5 g/L
MOPS	20 g/L
Glucose (getrennt autoklaviert)	50 g/L
Salze:
(NH₄)₂SO₄)	25 g/L
KH₂PO₄	0,1 g/L
MgSO₄*7H₂O	1,0 g/L
CaCl₂*2H₂O	10 mg/L
FeSO₄*7H₂O	10 mg/L
MnSO₄*H₂O	5,0 mg/L
Biotin (sterilfiltriert)	0,3 mg/L
Thiamin*HCl (sterilfiltriert)	0,2 mg/L
CaCO₃	25 g/L

CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das trocken autoklavierte CaCO₃ zugegeben. Für die Kultivierung von DSM 5715 wurde dem Medium zusätzlich 0,1 g/L Leucin zugesetzt. Für die Kultivierung von FERM BP-1763 wurden zusätzlich 0,1 g/L Isoleucin und 0,1 g/L Methionin zum Medium gegeben.
Die Kultivierung erfolgte in einem 10-ml-Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/L) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80% Luftfeuchtigkeit.
Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit einem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete L-Lysin- und L-Valin-Menge wurde mit einem Aminosäureanalysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustausch-Chromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrinnachweis bestimmt.
In den Tabellen 1 und 2 sind die Ergebnisse des Versuchs dargestellt.
Tabelle 1
Tabelle 2
Kurze Beschreibung der Figur
1: Karte des Plasmids pCR2.1lysR2int
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben die folgende Bedeutung.

KmR: Kanamycin-Resistenzgen

EcoRI: Spaltstelle des Restriktionsenzyms EcoRI

lysR2int: Internes Fragment des lysR2-Gens

ColE1 ori: Replikationsstartpunkt des Plasmids ColE1
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes coryneformes Bakterium, bei dem die Expression eines Polynucleotids, das ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz hat, die zu wenigstens 90% identisch mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 ist, beseitigt ist, wobei das Polypeptid die Funktion eines Transkriptionsregulators der lysR-Familie hat.
Bakterium nach Anspruch 1, wobei das genannte Bakterium zur Spezies Corynebacterium glutamicum gehört.
Bakterium nach Anspruch 1, wobei das genannte Polypeptid die in SEQ ID Nr. 2 dargelegte Aminosäuresequenz hat.
Bakterium nach Anspruch 1, wobei das genannte Polynucleotid die Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 1 hat.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Valin, umfassend: das Fermentieren der Bakterien gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, die die genannten Aminosäuren produzieren.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Valin, umfassend das Fermentieren der genannten Aminosäure produzierenden Bakterien, wobei die intrazelluläre Aktivität des in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Polypeptids beseitigt wird.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Valin, umfassend das Fermentieren der genannten Aminosäure produzierenden Bakterien, wobei die Expression des in SEQ ID Nr. 1 dargelegten Polynucleotids (lysR2-Gen) beseitigt wird.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, umfassend a) das Fermentieren der genannten Bakterien b) das Konzentrieren der genannten Aminosäuren in dem Medium oder in den Zellen der Bakterien, und c) das Isolieren der genannten Aminosäuren.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 5–8, wobei Bakterien verwendet werden, in denen weitere Gene des Biosynthesewegs der genannten Aminosäuren zusätzlich verstärkt oder überexprimiert sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 5–9, wobei Bakterien verwendet werden, in denen die Stoffwechselwege, die die Bildung der genannten Aminosäuren verringern, beseitigt sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei Bakterien fermentiert werden, in denen gleichzeitig ein oder mehrere der Gene verstärkt oder überexprimiert wird/werden, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus a) dem die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierenden Gen dapA, b) dem Enolase kodierenden Gen eno, c) dem das zwf-Genprodukt kodierenden Gen zwf, d) dem Pyruvatcarboxylase kodierenden Gen pyc, e) dem ein Protein für den Lysin-Export kodierenden Gen lysE, f) dem eine Feedback-resistente Aspartatkinase kodierenden Gen lysC, g) dem das Zwa1-Protein kodierenden Gen zwa1.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei gleichzeitig ein oder mehrere Gene beseitigt wird/werden, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: a) dem Phosphoenolpyruvatcarboxykinase kodierenden Gen pck, b) dem Glucose-6-Phosphatisomerase kodierenden Gen pgi, c) dem Pyruvatoxidase kodierenden Gen poxB, d) dem das Zwa2-Protein kodierenden Gen zwa2, e) dem Homoserindehydrogenase kodierenden Gen hom, f) dem Homoserinkinase kodierenden Gen thrB und g) dem Aspartatdecarboxylase kodierenden Gen panD.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 5–12, bei dem Bakterien der Gattung Corynebacterium verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die genannten Bakterien der Spezies Corynebacterium glutamicum verwendet werden.
Vektor zur Integrationsmutagenese, umfassend das interne Fragment von SEQ ID Nr. 1, dargelegt in SEQ ID Nr. 3.
Vektor pCR2.11lysR2int, der a) ein internes Fragment des lysR2-Gens mit einer Größe von 439 bp trägt, b) dessen Restriktionskarte in 1 reproduziert ist, und c) der im E. coli Stamm TOP10F/pCR2.1lysR2int unter der Nr. DSM 13617 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellenkulturen hinterlegt ist.
Coryneforme Bakterien, transformiert mit einem Integrationsvektor, der ein Fragment des in SEQ ID Nr. 1 dargelegten Polynucleotids trägt.