DE60120757T2

DE60120757T2 - 4-substituierte chinolone zur behandlung von autoimmunerkrankungen

Info

Publication number: DE60120757T2
Application number: DE60120757T
Authority: DE
Inventors: Idris David PRITCHARD; Doreen Hooi; Walsham Barrie BYCROFT; Siri Ram Chhabra
Original assignee: UK Secretary of State for Defence
Current assignee: UK Secretary of State for Defence
Priority date: 2000-12-16
Filing date: 2001-12-17
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2021-12-18
Also published as: EP1349550A1; ATE329595T1; WO2002047686A8; US7482362B2; EP1349550B1; GB0030729D0; AU2002222225A1; US20040082579A1; WO2002047686A1; DE60120757D1

Description

Die Erfindung betrifft 4-substituierte Chinolone, die immunosuppressive Eigenschaften aufweisen, deren Verwendung bei der Herstellung von Arzneimitteln für die Behandlung einer Autoimmunerkrankung.
Immunosuppressive Verbindungen leiten eine Inhibierung des Immunreaktionssystems ein. Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie immunosuppressive Wirkung zeigen, schließen den Pilzmetaboliten Cyclosporin A und das FK506 genannte Makrolidantibiotikum (ein Metabolit von Streptomyces tsukabaensis) ein. Beide von diesen Mitteln wurden klinisch und experimentell verwendet, um bei der Transplantation und bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten das Immunsystem zu unterdrücken.
Autoimmunerkrankheiten sind Störungen, bei denen die Wirtsdiskriminierung von „selbst" gegen „nicht selbst" zusammenbricht und das Immunsystem des Individuums (sowohl erworbene als auch angeborene Komponenten) Eigengewebe angreift. Diese Erkrankung reicht von üblichen, wie rheumatische Arthritis, Thyroidautoimmunerkrankung und Diabetes mellitus Typ I, zu weniger üblichen, wie multipler Sklerose, und selteneren Störungen, wie Myasthenie gravis. Fortschritte in der grundsätzlichen biomedizinischen Wissenschaft und insbesondere in der Immunologie haben gezeigt, dass die hauptsächliche und fundamentale Läsion, die für die Einleitung von dem Vorliegen von den meisten Autoimmunerkrankungen verantwortlich ist, in autoreaktiven proliferierenden T-Lymphozyten beruht. Tatsächlich ist die Mehrheit von Autoimmunerkrankungen an einen Verlust von T-Zellenhomeostase gebunden. Das gesunde Immunsystem wird in ausgeglichenem Gleichgewicht gehalten, scheinbar durch die kontra-suppressive Erzeugung von Cytokinen von T-Helfer 1 (Th1)- und T-Helfer 2 (Th2)-Lymphozyten-Unterreihen. Bei Autoimmunität herrschen Th1-Cytokine vor; bei Allergie nehmen Th2-Cytokine ihren Platz ein. Ein Cytokin, das innig mit der Entwicklung von auf Th1 basierenden Reaktionen und folglich Autoimmunerkrankungen verbunden ist, ist TNF-α.
Sowohl Cyclosporin A als auch FK506 wurden klinisch bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen mit ermutigenden Ergebnissen verwendet.
Die gegenwärtig verfügbaren immunosuppressiven Arzneimittel haben den Nachteil eines engen therapeutischen Index; d.h. Toxizität gegen klinischen Vorteil. Die Verbindungen sind bekanntlich nephrotoxisch, neurotoxisch und potenziell diabetogen, und dies begrenzt ihre Anwendung auf den vorstehend erwähnten Gebieten. Es gibt auch Probleme bei der Verabreichung dieser Verbindungen, deren Bioverfügbarkeit und dem Verfolgen ihrer Anteile, sowohl klinisch, als auch im Labor.
Erhaltene experimentelle Ergebnisse zeigen, dass Mitglieder einer bestimmten Klasse von substituierten 4-Chinolonverbindungen immunosuppressive Wirkung zeigen.
Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von einer Verbindung der Formel I bereit,
worin R¹ eine gerad- oder verzweigtkettige, gesättigte oder ethylenisch ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen darstellt, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren Substituentengruppen, ausgewählt aus Halogen, 1–6C Alkoxy, Carboxy, 1–6C Alkoxycarbonyl und NR⁶R⁷, substituiert sein kann, wobei jeder von R⁶ und R⁷ unabhängig aus H und 1–6C Alkyl ausgewählt ist, oder R⁶ und R⁷ zusammen mit dem N-Atom, an das sie gebunden sind, eine gesättigte heterocyclische Gruppe, ausgewählt aus Piperidino, Piperazino und Morpholino, bilden; R² eine Gruppe, ausgewählt aus H, -OH, Halogen, -CHO, -CO₂H und CONHR⁸, darstellt, wobei R⁸ H oder ein 1–6C Alkyl darstellt; jeder von R³, R⁴ und R⁵ unabhängig aus H, -CH₃, -OCH₃ und Halogen ausgewählt ist; oder ein nicht toxisches pharmazeutisch verträgliches Salz davon, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer Autoimmunerkrankung bei einem Lebewesen, einschließlich eines Menschen.
Wir nehmen an, dass die Verbindungen mit der Formel I, wie vorstehend definiert, einschließlich nichttoxische, pharmazeutisch verträgliche Salze davon, die Immunreaktion in dem lebenden Tierkörper, einschließlich Mensch, modulieren können. Insbesondere nehmen wir an, dass diese Verbindungen eine inhibitorische Wirkung auf Lymphozyten-Proliferation bei Menschen aufweist. Die Verbindungen mit der vorstehenden Formel I wurden in einem Verfahren zum Behandeln einer Krankheit von einem lebenden Tierkörper, einschließlich eines Menschen, verwendet, wobei die Krankheit für die Wirkung einer immunosuppressiven, beispielsweise Autoimmunkrankheit verantwortlich ist, wobei das Verfahren Verabreichen an den lebenden Tierkörper, einschließlich Menschen, einer therapeutisch wirksamen Menge einer wie vorstehend beschriebenen Verbindung umfasst.
Die Verbindungen mit immunosuppressiven Eigenschaften haben die allgemeine, vorstehend angegebene Formel I und schließen ihre nichttoxischen, pharmazeutisch verträglichen Salze ein. Die Gruppe R¹ in Formel I ist eine gerade oder verzweigte Kette mit 1 bis 18 C-, vorzugsweise 3 bis 13 C-, Kohlenwasserstoffgruppe, die gesättigt sein kann oder die ethylenisch ungesättigt sein kann. Diese Gruppe kann gegebenenfalls mit einer oder mehreren Substituentengruppen, ausgewählt aus Halogen, beispielsweise F, Cl, Br oder I; 1–6C-Alkoxy, beispielsweise Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, n-Butoxy, Isobutoxy und tert-Butoxy; Carboxy, ein schließlich nichttoxischer Salze davon; 1–6C-Alkoxycarbonyl, beispielsweise Methoxycarbonyl; und NR⁶R⁷, worin jedes R⁶ und R⁷ unabhängig ausgewählt ist aus H und C_1-6-Alkyl, beispielsweise Methyl oder Ethyl, substituiert sein. R⁶ und R⁷, zusammen mit dem N-Atom, an das sie gebunden sind, können alternativ eine Piperidinoeinheit, eine Morpholinoeinheit oder eine Piperazinoeinheit bilden, worin das 4-N-Atom gegebenenfalls mit einer Methylgruppe substituiert sein kann.
Typischerweise wird die Kohlenwasserstoffgruppe R¹ eine geradkettige Alkylgruppe mit 3 bis 13 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Propyl, n-Pentyl, n-Heptyl, n-Nonyl und n-Undecyl, sein, die gegebenenfalls, wie vorstehend beschrieben, substituiert sein kann. Vorzugsweise wird in der vorstehenden Formel I die Gruppe R¹ n-Heptyl sein.
Die Gruppe R² ist ausgewählt aus H, -OH, Halogen, beispielsweise F, Cl, Br und I, CHO, CO₂H und CONHR⁸, worin R⁸ H oder C_1-6-Alkyl darstellt. Wenn R² eine Carbonsäuregruppe darstellt, schließt der Umfang der Erfindung die nichttoxischen Metall- und Ammoniumsalze der Carbonsäure ein. Jedoch ist vorzugsweise die Gruppe R² OH. Jede von den Gruppen R³, R⁴ und R⁵ ist unabhängig ausgewählt aus H, CH₃, OCH₃ und Halogen, beispielsweise F, Cl, Br und I. Somit können R³, R⁴ und R⁵ die gleichen oder verschiedenen Gruppen sein. Beliebige von den Gruppen R³, R⁴ und R⁵ können an beliebige der freien Ringpositionen, die an den Benzolring von den Chinolonen kondensiert sind; d.h. an die Ringpositionen 5, 6, 7 und 8, gebunden sein. Wenn vorzugsweise nicht alle von den R³, R⁴ und R⁵ H darstellen, wird Substitution an der Chinolonstruktur an Position 6, 7 oder beiden sein. Bevorzugter sind jedoch alle von R³, R⁴ und R⁵ H; d.h. der kondensierte Benzolring des Chinolons ist unsubstituiert.
Eine besonders bevorzugte Verbindung mit der vorstehenden Formel I zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist 2-n-Heptyl-3-hydroxy-4(1H)-chinolon.
Wie vorstehend erwähnt, haben die Verbindungen der Formel I und nichttoxische Salze davon Verwendung als pharma zeutisch wirksame Bestandteile bei der Behandlung eines Tierkörpers, einschließlich des menschlichen Körpers, der unter einer Erkrankung oder Störung leidet, die für die Wirksamkeit von einem immunosuppressiven Mittel verantwortlich ist, beispielsweise für die Behandlung einer Autoimmunerkrankung, wie Psoriasis, multipler Sklerose oder rheumatischer Arthritis. Die an den Tierkörper bei Therapiebedarf zu verabreichende Dosierung wird natürlich von dem tatsächlich verwendeten Wirkstoff, der Behandlungsart und dem erwünschten Behandlungstyp, sowie von der Körpermasse des Patienten abhängen. Der Wirkstoff kann natürlich an sich oder in Form einer geeigneten medizinischen Zusammensetzung, die beispielsweise einen geeigneten pharmazeutischen Träger oder ein Verdünnungsmittel enthält, verabreicht werden. Andere Substanzen können natürlich auch in solchen medizinischen Zusammensetzungen angewendet werden, wie Antioxidantien und Stabilisatoren, wobei die Verwendung davon dem Fachmann gut bekannt ist. Bei der Behandlung von Psoriasis wird der Wirkstoff typischerweise zur örtlichen Verabreichung an den Patienten, beispielsweise in Form von Salbe, Creme oder Lotion, formuliert. Es wird angenommen, dass die hierin beschriebenen Verbindungen auch in einer Impfstoffzubereitung als ein Hilfsmittel verwendet werden können, in Situationen, wo verstärkte Th2-Reaktionen vorteilhaft sein würden, beispielsweise beim Impfen gegen Wurminfektion bei Menschen und Haustieren.
BEISPIELE FÜR VERBINDUNGEN DER FORMEL I
EXPERIMENTELLES
Synthese von 2-Heptyl-3-hydroxy-4(1H)-chinolon
Herstellung von 5-Octanoyl-Meldrum-Säure (2,2-Dimethyl-5-octanoyl-1,3-dioxan-4,6-dion)
N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (11 mMol) wurde zu einer gerührten Lösung von Octansäure (10 mMol) und 4-Dimethylaminopyridin (12 mMol) in trockenem Dichlormethan (40 ml) gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und Meldrum-Säure (10 mMol) wurde zugegeben. Das Rühren wurde über Nacht bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand erneut in Essig säureethylester gelöst und filtriert. Das Filtrat wurde mit 2 M HCl Lösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer verdampft, um das Titelprodukt als ein Öl in 95%iger Ausbeute zu erhalten, und wurde ohne weitere Reinigung in dem nächsten Schritt verwendet.
Herstellung von 3-Oxodecansäureethylester
Eine Lösung von 5-Octanoyl-Meldrum-Säure (10 mMol) in trockenem Ethanol (50 ml) wurde 4 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in Essigsäureethylester erneut gelöst. Die Lösung wurde nacheinander mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung, 1 M KHSO₄ und schließlich Salzsäure gewaschen. Trocknen (MgSO₄) und Aufkonzentrierung im Vakuum lieferte den Titel-β-Ketoester als ein Öl in nahezu quantitativer Ausbeute.
¹H NMR (90 MHz, CDCl₃) δ 0,9 (3H, t, CH₃), 1,3 (11H, m, OCH₂CH₃ und CH₃(CH₂)₄), 1,6 (2H, m, CH₂CH₂CO), 2,5 (2H, t, CH₂CO), 3,4 (2H, s, COCH₂CO), 4,2 (3H, q, OCH₂).
Herstellung von 3-Anilino-2-decensäureethylester
Eine Lösung von Anilin (6 mMol), 3-Oxodecansäureethylester (6 mMol) und Toluol-p-sulfonsäure (50 mg) in trockenem Toluol (60 ml) wurde 24 Stunden unter Verwendung einer Dean-Stark-Apparatur für die azeotrope Entfernung von Wasser unter Rückfluss erhitzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um das Titelprodukt als ein Öl bereitzustellen, das ohne Reinigung im nächsten Schritt verwendet wurde.
Herstellung von 2-Heptyl-4-(1H)-chinolon
Das Rohprodukt von 3-Anilino-2-decensäureethylester wurde mit Diphenylether (50 ml) vermischt und 30 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und dann mit Petrolether (Sdp. 60–80°C; 200 ml) verdünnt. Das Gemisch wurde gerührt und der Petrolether abdekantiert. Das Produkt wurde an einer Kieselgelsäule unter Ver wendung von 3%igem MeOH/CH₂Cl₂ als der mobilen Phase chromatographiert. 2-Heptyl-4-(1H)-chinolon wurde als ein kristalliner Feststoff in 50%iger Ausbeute erhalten.
¹H NMR (90 MHz, CDCl₃) δ 0,8 (3H, t, CH₃), 1,2 (8H, m, CH₃(CH₂)₄), 1,7 (2H, m, NHCCH₂CH₂), 2,7 (2H, m, NHCCH₂), 6,2 (1H, s, 3-H), 7,3 (1H, m, 6-H), 7,6 (1H, m, 7-H), 7,8 (1H, d, 5-H), 8,4 (1H, d, 8-H), 12,7 (1H, br s, NH).
Herstellung von 3-Formyl-2-heptyl-4(1H)-chinolon
Ein Gemisch von 2-Heptyl-4(1H)-chinolon (5 mMol), Hexamin (2,5 mMol) und TFA (7,5 ml) wurde 30 Stunden unter Stickstoff unter Rückfluss gerührt. MeOH (15 ml) und Wasser (15 ml) wurden zugegeben und das Erhitzen wurde 1 Stunde fortgesetzt. 3 M HCl (5 ml) wurde zugegeben und das Erhitzen wurde für einen weiteren Zeitraum von 30 Minuten fortgesetzt. Das Gemisch wurde gekühlt und der Niederschlag durch Filtration entfernt und mit Wasser gewaschen. Der Feststoff lieferte bei Verreibung mit Aceton die Titelverbindung in 40%iger Ausbeute. Umkristallisation aus MeOH/EtOAc ergab farblose Nadeln, Fp. 245–248°C (Zersetzung).
¹H NMR (250 MHz, DMSO-d₆) δ 0,82 (3H, t, CH₃), 1,27 (8H, m, CH₃(CH₂)₄), 1,6 (2H, m, NHCCH₂CH₂), 3,0 (2H, m, NHCCH₂), 7,38 (1H, dd, 6-H), 7,57 (1H, d, 7-H), 7,70 (1H, dd, 5-H), 8,12 (1H, d, 8-H), 10,37 (1H, s, CHO), 12,12 (1H, br s, NH).
Herstellung von 2-Heptyl-3-hydroxy-4(1H)-chinolon
Wässriges Wasserstoffperoxid (27,5 gewichtsprozentige Lösung in Wasser, 145 μl) wurde zu einer Lösung von 3-Formyl-2-heptyl-4(1H)-chinolon (1 mMol) in EtOH (3 ml) und 1 M NaOH Lösung (1,0 ml) unter Stickstoff gegeben und das Gemisch wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt, an der Luft getrocknet und aus EtOAc kristallisiert, um 2-Heptyl-3-hydroxy-4(1H)-chinolon in 70%iger Ausbeute als weißliche Nadeln zu ergeben, Fp. 195–197°C.
¹H NMR (250 MHz, DMSO-d₆) δ 0,82 (3H, t, CH₃), 1,27 (8H, m, CH₃(CH₂)₄), 1,63 (2H, m, NHCCH₂CH₂), 2,72 (2H, m, NHCCH₂), 7,20 (1H, m, 6,7-H₂), 7,52 (2H, m, 5-H), 8,00 (1H, br s, OH), 8,08 (1H, d, 8-H), 11,44 (1H, br s, NH).
Immunomodulatorische Wirkung von 2-Heptyl-3-hydroxy-4(1H)-chinolon
Materialien und Verfahren
1. ConA Mitogen-stimulierte Proliferation von Maussplenozyten
Das Concanavalin-A-(ConA)-Zellproliferationsassay wurde verwendet, um die Wirkung der Titelverbindung auf T-Zellenaktivierung und Proliferation zu bewerten. Die Proliferation wurde durch den Einbau von [³H]-Thymidin in DNA bewertet. Acht Wochen alte weibliche BALB/c Mäuse wurden von Harlan (Bicester, Oxon, GB) erhalten und nach Belieben mit Nahrung und Wasser versorgt. Splenozytensuspensionen wurden durch Entfernen der Milzen und Anordnen derselben in RPMI 1640 Medium hergestellt. Die Milzen wurden durch Drahtsiebe mit 70 μm Porengröße unter Verwendung des Stößels mit einer 5 ml Spritze gedrückt, um eine Einzelzellensuspension zu erzeugen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletisiert und Erythrozyten wurden mit 0,017 M Tris, 0,144 M Ammoniumchloridpuffer, pH 7,2, lysiert. Leukozyten wurden zweimal mit RPMI 1640 Medium mit 2% (Volumen/Volumen) fötalem Kalbsserum (FCS) gewaschen und in vollständigem Zellkulturmedium (CTCM), bestehend aus RPMI 1640 Medium mit 5% FCS, 2 mM L-Glutamin und 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol, resuspendiert. Die Titelverbindung wurde bei Verdoppeln der Verdünnungen im Bereich von etwa 10 bis 0,2 μM in einem Endvolumen von 200 μl CTCM, enthaltend ConA (Sigma, Poole, GB), bei 1 μg/ml und 100000 Milzzellen, getestet. Nach Inkubation für 48 Stunden bei 37°C in 5%iger CO₂-Luft wurden 0,25 μCi [³H]-Thymidin (Amersham) in 10 μl Volumen, aufgefüllt in RPMI 1640 Medium, zugegeben und die Zellen wurden weitere 24 h inkubiert. Die Zellen wurden auf Faserglasfiltern mit einem Packard-Filtermate-Ernter geerntet. Nach der Zugabe von 25 μl MicroS cint-O (Packard) zu jeder Vertiefung wurden die Filter mit dem Packard TopCount Szintillationszähler gezählt.
Mitogen-(Concanavalin A)-induzierte Maus-Splenozytenproliferation wurde durch den Einbau von tritiiertem Thymidin in die DNA in die Mausmilzzellen, wie durch Zählungen pro Minute, unter Anwendung des Szintillationszählers angezeigt. Die inhibitorische Wirkung der zu testenden Titelverbindung auf Zellproliferation wurde durch eine Verminderung in den Zählungen pro Minute angezeigt. 1 zeigt die Kurven der Zählungen pro Minute (cpm) gegen die Konzentrationen (mikromolar) von der Titelverbindung und den Träger Dimethylsulfoxid (DMSO). Es kann aus der Figur ersichtlich werden, dass 2-Heptyl-3-hydroxy-4(1H)-chinolon Splenozytenproliferation inhibiert.
2.
Die humane monozytische Zelllinie, Mono Mac 6, wurde mit Konzentrationen von bakteriellem Quorum-sensing Molekülen, 2-Heptyl-3-hydroxy-4(1H)-chinolon (PQS), N-(3-Oxododecanoyl)-L-homoserinlacton (OdDHL) und N-(3-Oxohexanoyl)-L-homoserinlacton, behandelt. Zellen mit 100000 pro Vertiefung wurden in Quorum-sensing Molekülen im Bereich von 3,90625 bis 500 μM ausgesetzt, nachdem die Zellen mit 10 ng/ml E. coli LPS und 5 ng/ml Phorbolmyristatacetat stimuliert wurden, um die Über-Nacht-Freisetzung von TNF-α in die Kulturmedien zu induzieren. Eine Tetrazoliumverbindung, (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium), inneres Salz MTS, wurde zu den Zellen gegeben, um die Zelllebensfähigkeit nach Behandlung mit den Quorumsensing Molekülen zu bestimmen. MTS ist bioreduziert durch Zellen in einem Formazanprodukt, das in Gewebekulturmedium löslich ist. Die Erzeugung von Formazan wurde durch Messen der Absorption der Verbindung bei 450 nm bestimmt. Die Ergebnisse werden in 2 gezeigt. Eine Titration der Zellzahlen wurde eingeschlossen, um zu der Anzahl an lebensfähigen Zellen in den behandelten Vertiefungen, die in der nachstehenden Tabelle ausgewiesen sind, zu korrelieren.
Die Photographie (3) zeigt die Herstellung von Formazan aufgrund von Bioreduzierbarkeit von Mono-Mac-6-Zellen (bei 100000 Zellen pro Vertiefung) nach deren Aussetzen über Nacht bakteriellen Quorum-sensing Molekülen.
3.
(A) In-vitro-Proliferationsassays und Freisetzung von IL-2
Periphere, einkernige Humanblutzellen (PBMC) wurden aus heparinisiertem Ganzblut durch Buoyant-Dichtezentrifugierung über Histopague 1077 (Sigma, Poole, GB) 600 g für 20 Minuten isoliert. PBMC, die aus den „Buffy"-Schichten geerntet wurden, wurden gewaschen und dann in 96-Vertiefungs-Platten mit 100000 pro Vertiefung gleichgewichtsmäßig einstellen lassen. PBMC wurden bakteriellem Quorum-sensing Molekülen (PQS oder OdDHL) mit Konzentrationen im Bereich von 0,78125 bis 100 μM ausgesetzt und dann mit 1 μg/ml Concanavalin A (ConA) stimuliert. Nach einer Über-Nacht-Kultur wurden 50 μl des Kulturüberstands für den Nachweis von IL-2, freigesetzt durch „Sandwich"-ELISA, entfernt. Die Zellen wurden zu der Kultur für weitere 24 Stunden zurückgeführt, bevor 0,25 μCi pro Vertiefung ³H-Thymidin zugegeben wurden. Nach 18 Stunden Puls wurden die Human-PBMC auf Fiberglasfiltern geerntet, die dann in Gegenwart von MicroScint-O mit dem Packard TopCount Szintillationszähler gezählt wurden. Die Ergebnisse werden in 4A gezeigt.
(B) Human-IL-2 „Sandwich" ELISA
Humanleukozyten wurden mit ConA stimuliert, das Cytokin IL-2 freisetzte. Die Anteile von in den Kulturüberständen nach 24 h erzeugtem Cytokin wurden in einem „Sandwich" ELISA bestimmt. Es wurden somit 96-Vertiefungen Nunc MaxiSorp-(Life Technologies, Paisley, GB)-Platten mit 50 μl eines „Einfangungs"-anti-IL-2-monoklonalen Antikörpers (BD Pharmingen, GB) in einem 0,05 M Carbonat/Bicarbonatpuffer, pH 9,6, über Nacht bei 4°C beschichtet. Nach Waschen der Platten dreimal mit PBS-Tween, das Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) enthält, mit 0,5% (Volumen/Volumen) Tween 20 (Sigma, Poole, GB), wurden die Platten mit 1% (Gewicht/Volumen) Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma, Poole, GB) bei Raumtemperatur für 2 h blockiert. Nach drei Waschungen mit PBS-Tween wurden 50 μl der Zellkulturüberstände zugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert; Standard-Humen-IL-2 (BD Pharmingen, GB) wurde für jede Platte eingeschlossen. Nach vier Waschungen mit PBS-Tween wurden 50 μl eines biotinylierten anti-IL-2-monoklonalen Antikörpers (BD Pharmingen, GB) zugegeben, in 1% BSA in PBS-Tween verdünnt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach vier Waschungen wurde der gebundene biotinylierte Antikörper mit 50 μl einer 1 : 1000 Verdünnung von Streptavidin-Peroxidase (BD Pharmingen, GB) nachgewiesen. Am Ende einer Inkubation von einer Stunde bei Raumtemperatur wurden die Platten sorgfältig sechsmal mit PBS-Tween gewaschen und das Assay wurde durch den Zusatz von 100 μl 0,1 mg/ml Tetramethylbenzidinsubstrat (Sigma, Poole, GB) in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 6, enthaltend 0,03% H₂O₂, entwickelt. Die Enzymreaktion wurde mit 50 μl 2,5 M H₂SO₄ nach einer Entwicklung von 10 Minuten bei Raumtemperatur gestoppt und die Entwicklung wurde bei 450 nm mit einem spektrophotometrischen 96-Vertiefungs-Platten-leser gelesen. Die Ergebnisse werden in 4B gezeigt.
(C) In-vitro-Stimulierung von humanem PBMC für die Freisetzung von TNF-α
Human-PBMC, mit 100000 Zellen pro Vertiefung, wurden mit 1 × 10^–5 μg/ml LPS E. coli Stamm 055:B5 stimuliert. Nach der Kultur für 24 Stunden wurden die Zellkulturüberstände gesammelt und auf TNF-α-Anteile durch „Sandwich" ELISA, in ähnlicher Weise, wie vorstehend für das IL-2-Nachweisassay beschrieben, getestet. Die Ergebnisse werden in 4C gezeigt.
Erörterung
Die dargereichten Daten weisen aus, dass zwei chemisch verschiedene bakterielle Quorum-sensing Moleküle Immunreaktionen verschieden modulieren. OdDHL inhibiert Human-PBMC-Zellproliferation, IL-2-Sekretion und TNF-α-Produktion; wohingegen PQS keine Wirkung auf TNF-α-Produktion bei niedriger Dosis aufweist und TNF-α-Produktion bei hoher Dosis verstärken kann. Weiterhin hat PQS, im Gegensatz zu OdDHL, keine Wirkung auf die Zelllebensfähigkeit, wie durch MTS-Umwandlung bearbeitet.

Claims

Verwendung einer Verbindung der Formel I
worin R¹ eine gerad- oder verzweigtkettige, gesättigte oder ethylenisch ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen darstellt, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren Substituentengruppen, ausgewählt aus Halogen, 1–6C Alkoxy, Carboxy, 1–6C Alkoxycarbonyl und NR⁶R⁷, substituiert sein kann, wobei jeder von R⁶ und R⁷ unabhängig aus H und 1–6C Alkyl ausgewählt ist, oder R⁶ und R⁷ zusammen mit dem N-Atom, an das sie gebunden sind, eine gesättigte heterocyclische Gruppe, ausgewählt aus Piperidino, Piperazino und Morpholino, bilden; R² eine Gruppe, ausgewählt aus H, -OH, Halogen, -CHO, -CO₂H und CONHR⁸, darstellt, wobei R⁸ H oder ein 1–6C Alkyl darstellt; jeder von R³, R⁴ und R⁵ unabhängig aus H, -CH₃, -OCH₃ und Halogen ausgewählt ist; oder ein nicht toxisches pharmazeutisch verträgliches Salz davon, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer Autoimmunerkrankung bei einem Lebewesen, einschließlich eines Menschen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die Formel I aufweist, worin R¹ eine geradkettige Alkylgruppe mit 3 bis 13 Kohlenstoffatomen darstellt.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei in der Formel I R¹ n-Heptyl darstellt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei in der Formel I R² OH darstellt.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Verbindung der Formel I 2-n-Heptyl-3-hydroxy-4(1H)-chinolon darstellt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Autoimmunerkrankung aus Psoriasis, multipler Sclerose und rheumatischer Arthritis ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Autoimmunerkrankung Psoriasis ist und wobei das Arzneimittel zur örtlichen Verabreichung formuliert wird.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Arzneimittel in Form einer Salbe, Creme oder Lotion vorliegt.
Verwendung einer Verbindung der Formel I
worin R¹ eine gerad- oder verzweigtkettige, gesättigte oder ethylenisch ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen darstellt, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren Substituentengruppen, ausgewählt aus Halogen, 1–6C Alkoxy, Carboxy, 1–6C Alkoxycarbonyl und NR⁶R⁷, substituiert sein kann, wobei jeder von R⁶ und R⁷ unabhängig aus H und 1–6C Alkyl ausgewählt ist, oder R⁶ und R⁷ zusammen mit dem N-Atom, an das sie gebunden sind, eine gesättigte heterocyclische Gruppe, ausgewählt aus Piperidino, Piperazino und Morpholino, bilden; R² eine Gruppe, ausgewählt aus H, -OH, Halogen, -CHO, -CO₂H und CONHR⁸, darstellt, wobei R⁸ H oder ein 1–6C Alkyl darstellt; jeder von R³, R⁴ und R⁵ unabhängig aus H, -CH₃, -OCH₃ und Halogen ausgewählt ist; oder ein nicht toxisches pharmazeutisch verträgliches Salz davon, zur Herstellung eines Hilfsmittels für die Verwendung in einer Impfstoffzubereitung zur Verstärkung einer Th2-Reaktion in vivo.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Verbindung die Formel I aufweist, worin R¹ eine geradkettige Alkylgruppe mit 3 bis 13 Kohlenstoffatomen darstellt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei in der Formel I R¹ n-Heptyl darstellt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei in der Formel I R² OH darstellt.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Verbindung der Formel I 2-n-Heptyl-3-hydroxy-4(1H)-chinolon darstellt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Impfstoffzubereitung zur Verwendung zum Impfen gegen Wurminfektion ist.