DE60118560T2

DE60118560T2 - Nicht-nukleosid reverse transkriptase inhibitoren

Info

Publication number: DE60118560T2
Application number: DE60118560T
Authority: DE
Inventors: Bruno Laval SIMONEAU
Original assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Current assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Priority date: 2000-06-16
Filing date: 2001-06-14
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2021-06-15
Also published as: HUP0301105A2; JP3923894B2; EP1294720B1; EA005598B1; UA74834C2; AR028958A1; NO20025844D0; US20020028807A1; JP2004502787A; BG107348A; YU94202A; EE200200690A; PL360370A1; EA200201255A1; IL152819A0; DK1294720T3; MY130375A; BR0102377A; PE20020083A1; CN1178939C

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft neue Verbindungen und pharmazeutisch verträgliche Salze davon, ihre Verwendung, entweder allein oder in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln, bei der Behandlung oder Prophylaxe der HIV-Infektion und pharmazeutische Zusammensetzungen umfassend die Verbindungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die als erworbenes Immundefektsyndrom (AIDS) bekannte Krankheit wird durch den humanen Immunschwächevirus (HIV) verursacht, insbesondere durch den als HIV-1 bekannten Stamm. Damit HIV durch eine Wirtszelle repliziert wird, muss die Information des viralen Genoms in die DNA der Wirtszelle integriert werden. HIV ist aber ein Retrovirus, was bedeutet, dass dessen genetische Information in Form von RNA vorliegt. Der HIV-Replikationszyklus erfordert daher einen Schritt der Transkription des viralen Genoms (RNA) in DNA, was die Umkehr der üblichen Ereigniskette ist. Die Transkription der viralen RNA in DNA wird durch ein Enzym bewerkstelligt, das passenderweise als Reverse Transkriptase (RT) bezeichnet worden ist. Das HIV-Virion beinhaltet eine Kopie der RT zusammen mit der viralen RNA.
Reverse Transkriptase hat drei bekannte enzymatische Funktionen; sie wirkt als eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, als eine Ribonuclease und als eine DNA-abhängige DNA-Polymerase. Als RNA-abhängige DNA-Polymerase transkribiert RT eine einsträngige DNA-Kopie der viralen RNA. Als Ribonuclease zerstört RT die ursprüngliche virale RNA und befreit die gerade produzierte DNA aus der ursprünglichen RNA. Als DNA-abhängige DNA-Polymerase erstellt RT schließlich einen zweiten, komplementären DNA-Strang unter Verwendung des ersten DNA-Strangs als Templat. Die beiden Stränge bilden zweisträngige DNA, die in das Genom der Wirtszelle durch ein anderes, als Integrase bezeichnetes Enzym integriert wird.
Verbindungen, welche die enzymatischen Funktionen der HIV-1-Reverse-Transkriptase inhibieren, hemmen die Replikation von HIV-1 in infizierten Zellen. Diese Verbindungen sind bei der Vermeidung oder Behandlung der HIV-1-Infektion von Patienten nützlich, wie durch bekannte RT-Inhibitoren demonstriert, wie 3'-Azido-3'-deoxythymidin (AZT), 2',3'-Dideoxyinosin (ddI), 2',3'-Dideoxycytidin (ddC), d4T, 3TC, Nevirapin, Delavirdin, Efavirenz und Abacavir, die Hauptarzneimittel, die sich bislang zur Verwendung bei der Behandlung von AIDS bewährt haben.
Wie bei jeder antiviralen Therapie führt der Einsatz von RT-Inhibitoren bei der Behandlung von AIDS schließlich zu einem Virus, der weniger empfindlich für das gegebene Arzneimittel ist. Die Resistenz (verringerte Empfindlichkeit) gegen diese Arzneimittel ist das Ergebnis von Mutationen, die im Reverse-Transkriptase-Segment des pol-Gens auftreten. Mehrere Mutantenstämme von HIV sind charakterisiert worden und der Grund der Resistenz gegenüber bekannten therapeutischen Mitteln sind Mutationen im RT-Gen. Einige der klinisch am häufigsten beobachteten Mutanten sind: der Y181C-Mutant, bei dem ein Tyrosin (Y) bei Codon 181 zu einem Cystein (C)-Rest mutiert worden ist, und K103N, bei dem Lysin (K) in Position 103 durch Asparagin (N) ersetzt worden ist. Andere Mutanten, die mit wachsender Häufigkeit während der Behandlung mit bekannten antiviralen Mitteln auftreten, beinhalten die Einzelmutanten V106A, G190A, Y188C und P236L; und die Doppelmutanten K103N/Y181C, K103N/P225H, K103N/V108I und K103N/L100I.
Da die Therapie und Vermeidung von HIV-Infektion unter Verwendung von antiviralen Mitteln fortgesetzt wird, ist das vermehrte Auftreten von neuen resistenten Stämmen zu erwarten. Es gibt daher einen ständigen Bedarf nach neuen Inhibitoren für RT mit unterschiedlichen Mustern an Wirksamkeit gegen die verschiedenen Mutanten.
Verbindungen mit tricyclischen Strukturen, die Inhibitoren von HIV-1 sind, sind im US-Patent Nr. 5366972 beschrieben. Andere Inhibitoren von HIV-1-Reverse-Transkriptase sind in Hargrave et al., J. Med. Chem., 34, 2231 (1991), beschrieben.
Das US-Patent Nr. 5705499 schlägt 8-Arylalkyl- und 8-Arylheteroalkyl-5,11-dihydro-6H-dipyrido[3,2-B:2',3'-E][1,4]diazepine als Inhibitoren von RT vor. Es wurde gezeigt, dass beispielhafte Verbindungen einige Wirksamkeit gegen Wildtypen und Mutanten-HIV-1-RT, insbesondere Y181C und andere Einzelmutanten, wie K103N, obgleich weniger wirkungsvoll, aufweisen.
Insbesondere sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei der Inhibierung der Mutanten Y181C und K103N ebenso wie für einen weiten Bereich anderer Einzelmutanten und bestimmter, gewöhnlich gefundener Doppelmutanten, wie K103N/Y181C und K103N/P225H, wirksam.
J. Klunder et al. (J. Med. Chem. 1998, 41, 2960–2971) und Ch. L. Cywin et al. (J. Med. Chem. 1988, 41, 2972–2984) beschreibt neue nicht-nucleosidische Inhibitoren der HIV-1-Reverse-Transkriptase, die sich von dem tricyclischen Dipyridodiazepinon-Gerüst von Nevirapin durch die Einführung eines Substituenten in 8-Position unterscheiden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung verringert die Schwierigkeiten und Nachteile des Standes der Technik durch Bereitstellen neuer Verbindungen, die starke Inhibitoren für Einzel- und Doppelmutantenstämme von HIV-1 RT sind.
Nach einem ersten Aspekt stellt die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel I bereit:
worin:
R² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, F, Cl, C_1-4-Alkyl, C_3-4-Cycloalkyl und CF₃;
R⁴ H oder Me ist;
R⁵ H, Me oder Et ist, mit der Maßgabe, dass R⁴ und R⁵ nicht beide Me sind und, wenn R⁴ Me ist, R⁵ dann nicht Et sein kann;
R¹¹ Me, Et, Cyclopropyl, Propyl, Isopropyl oder Cyclobutyl ist; Q ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Nach einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung einen Inhibitor der HIV-Replikation der allgemeinen Formel I oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon bereit.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung einen Inhibitor eines Reverse-Transkriptase-Enzyms von HIV der allgemeinen Formel I oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon bereit.
Nach einem vierten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Arzneimittels bereit, das zur Behandlung oder Vermeidung von HIV-Infektion geeignet ist.
Nach einem fünften Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung oder Vermeidung von HIV-Infektion bereit, die eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Nach einem sechsten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon bereit.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Wie hier verwendet soll der Ausdruck "C_1-4-Alkyl" lineare oder verzweigte Alkylreste, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten, bedeuten und Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, sek.-Butyl und tert.-Butyl beinhalten.
Wie hier verwendet, soll der Ausdruck "C_3-4-Cycloalkyl" gesättigte cyclische Kohlenwasserstoffreste, die 3 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten, bedeuten und Cyclopropyl und Cyclobutyl beinhalten.
Ausführliche Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
Nach einer bevorzugten Ausführungsform sind Verbindungen der Erfindung nach Formel I definiert, wobei R² vorzugsweise Cl, F oder H ist. Bevorzugter ist R² Cl oder H. Am meisten bevorzugt ist R² H.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform sind Verbindungen der Erfindung nach Formel I definiert, wobei R⁴ bevorzugt H ist.
Nach einer alternativen Ausführungsform sind Verbindungen der Erfindung nach Formel I definiert, wobei R⁵ bevorzugt Me ist.
Verbindungen der Erfindung sind vorzugsweise nach Formel I definiert, wobei R¹¹ Et oder Cyclopropyl ist. R¹¹ ist bevorzugter Et.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform sind Verbindungen der Erfindung nach Formel I definiert, wobei Q bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus
ausgewählt ist.
Bevorzugter ist Q:
Alternativ beinhalten bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung Verbindungen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
und
Die Verbindungen der Erfindung sind wirksame Inhibitoren von Wildtyp-Reverse-Transkriptasen ebenso wie zur Inhibierung von z.B. den Einzelmutationsenzymen Y181C, K103N, V106A, G190A, Y188C und P236L. Die Verbindungen inhibieren auch die Doppelmutationsenzyme K103N/Y181C, K103N/P225H, K103N/V108I und K103N/L100I.
Die Verbindungen der Formel I besitzen Inhibitoraktivität gegen HIV-1-Reverse-Transkriptase. Wenn in geeigneten Dosierungsformen verabreicht, sind sie bei der Behandlung von AIDS, ARC und zusammenhängenden Störungen, die mit HIV-1-Infektion verbunden sind, nützlich. Ein anderer Aspekt der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Behandlung von HIV-1-Infektion, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer neuen Verbindung I wie vorstehend beschrieben an einen Menschen, der durch HIV-1 infiziert ist, umfasst. Die Verbindungen können auch zur Verhinderung der perinatalen Übertragung von HIV-1 von der Mutter auf das Baby durch Verabreichung an die Mutter vor der Geburt verwendet werden, egal ob dies als Behandlung oder Prophylaxe bezeichnet wird.
Die Verbindungen der Formel I können in Einzeldosen oder geteilten Dosen über die orale oder parenterale Routen verabreicht werden. Eine geeignete orale Dosierung für eine Verbindung der Formel I wäre im Bereich von etwa 0,5 mg bis 1 g pro Tag. Eine bevorzugte orale Dosierung für eine Verbindung der Formel I wäre im Bereich von etwa 100 mg bis 800 mg pro Tag für einen Patienten mit einem Gewicht von 70 kg. Bei parenteralen Formulierungen kann eine geeignete Dosierungseinheit 0,1 bis 250 mg der genannten Verbindungen enthalten, vorzugsweise 1 mg bis 200 mg. Es sollte jedoch verständlich sein, dass die Dosierungsverabreichung von Patient zu Patient variiert und die Dosierung für jeden bestimmten Patienten von der Beurteilung des Krankenhausarztes abhängt, der zur Feststellung einer richtigen Dosierung die Größe und den Zustand des Patienten ebenso wie die Reaktion des Patienten auf das Arzneimittel als Kriterien verwenden wird.
Wenn die Verbindungen der vorliegenden Erfindung oral verabreicht werden sollen, können sie als Arzneimittel in Form von pharmazeutischen Präparaten verabreicht werden, die sie in Verbindung mit einem kompatiblen pharmazeutischen Trägermaterial enthalten. Bei einem derartigen Trägermaterial kann es sich um ein inertes organisches oder anorganisches Trägermaterial handeln, das für die orale Verabreichung geeignet ist. Beispiele für derartige Trägermaterialien sind Wasser, Gelatine, Talkum, Stärke, Magnesiumstearat, Gummi arabicum, pflanzliche Öle, Polyalkylenglycole, Rohvaseline usw.
Die pharmazeutischen Präparate können in üblicher Weise hergestellt werden und fertiggestellte Dosierungsformen können feste Dosierungsformen, z.B. Tabletten, Dragees, Kapseln usw., oder flüssige Dosierungsformen, z.B. Lösungen, Suspensionen, Emulsionen usw., sein. Die pharmazeutischen Präparate können üblichen pharmazeutischen Arbeitsgängen unterworfen werden, wie Sterilisierung. Die pharmazeutischen Präparate können ferner herkömmliche Adjuvantien enthalten, wie z.B. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Emulgatoren, Geschmacksverbesserer, Benetzungsmittel, Puffer, Salze zur Variierung des osmotischen Drucks, usw. Ein festes Trägermaterial, das eingesetzt werden kann, beinhaltet z.B. Stärke, Lactose, Mannit, Methylcellulose, mikrokristalline Cellulose, Talkum, Kieselsäure, Calciumhydrogenphosphat und hochmolekulare Polymere (wie Polyethylenglycol).
Für den parenteralen Einsatz kann eine Verbindung der Formel I in einer wässrigen oder nicht wässrigen Lösung, Suspension oder Emulsion in einem pharmazeutisch verträglichen Öl oder einer Mischung von Flüssigkeiten, die Bakteriostatika, Antioxidationsmittel, Konservierungsmittel, Puffer oder andere gelöste Stoffe, um die Lösung mit Blut isotonisch zu machen, Verdickungsmittel, Suspendiermittel oder andere pharmazeutisch verträgliche Additive enthalten können, verabreicht werden. Additive dieses Typs beinhalten z.B. Tartrat-, Citrat- und Acetatpuffer, Ethanol, Propylenglycol, Polyethylenglycol, Komplexbildner (wie EDTA), Antioxidationsmittel (wie Natriumbisulfit, Natriummetabisulfit und Ascorbinsäure), hochmolekulare Polymere (wie flüssige Polyethylenoxide) zur Viskositätssteuerung und Polyethylenderivate von Sorbitanhydriden. Konservierungsmittel können nach Bedarf auch zugegeben werden, wie Benzoesäure, Methyl- oder Propylparaben, Benzalkoniumchlorid und andere quaternäre Ammoniumverbindungen.
Die Verbindungen der Erfindung können auch als Lösungen für nasale Anwendungen verabreicht werden und können zusätzlich zu den Verbindungen der Erfindung geeignete Puffer, Tonuseinstellmittel, mikrobielle Konservierungsmittel, Antioxidationsmittel und die Viskosität erhöhende Mittel in einem wässrigen Vehikel enthalten. Beispiele für Mittel zur Erhöhung der Viskosität sind Polyvinylalkohol, Cellulosederivate, Polyvinylpyrrolidon, Polysorbate oder Glycerin. Zugesetzte mikrobielle Konservierungsmittel können Benzalkoniumchlorid, Thimerosal, Chlorbutanol oder Phenylethylalkohol beinhalten.
Außerdem können die durch die Erfindung bereitgestellten Verbindungen durch ein Suppositorium verabreicht werden.
Die Verbindungen der Erfindung können mit dem Fachwissen eines synthetischen organischen Chemikers hergestellt werden. Ein beispielhaftes Reaktionsschema ist in den Schemen 1 bis 6 gezeigt.
Schema 1: Herstellung von Zwischenprodukten, worin R⁴ Me ist
Schema 2: Herstellung von Zwischenprodukten, worin R⁵ Me ist
Diese Abfolge von Schema 2 ist analog zu der, die von J. M. Klunder et al.; J. Med. Chem. 1998, 41, 2960–71, und C. L. Cywin et al.; J. Med. Chem. 1998, 41, 2972–84, beschrieben wurde.
Schema 3: Herstellung von Zwischenprodukten, worin R² C_1-3-Alkyl ist
Schema 4: Herstellung von Zwischenprodukten, worin R² CF₃ ist
Schema 5: Einführung des Chinolinkerns
Schema 6: Alternative Route zu Verbindungen, in denen R⁴ Me ist
Wie vorstehend angegeben, inhibieren die durch die Erfindung bereitgestellten Verbindungen die enzymatische Aktivität von HIV-1 RT. Auf Basis der Prüfung dieser Verbindungen, wie nachstehend beschrieben, ist bekannt, dass sie die RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität von HIV-1 RT inhibieren. Es ist bekannt (Daten nicht gezeigt), dass sie auch die DNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität von HIV-1 RT inhibieren. Durch Einsatz des nachstehend beschriebenen Reversen Transkriptase (RT)-Assays können Verbindungen auf ihr Vermögen, die RNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität von HIV-1 RT zu inhibieren, geprüft werden. Bestimmte spezifische Verbindungen, die in den Beispielen beschrieben werden, die nachstehend aufgeführt sind, wurden so getestet. Die Ergebnisse dieser Prüfung sind in Tabelle 2 als IC₅₀ (nM) und Tabelle 3 als EC₅₀ (nM) aufgeführt.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird in weiteren Einzelheiten durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele veranschaulicht. Alle Reaktionen wurden in einer Stickstoff- oder Argonatmosphäre durchgeführt. Die Temperaturen sind in °C angegeben. Lösungsprozentsätze oder Verhältnisse drücken eine Beziehung Volumen zu Volumen aus, sofern nicht anders angegeben.
Hier verwendete Abkürzungen oder Symbole beinhalten:

DEAD:: Diethylazodicarboxylat;
DIAD:: Diisopropylazodicarboxylat;
DIEA:: Diisopropylethylamin;
DMAP:: 4-(Dimethylamino)pyridin;
DMSO:: Dimethylsulfoxid;
DMF:: Dimethylformamid;
ES MS:: Elektronenspray-Massenspektrometrie;
Et:: Ethyl;
EtOAc:: Ethylacetat;
Et₂O:: Diethylether;
HPLC:: Hochleistungsflüssigchromatographie;
iPr:: Isopropyl;
Me:: Methyl;
MeOH:: Methanol;
MeCN:: Acetonitril;
NBS:: N-Bromsuccinimid;
Ph:: Phenyl;
TBE:: Tris-Borat-EDTA;
TBTU:: 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorborat;
TFA:: Trifluoressigsäure;
THF:: Tetrahydrofuran;
MS(ES):: Elektrospray-Massenspektrometrie;
MS(FAB) oder FAB/MS:: Fast atom bombardment-Massenspektrometrie
HRMS:: hochauflösende Massenspektrometrie
PFU:: Plaque-bildende Einheiten;
DEPC:: Diethylpyrocarbonat;
DTT:: Dithiothreit;
EDTA:: Ethylendiamintetraacetat;
UMP:: Uridin-5'-monophosphat;
UTP:: Uridin-5'-triphosphat;
MES:: 2-(n-Morpholino)ethansulfonsäure;
SDS-PAGE:: Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese;
MWCO:: Molekulargewichts-Ausschlussgrenze;
Bis-Tris-Propan:: 1,3-Bis{tris(hydroxymethyl)methylamino}propan;
GSH:: reduziertes Glutathion;
OBG:: n-Octyl-β-D-glucosid.

SYNTHESEN
Die folgenden Beispiele veranschaulichen Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Erfindung.
BEISPIEL I (Eintrag 24, Tabelle 1)
5,11-Dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2;3'-e][1,4]diazepin-6-on
a) 2-(Ethylamino)-3-nitropyridin
Zu einer Lösung von 2-Chlor-3-nitropyridin (51 g, 325 mmol) in THF (650 ml) wurde eine 2 M Lösung Ethylamin in THF (365 ml, 731 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in Wasser (ca. 1,5 l) gegossen und der sich ergebende Feststoff wurde filtriert und unter verringertem Druck getrocknet, um die Titelverbindung zu ergeben (52 g).
b) 3-Amino-2-(ethylamino)pyridin
Eine Lösung von 2-(Ethylamino)-3-nitropyridin (52 g) in MeOH (600 ml) wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Wasserstoff (1 atm) in Anwesenheit von 20% Pd(OH)₂/C (10,4 g) gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Diatomeenerde entfernt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, um die Titelverbindung als schwarzen Feststoff zu ergeben (39 g, 88% Ausbeute über die Schritte a) und b)).
c) 2-Chlor-N-[2-(ethylamino)-3-pyridinyl]-5-brom-3-pyridincarboxamid
Zu einer gekühlten Lösung von 3-Amino-2-(ethylamino)pyridin (30,6 g, 223 mmol) in MeCN (740 ml) wurde festes NaHCO₃ (56,3 g, 669 mmol) gegeben. Nach 5 min wurde rohes 5-Brom-2-chlor-3-pyridincarbonylchlorid (hergestellt aus 5-Brom-2-hydroxy-3-pyridincarbonsäure und SOCl₂ [wie von T. W. Gero et al. in Synth. Commun. 1989, 19, 553–559, beschrieben (hier durch Bezugnahme aufgenommen), aber unter Weglassen der wässrigen Aufarbeitung] zugegeben (1 Äquiv., 223 mmol). Nach 2 h wurde die Reaktionsmischung über Eis/H₂O (1,5 l) gegossen und der sich ergebende Feststoff wurde filtriert, mit H₂O und dann Hexan gespült. Nach Trocknen unter vermindertem Druck über Nacht wurde die Titelverbindung als schwarzer Feststoff erhalten (54,9 g, 69% Ausbeute).
d) 8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Zu einer Lösung von 2-Chlor-N-{2-(ethylamino)-3-pyridinyl}-5-brom-3-pyridincarboxamid (54,9 g, 154,4 mmol) in Pyridin (308 ml) bei 50°C wurde eine 1 M Lösung NaHMDS (Natriumhexamethyldisilazid) in THF (355 ml, 355 mmol) tropfenweise zugegeben. Nach 10 min ließ man die Reaktion auf Raumtemperatur abkühlen und dann wurde sie über Eiswasser (2 l) gegossen. Der sich ergebende Feststoff wurde filtriert und mit Wasser und dann Hexan gespült. Der Feststoff wurde unter vermindertem Druck getrocknet, um die Titelverbindung (36 g, 75% Ausbeute) als dunkelgrünen Feststoff zu ergeben.
e) 8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-5-methyl-6H-dipyridoo[3.2-b:2'3'-e][1,4]diazepin-6-on
Zu einer Lösung des 8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (36,7 g, 115 mmol) in DMF (380 ml) wurde NaH (3,5 g, 138 mmol) gegeben und die Mischung wurde auf 50°C für 30 min erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Mel (14,3 ml, 230 mmol) behandelt. Nach 1,5 h wurde die Reaktionsmischung über Eiswasser gegossen. Der Feststoff wurde filtriert, mit Wasser und dann Hexan gewaschen, um nach Trocknung die Titelverbindung (37,9 g, 99% Ausbeute) als dunkelgrauen Feststoff zu ergeben.
f) 5,11-Dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Allyltributylzinn (30,7 ml, 99,0 mmol) und Pd(Ph₃P)₄ (5,20 g, 4,50 mmol) wurden zu einer entgasten (N₂ durch die Lösung für 30 min) Lösung von 8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,3]diazepin-6-on (30,0 g, 90,0 mmol) in DMF (450 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde 1,5 h bei 90°C gerührt, dann auf Raumtemperatur gekühlt und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan:EtOAc, 8:2 bis 7:3) gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben (22,19 g, 84% Ausbeute).
g) 5,11-Dihydro-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Ein ozonisierter Sauerstoffstrom wurde durch eine kalte (–78°C) Lösung von 5,11-Dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (22,19 g, 75,4 mmol) in CH₂Cl₂ (150 ml) und MeOH (150 ml) für 2,5 h geblubbert. Ein Strom von N₂ wurde als nächstes durch die Lösung für 15 min geblubbert und dann wurde festes NaBH₄ (4,99 g, 132 mmol) zur Lösung gegeben. Man ließ die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur aufwärmen. Nach 1 h wurde wässriges gesättigtes NH₄Cl (200 ml) zugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 h gerührt. Die organischen Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt. Wasser (300 ml) und CHCl₃ (300 ml) wurden zum Rückstand gegeben. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde mit CHCl₃ (3 × 300 ml) extrahiert. Die vereinten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc:CHCl₃, 4:1) gereinigt, um die Titelverbindung (16,1 g, 72% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben.
h) 5,11-Dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-[2-(4-chinolinyloxy)ethyl]-6H-dipyrido[3,2b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Diethylazodicarboxylat (DEAD) (12,8 ml, 81,0 mmol) wurde topfenweise zu einer Lösung von 5,11-Dihydro-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (16,1 g, 54,0 mmol), 4-Hydroxychinolin (11,6 g, 81,0 mmol) und Ph₃P (21,3 g, 81,0 mmol) in THF (270 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc: MeOH; 95:5) gereinigt, um die Titelverbindung (17,7 g, 77% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 426 (MH)⁺.
BEISPIEL II (Eintrag 2, Tabelle 1)
2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
a) 6-Chlor-2-(ethylamino)-3-nitropyridin
Eine eiskalte Lösung EtNH₂ (49,8 g, 1,10 mol) in Toluol (200 ml) wurde über 15 min zu einer eiskalten Lösung von 2,6-Dichlor-3-nitropyridin (100,0 g, 0,52 mol) in Toluol (225 ml) gegeben. Die Mischung wurde 45 min bei 0°C gerührt. Wasser (500 ml) und EtOAc (500 ml) wurden zugegeben und die Phasen wurden getrennt. Die organische Schicht wurde nacheinander mit Wasser (200 ml) und Salzlösung (200 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzen triert. Der restliche Feststoff wurde aus MeOH umkristallisiert, um die Titelverbindung (83,7 g, 80% Ausbeute) als gelbe Nadeln zu ergeben.
b) 3-Amino-6-chlor-2-(ethylamino)pyridin
Eine Lösung von SnCl₂·H₂O (616,3 g, 2,73 mol) in wässrigem 12 N HCl (500 ml) wurde rasch zu einer Lösung von 6-Chlor-2-(ethylamino)-3-nitropyridin (169,5 g, 0,84 mol) in AcOH (1,7 l) bei Raumtemperatur gegeben. Nach 20 min wurde die Mischung auf 0°C gekühlt und Wasser (250 ml) wurde zugegeben. Festes NaOH (240 g) wurde dann in kleinen Portionen zugegeben. Die sich ergebende Suspension wurde filtriert, um Zinnsalze zu entfernen. Das Filtrat wurde mit Wasser (3,5 l) verdünnt, die Lösung wurde durch Zugabe von wässriger 10 N NaOH basisch gemacht und dann mit EtOAc (3 × 1,7 l) extrahiert. Die vereinten organischen Schichten wurden mit Salzlösung (1 l) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan:EtOAc, 3:2) gereinigt, um die Titelverbindung (89,9 g, 62% Ausbeute) als braunen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 172/174 (MH)⁺.
c) 5-Brom-2-chlor-N-{2-(ethylamino)-6-chlor-3-pyridinyl}-3-pyridincarboxamid
Eine Lösung von 5-Brom-2-chlor-3-pyridincarbonylchlorid (30,0 g, 97,0 mmol) in MeCN (100 ml) wurde über eine Kanüle zu einer Lösung von 3-Amino-6-chlor-2-(ethylamino)pyridin (16,6 g, 97,0 mmol) in MeCN (180 ml) enthaltend festes NaHCO₃ (14,2 g, 169 mmol) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 h gerührt. Wasser (200 ml) wurde zugegeben und die Mischung wurde für 10 min gerührt. Die sich ergebende Suspension wurde filtriert. Der Feststoff wurde mit Et₂O (50 ml) gewaschen und aus Pyridinlösung (3 × 50 ml) konzentriert, um die Titelverbindung zu ergeben (28,4 g, 75% Ausbeute).
d) 8-Brom-2-chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Eine 1 M Lösung von NaHMDS in THF (167,5 ml, 167,5 mmol) wurde langsam zu einer Lösung von 5-Brom-2-chlor-N-{2-(ethylamino)-6-chlor-3-pyridinyl}-3-pyridincarboxamid (28,4 g, 72,8 mmol) in Pyridin (146 ml) auf 50°C erwärmt gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1,5 h bei 50°C gerührt. Die Mischung wurde dann in eine Mischung von Wasser und Eis (1 l) gegossen und nach 1 h wurde die sich ergebende Suspension filtriert. Der Feststoff wurde mit Wasser gewaschen und unter vermin dertem Druck getrocknet, um die Titelverbindung zu ergeben (23,4 g, 91% Ausbeute).
e) 8-Brom-2-chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Festes NaH (60% Öldispersion, 3,46 g, 86,1 mmol) wurde über 30 min zu einer Lösung von 8-Brom-2-chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (23,4 g, 66,3 mmol) in DMF (220 ml) bei 50°C gegeben. Die Mischung wurde 1 h bei 50°C gerührt und dann ließ man auf Raumtemperatur abkühlen. Die Mischung wurde in Wasser (1 l) gegossen und die sich ergebende Suspension wurde filtriert. Der Feststoff wurde nacheinander mit Wasser und Hexan gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet, um die Titelverbindung zu ergeben (23,0 g, 94% Ausbeute).
f) 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Allyltributylzinn (21,3 ml, 68,7 mol) und Pd(Ph₃P)₄ (3,61 g, 3,12 mmol) wurden zu einer entgasten (N₂ durch Lösung für 30 min) Lösung von 8-Brom-2-chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (23,0 g, 62,5 mmol) in DMF (312 ml) gegeben. Die Mischung wurde 2 h auf 90°C erwärmt. Die Mischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan:EtOAc, 7:3) gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben (13,4 g, 65% Ausbeute).
g) 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Ozonisierter Sauerstoff wurde in eine kalte (–78°C) Lösung von 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (13,4 g, 40,7 mmol) in MeOH (102 ml) und CH₂Cl₂ (102 ml) eingeleitet, bis das Alken vollständig verschwunden war. Stickstoff wurde durch die Lösung geblubbert, um überschüssiges O₃ zu entfernen. Festes NaBH₄ (2,69 g, 71,1 mmol) wurde als nächstes in kleinen Portionen zugegeben und man ließ die Mischung langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 1 h wurde wässriges gesättigtes NH₄Cl (150 ml) zugegeben und die Mischung 20 min gerührt. Die organischen Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt. Wasser (100 ml) wurde zur wässrigen Lösung gegeben. Die Lösung wurde mit CHCl₃ (3 × 200 ml) extrahiert. Die vereinten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc:CHCl₃, 4:1) gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben (10,4 g, 77% Ausbeute).
h) 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Diethylazodicarboxylat (DEAD) (4,26 ml, 27,0 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (6,00 g, 18,0 mmol), 4-Hydroxychinolin (3,92 g, 27,0 mmol) und Ph₃P (7,09 g, 27,0 mmol) in THF (90 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc:MeOH, 95:5) gereinigt, um die Titelverbindung (6,22 g, 75% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 460/462.
BEISPIEL III (Eintrag 6, Tabelle 1)
2-Chlor-11-cyclopropyl-5,11-dihydro-5-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)-ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
a) 6-Chlor-2-(cyclopropylamino)-3-nitropyridin
Eine Lösung von Cyclopropylamin (1,25 g, 22,0 mmol) in Toluol (11 ml) wurde über 10 min zu einer eiskalten Lösung von 2,6-Dichlor-3-nitropyridin (2,00 g, 10,4 mmol) in Toluol (10 ml) gegeben. Die Mischung wurde 1 h bei 0°C und bei Raumtemperatur für 2 h gerührt. Wasser (50 ml) wurde zur Mischung gegeben und die Phasen wurden getrennt. Die organische Schicht wurde mit Salzlösung (25 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan:EtOAc, 3:2) gereinigt, um die Titelverbindung (1,97 g, 89% Ausbeute) als gelben Feststoff zu ergeben.
b) 2-Chlor-11-cyclopropyl-5,11-dihydro-8-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Die Titelverbindung wurde aus 6-Chlor-2-(cyclopropylamino)-3-nitropyridin unter Verwendung eines Verfahrens hergestellt, das dem für das 11-Ethyl-Analoga beschriebene in Beispiel II ähnlich ist.
c) 2-Chlor-11-cyclopropyl-5,11-dihydro-5-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Diethylazodicarboxylat (DEAD) (85,6 μl, 0,54 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von 2-Chlor-11-cyclopropyl-5,11-dihydro-8-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (125 mg, 0,36 mmol), 4-Hydroxychinolin (78,9 mg, 0,54 mmol) und Ph₃P (143 mg, 0,54 mmol) in THF (1,8 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde 3 h bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde teilweise durch Flash-Chromatographie (EtOAc:MeOH; 95:5) gereinigt. Der Feststoff wurde weiter durch Umkehrphasen-HPLC (CombiPrep ADS-AQ 50 × 20 mm, 5 μ, 120 A, 5–100% MeCN + 0,10% THF/Wasser + 0,10% TFA in 25 min) gereinigt, um das Trifluoressigsäuresalz der Titelverbindung (17,7 g, 77% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 472/474 (MH)⁺.
BEISPIEL IV (Eintrag 4, Tabelle 1)
5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-5-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
a) 2,6-Difluor-3-nitropyridin
Zu einer Mischung von konzentrierter Schwefelsäure (600 ml) und rauchender Salpetersäure (90%, 400 ml) in einem Eisbad (Innentemperatur bei 5–10°C gehalten) wurde tropfenweise 2,6-Difluorpyridin (200 g, 1,74 mol) gegeben. Die sich ergebende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde langsam in 3 kg Eis gegossen und mit Et₂O (2 × 2 l) extrahiert. Die vereinten organischen Schichten wurden mit wässrigem 1,5 N NaOH (2 × 1 l) und dann mit wässrigem gesättigtem NaHCO₃ (400 ml) oder bis zu einem pH von etwa 8 bis 9 gewaschen. Die organischen Schichten wurden über MgSO₄ getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, bis ein konstantes Gewicht erhalten wurde (zur Entfernung von nicht umgesetztem 2,6-Difluorpyridin: 10–12%). Die Titelverbindung wurde als gelbe Flüssigkeit erhalten (207,3 g, 74% Ausbeute).
b) 2-(Ethylamino)-6-fluor-3-nitropyridin
Zu einer Lösung von 2,6-Difluor-3-nitropyridin (45,7 g, 285 mmol) in THF (500 ml) bei –40°C wurde tropfenweise ein Lösung von Ethylamin (25,7 g, 570 mmol) in THF (250 ml) gegeben. Nach 30 min wurde die Reaktionsmischung unter verminder tem Druck konzentriert und der Rückstand wurde in EtOAc gelöst. Die organische Phase wurde mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und konzentriert. Der sich ergebende gelbe Feststoff wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt (15% EtOAc in Hexan), um die Titelverbindung (43,2 g, 82% Ausbeute) als gelben Feststoff zu ergeben.
c) 3-Amino-2-(ethylamino)-6-fluorpyridin
Eine Lösung von 2-(Ethylamino)-6-fluor-3-nitropyridin (43,2 g, 230 mmol) in THF (1 l) wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Wasserstoff (1 atm) in Anwesenheit von 20% Pd(OH)₂/C (4,35 g) gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Diatomeenerde entfernt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, um die Titelverbindung (36,3 g, 25% Ausbeute) als schwarzen Feststoff zu ergeben.
d) 2-Chlor-N-{2-(ethylamino)-6-fluor-3-pyridinyl}-5-brom-3-pyridincarboxamid
Zu einer gekühlten Lösung (4°C) von 3-Amino-2-(ethylamino)-6-fluorpyridin (31,0 g, 200 mmol) in MeCN (160 ml) wurde festes NaHCO₃ (50,4 g, 600 mmol) gegeben. Nach 15 min wurde ein Lösung von 5-Brom-2-chlor-3-pyridincarbonylchlorid (1 Äquiv., 200 mmol) in MeCN (155 ml) gegeben. Nach 60 min bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung in Wasser (1,2 l) gegossen und 30 min gerührt. Der sich ergebende Feststoff wurde filtriert und unter vermindertem Druck bei 50°C über Nacht getrocknet. Die Titelverbindung (73,7 g, 99% Ausbeute) wurde als schwarzer Feststoff erhalten.
e) 8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-2-fluor-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Zu einer Lösung von dem 2-Chlor-N-{2-(ethylamino)-6-fluor-3-pyridinyl}-5-brom-3-pyridincarboxamid (73,5 g, 216 mmol) in Pyridin (435 ml) bei 50°C wurde tropfenweise eine 1 M Lösung von NaHMDS in THF (520 ml, 520 mmol) gegeben. Nach 10 min ließ man die Reaktion auf Raumtemperatur abkühlen und goß dann über Eiswasser (2 l). Der sich ergebende Feststoff wurde filtriert und mit Wasser und dann Hexan gespült. Der Feststoff wurde unter vermindertem Druck getrocknet, um die Titelverbindung (50,6 g, 69% Ausbeute) als dunkelgrünen Feststoff zu ergeben.
f) 8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-2-fluor-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]-diazepin-6-on
Zu einer Lösung des 8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-2-fluor-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (44 g, 130,5 mmol) in DMF (520 ml) wurde NaH (4,28 g, 178 mmol) gegeben und die Mischung wurde 30 min auf 50°C erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Mel (24,4 ml, 522 mmol) behandelt. Nach 1,5 h wurde die Reaktionsmischung über Eiswasser gegossen. Der Feststoff wurde filtriert, mit Wasser und dann Hexan gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, um die Titelverbindung (43,2 g, 94% Ausbeute) als dunkelgraunen Feststoff zu ergeben.
g) 5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-5-methyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Allyltributylzinn (32,0 ml, 103,4 mmol) und Pd(Ph₃P)₄ (5,43 g, 4,70 mmol) wurden zu einer entgasten (N₂ durch die Lösung für 45 min) Lösung von 8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-2-fluor-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (33,0 g, 94,0 mmol) in DMF (470 ml) gegeben. Zusätzliche Mengen an Pd(Ph₃)₄ (1,09 g, 0,94 mmol, zugegeben nach 1, 2, 3, 4, 5 h Reaktion) wurden zugegeben, um die Reaktion zu vervollständigen. Die Mischung wurde 6 h auf 90°C erwärmt. Die Mischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexanmischung:EtOAc, 8:2 bis 7:3) gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben (22,4 g, 76% Ausbeute).
h) 5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-8-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Ein Strom von ozonisiertem Sauerstoff wurde durch eine kalte (–78°C) Lösung von 5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-5-methyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (22,38 g, 71,6 mmol) in CH₂Cl₂ (100 ml) und MeOH (100 ml) für 3 h durchgeblubbert. Ein Strom von N₂ wurde als nächstes durch die Lösung für 15 min geblubbert und dann wurde festes NaBH₄ (5,05 g, 133 mmol) zur Lösung gegeben. Man ließ die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur aufwärmen. Nach 1 h wurde eine zusätzliche Portion NaBH₄ (1,62 g, 43,0 mmol) zur Reaktionsmischung gegeben. Nach einer zusätzlichen Stunde wurde wässriges gesättigtes NH₄Cl (150 ml) zugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 min gerührt. Die organischen Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt. Wasser (200 ml) wurde zugesetzt und die Mischung wurde mit CHCl₃ (3 × 300 ml) extrahiert. Die vereinten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc:CHCl₃, 4:1) gereinigt, um die Titelverbindung (19,7 g, 72% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben.
i) 5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-5-methyl-8-[2-(4-chinolinyloxy)ethyl]-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Diethylazodicarboxylat (DEAD) (14,3 ml, 91,0 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von 5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-8-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (19,2 g, 60,7 mmol), 4-Hydroxychinolin (13,2 g, 91,0 mmol) und Ph₃P (23,9 g, 91,0 mmol) in THF (300 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc:MeOH; 95:5) gereinigt, um die Titelverbindung (17,9 g, 67% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 444 (MH)⁺.
BEISPIEL V (Eintrag 1, Tabelle 1)
2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-4-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
a) 2-Chlor-N-(2,6-dichlor-4-methyl-3-pyridinyl)-3-pyridincarboxamid
NaHCO₃ (21,72 g, 258,6 mmol) wurde zu einer Lösung von 3-Amino-2,6-dichlor-4-methylpyridin (41,61 g, 235,1 mmol; hergestellt wie von K. G. Grozinger et al., J. Heterocyclic Chem. 1995, 32, 259–263 beschrieben) in MeCN (350 ml) gegeben und die sich ergebende Suspension wurde 15 min gerührt. Eine Lösung von 2-Chlornicotinylchlorid (43,44 g, 246,8 mmol) in MeCN (500 ml) wurde dann über 30 min eingeleitet. Die sich ergebende Suspension wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 24 h wurde festgestellt, dass die Lösung sauer war und eine zusätzliche Menge an NaHCO₃ (3,00 g, 35,7 mmol) wurde zugesetzt. Die Suspension wurde dann bei Raumtemperatur für 2 zusätzliche Tage gerührt. Die Mischung wurde dann in eine Mischung von Wasser (2 l) und Eis (200 g) gegossen und 20 min gerührt. Der Feststoff wurde filtriert und mit Wasser (500 ml) gewaschen und der sich ergebende Feststoff wurde dann über P₂O₅ unter vermindertem Druck getrocknet, um die Titelverbindung (62,55 g, 84% Ausbeute) als weißes Pulver zu ergeben.
b) N-(2,6-Dichlor-4-methyl-3-pyridinyl)-2-(ethylamino)-3-pyridincarboxamid
Eine Lösung von 2-Chlor-N-(2,6-dichlor-4-methyl-3-pyridinyl)-3-pyridincarboxamid (63,17 g, 194,0 mmol) und Ethylamin (28,0 g, 583 mmol) in Xylolmischung (250 ml) wurde bei 120 bis 125°C in einem Stahlautoklaven für 7 h gerührt. Die sich ergebende Suspension wurde in Wasser (1 l) gegossen, für 15 min gerührt und filtriert. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst und mit Wasser (3×) und Salzlösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das Filtrat wurde mit EtOAc extrahiert und die vereinten organischen Extrakte wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Die beiden Fraktionen wurden dann vereint und überschüssige Xylolmischung wurde durch Codestillation mit Benzol entfernt, um die Titelverbindung (61,98 g, pinkfarbener Feststoff) als Hauptkomponente einer Mischung von Verbindungen zu ergeben. Das Material wurde an dieser Stelle nicht gereinigt und wurde direkt in der nachfolgenden Reaktion verwendet.
c) 5-Brom-N-(2,6-dichlor-4-methyl-3-pyridinyl)-2-(ethylamino)-3-pyridincarboxamid
Festes KOAc (22,2 g, 229 mmol) wurde zu einer Lösung von rohem N-(2,6-dichlor-4-methyl-3-pyridinyl)-2-(ethylamino)-3-pyridincarboxamid (61,98 g, < 190 mmol) in AcOH (600 ml) gegeben. Eine Lösung von Br₂ (9,7 ml, 191 mmol) wurde dann über 30 min zugesetzt. Nach 30-minütigem Rühren wurden zusätzliche Mengen an KOAc und Br₂ eingeleitet, bis die TLC anzeigte, dass kein Ausgangsmaterial verblieben ist (insgesamt 11,2 g KOAc und 5,91 ml Br₂). Die Lösung wurde dann in Wasser (2 l) gegeben und 20 min gerührt. Der Feststoff wurde durch Filtration entfernt und dann in Et₂O (1 l) gelöst. Die etherische Lösung wurde mit Wasser (3×), wässrigem gesättigtem NaHCO₃ und Salzlösung gewaschen und dann getrocknet (MgSO₄), um eine Mischung zu ergeben, die als Hauptkomponente die Titelverbindung enthielt (77,7 g, gelber Schaum). Das Material wurde direkt in der anschließenden Reaktion verwendet.
d) 8-Brom-2-chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Eine Lösung von rohem 5-Brom-N-(2,6-dichlor-4-methyl-3-pyridinyl)-2-(ethylamino)-3-pyridincarboxamid (77,7 g, mmol) in wasserfreiem Pyridin (1,0 l) wurde auf 50°C erwärmt. Eine 1 M Lösung von NaHMDS in THF (418 ml, 418 mmol) wurde dann tropfenweise zugegeben und der Rührvorgang wurde für weitere 15 min fortge setzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde Wasser (50 ml) zugegeben und die Mischung an einem Rotationsverdampfer auf 2/3 des Volumens konzentriert. Der Rückstand wurde dann in Wasser (3 l) gegeben. Filtration ergab die Titelverbindung (23,44 g) als gelbbraunen Feststoff. Das Filtrat wurde mit EtOAc (3×) extrahiert und die vereinten Extrakte wurden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, dann getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan:EtOAc, 9:1 oder CHCl₃) gereinigt, um eine zusätzliche Menge der Titelverbindung zu ergeben (14,06 g, insgesamt 37,50 g, 50% Ausbeute für 3 Schritte).
e) 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-4-methyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Eine Lösung von 8-Brom-2-chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (12,6 g, 34,3 mmol) in DMF (25,0 ml) wurde unter vermindertem Druck für 20 min entgast. Pd(PPh₃)₄ (775 mg, 0,7 mmol) wurde dann zugesetzt und anschließend Allyltributylzinn (12,5 ml, 41,1 mmol). Nach Entgasung unter vermindertem Druck für 10 min wurde die Mischung auf 100°C für 7 h erwärmt. Die Mischung wurde dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan:EtOAc, 19:1) gereinigt, um die Titelverbindung (8,04 g, 71% Ausbeute) als gelben Feststoff zu ergeben.
f) 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Ein Strom von O₃ wurde in eine kalte (–78°C) Lösung von 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-4-methyl-8-(2-propenyl)-6GH-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (8,04 g, 24,4 mmol) und Sudan III in CH₂Cl₂ (120 ml) und MeOH (120 ml) eingeleitet. Als die pinkfarbene Lösung braun wurde, wurde O₂ durch die Lösung für 10 min durchgeblubbert. NaBH₄ (1,12 g, 29,4 mmol) wurde dann zugegeben und man ließ die Lösung auf Raumtemperatur aufwärmen. Nach 30 min wurde eine zusätzliche Menge NaBH₄ (500 mg) zugegeben. Nach 1 h wurde dann wässriges gesättigtes NH₄Cl zugesetzt und die Mischung 20 min gerührt. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert und mit CH₂Cl₂ (3×) extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash- Chromatographie (CHCl₃:EtOH, 97:3) gereinigt, um die Titelverbindung (6,01 g, 74% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben.
g) 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-4-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Diethylazodicarboxylat (DEAD) (83 μl, 0,53 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (125 mg, 0,38 mmol), 4-Hydroxychinolin (76,3 mg, 0,53 mmol) und Ph₃P (138 mg, 0,53 mmol) in THF (2,5 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 3 h gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in EtOAc (60 ml) gelöst und die Lösung wurde nacheinander mit 1 N wässrigem NaOH (3 × 10 ml) und Salzlösung (15 ml) gewaschen, dann getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc:MeOH, 9:1) gereinigt, und die Titelverbindung (52 mg, 30% Ausbeute) als weißen Feststoff zu erhalten: MS (ESI) m/z 460/462 (MH)⁺.
BEISPIEL VI (Eintrag 7, Tabelle 1)
5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-4-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2;3'-e][1,4]diazepin-6-on
a) 8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-2-{{(4-methoxyphenyl)methyl}amino}-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
8-Brom-2-chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (2,50 g, 6,80 mmol) wurden in Dioxan (10 ml) in einer Glasdruckflasche gelöst und 4-Methoxybenzylamin (4,0 ml, 30,6 mmol) wurde zur Lösung gegeben. Die Mischung wurde 5 Tage auf 170°C erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in EtOAc aufgenommen und mit 10% wässriger NH₄Cl gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, um ein braunes Öl zu ergeben, das über Silicagel (Hexan:EtOAc, 4:1) chromatographiert wurde. Die Titelverbindung wurde als gelber Feststoff erhalten (1,35 g, 42% Ausbeute).
b) 2-Amino-8-brom-5,11-dihydro-11-ethyl-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-2-{{(4-methoxyphenyl)methyl}amino}-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e]-[1,4]diazepin-6-on (6,52 g, 18,7 mmol) wurde in Trifluoressigsäure (100 ml) gelöst und die Lösung wurde mit einem Magneten bei Raumtemperatur für 18 h gerührt. Trifluoressigsäure wurde unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand wurde in eine Mischung gegossen, die Wasser (450 ml), konzentriertes NH₄OH (50 ml) und EtOAc (400 ml) enthielt. Die Mischung wurde mit einem Magneten 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Die organische Phase wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Der gelbe Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen, unter vermindertem Druck getrocknet, um 7,51 g eines gelben Feststoffs zu ergeben, der in Et₂O trituriert wurde, um die Titelverbindung (5,12 g, 105% Ausbeute) als gelben Feststoff zu ergeben.
c) 8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-2-fluor-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Eine Plastikflasche wurde mit 2-Amino-8-brom-5,11-dihydro-11-ethyl-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e]-[1,4]diazepin-6-on (5,10 g, 14,6 mmol) gefüllt. HF·Pyridin (100 g) wurde zugegeben und die sich ergebende Suspension wurde auf 0°C gekühlt. Natriumnitrit (1,12 g, 16,1 mmol) wurde in mehreren Portionen über 30 min zugegeben, um eine purpurfarbene Lösung zu bilden. Die Mischung wurde dann 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf Eis und 6 N NaOH gegossen. Die beigefarbene Suspension wurde mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereint, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde trituriert mit Et₂O/Hexan, um die Titelverbindung zu ergeben (4,30 g, 84% Ausbeute).
d) 5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-4-methyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Allyltributylzinn (7,77 ml, 25,1 mmol) und Pd(Ph₃P)₄ (1,32 g, 1,14 mmol) wurden zu einer entgasten (N₂ durch Lösung für 30 min) Lösung von 8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-2-fluor-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e]-[1,4]diazepin-6-on (8,0 g, 22,8 mmol) in DMF (114 ml) gegeben. Die Mischung wurde 3 h auf 90°C erwärmt. Die Mischung wurde in Wasser (250 ml) gegossen und mit EtOAc (4 × 250 ml) extrahiert. Die vereinten organischen Schichten wurden mit 20%igem wässrigem NH₄OH (250 ml) und Salzlösung (250 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexanmischung:EtOAc, 4:1 bis 1:1) gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben (3,16 g, 51% Ausbeute).
e) 5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-8-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Ein Strom von ozonisiertem Sauerstoff wurde durch eine kalte (–78°C) Lösung von 5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-4-methyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (3,16 g, 10,1 mmol) in CH₂Cl₂ (25 ml) und MeOH (25 ml) für 45 min durchgeblubbert. Ein Strom von N₂ wurde als nächstes durch die Lösung für 15 min geblubbert und dann wurde festes NaBH₄ (669 mg, 17,1 mmol) zur Lösung gegeben. Man ließ die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur aufwärmen. Nach 2 h wurde wässriges gesättigtes NH₄Cl (50 ml) zugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 min gerührt. Die organischen Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt. Die restliche wässrige Lösung wurde mit CHCl₃ (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc:CHCl₃, 1:1) gereinigt, um die Titelverbindung (2,40 g, 75% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben.
f) 5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-4-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) (117 μl, 0,59 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von 5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-8-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e]-[1,4]diazepin-6-on (125 mg, 0,40 mmol), 4-Hydroxychinolin (86,0 mg, 0,59 mmol) und Ph₃P (156 mg, 0,59 mmol) in THF (1,9 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 3 h gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in EtOAc (40 ml) gelöst und die Lösung wurde nacheinander mit 3 N wässrigem NaOH (3 × 20 ml), wässrigem gesättigtem NH₄Cl (15 ml) und Salzlösung (15 ml) gewaschen, dann getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde teilweise durch Flash-Chromatographie (EtOAc:MeOH; 95:5) gereinigt. Der Feststoff wurde weiter durch Umkehrphasen-HPLC (CombiPrep ADS-AQ 50 × 20 mm, 5 μ, 120 A, 5–100% MeCN + 0,10% TFA/Wasser + 0,10% TFA in 25 min) gereinigt, um das Trifluoressigsäuresalz der Titelverbindung (106 mg, 48% Ausbeute) als weißen Feststoff zu erhalten: MS (ESI) m/z 444 (MH)⁺.
BEISPIEL VII (Eintrag 5, Tabelle 1)
11-(Cyclopropyl)-5,11-dihydro-2-fluor-4-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)-ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b'2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
a) 11-Cyclopropyl-5,11-dihydro-2-fluor-8-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Die Titelverbindung wurde aus 8-Brom-2-chlor-11-cyclopropyl-5,11-dihydro-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on unter Verwendung eines Verfahrens hergestellt, das dem für das entsprechende 11-Ethyl-Analogon beschriebene ähnlich war, das in Beispiel VI beschrieben ist.
b) 11-Cyclopropyl-5,11-dihydro-2-fluor-4-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)-ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1m4]diazepin-6-on
Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) (131 μl, 0,66 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von 11-(Cyclopropyl)-5,11-dihydro-2-fluor-8-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (140 mg, 0,44 mmol), 4-Hydroxychinolin (96,4 mg, 0,66 mmol) und Ph₃P (124 mg, 0,66 mmol) in THF (2,2 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 3 h gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in EtOAc (60 ml) gelöst und die Lösung wurde nacheinander mit 3 N wässrigem NaOH (3 × 20 ml), wässrigem gesättigtem NH₄Cl (20 ml) und Salzlösung (20 ml) gewaschen, dann getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde teilweise durch Flash-Chromatographie (EtOAc:MeOH; 95:5) gereinigt. Der Feststoff wurde weiter durch Umkehrphasen-HPLC (CombiPrep ADS-AQ 50 × 20 mm, 5 μ, 120 A, 5–100% MeCN + 0,10% TFA/Wasser + 0,10% TFA in 25 min) gereinigt, um das Trifluoressigsäuresalz der Titelverbindung (104 mg, 43% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 456 (MN)⁺.
BEISPIEL VIII (Eintrag 8, Tabelle 1)
5,11-Dihydro-11-ethyl-4-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)-ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
a) 5,11-Dihydro-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Eine Mischung von 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (168 mg, 0,51 mmol), Ammoniumformiat (318 mg, 5,1 mmol) und 10% Pd/C (50 mg) in EtOH (6 ml) wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 24 h wurden zusätzliche Mengen an Ammoniumformiat (200 mg, mmol) und 10% Pd/C (50 mg) zugegeben. Nach weiteren 24 h Rühren wurde die Reaktion unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in CHCl₃ gelöst und die Mischung wurde mit wässrigem gesättigtem NaHCO₃ gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, um die Titelverbindung (122 mg, 81%) als gelbes Öl zu ergeben.
b) 5,11-Dihydro-11-ethyl-4-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) (42 μl, 0,21 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von 5,11-Dihydro-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-6H-dipyrido(3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (42,0 mg, 0,14 mmol), 4-Hydroxychinolin (31 mg, 0,21 mmol) und Ph₃P (55,4 mg, 0,21 mmol) in THF (0,7 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 h gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in EtOAc (60 ml) gelöst und die Lösung wurde nacheinander mit 3 N wässrigem NaOH (3 × 20 ml), wässrigem gesättigtem NH₄Cl (20 ml) und Salzlösung (20 ml) gewaschen, dann getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde teilweise durch Flash-Chromatographie (EtOAc:MeOH; 95:5) gereinigt. Der Feststoff wurde weiter durch Umkehrphasen-HPLC (CombiPrep ADS-AQ 50 × 20 mm, 5 μ, 120 A, 5–100% MeCN + 0,10% TFE/Wasser + 0,10% TFA in 25 min) gereinigt, um das Trifluoressigsäuresalz der Titelverbindung (15,2 mg, 19% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 426 (MH)⁺.
BEISPIEL IX (Eintrag 3, Tabelle 1)
11-(Cyclopropyl)-5,11-dihydro-4-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)-ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
a) 5-Brom-2-chlor-N-(2,6-dichlor-4-methyl-3-pyridinyl)-3-pyridincarboxamid
3-Amino-2,6-dichlor-4-methylpyridin (0,51 g, 2,85 mmol) wurde in Toluol (35 ml) gelöst und Pyridin (0,27 ml, 3,28 mmol) wurde zugegeben. 5-Brom-2-chlor-3-pyridincarbonylchlorid (0,80 g, 3,14 mmol) wurde dann tropfenweise für 30 min zugegeben. Die sich ergebende Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 h gerührt, mit Wasser verdünnt und mit Toluol (2×) extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Das sich ergebende dicke Öl wurde mit CH₂Cl₂ trituriert und der weiße Feststoff durch Saugfiltration gesammelt, um die Titelverbindung (0,41 g, 36% Ausbeute) zu ergeben.
b) 5-Brom-2-(cyclopropylamino)-N-(2,6-dichlor-4-methyl-3-pyridinyl)-3-pyridincarboxamid
Eine Lösung von 5-Brom-2-chlor-N-(2,6-dichlor-4-methyl-4-pyridinyl)-3-pyridincarboxamid (3,00 g, 7,61 mmol) und Cyclopropylamin (2,11 ml, 30,5 mmol) in Xylolmischung wurde in einem verschlossenen Rohr bei 120°C 24 h erwärmt. Die Reaktion wurde auf 0°C gekühlt, mit Wasser verdünnt und mit EtOAc (2×) extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der sich ergebende Rückstand wurde durch Trituration (Et₂O:Hexan, 3:1) gereinigt, um die Titelverbindung (2,35 g, 75% Ausbeute) als hellgelben Feststoff zu ergeben.
c) 8-Brom-2-chlor-11-cyclopropyl-5,11-dihydro-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Eine Lösung von 5-Brom-2-(cyclopropylamino)-N-(2,6-dichlor-4-methyl-3-pyridinyl)-3-pyridincarboxamid (105 mg, 0,254 mmol) in Pyridin (3,0 ml) wurde auf 50°C erwärmt, wobei eine 1 M Lösung von NaHMDS in THF (0,53 ml, 0,53 mmol) zugegeben wurde. Die sich ergebende Lösung wurde 3 h bei 50°C gerührt. Die Reaktion wurde mit wässrigem gesättigtem NH₄Cl gequencht, mit Wasser verdünnt und mit EtOAc (3×) extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der sich ergebende Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan:EtOAc, 7:3) gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben (32 mg, 33% Ausbeute).
d) 2-Chlor-11-cyclopropyl-5,11-dihydro-4-methyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Eine Lösung von 8-Brom-2-chlor-11-cyclopropyl-5,11-dihydro-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (0,046 g, 0,122 mmol) in DMF (2,0 ml) wurde durch Spülen mit N₂ für 10 min entgast. Pd(PPh₃)₄ (2,8 mg, 0,003 mmol) und Allyl tributylzinn (0,45 ml, 0,146 mmol) wurden zugegeben und die sich ergebende Lösung wurde 2,5 h auf 90°C erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt und mit CH₂Cl₂ (3×) und EtOAc (2×) extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der sich ergebende Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan zu Hexan:EtOAc, 7:3) gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben (0,033 g, 80% Ausbeute).
e) 2-Chlor-11-cyclopropyl-5,11-dihydro-8-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Eine kalte (–78°C) Lösung von 2-Chlor-11-cyclopropyl-5,11-dihydro-4-methyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (0,82 g, 2,43 mmol) in CH₂Cl₂ (7,5 ml) und MeOH (7,5 ml) wurde mit O₃ gesättigt, bis die Lösung hellblau wurde. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei –78°C gelassen, dann wurde NaBH₄ (0,23 g, 9,71 mmol) zugegeben und man ließ die Mischung langsam über 2 h auf Raumtemperatur aufwärmen. Die Reaktion wurde mit wässriger 10% Citronensäurelösung gequencht und mit EtOAc (3×) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereint, mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der sich ergebende Rückstand wurde über Flash-Chromatographie (MeOH:CH₂Cl₂, 2 bis 10%) gereinigt, um die Titelverbindung (0,41 g, 60% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben.
f) 11-Cyclopropyl-5,11-dihydro-8-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Die Titelverbindung wurde nach einem ähnlichen Verfahren wie für das 11-Ethyl-Analogon in Beispiel VIIIa beschrieben hergestellt.
g) 11-Cyclopropyl-5,11-dihydro-4-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) (167 μl, 0,85 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von 11-(Cyclopropyl)-5,11-dihydro-8-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (175 mg, 0,57 mmol), 4-Hydroxychinolin (123 mg, 0,85 mmol) und Ph₃P (223 mg, 0,85 mmol) in THF (2,8 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 3 h gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in EtOAc (60 ml) gelöst und die Lösung wurde nacheinander mit 3 N wässrigem NaOH (3 × 20 ml), wässrigem gesättigtem NH₄Cl (20 ml) und Salzlösung (20 ml) gewaschen, dann getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc:MeOH; 95:5) gereinigt, um die Titelverbindung (74 mg, 30% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 438 (MH)⁺.
BEISPIEL X (Eintrag 21, Tabelle 1)
5,11-Dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyloxy}ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Festes mCPBA (80–85%, m-Chlorperbenzoesäure) (2,21 g, 10,2 mmol) wurde zu einer Lösung von 5,11-Dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (2,56 g, 6,02 mmol) in CH₂Cl₂ (30 ml) und THF (30 ml) bei Raumtemperatur gegeben (Anm.: die Reaktion kann in CH₂Cl₂ allein durchgeführt werden). Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 h gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in CHCl₃ (400 ml) gelöst, die Lösung wurde nacheinander mit wässrigem 10% Na₂S₂O₃ (3 × 75 ml), wässrigem gesättigtem NaHCO₃ (3 × 75 ml) und Salzlösung (75 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt (CHCl₃:MeOH, 9:1), um die Titelverbindung (2,01 g, 76% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 442 (MH)⁺.
BEISPIEL XI (Eintrag 17, Tabelle 1)
2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Mit einer identischen Prozedur wie in Beispiel X ergab 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (2,70 g, 5,87 mmol) die Titelverbindung (2,05 g, 73% Ausbeute) als weißen Feststoff: MS (ESI) m/z 476/478 (MH)⁺.
BEISPIEL XII (Eintrag 11, Tabelle 1)
5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-5-methyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Festes mCPBA (457 mg, 2,12 mmol) wurde zu einer Lösung von 5,11-Dihydro-2-fluor-11-ethyl-5-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'- e][1,4]diazepin-6-on (470 mg, 1,06 mmol) in CH₂Cl₂ (10 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 13 h gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in CHCl₃ (75 ml) gelöst, die Lösung wurde nacheinander mit wässrigem 10% Na₂S₂O₃ (3 × 25 ml), wässrigem gesättigtem NaHCO₃ (3 × 25 ml) und Salzlösung (25 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (CHCl₃:MeON, 19:1 bis 9:1) gereinigt, um die Titelverbindung (250 mg, 51% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 460 (MH)⁺.
BEISPIEL XIII (Eintrag 10, Tabelle 1)
2-Chlor-11-cyclopropyl-5,11-dihydro-5-methyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Festes mCPBA (177 mg, 0,82 mmol) wurde zu einer Lösung von 2-Chlor-11-chlorpropyl-5,11-dihydro-5-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (143 mg, 0,30 mmol) in CH₂Cl₂ (3 ml) und THF (3 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 14 h gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in EtOAc (50 ml) gelöst, die Lösung wurde nacheinander mit wässrigem 10% Na₂S₂O₃ (3 × 10 ml), wässrigem gesättigtem NaHCO₃ (3 × 10 ml) und Salzlösung (10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde teilweise durch Flash-Chromatographie (EtOAc:MeOH, 95:5 bis CH₂Cl₂:MeOH, 9:1) gereinigt. Die unreine Verbindung wurde weiter durch Umkehrphasen-HPLC (CombiPrep ADS-AQ 50 × 20 mm, 5 μ, 120 A, 5–100% MeCN + 0,10% TFA/Wasser + 0,10% TFA in 25 min) gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden mit wässrigem gesättigtem NaHCO₃ behandelt, mit EtOAc extrahiert und die Lösung wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, um die Titelverbindung (28,3 mg, 19%) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 488/490 (MH)⁺.
BEISPIEL XIV (Eintrag 14, Tabelle 1)
2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-4-methyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Festes mCPBA (46,9 mg, 0,22 mmol) wurde zu einer Lösung von 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (50,0 mg, 0,11 mmol) in CH₂Cl₂ (2,2 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 h gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in EtOAc (50 ml) gelöst, die Lösung wurde nacheinander mit wässrigem 10% Na₂S₂O₃ (3 × 10 ml), wässrigem gesättigtem NaHCO₃ (3 × 10 ml) und Salzlösung (10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt (CombiPrep ADS-AQ 50 × 20 mm, 5 μ, 120 A, 5–100% MeCN + 0,10% TFA/Wasser + 0,10% TFA in 25 min). Die reinen Fraktionen wurden mit wässrigem gesättigtem NaHCO₃ behandelt, mit EtOAc extrahiert und die Lösung wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, um die Titelverbindung (32,5 mg, 63%) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 488/490 (MH)⁺.
BEISPIEL XV (Eintrag 9, Tabelle 1)
5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-4-methyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinoliny)oxy}ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Unter Verwendung einer ähnlichen Prozedur wie in Beispiel XIV ergab 5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-4-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (125 mg, 0,28 mmol) die Titelverbindung (40 mg, 31%) als weißen Feststoff (MS (ESI) m/z 460 (MH)⁺.
BEISPIEL XVI (Eintrag 12, Tabelle 1)
5,11-Dihydro-11-ethyl-4-methyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e]diazepin-6-on
Festes mCPBA (163 mg, 0,75 mmol) wurde zu einer Lösung von 5,11-Dihydro-11-ethyl-4-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (144 mg, 0,34 mmol) in CH₂Cl₂ (7,5 ml) gegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 2 h gerührt. Die Mischung wurde mit CH₂Cl₂ (125 ml) verdünnt, aufeinanderfolgend mit wässrigem 10% Na₂S₂O₃ (2 × 25 ml), wässrigem gesättigtem NaHCO₃ (2 × 25 ml) und Kochsalzlösung (25 ml) gewaschen, dann getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (CH₂Cl₂:MeOH, 10:1) gereinigt, um die Titelverbindung (102 mg, 68% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 442 (MH).
BEISPIEL XVII (Eintrag 15, Tabelle 1)
11-Cyclopropyl-5,11-dihydro-4-methyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}ethyl}-6H-dipydrio[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Unter Verwendung einer ähnlichen Prozedur wie in Beispiel XIV ergab 11-Cyclopropyl-5,11-dihydro-4-methyl-8-{2-(4-chinolinoxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (37,1 mg, 0,085 mmol) die Titelverbindung (35 mg, 91%) als weißen Feststoff: MS (ESI) m/z 454 (MH)⁺.
BEISPIEL XVIII (Eintrag 25, Tabelle 1)
2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-4-methyl-8{2-(5-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Diethylazodicarboxylat (DEAD) (77 μl, 0,49 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (125 mg, 0,38 mmol), 5-Hydroxychinolin (70,9 mg, 0,49 mmol) und Ph₃P (128 mg, 0,49 mmol) in THF (2,5 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Nach 1,5 h wurden zusätzliche Mengen an DEAD (35 μl, 0,22 mmol) und PPh₃ (59 mg, 0,22 mmol) zur Mischung gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 h gerührt, dann mit EtOAc (50 ml) verdünnt und die Lösung wurde nacheinander mit wässrigem 1 N NaOH (4 × 10 ml) und Salzlösung (15 ml) gewaschen, dann getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (CH₂Cl₂:Aceton, 85:15) gereinigt. Der sich ergebende Feststoff wurde trituriert mit Et₂O, um die Titelverbindung (38 mg, 22% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 460/462 (MH)⁺.
BEISPIEL XIX (Eintrag 20, Tabelle 1)
2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-{2-{(1-oxido-5-chinolinyl)oxy}ethyl}-6H-dipydrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Diethylazodicarboxylat (DEAD) (160 μl, 1,01 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (225 mg, 0,68 mmol), 5-Hydroxychinolin (147 mg, 1,01 mmol) und Ph₃P (266 mg, 1,01 mmol) in THF (3,4 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde 3 h bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde teilweise durch Flash-Chromatographie (EtOAc:MeOH; 95:5) gereinigt. Die Fraktionen enthaltend das 5-Chinolinyloxy-Derivat wurden konzentriert, in CH₂Cl₂ (2 ml) und THF (5 ml) gelöst und mit mCPBA (80%, 248 mg, 1,15 mmol) bei Raumtemperatur behandelt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 2,5 h gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in EtOAc (50 ml) gelöst, nacheinander mit wässrigem 10% Na₂SO₂O₃ (3 × 10 ml), wässrigem gesättigtem NaHCO₃ (3 × 10 ml) und Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen, dann getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc:MeOH, 95:5 bis CH₂Cl₂:MeOH, 9:1) gereinigt, um die Titelverbindung (113 mg, 35% Ausbeute für 2 Schritte) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 476/478 (MH)⁺.
BEISPIEL XX (Eintrag 18, Tabelle 1)
5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-5-methyl-8-{2-{(1-oxido-5-chinolinyl)-oxy}ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Unter Verwendung einer identischen Prozedur wie in Beispiel XIX ergab 5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-8-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (267 mg, 0,84 mmol) die Titelverbindung (204 mg, 52% Ausbeute für 2 Schritte) als weißen Feststoff: MS (ESI) m/z 460 (MH)⁺.
BEISPIEL XXI (Eintrag 19, Tabelle 1)
2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-4-methyl-8-{2-{(1-oxido-5-chinolinyl)oxy}ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Unter Verwendung einer ähnlichen Prozedur wie in Beispiel XIX, aber unter Verwendung von Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) anstelle von Diethylazodicarboxylat, ergab 2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (223 mg, 0,67 mmol) die Titelverbindung (43,4 mg, 14% Ausbeute für 2 Schritte) als weißen Feststoff: MS (ESI) m/z 476/478 (MH)⁺.
BEISPIEL XXII (Eintrag 23, Tabelle 1)
5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-4-methyl-8-{2-{(1-oxido-5-chinolinyl)oxy}ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Unter Verwendung einer ähnlichen Prozedur wie in Beispiel XXI ergab 5,11-Dihydro-11-ethyl-2-fluor-8-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (250 mg, 0,79 mmol) die Titelverbindung (64,7 mg, 18% Ausbeute für 2 Schritte) als weißen Feststoff: MS (ESI) m/z 460 (MH)⁺.
BEISPIEL XXIII, Eintrag 22, Tabelle 1
2-Chlor-5,11-dihydro-11-ethyl-8-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}ethyl}-6H-dipydrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on

MS (ESI) m/z 462/464 (MH)⁺.

BEISPIEL XXIV, Eintrag 26, Tabelle 1
5,11-Dihydro-5,11-diethyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on

MS (ESI) m/z 440 (MH)⁺.

BEISPIEL XXV, Eintrag 27, Tabelle 1
5,11-Dihydro-5,11-diethyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on

MS (ESI) m/z 456 (MH)⁺.

BEISPIEL XXVI (Eintrag 28, Tabelle 1)
2,5-Dimethyl-5,11-dihydro-11-ethyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
a) 5-Brom-2-chlor-N-(6-chlor-2-methyl-3-pyridinyl)-3-pyridincarboxamid
NaHCO₃ (3,9 g, 46,4 mmol) wurde zu einer Lösung von 3-Amino-2-chlor-6-methylpyridin (2,2 g, 15,4 mmol; hergestellt wie von K. G. Grozinger et al., J. Heterocyclic Chem. 1995, 32, 259–263 beschrieben) in MeCN (50 ml) gegeben. Die sich ergebende Suspension wurde 15 min gerührt und eine Lösung von rohem 5-Brom-2-chlor-3-pyridincarbonylchlorid (hergestellt aus 5-Brom-2-hydroxy-3-pyridincarbonsäure und SOCl₂ [wie von T. W. Gero et al. in Synth. Commun. 1989, 19, 553–559 beschrieben (hier unter Bezugnahme aufgenommen), aber unter Weglassung der wässrigen Aufarbeitung] (4 g) in MeCN (10 ml) wurde über 30 min eingeleitet. Die sich ergebende Suspension wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 24 h wurde die Mischung in eine Mischung von Wasser (100 ml) und Eis (10 g) gegeben und 20 min gerührt. Die Suspension wurde filtriert und der sich ergebende Feststoff mit Wasser (50 ml) und Hexan (25 ml) gewaschen, dann über P₂O₅ unter vermindertem Druck getrocknet, um die Titelverbindung (1,8 g, 31% Ausbeute) als weißes Pulver zu ergeben.
b) 5-Brom-N-(2-chlor-6-methyl-3-pyridinyl)-2-(ethylamino)-3-pyridincarboxamid
Eine Lösung von 5-Brom-2-chlor-N-(2-chlor-6-methyl-3-pyridinyl)-3-pyridincarboxamid (1,7 g, 4,8 mmol) und Ethylamin (2 M in THF, 10,5 mmol, 5,2 ml) in THF (5 ml) wurde bei 90 bis 95°C in einem Stahlautoklaven 16 h gerührt. Die sich ergebende Mischung wurde in Wasser (100 ml) gegossen, 15 min gerührt und filtriert. Der Feststoff wurde mit Wasser und anschließend Hexan gewaschen, um die Titelverbindung als gelben Feststoff zu ergeben (1,58 g, 89% Ausbeute).
c) 8-Brom-5,11-dihydro-2,5-dimethyl-11-ethyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Eine Lösung von rohem 5-Brom-N-(2-dichlor-6-methyl-3-pyridinyl)-2-(ethylamino)-3-pyridincarboxamid (0,7 g, 1,8 mmol) in wasserfreiem Pyridin (18 ml) wurde auf 50°C erwärmt. Eine 1 M Lösung von NaHMDS in THF (7,2 ml, 7,2 mmol) wurde dann tropfenweise zugegeben und der Rührvorgang wurde weitere 3 h fortgesetzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde Methyliodid (0,6 ml, 9 mmol) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht gerührt. Wasser (25 ml) wurde zugegeben und die Mischung wurde mit EtOAc (3×) extrahiert und die vereinten Extrakte wurden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, dann getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan:EtOAc, 8:2) gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben (259 mg, 41% Ausbeute).
d) 5,11-Dihydro-2,5-dimethyl-11-ethyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Eine Lösung von 8-Brom-5,11-dihydro-2,5-dimethyl-11-ethyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (258 mg, 0,7 mmol) in DMF (7,4 ml) wurde unter vermindertem Druck für 20 min entgast. Pd(PPh₃)₄ (43 mg, 0,04 mmol) wurde dann zugegeben, gefolgt von Allyltributylzinn (0,3 ml, 0,85 mmol). Nach Entgasen unter vermindertem Druck für 10 min wurde die Mischung auf 100°C für 1,5 h erwärmt. Die Mischung wurde dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan:EtOAc, 8:2) gereingt, um die Titelverbindung (184 mg, 98% Ausbeute) als gelben Feststoff zu ergeben.
e) 5,11-Dihydro-2,5-dimethyl-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Ein O₃-Strom wurde in eine kalte (–78°C) Lösung von 5,11-Dihydro-2,5-dimethyl-11-ethyl-8-(2-propenyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (187 mg, 0,6 mmol) und Sudan III in CH₂Cl₂ (3 ml) und MeOH (3 ml) eingeleitet. Als die pinkfarbene Lösung braun wurde, wurde O₂ durch die Lösung für 10 min geblubbert. NaBH₄ (57 mg, 1,52 mmol) wurde dann zugegeben und man ließ die Lösung auf Raumtemperatur aufwärmen. Nach 30 min wurde eine zusätzliche Menge NaBH₄ (20 mg) zugesetzt. Nach 2 h wurde dann wässriges gesättigtes NH₄Cl zugegeben und die Mischung 20 min gerührt. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert und mit CH₂Cl₂ (3×) extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc:Hexan, 6:4) gereinigt, um die Titelverbindung (111 mg, 58% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben.
f) 2,5-Dimethyl-5,11-dihydro-11-ethyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Diethylazodicarboxylat (DEAD) (139 μl, 0,88 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von 5,11-Dihydro-2,5-dimethyl-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (110 mg, 0,35 mmol), 4-Hydroxychinolin (128 mg, 0,88 mmol) und Ph₃P (231 mg, 0,88 mmol) in THF (3,5 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 16 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in EtOAc (60 ml) verdünnt und die Lösung wurde nacheinander mit 1 N wässrigem NaOH (3 × 10 ml) und Kochsalzlösung (15 ml) gewaschen, dann getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Die Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc dann EtOAc:MeOH, 9,5:0,5) gereinigt, um die Titelverbindung (57 mg, 37% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z 440 (MH)⁺.
g) 5,11-Dihydro-2,5-dimethyl-11-ethyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Festes mCPBA (80–85%, m-Chlorperbenzoesäure) (60 mg, 0,28 mmol) wurde zu einer Lösung von 5,11-Dihydro-2,5-dimethyl-11-ethyl-8-{2-(4-chinolinyloxy) ethyl}-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (55 mg, 0,13 mmol) in CH₂Cl₂ (1,3 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2,5 h gerührt und dann mit CH₂Cl₂ verdünnt. Die sich ergebende Lösung wurde nacheinander mit wässrigem 10% Na₂S₂O₃, wässrigem, gesättigtem NaHCO₃ und Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (MeOH/EtOAc, 2% bis 5%) gereinigt, um die Titelverbindung (59 mg, 99% Ausbeute) als weißen Feststoff zu erhalten: MS (ESI) m/z 456 (MH)⁺.
BEISPIEL XXVII (Eintrag 29, Tabelle 1)
5,11-Dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}ethyl}-2-(trifluormethyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
a) 2-(Ethylamino)-3-nitro-6-(trifluormethyl)pyridin
Zu einer Lösung von 2-Nitroacetamidammoniumsalz (4 g, 33 mmol) in Wasser (165 ml) wurde Piperidiniumacetat (33 mmol) in Wasser gegeben, gefolgt von der langsamen Zugabe von 4-Ethoxy-1,1,1-trifluor-3-buten-2-on (6,1 ml, 43 mmol) in MeOH (11 ml). Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei Raumtemperatur und 3 h bei Rückfluss gerührt. Man ließ die Reaktionsmischung auf 45°C abkühlen und wässrige HCl (1 N) wurde zugegeben, bis der pH sauer war. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit CH₂Cl₂ (3×) extrahiert. Die vereinten organischen Schichten wurden nacheinander mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc, dann EtOAc:MeOH, 9:1) gereinigt, um 3-Nitro-6-(trifluormethyl)-2(1H)-pyridinon (2,7 g, 40% Ausbeute) als gelben Feststoff zu ergeben.
Zu einer Lösung von 3-Nitro-6-(trifluormethyl)-2(1H)-pyridinon (2,4 g, 11,5 mmol) in DMF (69 ml) wurde Natriumhydrid (350 mg, 13,8 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde 30 min bei 45°C gerührt, auf Raumtemperatur abgekühlt und N-Phenyltrifluormethansulfonimid (4,9 g, 13,8 mmol) wurde zugegeben. Nach 1 h wurde eine 2 M Lösung von Ethylamin in THF (13 ml, 25 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in Wasser (100 ml) gegossen und mit EtOAc (3×) extrahiert. Die vereinte organische Schicht wurde nacheinander mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan:EtOAc, 9:1) gereinigt, um die gewünschte Verbindung (1,1 g, 41% Ausbeute) als gelbes Öl zu erhalten.
b) 3-Amino-2-(ethylamino)-6-trifluormethyl)pyridin
Eine Lösung von 2-(Ethylamino)-3-nitro-6-(trifluormethyl)pyridin (1,1 g, 4,9 mmol) in MeOH (40 ml) wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Wasserstoff (1 atm) in Anwesenheit von 20% Pd(OH)₂/C (100 mg) gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration über Diatomeenerde entfernt. Die Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, um die Titelverbindung als oranges Öl zu ergeben (1 g).
c) 2-Chlor-N-{2-(ethylamino)-6-(trifluormethyl)-3-pyridinyl}-5-brom-3-pyridincarboxamid
Zu einer gekühlten Lösung von 3-Amino-2-(ethylamino)-6-trifluormethylpyridin (1 g, 4,9 mmol) in MeCN (24 ml) wurde festes NaHCO₃ (906 mg, 11 mmol) gegeben. Nach 5 min wurde rohes 5-Brom-2-chlor-3-pyridincarbonylchlorid (hergestellt aus 5-Brom-2-hydroxy-3-pyridincarbonsäure und SOCl₂ [wie von T. W. Gero et al. in Synth. Commun. 1989, 19, 553–559 beschrieben (hier durch Bezugnahme aufgenommen), aber unter Weglassen der wässrigen Aufarbeitung)] zugegeben (1 Äquiv., 4,9 mmol). Nach 2 h wurde die Reaktionsmischung über Eis/H₂O (1,5 l) gegeben und der sich ergebende Feststoff wurde filtriert und mit H₂O und dann Hexan gespült. Nach Trocknen unter vermindertem Druck über Nacht wurde die Titelverbindung als hellbrauner Feststoff erhalten (1,6 g, 77% Ausbeute).
d) 8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-2-(trifluormethyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Zu einer Lösung von 2-Chlor-N-{2-(ethylamino)-6-(trifluormethyl)-3-pyridinyl}-5-brom-3-pyridincarboxamid (766 mg, 1,8 mmol) in DMF (18 ml) wurde NaH (137 mg, 5,4 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 80°C gerührt. Nach 1 h ließ man die Reaktion auf Raumtemperatur abkühlen und sie wurde dann in Wasser (20 ml) gegossen. Die sich ergebende Mischung wurde mit EtOAc (3×) extrahiert. Die vereinte organische Schicht wurde nacheinander mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan:EtOAc, 7:3) gereinigt, um die gewünschte Verbindung (200 mg, 28% Ausbeute) als gelben Feststoff zu ergeben.
e) 8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-5-methyl-2-(trifluormethyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Zu einer Lösung von 8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-2-(trifluormethyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (200 mg, 0,52 mmol) in DMF (2,6 ml) wurde NaH (20 mg, 0,78 mmol) zugegeben und die Mischung auf 50°C für 30 min erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und mit Mel (97 μl, 1,56 mmol) behandelt. Nach 16 h wurde die Reaktionsmischung mit Wasser verdünnt. Die sich ergebende Mischung wurde mit EtOAc (3×) extrahiert. Die vereinte organische Schicht wurde nacheinander mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan:EtOAc, 8,5:1,5) gereinigt, um die Titelverbindung (110 mg, 53% Ausbeute) als weißen Schaum zu ergeben.
f) 5,11-Dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-(2-propenyl)-2-(trifluormethyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Allyltributylzinn (98 μl, 0,32 mmol) und Pd(Ph₃P)₄ (16 mg, 0,02 mmol) wurden zu einer entgasten (N₂ durch Lösung für 30 min) Lösung von 8-Brom-5,11-dihydro-11-ethyl-5-methyl-2-(trifluormethyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (11 mg, 0,27 mmol) in DMF (1,4 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde 1,5 h bei 90°C gerührt und dann auf Raumtemperatur gekühlt und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Hexan:EtOAc, 8:2 bis 7:3) gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben (101 mg, 99% Ausbeute).
g) 5,11-Dihydro-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-2-(trifluormethyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Ein ozonisierter Sauerstoffstrom wurde durch eine kalte (–78°C) Lösung von 5,11-Dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-(2-propenyl)-2-(trifluormethyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (100 mg, 0,27 mmol) in CH₂Cl₂ (2,7 ml) und MeOH (2,7 ml) für 2,5 h durchgeblubbert. Ein Strom von N₂ wurde als nächstes durch die Lösung für 15 min geblubbert und dann wurde festes NaBH₄ (52 mg, 1,4 mmol) zur Lösung gegeben. Man ließ die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur aufwärmen. Nach 1 h wurde wässriges gesättigtes NH₄Cl (5 ml) zugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur 2 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit CH₂Cl₂ verdünnt und die wässrige Schicht wurde erneut mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die vereinte organische Schicht wurde nacheinander mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc:Hexan: 75:25 bis EtOAc 100%) gereinigt, um die Titelverbindung (60 mg, 59% Ausbeute) als weißen Feststoff zu erhalten.
h) 5,11-Dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-2-(trifluormethyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Diethylazodicarboxylat (DEAD) (38 μl, 0,24 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung von 5,11-Dihydro-11-ethyl-8-(2-hydroxyethyl)-5-methyl-2-(trifluormethyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (58 mg, 0,16 mmol), 4-Hydroxychinolin (35 mg, 0,24 mmol) und Ph₃P (62 g, 0,24 mmol) in THF (1,6 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 h gerührt und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (EtOAc:MeOH; 95:5) gereinigt, um die Titelverbindung (24 mg, 31% Ausbeute) als weißen Feststoff zu ergeben: MS (ESI) m/z (494, 495 (MH)⁺.
i) 5,11-Dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-{2-{(1-oxido-4-chinolinyl)oxy}ethyl}-2-(trifluormethyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on
Festes mCPBA (80–85%, m-Chlorperbenzoesäure) (16 mg, 0,08 mmol) wurde zu einer Lösung von 5,11-Dihydro-11-ethyl-5-methyl-8-{2-(4-chinolinyloxy)ethyl}-2-(trifluormethyl)-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on (22 mg, 0,04 mmol) in CH₂Cl₂ (0,5 ml) bei Raumtemperatur gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2,5 h gerührt und dann mit CH₂Cl₂ verdünnt. Die sich ergebende Lösung wurde nacheinander mit wässrigem 10% Na₂S₂O₃, wässrigem gesättigtem NaHCO₃ und Salzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (MeOH:CHCl₃, 5% bis 10%) gereinigt, um die Titelverbindung (11 mg, 52% Ausbeute) als weißen Feststoff zu erhalten (MS (ESI) m/z 511 (MH)⁺.
TABELLE I Verbindungen der Formel I
REVERSE TRANSKRIPTASE (RT)-ASSAYS
ASSAY-THEORIE:
Unter den Enzymen, für die das humane Immunschwächevirus (HIV-1) kodiert, befindet sich eine Reverse Transkriptase (1), die so bezeichnet wird, weil sie eine DNA-Kopie von einem RNA-Templat transkribiert. Diese Aktivität kann in einem zellfreien Enzym-Assay quantitativ gemessen werden und basiert auf der Beobachtung, dass Reverse Transkriptase in der Lage ist, ein synthetisches Templat Poly r(C) mit einem Primer biotinyliertes Oligo d(G) zu verwenden, um einen radioaktiv markierten DNA-Strang unter Verwendung von 3H-dGTP als Substrat zu transkribieren. Der nachstehend beschriebene Assay benutzt das Wildtyp-Enzym (welches die vorherrschende Form des Enzyms ist, das in Patienten beobachtet wird, die mit HIV-1 infiziert sind) und kann auch mit Enzymen von Mutanten-RT (z.B. Y181C, hergestellt durch Punktmutation, wobei der Tyrosinrest an Codon 181 durch einen Cysteinrest ersetzt worden ist) unter analogen Assaybedingungen verwendet werden. Dieser Assay ermöglicht es, Verbindungen auf ihre Wirksamkeit bei der Inhibierung der Mutantenenzyme zu bewerten.
MATERIALIEN:
a) Herstellung des Enzyms
Einige HIV-1 IIIB Klon BH10 RT-Mutanten wurden von Dr. C.-K. Shih (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc., U.S.A.) im Vektor pKK233-2 (Pharmacia) bereitgestellt. Kurz gesagt wurde ein HIV-RT Klon pKRT2 enthaltend nur das RT p66 Gen reguliert durch den lac-Operon/trc-Promotor von Dr. W. Summers (Yale University) erhalten (2). Eine Vielfalt von speziellen Aminosäuresubstitutionen wurde in das Wildtyp-RT-Gen durch Punktmutation eingeführt. RT-Klone wurden in den bakteriellen Expressionsvektor pKK233-2 subkloniert. Bereitgestellte Klone beinhalteten den Wildtyp, Val106Ala, Tyr181Cys, Tyr188Cys, Tyr188Leu, Gly190Ala und Pro236Leu. Andere wurden betriebsintern durch Punktmutation von pKK233-2 RT-Klonen erstellt, einschließlich Lys103Asn, Lys103Asn/Tyr181Cys, Lys103Asn/Leu100Ile, Lys103Asn/Pro225His und Lys103Asn/Val108Ile.
b) Reinigung des Enzyms
Die Reinigung von rekombinanter Reverse-Transkriptase erfolgte durch Verwendung einer Kombination von vorher beschriebenen Verfahren (3). Eine einzelne Kolonie aus einer frischen Platte von transformierten JM109-Zellen wurde verwendet, um das Wachstum einer bei 37°C gewachsenen Übernachtvorkultur zu starten. Zwei Liter Wachstumsmedium wurden mit dieser Vorkultur geimpft. Bei OD₆₀₀ ~ 1,5 (5–6 h bei 37°C) wurde die RT-Genexpression mit IPTG (1 mM am Ende) induziert und die Fermentation wurde einige weitere Stunden bei 37°C fortgesetzt. Nach Zentrifugieren wurden die überstehenden Lösungen verworfen, während Zellpellets zusammengelegt und bis zur Reinigung bei –80°C gelagert wurden. Die Zellen wurden bei 4°C über Nacht aufgetaut und in Lysispuffer (MES, 50 mM, pH 6, EDTA, 1 mM, 10% Vol./Vol. Glycerin, 0,02% Gew./Vol. OBG, 0,02% Gew./Vol. Natriumazid) suspendiert. Lysozym wurde zugegeben und die Mischung auf Eis 40 min inkuziert. Nach Homogenisierung mit einem Dounce in Anwesenheit von Lysozym und Beschallung wurden die Zellen 30 min zentrifugiert. Der Überstand (S1) wurde sichergestellt und bei 4°C gelagert. Der zentrifugierte Pellet wurde erneut in Extraktionspuffer (MES 50 mM pH 6, KPO₄ 50 mM pH 6, KCl 100 mM, 10% Vol./Vol. Glycerin, 0,02% Gew./Vol. OBG, 0,02% Gew./Vol. Natriumazid) suspendiert und 30 min bei 4°C gerührt. Diese zweite Mischung wurde wiederum zentrifugiert und der Überstand (S2) gesichert. Das vorstehende Verfahren wurde zwei weitere Male wiederholt, wobei die Überstände S3 und S4 gesichert wurden, und eine letzte Extraktion wurde über Nacht durchgeführt (S5). Polymin P (0,005% zum Schluß) wurde zu den vereinten Überständen zugegeben, um Nucleinsäuren zu entfernen. Diese Lösung wurde 75 min bei 4°C gerührt und 1 h zentrifugiert. Der Überstand (SS1) wurde auf Eis mit 20% Gew./Vol. Ammoniumsulfat gefällt und 1 h bei 4°C gerührt. Die Mischung wurde dann zentrifugiert und der sich ergebende Überstand (SS2) wurde mit zusätzlichem 40% Gew./Vol. Ammoniumsulfat (60% insgesamt) gefällt, 1 h gerührt und wiederum zentrifugiert. Der Endpellet (P1) wurde über Nacht bei 4°C gelagert, bevor er am folgenden Tag einer Reinigung unterworfen wurde. Alle Reinigungsschritte erfolgten bei 4°C, sofern nicht anders angegeben.
Pellet (P1) wurde erneut in MES 50 mM pH 6, KPO₄ 10 mM pH 6, KCl 100 mM, 10% Vol./Vol. Glycerin, 0,02% Gew./Vol. OBG, 0,02% Gew./Vol. Natriumazid suspendiert. Die Suspension wurde über Nacht mit einem 12 bis 14 kD MWCO-Dialyseschlauch gegen den gleichen Puffer dialysiert. Das Dialysat wurde zentrifugiert und der Überstand durch Millex-PF 0,8 m Filtereinheiten filtriert. Die filtrierte Probe wurde auf eine Hydroxylapatit-Säule (30 ml Bettvolumen) gegeben und mit dem gleichen Puffer gewaschen. Das gebundene Enzym wurde mit etwa 220 ml eines linearen Gradienten von 10 bis 300 mM KPO₄ in vorstehendem Puffer eluiert. Die Fraktionen enthaltend p66/p51-Heterodimer (bestimmt durch SDS-PAGE 8% und Western-Blotting) wurden für die nächste Säule gesammelt. Die RT enthaltenden Fraktionen wurden zweifach mit Bis-Tris-Propan 50 mM pH 7,0, 0,02% Gew./Vol. OBG, 10% Vol./Vol. Glycerin, 0,02% Gew./Vol. Natriumazid verdünnt und auf eine Hi-Trap Heparin-Sepharose-Säule (5 ml Bettvolumen) gegeben und mit dem gleichen Puffer gewaschen. Die gebundene RT wurde dann mit 75 ml eines linearen Gradienten von 0 bis 1 M Ammoniumsulfat in dem gleichen Puffer eluiert. RT enthaltende Fraktionen wurden gemäß SDS-PAGE- und Western-Blotting-Analysen gesammelt. Die Proteinkonzentration dieses Pools wurde durch das Bradford-Verfahren mit BSA als Standard bestimmt. Das fertige Enzympräparat wurde in MES 50 mM pH 6, KPO₄ 300 mM pH 6, KCl 175 mM, 10% Vol./Vol. Glycerin, 0,02% Gew./Vol. Natriumazid dialysiert, es wurden Aliquote genommen und bei –80°C gefroren.
ASSAYVERFAHREN:
Der radiometrische Enzymassay ist für das Format einer 96-Mulden-Mikrotiterplatte angepasst worden und es werden Streptavidin-Scintillation-Proximity-Perlen verwendet. Der Assay wird nachstehend kurz beschrieben. Das HIV-1 RT-Enzym wurde aufgetaut und in geeigneter Weise in Tris/HCl 50 mM pH 7,8 enthaltend NaCl 60 mM, MgCl₂·Hexahydrat 2 mM, DTT 6 mM, GSH 2 mM und 0,02% Gew./Vol. Chaps verdünnt, um ≈ 3 nM Enzym zu erhalten. Zu 30 μl dieser Enzymlösung wurden 10 μl der Inhibitorlösung (50 μm bis 2,5 nM Inhibitor im gleichen Assaypuffer wie vorstehend enthaltend 15% Vol./Vol. DMSO) zugegeben. Die Platte wurde 15 min bei Raumtemperatur vorinkubiert, bevor der nächste Schritte durchgeführt wurde. Bei diesem Vorinkubationsschritt waren die höchsten und niedrigsten Inhibitorkonzentrationen 12,5 μm bzw. 0,67 nM und die Konzentration von DMSO 3,75% Vol./Vol. Dann wurde die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 10 μl Substratlösung gestartet. Die Endreaktionsmischung enthielt Tris/HCl 50 mM pH 7,8, NaCl 60 mM, MgCl₂·6H₂O 2 mM, DTT 6 mM, GSH 2 mM, Chaps 0,02% Gew./Vol. DMSO 3% Vol./Vol., Poly rC 179 nM, Biotin dG₁₅ 18 nM, dGTP 288 nM, ³H-dGTP 71 nM und 1–2 nM Enzym.
Bei diesem Inkubationsschritt waren die höchsten und niedrigsten Inhibitorkonzentrationen 10 μm bzw. 0,5 nM. Nach der Zugabe der Substrate wurde die Platte mit einem Kunststoffdeckel bedeckt und 1 h bei 37°C in einem trockenen Inkubator inkubiert. Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 75 μl EDTA 0,5 M enthaltend 5 mg/ml Streptavidin-Scintillation-Proximity-Perlen gequencht.
Die Platte wurde 2 min bei mittlerer Geschwindigkeit geschüttelt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 75 μl einer 7 M Lösung Cäsiumchlorid zugegeben, die Platte wurde 2 min bei mittlerer Geschwindigkeit geschüttelt und wiederum 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde dann mit einer Kunststoffabdeckung bedeckt und unter Verwendung einer TopCount-NXT^® Microplate Scintillation & Luminescence Counter (Packard) ausgezählt. Jede Mulde wurde 60 s ausgezählt. Jede Reihe enthielt an den Rändern eine Blind- und eine Kontrollmulde.
Die Berechnung der prozentualen Inhibierung war:
Mit dem vorstehenden Assay wurden Verbindungen der Erfindung im Hinblick auf die Inhibierung des RT-Wildtyps (WT) und der Mutanten-Enzyme geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 als IC₅₀ (nM) aufgeführt.
Zur Bestätigung des Vermögens dieser Verbindungen zur Inhibierung der HIV-Replikation wurden sie auch in einem Human-T-Zellkultur (Syncytia)-Assay geprüft, wie nachstehend beschrieben.
ELISA-Assay für die Bewertung der Aktivität in Zellkultur
Verbindungen der Erfindung wurden auf ihr Vermögen zur Inhibierung der HIV-Replikation in einer Zellkultur in einem 96-Mulden-Platten-Assay geprüft. Ein vollständiges RPMI 1640, bestehend aus RPMI 1640 + 10% fötalem Rinderserum, 10 μg/ml Gentamycin und 10 μM β-Mercaptoethanol, wurde zur Verdünnung der Verbindung ebenso wie als Zellwachstumsmedium verwendet. Die T-Lymphozyten-Zelllinie C8166 wurde mit einem Infektionsverhältnis (multiplicity of infection) von 0,001 mit Viren, die Wildtyp- und Mutanten-Reverse Transkriptase kodieren, infiziert. Die Zellen wurden dann 3 Tage mit fortlaufenden Verdünnungen der Verbindungen der Erfindung inkubiert. Der Überstand wurde von 8 Muldenkopien gesammelt und die Konzentration extrazellulärer p24 wurden mit einem handelsüblichen HIV-1 p24-Antigen-Assay-Kit (Beckman-Coulter^®) bestimmt. Der Inhibierungsgrad (% Inhibierung) wurde mit der folgenden Gleichung berechnet:
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 als EC₅₀ (nM) aufgeführt.
Spezifitätsassays
Zur Bestimmung der Spezifität der Enzyminhibitoraktivität der durch die Erfindung bereitgestellten Verbindungen wurden einige im Hinblick auf ihr Vermögen zur Inhibierung anderer viraler Polymerasen (wie RNA-abhängige RNA-Polymerasen von Hepatitis C-Virus und Respiratory Syncytial-Virus) ebenso wie Säugerpolymerasen (wie Kalbsthymus-RNA-abhängige DNA-Polymerase und humane Telomerase) unter Verwendung bekannter Assayverfahren geprüft. Bei keiner der geprüften Verbindungen wurde festgestellt, dass sie irgendeine signifikante Inhibitoraktivität gegen diese Enzyme besitzen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Enzyminhibitoraktivität der durch die Erfindung bereitgestellten Verbindungen ziemlich spezifisch gegen HIV-1 RT gerichtet ist.
Referenzen (hier durch Bezugnahme aufgenommen)

1. Benn, S., et al., Science 230: 949, 1985.
2. D'Aquila, R. T., und Summers, W. C. J., Acq. Imm. Def. Syn. 2: 579, 1989;
3. a) Warren, T. C. et al. Protein Expression & Purification 3: 479, 1992;
b) Kohlstaedt, L. A., Science 256 (5065): 1783, 1992.

Claims

Verbindung der allgemeinen Formel I
worin: R² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, F, Cl, C_1-4-Alkyl, C_3-4-Cycloalkyl und CF₃; R⁴ H oder Me ist; R⁵ H, Me oder Et ist, mit der Maßgabe, dass R⁴ und R⁵ nicht beide Me sind und, wenn R⁴ Me ist, R⁵ dann nicht Et sein kann; R¹¹ Me, Et, Cyclopropyl, Propyl, Isopropyl oder Cyclobutyl ist; und Q ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R¹¹ Et oder Cyclopropyl ist, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Q ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Q
ist, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R⁵ Me ist, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R¹¹ Et ist, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Inhibitor der HIV-Replikation der allgemeinen Formel I nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel I nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Inhibitors der HIV-Replikation.
Verwendung einer Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vermeidung von HIV-Infektion.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Vermeidung von HIV-Infektion, umfassend eine Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.