DE60114640T2

DE60114640T2 - Antithrombosemittel

Info

Publication number: DE60114640T2
Application number: DE60114640T
Authority: DE
Inventors: Wade Douglas BEIGHT; Joseph John MASTERS; Scott Jason SAWYER; Theodore Robert SHUMAN; Robert Michael WILEY; Kwong Ying YEE
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2000-08-17
Filing date: 2001-08-06
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2021-08-07
Also published as: WO2002014308A1; EP1311501B1; US20040010017A1; US6924296B2; AU2001282871A1; EP1311501A1; ES2248380T3; ATE308540T1; DE60114640D1

Description

Die Erfindung beansprucht die Priorität der US Anmeldung 60/225 926 vom 17. August 2000.
Die Erfindung betrifft antithrombotische, aromatische Verbindungen, die eine Aktivität als Inhibitoren des Faktors Xa zeigen und demnach als Antikoagulantien bei Säugern brauchbar sind. Insbesondere betrifft sie aromatische Verbindungen mit einer hohen Antikoagulansaktivität und einer antithrombotischen Aktivität. Daher betrifft die Erfindung neue Inhibitoren des Faktors Xa, pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Verbindungen als Wirkstoffe enthalten und die Verwendung der Verbindungen als Antikoagulantien zur Prophylaxe und Behandlung von thromboembolischen Störungen, wie venöser Thrombose, Lungenembolie, arterieller Thrombose, insbesondere Myokardischämie, Myokardinfarkt und cerebraler Thrombose, allgemeinen Hyperkoagulationszuständen und lokalen Hyperkoagulationszuständen, wie nach einer Angioplastie und koronaren Bypass-Operationen, und von allgemeiner Gewebeverletzung, da diese mit dem Entzündungsprozess zusammenhängt. Zusätzlich sind die antithrombotischen Mittel als Antikoagulantien bei in vitro Anwendungen brauchbar.
Der Vorgang der Blutgerinnung, die Thrombose, wird durch eine komplexe proteolytische Kaskade ausgelöst, die zur Bildung von Thrombin führt. Thrombin entfernt proteolytisch die Aktivierungspeptide von den Aα und Bβ-Ketten von Fibrinogen, das in Blutplasma löslich ist, was die Bildung von unlöslichem Fibrin auslöst. Die Bildung von Thrombin aus Prothrombin wird durch den Faktor Xa katalysiert.
Die Antikoagulation wird derzeit durch die Verabreichung von Heparinen und Kumarinen erreicht. Die parenterale pharmakologische Kontrolle der Koagulation und der Thrombose basiert auf der Hemmung von Thrombin durch die Verwendung der Heparine. Heparine wirken indirekt auf Thrombin durch die Beschleunigung der hemmenden Wirkung von endogenem Antithrombin III (der hauptsächliche physiologische Inhibitor von Thrombin). Da die Antithrombin III Spiegel im Plasma variieren können und da oberflächengebundenes Thrombin gegenüber diesem indirekten Mechanismus resistent zu sein scheint, können Heparine eine uneffektive Behandlung darstellen. Da man glaubt, dass Gerinnungstests mit Wirksamkeit und Sicherheit zusammenhängen, müssen die Heparinspiegel mit Gerinnungstests überwacht werden (insbesondere mit dem aktivierten partiellen Thromboplastinzeittest (APTT)). Kumarine verhindern die Bildung von Thrombin durch die Blockierung der posttranslationalen gamma-Carboxylierung bei der Synthese von Prothrombin und anderen Proteinen dieses Typs. Aufgrund ihres Wirkmechanismus kann die Wirkung von Kumarinen sich nur langsam entwickeln, nämlich 6–24 Stunden nach der Verabreichung. Ferner sind sie keine selektiven Antikoagulantien. Kumarine erfordern ebenfalls die Überwachung mit Gerinnungstests (insbesondere dem Prothrombinzeittest (PT)).
Die WO 00 39 118 A beschreibt antithrombotische, aromatische Amide, die eine Aktivität als Inhibitoren des Faktors Xa zeigen.
Kürzlich ist das Interesse an kleinen, synthetischen Molekülen gewachsen, die eine potente direkte Hemmung von Thrombin und Faktor Xa zeigen. Siehe Joseph P. Vacca (Annette M. Doherty Sektionseditor), Annual Reports in Medicinal Chemistry (1998), 33, 81–90.
Obwohl die Heparine und Kumarine wirksame Antikoagulantien sind, enstand bis jetzt kein kommerzeilles Arzneimitel aus den kleinen synthetischen Molekülen und trotz der anhaltenden vielversprechenden Aussichten existiert immer noch ein Bedarf für Antikoagulantien, die selektiv auf den Faktor Xa oder Thrombin wirken und unabhängig von Antithrombin III sind, eine schnelle Hemmwirkung nach der Verabreichung, vorzugsweise einem oralen Weg, hervorrufen, und nicht mit der Lyse von Blutgerinnseln wechselwirken, wie dies zur Erhaltung der Hämostase erforderlich ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Feststellung, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, wie sie im folgenden definiert sind, potente Inhibitoren des Faktors Xa sind, die eine hohe Bioverfügbarkeit nach einer oralen Verabreichung aufweisen.
Gemäß der Erfindung wird eine Verbindung der Formel I bereitgestellt (oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon)
worin
eines von R¹ und R² für Q¹ steht und das andere von R¹ und R² für Q² steht, worin
Q¹ für 2-Pyridinyl (das einen Methyl-, Methoxy-, Methylthio-, Fluor- oder Chlorsubstituenten an der Position 5 tragen kann) oder 3-Pyridinyl steht (das einen Methyl-, Fluor- oder Chlorsubstituenten an der Position 6 tragen kann) oder
Q¹ für Phenyl steht, das einen, zwei oder drei Substituenten an den Positionen 3, 4 oder 5 tragen kann, die unabhängig ausgewählt sind aus Halogen, Cyano, Carbamoyl, Aminomethyl, Methyl, Methoxy, Difluormethoxy, Hydroxymethyl, Formyl, Vinyl, Amino, Hydroxy und 3,4-Methylendioxy und das Phenyl zusätzlich einen 2-Chlor- oder 2-Fluorsubstituenten tragen kann, oder
Q¹ steht für
worin
-E-G-NH- für -CH₂-CH₂-NH-, -C(R^a)=CH-NH-, -C(R^a)=N-NH-, -N=CH-NH- oder -N=N-NH- steht, worin R^a für Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom oder Methyl steht,
Q² steht für
worin R^m für C₁-C₄ Alkyl, Cyclohexyl, 4-Tetrahydropyranyl, Phenyl, 4-Pyridyl oder 2-Pyrimidinyl steht,
wenn R² für Q¹ steht, R³ dann für H, COOH, N-(Methyl)benzolsulfonylamino oder Phenyl steht (das an der Position 3 oder 4 mit Methyl, Chlor oder Fluor substituiert sein kann) und R⁴ für H steht, und
wenn R² für Q² steht, R³ dann für H steht und R⁴ für H, COOH, Methyl, N-(Methyl)benzolsulfonylamino, unsubstituiertes Phenyl oder Phenyl steht (das an der Position 3 oder 4 mit Methyl, Chlor oder Fluor substituiert sein kann),
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz der Verbindung der Formel I.
Eine besondere Verbindung der Formel I ist eine Verbindung der Formel I (oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon)
worin
eines von R¹ und R² für Q¹ steht und das andere von R¹ und R² für Q² steht, worin
Q¹ für 2-Pyridinyl (das einen Methyl-, Methoxy-, Methylthio-, Fluor- oder Chlorsubstituenten an der Position 5 tragen kann) oder 3-Pyridinyl steht (das einen Methyl-, Fluor- oder Chlorsubstituenten an der Position 6 tragen kann) oder
Q¹ für Phenyl steht, das einen, zwei oder drei Substituenten an den Positionen 3, 4 oder 5 tragen kann, die unabhängig ausgewählt sind aus Halogen, Cyano, Carbamoyl, Aminomethyl, Methyl, Methoxy, Difluormethoxy, Hydroxymethyl, Formyl, Vinyl, Dimethylamino, Amino, Hydroxy und 3,4-Methylendioxy und das Phenyl zusätzlich einen 2-Chlor- oder 2-Fluorsubstituenten tragen kann, oder
Q¹ steht für
worin
-E-G-NH- für -CH₂-CH₂-NH-, -C(R^a)=CH-NH-, -C(R^a)=N-NH-, -N=CH-NH- oder -N=N-NH- steht, worin R^a für Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom oder Methyl steht,
Q² steht für
worin R^m für C₁-C₄ Alkyl, Cyclohexyl, 4-Tetrahydropyranyl, Phenyl, 4-Pyridyl oder 2-Pyrimidinyl steht,
wenn R² für Q¹ steht, R³ dann für H, COOH, N-(Methyl)benzolsulfonylamino oder Phenyl steht (das an der Position 3 oder 4 mit Methyl, Chlor oder Fluor substituiert sein kann) und R⁴ für H steht, und
wenn R² für Q² steht, R³ dann für H steht und R⁴ für H, COOH, Methyl, N-(Methyl)benzolsulfonylamino, unsubstituiertes Phenyl oder Phenyl steht (das an der Position 3 oder 4 mit Methyl, Chlor oder Fluor substituiert sein kann),
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz der Verbindung der Formel I.
Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck "eine Verbindung der Formel I" oder der Ausdruck "eine Verbindung der Erfindung" die Verbindung und jedes herkömmliche Prodrug hiervon, wie auch ein pharmazeutisch annehmbares Salz dieser Verbindung oder dieses Prodrugs.
Ein pharmazeutisch annehmbares Salz eines antithrombotischen Mittels der vorliegenden Erfindung umfasst eines, worin ein Säureadditionssalz aus einer basischen Verbindung der Formel I und einer Säure hergestellt wird, die ein pharmazeutisch annehmbares Anion liefert, wie auch ein Salz, das aus einer sauren Verbindung der Formel I und einer Base hergestellt wird, die ein pharmazeutisch annehmbares Kation liefert. Daher liefert ein Salz einer oben bereitgestellten neuen Verbindung der Formel I, das mit einer Säure oder Base hergestellt wird, die ein pharmazeutisch annehmbares Gegenion liefert, einen bestimmten Aspekt der Erfindung. Beispiele für solche Säuren und Basen werden hierin später bereitgestellt.
Als zusätzlicher Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Formulierung geliefert, die eine neue Verbindung der Formel I (oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon) zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff enthält, wie dies in einer der Beschreibungen hierin bereitgestellt wird.
Zusätzlich wird die Verwendung einer den Faktor Xa hemmenden Verbindung der Formel I (oder eines Salzes hiervon), wie sie hierin beschrieben ist, als Wirkstoff zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Bereitstellung eines Antikoagulations- oder Antithromboseeffekts bereitgestellt.
Zusätzlich wird die Verwendung einer Faktor Xa hemmenden Verbindung der Formel I mit einer der Definitionen hierin zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer thromboembolischen Störung bereitgestellt.
In dieser Beschreibung werden die folgenden Definitionen verwendet, falls nichts anderes angegeben ist: Halogen steht für Brom, Chlor oder Fluor. Alkyl, Alkoxy usw. stehen sowohl für gerade als auch verzweigte Gruppen, aber der Bezug auf einen einzelnen Rest, wie "Propyl", umfasst nur den geradkettigen ("normalen") Rest, wobei ein verzweigtkettiges Isomer, wie "Isopropyl" spezifisch erwähnt wird.
Besondere Bedeutungen sind im folgenden nur zur Erläuterung für Reste, Substituenten und Bereiche angegeben und schließen nicht andere definierte Bedeutungen oder andere Bedeutungen innerhalb der für die Reste und Substituenten definierten Bereiche aus.
Für eine Alkylgruppe oder den Alkylteil einer Alkyl-enthaltenden Gruppe, wie beispielsweise Alkoxy, ist eine bestimmte Bedeutung für C₁-C₄ Alkyl Methyl, Ethyl, Isopropyl oder 2-Butyl und insbesondere Ethyl, Isopropyl oder 2-Butyl. Eine besondere Bedeutung für Halogen ist Fluor oder Chlor und insbesondere Fluor.
Eine bestimmte Bedeutung für Q¹ ist 5- oder 6-Indolyl. Eine bestimmte Bedeutung für Q¹ ist 6-Indolyl. Eine besondere Bedeutung für Q² ist 1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-yl. Wenn R² für Q¹ steht, sind bestimmte Bedeutungen für R³ H oder COOH und vor allem H und für R⁴ H. Wenn R² für Q² steht ist eine bestimmte Bedeutung für R⁴ H und für R³ H.
Eine besondere Verbindung der Formel I ist eine, worin eines von R¹ und R² für Q¹ steht und das andere von R¹ und R² für Q² steht,
Q¹ steht für
worin
-E-G-NH- für -CH₂=CH₂-NH- steht,
Q² steht für
worin R^m für 4-Pyridyl steht,
wenn R² für Q¹ steht, R³ dann für H oder COOH steht und R⁴ für H steht und
wenn R² für Q² steht, R³ dann für H steht und R⁴ für H steht.
Eine weitere besondere Verbindung der Formel I ist eine, worin
R¹ für Q² steht,
R² für Q¹ steht,
Q¹ für 6-Indolyl steht,
Q² für 1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-yl steht,
R³ für H steht, und
R⁴ für H steht.
Eine weitere besondere Verbindung der Formel I ist eine worin
R¹ für Q¹ steht,
R² für Q² steht,
Q¹ für 6-Indolyl steht,
Q² für 1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-yl steht,
R³ für H steht, und
R⁴ für H steht.
Es ist ersichtlich, dass bestimmte Verbindungen der Formel I (oder Salze usw.) in isomeren Formen vorkommen und so isoliert werden können, einschließlich tautomerer Formen oder cis- oder trans-Isomeren, wie auch als optisch aktive razemische oder diastereomere Formen, das sie mehr als ein asymmetrisches Zentrum haben können. Es ist auch verständlich, dass die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel I in allen tautomeren Formen oder als Gemisch hiervon oder als Diastereomerengemisch wie auch in Form eines einzelnen Diastereomers umfasst und dass die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel I als Enantiomerengemisch wie auch in Form eines einzelnen Enantiomers umfasst, wobei alle diese Gemische oder Formen eine hemmende Aktivität gegenüber dem Faktor Xa aufweisen, wobei es in der Technik bekannt ist, wie man bestimmte Formen herstellt oder isoliert und wie man die hemmenden Eigenschaften gegen den Faktor Xa durch Standardtests bestimmt, einschließlich der unten beschriebenen.
Zusätzlich kann eine Verbindung der Formel I (oder ein Salz usw.) einen Polymorphismus zeigen oder kann ein Solvat mit Wasser oder einem organischen Lösemittel bilden. Die vorliegende Erfindung umfasst alle solchen polymorphen Formen, jedes Solvat oder jedes Gemisch hiervon.
Eine Verbindung der Formel I kann durch Verfahren hergestellt werden, die in der Chemie zur Herstellung von strukturell analogen Verbindungen bekannt sind oder durch ein neues hierin beschriebenes Verfahren hergestellt werden. Ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Verbindung der Formel I (oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon), neue Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I und neue Zwischenprodukte zur Herstellung einer Verbindung der Formel I gemäß obiger Definition stellen weitere Merkmale der Erfindung dar und werden durch die folgenden Verfahren erläutert, worin die Bedeutungen der allgemeinen Reste wie oben definiert sind, falls nichts anderes angegeben ist. Es ist ersichtlich, dass es bevorzugt oder erforderlich ist, eine Verbindung der Formel I herzustellen, worin eine funktionelle Gruppe durch eine herkömmliche Schutzgruppe geschützt wird, und die Schutzgruppe anschließend unter Bildung der Verbindung der Formel I zu entfernen.
Daher wird ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Verbindung der Formel I (oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon) bereitgestellt, wie sie in einer der obigen Beschreibungen bereitgestellt wird, das aus einem der in den Beispielen beschriebenen einschließlich den folgenden ausgewählt wird.
(A) Für eine Verbindung der Formel I, worin R¹ für Q¹ steht, Acylierung der Aminogruppe einer entsprechenden Verbindung der Formel II
mittels einer entsprechenden Säure der Formel Q²-COOH (III) oder eines aktivierten Derivats hiervon.
Für eine Carbonsäure umfasst ein typisches aktiviertes Derivat einen Ester (insbesondere einen Niederalkylester, wie den Methyl- oder Ethylester), ein Säurehalogenid (insbesondere das Säurechlorid) und einen aktivierten Ester oder ein aktiviertes Anhydrid (einschließlich des 4-Nitrophenylesters und eines aktivierten Esters oder Anhydrids, das von einem Kupplungsreagenz stammt).
Die Acylierung kann beispielsweise mittels eines ähnlichen Verfahrens zu dem vervollständigt werden, das in Beispiel 1 Teil D beschrieben ist.
(B) für eine Verbindung der Formel I, worin R² für Q¹ steht, Acylierung der Aminogruppe einer entsprechenden Verbindung der Formel IV
mittels einer entsprechenden Säure der Formel Q²-COOH (III) oder eines aktivierten Derivats hiervon, beispielsweise mittels eines ähnlichen Verfahrens zu dem, das in Beispiel 1 Teil D beschrieben ist.
Wonach bei jedem der obigen Verfahren die Schutzgruppe entfernt wird, wenn eine funktionelle Gruppe mittels einer Schutzgruppe geschützt ist.
Wonach bei jedem der obigen Verfahren, wenn ein pharmazeutisch annehmbares Salz einer Verbindung der Formel I erforderlich ist, dies erhalten wird durch die Umsetzung der basischen Form einer basischen Verbindung der Formel I mit einer Säure, die ein physiologisch annehmbares Gegenion ergibt, oder der sauren Form einer sauren Verbindung der Formel I mit einer Base, die ein physiologisch annehmbares Gegenion liefert.
Wie oben erwähnt, umfasst die Erfindung pharmazeutisch annehmbare Salze der den Faktor Xa hemmenden Verbindungen, die durch die obige Formel I definiert sind. Eine basische Verbindung der Erfindung besitzt eine oder mehrere funktionelle Gruppen, die ausreichend basisch sind, um mit einer von mehreren anorganischen und organischen Säuren zu reagieren, die ein physiologisch annehmbares Gegenion liefern, um ein pharmazeutisch annehmbares Salz zu bilden. Säuren, die herkömmlich zur Bildung pharmazeutisch annehmbarer Säureadditionssalze verwendet werden, sind anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergleichen, wie auch organische Säuren, wie p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Oxalsäure, p-Brombenzolsulfonsäure, Kohlensäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Essigsäure und dergleichen. Beispiele für solche pharmazeutisch annehmbaren Salze sind daher Sulfat, Pyrosulfat, Bisulfat, Sulfit, Bisulfit, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Chlorid, Bromid, Iodid, Acetat, Propionat, Decanoat, Caprylat, Acrylat, Formiat, Isobutyrat, Caproat, Heptanoat, Propiolat, Oxalat, Malonat, Succinat, Suberat, Sebacat, Fumarat, Maleat, Butin-1,4-dioat, Hexin-1,6-dioat, Benzoat, Chlorbenzoat, Methylbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Phthalat, Sulfonat, Xylolsulfonat, Phenylacetat, Phenylpropionat, Phenylbutyrat, Citrat, Lactat, γ-Hydroxybutyrat, Glycolat, Tartrat, Methansulfonat, Propansulfonat, Naphthalin-1-sulfonat, Naphthalin-2-sulfonat, Mandelat und dergleichen. Bevorzugte pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze umfassen die, die mit Mineralsäuren gebildet werden, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure und Schwefelsäure.
Für eine Verbindung der Formel I, die einen sauren Rest aufweist, wie eine Carboxygruppe, kann ein pharmazeutisch annehmbares Salz mit einer Base hergestellt werden, die ein pharmazeutisch annehmbares Kation liefert, wobei dies Alkalimetallsalze (speziell Natrium und Kalium), Erdalkalimetallsalze (speziell Calcium und Magnesium), Aluminiumsalze und Ammoniumsalze, wie auch Salze umfasst, die aus physiologisch annehmbaren organischen Basen stammen, wie Triethylamin, Morpholin, Piperidin und Triethanolamin.
Falls sie nicht im Handel erhältlich sind, können die erforderlichen Ausgangsmaterialien zur Herstellung einer Verbindung der Formel I durch Verfahren hergestellt werden, die aus Standardtechniken der organischen Chemie ausgewählt werden, einschließlich aromatischer und heteroaromatischer Substitution und Transformation, aus Techniken, die zur Synthese von bekannten, strukturell ähnlichen Verbindungen analog sind, und Techniken, die analog zu den oben beschriebenen Verfahren oder zu den in den Beispielen beschriebenen Verfahren analog sind. Es ist dem Fachmann bekannt, dass eine Vielzahl an Sequenzen zur Herstellung der Ausgangsmaterialien erhältlich ist.
Neue Zwischenprodukt- oder Ausgangsverbindungen liefern weitere Aspekte der Erfindung.
Ein Beispiel ist eine Verbindung der Formel II
worin Q¹ und R⁴ die wie vorher definierten Bedeutungen haben.
Ein weiteres Beispiel ist eine Verbindung der Formel IV
worin Q¹, R³ und R⁴ die oben definierten Bedeutungen haben.
Es sind ausgewählte Verfahren zur Substitution, Anbringung und Entfernung der Schutzgruppen in der Technik zur Herstellung einer Verbindung bekannt, wie einer der Formel II und Formel IV, wie dies oben diskutiert ist.
Im allgemeinen wird eine erfindungsgemäße basische Verbindung am besten in Form eines Säureadditionssalzes isoliert. Ein Salz einer Verbindung der Formel I, das mit einer der oben erwähnten Säuren gebildet wird, ist als pharmazeutisch annehmbares Salz zur Verabreichung der antithrombotischen Mittel und zur Herstellung einer Formulierung dieses Mittels brauchbar. Es können andere Säureadditionssalze hergestellt und zur Isolierung und Reinigung der Verbindungen verwendet werden.
Wie oben erwähnt werden die optisch aktiven Isomere und Diastereomere der Verbindungen der Formel I auch als Teil der Erfindung betrachtet. Solche optisch aktiven Isomere können aus ihren jeweiligen optisch aktiven Vorläufern durch die oben beschriebenen Verfahren oder durch die Auftrennung der razemischen Gemische hergestellt werden. Diese Auftrennung kann durch Derivatisierung mit einem chiralen Reagenz ausgeführt werden, gefolgt von einer Chromatographie oder durch wiederholte Kristallisation. Die Entfernung des chiralen Auxiliars durch Standardverfahren ergibt im wesentlichen optisch reine Isomere der Verbindungen der vorliegenden Erfindung oder ihrer Vorläufer. Weitere Details in Bezug auf Auftrennungen können von Jaques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions, John Wiley & Sons 1981 erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen dürften ohne deutliche Beeinflussung der natürlichen Gerinnselauflösungsfähigkeit des Körpers (die Verbindungen weisen eine geringe hemmende Wirkung auf die Fibrinolyse auf) den Faktor Xa selektiv gegenüber anderen Proteinasen und Nichtenzymproteinen hemmen, die in der Blutgerinnung beteiligt sind. Ferner dürfte eine solche Selektivität die Verwendung mit thrombolytischen Mitteln erlauben, ohne die Thrombolyse und Fibrinolyse wesentlich zu beeinträchtigen.
Die Erfindung liefert in einem ihrer weiteren Aspekte eine Verwendung einer wirksamen (gerinnungshemmenden) Dosis einer Verbindung der Formel I zur Herstellung eines Arzneimittels zur Gerinnungshemmung bei einem Säuger.
Die Hemmung des Faktors Xa, die Gerinnungshemmung und die Behandlung einer thromboembolischen Störung, die durch die vorliegende Verwendung umfasst werden, umfassen die medizinisch therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung, wie dies geeignet ist.
Es wird auch eine Verbindung der Formel I (oder ein Salz) mit einer der Definitionen hierin zur Verwendung als antithrombotisches Mittel bereitgestellt.
Zusätzlich wird die Verwendung einer Verbindung der Formel I mit einer der Definitionen hierin zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer thromboembolischen Störung bereitgestellt.
Die Erfindung betrifft die Behandlung eines Zustands bei einem Menschen oder einem Tier, bei dem die Hemmung des Faktors Xa erforderlich ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen dürften bei Säugern, einschließlich dem Menschen, zur Behandlung oder Prophylaxe von Thrombose und Hyperkoagulabilität in Blut und Geweben brauchbar sein. Krankheitszustände, bei denen die Verbindungen eine potentielle Brauchbarkeit aufweisen, sind bei der Behandlung oder Prophylaxe von Thrombose und Hyperkoagulabilität in Blut und Geweben gegeben. Krankheitszustände, bei denen die Verbindungen eine potentielle Brauchbarkeit bei der Behandlung und/oder Prophylaxe haben, sind unter anderem venöse Thrombose und pulmonale Embolie, arterielle Thrombose, wie myokardiale Ischämie, Myokardinfarkt, instabile Angina, auf Thrombosen beruhender Schlaganfall und periphere arterielle Thrombose. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei der Behandlung oder Prophylaxe von arteriosklerotischen Störungen (Erkrankungen), wie koronarer arterieller Erkrankung, cerebraler arterieller Erkrankung und peripherer arterieller Erkrankung. Ferner dürften die Verbindungen zusammen mit Thrombolytika beim Myokardinfarkt brauchbar sein. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei der Prophylaxe einer Reokklusion nach einer Thrombolyse, einer perkutanen transluminalen Angioplastie (PTCA) und koronaren Bypassoperationen. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei der Prävention der Rethrombose nach einer Mikrooperation. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei der Antikoagulationsbehandlung in Zusammenhang mit künstlichen Organen und Herzklappen. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei der Antikoagulationsbehandlung bei einer Hämodialyse und disseminierter intravaskulärer Koagulation. Eine weitere erwartete Brauchbarkeit ist beim Waschen von Kathetern und mechanischen Vorrichtungen, die in Patienten in vivo verwendet wurden und als ein Antikoagulans zur Konservierung von Blut, Plasma und anderen Blutprodukten in vitro. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei anderen Krankheiten, bei denen die Blutgerinnung ein fundamentaler beitragender Prozess oder eine Quelle einer sekundären Pathologie sein könnte, wie bei Krebs, einschließlich Metastasierung, entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Arthritis, und Diabetes. Die Antikoagulationsverbindung wird oral, pa renteral, beispielsweise durch intravenöse Infusion (iv), intramuskuläre Injektion (im) oder subkutan (sc) verabreicht.
Die bestimmte Dosis einer erfindungsgemäß verabreichten Verbindung zur Erlangung von therapeutischen und/oder prophylaktischen Wirkungen wird natürlich durch die bestimmten, den Fall umgebenden Umstände bestimmt, beispielsweise der verabreichten Verbindung, der Verabreichungsgeschwindigkeit, des Verabreichungswegs und des zu behandelnden Zustands.
Eine typische Tagesdosis für jede der obigen Anwendungen liegt zwischen etwa 0,01 mg/kg und etwa 1000 mg/kg. Der Dosisplan kann variieren, beispielsweise kann zur prophylaktischen Verwendung eine einzelne Tagesdosis verabreicht werden oder es können mehrere Dosen, wie drei- oder fünfmal täglich, geeignet sein. Bei kritischen Gesundheitszuständen wird eine erfindungsgemäße Verbindung durch i.v. Infusion mit einer Geschwindigkeit zwischen etwa 0,01 mg/kg/h und etwa 20 mg/kg/h und vorzugsweise zwischen etwa 0,1 mg/kg/h und etwa 5 mg/kg/h verabreicht.
Die Verwendung der Erfindung wird auch zusammen mit einem gerinnselauflösenden Mittel, beispielsweise Gewebsplasminogenaktivator (tPA), modifiziertem tPA, Streptokinase oder Urokinase durchgeführt. In Fällen, bei denen eine Gerinnselbildung aufgetreten ist und eine Arterie oder Vene entweder teilweise oder völlig blockiert ist, wird gewöhnlich ein gerinnselauflösendes Mittel verwendet. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann vor oder zusammen mit dem Lysemittel oder anschließend an dessen Verwendung verabreicht werden, und wird ferner vorzugsweise zusammen mit Aspirin verabreicht, um das Wiederauftreten der Gerinnselbildung zu vermeiden.
Die Verwendung der Erfindung kann auch zusammen mit einem Blutplättchenglykoproteinrezeptor (IIb/IIIa) Antagonisten durchgeführt werden, der die Blutplättchenaggregation hemmt. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann vorher oder zusammen mit dem IIb/IIIa Antagonisten oder anschließend an dessen Verwendung verabreicht werden, um das Auftreten oder Wiederauftreten der Gerinnselbildung zu vermeiden.
Die Verwendung der Erfindung kann auch zusammen mit Aspirin durchgeführt werden. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann vorher oder zusammen mit Aspirin oder anschließend an dessen Verwendung verabreicht werden, um das Auftreten oder das Wiederauftreten der Gerinnselbildung zu vermeiden. Wie oben erwähnt, wird vorzugsweise eine erfindungsgemäße Verbindung zusammen mit einem gerinnselauflösenden Mittel und Aspirin verabreicht.
Die Erfindung liefert auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung im oben beschriebenen therapeutischen Verfahren. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung umfasst eine wirksame den Faktor Xa hemmende Menge einer Verbindung der Formel I zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel.
Der Wirkstoff umfasst in solchen Formulierungen 0,1 bis 99,9 Gewichtsprozent der Formulierung. Mit "pharmazeutisch annehmbar" ist gemeint, dass der Träger, das Verdünnungsmittel oder der Hilfsstoff mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel sein muss und für den Empfänger hiervon nicht schädlich sein darf.
Zur oralen Verabreichung wird die antithrombotische Verbindung in Gelatinekapseln oder Tabletten formuliert, die Hilfsstoffe enthalten können, wie Bindemittel, Gleitmittel, Zerfallshilfsmittel und dergleichen. Zur parenteralen Verabreichung wird das Antithrombotikum in einem pharmazeutisch annehmba ren Verdünnungsmittel formuliert, beispielsweise physiologische Kochsalzlösung (0,9 Prozent), 5 Prozent Glucose, Ringerlösung und dergleichen.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann in Einheitsdosierungsformulierungen formuliert werden, die eine Dosis zwischen etwa 0,1 mg und etwa 1000 mg umfassen. Vorzugsweise liegt die Verbindung in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes vor, wie beispielsweise dem Sulfatsalz, Acetatsalz oder Phosphatsalz. Ein Beispiel für eine Einheitsdosierungsformulierung umfasst 5 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung als pharmazeutisch annehmbares Salz in einer sterilen 10 ml Glasampulle. Ein weiteres Beispiel für eine Einheitsdosierungsformulierung umfasst etwa 10 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung als pharmazeutisch annehmbares Salz in 20 ml isotonischer Kochsalzlösung, die in einer sterilen Ampulle enthalten sind.
Die Verbindungen können auf eine Vielzahl an Arten verabreicht werden, einschließlich oral, rektal, transdermal, subkutan, intravenös, intramuskulär und intranasal. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden vorzugsweise vor der Verabreichung formuliert.
Die vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzungen werden durch gut bekannte Verfahren und mit leicht verfügbaren Inhaltsstoffen hergestellt. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können unter Verwendung von in der Technik gut bekannten Verfahren so formuliert werden, dass sie eine schnelle, anhaltende oder verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs nach der Verabreichung an den Patienten bereitstellen. Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wird der Wirkstoff gewöhnlich mit einem Träger gemischt oder mit einem Träger verdünnt oder in einen Träger eingeschlossen, der in Form einer Kapsel, eines Sachets, eines Papiers oder eines anderen Behälters vorliegen kann. Wenn der Träger als Verdünnungsmittel dient, kann dies ein festes, halbfestes oder flüssiges Material sein, das als Vehikel, Hilfsstoff oder Medium für den Wirkstoff dient. Daher können die Zusammensetzungen vorliegen in Form von Tabletten, Pillen, Pulvern, Lonzetten, Sachets, Cachets, Elixieren, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupen, Aerosolen (als Feststoff oder in einem flüssigen Medium), Weich- und Hartgelatinekapseln, Zäpfchen, sterilen injizierbaren Lösungen, sterilen verpackten Pulvern und dergleichen.
Die folgenden Formulierungsbeispiele sind nur erläuternd und sollen den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise beschränken. "Wirkstoff" meint natürlich eine Verbindung gemäß Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Solvat hiervon.
Formulierung 1
Hartgelatinekapseln werden unter Verwendung folgender Inhaltsstoffe hergestellt:

Menge

(mg/Kapsel)

Wirkstoff 250

Stärke, getrocknet 200

Magnesiumstearat 10

Gesamt 460 mg
Formulierung 2
Eine Tablette wird unter Verwendung der folgenden Inhaltsstoffe hergestellt:

Menge

(mg/Tablette)

Wirkstoff 250

mikrokristalline Cellulose 400

pyrogen hergestelltes Siliciumdioxid 10

Stearinsäure 5

Gesamt 665 mg
Die Bestandteile werden vermischt und unter Bildung von Tabletten gepresst, wobei jede 665 mg wiegt.
Formulierung 3
Eine Aerosollösung, die die folgenden Bestandteile enthält, wird hergestellt:

Gewicht

Wirkstoff 0,25

Ethanol 29,75

Propellant 22 (Chlordifluormethan) 70,00

Gesamt 100,00
Der Wirkstoff wird mit Ethanol gemischt und das Gemisch wird zu einem Teil Propellant 22 gegeben, auf –30°C abgekühlt und in ein Abfüllgerät gegeben. Die erforderliche Menge wird anschließend in einen Edelstahlbehälter gefüllt und mit dem Rest des Propellants verdünnt. Die Ventileinheiten werden anschließend am Behälter angebracht.
Formulierung 4

Tabletten, die jeweils 60 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:

Wirkstoff	60 mg
Stärke	45 mg
Mikrokristalline Cellulose	35 mg
Polyvinylpyrrolidon (als 10% Lösung in Wasser)	4 mg
Natriumcarboxymethylstärke	4,5 mg
Magnesiumstearat	0,5 mg
Talkum	1 mg
Gesamt	150 mg

Der Wirkstoff, die Stärke und die Cellulose werden durch ein Nr. 45 Mesh U.S. Sieb gegeben und sorgfältig vermischt. Die wässrige Lösung, die Polyvinylpyrrolidon enthält, wird mit dem entstehenden Pulver vermischt und das Gemisch wird anschließend durch ein Nr. 14 Mesh U.S. Sieb gegeben. Die so hergestellten Granula werden bei 50°C getrocknet und durch ein Nr. 18 Mesh U.S. Sieb gegeben. Die Natriumcarboxymethylstärke, das Magnesiumstearat und das Talkum werden, nachdem sie vorher durch ein Nr. 60 Mesh U.S. Sieb gegeben wurden, zu den Granula gegeben und nach dem Mischen in einer Tablettenmaschine unter Bildung von Tabletten gepresst, die jeweils 150 mg wiegen.
Formulierung 5
Kapseln, die jeweils 80 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:

Wirkstoff 80 mg

Stärke 59 mg

Mikrokristalline Cellulose 59 mg

Magnesiumstearat 2 mg

Gesamt 200 mg
Der Wirkstoff, die Cellulose, die Stärke und das Magnesiumstearat werden gemischt, durch ein Nr. 45 Mesh U.S. Sieb gegeben und in Hartgelatinekapseln in 200 mg Mengen abgefüllt.
Formulierung 6
Zäpfchen, die jeweils 225 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:

Wirkstoff 225 mg

Gesättigte Fettsäureglyceride 2 000 mg

Gesamt 2 225 mg
Der Wirkstoff wird durch ein Nr. 60 Mesh U.S. Sieb gegeben und in den gesättigten Fettsäureglyceriden suspendiert, die vorher bei möglichst geringer Hitze geschmolzen werden. Das Gemisch wird anschließend in eine Zäpfchenform mit einer nominalen Kapazität von 2 g gegossen und abgekühlt.
Formulierung 7
Suspensionen, die jeweils 50 mg des Wirkstoffs pro 5 ml Dosis enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:

Wirkstoff 50 mg

Natriumcarboxymethylcellulose 50 mg

Sirup 1,25 ml

Benzoesäurelösung 0,10 ml

Geschmacksstoff q.v.

Farbstoff q.v.

Gereinigtes Wasser auf gesamt 5 ml
Der Wirkstoff wird durch ein Nr. 45 Mesh U.S. Sieb gegeben und mit Natriumcarboxymethylcellulose und Sirup vermischt, um eine glatte Paste zu erhalten. Die Benzoesäurelösung, der Geschmacksstoff und der Farbstoff werden mit einem Anteil Wasser vermischt, und unter Rühren zugegeben. Anschließend wird ausreichend Wasser zugegeben, um das erforderliche Volumen zu erhalten.
Formulierung 8
Eine intravenöse Formulierung kann folgendermaßen hergestellt werden:

Wirkstoff 100 mg

Isotonische Kochsalzlösung 1 000 ml
Die Lösung der obigen Inhaltsstoffe wird im allgemeinen einem Patienten mit einer Geschwindigkeit von 1 ml pro Minute intravenös verabreicht.
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, ein effektiver und oral wirksamer Faktor Xa Inhibitor zu sein, wird in einem oder mehreren der folgenden Tests oder in anderen Standardtests evaluiert, die dem Fachmann bekannt sind.
Die Hemmung einer Serinprotease des humanen Blutgerinnungssystems oder des fibrinolytischen Systems wie auch von Trypsin durch eine erfindungsgemäße Verbindung wird in vitro für das entsprechende Enzym durch Messen der Inhibitorbindungsaffinität in einem Test gemessen, worin das Enzym ein bestimmtes chromogenes Substrat hydrolysiert, wie dies beispielsweise beschrieben ist von G. F. Smith, D. Gifford-Moore, T. J. Craft, N. Chirgadze, K. J. Ruterbories, T. D. Lindstrom, J. H. Satterwhite, Efegatran: A New Cardiovascular Anticoagulant. New Anticoagulants for the Cardiovascular Patient, R. Pifarre, Herausgeber Hanley & Belfus Inc.: Philadelphia 1997, Seiten 265–300. Die Inhibitorbindungsaffinität wird als scheinbare Assoziationskonstante Kass gemessen, die die hypothetische Gleichgewichtskonstante für die Reaktion zwischen Enzym und der Testinhibitorverbindung (I) ist.
Bequemerweise werden die Enzymhemmkinetiken in Polystyrolplatten mit 96 Vertiefungen ausgeführt und die Reaktionsraten werden aus der Hydrolysegeschwindigkeit von geeigneten p-Nitroanilidsubstraten bei 405 nm mittels eines Thermomax Mikrotiterplattenphotometers von Molecular Devices (San Francisco, CA) bestimmt. Es wird dasselbe Protokoll für alle untersuchten Enzyme befolgt: 50 μl Puffer (0,03 M Tris, 0,15 M NaCl pH 7) in jeder Vertiefung, gefolgt von 25 μl Inhibitorlösung (in 100 Methanol oder in 50% V/V wässrigem Methanol) und 25 μl Enzymlösung, wobei innerhalb von 2 Minuten 150 μl wässrige Lösung des chromogenen Substrats (0,25 mg/ml) zugegeben werden, um die enzymatische Reaktion zu starten. Die Geschwindigkeit der Hydrolysereaktionen des chromogenen Substrats liefert eine lineare Beziehung mit den untersuchten Enzymen, so dass das freie Enzym in den Reaktionsgemischen quantifiziert werden kann. Die Daten werden direkt als Geschwindigkeiten durch das Softmaxprogramm unter Bereitstellung von Berechnungen des [freien Enzyms] bei fest-bindenden Kass Bestimmungen analysiert. Für die Bestimmung des scheinbaren Kass werden 1,34 nM des humanen Faktors Xa zur Hydrolyse von 0,18 mM Bzlle-Glu-Gly-Arg-pNA, 5,9 nM Humanthrombin oder 1,4 nM Rindertrypsin zur Hydrolyse von 0,2 mM BzPhe-Val-Arg-pNA, 3,4 nM Humanplasmin mit 0,5 mM HD-Val-Leu-Lys-pNA, 1,2 nM humanes nt-PA mit 0,81 mM HD-Ile-Pro-Arg-pNA und 0,37 nM Urokinase mit 0,30 mM Pyroglutamyl-Glu-Gly-Arg-pNA verwendet.
Der Kass Wert wird für einen Bereich an Konzentrationen der Testverbindungen berechnet und der Mittelwert wird in Einheiten pro Liter pro Mol angegeben. Im allgemeinen zeigt eine den Faktor Xa hemmende Verbindung der Formel I der vorliegenden Erfindung, wie sie hierin beispielhaft dargestellt wird, einen Kass von 0,03 bis 2,0 × 10⁶ l/mol oder größer. Beispielsweise wird ein Kass Wert von 2,21 × 10⁶ l/mol für die Verbindung von Beispiel 1 gemessen.
Der Faktor Xa Inhibitor sollte vorzugsweise die durch Urokinase, Gewebsplasminogenaktivator (t-PA) und Streptokinase ausgelöste Fibrinolyse schonen. Dies wäre für die therapeutische Verwendung solcher Mittel als Zusatz zu einer thrombolytischen Therapie mit Streptokinase, t-PA oder Urokinase wichtig und für die Verwendung solcher Mittel als endogene Fibrinolyse-schonende (in Hinblick auf t-PA und Urokinase) antithrombotische Mittel. Zusätzlich zur fehlenden Beeinflussung mit der Amidaseaktivität der fibrinolytischen Proteasen, kann ein Sparen am fibrinolytischen System durch die Verwendung von humanen Plasmagerinnseln und ihrer Lyse durch die jeweiligen fibrinolytischen Plasminogenaktivatoren untersucht werden.
Materialien
Hundeplasma wird von bewusst gemischt gekreuzten Jagdhunden (beider Geschlechts Butler Farms, Clyde, New York, USA) durch eine Venenpunktion in 3,8 Prozent Citrat erhalten. Das Fibrinogen wird aus frischem Hundeplasma präpariert und das humane Fibrinogen wird von humanem nicht abgelaufenem ACD Blut bei der Fraktion I-2 gemäß bekannter Verfahren und Spezifikationen präpariert. Smith, Biochem. J., 185, 1–11 (1980) und Smith et al., Biochemistry, 11, 2958–2967, (1972). Humanes Fibrinogen (98 Prozent rein/plasminfrei) stammt von American Diagnostica, Greenwich, Connecticut. Die radioaktive Markierung von Fibrinogen I-2 Präparationen wird wie vorher beschrieben durchgeführt. Smith et al., Biochemistry, 11, 2958–2967 (1972). Die Urokinase wird von Leo Pharmaceuticals, Denmark mit 2200 Ploug Einheiten/Gläschen bezogen. Die Streptokinase wird von Hoechst-Roussel Pharmaceuticals, Somerville, New Jersey bezogen.
Verfahren – Wirkungen auf die Lyse der humanen Plasmagerinnsel durch t-PA
Humane Plasmagerinnsel werden in Mikroteströhrchen durch die Zugabe von 50 μl Thrombin (73 NIH Einheiten/ml) zu 100 μl humanem Plasma gebildet, das 0,0229 μCi 125-Iod-markiertes Fibrinogen enthält. Die Gerinnselauflösung wird durch die Überschichtung der Gerinnsel mit 50 μl Urokinase oder Streptokinase (50, 100 oder 1000 Einheiten/ml) und einer Inkubation für 20 Stunden bei Raumtemperatur untersucht. Nach der Inkubation werden die Röhrchen in einer Beckman Microfuge zentrifugiert. 25 μl Überstand werden in ein Volumen von 1,0 ml 0,03 M Tris/0,15 M NaCl Puffer für die Gammazählung gegeben. Zählkontrollen mit 100% Lyse werden durch das Weglassen von Thrombin (und den Ersatz durch Puffer) erhalten. Die Inhibitoren des Faktors Xa werden auf die mögliche Wechselwirkung mit der Fibrinolyse getestet, indem man die Verbindungen in die Überschichtungslösungen in Konzentrationen von 1, 5 und 10 μg/ml einarbeitet. Grobe Annäherungen der HK₅₀ Werte werden durch lineare Extrapolationen von Datenpunkten zu einem Wert abgeschätzt, der 50 Prozent Lyse für diese bestimmte Konzentration des fibrinolytischen Mittels darstellen würde.
Antikoagulationsaktivität
Materialien
Hundeplasma und Rattenplasma werden von bewusst gemischt gekreuzten Jagdhunden (beider Geschlechts Butler Farms, Clyde, New York, USA) oder von anaesthesierten männlichen Sprague-Dawley Ratten (Harlan Sprague-Dawley, Inc., Indianapolis, Indiana, USA) durch eine Venenpunktion in 3,8 Prozent Citrat erhalten. Das Fibrinogen wird von humanem nicht abgelaufenem ACD Blut bei der Fraktion I-2 gemäß vorheriger Verfahren und Spezifikationen präpariert. Smith, Biochem. J., 185, 1–11 (1980) und Smith et al., Biochemistry, 11, 2958–2967, (1972). Humanes Fibrinogen wird 98 Prozent rein/plasminfrei von American Diagnostica, Greenwich, Connecticut bezogen. Die Koagulationsreagentien ACTIN, Thromboplastin, Innovin und humanes Plasma werden von Baxter Healthcare Corp., Dade Division, Miami, Florida erhalten. Rinderthrombin von Parke-Davis (Detroit, Michigan) wird für Koagulationstests im Plasma verwendet.
Verfahren
Antikoagulationsbestimmungen
Die Koagulationstestverfahren laufen wie vorher beschrieben. Smith et al., Thrombosis Research, 50, 163–174 (1988). Ein CoA-Screener-Koagulationsgerät (American LABor, Inc) wird für alle Koagulationstestmessungen verwendet. Die Prothrombinzeit (PT) wird durch die Zugabe von 0,05 ml Kochsalzlösung und 0,05 ml Thromboplastin-C Reagenz oder rekombinantem Humangewebefaktorreagenz (Innovin) zu 0,05 ml Testplasma gemessen. Die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) wird durch die Inkubation von 0,05 ml Testplasma mit 0,05 ml Actinreagenz für 120 Sekunden gefolgt von 0,05 ml CaCl₂ (0,02 M) gemessen. Die Thrombinzeit (TT) wird durch die Zugabe von 0,05 ml Kochsalzlösung und 0,05 ml Thrombin (10 NIH Einheiten/ml) zu 0,05 ml Testplasma gemessen. Die Verbindungen der Formel I werden zu Human- oder Tierplasma über einen weiten Konzentrationsbereich gegeben, um die Verlängerungswirkungen auf die APTT, PT und TT Tests zu bestimmen. Es werden lineare Extrapolationen durchgeführt, um die Konzentrationen zu bestimmen, die zur Verdoppelung der Gerinnungszeit für jeden Test erforderlich sind.
Tiere
Männliche Sprague Dawley Ratten (350–425 g, Harlan Sprague Dawley Inc., Indianapolis, IN) werden mit Xylazin (20 mg/kg, s.c.) und Ketamin (120 mg/kg, s.c.) anaesthesiert und auf einem mit Wasser geheizten Kissen gehalten (37°C). Die Jugularvene wird kanüliert, um Infusionen zu ermöglichen.
Arterio-venöses Shuntmodell
Die linke Jugularvene und die rechte Arteria carotis werden mit 20 cm langen Polyethylen PE 60 Schläuchen kanüliert. Ein 6 cm langer zentraler Abschnitt eines größeren Sch auchs (PE 190) wird mit einem Baumwollfaden (5 cm) im Lumen zwischen den längeren Abschnitten per Reibung befestigt, um den arterio-venösen Shuntkreislauf zu vervollständigen. Das Blut zirkuliert für 15 Minuten durch den Shunt bevor der Faden sorgfältig entfernt und gewogen wird. Das Gewicht eines nassen Fadens wird vom Gesamtgewicht des Fadens und des Thrombus abgezogen (siehe J. R. Smith, Br. J. Pharmacol., 77: 29, 1982).
FeCl₃ Modell einer arteriellen Verletzung
Die Carotisarterien werden über eine ventrale cervikale Inzision entlang der Mittellinie isoliert. Ein Thermoelement wird unter jede Arterie plaziert und die Gefäßtemperatur wird kontinuierlich auf einem Bandschreiber aufgezeichnet. Ein Cuff eines Schlauchs (0,058 ID × 0,077 OD × 4 mm, Baxter Med. Grade Silicone), der längs aufgeschnitten ist, wird um jede Carotis direkt über dem Thermoelement plaziert. FeCl₃ Hexahydrat wird in Wasser gelöst und die Konzentration (20 Prozent) wird als tatsächliches Gewicht des isolierten FeCl₃ angegeben. Um die Arterie zu verletzen und eine Thrombose zu induzieren werden 2,85 μl in den Cuff pipettiert, um die Arterie über der Thermoelementsonde zu benetzen. Die arterielle Okklusion wird durch einen rapiden Temperaturabfall angezeigt. Die Zeit bis zur Okklusion wird in Minuten angegeben und stellt die vergangene Zeit zwischen der Verabreichung des FeCl₃ und des rapiden Abfalls der Gefäßtemperatur dar (siehe K. D. Kurz, Thromb. Res. 60: 269, 1990).
Koagulationsparameter
Die Plasmathrombinzeit (TT) und die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) werden mit einem Fibrometer gemessen. Das Blut wird aus einem Jugularkatheter entnommen und in Spritzen gesammelt, die Natriumcitrat enthalten (3,8 Prozent, 1 Teil auf 9 Teile Blut). Um TT zu messen, wird Rattenplasma (0,1 ml) mit Kochsalzlösung (0,1 ml) und Rinderthrombin (0,1 ml, 30 E/ml in Tris-Puffer, Parke Davis) bei 37°C gemischt. Für die APTT werden Plasma (0,1 ml) und APTT Lösung (0,1 ml Organon Teknika) für 5 Minuten inkubiert (37°C) und CaCl₂ (0,1 ml, 0,025 M) wird zum Starten der Koagulation zugegeben. Die Tests werden doppelt ausgeführt und gemittelt.
Index der Bioverfügbarkeit
Die Bioverfügbarkeitsstudien können folgendermaßen ausgeführt werden. Die Verbindungen werden als wässrige Lösungen männlichen Fischer Ratten intravenös (iv) mit 5 mg/kg über eine Schwanzveneninjektion und oral (po) an nüchterne Tiere mit 20 mg/kg durch Füttern verabreicht. Man erhält serielle Blutproben nach 5, 30, 120 und 240 Minuten nach der intravenösen Verabreichung der Dosis und nach 1, 2, 4 und 6 Stunden nach einer oralen Dosierung. Das Plasma wird auf eine Arzneimittelkonzentration unter Verwendung eines HPLC Verfahrens analysiert, das C8 Bond Elute (Varion) Kartuschen für eine Probenvorbereitung und einen Methanol/30 nM Ammoniumacetatpuffer (pH 4) Gradienten umfasst, der für jede Verbindung optimiert ist. Die prozentuale orale Bioverfügbarkeit wird durch die folgende Gleichung berechnet:
worin AUC die Fläche unter der Kurve ist, die aus dem Plasmaspiegel der Verbindung über den Zeitverlauf des Experiments nach einer oralen (AUC po) und intravenösen (AUC iv) Dosierung berechnet wird.
Verbindungen
Die Lösungen der Verbindungen werden täglich frisch in normaler Kochsalzlösung hergestellt und werden als Bolus injiziert oder 15 Minuten vor und während der experimentellen Pertubation infundiert, die im arteriovenösen Shuntmodell 15 min und im FeCl₃ Modell der arteriellen Verletzung und im spontanen Thrombolysemodell 60 min beträgt. Das Bolusinjektionsvolumen beträgt 1 ml/kg für i.v. und 5 ml/kg für p.o. und das Infusionsvolumen beträgt 3 ml/h.
Statistiken
Die Ergebnisse werden als Mittel ± SEM ausgedrückt. Es wird eine Einwegsanalyse der Varianz verwendet, um statistisch signifikante Unterschiede festzustellen und dann wird der Dunnett's Test angewendet, um zu bestimmen, welche Mittel unterschiedlich sind. Die Signifikanzgrenze für die Zurückweisung der Nullhypothese von gleichen Mittelwerten ist P < 0,05.
Tiere
Männliche Hunde (Beagles, 18 Monate – 2 Jahre, 12–13 kg, Marshall Farms, North Rose, New York 14516) lässt man über Nacht fasten und füttert sie mit zertifizierter Prescription Diet von Purina (Purina Mills, St. Louis, Missouri) 240 Minuten nach der Dosisverabreichung. Wasser ist frei verfügbar. Die Raumtemperatur wird zwischen 66–74°F gehalten, die Luftfeuchtigkeit beträgt 45–50 Prozent relative Luftfeuchte und es wird von 6 Uhr bis 18 Uhr beleuchtet.
Pharmakokinetisches Modell
Die Testverbindung wird unmittelbar vor der Dosierung formuliert, indem man sie in steriler 0,9 prozentiger Kochsalzlösung in einer 5 mg/ml Präparation auflöst. Den Hunden wird eine einzelne 2 mg/kg Dosis der Testverbindung durch orale Verabreichung gegeben. Blutproben (4,5 ml) werden aus der Vena cephalica 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4 und 6 Stunden nach der Dosisverabreichung entnommen. Proben werden in citratisierten Vacutainerröhrchen gesammelt und vor der Reduzierung auf das Plasma durch Zentrifugation auf Eis gehalten. Die Plasmaproben werden durch HPLC MS analysiert. Die Plasmakonzentration der Testverbindung wird aufgezeichnet und zur Berechnung der pharmakokinetischen Parameter verwendet: Eliminationsgeschwindigkeitskonstante, Ke, totale Clearance, Clt, Verteilungsvolumen, V_D, Zeit der maximalen Plasmakonzentration der Testverbindung, T_max, maximale Konzentration der Testverbindung von T_max, C_max, Plasmahalbwertszeit, t_0,5, die Fläche unter der Kurve, A.U.C, und den Teil der Testverbindung, der absorbiert wurde, F.
Hundemodell der Koronararterienthrombose
Die operative Vorbereitung und instrumentelle Ausstattung der Hunde erfolgt, wie dies in Jackson et al., Circulation, 82, 930–940 (1990) beschrieben wurde. Gemischt-gekreuzte Jagdhunde (6–7 Monate alt, beider Geschlechts, Butler Farms, Clyde, New York, USA) werden mit Natriumpentobarbital (30 mg/kg intravenös, i.v.) anaesthesiert, intubiert und mit Raumluft beatmet. Das Differenzvolumen und die Atemgeschwindigkeit werden eingestellt, um die PO₂, PCO₂ und pH Werte des Bluts innerhalb der normalen Grenzen zu halten. Subdermale Nadelelektroden werden zur Aufzeichnung eines Leit II EKG eingeführt.
Die linke Jugularvene und die Arteria carotis communis werden durch einen mediolateralen Halsschnitt auf der linken Seite isoliert. Der arterielle Blutdruck (ABP) wird kontinuierlich mit einem vorkalibrierten Millar-Umwandler (Modell MPC-500, Millar Instruments, Houston, TX, USA) gemessen, der in die Arteria carotis eingeführt wurde. Die Jugularvene wird zur Blutprobenentnahme während des Experiments kanüliert. Zusätzlich werden die femoralen Venen beider Hinterbeine zur Verabreichung der Testverbindung kanüliert.
Es wird eine Thorakotomie auf der linken Seite im fünften intercostalen Raum durchgeführt und das Herz wird in einem perikardialen Drahtgestell aufgehängt. Es wird ein 1 bis 2 cm Segment der linken circumflexen Koronararterie (LCX) proximal zur ersten diagonalen ventrikulären Hauptverzweigung isoliert. Eine Anodenelektrode, die mit einer 26 Gauge Nadel versehen wurde (Teflon-beschichtet, silberbeschichteter 30 Gauge Kupferdraht), mit einer Länge von 3–4 mm wird in die LCX eingeführt und mit der Intimaoberfläche der Arterie in Kontakt gebracht (wird am Ende des Experiments bestätigt). Der stimulierende Kreislauf wird durch die Plazierung einer Kathode an einer subkutanen Stelle (s.c.) vervollständigt. Ein einstellbarer Plastikverschluss wird um die LCX über die Region der Elektrode plaziert. Eine vorkalibrierte elektromagnetische Flusssonde (Carolina Medical Electronics, King, NC, USA) wird um die LCX proximal zur Anode zum Messen des koronaren Blutflusses (CBF) plaziert. Der Verschluss wird zur Herstellung einer 40–50 prozentigen Hemmung der hyperämischen Blutflussreaktion eingestellt, die nach 10 Sekunden mechanischer Okklusion der LCX beobachtet wird. Alle hämodynamischen und EKG Messungen werden mit einem Datenaufnahmesystem (Modell M3000, Modular Instruments, Malvern, PA, USA) aufgezeichnet und analysiert.
Thrombusbildung und Verabreichungsplan der Verbindung
Eine elektrolytische Verletzung der Intima der LCX wird durch Anlegen eines Gleichstroms (DC) von 100 μA an die Anode hergestellt. Der Strom wird für 60 Minuten aufrechterhalten und dann abgebrochen, ob das Gefäß verschlossen ist oder nicht. Die Thrombusbildung läuft spontan bis die LCX total verschlossen ist (bestimmt als Null CBF und Anstieg im S-T Segment). Die Verabreichung der Verbindung wird begonnen, nachdem der verschließende Thrombus für eine Stunde reifen konnte. Eine 2 Stunden dauernde Infusion der erfindungsgemäßen Verbindungen in Dosen von 0,5 und 1 mg/kg/Stunde wird gleichzeitig mit einer Infusion eines thrombolytischen Mittels begonnen (beispielsweise Gewebsplasminogenaktivator, Streptokinase, APSAC). Die Reperfusion wird für 3 Stunden nach einer Verabreichung der Testverbindung verfolgt. Eine Reokklusion der Koronararterien nach einer erfolgreichen Thrombolyse, die für mehr als 30 Minuten anhält, wird als Null CBF definiert.
Hämatologie und Bestimmung der Zielblutungszeit
Bestimmungen der gesamten Blutzellen, des Hämoglobins und der Hämotokritwerte werden in einer 40 μl Probe citratisierten (3,8 Prozent) Bluts (1 Teil Citrat:9 Teile Blut) mit einem Hämatologieanalysegerät bestimmt (Cell-Dyn 900, Sequoia-Turner, Mount View, CA, USA) Zahnfleischzielblutungszeiten werden mit einer Simplate II Blutungszeitvorrichtung bestimmt (Organon Teknika Durham, N. C., USA). Die Vorrichtung wird verwendet, um zwei horizontale Schnitte in das Zahnfleisch entweder des oberen oder des unteren Kiefers des Hundes zu machen. Jeder Schnitt ist 3 mm breit und 2 mm tief. Die Schnitte werden gemacht und es wird eine Stoppuhr zur Bestimmung verwendet, wie lange die Blutung dauert. Es wird ein Baumwolltupfer verwendet, um das Blut aufzusaugen, wenn es aus dem Schnitt sickert. Die Zielblutungszeit ist die Zeit vom Schnitt bis zur Beendigung der Blutung. Die Blutungszeiten werden direkt vor der Verabreichung der Testverbindung (0 min), 60 min bei der Infusion, bei Beendigung der Verabreichung der Testverbindung (120 min) und am Ende des Experiments bestimmt.
Alle Daten werden durch Einwegsanalyse der Varianz (ANOVA) gefolgt von einem Student-Neuman-Kuels post hoc T Test analysiert, um die Signifikanzgrenze zu bestimmen. Wiederholungs ANOVA Messungen werden zur Bestimmung der signifikanten Unterschiede zwischen den Zeitpunkten während der Experimente verwendet. Die Werte sind per Definition mindestens ab der Grenze von p < 0,05 statistisch unterschiedlich. Alle Werte sind Mittelwerte ± SEM. Alle Untersuchungen werden gemäß den Richtlinien der American Physiological Society durchgeführt. Weitere Details, die die Verfahren betreffen, sind in Jackson et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 21, 587–599 (1993) beschrieben.
Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen, Symbole und Ausdrücke haben die folgenden Bedeutungen:

Boc: = t-Butoxycarbonyl
Cbz: = Benzyloxycarbonyl
DCC: = Dicyclohexylcarbodiimid
DMF: = Dimethylformamid
DMSO: = Dimethylsulfoxid
EtOAc: = Ethylacetat
Et₂O: = Diethylether
EtOH: = Ethanol
Fmoc: = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
Fmoc-OSu: = 9-Fluorenylmethyl-N-succinimidylcarbonat
HOAc: = Essigsäure
HOAt: = 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol
HOBt: = 1-Hydroxybenzotriazol
HPLC: = Hochleistungsflüssigchromatographie
MS: = Massenspektrum
RP-HPLC: = Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie
TFA: = Trifluoressigsäure
THF: = Tetrahydrofuran
TLC: = Dünnschichtchromatographie

Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung weiter zu erläutern und sollen nicht als Beschränkungen aufgefasst werden.
Die R_f Werte in den Beispielen werden durch Silicageldünnschichtchromatographie (Kieselgel 60 F-254) in den folgenden Systemen bestimmt:

(A) Chloroform–Methanol–Essigsäure (135:15:1),
(B) Chloroform–Methylalkohol (9:1),
(C) Chloroform–Ethylacetat (8:2),
(D) Chloroform–Ethylacetat (1:1).

Beispiel 1 Herstellung von 3-[(6-Indolyl)carbonyl]amino-1-[(1-(4-pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonyl]pyrrolidinhydrochloridsalz
A. 1-Cbz-3-(t-Butyloxycarbonyl)aminopyrrolidin
Zu einer Lösung aus 3-(t-Butyloxycarbonyl)aminopyrrolidin (5,0 g, 26,8 mmol) in THF (40 ml) wird Triethylamin (3,7 ml, 26,8 mmol) gefolgt von der Zugabe von Benzylchlorformiat (3,8 ml, 26,8 mmol) langsam gegeben. Nachdem das Reaktionsgemisch für 24 h bei Raumtemperatur gerührt wurde, wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Lösemittel wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in EtOAc gelöst und nacheinander mit 1 N NaHCO₃ (100 ml), 1,5 N Zitronensäure (100 ml) und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum unter Bildung der Titelverbindung (7,13 g, 83%) zur Trockne konzentriert.
TLC R_f (C) 0,41.
MS 321 (M + H)⁺.
Analyse für C₁₇H₂₄N₂O₄:
Berechnet: C 63,73, H 7,55, N 8,74. Gefunden: C 64,01, H 7,39, N 8,71.
B. 1-Cbz-3-[(6-Indolyl)carbonyl]aminopyrrolidin
Die obige Verbindung von Teil A (3,15 g, 9,8 mmol) wird in einen Kolben gegeben, der Trifluoressigsäure (30 ml) und Anisol (3,0 ml) enthält, und bei 0°C für 20 min gerührt. Die Reaktion wird im Vakuum ohne Erhitzen konzentriert und Diethylether (100 ml) wird zugegeben. Der entstehende Feststoff wird filtriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuum unter Bildung von 3,07 g des Amin TFA Salzes getrocknet.
Das Aminsalz (3,07 g) wird in EtOAc (200 ml) gelöst und nacheinander mit 1 N NaHCO₃ und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum zu einem amorphen Feststoff eingedampft. Der Feststoff (0,6 g, 2,72 mmol) wird in DMF (20 ml) gelöst und bei Raumtemperatur gerührt. Zu der Lösung werden Indol-6-carbonsäure (0,71 g, 2,72 mmol), HOBt (0,37 g, 2,72 mmol) und DCC (0,56 g, 2,72 mmol) gegeben. Die Reaktion wird für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der entstehende Niederschlag wird durch Filtration entfernt und die Mutterlauge wird im Vakuum zu einem Öl konzentriert. Das Öl wird in EtOAc (250 ml) gelöst und nacheinander mit 1 N NaHCO₃, Wasser, 1,5 N Zitronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum zu einem amorphen Feststoff der rohen Titelverbindung (0,53 g, 53%) eingedampft.
TLC R_f (D) 0,21.
MS 364 (M + H)⁺
Analyse für C₂₁H₂₁N₃O₃:
Berechnet: C 69,41, H 5,82, N 11,56. Gefunden: C 69,37, H 6,08, N 11,50.
C. 1-Cbz-3-[[1-(t-Butyloxycarbonyl)indol-6-yl]carbonyl]aminopyrrolidin
Der amorphe rohe Feststoff aus Teil B (0,99 g, 2,72 mmol) wird in CH₃CN (20 ml) und CH₂Cl₂ (5 ml) gelöst. Zu der Lösung werden 4-Dimethylaminopyridin (0,33 g, 2,72 mmol), Diisopropylethylamin (0,47 ml, 2,72 mmol) und Di-tert-butyldicarbonat (0,66 ml, 2,86 mmol) gegeben. Danach wird das Reaktionsgemisch für 24 Stunden gerührt und das Reaktionsgemisch wird im Vakuum zu einem Öl konzentriert. Das Öl wird in EtOAc (250 ml) gelöst und nacheinander mit 1 N NaHCO₃, Wasser, 1,5 N Zitronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum zu einem amorphen Feststoff der rohen Titelverbindung (1,25 g, 99%) eingedampft.
TLC R_f (D) 0,62
MS 464 (M + H)⁺.
Analyse für C₂₆H₂₉N₃O₅:
Berechnet: C 67,37, H 6,31, N 9,07. Gefunden: C 67,66, H 6,26, N 9,22.
D. 3-[(6-Indolyl)carbonyl]amino-1-[[1-(4-pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonyl]pyrrolidinhydrochlorid
Die amorphe rohe Feststoffverbindung von Teil C (1,25 g, 2,69 mmol), die in Ethanol (100 ml) und 1 N HCl (2,7 ml, 2,69 mmol) gelöst ist, wird in Anwesenheit von 5% Pd/C Katalysator (0,30 g) bei Umgebungstemperatur und Umgebungsdruck hydriert. Nachdem die Reaktion vollständig ist, wird der Katalysator durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird im Vakuum konzentriert und über Nacht getrocknet. Der Feststoff wird mit Et₂O behandelt, filtriert und unter Bildung des 3-[[1-(t-Butyloxycarbonyl)indol-6-yl]carbonylamino]pyrrolidinhydrochloridsalzes (0,93 g) getrocknet.
In einen getrennten Kolben wird [1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonsäure (0,76 g, 3,69 mmol) in CH₂Cl₂ (30 ml) suspendiert und Thionylchlorid (0,4 ml, 5,53 mmol) wird zugegeben. Die Reaktion wird für 2 h am Rückfluss erhitzt und das Lösemittel wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in CH₂Cl₂ (25 ml) gelöst und zu einer Lösung gegeben, die das obige Hydrochloridsalz (0,93 g), Diisopropylethylamin (0,43 ml, 2,46 mmol) und Pyridin (3 ml) enthält. Das Reaktionsgemisch wird für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Die entstehende Lösung wird im Vakuum konzentriert und über Nacht unter Bildung eines Öls (2,53 g) getrocknet. Das Öl (2,53 g) wird in einen Kolben gegeben, der Trifluoressigsäure (20 ml) und Anisol (2,0 ml) enthält und bei 0°C (30 min) gerührt. Die Reaktion wird im Vakuum ohne Erhitzen konzentriert und Diethylether (100 ml) wird zugegeben. Der entstehende Feststoff wird filtriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuum unter Bildung von 1,65 g der Titelverbindung getrocknet. Die 1,65 g des rohen Produkts werden mittels einer 5 × 25 cm Chromatographiesäule mit C₁₈ Harz gereinigt und es wird ein Gradient an steigenden Konzentrationen von 0,01% HCl/CH₃CN (5% bis 40%) zur Elution des Produkts aus der Säule verwendet. Die Fraktionen werden gesammelt und auf der Basis des analytischen RP HPLC Profils vereinigt und unter Bildung der reinen Titelverbindung als weißer Feststoff (0,747 g, 56%) lyophilisiert.
MS 418 (M + H)⁺.
Beispiel 2 Herstellung des 3S-[(6-Indolyl)carbonyl]amino-1-[[1-(4-pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonyl]pyrrolidindihydrochloridsalzes
A. 1-t-Butyloxycarbonylindol-6-carbonsäure
Zu einer Suspension aus Indol-6-carbonsäure (2,5 g, 15,5 mmol) in CH₃CN (5 ml) und DMF (20 ml) werden 4-Dimethylaminopyridin (1,9 g, 15,5 mmol), Diisopropylethylamin (2,7 ml, 15,5 mmol) und Ditert-butyldicarbonat (3,7 ml, 16,3 mmol) gegeben. Nachdem das Reaktionsgemisch für 24 h bei Raumtemperatur gerührt wurde, wird das Reaktionslösemittel im Vakuum entfernt und der Rückstand wird in 1 N NaHCO₃ (100 ml) und Et₂O (100 ml) suspendiert. Die wässrige Phase wird abgetrennt und mit Et₂O (2 × 200 ml) extrahiert. Die wässrige Phase wird mit 5 N HCl auf pH 2,5 angesäuert und mit EtOAc (500 ml) extrahiert. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum unter Bildung der Titelverbindung (2,35 g, 58%) zur Trockne konzentriert.
TLC R_f (B) 0,49
MS 262 (M + H)⁺
Analyse für C₁₄H₁₅NO₄:
Berechnet: C 64,36, H 5,79, N 5,36. Gefunden: C 66,69, H 5,43, N 6,23.
B. 1-Cbz-3S-(t-Butyloxycarbonyl)aminopyrrolidin
Zu einer Lösung aus 3S-(t-Butyloxycarbonyl)aminopyrrolidin (5,0 g, 26,8 mmol) in THF (40 ml) wird Triethylamin (3,7 ml, 26,8 mmol) gegeben, gefolgt von der langsamen Zugabe von Benzylchlorformiat (3,8 ml, 26,8 mmol). Nach dem Rühren des Reaktionsgemisches bei Raumtemperatur für 24 h wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Lösemittel wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in EtOAc gelöst und mit 1 N NaHCO₃ (100 ml), 1,5 N Citronensäure (100 ml) und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum unter Bildung der Titelverbindung (7,13 g, 83%) zur Trockne konzentriert.
TLC R_f (C) 0,41.
MS 321 (M + H)⁺.
Analyse für C₁₇H₂₄N₂O₄:
Berechnet: C 63,73, H 7,55, N 8,74. Gefunden: C 64,01, H 7,39, N 8,71.
C. 1-Cbz-3S-[[1-(t-Butyloxycarboxy)indol-6-yl]carbonyl]aminopyrrolidin
Zu einer Lösung der Verbindung von Teil B (6,95 g, 21,7 mmol) in Eisessig HOAc (40 ml) wird Anisol (4 ml) gegeben und HCl Gas wird für 20 min in die Reaktion geblasen. Das Reaktionslösemittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand wird mit Et₂O (200 ml) behandelt. Der Feststoff wird filtriert und unter Bildung von 5,7 g an 1-Cbz-3S-Aminopyrrolidinhydrochloridsalz getrocknet.
Zu einer Lösung des Hydrochloridsalzes (0,49 g, 1,91 mmol) in DMF (20 ml) werden 1-t-Butyloxycarbonylindol-6-carbonsäure (0,5 g, 1,91 mmol), Diisopropylethylamin (0,33 ml, 1,91 mmol), HOBt (0,26 g, 1,91 mmol) und DCC (0,4 g, 1,91 mmol) gegeben. Die Reaktion wird für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Der entstehende Niederschlag wird durch Filtration entfernt und die Mutterlauge wird im Vakuum zu einem Öl konzentriert. Das entstehende Öl wird in EtOAc (250 ml) gelöst und nacheinander mit 1 N NaHCO₃, Wasser, 1,5 N Zitronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum unter Bildung der rohen Titelverbindung (0,87 g, 98%) zu einem amorphen Feststoff eingedampft.
TLC R_f (D) 0,64
MS 464 (M + H)⁺.
D. 3S-[(6-Indolyl)carbonyl]amino-1-[[1-(4-pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonyl]pyrrolidindihydrochlorid
Die amorphe rohe Feststoffverbindung von Teil C (0,69 g, 1,49 mmol), die in Ethanol (80 ml) und 1 N HCl (1,5 ml, 1,53 mmol) gelöst ist, wird in Anwesenheit von 10% Pd/C Katalysator (0,35 g) bei Umgebungstemperatur und unter Druck hydriert. Nachdem die Reaktion vollständig ist, wird der Katalysator durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird im Vakuum konzentriert und über Nacht getrocknet. Der Feststoff wird mit Et₂O behandelt, filtriert und unter Bildung des Hydrochloridsalzes (0,44 g) getrocknet.
In einen separaten Kolben wird die Verbindung [1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonsäure (0,18 g, 0,86 mmol) in CH₂Cl₂ (25 ml) suspendiert und Thionylchlorid (0,94 ml, 1,29 mmol) wird zugegeben. Die Reaktion wird für 2 h am Rückfluss erhitzt und das Lösemittel wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in CH₂Cl₂ (25 ml) gelöst und zu einer Lösung die das Hydrochloridsalz (0,21 g, 0,57 mmol), Diisopropylethylamin (0,1 ml, 0,57 mmol) und Pyridin (2 ml) enthält, gegeben. Die Reaktion wird für 48 h bei Raumtemperatur gerührt. Die entstehende Lösung wird im Vakuum konzentriert und über Nacht unter Bildung eines Öls (0,63 g) getrocknet. Das Öl (0,63 g) wird in einen Kolben gegeben, der Trifluoressigsäure (10 ml) und Anisol (1,0 ml) enthält und bei 0°C (30 min) gerührt. Die Reaktion wird im Vakuum ohne Erhitzen konzentriert und Diethylether (100 ml) wird zugegeben. Der entstehende Feststoff wird filtriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuum unter Bildung von 0,34 g der Titelverbindung getrocknet. Es werden 0,34 g des rohen Produkts mittels einer 5 × 25 cm Chromatographiesäule mit C₁₈ Harz gereinigt und ein Gradient an steigenden Konzentrationen von 0,01% HCl/CH₃CN (5% bis 35%) wird zur Elution des Produkts aus der Säule verwendet. Die Fraktionen werden gesammelt und auf der Basis des analytischen RP-HPLC Profils vereinigt und unter Bildung der reinen Titelverbindung als weißer Feststoff (0,095 g, 37%) lyophilisiert.
MS 418 (M + H)⁺.
Analyse für C₂₄H₂₇N₅O₂ × 2HCl:
Berechnet: C 58,78, H 5,96, N 14,28. Gefunden: C 60,95, H 6,31, N 14,71.
Beispiel 3 Herstellung des 3R-[(6-Indolyl)carbonyl]]amino-1-[[1-(4-pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonyl]pyrrolidindihydrochloridsalzes
A. 1-t-Butyloxycarbonylindol-6-carbonsäure
Die Titelverbindung wird gemäß dem in Beispiel 2A beschriebenen Verfahren hergestellt.
B. 1-Cbz-3R-(t-Butyloxycarbonyl)aminopyrrolidin
Zu einer Lösung aus 1-Cbz-3R-(t-Butyloxycarbonyl)aminopyrrolidin (5,0 g, 26,8 mmol) in THF (40 ml) wird Triethylamin (3,7 ml, 26,8 mmol) gefolgt von der Zugabe von Benzylchlorformiat (3,8 ml, 26,8 mmol) langsam gegeben. Nach dem Rühren des Reaktionsgemisches für 24 h bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Lösemittel wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in EtOAc gelöst und mit 1 N NaHCO₃ (100 ml), 1,5 N Zitronensäure (100 ml) und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum unter Bildung der Titelverbindung (7,39 g, 86%) zur Trockne konzentriert.
TLC R_f (C) 0,41
MS 321 (M + H)⁺
Analyse für C₁₇H₂₄N₂O₄:
Berechnet: C 63,73, H 7,55, N 8,74. Gefunden: C 63,51, H 7,43, N 8,65.
C. 1-Cbz-3R-[[1-(t-Butyloxycarbonyl)indol-6-yl]carbonyl]aminopyrrolidin
Zu einer Lösung der Verbindung von Teil B (7,21 g, 22,5 mmol) in Eisessig (40 ml) wird Anisol (4 ml) gegeben und HCl Gas wird für 20 min in die Reaktion geblasen. Das Reaktionslösemittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand wird mit Et₂O (200 ml) behandelt. Der Feststoff wird filtriert und unter Bildung von 5,9 g des 1-Cbz-3R-Aminopyrrolidinhydrochloridsalzes getrocknet. Zu einer Lösung des Hydrochloridsalzes (0,49 g, 1,91 mmol) in DMF (20 ml) werden die Verbindung von Teil A (0,5 g, 1,91 mmol), Diisopropylethylamin (0,33 ml, 1,91 mmol), HOBt (0,26 g, 1,91 mmol) und DCC (0,4 g, 1,91 mmol) gegeben. Die Reaktion wird für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Der entstehende Niederschlag wird durch Filtration entfernt und die Mutterlauge wird im Vakuum zu einem Öl konzentriert. Das entstehende Öl wird in EtOAc (250 ml) gelöst und nacheinander mit 1 N NaHCO₃, Wasser, 1,5 N Zitronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum zu einem amorphen Feststoff der rohen Titelverbindung (0,88 g, 99%) eingedampft.
TLC R_f (D) 0,64.
MS 464 (M + H)⁺.
D. 3R-[3-[(6-Indolyl)carbonyl]amino-1-[[1-(4-pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonyl]pyrrolidindihydrochlorid
Die amorphe rohe Feststoffverbindung von Teil C (0,71 g, 1,53 mmol), die in Ethanol (80 ml) und 1 N HCl (1,5 ml, 1,53 mmol) gelöst ist, wird in Anwesenheit von 10% Pd/C Katalysator (0,28 g) bei Umgebungstemperatur und unter Umgenungsdruck hydriert. Nachdem die Reaktion vollständig ist, wird der Katalysator durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird im Vakuum konzentriert und über Nacht getrocknet. Der Feststoff wird mit Et₂O behandelt, filtriert und unter Bildung des 3R-[(1-t-Butyloxycarbonyl)indol-6-yl-carbonyl]aminopyrrolidinhydrochloridsalzes (0,43 g) getrocknet.
In einen separaten Kolben wird die Verbindung [1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonsäure (0,18 g, 0,86 mmol) in CH₂Cl₂ (25 ml) suspendiert und Thionylchlorid (0,94 ml, 1,29 mmol) wird zugegeben. Die Reaktion wird für 2 h am Rückfluss erhitzt und das Lösemittel wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in CH₂Cl₂ (25 ml) gelöst und zu einer Lösung die das obige Hydrochloridsalz (0,21 g, 0,57 mmol), Diisopropylethylamin (0,1 ml, 0,57 mmol) und Pyridin (2 ml) enthält, gegeben. Die Reaktion wird für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Die entstehende Lösung wird im Vakuum konzentriert und über Nacht unter Bildung eines Öls (0,58 g) getrocknet. Das Öl (0,58 g) wird in einen Kolben gegeben, der Trifluoressigsäure (15 ml) und Anisol (1,5 ml) enthält und bei 0°C (30 min) gerührt. Die Reaktion wird im Vakuum ohne Erhitzen konzentriert und Diethylether (100 ml) wird zugegeben. Der entstehende Feststoff wird filtriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuum unter Bildung von 0,31 g der Titelverbindung getrocknet. Es werden 0,31 g des rohen Produkts mittels einer 5 × 25 cm Chromatographiesäule mit C₁₈ Harz gereinigt und ein Gradient an steigenden Konzentrationen von 0,01% HCl/CH₃CN (5% bis 35%) wird zur Elution des Produkts aus der Säule verwendet. Die Fraktionen werden gesammelt und auf der Basis des analytischen RP-HPLC Profils vereinigt und unter Bildung der reinen Titelverbindung als weißer Feststoff (0,078 g, 3%) lyophilisiert.
MS 418 (M + H)⁺.
Analyse für C₂₄H₂₇N₅O₂ × 2HCl:
Berechnet: C 59,96, H 5,96, N 14,28. Gefunden: C 59,96, H 6,29, N 14,57.
Beispiel 4 Herstellung von 3-[(5-Benzimidazolyl)carbonyl]amino-1-[(1-(4-pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonyl]pyrrolidindihydrochlorid
A. 1-t-Butyloxycarbonylbenzimidazol-5-carbonsäure
Zu einer Suspension aus Benzimidazol-5-carbonsäure (5,0 g, 30,8 mmol) in DMF (50 ml) werden 4-Dimethylaminopyridin (3,77 g, 30,8 mmol), Diisopropylethylamin (5,37 ml, 30,8 mmol) und Di-tert-Butyldicarbonat (7,5 ml, 32,4 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird anfänglich für 30 min auf 60°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur gekühlt und für 24 h gerührt. Das Reaktionslösemittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand wird in 1 N NaHCO₃ (100 ml) und Et₂O (100 ml) suspendiert. Die wässrige Phase wird abgetrennt und mit Et₂O (2 × 200 ml) extrahiert. Die wässrige Phase wird mit 5 N HCl auf pH 2,8 angesäuert und mit EtOAc (500 ml) extrahiert. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum unter Bildung der Titelverbindung (5,6 g, 70%) zur Trockne konzentriert.
TLC R_f (B) 0,52
MS 263 (M + H)⁺
B. 1-Cbz-(t-Butyloxycarbonyl)aminopyrrolidin
Die Titelverbindung kann gemäß dem in Beispiel 1A beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
C. 1-Cbz-3-[[1-(t-Butyloxycarbonyl)benzimidazol-5-yl]carbonyl]aminopyrrolidin
Zu einer Lösung der Verbindung von Teil B (6,95 g, 21,7 mmol) in Eisessig (40 ml) wird Anisol (4 ml) gegeben und HCl Gas wird für 20 min in die Reaktion geblasen. Das Reaktionlösemittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand wird mit Et₂O (200 ml) behandelt. Der Feststoff wird filtriert und unter Bildung von 5,7 g an 1-Cbz-3-Aminopyrrolidinhydrochloridsalz getrocknet.
Zu einer Lösung des Hydrochloridsalzes (0,49 g, 1,91 mmol) in DMF (20 ml) werden 1-t-Butyloxycarbonylbenzimidazol-5-carbonsäure (0,5 g, 1,91 mmol), Diisopropylethylamin (0,33 ml, 1,91 mmol), HOBt (0,26 g, 1,91 mmol) und DCC (0,4 g, 1,91 mmol) gegeben. Die Reaktion wird für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Der entstehende Niederschlag wird durch Filtration entfernt und die Mutterlauge wird im Vakuum zu einem Öl konzentriert. Das entstehende Öl wird in EtOAc (250 ml) gelöst und nacheinander mit 1 N NaHCO₃, Wasser, 1,5 N Zitronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum zu einem amorphen Feststoff der rohen Titelverbindung (0,78 g, 88%) eingedampft.
TLC R_f (B) 0,64.
D. 3-[(5-Benzimidazolyl)carbonyl]amino-1-[[1-(4-pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonyl]pyrrolidindihydrochlorid
Der amorphe rohe Feststoff der Verbindung von Teil C (0,75 g, 1,61 mmol), der in Ethanol (80 ml) und 1 N HCl (1,6 ml, 1,61 mmol) gelöst ist, wird in Anwesenheit des 5% Pd/C Katalysators (0,53 g) bei Umgebungstemperatur und unter Umgebungsdruck hydriert. Nachdem die Reaktion vollständig ist, wird der Katalysator durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird im Vakuum konzentriert und über Nacht getrocknet. Der Feststoff wird mit Et₂O behandelt, filtriert und unter Bildung des 3-[[1-(t-Butyloxycarbonyl)benzimidazol-5-yl]carbonyl]aminopyrrolidinhydrochloridsalzes (0,44 g) getrocknet.
In einem separaten Kolben werden CH₂Cl₂ (25 ml) und Thionylchlorid (0,94 ml, 1,29 mmol) zu 1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-ylcarbonsäure (0,18 g, 0,86 mmol) gegeben, das in CH₂Cl₂ (10 ml) suspendiert ist. Das Reaktionsgemisch wird für 2 h am Rückfluss erhitzt und das Lösemittel wird im Vakuum entfernt. Das entstehende Öl wird in CH₂Cl₂ (20 ml) gelöst und das Hydrochloridsalz (0,21 g, 0,57 mmol) von oben wird zugegeben, gefolgt von Diisopropylethylamin (0,1 ml, 0,57 mmol) und Pyridin (3 ml). Die Reaktion wird für 24 h bei Raumtemperatur gerührt und das Lösemittel wird im Vakuum unter Bildung eines braunen Feststoffs (0,49 g) entfernt.
Der Feststoff (0,49 g) wird in einen Kolben gegeben, der Trifluoressigsäure (15 ml) und Anisol (1,5 ml) enthält und bei 0°C für 20 min gerührt. Die Reaktion wird im Vakuum ohne Erhitzen konzentriert und Diethylether (100 ml) wird zugegeben. Der entstehende Feststoff wird filtriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuum unter Bildung von 0,49 g der rohen Titelverbindung getrocknet. Die 0,49 g des rohen Produkts werden mittels einer 5 × 25 cm Chromatographiesäule mit C₁₈ Harz gereinigt und ein Gradient von steigenden Konzentrationen an 0,01% HCl/CH₃CN (2% bis 25%) wird unter Elution des Produkts aus der Säule verwendet. Die Fraktionen werden gesammelt und auf der Basis des analytischen RP-HPLC Produkts vereinigt und unter Bildung der reinen Titelverbindung als weißer Feststoff (0,073 g, 9%) lyophilisiert.
MS 419 (M + H)⁺.
Analyse für C₂₃H₂₆N₆O₂ × 2HCl × 1,5H₂O:
Berechnet: C 53,29, H 6,03, N 16,21. Gefunden: C 53,30, H 6,15, N 16,00.
Beispiel 5 Herstellung von 3-[[1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonyl]amino-1-[(6-indolyl)carbonyl]pyrrolidindihydrochlorid
A. 1-t-Butyloxycarbonylindol-6-carbonsäure
Die Titelverbindung wird gemäß dem in Beispiel 2A beschriebenen Verfahren hergestellt.
B. 1-Cbz-3-(t-Butyloxycarbonyl)aminopyrrolidin
Die Titelverbindung wird gemäß dem in Beispiel 1A beschriebenen Verfahren hergestellt.
C. 1-Cbz-3-[(9-Fluorenyl)methoxycarbonyl]aminopyrrolidin
Zu einer Lösung der Verbindung von Teil B (6,95 g, 21,7 mmol) in Eisessig (40 ml) werden Anisol (4 ml) und HCl Gas für 20 min in die Reaktion geblasen. Das Reaktionslösemittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand wird mit Et₂O (200 ml) behandelt. Der Feststoff wird filtriert und unter Bildung von 5,7 g des 1-Cbz-3-Aminopyrrolidinhydrochloridsalzes getrocknet. Zu einer Lösung des Hydrochloridsalzes (1,5 g, 5,8 mmol) in Dioxan (20 ml) und Wasser (20 ml) werden Fmoc-OSu (1,97 g, 5,84 mmol) und Natriumcarbonat (0,61 g, 5,84 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum konzentriert und mit EtOAc (200 ml) verdünnt. Die entstehende Lösung wird nacheinander mit 1 N NaHCO₃, Wasser, 1,5 N Zitronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum zu einem amorphen Feststoff der rohen Titelverbindung (2,6 g, 99%) eingedampft.
TLC R_f (C) 0,44
MS 443 (M + H)⁺.
Analyse für C₂₇H₂₆N₂O₄:
Berechnet: C 73,29, H 5,92, N 6,33. Gefunden: C 73,27, H 6,01, N 6,50.
D. 3-[(Fluorenyl)methoxycarbonyl]amino-1-[[1-(t-butyloxycarbonyl)indol-6-yl]carbonyl]pyrrolidin
Die Feststoffverbindung von Teil C (2,58 g, 5,8 mmol), die in Ethanol (125 ml) und 1 N HCl (5,8 ml, 5,8 mmol) gelöst ist, wird in Anwesenheit von 5% Pd/C Katalysator (0,7 g) bei Umgebungstemperatur und Umgebungsdruck hydriert. Nachdem die Reaktion vollständig ist, wird der Katalysator durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird im Vakuum konzentriert und über Nacht getrocknet. Der Feststoff wird mit Et₂O behandelt, filtriert und unter Bildung von 3-[(Fluorenyl)methoxycarbonyl]aminopyrrolidinhydrochloridsalz (1,65 g) getrocknet.
Zu einer Lösung des Hydrochloridsalzes (0,66 g, 1,91 mmol) in DMF (20 ml) wird die Verbindung von Teil A (0,5 g, 1,91 mmol), Diisopropylethylamin (0,33 ml, 1,91 mmol), HOBt (0,26 g, 1,91 mmol) und DCC (0,4 g, 1,91 mmol) gegeben. Die Reaktion wird für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Der entstehende Niederschlag wird durch Filtration entfernt und die Mutterlauge wird im Vakuum zu einem Öl konzentriert. Das entstehende Öl wird in EtOAc (250 ml) gelöst und nacheinander mit 1 N NaHCO₃, Wasser, 1,5 N Zitronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum zu einem amorphen Feststoff der rohen Titelverbindung (0,73 g, 69%) eingedampft.
TLC R_f (D) 0,40.
E. 3-[[1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonyl]amino-1-[(6-indolyl)carbonyl]pyrrolidindihydrochlorid
Die amorphe rohe Feststoffverbindung aus Teil D (0,7 g, 1,27 mmol) wird in 20% Piperidin in DMF (20 ml) gelöst und bei Raumtemperatur für 25 min gerührt. Nachdem die Reaktion vollständig ist, wird die Lösung im Vakuum konzentriert. Der Feststoff wird mit Hexan behandelt, filtriert und unter Bildung des freien 1-[1-(Butyloxycarbonyl)indol-6-yl)carbonyl]-3-aminopyrrolidins (0,39 g) getrocknet.
In einen separaten Kolben wird die Verbindung [1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonsäure (0,21 g, 1,0 mmol) in CH₂Cl₂ (25 ml) suspendiert und Thionylchlorid (0,11 ml, 1,5 mmol) wird zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird am Rückfluss erhitzt (2 h) und das Lösemittel wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in CH₂Cl₂ (25 ml) gelöst und zu einer Lösung gegeben, die die freie Base (0,22 g, 0,67 mmol) in CH₂Cl₂ (15 ml) und Pyridin (3 ml) enthält. Das Reaktionsgemisch wird für 48 h bei Raumtempe ratur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum konzentriert und über Nacht unter Bildung eines Öls (0,49 g) getrocknet.
Das Öl (0,49 g) wird in einen Kolben gegeben, der Trifluoressigsäure (20 ml) und Anisol (2,0 ml) enthält, und bei 0°C für 25 min gerührt. Die Reaktion wird im Vakuum ohne Erhitzen konzentriert und Diethylether (100 ml) wird zugegeben. Der entstehende Feststoff wird filtriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuum unter Bildung von 0,49 g der Titelverbindung getrocknet. Die 0,49 g des rohen Produkts werden mittels einer 5 × 25 cm Chromatographiesäule mit C₁₈ Harz gereinigt und ein Gradient von steigenden Konzentrationen von 0,01% HCl/CH₃CN (5% bis 40%) wird unter Elution des Produkts aus der Säule verwendet. Die Fraktionen werden gesammelt und auf der Basis des analytischen RP HPLC Profils vereinigt und unter Bildung der reinen Titelverbindung als weisser Feststoff (0,050 g, 2%) lyophilisiert.
MS 418 (M + H)⁺.
Analyse für C₂₄H₂₇N₅O₂ × 2HCl × 0,5H₂O:
Berechnet: C 57,72, H 6,05, N 14,02. Gefunden: C 57,14, H 5,76, N 13,76.
Beispiel 6 Herstellung von 3S-[(6-Indolyl)carbonyl)]amino-1-[[1-(4-pyridinyl)piperidin-4-yl]methoxycarbonyl]pyrrolidin
A. 1-t-Butyloxycarbonylindol-6-carbonsäure
Die Titelverbindung wird gemäß den in Beispiel 2A beschriebenen Verfahren hergestellt.
B. 1-Cbz-3S-(t-Butyloxycarbonyl)aminopyrrolidin
Die Titelverbindung wird gemäß den in Beispiel 2B beschriebenen Verfahren hergestellt.
C. 1-Cbz-3S-[[1-(t-Butyloxycarbonyl)indol-6-yl]carbonyl]aminopyrrolidin
Die Titelverbindung wird gemäß den in Beispiel 2C beschriebenen Verfahren, hergestellt.
D. 3S-[(6-Indolyl)carbonyl)]amino-1-[[1-(4-pyridinyl)piperidin-4-yl]methoxycarbonyl]pyrrolidin
Die amorphe rohe Feststoffverbindung von Teil C (0,69 g, 1,5 mmol), die in Ethanol (80 ml) und 1 N HCl (1,5 ml, 1,5 mmol) gelöst ist, wird in Anwesenheit von 10% Pd/C Katalysator (0,3 g) bei Umgebungstemperatur und Umgebungsdruck hydriert. Nachdem die Reaktion vollständig ist, wird der Katalysator durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird im Vakuum konzentriert und über Nacht getrocknet. Der Feststoff wird mit Et₂O behandelt, filtriert und unter Bildung von 3S-[[1-(t-Butyloxycarbonyl)indol-6-yl]carbonyl]aminopyrrolidinhydrochloridsalz (0,44 g) getrocknet.
In einen separaten Kolben wird zu CH₂Cl₂ (20 ml) Phosgen (20% in Toluol, 0,28 ml, 0,55 mmol) gegeben und die Lösung wird bei Raumtemperatur gerührt. [1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-methanol (0,11 g, 0,55 mmol), das in CH₂Cl₂ (10 ml) suspendiert ist, wird zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 5 min gerührt und dann wird das Hydrochloridsalz (0,2 g, 0,55 mmol) von oben zugegeben, gefolgt von Triethylamin (0,08 ml, 0,55 mmol). Das Reaktionsgemisch wird für 1,5 h gerührt und das Lösemittel wird im Vakuum unter Bildung eines braunen Feststoffs (0,47 g) entfernt. Der Feststoff (0,47 g) wird in einen Kolben gegeben, der Trifluoressigsäure (15 ml) und Anisol (1,5 ml) enthält und bei 0°C für 25 min gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum ohne Erhitzen konzentriert und Diethylether (100 ml) wird zugegeben. Der entstehende Feststoff wird filtriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuum unter Bildung von 0,38 g der Titelverbindung getrocknet. Es werden 0,38 g des rohen Produkts mittels einer 5 × 25 cm Chromatographiesäule mit C₁₈ Harz gereinigt und ein Gradient an steigenden Konzentrationen von 0,01% HCl/CH₃CN (2% bis 30%) wird zur Elution des Produkts aus der Säule verwendet. Die Fraktionen werden gesammelt und auf der Basis des analytischen RP-HPLC Profils vereinigt und unter Bildung der reinen Titelverbindung als weißer Feststoff (0,044 g, 2%) lyophilisiert.
MS 448 (M + H)⁺.
Analyse für C₂₅H₂₉N₅O₃ × 2HCl:
Berechnet: C 57,69, H 6,00, N 13,46. Gefunden: C 57,50, H 6,05, N 13,16
Beispiel 7 Herstellung von (2S,4S)-4-[[1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonyl]amino-1-[(6-indolyl)carbonyl]pyrrolidin-2-carbonsäure
A. 1-t-Butyloxycarbonylindol-6-carbonsäure
Die Titelverbindung wird gemäß dem in Beispiel 2A beschriebenen Verfahren hergestellt.
B. (2S,4S)-4-[[(9-Fluorenyl)methoxy]carbonyl]amino-1-[(1-(t-butyloxycarbonyl)indol-6-yl]carbonyl]pyrrolidin-2-carbonsäure
(2S,4S)-4-(Fmoc-amino)-1-Boc-pyrrolidin-2-carbonsäure (0,5 g, 1,1 mmol) wird in einen Kolben gegeben, der Trifluoressigsäure (20 ml) und Anisol (2,0 ml) enthält und bei 0°C für 20 min gerührt. Die Reaktion wird im Vakuum ohne Erhitzen konzentriert und Diethylether (100 ml) wird zugegeben. Der entstehende Feststoff wird filtriert mit Diethylether gewaschen und im Vakuum unter Bildung von (0,5 g, 97%) des rohen TFA Salzes von (2S,4S)-4-(Fmoc-Amino)pyrrolidin-2-carbonsäure getrocknet.
In einen separaten Kolben wird die Verbindung aus Beispiel 7, Teil A, (0,14 g, 0,54 mmol) in CH₂Cl₂ (10 ml) suspendiert und Pyridin (0,044 ml, 0,54 mmol) wird zugegeben. Zu dem Reaktionsgemisch wird Oxalylchlorid (0,47 ml, 0,54 mmol) gegeben und das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 5 min gerührt. Das Reaktionslösemittel wird im Vakuum entfernt. Das entstehende Öl wird in CH₂Cl₂ (10 ml) gelöst und DMSO (10 ml) wird zu der Lösung des obigen TFA Salzes (0,25 g, 0,55 mmol), CH₂Cl₂ (5 ml) und Pyridin (0,13 ml, 1,6 mmol) gegeben. Danach wird das Reaktionsgemisch für 4 h gerührt und das Reaktionslösemittel wird im Vakuum entfernt. Das entstehende Öl wird in EtOAc (250 ml) gelöst und nacheinander mit 1,5 N Zitronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum zu einem amorphen Feststoff der rohen Titelverbindung (0,13 g, 39%) eingedampft.
C. (2S,4S)-4-[[1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonyl]amino-1-[(6-indolyl)carbonyl]pyrrolidin-2-carbonsäure
Der amorphe rohe Feststoff der Verbindung von Teil B (0,13 g, 0,22 mmol) wird in 20% Piperidin in DMF (10 ml) gelöst und bei Raumtemperatur für 25 min gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum konzentriert und Diethylether (100 ml) wird zugegeben. Der entstehende Feststoff wird filtriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuum unter Bildung von 0,08 g der rohen (2S,4S)-4-Amino-1-[1-(t-butyloxycarbonyl)indol-6-yl]carbonylpyrrolidin-2-carbonsäure getrocknet.
In einen separaten Kolben wird die Verbindung [1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-yl]carbonsäure (0,07 g, 0,32 mmol) in CH₂Cl₂ (25 ml) suspendiert und Thionylchlorid (0,04 ml, 0,48 mmol) wird zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 2 h am Rückfluss erhitzt und das Lösemittel wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in CH₂Cl₂ (25 ml) gelöst und zu einer Lösung die das obige Amin (0,08 g, 0,21 mmol) und Pyridin (3 ml) enthält, gegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Die entstehende Lösung wird im Vakuum konzentriert und über Nacht unter Bildung eines Öls (0,08 g) getrocknet. Das Öl (0,08 g) wird in einen Kolben gegeben, der Trifluoressigsäure (15 ml) und Anisol (1,5 ml) enthält und bei 0°C für 30 min gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum ohne Erhitzen konzentriert und Diethylether (100 ml) wird zugegeben. Der entstehende Feststoff wird filtriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuum unter Bildung von 0,2 g der Titelverbindung getrocknet. Es werden 0,2 g des rohen Produkts mittels einer 5 × 25 cm Chromatographiesäule mit C₁₈ Harz gereinigt und ein Gradient an steigenden Konzentrationen von 0,01% HCl/CH₃CN (2% bis 40%) wird zur Elution des Produkts aus der Säule verwendet. Die Fraktionen werden gesammelt und auf der Basis des analytischen RP-HPLC Profils vereinigt und unter Bildung der reinen Titelverbindung als weißer Feststoff (0,006 g, 6%) lyophilisiert.

Claims

Verbindung der Formel I (oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon)
worin eines von R¹ und R² für Q¹ steht und das andere von R¹ und R² für Q² steht, worin Q¹ für 2-Pyridinyl (das einen Methyl-, Methoxy-, Methylthio-, Fluor- oder Chlorsubstituenten an der Position 5 tragen kann) oder 3-Pyridinyl steht (das einen Methyl-, Fluor- oder Chlorsubstituenten an der Position 6 tragen kann) oder Q¹ für Phenyl steht, das einen, zwei oder drei Substituenten an den Positionen 3, 4 oder 5 tragen kann, die unabhängig ausgewählt sind aus Halogen, Cyano, Carbamoyl, Aminomethyl, Methyl, Methoxy, Difluormethoxy, Hydroxymethyl, Formyl, Vinyl, Dimethylamino, Amino, Hydroxy und 3,4-Methylendioxy und das Phenyl zusätzlich einen 2-Chlor- oder 2-Fluorsubstituenten tragen kann, oder Q¹ steht für
worin -E-G-NH- für -CH₂-CH₂-NH-, -C(R^a)=CH-NH-, -C(R^a)=N-NH-, -N=CH-NH- oder -N=N-NH- steht, worin R^a für Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom oder Methyl steht, Q² steht für
worin R^m für C₁-C₄ Alkyl, Cyclohexyl, 4-Tetrahydropyranyl, Phenyl, 4-Pyridyl oder 2-Pyrimidinyl steht, wenn R² für Q¹ steht, R³ dann für H, COOH, N-(Methyl)benzolsulfonylamino oder Phenyl steht (das an der Position 3 oder 4 mit Methyl, Chlor oder Fluor substituiert sein kann) und R⁴ für H steht, und wenn R² für Q² steht, R³ dann für H steht und R⁴ für H, COOH, Methyl, N-(Methyl)benzolsulfonylamino, unsubstituiertes Phenyl oder Phenyl steht (das an der Position 3 oder 4 mit Methyl, Chlor oder Fluor substituiert sein kann), oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz der Verbindung der Formel I.
Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 (oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon)
worin eines von R¹ und R² für Q¹ steht und das andere von R¹ und R² für Q² steht, worin Q¹ für 2-Pyridinyl (das einen Methyl-, Methoxy-, Methylthio-, Fluor- oder Chlorsubstituenten an der Position 5 tragen kann) oder 3-Pyridinyl steht (das einen Methyl-, Fluor- oder Chlorsubstituenten an der Position 6 tragen kann) oder Q¹ für Phenyl steht, das einen, zwei oder drei Substituenten an den Positionen 3, 4 oder 5 tragen kann, die unabhängig ausgewählt sind aus Halogen, Cyano, Carbamoyl, Aminomethyl, Methyl, Methoxy, Difluormethoxy, Hydroxymethyl, Formyl, Vinyl, Dimethylamino, Amino, Hydroxy und 3,4-Methylendioxy und das Phenyl zusätzlich einen 2-Chlor- oder 2-Fluorsubstituenten tragen kann, oder Q¹ steht für
worin -E-G-NH- für -CH₂-CH₂-NH-, -C(R^a)=CH-NH-, -C(R^a)=N-NH-, -N=CH-NH- oder -N=N-NH- Steht, worin R^a für Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom oder Methyl steht, Q² steht für
worin R^m für C₁-C₄ Alkyl, Cyclohexyl, 4-Tetrahydropyranyl, Phenyl, 4-Pyridyl oder 2-Pyrimidinyl steht, wenn R² für Q¹ steht, R³ dann für H, COOH, N-(Methyl)benzolsulfonylamino oder Phenyl steht (das an der Position 3 oder 4 mit Methyl, Chlor oder Fluor substituiert sein kann) und R⁴ für H steht, und wenn R² für Q² steht, R³ dann für H steht und R⁴ für H, COOH, Methyl, N-(Methyl)benzolsulfonylamino, unsubstituiertes Phenyl oder Phenyl steht (das an der Position 3 oder 4 mit Methyl, Chlor oder Fluor substituiert sein kann), oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz der Verbindung der Formel I.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin für eine Alkylgruppe oder den Alkylteil einer Alkyl-enthaltenden Gruppe C₁-C₄ Alkyl für Methyl, Ethyl, Isopropyl oder 2-Butyl steht und Halogen für Brom, Chlor oder Fluor steht.
Verbindung nach Anspruch 3; worin für eine Alkylgruppe oder den Alkylteil einer Alkyl-enthaltenden Gruppe C₁-C₄ Alkyl für Ethyl, Isopropyl oder 2-Butyl steht und Halogen für Fluor oder Chlor steht.
Verbindung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, worin eines von R¹ und R² für Q¹ steht und das andere von R¹ und R² für Q² steht, Q¹ steht für
worin -E-G-NH- für -CH₂=CH₂-NH- steht, Q² steht für
worin R^m für 4-Pyridyl steht, wenn R² für Q¹ steht, R³ dann für H oder COOH steht und R⁴ für H steht und wenn R² für Q² steht, R³ dann für H steht und R⁴ für H steht.
Verbindung nach Anspruch 2, worin R¹ für Q² steht, R² für Q¹ steht, Q¹ für 6-Indolyl steht, Q² für 1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-yl steht, R³ für H steht, und R⁴ für H steht.
Verbindung nach Anspruch 2, worin R¹ für Q¹ steht, R² für Q² steht, Q¹ für 6-Indolyl steht, Q² für 1-(4-Pyridinyl)piperidin-4-yl steht, R³ für H steht, und R⁴ für H steht.
Pharmazeutisch annehmbares Salz einer Verbindung der Formel I nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das ein Säureadditionssalz ist, welches aus einer basischen Verbindung der Formel I und einer Säure hergestellt wird, die ein pharmazeutisch annehmbares Anion liefert oder ein Salz, das aus einer sauren Verbindung der Formel I und einer Base hergestellt wird, die ein pharmazeutisch annehmbares Kation liefert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon nach Anspruch 1 oder 2 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer neuen Verbindung der Formel I (oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon)
nach Anspruch 1 oder 2, das ausgewählt ist aus (A) für eine Verbindung der Formel I, worin R¹ für Q¹ steht, Acylierung der Aminogruppe einer entsprechenden Verbindung der Formel II
mittels einer entsprechenden Säure der Formel Q²-COOH (III) oder eines aktivierten Derivats hiervon, (B) für eine Verbindung der Formel I, worin R² für Q¹ steht, Acylierung der Aminogruppe einer entsprechenden Verbindung der Formel IV
mittels einer entsprechenden Säure der Formel Q²-COOH (III) oder eines aktivierten Derivats hiervon, wonach bei jedem der obigen Verfahren die Schutzgruppe entfernt wird, wenn eine funktionelle Gruppe mittels einer Schutzgruppe geschützt ist, wonach bei jedem der obigen Verfahren, wenn ein pharmazeutisch annehmbares Salz einer Verbindung der Formel I erforderlich ist, dies erhalten wird durch die Umsetzung der basischen Form einer basischen Verbindung der Formel I mit einer Säure, die ein physiologisch annehmbares Gegenion ergibt, oder der sauren Form einer sauren Verbindung der Formel I mit einer Base, die ein physiologisch annehmbares Gegenion liefert, und worin, falls nichts anderes angegeben ist, Q¹, Q², R¹, R², R³ und R⁴ die in Anspruch 1 oder 2 angegebenen Bedeutungen aufweisen.
Verbindung der Formel II
worin Q¹ und R⁴ die in Anspruch 2 angegebenen Bedeutungen haben.
Verbindung der Formel IV
worin R², R³ und R⁴ die in Anspruch 2 angegebenen Bedeutungen haben.
Verbindung der Formel I (oder ein Salz hiervon) nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung als antithrombotisches Mittel.