DE60108950T2

DE60108950T2 - Verfahren und vorrichtung zur plasmidgewinnung mit hilfe von ultrafiltration

Info

Publication number: DE60108950T2
Application number: DE60108950T
Authority: DE
Inventors: Thacher Jack LEONARD
Original assignee: Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 2000-04-13
Filing date: 2001-03-29
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2021-03-30
Also published as: WO2001079486A2; JP2003530854A; WO2001079486A3; EP1272627A2; ES2184661T1; US20030203453A1; EP1272627B1; US20020001836A1; US6759233B2; ES2184661T3; DE1272627T1; DE60108950D1; JP4150187B2; US7297534B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren der Plasmidgewinnung, welches Filtrieren durch konstante Druckdifferenz beinhaltet, und eine Apparatur, um dies zu tun. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren der Plasmidzubereitung und die Vorrichtung, um dieses Verfahren zu bewerkstelligen.
Hintergrund der Erfindung
Das herkömmliche Verfahren zur Plasmidgewinnung aus einem Bakterienlysat nach alkalischer Lyse ist allgemein als ein Verfahren des Bindens, Waschens und Eluierens bekannt. Dieses Verfahren gewinnt Plasmid aus einem filtrierten Lysat mittels Binden an einen Glasfaserfilter in Gegenwart eines chaotropen Mittels, wie Kaliumiodid. Dieses chaotrope Mittel bewirkt die Bindung des Plasmids an die Glasfasern, während die meisten anderen Zellbestandteile hindurchpassieren. Der Glasfaserfilter wird dann mit Ethanol (70 Gew.-% oder höher) gewaschen, um das chaotrope Mittel zu entfernen. Überschüssiges Ethanol wird von der Unterseite der Filterplatte durch Abtupfen, Zentrifugieren oder extensives Vakuumtrocknen entfernt. Das Plasmid wird dann unter Verwendung von Wasser oder einem Puffer mit geringem Salzgehalt von den Glasfasern eluiert.
Dieses Verfahren besitzt viele Nachteile. Zuallererst führt es einen kontaminierenden Stoff (Ethanol) in das System ein, welches schwer vollständig zu entfernen ist. Das verbleibende Ethanol kann die Plasmide oder die an ihnen durchgeführten Tests nachteilig beeinflussen. Zudem ist dies ein zeitaufwendiges Verfahren und es benötigt viele aufeinanderfolgende Stufen. Ferner ist die Kapazität der Glasfasern, die Plasmide zu binden, beschränkt, was die Bindung uneffektiv macht. In ähnlicher Weise ist die Elution von dem Glas nicht vollständig. Es wurde ermittelt, dass einiges Plasmid irreversibel an das Glas bindet. Summa summarum beträgt die Gewinnung des Plasmids oft weniger als 80%, manchmal weniger als 70% der verfügbaren Plasmide.
Die vorliegende Erfindung stellt ein besseres Verfahren und eine bessere Apparatur zur Gewinnung von Plasmiden oder anderer zirkulärer DNA bereit, welches die Einführung neuer kontaminierender Stoffe ausschaltet, höhere Plasmidgewinnungsraten mit höherer Reinheit bereitstellt und viel schneller als das gängige Verfahren ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren des Aufbrechens von Zellen und dann Filtrieren der aufgebrochenen Zellen durch eine oder mehrere Mikrofiltrations(MF)- oder Grobfiltrationsmembranen bereit wie dies in Anspruch 1 beansprucht ist. Die meisten Zelltrümmer werden durch die Membran(en) entfernt und das Verbleibende wird dann durch eine Ultrafiltrations(UF)membran so filtriert, dass die Plasmide oder andere DNA auf der oberen Fläche der UF-Membran zurückgehalten werden, wo sie gewonnen werden.
Es ist bevorzugt, dass das Verfahren eine konstante Druckdifferenz für beide Stufen verwendet, und insbesondere ist es bevorzugt, dass eine negative konstante Druckdifferenz (Vakuum) in beiden Stufen verwendet wird.
Zudem ist eine Apparatur zum Bewirken dieses Verfahrens, wie in Anspruch 14 beansprucht, offenbart. Sie umfasst eine obere Filterplatte, die eine oder mehrere Vertiefungen enthält, wobei jede Vertiefung eine MF- oder Grobfiltrationsmembran darin platziert enthält, vorzugsweise angrenzend an den Boden der Vertiefung(en). Die obere Platte besitzt eine Verbindung zur Versorgung mit einer konstanten Druckdiffe renz. Eine untere Platte, die eine oder mehrere Vertiefungen enthält, ist angebracht, wobei jede Vertiefung eine UF-Membran, vorzugsweise angrenzend an den Boden der Vertiefungen darin platziert aufweist. Die untere Platte besitzt eine Verbindung zur Versorgung mit einer negativen konstanten Druckdifferenz. Unter der unteren Platte befindet sich ein(e) Flüssigabfallsammelvorrichtung oder -abfluss.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Gewinnung von Plasmiden oder anderer DNA bereitzustellen, welches die Stufen umfasst:

(a) ausreichendes Aufbrechen der Zellwände zum Befreien der Zellkomponenten, insbesondere Plasmide oder anderer DNA;
(b) Filtrieren der Zellkomponenten über eine oder mehrere Mikrofiltrations- oder Grobfiltrationsmembranen oder Kombinationen der beiden und Gewinnen des Filtrats;
(c) Filtrieren des Filtrats von (b) über eine oder mehrere Ultrafiltrationsmembranen, um die Plasmide oder andere DNA als zurückgehaltenes Material auf der oberen Oberfläche von einer oder mehreren Ultrafiltrationsmembranen zu hinterlassen; und
(d) Gewinnen der Plasmide oder anderen DNA von der oberen Oberfläche der Ultrafiltrationsmembran.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Gewinnung von Plasmiden oder anderer DNA bereitzustellen, das die Stufen umfasst:

(a) ausreichendes Aufbrechen der Zellwände zum Befreien der Zellkomponenten, insbesondere Plasmide oder anderer DNA;
(b) Filtrieren der Zellkomponenten über eine oder mehrere Mikrofiltrations- oder Grobfiltrationsmembranen oder Kombinationen der beiden unter Verwendung von positivem Druck, um die Filtration durchzuführen, und Gewinnen des Filtrats;
(c) Filtrieren des Filtrats von (b) über eine oder mehrere Ultrafiltrationsmembranen unter Verwendung von negativem Druck, um die Filtration durchzuführen, um die Plasmide oder andere DNA als zurückgehaltenes Material auf der oberen Oberfläche einer oder mehrerer Ultrafiltrationsmembranen zu hinterlassen; und
(d) Gewinnen der Plasmide oder anderen DNA von der oberen Oberfläche der Ultrafiltrationsmembran.

(a) ausreichendes Aufbrechen der Zellwände zum Befreien der Zellkomponenten, insbesondere Plasmide oder anderer DNA;
(b) Filtrieren der Zellkomponenten über eine oder mehrere Mikrofiltrations- oder Grobfiltrationsmembranen oder Kombinationen der beiden unter Verwendung von positivem Druck, um die Filtration durchzuführen, und Gewinnen des Filtrats;
(c) Filtrieren des Filtrats von (b) über eine oder mehrere Ultrafiltrationsmembranen unter Verwendung von positivem Druck, um die Filtration durchzuführen, um die Plasmide oder andere DNA als zurückgehaltenes Material auf der oberen Oberfläche einer oder mehrerer Ultrafiltrationsmembranen zu hinterlassen; und
(d) Gewinnen der Plasmide oder anderen DNA von der oberen Oberfläche der Ultrafiltrationsmembran.

(a) ausreichendes Aufbrechen der Zellwände zum Befreien der Zellkomponenten, insbesondere Plasmide oder anderer DNA;
(b) Filtrieren der Zellkomponenten über eine oder mehrere Mikrofiltrations- oder Grobfiltrationsmembranen oder Kombinationen der beiden unter Verwendung von negativem Druck, um die Filtration durchzuführen, und Gewinnen des Filtrats;
(c) Filtrieren des Filtrats von (b) über eine oder mehrere Ultrafiltrationsmembranen unter Verwendung von positivem Druck, um die Filtration durchzuführen, um die Plasmide oder andere DNA als zurückgehaltenes Material auf der oberen Oberfläche einer oder mehrerer Ultrafiltrationsmembranen zu hinterlassen; und
(d) Gewinnen der Plasmide oder anderen DNA von der oberen Oberfläche der Ultrafiltrationsmembran.

(a) ausreichendes Aufbrechen der Zellwände zum Befreien der Zellkomponenten, insbesondere Plasmide oder anderer DNA;
(b) Filtrieren der Zellkomponenten über eine oder mehrere Mikrofiltrations- oder Grobfiltrationsmembranen oder Kombinationen der beiden unter Verwendung von negativem Druck, um die Filtration durchzuführen, und Gewinnen des Filtrats;
(c) Filtrieren des Filtrats von (b) über eine oder mehrere Ultrafiltrationsmembranen unter Verwendung von negativem Druck, um die Filtration durchzuführen, um die Plasmide oder andere DNA als zurückgehaltenes Material auf der oberen Oberfläche einer oder mehrerer Ultrafiltrationsmembranen zu hinterlassen; und
(d) Gewinnen der Plasmide oder anderen DNA von der oberen Oberfläche der Ultrafiltrationsmembran.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Apparatur zur Gewinnung von Plasmiden oder anderer DNA bereitzustellen, die eine obere Filterplatte mit einer oder mehreren Mikrofiltrations- oder Grobfiltrationsmembranen und eine untere Filterplatte mit einer oder mehreren Ultrafilt rationsmembranen, wobei die obere Filterplatte über der und angrenzend an die untere Filterplatte platziert ist, umfasst.
Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden aus der Beschreibung der Erfindung und den Ansprüchen klar.
In den Zeichnungen
zeigt 1 ein Blockdiagramm eines ersten bevorzugten Verfahrens der vorliegenden Erfindung;
zeigt 2 ein Blockdiagramm des zweiten bevorzugten Verfahrens der vorliegenden Erfindung;
zeigt 3 ein Blockdiagramm eines dritten Verfahrens der vorliegenden Erfindung;
zeigt 4 ein Blockdiagramm eines vierten Verfahrens der vorliegenden Erfindung;
zeigt 5 ein Blockdiagramm eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung;
zeigt 6 eine Apparatur für das Verfahren der vorliegenden Erfindung in einer Querschnittsansicht;
zeigt 7 eine zweite Apparatur zur Bewerkstelligung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in einer Querschnittsansicht.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In 1 wird eine erste Ausführungsform eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt. Die erste Stufe 10 ist das Aufbrechen der betreffenden Zellen, um das Plasmid oder anderes DNA-Material zur Gewinnung freizustellen. Dies kann auf vielerlei Weise gemacht werden. Das häufigste Verfahren ist die Verwendung eines alkalischen Lyseverfahrens wobei eine ein alkalisches Material und Detergens, enthaltende wässrige Flüssigkeit, wie Natriumhydroxid und SDS (Natriumdodecylsulfat), in die resuspendierte Zelllösung unter Bewirken einer Zelllyse eingebracht wird.
Die lysierten Zellen werden dann durch eine oder mehrere Mikroporen- oder Grobfiltrationsmembranen filtriert, 11, um die Zelltrümmer, wie Zellwände, denaturiertes Protein und chromosomale DNA und andere große Zellkomponenten zu entfernen.
Das Filtrat wird dann, entweder oben auf einer Ultrafiltrationsmembran, falls das Verfahren aufeinanderfolgend durchgeführt wird, oder in einem geeigneten Behälter, falls die Stufen getrennt durchgeführt werden, gesammelt.
Das Filtrat wird dann über eine oder mehrere Ultrafiltrationsmembranen filtriert, 12, so dass die Plasmide oder andere DNA oben auf der Ultrafiltrationsmembran gesammelt werden. Das Plasmid oder andere DNA wird dann zur Verwendung gesammelt, 13.
Eine oder mehrere Mikrofiltrationsmembran(en) oder Grobfiltrationsmaterialien können verwendet werden. Typischerweise wird eine bzw. eines verwendet, jedoch können eine Serie aus zwei oder mehreren Membranen zur Entfernung aller Zelltrümmer verwendet werden, insbesondere wenn die Menge der Trümmer hoch ist oder die erste Membran dazu neigt, schnell zu verstopfen. Wenn mehrere Membranen verwendet werden können sie getrennt oder aufeinanderfolgend angeordnet, verwendet werden, wobei es, wenn sie in Folge sind, zu bevorzugen ist, dass die nominale Porengröße jeder folgenden Membranschicht gleich oder geringer ist. In dieser Ausführungsform kann man einen Grobfilter und anschließend einen Mikroporenfilter, zwei Grobfilter oder zwei Mikroporenfilter verwenden.
Typischerweise liegen die nominalen Porengrößen dieser einen oder mehreren Mikroporenmembranen für diese Anwendung im Bereich von etwa 0,01 μm bis etwa 100 μm, zweckmäßigerweise etwa 0,05 μm bis etwa 75 μm und vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 50 μm.
Typischerweise besitzen die Grobfilter nominale Porengrößen von etwa 100 μm bis etwa 1000 μm, zweckmäßigerweise etwa 100 μm bis etwa 500 μm und vorzugsweise etwa 100 bis etwa 250 μm.
Die Mikrofiltrations- und/oder Grobmembran(en) kann/können aus jedem natürlichen oder synthetischen Polymer, Papier, Keramiken oder Metall, wie rostfreier Stahl oder Nickel, gebildet sein. Zur Herstellung von Membranen verwendbare bevorzugte Polymere umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Nitrocellulose, regenerierte Cellulose, Celluloseacetat, Polysulfone, die Polysulfon, Polethersulfon, Polyphenylsulfone und Polyarylsulfone umfassen, Polyvinylidenfluorid, Polyolefine, wie ultrahochmolekulargewichtiges Polyethylen, Polyethylen niedriger Dichte und Polypropylen, Nylon und andere Polyamide, PTFE, thermoplastische fluorierte Polymere, wie Poly(TFE-co-PFAVE), Polycarbonate oder mit Teilchen gefüllte Membranen, wie EMPORE^®-Membranen, erhältlich von 3M aus Minneapolis, Minnesota. Die Membranen können poröse Gussmembranen, gewebte oder nichtgewebte Materialien oder poröse Materialien, die durch andere herkömmliche Membranherstellungsverfahren, wie Track-Etching, gebildet werden, sein. Alle diese Membranen sind auf dem Gebiet bekannt und von einer Vielzahl von Quellen, einschließlich Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, erhältlich.
Falls gewünscht können diese Membranen, um sie hydrophil zu machen, behandelt werden. Derartige Verfahren sind bekannt und umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Pfropfen, Vernetzen oder einfach Polymerisieren hydrophiler Materialien oder Beschichtung auf den Oberflächen der Membranen.
Die Mikrofiltrations- oder Grobfiltrationsstufe kann durch ein herkömmliches Verfahren, wie Zentrifugalkraft, Schwerkraft oder eine konstante Druckdifferenz (wie positiver Druck oder Vakuum), gemäß der Lehre von WO 00/66723 ausgelöst werden.
Eine "konstante Druckdifferenz" bedeutet entweder einen positiven Druck oder negativen (oder Vakuum) Druck. Entgegen dem Druck der Zentrifugalmethode, wobei der Druck im Verlauf der Zeit aufgrund einer Verringerung der Höhe der Flüssigkeit im Kopf ständig abnimmt, kann in einem Verfahren einer konstanten Druckdifferenz der Druck, der auf die Flüssigkeit wirkt, während des Filtrationszyklus konstant bleiben. Zudem kann der Druck, da er von der Höhe der Flüssigkeit im Kopf, auf die er wirkt, unabhängig ist, sogar im Laufe der Zeit erhöht werden, um das Filtrationsverfahren zur vollständigen Durchführung zu treiben. Es liegt auch innerhalb dieser Definition, falls erwünscht, eine Verringerung des Drucks im Laufe der Zeit, zu haben, jedoch ist diese Verringerung, entgegen der Zentrifugation gesteuert und unabhängig der Höhe der Flüssigkeit im Kopf, wodurch eine unbeabsichtigte Durchflussverringerung vermindert oder eliminiert wird.
Bei diesem Verfahren wird eine konstante Druckdifferenzkraft auf die Flüssigkeit in der Vorrichtung angewendet und die konstante Druckdifferenz wird die treibende Kraft für den Filtrationsprozess anstelle der traditionellen g-Kraft der Zentrifugation. Bei der Verwendung einer positiven Druckdifferenz (positiver Druck) wird diese typischerweise an der oberen Seite der Flüssigkeit angewendet, um die Flüssigkeit durch die Membran zu treiben. Wenn eine negative Druckdifferenz oder ein Vakuum verwendet wird, wird der Druck typischerweise auf der Stromabwärtsseite der Membran angewendet, so dass er auf die Unterseite der Flüssigkeit wirkt und sie durch die Membran zieht.
Der Höhe der Kraft (ob positiv oder negativ), die angewendet wird, hängt von einer Zahl von Faktoren ab, zu denen gehören: die Menge der zu filtrierenden Probe, die Art der verwendeten Membran (die Porengröße oder die molekulare Anschlussgrenze der Membran, deren Festigkeit und Dicke), die aktive Filtrationsfläche der Membran, die Geschwindigkeit, mit der die Filtration stattfinden soll, und der Polarisationsgrad der Probe.
Entgegen der Zentrifugenfiltration ist die Filtration mit konstanter Druckdifferenz vollständig unabhängig von der Fähigkeit, eine Kopfhöhe zu erreichen und beizubehalten, was bedeutet, dass das Verfahren nicht typischerweise einem Flussabfall bei nicht-polarisierenden Konzentrationen des gelösten Stoffes unterworfen ist. Typischerweise ist bei geringen Volumina die Konsequenz, dass viel höhere Konzentrationsfaktoren bei mit konstanter Druckdifferenz getriebener Ultrafiltration zu erreichen sind als mit Zentrifugation innerhalb des gleichen Zeitraums zu erreichen ist.
Normalerweise variieren die Flüssigkeitsvolumina bei denen dieses Verfahren verwendet werden kann, wobei ein hoher Wert etwa 2 mm beträgt. Noch typischer wird es bei Volumina von weniger als 1 ml und vorzugsweise unter 0,5 ml (500 μl) verwendet. Es gibt eine Obergrenze bei der aufgrund von ausreichender Kopfhöhe die Zentrifugation genau so schnell wie das Verfahren mit konstanter Druckdifferenz ist (die genaue Höhe ist unter anderen Dingen von der verwendeten Flüssigkeit und der Höhe der konstanten Druckdifferenz und der verwendeten Zentrifugation abhängig). Wie unten im Zusammenhang mit Diafiltration erklärt wird, bestehen jedoch, auch wenn die Raten für die Zentrifugation deutlich schneller sind, andere überzeugende Gründe, trotzdem das Verfahren der vorliegenden Erfindung anstelle von Zentrifugation zu verwenden, da es die Notwendigkeit einer Diafiltration beseitigt oder verringert.
Bei geringeren Volumina ist es jedoch deutlich, dass die Verwendung der konstanten Druckdifferenz deutlich schneller als die der Zentrifugation ist. Der Punkt, an dem das Verfahren der konstanten Druckdifferenz schneller als Zentrifugation ist, wird im Folgenden als "Durchbruchpunkt" bezeichnet. Bei Verwendung geringer Volumina, etwa 0,300 ml, ist das vorliegende Verfahren etwa 60% schneller als Zentrifugation.
Die erhaltene Wirkung kann durch Verändern der Höhe der konstanten Druckdifferenz auf das Verfahren variiert werden. Beispielsweise ergibt eine Erhöhung der konstanten Druckdifferenz auf das 3,5fache (3,5X) gegenüber der normal angewendeten (1X) eine Erhöhung der Filtrationsgeschwindigkeit auf das fast 6fache (6X). Zudem tritt der Durchbruchpunkt bei etwa 1 Minute mit der erhöhten (3,5X) Differenz im Vergleich zu 7 Minuten für den mit unveränderter (1X) konstanter Druckdifferenz auf.
Ein Flussabfall kann bei der Filtration von Materialien, die einen hohen Grad polarisierender Eigenschaften aufweisen, auftreten. In diesen Fällen kann etwas Flussabfall während der Filtration durch das vorliegende Verfahren beobachtet werden, jedoch ist dies unabhängig von der Kopfhöhe und es liegt an den innewohnenden Eigenschaften des zu filternden Materials. Dies bedeutet, dass kleinere Ausgangsmengen der Probe verwendet werden können und hohe Grade der Ultrafiltration und Gewinnung bei zufriedenstellenden Raten auch in Gegenwart derartiger polarisierender Materialien erreicht werden können, was mit Zentrifugalverfahren nicht immer möglich ist.
Die konstante Druckdifferenz kann negativ, beispielsweise ein verminderter Druck (beispielsweise unter atmosphäri schem Druck oder ein Vakuum) oder positiv (beispielsweise über dem atmosphärischem Druck) sein.
Typischerweise kann eine negative konstante Druckdifferenz oder Vakuumkraft von etwa 5 inch Hg bis etwa 27 inch Hg (169– 914 Millibar) verwendet werden. Vorzugsweise können von etwa 10 bis etwa 27 inch (338 bis 914 Millibar) verwendet werden. Die Höhe der Vakuumkraft kann durch den Verwender leicht in Anpassung an die erwünschten Parameter des Systems, die erwünschte Ultrafiltrationsrate und die Probe die man verwendet, variiert werden.
Typischerweise kann eine positiv konstante Druckdifferenz von etwa 5 bis etwa 80 psi verwendet werden. Höhere Drücke können mit Vorrichtungen die die Festigkeit besitzen, derartigen Drücken zu widerstehen, verwendet werden. Vorzugsweise können etwa 40 bis etwa 60 psi verwendet werden. Die Höhe des positiven Drucks kann durch den Verwender ohne weiteres in Anpassung an die erwünschten Parameter des Systems, die erwünschte Ultrafiltrationsrate und die Probe die er/sie verwendet, variiert werden.
Die Menge an zu filtrierender Ausgangsflüssigkeit kann stark variieren. Dieses Verfahren wurde jedoch vor allem als bei kleinen Flüssigkeitsvolumina, die typischerweise keine geeignete Kopfhöhe erzeugen oder aufrechterhalten können, verwendbar befunden. Derartige Volumina betragen allgemein unter etwa 1000 μl, vorzugsweise weniger als etwa 500 μl und können sogar weniger als 1 μl sein.
Ein zusätzlicher Vorteil des Verfahrens ist, dass die Notwendigkeit einer Diafiltration (Verringerung von Salzen oder kontaminierenden Stoffen) durch wiederholte Verdünnungen in ultrareinem Wasser oder Lösemittel und anschließende Zentrifugenfiltration zum Entfernen der solvatisierten Verunreinigungen und Salze) verringert oder beseitigt werden kann, wodurch dieses Verfahren besonderen Nutzen für das Gebiet der biologischen Forschung bietet, wo derartige Diafiltrationsstufen zeitaufwendig sind und bei nicht vollständiger Durchführung die erhaltenen Ergebnisse verfälschen können.
Es ist bekannt, dass ein einzelner Durchgang eines Zentrifugationsverfahrens nicht alle Salze und andere Verunreinigungen aus einer biologischen Probe entfernt. Daher ist das normale Protokoll die Verdünnung des Retentats in ultrareinem Wasser oder einem Lösemittel und Wiederzentrifugieren des Materials ein oder mehrere Male, um ein ausreichendes Volumen dieser Verunreinigungen herauszuziehen.
Es wurde festgestellt, dass bei der normalen Zentrifugation, wenn das Flüssigkeitsvolumen über der Membran unter eine bestimmte Menge, typischerweise unter 1 μl Volumen, abfällt, Verdampfung der Flüssigkeit, nicht Ultrafiltration, das primäre Phänomen, das für die Entfernung der Flüssigkeit verantwortlich ist, ist. Dies liegt an der geringen Kopfhöhe, die einen geringen, falls überhaupt, Druck, der auf die verbleibende Flüssigkeit angewendet wird, erzeugt, und wodurch wenig, falls überhaupt, Filtration auftritt. Deshalb wird jede Verunreinigung einfach auf der Oberfläche des Diafiltrationsfilters dehydratisiert. Wenn ein rekonstituierende Flüssigkeit zu dem Retentat zugegeben wird, werden diese Materialien einfach in der rekonstituierenden Flüssigkeit gelöst und verbleiben in dem Retentat. Dies erklärt die Notwendigkeit mehrerer Diafiltrationsstufen.
Es wurde festgestellt, dass bei der Verwendung des Verfahrens einer konstanten Druckdifferenz Filtration das dominante Mittel zur Entfernung dieser Verunreinigungen bleibt (da es, um zu funktionieren, von der Kopfhöhe unabhängig ist), wodurch bewirkt wird, dass die Verunreinigungen durch die Membram und aus dem Retentat in einem viel höheren Grad, als durch Zentrifugation erreicht werden kann, passieren. Im Wesentlichen alle Verunreinigungen werden durch das gegenwärtige Verfahren in einem einzigen Durchgang entfernt, während oft weniger als 90% aller Verunreinigungen durch einen einzigen Durchgang unter Verwendung des herkömmlichen Zentrifugationsverfahrens entfernt werden. Dies erlaubt, die Notwendigkeit von Diafiltrationsstufen nach der Filtration zu verringern oder zu beseitigen, und stellt für weitere Verwendung ein reineres Produkt bereit.
Wie oben angegeben, ist dieses Verfahren wenn mit kleinen Volumina begonnen wird, besonders nützlich, da das Verfahren schneller als Zentrifugation ist. Zudem kann, wenn gewünscht wird, Verunreinigungen von einer biologischen Probe zu entfernen, dieses Verfahren mit größeren Ausgangsproben verwendet werden, auch wenn die Filtrationszeit länger als die eines Zentrifugationsverfahrens sein kann, da es zu einem reineren Retentat mit weniger Diafiltrationsstufen, falls überhaupt welchen, führt. Der insgesamte Zeitgewinn (Filtration und Diafiltration) kann die scheinbare Zunahme der Filtrationszeit rechtfertigen.
Das Filtrat der Mikrofiltrationsstufe enthält die Plasmide, andere Zellkomponenten und Zellflüssigkeiten, sowie Lysematerial oder wässrige Flüssigkeit, die in entweder der Lysestufe oder Mikrofiltrationsstufe verwendet wurden.
Das Filtrat wird dann einem Ultrafiltrationsverfahren unterworfen. Das Verfahren entfernt im Wesentlichen alle anderen Komponenten des Filtrats unter Zurücklassen der Plasmide auf der Oberfläche der Ultrafiltrationsmembran(en) wo sie für weitere Verwendung gesammelt werden. Jedes Verfahren zum Durchführen von Ultrafiltration kann verwendet werden, einschließlich Zentrifugation, positivem Druck oder negativem Druck, es ist jedoch bevorzugt, dass eine konstante Druckdifferenz, entweder positiv oder negativ oder eine Kombination von beiden, verwendet wird.
Eine oder mehrere Ultrafiltrationsmembranen können verwendet werden, obwohl eine typischerweise alles ist, was benötigt wird.
Die Ultrafiltrationsmembran(en) sollte(n) eine nominale Molekulargewichtsgrenze (Materialien über dem genannten Molekulargewicht bleiben vorwiegend auf der Stromaufwärtsseite der Membran, während Materialien, die kleiner als das genannte Molekulargewicht sind, durch oder in die Membran passieren) von etwa 3000 Dalton bis etwa 300 KiloDalton in Abhängigkeit der Größe der Plasmide oder anderer DNA, die gewonnen werden sollen, aufweisen.
Ultrafiltration(UF)membranen, die in diesem Verfahren verwendet werden können, können aus der Gruppe gebildet werden, welche, ohne hierauf beschränkt zu sein, Polysulfone, einschließlich Polysulfon, Polyethersulfon, Polyphenylsulfone und Polyarylsulfone, Polyvinylidenfluorid und Cellulose und dessen Derivate, wie Nitrocellulose und regenerierte Cellulose, umfasst. Diese Membranen umfassen typischerweise eine Trägerschicht, die allgemein aus einer stark porenhaltigen Struktur gebildet ist. Typische Materialien für diese Trägerschichten umfassen verschiedene nicht-gewebte Materialien, wie "spun bounded" Polyethylen oder Polypropylen, Papier oder Glas oder mikroporöse Materialien, die aus dem gleichen oder einem verschiedenen Polymer, gegenüber der Membran selbst gebildet sind. Derartige Membranen sind auf dem Gebiet bekannt und im Handel aus einer Vielzahl von Quellen, wie Millipore Corporation aus Bedford, Massachusetts, erhältlich.
Bevorzugte UF-Membranen umfassen regenerierte Cellulose oder Polysulfonmembranen, wie YM^TM oder Biomax^TM-Membranen, erhältlich von Millipore Corporation aus Bedford, Massachusetts.
Sowohl die Mikrofiltrations- als auch Ultrafiltrationsmembranen können in Form einer oder mehrerer Membranen, die gleichzeitig durchlaufen werden können, verwendet werden. Beispielsweise kann eine einzelne Membran in einer Filterhaltevorrichtung, wie der Analytical Stainless Steel Filter Holder, Katalognr. XX30 012 40 von Millipore oder einer Microcon^®-Vorrichtung von Millipore, gehalten werden. Eine Vorrichtung, die mehrere Membranen enthält, umfasst die Verwendung mehrerer Microcon^®-Vorrichtungen oder einer Mehrfachvertiefungsplatte wie einer MULTISCREEN^TM-Platte, erhältlich von Millipore mit verschiedenen Zahlen von Vertiefungen, typischerweise 96 oder 384 Vertiefungen pro Platte. Andere Mehrfachvertiefungsmembranvorrichtungsmodelle können von 2 bis über 1536 Vertiefungen pro Platte aufweisen. Die Auswahl zwischen einer Einzelvorrichtung und Mehrfachvorrichtung und der Zahl der Membranen in der Mehrfachvorrichtung hängt von der Anwendung und der Menge des zu gewinnenden Plasmids ab. Typischerweise hat die benötigte Menge ein eher geringes Gesamtvolumen und kleine Einzelfiltervorrichtungen, wie eine MICROCON^®-Vorrichtung oder 96- oder 384-Mehrfachvertiefungsvorrichtungen, wie MULTISCREEN^®-Platten, sind bevorzugt.
Die eine oder mehreren Mikrofiltrations- und eine oder mehreren Ultrafiltrationsmembran(en) können symmetrisch oder asymmetrisch hinsichtlich der Porenform (Morphologie) über die Tiefe des Filters sein. Symmetrisch bedeutet, dass die Porengröße von einer Oberfläche der Membran zu der anderen wenig variiert. Asymmetrisch bedeutet, dass die Porengröße von einer Seite zu der anderen in einiger Weise variiert. Asymmetrische Membranen kommen in einer Vielzahl von Formen und Konfigurationen vor, besitzen jedoch allgemein eine Porenmorphologie von der einen Oberfläche zu der anderen, die aus der Gruppe, die aus einem symmetrischen, asymmetrischen, isotropen Bereich und einem anschließenden asymmetrischen Bereich, divergierenden asymmetrischen Bereichen derart, dass die kleinste Pore der Membran in der Tiefe der Struktur liegt, und konvergierenden asymmetrischen Bereichen derart, dass die kleinste Pore an einer Oberfläche liegt und die Porengröße am Zusammentreffen der zwei asymmetrischen Schichten kleiner ist als die Poren in einer der beiden angrenzenden asymmetrischen Schicht sind, ausgewählt ist. Wenn sie in der Form eines gewebten oder nicht-gewebten Materials vorliegen, können sie eine Porengröße aufweisen, die stark variiert, und sie fallen klassischerweise nicht in die symmetrische oder asymmetrische Definition. Sie werden oft als Tiefenfilter klassifiziert.
2 zeigt ein zweites bevorzugtes Verfahren der vorliegenden Erfindung. In diesem Verfahren werden die Zellen in Stufe 20 aufgebrochen, wie in dem Verfahren von 1 besprochen, und aufeinanderfolgend über eine oder mehrere MF- und/oder Grobfiltrationsmembranen von Stufe 21 und dann eine oder mehrere UF-Membranen von Stufe 22 durch eine positiv konstante Druckdifferenz filtriert. Der positive Druck kann allein auf die MF- und/oder Grobfiltrationsmembran(en) angewendet werden und dann auch auf die UF-Membran angewendet werden, wenn sie in einer Vorrichtung, wie in 5 gezeigt und weiter unten besprochen, angeordnet sind. Alternativ kann positiver Druck in jeder Stufe getrennt angewendet werden. Plasmide werden dann von der Oberfläche der UF-Filtration, Stufe 23, gewonnen.
Typische Drücke, die für das Durchführen des Verfahrens geeignet sind, liegen im Bereich von etwa 0,1 bar bis etwa 6,9 bar, vorzugsweise etwa 0,17 bar bis etwa 0,85 bar. Wenn getrennte Anwendungen von Druck in den zwei Filtrationsstufen 21 und 22 verwendet werden, muss der angewendete Druck einer Stufe nicht gleich dem, der in der anderen Stufe angewendet wird, sein.
3 zeigt eine weitere Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens. In dieser Ausführungsform ist die Zellaufbrechungsstufe 30 identisch mit der der Ausführungsform von 1. Die Mikrofiltrationsstufe 31 und Ultrafiltrationsstufe 32 werden beide unter Verwendung einer negativen konstanten Druckdifferenz (CPD) zur Stromabwärtsseite jeder Membran durchgeführt. Entgegen der Ausführungsform von 2 muss der negative Druck jedoch bei jeder Stufe 31, 32 getrennt angewendet werden. Dies liegt an der Natur der UF-Membranen, die heute erhältlich sind, die nicht genug Kraft in ausreichendem Maße durch die UF-Membran dringen lassen, um eine ausreichende Kraft an der MF- und/oder Grobfiltrationsmembran zu entwickeln. Sollte eine derartige UF-Membran, die dies ermöglicht, entwickelt werden, dann ist es das Vorhaben dieser Anwendung, es in das vorliegend beanspruchte Verfahren einzugliedern. Plasmide oder andere DNA werden in Stufe 33 gewonnen.
4 zeigt ein anderes bevorzugtes Verfahren der vorliegenden Erfindung. In diesem Verfahren wird die Zellaufbrechungsstufe 40 wie in der Ausführungsform von 1 erklärt durchgeführt, die Mikrofiltrationsstufe 41 durch positiven Druck bewirkt und die Ultrafiltrationsstufe 42 durch negative konstante Druckdifferenz bewirkt. Die Plasmide oder andere DNA werden dann in Stufe 43 gewonnen.
5 zeigt ein anderes bevorzugtes Verfahren, worin das Aufbrechen der Zellen 50 wie in der Ausführungsform von 1 erklärt durchgeführt, die Mikrofiltrationsstufe 51 durch eine negative konstante Druckdifferenz bewirkt und die Ultrafiltrationsstufe 42 durch eine positive konstante Druckdifferenz bewirkt wird. Plasmide oder andere DNA werden in Stufe 53 gewonnen.
Andere Verfahrenskräfte, wie Zentrifugation, können auch in jeder der obigen Stufen angewendet werden.
6 zeigt eine für die Durchführung der Verfahren von 1 bis 5 geeignete Vorrichtung. In dieser Figur ist eine Platte 60 und eine zweite Platte 61 so angeordnet, dass die Platte 60 über der Platte 61 liegt und an diese so gesiegelt ist, dass sie entfernt werden kann. Die obere Platte 60 besitzt eine Abdeckung 62, mit der ein Anschluss 63 zum Anlegen einer positiven konstanten Druckdifferenz von einer Quelle (die nicht gezeigt ist), wie komprimierte Luft, verbunden ist. Der Anschluss wird selektiv für die Quelle der positiven konstanten Druckdifferenz durch ein Ventil 64, das angrenzend an die Mündung 63 gezeigt ist, geöffnet oder geschlossen, obwohl klar ist, dass das Ventil an anderen Stellen zwischen der Abdeckung und der Quelle der Druckdifferenz liegen kann oder dass andere bekannte Mittel zum Variieren oder Verhindern der Zufuhr zu dem Anschluss verwendet werden können.
Die obere Platte 60 enthält eine oder mehrere Membranen, wobei in diesem Beispiel eine Membran 65, die aus Grobmembranen und Mikrofiltrationsmembranen oder Kombinationen von diesen ausgewählt ist, verwendet wird.
Die untere Platte 61 enthält eine oder mehrere Ultrafiltrationsmembranen 66. Ein Gummidichtung 67 bildet die entfernbare Versiegelung zwischen den Platten, obwohl andere auf dem Gebiet bekannte Versiegelungsmittel verwendet werden können. Wie gezeigt, ist sie an der untere Platte 61 festgemacht, obwohl sie an der obere Platte 60 festgemacht sein kann oder von beiden Platten 60 oder 61 getrennt sein kann.
Ein Abfallbehälter 68 wird unter der unteren Platte angebracht, um jegliches Filtrat unter der unteren Platte aufzufangen. Er kann direkt an einen Abfluss (nicht gezeigt) angeschlossen sein oder einfach ein Sammelbehälter sein, in den das Filtrat passiert und aus diesem dann getrennt danach beseitigt wird.
Klemmen, Schrauben oder andere Haltevorrichtungen können auch zum Zusammenhalten der zwei Platten während der Verwendung, falls gewünscht, verwendet werden.
Wie gezeigt, zeigen sowohl Platte 60 als auch 61 ein Einzelvertiefungsmodell. Es ist klar, dass Platten mit mehrfachen Vertiefungen, wobei jede Vertiefung eine Membran enthält, stattdessen verwendet werden können. Platten, die 8, 12, 96, 384, 1536 Vertiefungen oder mehr enthalten, sind allgemein von Quellen wie Millipore Corporation und anderen erhältlich und bekannt.
Die Vorrichtung wird wie folgt verwendet. Die interessierenden Zellen werden entweder in der oberen Platte oder getrennt lysiert und dann auf die obere Platte übertragen. Die obere Platte, die schon an der unteren Platte in einer versiegelten Weise, wie durch die Verwendung des Gummidichtung, festgemacht wurde, und die untere Platte werden mit dem Sammelbehälter oder Abfluss verbunden. Die Abdeckung wird angebracht und der Anschluss wird mit einer Zufuhr einer positiven konstanten Druckdifferenz, wie einer Zufuhr komprimierter Luft, verbunden. Der Druck wird angelegt, um die ganze Flüssigkeit und kleine Bestandteile durch die Membran der oberen Platte und auf die Oberfläche der UF-Membran der unteren Platte zu zwingen. Der flüssige Bestandteil wird dann durch die UF-Membran mit dem gleichen Druck gezwungen und die Plasmide oder andere DNA bleiben auf der Oberfläche der UF-Membran. Der Druck wird entfernt und die Abdeckung und obere Platte werden entfernt und beseitigt. Die Plasmide oder andere DNA werden dann von der oberen Oberfläche der Membran der unteren Platte, beispielsweise durch Rehydratisieren der Plasmide oder anderen DNA und Abpipettieren derselben von der Membranoberfläche, zur weiteren Verarbeitung und Analyse gewonnen.
Die obige Konfiguration wird bei der Verwendung eines positiven Drucks, entweder als eine konstante Druckdifferenz, Zentrifugation oder anderes, funktionieren. Sie wird bei den Verfahren, die nur negativen Druck als Kraft verwenden, nicht funktionieren, da die Kraft, die nötig wäre, um einen Fluss durch die UF-Membran der unteren Platte und die obere Platte zu bewirken, so groß wäre, dass die UF-Membran zerreißen würde.
In ähnlicher Weise wird sie nicht für gemischte Kraftverfahren funktionieren, da sie nur einen Anschluss für die Zufuhr der treibenden Kraft aufweist.
7 zeigt eine zweite Vorrichtung, die zur Durchführung des Verfahrens von 1–5 geeignet ist, wenn man entweder negative Kräfte, wie Vakuum, in beiden Filtrationsstufen oder ein Gemisch aus positivem Druck in einer Stufe und negativem Druck in der anderen Stufe verwendet. In dieser Figur wird eine erste Platte 80 und eine zweite Platte 81 so angeordnet, dass die Platte 80 über der Platte 81 liegt und an diese so gesiegelt ist, dass sie entfernt werden kann, obwohl dies nicht erforderlich ist. Die obere Platte 80 besitzt eine Abdeckung 82, mit der ein erster Anschluss 83 für das Anlegen einer konstanten Druckdifferenz von einer Quelle (nicht gezeigt), wie komprimierter Luft oder Vakuum, verbunden werden kann. Der erste Anschluss 83 wird selektiv für die Quelle der positiven konstanten Druckdifferenz, beispielsweise durch ein Ventil 84, das neben dem Anschluss 83 liegend gezeigt ist, geöffnet und geschlossen, obwohl klar ist, dass das Ventil an anderen Stellen zwischen der Abdeckung und der Quelle der Druckdifferenz liegen kann oder dass andere bekannte Mittel zum Variieren oder Beenden der Zufuhr zu dem Anschluss 83 verwendet werden können.
Die obere Platte 80 enthält eine oder mehrere Membranen, in diesem Beispiel eine Membran 85, die aus Grobmembranen und Mikrofiltrationsmembranen oder Kombinationen von diesen ausgewählt ist.
Die untere Platte 81 enthält eine oder mehrere Ultrafiltrationsmembranen 86. Ein Gummidichtung 87 bildet die entfernbare Versiegelung zwischen den Platten, obwohl andere Ver siegelungsmittel, die auf dem Gebiet bekannt sind, verwendet werden können. Wie dargestellt, ist sie an der unteren Platte 81 festgemacht, obwohl sie an der obere Platte 80 festgemacht sein kann oder von sowohl Platte 80 wie auch 81 getrennt sein kann.
Ein Abfallbehälter 88 wird unter der unteren Platte platziert, um jegliches Filtrat durch die untere Platte aufzufangen. Er kann direkt an einen Abfluss (nicht gezeigt) angeschlossen sein oder einfach ein Sammelbehälter sein, in den das Filtrat passiert und aus dem es dann danach getrennt beseitigt wird.
Ein zweiter Anschluss 89 wird mit der unteren Platte 81 verbunden und zur Zufuhr der filtrationstreibenden Kraft zur unteren Platte verwendet. Der zweite Anschluss 89 wird für die Quelle positiver konstanter Druckdifferenz, beispielsweise durch ein Ventil 90, das neben dem Anschluss 89 liegend gezeigt wird, selektiv geöffnet und geschlossen, obwohl klar ist, dass das Ventil an anderen Positionen zwischen der Abdeckung und der Quelle der Druckdifferenz liegen kann oder dass andere bekannte Mittel zum Variieren oder Beenden der Zufuhr zu dem Anschluss 89 verwendet werden können.
Die zwei Anschlüsse können gleichzeitig oder aufeinanderfolgend (erster Anschluss, dann zweiter Anschluss) mit ähnlichen oder unterschiedlichen Kräften (beispielsweise beide positiv oder beide negativ oder einer positiv und einer negativ) verwendet werden.
Klemmen, Schrauben oder andere Haltevorrichtungen können auch zum Zusammenhalten der beiden Platten während der Verwendung, falls gewünscht, verwendet werden.
Wie gezeigt, zeigen beide Platten 80 und 81 ein Einzelvertiefungsmodell. Es ist klar, dass Platten mit mehrfachen Vertiefungen, wobei jede Vertiefung eine Membran enthält, stattdessen verwendet werden können. Platten, die 8, 12, 96, 384, 1536 Vertiefungen oder mehr enthalten, sind allgemein von Quellen, wie Millipore Corporation oder anderen, erhältlich und bekannt.
Die Vorrichtung wird wie folgt verwendet. Interessierende Zellen werden entweder auf der oberen Platte oder getrennt lysiert und dann in die obere Platte gegossen. Die obere Platte, die schon auf eine versiegelte Weise an der unteren Platte festgemacht wurde, beispielsweise durch die Verwendung einer Gummidichtung, und die untere Platte werden an einen Sammelbehälter oder Abfluss angeschlossen. Die Abdeckung wird angebracht und der Anschluss wird mit der Zufuhr positiver oder negativer konstanter Druckdifferenz so verbunden, dass komprimierte Luft oder ein Vakuum bereitgestellt wird. Der Druck wird angewendet, um die ganze Flüssigkeit und kleine Bestandteile durch die Membran der oberen Platte und auf die Oberfläche der UF-Membran der unteren Platte zu zwingen. Der flüssige Bestandteil wird dann durch die UF-Membran durch die von dem zweiten Anschluss gelieferte filtrationstreibenden Kraft gezwungen, und dies kann die gleiche Art von Kraft, die in der oberen Platte verwendet wurde (beispielsweise beide eine negative konstante Druckdifferenz oder beide eine positive konstante Druckdifferenz) oder eine unterschiedliche (beispielsweise eine eine negative konstante Druckdifferenz und die andere eine positive konstante Druckdifferenz) sein. Die Kraft kann zuerst an der oberen Platte und dann an der unteren Platte (aufeinanderfolgend) angewendet werden oder sie können gleichzeitig (simultan) angewendet werden. Die Plasmide oder andere DNA bleiben auf der Oberfläche der UF-Membran zurück. Die treibende Kraft oder der Druck wird von der unteren Platte (falls dies aufeinanderfolgend durchgeführt wird) oder von beiden Platten (falls dies simultan durchgeführt wird) entfernt und die Abdeckung und die obere Platte werden entfernt und beseitigt. Die Plasmide oder andere DNA werden dann von der oberen Oberfläche der Membran auf der unteren Platte, beispielsweise durch Rehydratisieren der Plasmide oder anderer DNA und Abpipettieren derselben von der Membranoberfläche, zur weiteren Verarbeitung und Analyse gewonnen.
Beispiel 1
Verfahren konstanter Druckdifferenz
E. coli JM109, die pUC19 tragen, wurden in 1-ml-Aliquots 2X LB plus geeignetes Antibiotikum in einem sterilen 96-tiefe-Vertiefungen-Block (2 ml Kapazität) (Beckman-Coulter, Fullerton, CA) inokuliert. Die Platten wurden bedeckt und in einem Inkubator verwahrt. Sie wurden 20 Stunden bei 37°C bei 320 Umdrehungen pro Minute inkubiert.
Die tiefe-Vertiefungen-Blockkulturen wurden mit klarem Plattenfilm (Millipore: MATA09600) bedeckt und bei 1500 × g 5 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Kulturüberstand sofort in einen Behälter zur entsprechenden Beseitigung dekantiert. Die Platten wurden umgekehrt und fest auf mehrere Schichten von Papiertüchern auf dem Labortisch geklopft, um verbleibenden Kulturüberstand zu entfernen.
Die Pellets wurden in 80 μl Lösung I (30 mM Glucose; 15 mM Tris-HCl, pH-Wert 8; 30 mM Na₂EDTA; 60 μg/ml Ribonuclease A, alles von Sigma, St. Louis, Mo., erhältlich) resuspendiert. Dann wurde Lösung II (0,2 N NaOH; 1% SDS, erhältlich von Sigma) hinzugegeben und es wurde sofort und kräftig mit einem Plattenschüttler (maximale Geschwindigkeit) 1 Minute zum Lysieren der Zellen gemischt. Das Gemisch wurde weitere 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 80 μl der Lösung III (3,6 M Kalium; 6 M Acetat, pH-Wert ~5, erhältlich von Sigma) wurden hinzugegeben und es wurde sofort und kräftig (maximale Geschwindigkeit) mit einem Plattenschüttler 2 Minuten gemischt.
Die UF-Platte wurde auf dem Boden eines Vakuumverteilers (Millipore MAVM 096 0R oder Äquivalent) platziert. Das Lysat wurde durch Absenken der Pipettenspitzen an den Seiten der tiefen Vertiefungen hinunter durch das Lysat, bis der Boden erreicht wurde, entfernt. Die Flüssigkeit wurde dreimal aufund-abpipettiert. 180 μl des Lysats wurden von dem Boden jeder tiefen Vertiefung entfernt und in die entsprechende Vertiefung einer MultiScreen^TM-NA-Lysatklärungsplatte (Millipore: MANANLYL50) gegeben.
Bei einem zweiten Besuch der gleichen Vertiefungen wurde jegliches verbleibende Lysat von der tiefe-Vertiefungen-Platte entfernt und in die entsprechenden Vertiefungen der Lysatklärungsplatte übertragen. Die Platte wurde oben an dem Verteiler platziert und das Vakuum wurde auf 8 inch Hg (0,27 bar – 203 Torr) eingestellt. Das Vakuum wurde 3 Minuten angelegt, wobei das Lysat durch die Platte und in die UF-Platte gezogen wurde. Die erste Platte wurde verworfen.
Die UF-Platte wurde aus dem Inneren des Verteilers entfernt und oben an dem leeren Verteiler platziert, und es wurde volles Vakuum während 8 Minuten angelegt (24 inch Hg). Das Filtrat wurde dem Abfall zugeführt.
200 μl MilliQ^®-Wasser wurden jeder Vertiefung der Platte zugeführt. Ein vollständiges Vakuum wurde 4 Minuten angelegt, wobei das Filtrat dem Abfall zugeführt wurde. Zum Lösen des Plasmids wurden 50 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8; 1 mM Na₂EDTA, erhältlich von Sigma) zu jeder Vertiefung der UF-Platte gegeben. Um das Plasmid zu gewinnen, wurde es durch 10-maliges Auf-und-ab-Pipettieren mit einer Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung resuspendiert und in eine V-Boden-Mikroplatte übertragen.
Die relative Ausbeute an Plasmid oder anderer DNA wurde durch fluorometrischen Test quantifiziert. Die relative Sequenzierungsqualität wurde durch ET Terminator Sequencing (Amersham Pharmacia Biotech) und anschließende Kapillarelektrophorese auf MegaBACE^® 1000 Sequenzierungssystem (Amersham Pharmacia Biotech) bestimmt.
Beispiel 2
E. coli JM109, die pUC19 tragen, wurden in 1 ml Aliquots 2X LB plus geeignetes Antibiotikum in sterile 96-tiefe-Vertiefungen-Blocks (2 ml Kapazität) (Beckman-Coulter, Fullerton, CA) inokuliert. Die Platten wurden bedeckt und in dem Inkubator verwahrt und bei 37°C bei 320 Umdrehungen pro Minute 20 Stunden inkubiert.
Die tiefe-Vertiefungen-Blockkulturen wurden mit einem klaren Plattenfilm (Millipore: MATA09600) bedeckt und bei 1500 × g 5 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Kulturüberstand sofort in einen Behälter zur entsprechenden Beseitigung dekantiert. Die Platten wurden umgekehrt und fest auf mehrere Schichten von Papiertüchern auf dem Labortisch geklopft, um verbleibenden Kulturüberstand zu entfernen.
Die Pellets wurden in 80 μl Lösung I, wobei zuerst eine Plattenschüttelvorrichtung oder -verwirbelungsvorrichtung verwendet wurde, und dann durch Pipettenmischen resuspendiert. 80 μl der Lösung II wurden zugegeben und es wurde sofort und kräftig mit einem Plattenschüttler (maximale Geschwindigkeit) 1 Minute gemischt. Es wurde dann weitere 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 80 μl von Lösung III wurden zugegeben und es wurde sofort und kräftig (maximale Geschwindigkeit) mit einem Plattenschüttler 2 Minuten lang gemischt.
Getrennt wurden 150 μl Bind Solution zu jeder Vertiefung einer MultiScreen^TM-Platte (Millipore: (MAFB N0B 50) gegeben. Die FB-Platte wurde auf dem Boden eines Vakuumverteilers platziert (Millipore: MAVM 096 0R oder Äquivalent).
Um das Lysat zu entfernen, wurden Pipettenspitzen entlang der Seiten der tiefen Vertiefungen herunter durch das Lysat, bis der Boden erreicht wurde, abgesenkt und dann das Lysat dreimal auf-und-ab-pipettiert. 180 μl des Lysats wurden vom Boden jeder tiefen Vertiefungen entfernt und in die entsprechende Vertiefung einer MultiScreen^TM-NA-Lysatklärungsplatte (Millipore: MANANLY50) gegeben. Durch einen zweiten Besuch der gleichen Vertiefungen wurde jegliches verbleibende Lysat aus der tiefe-Vertiefungen-Platte entfernt und in die entsprechenden Vertiefungen der MultiScreen^TM-Lysatklärungsplatte übertragen.
Die NA-Platte wurde oben an dem Verteiler platziert und das Vakuum wurde auf 8 inch Hg (0,27 bar – 203 Torr) eingestellt. Das Vakuum wurde 3 Minuten angelegt, wobei das Lysat durch die NA-Platte in die zuvor mit Bind Solution gefüllte FB-Platte gezogen wurde. Die NA-Platte wurde verworfen.
Die FB-Platte wurde aus dem Inneren des Verteilers entfernt und das geklärte Lysat wurde gründlich mit Bind Solution durch mehrmaliges schnelles Auf-und-ab-Pipettieren gemischt. Die FB-Platte wurde oben an dem leeren Verteiler wieder festgemacht und ein vollständiges Vakuum wurde 1 Minute angelegt. Das Filtrat wurde zum Abfall geschickt. Zu diesem Zeitpunkt war die Plasmid-DNA nun an die FB-Platte gebunden.
200 μl 80%iges Ethanol (Reagensqualität) wurde zu jeder Vertiefung der FB-Platte gegeben und ein vollständiges Vakuum wurde 1 Minute angelegt. Das Filtrat wurde zum Abfall geleitet. Diese Stufe wurde unter Anlagen des Vakuums während 3 Minuten wiederholt.
Die FB-Platte wurde von dem Verteiler entfernt. Der Boden der Platte wurde auf einem sauberen faserfreien absorbierenden Material gesäubert. Die FB-Platte wurde oben an ei ner Standardmikrotiterplatte mit Zentrifugenausrichtungsrahmen platziert (Millipore: MACF09604) und mit 1000 × g 10 Minuten zum Trocknen zentrifugiert. Um das Plasmid zu lösen, wurden 70 μl TE-Puffer jeder Vertiefung der FB-Platte gegeben, wobei das TE nahe der Mitte jeder Vertiefung abgegeben wurde. Das Plasmid wurde durch Zentrifugation mit 1000 × g während 5 Minuten zentrifugiert (das Eluatvolumen ist typischerweise 45 μl).
Ergebnisse:
Die vorliegende Erfindung stellt viele Vorteile gegenüber dem Stand der Technik bereit. Zuerst verringert sie die Zahl der Stufen und die benötigte Zeit zum Gewinnen von Plasmiden oder anderer DNA. Zudem tut sie dies ohne die Einführung von kontaminierenden Stoffen wie Ethanol. Zudem gewinnt sie wesentlich größere Mengen an Plasmid oder anderer DNA als das frühere System, typischerweise 20 bis 30% mehr im Durchschnitt. Zudem ist bei Verwendung einer treibenden Kraft mit konstanter Druckdifferenz in der UF-Stufe das gewonnene Plasmid reiner als das durch das herkömmliche Verfahren erhaltene, oft ohne Enthalten von Salzen oder anderen Unreinheiten, und daher ist die Notwendigkeit für mehrfache Diafiltrationsstufen beseitigt. Gewinnung des Plasmids oder anderer DNA von der Oberseite der Ultrafiltrationsplatte und die Beseitigung einer Zentrifugation machen dieses Verfahren zur Automatisierung besser geeignet. Zuallerletzt besitzt die vorliegende Erfindung entgegen dem vorherigen Binden/Eluierverfahren, welches eine auf die Menge aktive Bindungsstellen, die auf der Glasfaser gebildet sind, beschränkte Kapazität hat, eine im Wesentlichen uneingeschränkte Kapazität und es kann versiegelt werden, so dass Mengen eines Plasmids oder anderer DNA in Femtogramm- bis Milligramm-Mengen gewonnen werden können.

Claims

Verfahren zur Gewinnung von Plasmiden oder anderer DNA, umfassend die Stufen (a) Aufbrechen von Zellwänden zum Befreien der Zellkomponenten einschließlich von Plasmiden oder anderer DNA; (b) Filtrieren der Zellkomponenten über eine oder mehrere Membranen, die aus der aus Mikrofiltrations-, Grobfiltrationsmembranen und Kombinationen derselben bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und Gewinnen des Filtrats; (c) Filtrieren des Filtrats von (b) über eine oder mehrere Ultrafiltrationsmembranen, um die Plasmide oder andere DNA als zurückgehaltenes Material auf der oberen Oberfläche von einer oder mehreren Ultrafiltrationsmembranen zu hinterlassen; und (d) Gewinnen der Plasmide oder anderen DNA von der oberen Oberfläche der Ultrafiltrationsmembran, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Filtrationsstufen von (b) und (c) mittels einer konstanten Druckdifferenz durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellwände durch ein alkalisches Lyseverfahren aufgebrochen werden und über eine oder mehrere Membranen mit einem nominalen Porengrößenbereich von 0,1 μm bis 50 μm und eine oder mehrere Ultrafiltrationsmembranen mit einer nominalen Molekulargewichtsgrenze von 3000 Dalton bis 300 Kilo-Dalton filtriert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stufen (b) und (c) mittels einer positiven konstanten Druckdifferenz durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stufen (b) und (c) mittels einer negativen konstanten Druckdifferenz durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stufe (b) mittels eines Verfahrens, das aus der aus Zentrifugation und positiver konstanter Druckdifferenz bestehenden Gruppe ausgewählt ist, durchgeführt wird und die Stufe (c) mittels einer negativen konstanten Druckdifferenz durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die eine oder mehreren Mikrofiltrationsmembran(en) aus einem Material, das aus der aus natürlichen oder synthetischen Polymeren, Keramiken und Metall bestehenden Gruppe ausgewählt ist, gebildet sind und die Ultrafiltrationsmembran(en) aus einem Material, das aus der aus Polysulfonen, Polyethersulfonen, Polyphenylsulfonen, Polyarylsulfonen, Polyvinylidenfluorid, Cellulose und Cellulosederivaten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, gebildet sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine oder mehrere Mikrofiltrations- und eine oder mehrere Ultrafiltrationsmembranen eine Porenmorphologie von einer Oberfläche zur anderen aufweisen, die aus der Gruppe von einem symmetrischen, asymmetrischen, isotropen Bereich und einem anschließenden asymmetrischen Bereich, divergierenden asymmetrischen Bereichen derart, dass die kleinste Pore der Membran in der Tiefe der Struktur liegt, und konvergierenden asymmetrischen Bereichen derart, dass die kleinste Pore an einer Oberfläche liegt und die Porengröße am Zusammentreffen der zwei asymmetrischen Schichten kleiner als die Poren in einer der beiden angrenzenden asymmetrischen Schichten sind, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Filtrationsstufen von (b) und (c) eine positive konstante Druckdifferenz verwenden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Filtrationsstufe von (b) eine positive konstante Druckdifferenz verwendet und die Stufe von (c) eine negative konstante Druckdifferenz verwendet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Filtrationsstufe von (b) eine negative konstante Druckdifferenz verwendet und die Filtrationsstufe von (c) eine positive konstante Druckdifferenz verwendet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Filtrationsstufen von (b) und (c) eine negative konstante Druckdifferenz verwenden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Filtrationsstufen von (b) und (c) nacheinander durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Filtrationsstufen von (b) und (c) gleichzeitig durchgeführt werden.
Vorrichtung zur Gewinnung von Plasmiden, die ein oberes Filter mit einer oder mehreren, aus der aus Mikrofiltrationsmembranen und Grobmembranen bestehenden Gruppe ausgewählten Membranen und ein unteres Filter mit einer oder mehreren Ultrafiltrationsmembranen, wobei das obere Filter über dem und angrenzend an das untere Filter platziert ist, und ein Mittel zum Anlegen von einer oder mehreren treibenden Kräften an das obere und das untere Filter zum Bewirken einer Filtration umfasst, wobei mindestens eine der treibenden Kräfte eine konstante Druckdifferenz verwendet.
Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei die Filter flüssigkeitsdicht zueinander abgeschlossen sind.
Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei das eine oder die mehreren Mittel zum Bewirken einer treibenden Kraft eine konstante Druckdifferenz ist bzw. sind.
Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei das eine oder die mehreren Mittel zum Bewirken einer treibenden Kraft ein positiver Druck ist bzw. sind.
Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei das eine oder die mehreren Mittel zum Bewirken einer treibenden Kraft ein negativer Druck ist bzw. sind.
Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei das eine oder die mehreren Mittel zum Bewirken einer treibenden Kraft eine positive konstante Druckdifferenz ist bzw. sind.
Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei das eine oder die mehreren Mittel zum Bewirken einer treibenden Kraft eine negative konstante Druckdifferenz ist bzw. sind.
Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei das eine oder die mehreren Mittel zum Bewirken einer treibenden Kraft eine an das obere Filter angelegte positive Kraft und eine an das untere Filter angelegte negative Kraft sind.
Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei das eine oder die mehreren Mittel zum Bewirken einer treibenden Kraft nacheinander an das obere Filter und dann das untere Filter angelegt werden.
Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei das eine oder die mehreren Mittel zum Bewirken einer treibenden Kraft gleichzeitig an das obere und das untere Filter angelegt werden.