DE60112601T2 - Behandlung von tinnitus - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft die Verwendung von Apamin zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Medikamentes zur Behandlung von Tinnitus.
• Zwei Hauptzelltypen sind bei der Weiterleitung von Geräuschen beteiligt. Die inneren Haarzellen, welche als Überträger auf das zentrale Nervensystem (CNS) agieren, und die äußeren Haarzellen, welche als elektromechanische Verstärker für Geräusche auf der Basis eines lautsprecherartigen Mechanismus agieren. Die äußeren Haarzellen (OHC) empfangen eine synaptische Eingabe von der übergeordneten Olive, welche die cochlear afferente Aktivität durch Inhibition des schnellen spannungsabhängigen Verstärkungsmechanismus, der durch diese Sensorzellen bereitgestellt wird, kontrolliert (Guinan, J. 1996. Dallos, P., Popper, N. und Fay, R. eds. New York-Springer, 435 – 502). Diese schnelle synaptische Inhibition wird generell durch eine hyperpolarisierende Chloridweiterleitung durch unterschiedliche Rezeptoren, aktiviert durch von der Presynapse ausgeschüttete Transmitter, vermittelt (Alger, B. E. 1991. Ann. NY Acad. Sci. 627, 249 – 263; Betz, H., Kuhse, J., Schmieden, V., Laube, B., Kirsch, J. and Harvey, R. J. 1999. Ann. NY Acad. Sci. 868, 667 – 676). Wie diese synaptische Inhibition in OHCs funktioniert, ist noch unklar. Was man weiß ist, dass neuronale Acetylcholin (nAChR) Rezeptoren in OHCs die prosynaptische Zelle mit Kalzium (Ca²⁺) versorgen, welches eine inhibitorische Hyperpolarisation durch Öffnung eines Kalzium (Ca²⁺)-aktivierten Kaliums (SK) Kanals initiiert (Oliver, D., Klöcker, N., Schluck, J., Baukrowith, T., Ruppersberg, J. P. und Fakler, B. 2000. Neuron 26, 595 – 601).
• Schäden des inneren Ohres treten beispielsweise bei traumatischen, hypoxischen und toxischen Einflüssen auf. Der Hauptgrund für diese Schäden sind Lärm, plötzliche Gehörverluste (Gehörsturz) und Medikamente wie beispielsweise Antibiotika und Cytostatika. Krankheiten oder Störungen, in welchen subjektiver Lärm im Ohr, ein sogenannter Tinnitus, auftreten, sind weit verbreitet. Es wird geschätzt, dass in Deutschland allein ungefähr 6 Millionen Menschen an Tinnitus leiden. In ungefähr 800.000 Fällen ist der Tinnitus so ausgeprägt, dass diese Patienten aufgrund der Tatsache, dass der Patient ernsthaft durch quälende Ohrgeräusche behindert wird, eine intensive Behandlung durch einen Therapeuten benötigen.
• Im Falle von Tinnitus sind verschiedene medizinische Therapien darauf angewandt worden. Diese umfassen, in Ergänzung zu der Verwendung von Anästhetika, die Anwendung von lidocainartigen Antirhythmika oder Antikonvulsiva, oder einer Infusionstherapie. Allerdings führten Behandlungen dieser Art in den meisten Fällen zu unbefriedigenden Ergebnissen.
• In dem europäischen Patent 0 759 295 wurde gezeigt, dass Adamantan-Derivate erfolgreich zur Behandlung von Tinnitus eingesetzt werden können, die mit einem sogenannten positiven Recruitment und/oder einer Reduktion oder einem Wegfall von otoakustischen Emissionen verbunden ist. Jedoch war der molekulare Mechanismus wie Adamantan-Derivate wirken noch unbekannt, obwohl es Anzeichen gab, dass auf den äußeren Haarzellen vorhandene Rezeptoren beteiligt sind. In der Publikation von Oliver et al. (Oliver, D. et al., 2000, siehe oben) wurde gezeigt, dass die Hyperpolarisation von OHC Zellen durch SK2 Kanäle vermittelt wird und dass dies schnell stattfindet, was einen möglichen Mechanismus für die Erzeugung von schnellen inhibitorischen synaptischen Transmissionen erklärt.
• Die WO-A-9603504 beschreibt isolierte Nukleinsäuren, die eine alpha9 Nikotinacetylcholin-Rezeptor-Untereinheit kodieren, die isolierte Rezep tor-Protein-Untereinheit und den rekombinant erzeugten alpha9 Nikotinacetylcholin-Rezeptor. Es wird vorgeschlagen, dass der alpha9 Rezeptor die cholinerge Komponente des cochlear efferenten Systems ist. Die Behandlung von Tinnitus wird jedoch in diesem Dokument nicht erwähnt.
• In Cell, Vol. 79, 1994, Seiten 705 – 715 wird die Isolation und funktionale Charakterisierung des alpha9 Rezeptors, der ein ungewöhnliches gemischtes nikotin-muskarin pharmakologisches Profil zeigt, diskutiert. Es wird weiter vorgeschlagen, dass der alpha9 Rezeptor möglicherweise in der cholinergen efferenten Innervation der cochleären Haarzellen beteiligt ist. Wiederum gibt es keine Erwähnung einer Behandlung von Tinnitus.
• Die Aufgabe der Erfindung ist es, neue Targets zu finden oder neue Substanzklassen, welche Apamin oder ein Apamin kodierendes Polynucleotid sind, zur Behandlung von Tinnitus zugänglich zu machen durch eine genaue Aufklärung des molekularen Mechanismus, der bei der Signalübertragung der OHCs, welche ein Grund für den Tinnitus Pathomechanismus sein kann, beteiligt ist. Diese Aufgabe wird gelöst durch den Gegenstand des Anspruchs 1. Der Wortlaut dieses Anspruchs wird durch Verweis zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
• Es wurde gefunden, dass neuronale Acetylcholin-Rezeptoren des inneren Ohres alpha9- und alpha10-Untereinheiten umfassen. Daher gibt es einen alpha9/alpha10 heteromeren Acetylcholin-Rezeptor. Über solche Acetylcholin-Rezeptoren findet die Hyperpolarisation von äußeren Haarzellen (OHCs) statt und wird durch SK2-Kanäle vermittelt. Der Acetylcholin-Rezeptor kann effizient durch Memantin (3,5-Dimethyl-1-adamantan-amin) und andere Substanzen blockiert werden und damit tritt eine Inaktivierung der OHCs ein. Weiterhin wurde gefunden, dass dieser ionotrope Acetylcholin-Rezeptor funktional mit einem Kalziumaktivierten Kaliumkanal verbunden ist. Die Blockierung dieses Kanals kann ebenso zu einer Inaktivierung der OHCs führen. Diese neuen Er gebnisse machen es möglich, den Acetylcholin-Rezeptor und/oder den SK-Kanal als ein neues Target zur Behandlung von Tinnitus zu verwenden. Dementsprechend können neue Substanzklassen verwendet werden, um den Acetylcholin-Rezeptor und/oder den Kalzium-aktivierten Kaliumkanal zu blockieren.
• Der mögliche Pathomechanismus von Tinnitus kann durch diese Ergebnisse auch erklärt werden. Die OHC können physiologisch oder pathologisch den psychischen Eindruck eines Geräusches generieren, durch mechanische Bewegungen, welche an die inneren Haarzellen übermittelt werden und durch diese an das CNS propagiert werden. Solche Bewegungen werden verursacht durch Membranpotentialwechsel, verursacht entweder durch Geräusche oder durch die efferente Synapse in dem OHC. Diese Synapse verursacht Membranpotentialwechsel, welche nicht in Verbindung mit einem realen Geräusch stehen, sondern durch das CNS als pathologisches Geräusch (Tinnitus) aufgefasst werden. Da nAChR und der Kalzium-aktivierte Kaliumkanal in diese Signalübertragung der Synapse involviert sind, könnte jeder wirksame Inhibitor der Signalübertragung Tinnitus unterdrücken.
• Gemäß der Erfindung ist die Substanz, welche mindestens teilweise mindestens einen wie oben definierten Kalzium-aktivierten Kaliumkanal blockiert, ist Apamin. Die Substanz kann auch ein Apamin kodierendes Polynucleotid sein.
• Materialien und Methoden
• Patch-clamp Aufzeichnungen auf äußeren Haarzellen
• Die apikale Windung des Corti-Organs wurde aus Cochlea von drei bis sechs Wochen alten Wistar-Ratten wie vorher beschrieben dissektiert (Oliver et al., 1999, J Physiol (Lond) 519, 791 – 800; Oliver et al., 2000, Neuron 26, 595 – 601). Die Präparation wurde in einer Lösung vorgenommen enthaltend (in mM) 144 NaCl, 5,8 KCl, 0,1 CaCl₂, 2,1 MgCl₂, 10 HEPES, 0,7 Na₂HPO₄, 5,6 Glucose, eingestellt auf pH 7,3 mit NaOH. Zur Aufzeichnung wurden OHCs zwischen einer halben und einer Windung vom Apex der Cochlea angeordnet, ausgewählt. Falls notwendig, wurden umgebende Zellen mit leichtem Zug einer Reinigungspipette vorsichtig entfernt, wobei mechanische Störungen der efferenten Nervenenden vermieden wurden.
• Patch-clamp Aufzeichnungen mit ganzen Zellen wurden mit einem Axopatch 200B Amplifier (Axon Instruments, Foster City, CA) bei Raumtemperatur (22 – 25 °C) durchgeführt. Elektroden wurden aus Quarzglas gezogen, hatten einen Widerstand von 2 bis 3 MΩ und wurden mit intrazellularer Lösung gefüllt (in mM): 135 KCl, 3,5 MgCl₂, 0,1 CaCl₂, 5 EGTA, 5 HEPES, 2,5 Na₂ATP. Der pH der Lösung wurde auf pH 7,3 mit KOH eingestellt. Das Membranpotential wurde für das Elektroden-Kreuzungspotential (–4 mV) korrigiert. Der Ganzzellen-Serienwiderstand reichte von 4 bis 9 MΩ und wurde nicht kompensiert. Ströme wurden bei 1 kHz gefiltert und bei 5 kHz abgetastet.
• Die Proben wurden kontinuierlich mit extrazellularer Lösung übergossen (in mM: 144 NaCl, 5,8 KCl, 2 CaCl₂, 0,9 MgCl₂, 10 HEPES, 0,7 Na₂HPO₄, 5,6 Glukose, pH eingestellt auf 7,3 mit NaOH). Die Chemikalien wurden ebenso wie depolarisierende Lösungen durch eine Glasskapillare (Durchmesser ungefähr 80 μm) nahe an das Corti-Organ positioniert eingesetzt. Für die depolarisierende externe Lösung wurde KCl durch eine gleiche Menge an NaCl ersetzt, um in [K⁺]_ex von 47 mM zu resultieren. Strychnin, Apamin und Acetylcholin wurden aus wässrigen Vorratslösungen zu der extrazellulären Lösung hinzugefügt. Um den großen OHC gebundenen K⁺ Strom, I_k,n zu blocken, wurde 10 μM Linopirdin (RBI) oder 1-5 μM XE991 (erhalten von Du-Pont) zu dem Standard extrazellularen Medium aus den Vorratslösungen hergestellt mit DMSO (Endkonzentration < 0,1%) hinzugefügt (Housely and Ashmore, 1992, J Physiol (Lond) 448, 73 – 98; Marcotti and Kros, 1999, J Physiol (Lond) 520, 653 – 660). XE991 ist ein M-Stromblocker (Wang et al., 1998, Science 282, 1890 – 1893), der I_k,n bei submikromolaren Konzentration in einer schwach reversiblen Art inhibiert.
• Elektrophysiologie von heterolog exprimierten Kanälen
• Die in vitro mRNA Synthese und die Oozyten Injektionen wurden durchgeführt wie früher beschrieben (Fakler et al., 1995, Cell 80, 149 – 154; Oliver et al., 2000, siehe oben). Die Elektrophysiologie von Oozyten war ebenfalls wie früher beschrieben (Oliver et al., 2000, siehe oben). Im Detail, AChR Untereinheiten und SK2 Kanäle wurden heterolog in Xenopus Oocyten exprimiert. Oocyten wurden chirurgisch von erwachsenen Frauen entnommen und von Hand dissektiert. 4 – 5 Tage vor den elektrophysiologischen Aufzeichnungen wurden Dumont Stufe VI Oocyten mit ungefähr 50 ng RNA injiziert. Für Coexpressions-Experimente wurde die Gesamtmenge an RNA konstant gehalten und die unterschiedlichen RNAs wurden in gleichen Konzentrationen coinjiziert. Zwei-Elektroden Spannungsklammer Messungen wurden mit einem TurboTec 01C Amplifier durchgeführt (npi, Tamm, Deutschland), unter Verwendung von Mikroelektroden von 0,1 bis 0,5 MΩ, gefüllt mit 3 M KCl. Extrazellulares Medium war CaNFR, enthaltend (in mM): 120 KCl, 2,5 KCl, 2 CaCl₂, 10 HEPES, pH eingestellt auf 7,3 mit NaOH. Für Experimente in Abwesenheit von extrazellulärem Ca²⁺ war die extrazellulare Lösung MgNFR (in mM): 120 KCl, 2,5 KCl, 2 MgCl₂, 10 HEPES, pH eingestellt auf 7,3 mit NaOH. ACh wurde aus einer Vorratslösung hinzugefügt und durch ein Applikationssystem angewendet, das einen Lösungsaustausch mit einer Zeitkonstanten von ca. 1 s. zuließ. Ströme wurden bei 100 Hz gefiltert und bei einer Frequenz von 1 kHz abgetastet. Dosis-Inhibitions Beziehungen, die aus den elektrophysiologischen Experimenten erhalten wurden, wurden an die empirische Hill-Gleichung angepasst,

  

  worin I_norm der normalisierte Strom ist, c ist die Blocker-Konzentration, IC₅₀ ist die halbinhibierende Konzentration, und n_H ist der Hill-Koeffizient.
• Die Datenanalyse und Anpassung wurde mit IgorPro (Wavemetrics, Lake Oswego, OR) auf einem Macintosh PowerPC durchgeführt. Falls nicht anders angegeben, sind die Daten als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt.
• Molekular-Biologie
• Die kodierende Region des Ratten α10 Gens (GeneBank Accession No. AF196344) wurde aus Rattenhirn cDNA mittels PCR amplifiziert unter Verwendung von 5'- und 3'-Adapter-Primern, enthaltend geeignete Restriktionsstellen (GAGACCCGGGAGCTCCACC, ATGGGGACAAGGAG CCACTACC und GAGTCTAGATTACAGGGCTTGCACCAGTACAATG). Die amplifizierten Fragmente wurden subkloniert in den Xenopus Oocyten Expressionsvektor pGEM-HE Stränge (Geschenk von Dr. J. Tytgat), resultierend in pGEM-HE Stränge nAChR α10, durch Sequenzierung verifiziert. Gekappte mRNAs für α9, α10 und SK2 wurden in vitro synthetisiert unter Verwendung des mMESSAGE mMACHINE kit (Ambion, Austin, TX).
• Um die α10 und α9 Transkripte zu detektieren, wurde die PCR unter Verwendung von revers transkribierter RNA, isoliert aus anderen OHCs, durchgeführt, enthaltend einige Deiters-Zellen oder unterstützenden Zellen (Deiters und Hensen's-Zellen) als Templat. Die Zellen wurden von Corti-Organen aus Ratten mit Saug-Glasmikropipetten (Durchmesser 10 μm) gesammelt. RNA wurde von ca. 100 Zellen einer jeden Fraktion unter Verwendung des Qiagen RNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Vorschriften des Herstellers hergestellt. Die Oligonukleotide, die als Primer in den PCR- Reaktionen verwendet wurden, wurden so ausgewählt, um ein Intron im menschlichen α9 und α10 Gen zu umfassen, um die Unterscheidung zwischen Produkten, die von cDNA und Produkten, die von kontaminierender genomischer DNA stammen, zu ermöglichen.
  α9 sense: CGTCCTCATATCGTTCCTCGCTCCG,
  α9 antisense: TGGTAAGGGCTGTGGAGGCAGTGA;
  α10 sense: GCAGCCTACGTGTGCAACCTCCTGC,
  α10 antisense: AGGTGTCCCAGCAGGAGAACCCGAG.
• Für jede PCR-Reaktion wurde RNA entsprechend zu ca. 3 Zellen als Templat verwendet.
• Figurenbeschreibungen
• 1: (A) Modell für die inhibitorische synaptische Transmission bei äußeren Haarzellen (OCHs) wie aus Experimenten mit isolierten Zellen erhalten. (B) Inhibitorische postsynaptische Ströme (IPSCs) wurden durch Strychnin und Apamin inhibiert.
• 2: (A) ACh (100 μM) induzierte Eingangsströme in Oocyten kodierend für α9 aber nicht in Oocyten kodierend für α10. (B) Detektion von α9 und α10 mRNA in OHCs durch RT-PCR. (C) Gleiches Experiment wie in (A), aber zur Coexpression von beiden Untereinheiten. (D) Stromamplituden der Experimente in (A) und (C) summiert für Oocyten injiziert mit für eine nicht leitende SK2 Kanal Mutante (Kontrolle), α9, α10, und α9/α10 kodierende RNA.
• 3: (A) Durch Aktivierung von α9/α10 nAChRs erzielte Ströme sind abhängig von externem Ca²⁺. (B) Ströme aus homomerem α9 und heteromerem α9/α10 nAChRs aufgezeichnet durch Anwendung von 100 μM ACh in nominell Ca²⁺-freier externer Lösung. (C) Stromamplituden von Oocyten α9 und α9/α10 darstellend, aufgenommen wie in 3B.
• 4: Anwendung von 100 μM ACh für die angegebene Zeit an einen Oocyten coexprimierend α9, α10 und SK2.
• 5: Block von alpha9/alpha10 SK2 Stromerwiderungen auf Acetylcholin in Xenopus Oocyten durch Strychnin.
• Experiment 1
• In 1A wird ein Modell gezeigt, wie die inhibitorische Transmission bei OHCs stattfindet. Ca²⁺, welches in die Postsynapse über den Transmitter aktivierten nAChR eindringt, öffnet SK-Kanäle und ergibt hyperpolarisierende K⁺ Ströme (Art, J. J., Fettiplace, R. und Fuchs, P. A. 1984, J. Physiol. (Lond.) 356, 525 – 550; Yuhas, W. A: and Fuchs, P. A. 1999. J. Comp. Physiol. 18, 455 – 462).
• In 1B wurden postsynaptische Ströme von OHCs in Spannungsklammer-Experimenten aufgenommen, wobei die Zellen bei –64mV gehalten wurden und die gesamte Corti-Präparation mit hohem extrazellularen K⁺ (150 mM) übergossen wurde, um die Presynapse zu depolarisieren. Anwendung von hoch K⁺ und Toxinen wie durch horizontale Balken angegeben: Strom und Zeitskala wie angegeben.
• In Übereinstimmung mit dem Modell dargestellt in 1A wurden die postsynaptischen Ströme durch Anwendung von entweder dem Acetylcholin-Blocker Strychnin (Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boutler, J., Vetter, D. E. and Heinemann, S. 1994. Cell 79, 705 – 715) oder dem SK-Kanal-Blocker Apamin (komplette Inhibition bei 100 nM und 10 nM, 1B) inhibiert.
• Experiment 2:
• α9 und α10 nAChR Untereinheiten werden in OHCs exprimiert und zu funktionalen Kanälen coassembliert. In (A) ACh (100 μM) induzierte Einwärts-Ströme in Oocyten, injiziert mit RNA kodierend für α9 (niedrige Spuren), aber nicht in Oocyten, injiziert mit RNA kodierend für α10 (höhere Spuren). Haltepotential war –80 mV. Schnelle Spitzen nach unten in den Kurven sind Artefakte durch das Umschalten zwischen Lösungen. (B) Detektion von α10 und α9 mRNA in OHCs durch RT-PCR. Fragmente der erwarteten Länge wurden für α9 und α10 aus OHCs (Spur 1, 2) amplifiziert, aber nicht von den umgebenden Zellen (Spur 3, Daten für α9 nicht gezeigt). Kontrollen waren OHC-RNA ohne zugefügtes RT (Spur 4) und Wasser (Spur 5) als Templat für die PCR. (C) Gleiches Experiment wie in (A), aber zur Coexpression von beiden Untereinheiten. Die unterschiedliche Stromskalierung beachten. Die Aufzeichnungen aus (A) (α9) wurden zum Vergleich hinzugefügt. (D) Stromamplituden für Experimente wie in (A) und (C) summiert für Oocyten injiziert mit RNA kodierend für eine nicht leitende SK2-Kanal-Mutante (Kontrolle), α9, α10 und α9/α10 (Werte sind Mittelwerte + Standardfehler von 5, 13 bzw. 18 Oocyten).
• Es ist gezeigt worden, dass die nAChR der äußeren Haarzellen die α9-Untereinheit aufweisen durch eine Vielzahl von Methoden einschließlich in-situ Hybridisation (Elgohyen et al., 1994, siehe oben; Morley et al., 1998, Brain Res Mol Brain Res 53, 78-87), Einzelzell RT-PCR (Glowatzki und Fuchs., 1995, Science 288, 2366-2368), transgene Expression von grün fluoreszierendem Protein kontrolliert durch den α9 Promotor (Zuo et al., 1999, Proc Natl. Acad Sci 96, 14100-14105) und Inaktivierung des α9-Gens (Vetter et al., 1999, Neuron 23, 93-103). Homomere α9-Rezeptoren ergaben bedeutend geringere Ströme, wenn sie heterolog in Xenopus Oocyten exprimiert wurden (Elgoyhen et al., 1994, siehe oben), die die Möglichkeit erhöhten, dass eine zusätzliche Untereinheit benötigt wird, um den vollständig funktionierenden OHC-Rezeptor zu ergeben. Jedenfalls fehlt es den OHCs an jeglichen weiteren der bekannten nAChR Subtypen (Morley et al., 1998, siehe oben). Eine Gene- Bank Suche ergab eine neue Untereinheit der nAChR Familie (GeneBank Accession No. AF196344), bestimmt als α10.
• Daher wurde um zu testen, ob die Inhibition der komplexen IPSCs aus der Blockierung des Ca²⁺ Eintritts über den nAChR resultierten, und um zu testen, ob α10 eine mögliche Untereinheit für den OHC Rezeptor ist, OHC nAChR, heterolog in Xenopus Oocyten exprimiert, getestet. Jedoch ergaben die Anwendungen von 100 μM ACh zu Oocyten, injiziert mit α9 spezifischer RNA, sehr geringe Ströme (9,3 + 5,0 nA bei –80 mV; 2A), in Übereinstimmung mit früheren Berichten (Elogyhen et al., 1994, siehe oben; Katz et al., 2000, Hear Res 141, 117 – 128). Keine Ströme, die das Hintergrundniveau überschritten, wurden mit den Homologen der α10 Untereinheit der Ratte beobachtet, einem Mitglied der nAChR Familie, welches vor kurzem durch Boulter und Kollegen identifiziert wurde (GeneBank Accession No. AF196344; 2A, D). Wie in 2B durch RT-PCT an OHCs, isoliert aus dem Corti-Organ von der Ratte (siehe Methoden), gezeigt, ist α10 mRNA tatsächlich in diesen Sensorzellen vorhanden, wohingegen es in der umgebenden Zellfraktion, enthaltend Hensen- und Deiters-Zellen, nicht detektiert worden ist. In einem Kontrollexperiment mit RNA aus OHCs, die nicht revers transkribiert war, amplifizierte die PCR ein Fragment von ca. 900 bp (2B, Spur 4), das am wahrscheinlichsten aus einer Kontamination mit genomischer DNA resultierte, da die Länge dieses Fragmentes gut mit der Sequenz übereinstimmt, wie sie durch die Primer-Paare im menschlichen Genom definiert wird (BAC aus Chromosom 11; GeneBank Acc #AC060812). Wenn beide, α9 und α10, in Oocyten coexprimiert wurden, wurden große innere Ströme mit Spitzenamplituden von bis zu –35 μA (bei –80 mV) nach Anwendung von ACh aufgezeichnet (2C, D). Ähnlich zu α9 vermittelten Strömen, wurde der Zeitverlauf hinsichtlich des Stromscheitelwertes durch ein vorübergehendes Absinken zu einem kleineren Plateau einer variablen Amplitude charakterisiert.
• Der Anstieg der Stromamplitude von mehr als drei Größenordnungen (verglichen zur homomeren α9 Expression) zusammen mit der Coexpression von α9 und α10 in OHCs legt nahe, dass die Heteromultimerisation von beiden Untereinheiten essentiell ist, um voll funktionale Rezeptorkanäle zu ergeben. Desweiteren legt die Abwesenheit von jeglichen weiteren der bekannten nAChR Untereinheiten (Morley et al., 1998, siehe oben) nahe, dass der OHC nAChR ein Heteromer, zusammengesetzt aus α9 und α10 Untereinheiten, ist.
• Experiment 3:
• In (A) sind die durch Aktivierung von α9/α10 nAChRen hervorgerufenen Ströme abhängig von externen Ca²⁺. Die Spuren zeigen die nachfolgenden Anwendung von 100 μM ACh bei den gleichen Oocyten in CaNFR (Ca²⁺) und MgNFR (Mg²⁺) bei –80 mV. (B) Ströme von homomeren α9 (obere Spur) und heteromeren α9/α10 nAChRen (untere Spur), aufgenommen durch Anwendung von 100 μM ACh in nominell Ca²⁺-freier externer Lösung (MgNFR, –80 mV). (C) Stromamplituden von α9 und α9/α10 exprimierenden Oocyten, aufgenommen, wie in 3B (Mittelwert ± Standardfehler von 12 bzw. 15 Oocyten).
• Ein charakteristisches Merkmal von homomeren α9 Kanälen ist ihre außerordentlich hohe Ca²⁺ Permeabilität (Jagger et al., 2000, J Physiol 527, 49 – 54; Katz et al., siehe oben). Diese Ca²⁺ Permeabilität wird als essentiell für die OHC nAChR angesehen, da sie einen Ca²⁺ Zufluss erlaubt, der ausreichend hoch ist, die SK-Typ Kalium-Kanäle effektiv zu aktivieren. Das Oocyten-Expressionssystem ist jedoch charakterisiert durch ein hohes endogenes Expressionsniveau an Ca²⁺ aktivierten Cl^– Kanälen (Stühmer und Parekh, 1995, in Single channel recording 2^nd edition (Neher E. and Sakmann B. eds. 341 – 356. Plenum Press, New York). Daher führt das Öffnen von Ca²⁺-permeablen Kanälen in einem externen Ca²⁺-haltigen Medium zu einer Coaktivierung einer Cl^– Leitfähigkeit. Wenn externes Ca²⁺ durch Mg²⁺ ersetzt wurde, wurden die durch ACh Anwendung auf α9/α10 heteromere Kanäle induzierten Ströme um einen Faktor von ungefähr 10 reduziert (3A). Daher war ein großer Anteil des ACh induzierten Stroms, der in CaNFR gemessen wurde, durch die Öffnung von Ca²⁺ aktivierten Cl^–-Strömen bedingt. Dies wurde weiter unterstützt durch das reverse Potential des Stroms in CaNFR von ungefähr –25 mV (Daten nicht gezeigt), nahe an dem geschätzten Cl^–-Gleichgewichtspotential in Xenopus Oocyten (Stühmer und Parekh, 1995, siehe oben). Dementsprechend hatten α9/α10 heteromere Kanäle eine signifikante Ca²⁺-Permeabilität, ähnlich zu dem was von homomeren α9 Rezeptoren bekannt ist. Die Anwendung von ACh in der Abwesenheit von extrazellulärem Ca²⁺ erlaubte die Aufzeichnung von α9/α10 Strömen in Isolation. Heteromere Kanäle ergaben Ströme, die 100 mal größer waren als Ströme, die von α9 Kanälen unter denselben Bedingungen aufgezeichnet wurden, und bestätigten den großen Gewinn an Rezeptorleitfähigkeit durch die Coexpression, die in der Gegenwart von externen Ca²⁺ beobachtet wurde (3B, C). In der Abwesenheit von Ca²⁺ zeigte α9/α10 ebenso folgerichtige Kinetiken, gekennzeichnet durch langsame Desensibilisierung auf einer Zeitskala in Sekunden. Desensitivierung wurde mit α9 Kanälen innerhalb der Grenzen der Geschwindigkeit des Lösungsaustausches nicht beobachtet (3B).
• Experiment 4:
• Anwendung von 100 μM ACh für die angegebene Zeit auf einen α9, α10 und SK2 coexprimierenden Oocyten. Die Spuren zeigen aufeinanderfolgende Aufzeichnungen desselben Oocyten bei den angegebenen Haltepotentialen.
• In Haarzellen aktiviert ein Ca²⁺ Zufluss via nAChRs die SK2 Kanäle, um IPSCs hervorzurufen. 4 zeigt, dass diese Aktivierungskaskade in Xenopus Oocyten durch Coexpression der α9/α10 nAChR mit SK2 Kanälen nachgebildet werden kann. In Oocyten, die beide Kanalspezies exprimierten, rief die Anwendung von ACh eine zweiphasige Antwort bei –70 mV hervor. Einem anfänglichen nach innen gehenden hauptsächlich durch Chlorid verursachten Strom folgte ein nach außen gehender, durch die Aktivierung der SK2 Kanäle verursachter, Strom (4). Mit einer zum größten Teil aufgehobenen treibenden Cl^– Kraft und einer ansteigenden treibenden Kraft für K⁺ bei einem Membranpotential von –30mV induzierte ACh einen nach außen gerichteten monophasischen Kaliumstrom, ähnlich zu der Reaktion von isolierten OHCs auf ACh Anwendung (Blanchet et al., 1996 J Neurosci 16, 2574 – 2584; Evans, 1996, J Physiol (Lond) 491, 563 – 578).
• Experiment 5:
• Für die weitere Charakterisierung der Strychninbehandlung der nAChR wurde die mRNA von α9/α10 Untereinheiten des Acetylcholin Rezeptors in Oocyten von Xenopus laevis injiziert. Nach Expression dieser Untereinheiten wurden sie durch Behandlung mit Strychnin in einem Spannungsklammerexperiment untersucht. Die Zellen wurden bei –30mV gehalten. Strom- und Zeitskala sind wie angegeben. Wie in 5 gezeigt, wurden ähnliche Ergebnisse wie in 1 erhalten. In Übereinstimmung mit dem oben gezeigten Modell (1) konnten die Stromantworten am Acetylcholin-Rezeptor reversibel durch Behandlung mit dem Acetylcholin-Blocker Strychnin geblockt werden. Eine vollständige Hemmung findet bei 1 μM statt, und nach einem Auswaschen des Strychnins während drei Minuten war der Rezeptor wieder funktional aktiv, was eine reversible Blockierung des Rezeptors anzeigt.

Claims (1)

1. Verwendung einer Substanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Medikamentes zur Behandlung von Tinnitus, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Substanz um Apamin oder ein für Apamin codierendes Polynukleotid handelt.