DE60112413T2

DE60112413T2 - Ssa inaktivierte salmonella impfstoffe

Info

Publication number: DE60112413T2
Application number: DE60112413T
Authority: DE
Inventors: E. David LOWERY; J. Michael KENNEDY
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co LLC
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co LLC
Priority date: 2000-03-17
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2021-03-14
Also published as: ES2244617T3; CA2402252A1; ZA200207002B; BR0109322A; EP1267899A2; EP1267899B1; DK1267899T3; WO2001070247A3; AU5695701A; PT1267899E; US6923957B2; AU2001256957B2; PE20011180A1; WO2001070247A2; DE60112413D1; AR027680A1; JP2003527433A; US20050260223A1; US20040009191A1; MXPA02008748A

Description

Gebiet der Erfindung
Im Allgemeinen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf gentechnisch manipulierte Salmonellen, welche als lebende Impfstoffe nützlich sind, und im Speziellen auf eine Impfstoffzusammensetzung, die mutierte Salmonellen enthält.
Hintergrund der Erfindung
Durch Salmonellabakterien verursachte Erkrankungen reichen von einer milden, sich selbst-begrenzenden Diarrhö bis zu Magen-Darm- und septischen Erkrankungen in Menschen und Tieren. Salmonella ist ein gram-negatives, stäbchenförmiges, freibewegliches Bakterium (nicht freibewegliche Ausnahmen umfassen S. gallinarum und S. pullorum), welches keine Sporen bildet. Umweltbedingte Quellen des Organismus umfassen Wasser, Boden, Insekten, Fabrikoberflächen, Küchenoberflächen, Tierfäkalien, rohes Fleisch, rohes Geflügel und rohe Meeresfrüchte.
Die Salmonellainfektion ist bei Tieren, besonders bei Geflügel und Schweinen, eine weit verbreitete Erscheinung, und ist eine der wirtschaftlich am meisten schädigenden der enterischen und septischen Erkrankungen, die Nahrungsmittel erzeugende Tiere betreffen. Obwohl viele Serotypen von Salmonella aus Tieren isoliert worden sind, sind S. choleraesuis und S. typhimurium die zwei am häufigsten isolierten Serotypen, die mit die klinischen Salmonellenerkrankung in Schweinen assoziiert sind. In Schweinen verursacht S. typhimurium üblicherweise eine enterische Erkrankung, während S. choleraesuis (welches an den Wirt Schwein angepaßt ist) oft der Krankheitserreger einer tödlichen septischen Erkrankung, mit geringer Beteiligung des Magen-/Darmtrakts, ist. S. dublin und S. typhimurium sind gemeinsame Infektionsursachen in Schafen; von denen, S. dublin an das Schaf als Wirt angepaßt ist und oftmals der Krankheitserreger der tödlichen septischen Erkrankung ist. Andere Serotypen wie zum Beispiel S. gallinarum und S. pullorum sind bedeutende Krankheitserreger der Salmonellenerkrankung in Affen und in anderen Spezies. Obwohl diese Serotypen hauptsächlich Tiere infizieren, sind S. dublin und S. choleraesuis auch oft die Ursache für menschliche Erkrankungen.
Verschiedene Salmonella-Spezies sind von der Außenseite von Eierschalen isoliert worden, einschließlich S. enteritidis, welches auch innerhalb des Eidotters vorhanden sein kann. Es ist vorgeschlagen worden, daß das Vorhandensein des Organismus im Eidotter durch die Übertragung von der infizierten Legehenne vor der Abscheidung der Schale hervorgerufen wird. Andere Nahrungsmittel als Eier haben auch Ausbrüche der S. enteritidis Erkrankung in Menschen verursacht.
S. typhi und S. paratyphi A, B, und C produzieren in Menschen typhusartiges und typhusähnliches Fieber. Obwohl die anfängliche Infektion mit Salmonellen üblicherweise durch den Magen-Darm-Trakt erfolgt, ist typhusartiges Fieber eine systemische Erkrankung, die sich innerhalb des Wirts ausbreitet und mehrere Organorte infizieren kann. Der Anteil an Todesopfern an typhusartigem Fieber kann so hoch sein wie 10% (verglichen zu weniger als 1% für die meisten Formen der Salmonellenerkrankung). S. dublin hat eine 15% ige Sterblichkeitsrate, wenn der Organismus eine Blutvergiftung bei älteren Menschen verursacht und S. enteritidis hat eine etwa 3,6% ige Sterberate bei Ausbrüchen in Krankenhäusern/Altenheimen, bei denen ältere Menschen besonders betroffen sind.
Zahlreiche Versuche sind unternommen worden, um Menschen und Tiere durch Immunisierung mit einer Vielzahl von Impfstoffen zu schützen. Viele dieser Impfstoffe liefern nur einen schwachen bis moderaten Schutz und erfordern beträchtliche Dosen, um vollkommen wirksam zu sein. Früher verwendete Impfstoffe gegen Salmonellen und andere Krankheitserreger sind gewöhnlich in vier Kategorien gegliedert: (i) besondere Bestandteile vom Krankheitserreger, einschließlich Zellfraktionen oder – lysate, intakte Antigene, Fragmente davon oder synthetische Nachbildungen von natürlich vorkommenden Antigenen oder Epitopen (oft als Untereinheit-Impfstoffe bezeichnet); (ii) antiidiotypische Antikörper; (iii) der vollständige getötete Krankheitserreger (oft als getötete Impfstoffe bezeichnet); oder (iv) ein nicht ansteckendes (abgeschwächtes) als lebender Impfstoff verwendetes Derivat des Krankheitserregers.
Berichte in der Literatur haben gezeigt, daß abgeschwächte lebende Impfstoffe effektiver als getötete Impfstoffe oder Untereinheit-Impfstoffe für das Auslösen einer schützenden Immunität sind. Trotz dieses werden hohe Dosen von lebenden Impfstoffen häufig für die Wirksamkeit benötigt und einige leben-abgeschwächte Salmonella-Impfstoffe sind kommerziell erhältlich. Idealerweise bewahrt ein erfolgreich abgeschwächter lebender Impfstoff die Fähigkeit, den Wirt ohne eine ernsthafte Erkrankung zu verursachen zu infizieren und ist auch fähig, humorale (auf Antikörper-basierende) Immunität und Zell-vermittelte Immunität, die ausreicht, Resistenz zu jeder zukünftigen Infektion durch virulente Bakterien zur Verfügung zu stellen, zu stimulieren.
Mehrere Abschwächungsstrategien sind verwendet worden, um Salmonella nicht virulent zu machen [Cardenas et al., Clin Microbial Rev. 5:328–342 (1992); Chatfield et al., Vaccine 7:495–498 (1989); Curtiss, in Woodrow et al., eds., New Generation Vaccines, Marcel Dekker, Inc., New York, p. 161 (1990); Curtiss et al., in Kohler et al., eds., Vaccines: new concepts and developments. Proceedings of the 10^th Int'1 Convocation of Immunology, Longman Scientific and Technical, Harlow, Essex, UK, pp. 261–271 (1987); Curtiss et al., in Blankenship et al., eds., Colonization control of human bacterial enteropathogens in poultry, Academic Press, New York, pp. 169–198 (1991)]. Diese Strategien umfassen die Verwendung von Temperatur sensitiven Mutanten [e.g., Germanier et al., Infect Immun. 4:663–673 (1971)], aromatischen und auxotrophen Mutanten (e.g., -aroA, -asd, -cys oder -thy [Galan et al., Gene 94:29–35 (1990); Hoiseth et al., Nature 291:238–239 (1981); Robertsson et al., Infect Immun. 41:742–750 (1983); Smith et al., Am J Vet Res. 45:59–66 (1984); Smith et al., Am J Vet Res. 45:2231–2235 (1984)]), Mutanten, defekt in der Biosynthese von Purin oder Diaminopimelinsäure (e.g., Δpur und Δdap [Clarke et al., Can J Vet Res. 51:32–38 (1987); McFarland et al., Microb Pathog. 3:129–141 (1987); O'Callaghan et al., Infect Immun. 56:419–423 (1988)], Stämmen, verändert in der Nutzbarmachung oder Synthese von Kohlenhydraten (e.g., ΔgalE [Germanier et al., Infect Immun. 4:663–673 (1971); Hone et al., J Infect Dis. 156:167–174 (1987)]), Stämmen, verändert in der Fähigkeit Lipopolysaccharide zu synthetisieren (e.g., galE, pmi, rfa) oder vom Virulenz-Plasmid geheilte Stämme, Stämmen mit Mutationen in einem oder mehreren Virulenz-Genen (e.g., invA) und Mutanten, verändert in der allgemeinen Genexpression (e.g., -cya-crp, ompR oder -phoP [Curtiss (1990), supra; Curtiss et al., (1987), supra; Curtiss et al., (1991)], supra).
Außerdem sind zufallsbedingte Mutagenesetechniken verwendet worden, um Virulenz-Gene, die während der Infektion in einem Tiermodel exprimiert werden, zu identifizieren. Beispielsweise wird unter Verwendung einer Vielfalt von Ansätzen eine zufallsbedingte Mutagenese in Bakterien durchgeführt, gefolgt von der Beurteilung der Mutanten in Tiermodellen oder Gewebekultursystemen, wie zum Beispiel die Signatur-markierte Mutagenese (STM) [siehe U.S. Patent-Nummer 5,876,931].
Jedoch haben veröffentlichte Berichte gezeigt, daß Versuche, Salmonella dadurch und durch andere Methoden abzuschwächen, zu verschiedenen Erfolgsgraden geführt und Unterschiede sowohl in der Virulenz als auch in der Immunogenität demonstriert haben [Chatfield et al., Vaccine 7:495–498 (1989); Clare et al., Can J Vet Res. 51:32–38 (1987); Curtiss (1990), supra; Curtis et al., (1987), supra; Curtiss et al., (1991), supra]. Vorherige Versuche, Abschwächungsmethoden zu verwenden, um sichere und wirkungsvolle lebende Impfstoffe zur Verfügung zu stellen, haben auf eine Anzahl von Problemen getroffen.
Erstens kann ein abgeschwächter Salmonella-Stamm, der eine teilweise oder vollständige Verringerung in der Virulenz aufweist, nicht die Fähigkeit behalten, eine schützende Immunantwort zu induzieren, wenn er als ein Impfstoff gegeben wird. Beispielsweise wurden ΔaroA-Mutanten und galE-Mutanten von S. typhimurium, denen die UDP-Galaktose-Epimerase Aktivität fehlt, gefunden, um in den Mäusen immunisierend zu sein [Germanier et al., Infect Immun. 4:663–673 (1971), Hohmann et al., Infect Immun. 25:27–33 (1979); Hoiseth et al., Nature, 291:238–239 (1981); Hone et al., J. Infect Dis. 156:167–174 (1987)], während es die Δasd-, Δthy- und Δpur-Mutanten von S. typhimurium nicht waren [Curtiss et al. (1987), supra, Nnalue et al., Infect Immun. 55:955–962 (1987)]. Alle diese Stämme wurden trotzdem für Mäuse abgeschwächt, wenn sie oral oder parenteral in Dosen, ausreichend um Mäuse mit dem wildtypischen Elternstamm zu töten, gegeben wurden. Ebenso waren ΔaroA-, Δasd-, Δthy- und Δpur-Mutanten von S. choleraesuis in der Maus nicht virulent, allerdings waren nur ΔaroA-Mutanten ausreichend nicht virulent und keine waren als lebende Impfstoffe wirksam [Nnalue et al., Infect Immun. 54:635–640 (1986); Nnalue et al., Infect Immun. 55:955–962 (1987)].
Zweitens wurden abgeschwächte Stämme von S. dublin, die Mutationen in phoP, phoP crp, [crp-cdt] cya, crp cya tragen, gefunden, um in Mäusen jedoch nicht in Rindern immunisierend zu sein [Kennedy et al., Abstracts of the 97^th General Meeting of the American Society for Microbiology. B-287:78 (1997)]. Gleichermaßen war ein anderer Stamm von S. dublin, SL5631, mit einer das aroA-Gen beeinträchtigenden Deletion, gegen die tödliche Konfrontation zu einem heterologen Konfrontationsstamm in Mäusen [Lindberg et al., Infect Immun. 61:1211–1221 (1993)] aber nicht in Rindern [Smith et al., Am J Vet Res. 54:1249–1255 (1993)] höchst schützend.
Drittens können gentechnisch manipulierte Salmonella-Stämme, die eine Mutation in nur einem einzelnen Gen beinhalten, spontan mutieren und zum virulenten Zustand „zurückkehren". Die Einführung von Mutationen in zwei oder mehr Genen zielt darauf ab, ein hohes Sicherheitsniveau gegen die Wiederherstellung der Pathogenität durch Rekombination [Tacket et al., Infect Immun. 60:536–541 (1992)] zur Verfügung zu stellen. Jedoch ist die Verwendung von doppelten oder multiplen Genunterbrechungen in ihrem Effekt auf Virulenz und Immunogenität unvorhersehbar; die Einführung von multiplen Mutationen kann ein Bakterium für einen bestimmten Wirt übermäßig abschwächen [Linde et al., Vaccine 8:278–282 (1990); Zhang et al., Microb. Pathog., 26(3):121–130 (1999)].
Von Interesse zur vorliegenden Erfindung ist die Identifizierung von Pathogenitätsinseln (PAIs) in Salmonella und in anderen Bakterien, welche große, manchmal instabile, chromosomale Regionen beherbergende Klustern von Genen sind, die häufig die Virulenz-Charakteristika in enterischen Bakterien bestimmen. Die DNA-Basenanordnung der PAIs unterscheidet sich oft von jener der bakteriellen Chromosomen, in welchen sie angeordnet sind, was darauf hindeutet, daß sie möglicherweise durch horizontale Genübertragung erworben worden sind. Eine Salmonella-Pathogenitätsinsel, die Gene erforderlich für die epitheliale Zelleinwanderung enthält, ist bei ungefähr 63 Centrisomen (cs) auf dem S. typhimurium-Chromosom identifiziert worden und ist gezeigt worden, Gene zu enthalten, die Komponenten eines Typ III-(Kontakt-abhängigen) Sekretionssystems, abgesonderte Effektorproteine und assoziierte regulatorische Proteine [Millis et al., Mol Microbiol 15(4):749–95 (1995)] kodieren. Eine zweite Salmonella-PAI von 40 kb befindet sich bei 30,7 und ist als Salmonella-Pathogenitätsinsel 2 (SPI2) bezeichnet worden [Shea et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 19;93(6):2593–2597 (1996)]. Die Analysen der Nukleotidsequenz der Regionen von SPI2 offenbarten Gene, die für einen zweiten Typ III Sekretionsapparat kodieren, für den vorgeschlagen worden ist, daß er an einem Pathogenitätsstadium, das der epithelialen Zelldurchdringung folgt, involviert ist. Mutationen in einigen Genen innerhalb von SPI2 haben gezeigt, daß sie zu einer Abschwächung der bakteriellen Virulenz in Mäusen führen. Siehe U.S. Patent No. 5,876,931; Shea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2593–2597 (1996); Ochmann et al., Proc Natl Acad Sci USA; 93(15):7800–7804 (1996); Hensel et al., J. Bacteriol., 179(4):1105–1111 (1997); Hensel et al., Molec. Microbiol., 24(1):155–167 (1997); Dunyak et al., Poster präsentiert auf dem 97. Allgemeinen Meeting der Gesellschaft für Mikrobiologie (1997), p. 76.
Die WO 0014240 befaßt sich im Allgemeinen mit Impfstoffzusammensetzungen, die eine funktionelle Deletion von einem oder mehr Genen innerhalb des Salmonella-Pathogenitätsinsel 2 (SPI2)-Lokus umfassen, welche ssa-, sse-, ssc- und ssr-Gene mit einschließt und schlägt eine beträchtlich erweiterbare Klasse an Zusammensetzungen vor.
Die WO-A-0147962 offenbart Salmonella, in denen eine Kombination von zwei ssa-Genen für das Bilden eines Impfstoffes gegen Salmonelleninfektionen inaktiviert werden.
Eine Notwendigkeit für sichere und wirksamere lebende abgeschwächte Salmonella-Impfstoffe, die Idealerweise nicht in sehr großen Dosen verabreicht werden brauchen, besteht fort.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf sichere und wirksame Impfstoffe, die ein oder mehr Stämme von abgeschwächten Mutanten gram-negativer Bakterien verwenden, in welchen zwei oder mehr Gene, die homolog zu den Genen innerhalb der Salmonella-Pathogenitätsinsel 2 (SPI2) sind, vorzugsweise durch Deletion von ungefähr 5% bis ungefähr 100% des Gens, am meisten bevorzugt durch Deletion von ungefähr 50% oder mehr des Gens, inaktiviert worden sind. Besonders betrachtet werden Impfstoffe, die ein oder mehr Spezies von abgeschwächten Mutanten von Salmonella-Bakterien umfassen, in welchen zwei oder mehr Gene innerhalb der SPI2-Region inaktiviert worden sind. Entsprechend der Erfindung sind zwei oder mehr der ssa-, ssaT-, ssaJ-, ssaC- oder ssaM-Gene in den mutierten Bakterien inaktiviert worden. Die Erfindung basiert auf den Ergebnissen von umfangreichen Sicherheits- und Wirksamkeitstests dieser Impfstoffe, einschließlich der Impfstoffe, die mehr als einen Serotyp von Salmonella enthalten, in tierischen Spezies mit Ausnahme von Nagetieren, einschließlich Rindern und Schweinen.
Entsprechend einem Aspekt der Erfindung werden Impfstoffzusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die eine immunologisch schützende Menge einer ersten abgeschwächten Mutante eines Salmonellabakteriums, in welcher zwei oder mehr ssa-Gene inaktiviert werden, umfassen. Die ssa-Gene werden aus einer Gruppe bestehend aus ssaT, ssaJ, ssaC und ssaM ausgewählt. Geeignete Mengen werden variieren aber können ungefähr 10⁹ Bakterien oder weniger umfassen. In diesen mutierten Bakterien werden die inaktivierten Gene vorzugsweise durch Deletion eines Teils der kodierenden Region des Gens inaktiviert. Alternativ wird die Inaktivierung durch das Einfügen einer Mutation bewirkt. Jede Spezies der Salmonellabakterien, insbesondere die S. enterica-Subspezies und Subtypen, können entsprechend der Erfindung mutiert sein, einschließlich Salmonella aus den Serogruppen A, B, C₁, C₂, D₁ und E₁. Alle Salmonellenserovars gehören zu zwei Spezies: S. bongori und S. enterica. Die sechs Subspezies von S. enterica sind: S. enterica subsp. enterica (I oder 1), S. enterica subsp. salamae (II oder 2), S. enterica subsp. arizonae (IIIa oder 3a), S. enterica subsp. diarizonae (IIIb oder 3b), S. enterica subsp. houtenae (IV oder 4), S. enterica subsp. indica (VI oder 6). Beispielhafte Subspezies umfassen: S. Choleraesuis, S. Typhimurium, S. Typhi, S. Pararyphi, S. Dublin, S. Enteritidis, S. Gallinarum, S. Pullorum, Salmonella Anatum, Salmonella Hadar, Salmonella Hamburg, Salmonella Kentucky, Salmonella Miami, Salmonella Montevideo, Salmonella Ohio, Salmonella Sendai, Salmonella Typhisuis.
Zwei oder mehr Virulenzgene, welche Gene innerhalb der SPI2 sind, werden in den Mutanten der Salmonellabakterien inaktiviert. Die Gene sind ssa-Gene, die aus der Gruppe, bestehend aus ssaT, ssaJ, ssaC und ssaM, ausgewählt werden, welche inaktiviert worden sind. Vorzugsweise ist die Kombination aus ssaT und ssaC oder ssaT und ssaJ inaktiviert worden.
Die Impfstoffzusammensetzung kann weiterhin eine zweite abgeschwächte Mutante eines Salmonellabakteriums, in welcher ein oder mehr ssa-Gene inaktiviert worden sind, umfassen. In einem Aspekt wird das ssa-Gene aus einer Gruppe, bestehend aus ssaT, ssaJ und ssaC ausgewählt. Vorzugsweise sind die ersten und die zweiten abgeschwächten Mutanten der Salmonellabakterien von verschiedenen Serotypen. Für Rinder werden Impfstoffe, die sowohl S. dublin als auch S. typhimurium umfassen, bevorzugt.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung eines Medikaments, vorgesehen zur Immunisierung, zur Verfügung, d.h., die Übertragung schützender Immunität auf ein Tier unter Verwendung der Impfstoffzusammensetzung der Erfindung. Die Zeichen der schützenden Immunität werden unten beschrieben. Die Erfindung stellt ferner Verfahren für die Herstellung eines Medikaments, vorgesehen zur Verringerung der Übertragung der Infektion, zur Verfügung, durch die Verwendung der Impfstoffe der Erfindung in Mengen, welche wirkungsvoll sind, um die Menge oder die Dauer des Bakterien-Sheddings während der Infektion zu reduzieren. Tiere, die geeignete Empfänger solcher Impfstoffe sind, umfassen, beschränken sich aber nicht auf, Rinder, Schafe, Pferde, Schweine, Geflügel oder andere Vögel, Katzen, Hunde und Menschen. Die Verfahren der Erfindung verwenden jede der Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung, und vorzugsweise umfaßt der Impfstoff eine effektive Menge einer abgeschwächten, nicht-revertierende Mutante eines Salmonellabakteriums, in welchem zwei oder mehr Gene innerhalb der SPI2-Region entweder durch die Deletion eines Teil des Gens/der Gene, oder alternativ, durch das Einfügen einer Mutation, inaktiviert worden sind. Die Verfahren verwenden abgeschwächte Bakterien, worin zwei oder mehr ssa-Gene inaktiviert werden, welche ssa-Gene aus einer Gruppe, bestehend aus ssaT, ssaJ, ssaC und ssaM ausgewählt werden.
Entsprechend einem anderen Aspekt der Erfindung kann die abgeschwächten Mutante eines Salmonella-Bakteriums weiterhin ein Polynukleotid, welches für ein Nicht-Salmonella-Polypeptid kodiert, umfassen. Die Verabreichung der Mutanten der Bakterien oder einer Impfstoffzusammensetzung, die die Mutanten der Bakterien umfaßt, stellt folglich ein Medikament für die Abgabe eines immunogenen Polypeptid-Antigens an ein Tier zur Verfügung.
Zahlreiche zusätzliche Aspekte und Vorteile der Erfindung werden für den Fachmann nach der Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung, welche die zurzeit bevorzugten Ausführungsformen davon beschreibt, ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1, 2 und 3 zeigen eine schematische Darstellung der Nukleotidsequenzen von S. typhimurium, welche die internen Deletionen der ssaT-, ssaJ- und ssaC-Gene flankieren, jeweils im Genom des Wildtyps und im Genom der Mutante. Die obere Sequenz zeigt die Nukleotide, die die Deletionspunkte umgeben, während die untere Sequenz die DNA-Sequenz in dem deletierten Locus zeigt. Die kleinen Buchstaben kennzeichnen Nukleotide und die Großbuchstaben kennzeichnen Aminosäuren.
4 zeigt die Organisation der SPI2 in S. typhimurium, welche unter Verwendung von Sequenzen, erhältlich bei der Genbank (Accession #'s (Zugangsnummern) AJ224892, Z95891, U51927, Y09357 und X99944), zusammengestellt wurde. Die vorhergesagten offenen Leseraster werden als offene Boxen, mit der Angabe der Orientierung des offenen Leserasters, gezeigt. Das Diagram ist maßstäblich gezeichnet. Im unteren Bereich werden die Positionen der ssaC-, ssaJ- und ssaT-Deletionen angezeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Impfstoffe oder immunogene Zusammensetzung zur Verfügung, die ein oder mehr Spezies abgeschwächter Mutanten der Salmonellabakterien umfassen, in welchen zwei oder mehr Virulenz-Gene innerhalb der SPI2 deletiert worden sind. Ein Vorteil der Impfstoffe der vorliegenden Erfindung ist, daß die lebenden abgeschwächten Mutanten der Bakterien als Impfstoffe in angemessenen Dosen, über eine Vielzahl von verschiedenen Wegen verabreicht werden können, und dennoch eine schützende Immunität in den geimpften Tieren auslösen. Ein anderer Vorteil ist, daß die Mutanten der Bakterien, die Inaktivierungen in zwei verschiedenen Genen enthalten, nicht-revertierend sind, oder sie sind wenigstens viel weniger wahrscheinlich dafür anfällig, daß sie zu einem virulenten Zustand revertieren.
Die Gefahr der Reversion kann durch mehrfaches Passagieren der Bakterien (z.B. 5 Passagen) und Verabreichung der resultierenden Bakterien an die Tiere, beurteilt werden. Nicht-revertierende Mutanten werden abgeschwächt fortbestehen.
Die Beispiele hierin zeigen, daß die Inaktivierung von zwei oder mehr Genen innerhalb der SPI2 die Bakterien nicht weiter schwächt (oder übermäßig schwächt), im Vergleich zu Bakterien, in welchen nur ein Gen ausgeschaltet worden ist. Die Beispiele demonstrieren auch, daß Deletionen von Genen innerhalb der SPI2 sichere und wirkungsvolle Impfstoffe ergeben, wie die wahrnehmbaren Verminderungen der nachteiligen Zeichen und Symptome, assoziiert mit der Infektion durch wildtypischen Bakterien, zeigten. Beispielhafte Impfstoffe der gegenwärtigen Erfindung haben gezeigt, daß sie eine höhere schützende Immunität im Vergleich zu anderen Impfstoffen, die lebende abgeschwächte Bakterien, z.B., Salmo Shield^®TD (Grand Laboratories, Inc.), enthalten und Mutanten der Salmonella-Bakterien, die Δrfa K- oder Δcya Δcrp-Mutationen enthalten, verleihen. Die Beispiele demonstrieren weiterhin, daß ein Kombinationsimpfstoff, welcher zwei oder mehr Stämme abgeschwächten Salmonella-Mutanten oder verschiedene Serotypen enthält, wirksamer ist und daß die Einbeziehung von verschiedenen Serotypen nicht eine Beeinträchtigung der Immunantwort verursacht.
Wenn zwei oder mehr Gene innerhalb SPI2 inaktiviert werden, sind die zwei Gene von der gleichen SPI2 „Region". Die Gene sind von der gleichen Gruppe oder funktionellen Gruppe wie in 4 dargestellt, welche die strukturellen Komponenten, ssa (Sekretionssystem-Apparat, ssaC ssaJ, ssaM und/oder ssaT) umfasst.
Die Nukleotidsequenz von ssaT von S. dublin wird in SEQ ID NO: 1 dargelegt. Die Nukleotidsequenz von ssaT von S. typhimurium wird in SEQ ID NO: 2 dargelegt. Wie hierin verwendet, umfasst „ssaT" die SEQ ID NOS: 1, 2 und andere Salmonella-Spezies Äquivalente davon, z.B. Salmonella-Nukleotidsequenzen in Gesamtlänge, die an das nicht-kodierende Gegenstück von SEQ ID 1 oder 2 unter stringenten Bedingungen hybridisieren (z.B. wie in 4 von Shea et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 93:2593–2597 (1996) beschrieben), und Salmonella-Nukleotidsequenzen in Gesamtlänge, welche eine 95 %ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 1 oder 2 haben. Salmonella-Spezies Äquivalente können leicht durch Fachleute identifiziert werden und umfassen auch Nukleotidsequenzen mit, z.B. 95 %iger, 98 %iger und 99 %iger Identität zu SEQ ID NO: 1 oder 2.
Die Nukleotidsequenz von ssaJ von S. dublin wird in SEQ ID NO: 3 dargelegt. Die Nukleotidsequenz von ssaJ von S. typhimurium wird in NO: 4 dargelegt. Wie hierin verwendet, umfasst „ssaJ" die SEQ ID NOS: 3, 4, und andere Salmonella-Spezies Äquivalente davon, z.B. Salmonella-Nukleotidsequenzen in Gesamtlänge, welche an das nicht-kodierende Gegenstück von SEQ ID 3 oder 4 unter stringenten Bedingungen hybridisieren, und Salmonella-Nukleotidsequenzen in Gesamtlänge, welche eine 95 %ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 3 oder 4 haben.
Salmonella-Spezies Äquivalente können leicht durch Fachleute identifiziert werden und umfassen auch Nukleotidsequenzen mit, z.B. 95 %iger, 98 %iger und 99 %iger Identität zu SEQ ID NO: 3 oder 4.
Die Nukleotidsequenz von ssaC von S. dublin wird in SEQ ID NO: 5 dargelegt. Die Nukleotidsequenz von ssaC von S. typhimurium wird in NO: 6 dargelegt. Wie hierin verwendet, umfasst „ssaC" die SEQ ID NOS: 5, 6, und andere Salmonella-Spezies Äquivalente davon, z.B. Salmonella-Nukleotidsequenzen in Gesamtlänge, welche an das nicht-kodierende Gegenstück von SEQ ID 5 oder 6 unter stringenten Bedingungen hybridisieren, und Salmonella-Nukleotidsequenzen in Gesamtlänge, welche eine 95 %ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 5 oder 6 haben.
Salmonella-Spezies Äquivalente können leicht durch Fachleute identifiziert werden und umfassen auch Nukleotidsequenzen mit, z.B. 95 %iger, 98 %iger und 99 %iger Identität zu SEQ ID NO: 5 oder 6.
Die Nukleotidsequenz von ssaM von S. dublin wird in SEQ ID NO: 30 dargelegt. Die Nukleotidsequenz von ssaM von S. typhimurium wird in NO: 7 dargelegt. Wie hierin verwendet, umfasst „ssaM" die SEQ ID NOS: 7, 30, und andere Salmonella-Spezies Äquivalente davon, z.B. Salmonella-Nukleotidsequenzen in Gesamtlänge, welche an das nicht-kodierende Gegenstück von SEQ ID 7 oder 30 unter stringenten Bedingungen hybridisieren, und Salmonella-Nukleotidsequenzen in Gesamtlänge, welche eine 90 %ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 7 oder 30 haben. Salmonella-Spezies Äquivalente können leicht durch jene mit fachlicher Fähigkeit identifiziert werden und umfassen auch Nukleotidsequenzen mit, z.B. 95 %iger, 98 %iger und 99 %iger Identität zu SEQ ID NO: 7 oder 30.
Die Nukleotidsequenzen anderer Gene in SPI2 können unter Verwendung von Sequenzen, verfügbar in der Genbank (z.B. Zugangsnummern # AJ224892, AJ224892, Z95891, U51927, Y09357, X99944), welche die SPI2 betreffen, angeordnet werden.
Wie hierin verwendet, bedeutet ein „inaktiviertes" Gen, daß das Gen durch Insertion, Deletion oder Substitution der Nukleotidsequenz mutiert worden ist, so daß die Mutation die Expression und/oder die biologische Aktivität des kodierenden Genprodukts inhibiert oder vernichtet. Die Mutation kann durch die Beeinträchtigung der Transkription oder Translation des Gens oder seiner mRNA fungieren oder die Mutation kann das Polypeptid-Genprodukt selbst in solch einer Weise beeinflussen, die es inaktiv macht.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Inaktivierung durch die Deletion eines Teils der kodierenden Region eines Gens übertragen, da eine Deletionsmutation das Risiko, daß die Mutante wieder zu einem virulenten Zustand revertieren wird, reduziert. Beispielsweise kann etwas, das meiste (z.B. die Hälfte oder mehr) oder praktisch die gesamt kodierende Region deletiert werden (z.B. circa 5% bis circa 100% des Gens, aber vorzugsweise circa 20% oder mehr des Gens und am meisten bevorzugt kann circa 50% oder mehr des Gens deletiert werden). Alternativ kann die Mutation eine Insertion oder eine Deletion von selbst einem einzelnen Nukleotids sein, welche eine Rahmenverschiebung im offenen Leserahmen bewirkt, die wiederum die vorzeitige Terminierung des kodierten Polypeptids oder die Expression eines völlig inaktiven Polypeptids verursachen kann. Mutationen können auch durch die Insertion von fremden DNA-Sequenzen, z.B. die Insertion eines Gens, welches für ein Antibiotika-Resistenz kodiert, hergestellt werden.
Deletionsmutanten können unter Verwendung einer, aus einer Anzahl von in dem Fachgebiet gut bekannten und routinemäßig praktizierten Techniken, konstruiert werden. In einem Beispiel kann eine Strategie unter Verwendung gegenselektierbarer Marker zum Einsatz kommen, welche allgemein genutzt worden ist, um Gene in vielen Bakterien zu deletieren. Für ein Review, siehe zum Beispiel, Reyrat, et al., Infection and Immunity 66:4011–4017 (1998). In dieser Technik wird oft eine Doppelselektionsstrategie eingesetzt, worin ein Plasmid konstruiert wird, welches sowohl einen selektierbaren als auch einen gegenselektierbaren Marker kodiert, mit flankierenden, von beiden Seiten der gewünschten Deletion abgeleiteten, DNA-Sequenzen. Der selektierbare Marker wird verwendet, um nach Bakterien zu selektieren, in welchen das Plasmid in das Genom an geeigneter Stelle und auf geeignete Art und Weise integriert hat. Der gegenselektierbare Marker wird verwendet, um nach einem sehr kleinen Anteil von Bakterien zu selektieren, die spontan das integrierte Plasmid entfernt haben. Eine Fraktion dieser Bakterien wird dann nur die gewünschte Deletion ohne andere anwesende fremde DNA enthalten. Der Schlüssel zur Verwendung dieser Technik ist die Verfügbarkeit eines geeigneten gegenselektierbaren Markers.
In einer anderen Technik wird das cre-lox-System zur Orts-spezifischen Rekombination von DNA verwendet. Das System besteht aus 34 Basenpaar-lox-Sequenzen, die vom bakteriellen cre-Rekombinase-Gen erkannt werden. Wenn die lox-Stellen in der DNA in geeigneter Orientierung vorhanden sind, wird die DNA, die von den lox-Stellen flankiert wird, durch die cre-Rekombinase ausgeschnitten, was die Deletion aller Sequenzen außer einer restlichen Kopie der lox-Sequenz ergibt. Unter Verwendung von Standardrekombinationstechniken ist es möglich, das interessierende Zielgen im Salmonella-Genom zu entfernen und es durch einen selektierbaren Marker zu ersetzen (z.B. ein Gen, das für Kanamycin-Resistenz kodiert), das von den lox-Stellen flankiert wird. Die transiente Expression (durch Elektroporation eines Suizid-Plasmids, welches das cre-Gen unter Kontrolle eines Promotors, welcher in Salmonella funktioniert, enthält) der Cre-Rekombinase sollte die effiziente Eliminierung der lox-flankierenden Marker ergeben. Dieser Prozeß würde zu eine Mutante führen, die die gewünschte Deletionsmutation und eine Kopie der lox-Sequenzen enthält.
In einem anderen Ansatz ist es möglich, die gewünschte deletierte Sequenz im Salmonella-Genom direkt durch ein Markergen, wie zum Beispiel grün fluoreszierendes Protein (GFP), β-Galaktosidase oder Luziferase, zu ersetzen. In dieser Technik werden DNA-Segmente, die eine gewünschte Deletion flankieren, mittels PCR erstellt und in einen Suizid(nicht-replizierenden)-Vektor für Salmonella kloniert. Eine Expressionskassette, die einen in Salmonella aktiven Promotor und ein geeignetes Markergen enthält, wird zwischen die flankierenden Sequenzen kloniert. Das Plasmid wird in wildtypische Salmonella eingeführt. Bakterien, die das Markergen einbauen und exprimieren (wahrscheinlich bei einer sehr niedrigen Frequenz) werden isoliert und nach dem entsprechenden Rekombinationsereignis (d.h. Austausch des wildtypischen Gens mit dem Markergen) untersucht.
Damit ein modifizierter Stamm in einer Impfstoff-Formulierung wirkungsvoll ist, muss die Abschwächung erheblich genug sein, um den Erreger vor dem Hervorrufen von schwerwiegenden klinischen Symptomen zu bewahren, aber auch geringfügig genug sein, um eine limitierte Replikation und das Wachstum der Bakterien im Empfänger zu ermöglichen. Der Empfänger ist ein Proband, der Schutz vor einer Erkrankung, die durch die virulente Form von Salmonella oder anderen pathogenen Mikroorganismen verursacht wird, benötigt. Der zu immunisierende Proband kann ein Mensch oder ein anderes Säugetier oder ein Tier sein, z.B., Nutztiere, einschließlich Rinder, Schafe, Schweine, Pferde, Ziegen und Geflügel (z.B. Hühner, Truthähne, Enten und Gänse) und Gesellschaftstiere wie zum Beispiel Hunde und Katzen; exotische und/oder Zootiere. Die Immunisierung sowohl von Nagetieren als auch von Nichtnagetieren wird erwogen.
Die abgeschwächten mutierten Bakterien sollen in einer wirksamen Menge verabreicht werden, um eine Immunantwort in dem Empfänger zu induzieren, die ausreichend ist, um die Anzeichen oder Symptome der Erkrankung zu verhindern oder zu verbessern, einschließlich gesundheitsschädigender Wirkungen oder Komplikationen davon, verursacht durch die Infektion mit wildtypischen Salmonella-Bakterien. Entweder können humorale Immunität oder Zell-vermittelte Immunität oder beides induziert werden. Die Immunantwort eines Tiers auf eine Impfstoffzusammensetzung kann, z.B. indirekt durch die Bestimmung des Antikörper-Titers, durch Lymphozyten-Proliferationstests oder direkt durch die Beobachtung der Anzeichen und Symptome nach der Konfrontation mit dem wildtypischen Stamm, ausgewertet werden.
Die durch einen Impfstoff verliehene schützende Immunität kann durch Messung, z.B. der Verminderung klinischer Anzeichen wie Sterblichkeit, Morbidität, Temperaturzahl und prozentualer Anteil der Tage mit Durchfall, Milchproduktion oder -ausbeute, durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme, körperlicher Zustand und allgemeine Gesundheit und Auftritt des Probanden, beurteilt werden.
Wenn eine Kombination von zwei oder mehreren verschiedenen Serotypen von Bakterien verabreicht werden, ist es höchst erstrebenswert, daß es wenig oder keine Beeinträchtigung zwischen den Serotypen gibt, so daß der Wirt nicht vor der Bildung einer schützenden Immunantwort zu einem der zwei oder zu mehreren verabreichten Serotypen bewahrt wird. Eine Beeinträchtigung kann auftreten, z.B. wenn ein Stamm in dem Wirt vorherrscht, bis hin zu dem Punkt, daß er den Wirt an der Entwicklung einer schützenden Immunantwort zu dem anderen Stamm hindert oder beschränkt. Andernfalls kann ein Stamm auch direkt den anderen Stamm inhibieren.
Zusätzlich zur Immunisierung des Empfängers können die Impfstoffe der Erfindung auch das Wachstum des Empfängers fördern und/oder die Immunität des Empfängers erhöhen und/oder den gesamten Gesundheitsstatus des Empfängers verbessern. Bestandteile der Impfstoffe der Erfindung oder mikrobiologische Produkte können als Regulatoren des Immunsystems agieren, die Aspekte des Immunsystem hemmen oder erhöhen kann. Beispielsweise können die Impfstoffe der Erfindung Wege signalisieren, die Zytokine rekrutieren würden, was einen allumfassenden positiven Vorteil für den Wirt haben würde.
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung stellen auch für die tierische und menschliche Gemeinschaft Gesundheitsvorteile bereit, indem sie das Shedding von virulenten Bakterien durch infizierte Tiere reduzieren. Entweder können der Abwurf der bakteriellen Last (Menge der Bakterien, z.B., CFU/ml Fäkalien) oder die Dauer des Sheddings (z.B., prozentuale Zahl von Tagen, an denen Shedding beobachtet wird) reduziert werden, oder beides. Vorzugsweise wird die Shedding-Ladung um ungefähr 10% oder mehr, verglichen mit nicht-geimpften Tieren, vorzugsweise um 20 % oder mehr, reduziert, und/oder es wird die Dauer des Sheddings um wenigstens 1 Tag oder vorzugsweise um 2 oder 3 Tage, oder um 10% oder mehr oder um 20% oder mehr, reduziert.
Obwohl es für abgeschwächte Bakterien der Erfindung möglich ist, alleine verabreicht zu werden, werden ein oder mehrere solcher Bakterienmutanten vorzugsweise in Verbindung mit geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Arzneistoffträger(n), Verdünnungsmittel(n), Hilfsstoffe(n) oder Träger(n) verabreicht. Der/die Träger müssen „akzeptabel", im Sinne von mit den abgeschwächten mutierten Bakterien der Erfindung kompatibel und nicht schädlich zu den zu immunisierenden Probanden sein. Gewöhnlich sind die Träger Wasser oder Salz, die steril und pyrogen-frei sind.
Jeder in der Fachwelt bekannte Hilfsstoff kann in der Impfstoffzusammensetzung verwendet werden, einschließlich auf Öl-basierende Hilfsstoffe wie beispielsweise das vollständige Freund's-Hilfsmittel, das unvollständige Freund's-Hilfsmittel, auf Mykolat-basierende Hilfsstoffe (z.B., Trehalose-Dimykolat), bakterielle Lipopolysaccharide (LPS), Peptidoglykane (d.h. Mureine, Mucopeptide oder Glykoproteine, wie zum Beispiel N-Opaca, Muramyldipeptid [MDP] oder MDP-Analoge), Proteoglykane (z.B., extrahiert von Klebsiella pneumoniae), Streptokokken-Präparate (z.B. OK432), Biostim^TM (z.B. 01K2), die „Iscoms" von EP 109 942 , EP 180 564 und EP 231 039 , Aluminiumhydroxid, Saponin, DEAE-Dextran, neutrale Öle, (wie zum Beispiel Miglyol), pflanzliche Öle (wie zum Beispiel Erdnußöl), Liposome, Pluronic^®-Polyole, das Ribi-Hilfstoffsystem (siehe zum Beispiel GB-A-2 189 141) oder Interleukine, vorzugsweise jene, die Zell-vermittelte Immunität stimulieren. Ein aus Extrakten von Amycolatea, eine bakterielle Gattung in der Ordnung Actinomycetales, bestehender alternativer Hilfsstoff ist in dem US Patent 4,877,612 beschrieben worden. Zusätzlich sind geschützte Hilfsstoff-Mischungen kommerziell erhältlich. Der verwendete Hilfsstoff hängt zum Teil von dem Empfängerorganismus ab. Die Menge des zu verabreichenden Hilfsstoffs hängt von der Art und von der Größe des Tiers ab. Die optimale Dosierungen können durch Routinemethoden leicht festgestellt werden.
Die Impfstoffzusammensetzungen können wahlweise Impfstoff-kompatible pharmazeutisch akzeptable (d.h. sterile und nicht toxische) flüssige, halb feste, oder feste Verdünnungsmittel umfassen, die als pharmazeutische Vehikel, Hilfsstoffe oder Medien dienen. Jedes in der Fachwelt bekannte Verdünnungsmittel kann verwendet werden. Exemplarische Verdünnungsmittel umfassen, allerdings ohne Einschränkung darauf, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, Magnesiumstearat, Methyl- und Propylhydroxybenzoat, Talkum, Alginat, Stärke, Laktose, Saccharose, Dextrose, Sorbit, Mannitol, Akaziengummi, Calciumphosphat, Mineralöl, Kakaobutter und Theobroma-Öl beschränkt.
Die Impfstoffzusammensetzungen können in für die Verabreichung geeignete Formen verpackt werden. Die Zusammensetzungen können im Innern einer Kapsel, eines Caplets, eines Duftkissens, einer Kapsel aus Stärkemasse, von Gelatine, von Papier oder von anderen Behältern eingeschlossen sein. Diese Verabreichungsformen werden bevorzugt, wenn sie mit dem Eintritt der immunogenen Zusammensetzung in den Empfängerorganismus vereinbar sind und vor allem, wenn die immunogene Zusammensetzung in Form von Einheitsdosen verabreicht wird. Die Dosiseinheiten können z.B., in Tabletten, Kapseln, Zäpfchen oder Kapseln aus Stärkemehl verpackt werden.
Die Impfstoffzusammensetzungen können in den zu immunisierenden Probanden durch jede konventionelle Methode eingeführt werden, einschließlich, z.B., durch intravenöse, intradermale, intramuskuläre, intramammäre, intraperitoneale oder subkutane Injektionen; durch orale, transdermale, sublinguale, intranasale, anale oder vaginale Verabreichung. Die Behandlung kann aus einer einzelnen Dosis oder einer Vielzahl von Dosen über einen Zeitraum bestehen.
Abhängig vom Verabreichungsweg umfassen die geeigneten Mengen der zu verabreichenden Bakterienmutanten ~10⁹ Bakterien oder weniger, unter der Bedingung, daß eine adäquate Immunantwort durch den Impfstoff induziert wird. Dosen von ~10¹⁰ oder weniger oder ~10¹¹ oder weniger können erforderlich sein, um die gewünschte Antwort zu erzielen. Dosen deutlich höher als ~10¹¹ können kommerziell nicht wünschenswert sein.
Ein anderer Aspekt der Erfindung umfasst die Konstruktion von abgeschwächten mutierten Bakterien, die zusätzlich eine Polynukleotidsequenz, die ein heterologes Polypeptide kodiert, beinhalten. Beispielsweise würde für Salmonella ein „heterologes" Polypeptid ein Nicht-Salmonella-Polypeptide sein, welches normalerweise nicht durch Salmonellabakterien exprimiert wird. Solche abgeschwächten Bakterienmutanten können in Verfahren zur Verabreichung des heterologen Polypeptids oder der DNA verwendet werden. Beispielsweise könnte Salmonella hergestellt werden, um nach den Eintritt in das Zellplasma der eukaryontischen Wirtszelle, ohne bedeutende Schäden zu verursachen, zu lysieren und dabei zu einem Vektor für die Einführung von Plasmid-DNA in die Zelle zu werden. Geeignete heterologe Polypeptide umfassen immunogene Antigene von anderen infektiösen Mitteln (einschließlich gram-negative Bakterien, gram-positive Bakterien und Viren), die eine schützende Immunantwort in den Empfängern hervorrufen, und die Expression des Polypeptide-Antigens durch die Bakterienmutanten im Impfstoff veranlaßt den Empfänger, gegen das Antigen immunisiert zu werden. Andere heterologe Polypeptide, die unter Verwendung der Salmonella-Mutante eingeführt werden können, schließen immuno-regulatorische Moleküle, z.B. Zytokine oder „Performanz"-Proteine, wie die Wachstumshomone GRH und GDF-8, mit ein.
Beispiel 1 befaßt sich mit der Konstruktion von abgeschwächten Mutanten der Salmonella-Bakterien, die bestimmte Einzel- oder Doppeldeletionen in den ssaT-, ssaJ-, ssaC-, rfaK- und glnA-Genen enthalten; und mit der Konstruktion einer Salmonella-Mutante, die inaktivierende Insertionen enthält. Beispiel 2 befaßt sich mit den Ergebnissen der Sicherheits- und Wirksamkeitstests von mit diesen abgeschwächten Mutanten der Salmonella-Bakterien geimpften Tieren.
Beispiel 1
Konstruktion von Salmonella-Mutanten, die Einzel- und Doppeldeletionen der ausgewählten Gene: ssaT, ssaJ, ssaC, rfaK und glnA, enthalten.
A. Konstruktion von pCVD442::ΔGen-Plasmiden.
Für jedes der S. typhimurium und S. dublin ssaT-, ssaJ-, ssaC-, rfaK- und glnA-Gene wurden positive Selektions-Suizid-Vektoren basierend auf dem Plasmid pCVD442 [Donnenberg und Kaper, Infect Immun 59:4310–17 (1991)] konstruiert, die einen Teil der 5'- und 3'-chromosomalen Regionen enthielten, die jedes Gen flankieren, allerdings mit erheblicher internen Deletion (üblicherweise > 95%) innerhalb des Gens selbst. Gen-Spleißen durch überlappende Erweiterung („gene SOEing" [Horton et al., Biotechniques 8:528–535 (1990)]) wurde verwendet, um DNA-Fragmente zu erzeugen, die zu dem zu deletierenden Gen komplementär waren aber denen die Mehrheit der internen Nukleotidsequenz fehlte. Die Plasmide, die diese intern deletierten Gene enthalten, wurden jeweils als pCVD442::ΔssaT, pCVC442::ΔssaJ, pCVD442::ΔssaC pCVD442::ΔrfaK und pCVD442::ΔglnA bezeichnet. Diese Vektoren wurden dann verwendet, um S. typhimurium- und S. dublin-Deletionsmutanten durch Allel-Ausstausch zu generieren. Die Plasmide, welche die S. dublin-deletierten Gene enthalten wurden verwendet, um die Deletionen in S. dublin zu erzeugen, und Plasmide, die S. typhimurium-Sequenzen enthalten wurden verwendet, um die Deletionen in S. typhimurium zu erzeugen (siehe Beispiel 1B unten).
In Kürze, es wurden zwei Sets von PCR-Primern designt, um ungefähr 600 bp-Fragmente, die komplementär zu der DNA sind, die die 5'- und 3'-Stellen des gewünschten Gens flankiert, zu synthetisieren. Die Primer A und D (Tabelle 1) enthalten chromosomale Sequenzen jeweils aufwärts und abwärts des gewünschten Gens und jeder enthält auch die Nukleotidsequenz für eine gewünschte Restriktionsendonukleaseschnittstelle. Der Primer B umfaßt die Aufwärtsverbindung zwischen den Sequenzen, die unmittelbar die 5'Stelle des Gens und das Gen selbst flankieren und er schließt etwas von einem Teil des 5'Endes des Gens (in manchen Fällen nur das Stop-Codon) mit ein. Gleichermaßen umfaßt Primer C die Abwärtsverbindung zwischen den Sequenzen, die unmittelbar die 3'Stelle des Gens und das Gen selbst flankieren und er schließt etwas von einem Teil des 3'Endes des Gens (in manchen Fällen nur das Start-Codon) mit ein. PCR-Reaktionen mit genomischer DNA von S. typhimurium oder S. dublin und entweder mit Primern A und B oder Primern C und D wurden durchgeführt und erbrachten PCR-Produkte (jeweils die gewünschten Fragmente AB und CD) von ungefähr 600 bp, mit Sequenzen, die jeweils mit den aufwärts und abwärts flankierenden Regionen des gewünschten Gens korrespondieren. Jedes AB- oder CD-Fragment enthielt auch die gewünschte Restriktionsschnittstelle (Xba I for ssaT, ssaJ, ssaC und glnA und Sal I für rfaK). Eine zweite PCR-Reaktion wurde dann unter Verwendung der Fragmente AB und CD mit den Primern A und D durchgeführt und erbrachte ein als Fragment AD bezeichnetes PCR-Produkt. Das Fragment AD ist komplementär zu der das Zielgen umgebenden Nukleotidsequenz, enthält jedoch hauptsächlich eine vollständige Deletion der Zielsequenz (>95% Deletion) für ssaS, ssaT, rfaK und glnA und eine Deletion der C-terminalen Hälfte (~50% Deletion) für ssaJ (siehe 1–3). Das resultierende PCR-Produkt für jedes der S. dublin oder S. typhimurium ΔssaT-, ΔssaJ-, ΔssaC-,Δ rfaK- und ΔglnA-Gene wurde dann durch verschiedene Vektoren und Wirtsstämme kloniert und schließlich in die Mehrfachklonierungsstelle des Vektors pCVD442 im Wirtsstamm SM10λpir eingefügt.
1, 2 und 3 zeigen die Nukleotidsequenzen, die die Stellen der ssaT-, ssaJ- und ssaC-Gene im wildtypischen Genom und im mutierten Genom flankieren. Diese Mutationen wurden hergestellt um so viel wie möglich des offenen Leserahmens zu entfernen. Im Falle der ssaC-(1052 bp) und ssaT-(779 bp) Gene wurde von jedem der gesamte offene Leserahmen deletiert und nur das Start- und Stop-Codon (6 bp) zurückgelassen nachdem die Deletion erzeugt wurde. Nur die C-terminale Hälfte des ssaJ-Gens konnte entfernt werden als die Deletion erzeugt wurde. Dies reduzierte die Größe des Gens von 749 auf 324 bp.
4 zeigt die genetische Anordnung des SPI2 Locus in S. typhimurium. Dies ist eine Aufstellung der SPI2-Region von S. typhimurium, angeordnet unter Verwendung der Sequenzen erhältlich von der GenBank (Zugangsnummern AJ224892, Z95891, U51927, Y09357 und X99944). Gezeigt sind auch die Positionen, der in den ssaC-, ssaJ- und ssaT-Genen erstellten Deletionen.
Die Gene von S. dublin und S. typhimurium sind ähnlich genug, so daß die gleichen Primer für beide Arten benutzt werden konnten.
B. Konstruktion von Deletionsmutanten von S. typhimurium und S. dublin.
Die im obigen Beispiel 1A hergestellten pcVD442::ΔGen-Plasmide wurden verwendet, um Deletionsmutanten durch homologe Rekombination mit dem geeigneten Salmonella-Stamm zu erzeugen, d.h. ein Plasmid, welches das deletierte Gen enthält, wurde verwendet, um die Deletion in S. dublin herzustellen und ein Plasmid, welches die S. typhimurium-Sequenzen enthält, wurde verwendet, um die Deletion in S. typhimurium herzustellen. Das Plasmid pcVD442 ist ein positiver Selektionssuizidvektor. Es enthält den Replikationsursprung für R6K-Plasmide (ori), das Mobilisierungsgen für RP4-Plasmide (mob), das Gen für Ampicillinresistenz (bla), das sacB-Gen von B. subtilis, welches das Gen für Levan-Saccharose kodiert und eine Mehrfachklonierungsstelle.
Das Plasmid pcVD442 kann extrachromosomal nur in bakteriellen Stämmen, die das π-Protein, das pir-Genprodukt (z.B. E. coli SM10λpir oder DH5αλpir), herstellen, erhalten werden. Die Einfuhr eines auf pcVD442 basierenden Vektors in einen nicht-toleranten Wirtsstamm (S. typhimurium oder S. dublin) durch Konjugation und Selektion auf Ap (Ampicillin)- und Nal (Nalidixinsäure))-enhaltenen Medium, erlaubt die Isolierung von Ap^R teilweise diploiden (merodiploiden) Isolaten, in welchen das Plasmid in das Genom des Zielstamms durch homologe Rekombination mit dem wildtypischen Gen integriert hat.
In Kürze, der E. coli Stamm SM10λpir (thi thr leu tonA lacY supE recA::RP4-2-Tc::Mu km) [(Donnenberg und Kaper, Infect Immun 59:4310–17 (1991)], welcher die pCVD442-Plasmide mit den S. typhimurium oder S. dublin ΔssaT-, ΔssaJ-, ΔssaC-, ΔrfaK- oder ΔglnA-Genen (als SM10λpir/pCVD442::Δ-Gene bezeichnet) trägt, wurden mit Nal^R S. typhimurium MK315N oder S. dublin B94-058N gepaart, und die Rekombinanten wurden auf Ap und Nal ausgewählt. Sowohl MK315N als auch B94-058N sind spontane Nal^R-Stämme, hergestellt durch Ausplattieren der entsprechenden Elternstämme auf LB-Agar, der 50μg/ml Nal (jeweils klinische Isolate von einem Rind oder Mensch als Proband) enthält. Die wiederhergestellten Ap^RNal^R-Rekombinanten müssen das Plasmid in das Chromosom integriert haben, da das Plasmid extrachromosomal nicht erhalten werden kann. Dies ergibt die Bildung eines teilweise diploiden (merodiploiden) Stamms, der das in diesen Genort auf dem Chromosom integrierte pCVD442::ΔGen-Plasmid enthält.
Die Ap^RNal^R S. typhimurium MK315N::pCVD442::ΔGen- und die S. dublin B94-058N::pCVD:: ΔGen-Rekombinaten wurden dann unter nicht-selektiven Bedingungen aufgezogen, gefolgt von Wachstum auf LA (-Saccharose)- und TYPES (+Saccharose)-Agar. In der Abwesenheit von Selektionsdruck kann ein spontanes Rekombinationsereignis auftreten, in welchem das pCVD442-Plasmid und entweder das wildtypische Gen oder das deletierte Gen aus dem Chromosom herausgeschnitten werden. Die Zellen, die das pCVD442-Plasmid behalten, wurden auf TYPES-Nährboden durch die giftigen Produkte Zähler-selektiert, die aus der Aufspaltung von Saccharose durch die Levan-Sucrase, kodiert durch das sacB-Gen, produziert wurden. Infolgedessen wird die Anzahl der Kolonien auf TYPES-Nährboden im Verhältnis zu der Zahl auf LA verringert. Nach der Bestätigung des Ap^S-Phänotyps der isolierten Kolonien auf dem TYPES-Nährboden wurden die Rekombinanten durch PCR analysiert, um festzustellen, ob das wildtypische Gen oder das deletierte Gen behalten worden waren.
In Anfangsexperimenten wurde der Spender und der Empfänger für 5 Stunden auf LB-Nährboden verpaart und dann auf LB-Nährboden, welches Nal (20 oder 100μg/ml) und Ap enthält, selektiert. Obwohl starkes Wachstum auf der Ausgangsselektionsplatte auftrat, konnten, wenn überhaupt, wenige der isolierten Kolonien als Ap^RNal^R bestätigt werden. Die Unfähigkeit rekombinantes Wachstum zu isolieren, lag wahrscheinlich am Wachstum des Empfängers, als ein Ergebnis des Abbaus von Ampicillin durch die Freigabe der β-Lactamase von den Spenderzellen. Um dieses Problem zu überwinden wurden Paarungs- und Selektionsbedingungen entworfen, die die Rekombinanten bevorzugten und gegen die Spender- und Empfängerstämme selektionierten. Speziell wurden Empfänger- und Spenderstämme über Nacht auf LB-Nährboden oder auf modifiziertem M9-Nährboden (Difco Laboratory, Detriot, MI) gepaart, gefolgt von der Anreicherung von Rekombinanten durch das Wachstum in selektiver (Nal und Ap (75μg/ml)) LB-Brühe (Difco laboratory, Detriot, MI) und der Isolierung auf selektivem (Nal und Ap (75μg/ml)) Nährbodenmedium. Die Paarung auf modifiziertem M9-Nährmedium gestattete das Auftreten von Konjugation, begrenzte jedoch die Replikation, welches die Zahl der Spender- und Empfängerzellen verringerte, die in die Selektionsbrühe eingebracht wurden. Das Wachstum zur frühen logarithmischen Phase in der Selektionsbrühe bevorzugte die Replikation von Rekombinanten aber nicht der Spender- und Empfängerstämme. Die anschließende Selektion auf LB-Nährmedium mit Nal und Ap (75μg/ml von jedem) favorisierte weiter die Rekombinanten gegenüber dem Spender und dem Empfänger, welches bestätigt wurde, als fast alle isolierten Kolonien Ap^RNal^R waren. Diese Verfahren erbrachte teilweise diploiden (merodiploiden) S. typhimurium- oder S. dublin-Rekombinanten, die das entsprechende Plasmid pCVD442::ΔGen integriert in das Genom tragen.
Meridiploide Isolate wurden dann unter nicht-selektiven Bedingungen bis zur späten logarithmischen Phase wachsen gelassen und zu LB-Nährboden und TYPES-Nährboden überimpft. Während des nicht-selektiven Wachstums kann ein spontanes Rekombinationsereignis zwischen den duplizierten Sequenzen im merodiploiden Stadium auftreten und eine Kopie entweder des wildtypischen oder des deletierten Gens im Chromosom lassen. Wachstum auf Saccharose (TYES) wählt gegen jene Zellen aus, die das zweite Rekombinationsereignis nicht durchgemacht haben, weil die Produkte der Levansucrase, kodiert durch das sacB-Gen auf dem pCV442-Plasmid, toxisch zu gram-negativen Zellen sind. Infolgedessen ist die Zahl der Kolonien auf TYES-Nährboden viel niedriger als auf LA. In unseren Händen war es kritisch die Platten bei Raumtemperatur zu inkubieren, damit die Selektion erfolgreich ist. Die Inkubation bei höheren Temperaturen (30°C oder 37°C) verringerte nicht die Zahl der Kolonien auf TYES relativ zu LA, was darauf hinweist, daß die Selektion für pCVD442-negative Zellen nicht erfolgte.
Auf TYES-gewachsene Kolonien wurden für einzelne Kolonien ausgestrichen und der Nal^R Ap^S-Phänotyp bestätigt. Es wurde dann eine PCR-Analyse der genomischen DNA der Kolonien unter Verwendung der geeigneten und oben für jedes Gen beschriebenen Primer A und D durchgeführt, um festzustellen, ob das deletierte oder wildtypische Gen im Chromosom behalten worden war. Für ssaT zeigte ein PCR-Produkt von 1206 bp (im Vergleich zu 1980 bp im wildtypischen Gen) an, daß das Gen deletiert worden war. Für ssaJ zeigte ein PCR-Produkt von 1074 bp (im Vergleich zu 1500 bp im wildtypischen Gen) an, daß das Gen entfernt worden war. Für ssaC zeigte ein PCR-Produkt von 1229 bp (im Vergleich zu 2275 bp im wildtypischen Gen) an, daß das Gen beseitigt worden war. Für rfaK zeigte ein PCR-Produkt von 1300 bp (im Vergleich zu 2400 bp im wildtypischen Gen) an, daß das Gen deletiert worden war. Für glnA zeigte ein PCR-Produkt von 1161 bp (im Vergleich zu 2411 bp im wildtypischen Gen) an, dass das Gen entfernt worden war.
Obgleich theoretisch 50% dieser Isolate das deletierte Gen tragen sollten, war der tatsächliche Prozentsatz der das deletierte Gen tragenden Isolate ziemlich variabel und reichte von 1,4 % (1 von 73 Isolaten) für das S. dublin glnA-Gen bis zu 80% (4 von 5) für das S. dublin ssaJ-Gen, was darauf hindeutet, daß die Entfernung des Gens nicht willkürlich war. Die Deletionsmutanten wurden durch serologische Tests bestätigt, S. typhimurium oder S. dublin zu sein.
C. Konstruktion von Doppeldeletionsmutanten von S. typhimurium und S. dublin
Salmonella-Doppeldeletionsmutanten wurden auf die gleiche Art und Weise wie die Salmonella-Einzeldeletionsmutanten unter Verwendung der oben beschriebenen E. coli- und Salmonella-Stämme konstruiert. In Kürze, E. coli SM10λpir-Spenderstämme, die das pCVD442-Plasmid mit dem deletierten ssaT-Gen (ΔssaT) entweder von S. typhimurium oder von S. dublin tragen, wurden mit S. dublin B94-058N- oder mit S. typhimurium MK315N-Mutanten mit entweder dem deletierten ssaC- oder dem ssaJ-Gen (ΔssaC und ΔssaJ) gepaart, und Ap^R-Exkonjuganten wurden ausgewählt. Die Einführung des Plasmids in den nicht-toleranten Salmonella-Wirt und die Selektion von Ap^R-Kolonien erlaubte die Isolierung von merodiploiden Rekombinanten, in denen das Plasmid in das Genom durch homologe Rekombination mit dem wildtypischen Gen integriert wurde. Anschließendes Wachstum der merodiploiden Rekombinanten bis zur späten logarithmischen Phase unter nicht-selektiven Bedingungen ermöglichte das Auftreten eines spontanen Rekombinationsereignis zwischen den duplizierten Sequenzen im merodiploiden Genom, welches entweder eine Kopie des wildtypischen oder des deletierten Gens im Chromosom ließ. Kolonien, die unter diesen nicht selektiven Wachstumsbedingungen gezüchtet wurden, wurden dann in Saccharose enthaltenes Medium überimpft, das gegen jene Zellen selektierte, die nicht das zweite Rekombinationsereignis durchgemacht haben. Isolierte Saccharose-resistente Kolonien von S. typhimurium wurden durch PCR analysiert, um die erwünschte ssaT-Deletionsmutante zu identifizieren.
Trotz des Prüfens zahlreicher Saccharose resistenter Kolonien durch PCR konnte eine S. dublin ssaT-Deletionsmutante nicht identifiziert werden. Die putativen B94-058N::ΔssaCΔssaT- und B94-058N::ΔssaJΔssaT-Rekombinanten wurden durch Koloniehybridisierung identifiziert. Die E. coli SM10λpir-Spenderstämme, die das pCVD442 Plasmid mit dem deletierten ssaT-Gen (ΔssaT) von S. dublin tragen, wurden mit S. dublin B94-058N-Mutanten mit entweder dem deletierten ssaC- oder ssaJ-Gen (ΔssaC und ΔssaJ) gepaart und wie oben beschrieben nach Saccharose-resistenten Kolonien selektiert. Diese Kolonien wurden dann auf selektivem (Ap und Nal) Medium gezüchtet und dann auf Nitrocellulose übertragen (Schleicher & Schuell Nitrocellulose BA85; Schleicher und Schuell, Keene, NH). Die Nitrozellulose-Blots wurden dann wie in Davis et al., Basis methods in molecular biology, Elsevier, New York (1986) beschrieben verarbeitet, mit der Ausnahme, daß die verwendeten zweiten und dritten Puffer jeweils 1 M Tris, pH 7,6 und 1,5 M NaCl-0,25 M Tris, pH 7,6 waren. Die bakterielle DNA wurde mit der Nitrocellulose unter Verwendung eines Stratagene UV Stratalinkers 1800 (Stratagene, La Jolla, CA) und unter Verwendung der Auto-Vernetzungseinstellung (1200μJ X 100) vernetzt. Der Blot wurde prähybridisiert, hybridisiert, gewaschen und gemäß der Genius-Systembestimmungen (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) unter Verwendung der Herstellungsanweisung entwickelt. Die inneren Sequenzen des ssaT-Gens wurden als Probe während des Hybridisierungsschritts verwendet. Die Probe wurde durch PCR unter Verwendung von Del-1680 (5'-TGGCTTTTATTCGACCATTGAGCCTTTC-3' (SEQ ID NO:8)) und DEL-1681 (5'-TTTATCGCTTTCAACCAAATAGTGATG-3') (SEQ ID NO:9)) als Primer erzeugt und B94-058N-Kolonienwachstum als DNA-Matrize unterdrückt. Die DNA-Probe wurde durch Einbau von Digoxigenin in das verkürzte ssaT-Gen unter Verwendung des DIG-High Primer Kits (Boehringer Mannheim Biochemicals) markiert. Die Kolonien, die kein positives Signal erbrachten, putative ssaT-Deletionsmutanten, wurden auf das Vorhandensein des wildtypischen oder des deletierten ssaT-Gens mittels PCR, unter Verwendung von unterdrücktem Kolonienwachstum und den oben beschriebenen (siehe Beispiel 1A) Primern A und D für das ssaT-Gen, untersucht.
Um die gewünschten Doppelmutanten zu isolieren war es notwendig, Rekombinante nach nicht-selektivem Wachstum, unter Verwendung von entweder PCR (S. typhimurium Rekombinanten) oder Kolonienhybridisierung gefolgt von PCR (S. dublin Rekombinanten), zu analysieren. In der Theorie sollte das Entfernen des wildtypischen und des deletierten Gens willkürlich und bei einer gleichen Frequenz auftreten, was 50% Rekombinante, die das deletierte Gen tragen, ergibt. Wie in Beispiel 1B gezeigt war jedoch der Prozentsatz der Isolate mit dem deletierten Gen ziemlich variabel. Die Frequenz, in der das deletierte ΔssaT-Gen in den putativen S. typhimurium MK315N::ΔssaJΔssaT-, S. typhimurium MK315N::ΔssaCΔssaT-, S. dublin B94-058N::ΔssaCΔssaT- und S. dublin B94-058N::ΔssaJΔssaT-Rekombinanten zurückgewonnen wurde, war jeweils 50% (4 von 8), 12,5% (1 von 8), 3,8% (8 von 209) und 8,9% (14 von 158).
PCR-Analysen von genomischer DNA von putativen S. typhimurium und S. dublin Doppeldeletionsmutanten (unter Verwendung der oben beschriebenen geeigneten Primer A und D) bestätigten die Anwesenheit von sowohl ssaC- und ssaT- als auch ssaJ- und ssaT-deletierten Genen. Die Deletionsmutanten wurden durch serologische Tests bestätigt, S. typhimurium oder S. dublin zu sein. Es wurde gezeigt, daß wie erwartet S. typhimurium- und S. dublin-Mutanten jeweils mit Salmonella O Gruppe B und Salmonella O Gruppe D₁ Antiserum (Difco Laboratory, Detriot, MI) verbunden sind.
D. Konstruktion von 5. choleraesuis Mutanten
S. choleraesuis Mutanten wurden unter Verwendung des STM-Verfahrens, allgemein im US Patent Nummer 5,876,931 beschrieben, konstruiert. In Kürze, jede erzeugte Insertionsmutation trägt ein unterschiedliches DNA-charakteristisches Kennzeichen („Tags"), welches den Mutanten ermöglicht, voneinander unterschieden zu werden. Die Kennzeichen umfassen 40-bp variable zentrale Regionen, die durch unveränderliche „Arme" von 20-bp flankiert werden, die erlauben, daß der zentralen Teil durch PCR co-amplifiziert wird. Die markierten Mutantenstämme werden in Mikrotiter-Schalen gesammelt und dann kombiniert, um das „Inoculum-Reservoir" für Infektionsstudien zu bilden. Zu einer adäquaten Zeit nach der Beimpfung werden die Bakterien vom Tier isoliert und vereinigt, um das „zurückgewonnene Reservoir" zu bilden. Die „Tags" in dem zurückgenommenen Reservoir und die „Tags" in dem Inoculum-Reservoir werden gesondert amplifiziert, markiert, und dann verwendet, um Filter zu untersuchen, auf denen unterschiedlichen „Tags" angeordnet sind, welche die Mutanten in dem Inoculum repräsentieren. Mutanten mit geeigneter Virulenz sind solche mit „Tags", die Hybridisierungssignale geben wenn sie mit „Tags" vom Inoculum-Reservoir sondiert werden aber nicht wenn sie mit „Tags" vom zurückgewonnenen Reservoir sondiert werden. STM erlaubt, daß eine große Anzahl von Insertionsmutationsstämme gleichzeitig in einem einzelnen Tier auf den Verlust der Virulenz überprüft werden. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden Insertionsmutanten von S. choleraesuis hergestellt, die ein mini-tn5-Transposon, welches das jeweilige Gen unterbricht, enthalten. Teile des Gens die jedes Transposon umgeben wurden sequenziert, um die Insertionsstelle durch die Anpassung der Sequenz mit der korrespondierenden Sequenz von bekannten S. typhimurium-Genen zu identifizieren. Das mini-tn5-Transposon, welches die ΔssaM-Mutation erzeugt, wurde zwischen den Nukleotidpositionen 126 und 127 in SEQ ID NO:7 lokalisiert und das mini-tn5 Transposon, welches die ΔssaJ-Mutation erzeugt, wurde zwischen den Nukleotidpositionen 209 und 210 in SEQ ID NO:4 lokalisiert.
E. Charakterisierung der Einfach- und Doppel-SPI2-Mutanten
Die Daten zeigten, daß bestimmte der Einfach- und Doppeldeletionsmutanten, speziell ΔssaC und ΔssaCΔssaT, weniger invasiv als der Wildtyp oder andere Mutanten sind. Dies kann zu einer etwas besseren Wirksamkeit beitragen. Es kann sein, daß Mutanten, z.B. ΔssaC-Mutanten, die für längere Zeitabschnitte mit der Darmschleimhaut assoziiert bleiben und dennoch eine reduzierte Fähigkeit haben in epithelische Zellen des Wirts einzudringen, besser in der Lage sind, eine starke Immunität der Schleimhaut auszulösen.
Beispiel 2
Sicherheit und Effizienz von Einfach- und Doppeldeletions-SPI2-mutanten
A. Wirksamkeit von einer S. choleraesuis ΔssaC-Mutante als ein Impfstoff im Schwein (Versuchsnummer 704-7923-I-MJK-96-008) (nicht von der Erfindung umfaßt)
Die Sicherheit und die Wirksamkeit von einer lebenden und abgeschwächten S. choleraesuis ΔssaC-Mutante als Impfstoff wurde im Schwein ermittelt (3–4 Wochen alte Schweine). Die Scheine (8 Schweine pro Gruppe) wurden entweder oral über das Trinkwasser oder intramuskulär (IM) mit einer Dosis von ungefähr ~1 × 10⁹ CFUs/Schwein geimpft. Für die orale Verabreichung wurde 10 ml von der im Labor aufgezogenen Impfstoffkultur (im Allgemeinen gewachsen wie in Beispiel 2.D unten beschrieben) 1:4 in ddH₂O verdünnt. 40 ml dieser Mischung wurde durch Zugabe von 960 ml sterilem ddH₂O weiter verdünnt; 100 ml dieser Endmischung wurde den Schweinen über eine Tränke gegeben (die Schweine tanken ungefähr 50 ml Wasser, was eine endgültigen Impfstoffdosis von 2,6 × 10⁸ pro Schwein ergibt). Für die IM-Impfung wurde 27 ml der 1:4 verdünnten Impfstoffkultur zu 3 ml sterilem WFI gegeben; 2,5 ml dieser Mischung wurde intramuskulär jedem Tier verabreicht, eine endgültige Dosis von ~3,0 × 10⁸ pro Schwein ergebend. Die Schweine wurden täglich zu Temperatur, Körpergewicht, Note der Fäkalien-Beschaffenheit, körperliches Befinden und Sterblichkeit überwacht. Die Tiere wurden auch zu Shedding des Impfstoffes und des Konfrontationsorganismus überwacht. Alle Tiere wurden am Endpunkt des Versuches obduziert und Gewebe wurden für den Konfrontationsorganismus kultiviert.
Im Anschluß an die Schutzimpfung wurden keine nachteiligen klinischen Krankheitsanzeichen in den Tieren beobachtet, die oral oder intramuskulär (IM) mit der ΔssaC-Mutante geimpft wurden, abgesehen von einem kurzfristigen Anstieg der Temperatur. Die Schweine wurden dann mit dem hoch-giftigen S. choleraesusis-Wildtyp, welcher ein Feldisolat war, das von einem Fall von Salmonellose erhalten wurde, 28 Tage nach der Impfung erneut konfrontiert. Die Ergebnisse zeigten, daß die Verabreichung der ΔssaC-Mutante entweder auf oralen oder intramuskulären Wegen sicher und wirksam gegen experimentell verursachte Salmonellose war. Nicht-Geimpfte zeigten schwerwiegendes Fieber, das von wäßriger Diarrhöe, verminderter Nahrungsaufnahme, Dehydrierung und vom Tod begleitet wurde. Demgegenüber waren die Tiere, die mit dem ΔssaC-Impfstoff-Konstrukten geimpft wurden, gegen eine Infektion resistent. In diesen Tieren gab es eine statistisch bedeutende Verringerung sowohl der schwere als auch der Dauer der Morbidität, der Sterblichkeit, der Tage der Untätigkeit und des Sheddings des Konfrontationsorganismus.
B. Wirksamkeit einer S. choleraesuis ΔssaM- oder S. choleraesuis ΔssaC-Mutante als Impfstoffe im Schwein (704-7923-I-MJK-96-012) (nicht von der Erfindung umfaßt)
Die Sicherheit und die Wirksamkeit einer lebenden abgeschwächten S. choleraesuis ΔssaM- oder einer S. choleraesuis ΔssaC-Mutante als ein Impfstoff wurde im Schwein (3–4 Wochen alte Schweine) ermittelt. Acht Schweine wurden oral über das Trinkwasser bei einer Dosis von ungefähr ~1 × 10⁹ CFUs/Schwein geimpft. Für die orale Impfung wurde eine im Labor aufgezogene Impfstoffkultur (im Allgemeinen gewachsen wie in Beispiel 2.D unten beschrieben) 1:4 in ddH₂O verdünnt; 40 ml dieser Mischung wurde zu 960 ml sterilem ddH₂O hinzugefügt; und 100 ml von dieser Endmischung wurde den Schweinen über eine Tränke gegeben. Die Anzahl der CFUs pro ml wurde festgestellt, indem man fortlaufende 10fach Verdünnungen der Endmischung durchführte und auf Agar ausplattierte. Die Dosis pro Schwein wurde dann festgestellt, indem man die Zahl der CFUs/ml mit der vom Tier konsumierten ml-Anzahl Wasser (jedes Tier trank ungefähr 50 ml Wasser) multiplizierte, was eine endgültige Impfstoffdosis von 1 × 10⁹ CFUs/Schwein ergab. Grundwerte für Körpertemperatur, Fäkalien-Konsistenz und körperlichen Zustand für jedes Tier wurden während der vier Tage unmittelbar vor der Impfung gesammelt und mit den Werten nach der Impfung verglichen, um die Sicherheit jedes Impfstoffs zu bewerten. Die Schweine wurden täglich zu Temperatur, Körpergewicht, Note der Fäkalien-Beschaffenheit, körperlichen Zustand und Sterblichkeit überwacht. Die Tiere wurden auch zu Shedding des Impfstoffes und des Herausforderungsorganismus überwacht. Alle Tiere wurden am Endpunkt des Versuches obduziert und Gewebe wurden für den Konfrontationsorganismus kultiviert.
Nach der Schutzimpfung wurden keine nachteiligen klinischen Krankheitsanzeichen in den Tieren beobachtet, die oral mit jeder SPI2-Mutante geimpft wurden, abgesehen von einem kurzfristigen Anstieg der Temperatur. Die Schweine wurden dann mit dem hoch-giftigen S. choleraesusis-Wildtyp, welcher ein Feldisolat war, das von einem Salmonellose-Fall erhalten wurde, 28 Tage nach der Impfung erneut konfrontiert. Die Ergebnisse zeigten, daß die Verabreichung jeder SPI2-Mutante auf oralen Wegen sicher und wirksam gegen experimentell verursachte Salmonellose war. Nicht-Geimpfte zeigten schwerwiegendes Fieber, das von wäßriger Diarrhöe, verminderter Nahrungsaufnahme, Dehydrierung und vom Tod begleitet wurde. Demgegenüber waren die Tiere, die mit ΔssaC- und ΔssaM-Impfstoff-Konstrukten geimpft wurden, gegen einer Infektion resistent. In diesen Tieren gab es eine statistisch bedeutende Verringerung sowohl der schwere als auch der Dauer der Morbidität, der Sterblichkeit, der Tage der Untätigkeit und des Sheddings des Konfrontationsorganismus.
C. Wirksamkeit einer S. choleraesuis ΔssaJ- oder S. choleraesuis ΔssaC-Mutante als Impfstoffe im Schwein (704-7923-I-MJK-97-004) (nicht von der Erfindung umfaßt)
Die Sicherheit und die Wirksamkeit einer lebenden abgeschwächten S. choleraesuis ΔssaJ- oder einer S. choleraesuis ΔssaC-Mutante als ein Impfstoff wurde im Schwein (56 männliche und weibliche durch Kreuzung erzeugte Schweine, bei der Impfung 18–24 Tage alt) ermittelt. Die Basislinie der Temperaturen und klinische Werte (Sterblichkeit, Morbidität, Diarrhö, Bakterien-Shedding und tägliche durchschnittliche Gewichtszunahme) wurden an den Tagen 1–4 notiert. Die Schweine wurden wie im Beispiel 2B oben beschrieben oral über das Trinkwasser am Tag 4 mit einer Dosis von ungefähr ~1 × 10⁹ CFUs/Schwein geimpft. Die Schweine wurden täglich zu klinischen Symptomen (prozentuale Sterblichkeit, prozentuale Morbidität, prozentualer Anteil der Tage mit Durchfall, prozentualer Anteil der Tage mit Shedding und durchschnittliche Gewichtszunahme, ermittelt wie in Beispiel 2.D unten beschrieben) für 21 Tage nach der Impfung (Tage 5–25) überwacht, von denen die Tage 22–25 als eine Grundlinie vor der Konfrontation mit den wildtypischen Bakterien betrachtet wurden. Die Schweine wurden dann mit einem hoch virulenten S. choleraesuis-Wildtyp, welcher ein Feldisolat war, das von einem Salmonellose-Fall erhalten wurde, oral über die Nahrung (nach einem 24 Stunden Fasten) 21 Tage nach der Impfung (Tag 25) konfrontiert. Es wurde fortgefahren, die Schweine auf klinische Symptome für weitere 21 Tage nach der Konfrontation zu überwachen (Tag 26–46). Die Ergebnisse der erneuten Impfung (und vor der Konfrontation) werden in Tabelle 3 unten gezeigt. Die Ergebnisse zeigten, daß die orale Verabreichung jeder dieser zwei Mutanten als ein Impfstoff sicher und wirksam gegenüber der experimentell erzeugten Salmonellose war.
Tabelle 2: Das Fehlen der klinischen Anzeichen in Geimpften zeigt die Sicherheit der S. choleraesuis Impfstoff nach der Impfung.
Tabelle 3. Verringerung der klinischen Anzeichen in erneut herausgeforderten Geimpften zeigt die Wirksamkeit des S. choleraesuis-Impfstoffs.
D. Wirksamkeit einer S. dublin ΔssaC- oder S. dublin ΔssaJ- oder einer S. dublin ΔssaT-Mutante als Impfstoffe im Rind (2051-7923-I-MJK-98-004) (nicht von der Erfindung umfaßt)
Die Sicherheit und die Wirksamkeit einer lebenden-abgeschwächten S. dublin ΔssaC- oder S. dublin ΔssaJ- oder einer S. dublin ΔssaT-Mutante als ein Impfstoff wurde im Rind (36 männliche und weibliche Kälber, bei der Impfung 10–14 Tage alt) ermittelt. Lebende-abgeschwächte S. dublin-Stämme wurden von Lagerkulturen durch das Ausstreichen auf Blut-Agar wiederhergestellt. Nach 18–24 Stunden Inkubation bei 37°C wurden Kolonien vom einem stark gewachsenen Gebiet mit einer sterilen Öse entnommen und in LB-Brühe überimpft. Nach 14 Stunden stationärer Inkubation bei 37°C wurde 1 ml dieser Kultur verwendet, um 22,5 ml frische LB-Brühe in 205 ml sterile Polycarbonat-Erlenmeyerkolben zu beimpfen. Nach 6 Stunden stationärer Inkubation bei 37°C wurde 2,5 ml der resultierenden unverdünnten Kulturbrühe zu 3 Liter eines Milchaustauschers zur Verabreichung jedes Kalbs gegeben. Die Verdünnungszahl und die Zahl lebensfähiger Platten auf Blut-Agar stellten die „Anzahl entwicklungsfähiger Bakterien" für jeden Stamm zum Zeitpunkt der Präparation fest. Jeder Impfstoff wurde bei Raumtemperatur erhalten und den Tieren so schnell wie möglich nach der Präparation (innerhalb 30 min) verabreicht. Die Basislinie der Temperaturen und die klinischen Anzeichen (Sterblichkeit, körperlicher Zustand, Untätigkeit, Diarrhö (Fäkaliennote) und Bakterien-Shedding) wurden an den Tagen 1–4 aufgezeichnet. Die Kälber wurden oral über den Milchaustauscher am Tag 4 entweder mit dem Wildtyp oder einer Bakterienmutante mit einer Dosis von ungefähr ~1 × 10⁹ CFUs/Kalb geimpft. Für die orale Impfung wurde 1 ml der im Labor gewachsenen Impfstoffkultur in den Milchausstaucher des Kalbs überimpft. Die Anzahl der CFUs/ml wurde wie in Beispiel 2B oben beschrieben ermittelt. Weil jedes Kalb seine gesamte Menge des Milchaustauschers am Tag der Schutzimpfung verbrauchte, war die Anzahl der CFUs pro Tier dieselbe wie die Zahl CFUs/ml der Kultur.
Die Kälber wurden täglich für 28 Tage nach der Impfung (Tage 5–32) auf klinische Symptome überwacht (prozentuale Sterblichkeit, körperlicher Zustand, prozentualer Anteil inaktiver Tage, Fäkaliennote und 5 Shedding-Tage), von welchen die Tage 29–32 als eine Grundlinie vor der Konfrontation mit den wildtypischen Bakterien betrachtet wurden. Wenn ein Kalb während der interessierenden Periode starb, wurde ihm eine Zahl von „1" für die Sterblichkeitsvariable zugewiesen, andernfalls war die zugewiesene Sterblichkeitsvariable „0". Der körperliche Zustand wurde auf einer Skala von 1 bis 5 beschrieben, wo „1" ein gesundes, aktives Tier mit normalem Haarkleid war, „ 2" ein wenig niedergeschlagenes Tier war, welches durchschnittlich aktiv war und ein rauhes Haarkleid hatte; „ 3" ein mäßig bis schwer niedergeschlagenes Tier war, das ungeachtet des Haarkleids inaktiv/lustlos und/oder mager war; „4" ein sterbendes Tier war; und „5" ein totes Tier war. Wenn ein Kalb starb, wurde dem körperlichen Zustand eine „5" für den Todestag (oder für den folgenden Tag in Abhängigkeit vom Todeszeitpunkt) und für die fehlenden Werte danach zugewiesen. Der durchschnittliche körperliche Zustand wurde als der Mittelwert der täglichen Werte innerhalb der interessierenden Periode für jedes Kalb genommen. Die durchschnittlichen körperlichen Werte wurden dann verwendet, um die neu-skalierten Werte in den folgenden Tagen zu ermitteln: der neu-skalierte Wert = 100x (Wert des durchschnittlichen körperlichen Zustands – 1)/4. Dieses wandelt die Skala 1–5 in eine Skala von 0–100 um. Der prozentuale Wert nicht aktiver Tage wurde festgestellt, indem man die Prozentzahl an Tagen während der interessierenden Periode ermittelte, bei denen ein Kalb einen Wert von größer als 2 beim körperlichen Zustandswerts hatte. Der Fäkalienwert wurde auf einer Skala von 1–4 ermittelt, wo „1" normal ist, fest geformt oder weich mit Form; „ 2" weich ungeformt ist, „ 3" wäßrig mit festem Material ist; und „4" übermäßig wäßrig/durchfallartig mit wenig oder keinem festen Material ist. Das Prozent Shedding-Tage wurde als das Prozent an Tagen während der interessierenden Periode ermittelt, an welchen ein Kalb einen Salmonella-positiven rektalen Abstrich hatte.
Die Kälber wurden dann mit einem hoch ansteckenden, heterologen S. dublin-Wildtypstamm, welcher von einem Salmonellose-Fall beim Rind erhalten wurde, 28 Tage nach der Impfung (Tag 32) herausgefordert. Es wurde fortgefahren, die Kälber für weitere 14 Tage nach der Konfrontation (Tage 33–46) auf klinische Symptome zu überwachen. Die Ergebnisse nach der Impfung (und vor der Konfrontation) sind in Tabelle 4 unten gezeigt. Die Ergebnisse nach der Konfrontation sind in Tabelle 5 unten offenbart. Die Leichenschau wurde am Tage 46 oder beim Tod durchgeführt, und Gewebe- und Fäkalienproben wurden für die Kultivierung des Konfrontationsorganismus erhalten. Die Daten der Kultivierung der Gewebe- (> 2 g) oder der Fäkalienproben (> 2 g) zeigten, daß es eine Verringerung des Konfrontationsstammes in den Geweben der Tiere gab, die mit den SPI2-Mutanten, verglichen mit den harmlosen Kontrollen, geimpft wurden, und daß die orale Verabreichung von jeder dieser drei Mutanten als ein Impfstoff sicher und gegen experimentell verursachte Salmonellose wirkungsvoll war. Die schützenden Effekte, die mit diesen SPI2-Mutanten gesehen wurden waren besser als die, die mit den ΔcyaΔcrp-Mutanten beobachtet wurden.
Tabelle 4. Das Fehlen von klinischen Anzeichen in den Geimpften zeigt die Sicherheit von S. dublin-Impfstoffen nach der Impfung.
Tabelle 5. Verringerung der klinischen Anzeichen in danach herausgeforderten Geimpften zeigt die Wirksamkeit des S. dublin-Impfstoffs.
E. Wirksamkeit einer S. typhimurium ΔssaC- oder S. typhimurium ΔssaJ- oder einer S. typhimurium ΔssaT-Mutante als Impfstoffe im Rind (2051-7923-I-MJK-98-006) (nicht von der Erfindung umfaßt)
Die Sicherheit und die Wirksamkeit einer lebenden abgeschwächten S. typhimurium ΔssaC- oder S. typhimurium ΔssaJ- oder einer S. typhimurium ΔssaT-Mutante als Impfstoffe wurde im Rind, wie in Beispiel 2D oben beschrieben, ermittelt. Die Resultate, gezeigt in Tabellen 6 und 7 unten, demonstrierten, daß die orale Verabreichung von jeder dieser drei Mutanten als ein Impfstoff sicher und gegen experimentell verursachte Salmonellose wirkungsvoll war. Die schützenden Effekte, die mit diesen SPI2-Mutanten gesehen wurden, waren besser als die, die mit ΔrfaK-Mutanten beobachtet wurden.
Tabelle 6. Das Fehlen von klinischen Anzeichen in den Geimpften zeigt die Sicherheit von S. typhimurium-Impfstoffen.
Tabelle 7. Verringerung der klinischen Anzeichen in danach herausgeforderten Geimpften zeigt die Wirksamkeit des S. typhimurium-Impfstoffs.
F. Wirksamkeit einer S. dublin ΔssaC- (nicht umfaßt) oder einer S. dublin ΔssaC/ΔssaT- oder einer S. dublin ΔssaJ/ΔssaT-Mutante oder einer Kombination von S. dublin ΔssaC/ΔssaT mit S. typhimurium ΔssaC/ΔssaT als Impfstoffe im Rind (2051-7923-I-MJK-99-001)
Die Sicherheit und die Wirksamkeit einer lebenden abgeschwächten S. dublin ΔssaC- oder einer S. dublin ΔssaC/ΔssaT- oder einer S. dublin ΔssaJ/ΔssaT-Mutante oder einer Kombination von S. dublin ΔssaC/ΔssaT mit S. typhimurium ΔssaC/ΔssaT als Impfstoffe wurde im Rind, wie in Beispiel 2D oben beschrieben, ermittelt. Die Resultate, gezeigt in Tabellen 8 und 9 unten, demonstrierten, daß die orale Verabreichung von jeder dieser drei Mutanten als ein Impfstoff sicher und gegen experimentell verursachte Salmonellose wirkungsvoll war. Die Ergebnisse zeigten auch, daß es keine Beeinträchtigung gab, als ein Kombination von S. dublin- und S. typhimurium-Mutanten verabreicht wurden. Tiere, die sowohl mit S. dublin ΔssaC/ΔssaT- als auch mit ΔssaC/ΔssaT-Impfstoff-Konstrukten geimpft wurden, hatten keine Sterblichkeit und die niedrigsten klinischen Werte aller Gruppen, in folge der Konfrontationsbelastung mit einem hoch giftigen heterologen S. dublin-Konfrontationsorganismus. Weil nur teilweiser Schutz für die Konfrontation mit S. dublin durch die Impfung von Kälbern mit lebenden abgeschwächten S. typhimurium Impfstoffen geleistet wird, lag die Resistenz dieser Tiere wahrscheinlich an der Immunität, die durch den S. dublin-Bestandteil des Impfstoffes verursacht wurde. So wurde die Wirksamkeit der S. dublin-Komponente des Impfstoffs nicht durch das Vorhandensein des S. typhimurium-Bestandteils behindert, und es ist möglich, daß das letzte die Immunität zu S. dublin wirklich erhöhen kann, wenn es als Kombinationsimpfstoff gegeben wird.
Tabelle 8. Das Fehlen von klinischen Anzeichen infolge der Impfung zeigt die Sicherheit von S. dublin-Einfach- und Doppeldeletionsimpfstoffen, und von S. dublin/S. typhimurium-Kombinationsimpfstoffen.
Tabelle 9. Verringerung der klinischen Anzeichen in danach herausgeforderten Geimpften zeigt die Wirksamkeit der S. dublin-Einfach- und Doppeldeletionssimpfstoffe, und der S. dublin/S. typhimurium-Kombinationsimpfstoffe.
G. Wirksamkeit einer S. typhimurium ΔssaC- (nicht umfaßt) oder einer S. typhimurium ΔssaC/ΔssaT- oder einer S. dublin ΔssaJ/ΔssaT-Mutante oder einer Kombination von S. dublin ΔssaC/ΔssaT mit S. typhimurium ΔssaC/ΔssaT als Impfstoffe im Rind (2051-7923-I-MJK-99-007)
Die Sicherheit und die Wirksamkeit einer lebenden abgeschwächten S. typhimurium ΔssaC- oder einer S. typhimurium ΔssaC/ΔssaT- oder einer S. dublin ΔssaJ/ΔssaT-Mutante oder einer Kombination von S. dublin ΔssaC/ΔssaT mit S. typhimurium ΔssaC/ΔssaT als Impfstoffe wurde im Rind, welches mit virulenten S. typhimurium wie im obigen Beispiel 2D beschrieben herausgefordert wurde, ermittelt. Die Resultate, gezeigt in Tabellen 10 und 11 unten, demonstrierten, daß die orale Verabreichung von jeder dieser drei Mutanten als ein Impfstoff sicher und gegen experimentell verursachte Salmonellose wirkungsvoll war. Wie im obigen Beispiel 2F beschrieben, zeigten diese Ergebnisse auch, daß es keine Beeinträchtigung gab, als eine Kombination von S. dublin- und S. typhimurium-Mutanten verabreicht wurden.
Tabelle 10. Das Fehlen von klinischen Anzeichen infolge der Impfung zeigt die Sicherheit von S. typhimurium-Impfstoffen.
Tabelle 11. Verringerung der klinischen Anzeichen in danach herausgeforderten Geimpften zeigt die Wirksamkeit der S. typhimurium-Impfstoffe.
Sequenzprotokoll

Claims

Impfstoffzusammensetzung, welche eine immunologisch schützende Menge einer ersten abgeschwächten, nicht-revertierenden Mutante eines Salmonellabakteriums, in welcher zwei oder mehr Gene des Sekretionssystem-Apparats (ssa) inaktiviert worden sind, umfasst; worin die ssa-Gene aus der Gruppe, bestehend aus ssaT, ssaJ, ssaC und ssaM, ausgewählt sind und worin (a) das ssaT-Gen die SEQ ID NO: 1 oder 2, oder eine Nukleotidsequenz in Gesamtlänge, welche an das nicht-kodierende Gegenstück von SEQ ID NO: 1 oder 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder eine Nukleotidsequenz von Salmonella in Gesamtlänge, welche eine 95%ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 1 oder 2 hat, aufweist; (b) das ssaJ-Gen die SEQ ID NO: 3 oder 4, oder eine Nukleotidsequenz in Gesamtlänge, welche an das nicht-kodierende Gegenstück von SEQ ID NO: 3 oder 4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder eine Nukleotidsequenz von Salmonella in Gesamtlänge, welche eine 95%ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 3 oder 4 hat, aufweist; (c) das ssaC-Gen die SEQ ID NO: 5 oder 6, oder eine Nukleotidsequenz in Gesamtlänge, welche an das nicht-kodierende Gegenstück von SEQ ID NO: 5 oder 6 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder eine Nukleotidsequenz von Salmonella in Gesamtlänge, welche eine 95%ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 5 oder 6 hat, aufweist; und (d) das ssaM-Gen die SEQ ID NO: 7 oder 30, oder eine Nukleotidsequenz in Gesamtlänge, welche an das nicht-kodierende Gegenstück von SEQ ID NO: 7 oder 30 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder eine Nukleotidsequenz von Salmonella in Gesamtlänge, welche eine 95%ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 7 oder 30 hat, aufweist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Gene ssaT- und ssaC-Gene sind.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Gene ssaT- und ssaJ-Gene sind.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, welche weiterhin eine zweite abgeschwächte Mutante eines Salmonellabakteriums, in welcher wenigstens ein Gen innerhalb der SPI2-Region inaktiviert worden ist, umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 4, worin das Gen aus der Gruppe, bestehend aus ssaT, ssaJ, ssaC und ssaM, ausgewählt ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 4, worin die erste und zweite Mutante der Salmonellabakterien von verschiedenen Serogruppen sind.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1 oder 4, worin jedes Salmonellabakterium Salmonella enterica der Subspezies Enterica ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1 oder 4, worin jedes Salmonellabakterium von einer der Serogruppen A, B, C1, C2, D1 oder E1 ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 4, worin die erste und zweite abgeschwächte Mutante der Salmonellabakterien aus der Gruppe, bestehend aus S.dublin, S.typhimurium und S.choleraesuis, ausgewählt sind.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1 oder 4, worin die erste abgeschwächte Salmonellabakterium-Mutante weiterhin ein Polynukleotid, welches für ein Nicht-Salmonella-Polypeptid kodiert, umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Medikaments, vorgesehen für das Übertragen schützender Immunität auf ein Nichtnagetier dadurch gekennzeichnet, dass eine Impfstoffzusammensetzung, welche eine immunologisch schützende Menge von einer abgeschwächten, nicht-revertierenden Mutante eines Salmonellabakteriums, in welcher zwei oder mehr Gene des Sekretionssystem-Apparats (ssa) inaktiviert worden sind, umfasst, verwendet wird; worin die ssa-Gene aus der Gruppe, bestehend aus ssaT, ssa J, ssaC und ssaM, ausgewählt sind und worin (a) das ssaT-Gen die SEQ ID NO: 1 oder 2, oder eine Nukleotidsequenz in Gesamtlänge, welche an das nicht-kodierende Gegenstück von SEQ ID NO: 1 oder 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder eine Nukleotidsequenz von Salmonella in Gesamtlänge, welche eine 95%ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 1 oder 2 hat, aufweist; (b) das ssaJ-Gen die SEQ ID NO: 3 oder 4, oder eine Nukleotidsequenz in Gesamtlänge, welche an das nicht-kodierende Gegenstück von SEQ ID NO: 3 oder 4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder eine Nukleotidsequenz von Salmonella in Gesamtlänge, welche eine 95%ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 3 oder 4 hat, aufweist; (c) das ssaC-Gen die SEQ ID NO: 5 oder 6, oder eine Nukleotidsequenz in Gesamtlänge, welche an das nicht-kodierende Gegenstück von SEQ ID NO: 5 oder 6 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder eine Nukleotidsequenz von Salmonella in Gesamtlänge, welche eine 95%ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 5 oder 6 hat, aufweist; und (d) das ssaM-Gen die SEQ ID NO: 7 oder 30, oder eine Nukleotidsequenz in Gesamtlänge, welche an das nicht- kodierende Gegenstück von SEQ ID NO: 7 oder 30 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder eine Nukleotidsequenz von Salmonella in Gesamtlänge, welche eine 95%ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 7 oder 30 hat, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die immunologisch schützende Menge des abgeschwächten Bakteriums eine Verbesserung der Sterblichkeit, des symptomatischen Durchfalls, des physischen Zustands, oder der Milchproduktion bietet.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die Gene durch Deletion eines Teils der kodierenden Region des Gens inaktiviert werden.
Verfahren zur Herstellung eines Medikaments, vorgesehen zur Verringerung der Menge oder der Dauer von Bakterien-Shedding während der Infektion in einem Nichtnagetier, dadurch gekennzeichnet, dass eine Impfstoffzusammensetzung, welche eine abgeschwächte, nicht-revertierende Mutante des Salmonellabakteriums, in welcher zwei oder mehr Gene des Sekretionssystem-Apparats (ssa) inaktiviert worden sind, umfasst, in einer Menge, welche wirkungsvoll ist, um Bakterien-Shedding durch das Tier zu verringern, verwendet wird; worin die ssa Gene aus der Gruppe, bestehend aus ssaT, ssaJ, ssaC und ssaM, ausgewählt sind und worin (a) das ssaT-Gen die SEQ ID NO: 1 oder 2, oder eine Nukleotidsequenz in Gesamtlänge, welche an das nicht-kodierende Gegenstück von SEQ ID NO: 1 oder 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder eine Nukleotidsequenz von Salmonella in Gesamtlänge, welche eine 95%ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 1 oder 2 hat, aufweist; (b) das ssaJ-Gen die SEQ ID NO: 3 oder 4, oder eine Nukleotidsequenz in Gesamtlänge, welche an das nicht-kodierende Gegenstück von SEQ ID NO: 3 oder 4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder eine Nukleotidsequenz von Salmonella in Gesamtlänge, welche eine 95%ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 3 oder 4 hat, aufweist; (c) das ssaC-Gen die SEQ ID NO: 5 oder 6, oder eine Nukleotidsequenz in Gesamtlänge, welche an das nicht-kodierende Gegenstück von SEQ ID NO: 5 oder 6 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder eine Nukleotidsequenz von Salmonella in Gesamtlänge, welche eine 95%ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 5 oder 6 hat, aufweist; und (d) das ssaM-Gen die SEQ ID NO: 7 oder 30, oder eine Nukleotidsequenz in Gesamtlänge, welche an das nicht-kodierende Gegenstück von SEQ ID NO: 7 oder 30 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder eine Nukleotidsequenz von Salmonella in Gesamtlänge, welche eine 95%ige Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 7 oder 30 hat, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das Ausmaß an Bakterien-Shedding um etwa 10% oder mehr reduziert wird.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Dauer des Bakterien-Shedding um etwa 10% oder mehr reduziert wird.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 14, worin das Tier aus der Gruppe, bestehend aus Rindern, Schafen, Ziegen, Pferden, Schweinen, Vögeln, Katzen, Hunden und Menschen, ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das Tier ein Schwein ist.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das Tier Rind ist.
Verfahren für die Herstellung eines Arzneimittels, vorgesehen für die Verabreichung eines Polypeptid-Antigens an ein Tier, dadurch gekennzeichnet, dass die Impfstoffzusammensetzung von Anspruch 9 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 17, worin der Vogel Geflügel ist.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das Tier ein Pferd ist.