DE60111835T9

DE60111835T9 - Verfahren zur herstellung bakterieller toxine

Info

Publication number: DE60111835T9
Application number: DE60111835T
Authority: DE
Inventors: S. Milan BLAKE; A. John BOGDAN; Javier Rio Piedras NAZARIO-LARRIEU
Original assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Current assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Priority date: 2000-04-04
Filing date: 2001-04-04
Publication date: 2006-10-12
Also published as: AU2001253134B2; CA2405035C; ES2245357T3; DE60111835T2; JP2011152141A; EP1268531A2; WO2001074862A3; JP4964385B2; EP1268531B1; ATE299149T1; CA2405035A1; JP2003531586A; DE60111835D1; WO2001074862A2; PT1268531E; AU5313401A

Description

BEZUGNAHME AUF SEQUENZPROTOKOLLE, TABELLEN ODER COMPUTERPROGRAMMPROTOKOLLE
Ein Sequenzprotokoll in computerlesbarem Format ist beigefügt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Steigerung der Produktion von Bakterientoxin unter Verwendung von Verfahren und Zusammensetzungen, welche die Akkumulation von intrazellulären und extrazellulären Toxinexpressions-Inhibitoren reduzieren oder eliminieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen zur Reduzierung oder Eliminierung der Akkumulation von Toxinexpressions-Inhibitoren der Spezies Bordetella. Speziell betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung von Pertussistoxin, Pertactin, Adenylatcyclasetoxin-Hämolysin, filamentösem Hämagglutinin und anderen Toxinen mit hoher Ausbeute.
Pertussistoxin (PT) ist eine von den verschiedenen Komponenten, die durch virulentes B. pertussis, den Mikroorganismus, der Keuchhusten verursacht, erzeugt werden. Keuchhusten ist eine schwere Infektion der Atemwege, die früher in den Vereinigten Staaten für den Tod von 5000 bis 10.000 Menschen pro Jahr verantwortlich war. Seit dem Aufkommen des Keuchhustenimpfstoffs ist die Todesrate im Zusammenhang mit Keuchhusten auf weniger als 20 pro Jahr gesenkt worden. Zur Zeit treten ungefähr 50 % aller Keuchhusteninfektionen bei Kindern unter einem Jahr auf, und nur 15 % treten bei Kindern über 15 Jahren auf. Kids Health.org (besucht am 23. März 2000) <http://kidshealth.org/parent/common/whooping_cough.html>.
PT ist ein Haupt-Schutzantigen in dem Impfstoff gegen Keuchhusten. Andere Komponenten von Interesse, die von B. pertussis erzeugt werden, sind filamentöses Hämagglutinin, hitzelabiles Toxin, Adenylatcyclase und dergleichen, die ebenfalls eine wichtige Rolle als Schutzantigene spielen können. Die großtechnische Herstellung dieser Komponenten, die als diagnostische oder chemische Reagenzien und bei der Herstellung von Impfstoffen nützlich sind, erfordert die großtechnische Kultivierung des Mikroorganismus. B. pertussis ist jedoch ein anspruchsvoller Organismus, dessen Züchtung in großen Bioreaktoren sich als schwierig zu züchten erwiesen hat. Ältere Verfahren für die Züchtung von B. pertussis arbeiten mit der Kultivierung in einer stationären Kultur oder in Bioreaktoren. Das Züchten in einer stationären Kultur ist arbeitsintensiv, während das Kultivieren im Bioreaktormaßstab Wirbelrühren und Oberflächenbelüftung erfordert. Infolgedessen ist das Nutzvolumen des Bioreaktors reduziert, und eine Modifikation des Bioreaktors für das Züchten von Pertussis ist häufig notwendig. Außerdem sind die Mengen an PT, die während der Fermentation unter diesen Bedingungen hergestellt werden, veränderlich und oft gering.
Das US-Patent Nr. 5 338 670 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von B. pertussis in Anwesenheit eines Eisensalzes, nämlich Eisen(II)-sulfat. Ein hoher Eisengehalt unterstützt zwar ein stärkeres Bakterienwachstum, unterdrückt jedoch die Erzeugung von PT. Durch Einstellung des Eisengehalts von modifiziertem Stainer-Scholte-Medium auf 10 % der empfohlenen Konzentration wurde die Produktion von PT optimiert.
Frohlich et al., 1995, Journal of Biotechnology, 39, 205 bis 219, berichtet, daß eine ionische Zusammensetzung und eine Gesamtionenkonzentration des Kulturmediums wichtige Faktoren bei der Begrenzung der Produktivität in belüfteten Reaktoren waren, die für die Herstellung von Pertussistoxin und anderen Antigenen durch Bordatella pertusssis verwendet wurden. Frohlich et al. schlägt vor, Natriumchlorid durch Mononatriumglutamat zu ersetzen, um Zell- und Toxinausbeuten zu erhöhen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Ausbeute von PT, das aus B. pertussis erhalten wird, zu verbessern durch (1) Einbringen eines löslichen Salzes in das Kulturmedium, das Sulfat (SO₄ ^2–) maskiert und/oder (2) Verwenden eines B. pertussis-Cystein-Desulfinase-Knockout-Mutanten.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß Bakterientoxinexpressions-Inhibitoren in Kulturmedium akkumulieren und somit die Toxinproduktion signifikant reduzieren. Außerdem beruht die vorliegende Erfindung auf der Erkenntnis, daß das Unterdrücken oder Eliminieren von Toxinexpressions-Inhibitoren die Toxinexpression signifikant nach oben regulieren kann. Nicht einschränkende Beispiele der vorliegenden Erfindung sind angegeben, wobei Bordetella sp., insbesondere B. pertussis und/oder B. bronchiseptica, verwendet werden, die Pertussistoxin (PT) bzw. Pertactin erzeugen. Es versteht sich jedoch, daß höhere Bakterientoxinwerte in anderen Bakterienkultursystemen erzielt werden können, die von der Lehre der vorliegenden Erfindung Gebrauch machen, wobei Adenylatcyclasetoxin-Hämolysin und filamentöses Hämagglutinin eingeschlossen sind, jedoch keine Beschränkung darauf erfolgt.
Im allgemeinen wird die vorliegende Erfindung durch die Beschreibung von zum Züchten von B. pertussis angewandten Verfahren und Zusammensetzungen veranschaulicht, die intrazelluläre und extrazelluläre PT-Inhibitorakkumulation eliminieren oder reduzieren, was in einer signifikanten Steigerung der PT-Produktion resultiert.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Herstellung neuer Kulturmedien beschrieben, die das Wachstum von B. pertussis unterstützen und die Expression der PT-Inhibition durch Sulfatanionen verhindern oder verringern. Diese Zusammensetzungen von Medien und die zugehörigen Verfahren weisen auf, ohne darauf beschränkt zu sein: das Beimischen einer effektiven Menge eines oder mehrerer löslichen Metallsalze, die im wesentlichen unlösliche Komplexe mit Sulfatanionen bilden, zu einem B. pertussis-Kulturmedium.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden das Wachstum von B. pertussis unterstützende Kulturmedien bereitgestellt, die eine Menge eines oder mehrerer löslichen Salze aufweisen, die im wesentlichen unlösliche Komplexe mit PT-Inhibitoren bilden, wobei die Menge die Inhibition der PT-Expression verhindert oder reduziert. Dabei werden lösliche Metallsalze angegeben, die im wesentlichen unlösliche Komplexe mit Sulfatanionen bilden.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen B. pertussis-Kulturmedien und Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben, die PT-Inhibitoren reduzieren, indem sie Bestandteile der Medien, die zu der PT-Inhibitorakkumulation beitragen, begrenzen oder eliminieren. Dabei wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Cysteinkonzentration reduziert.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren und Zusammensetzungen zur Herstellung von PT, die das Züchten von B. pertussis unter Bedingungen umfassen, welche die Akkumulation von PT-Inhibitoren in den Kulturmedien eliminieren oder reduzieren, was in signifikanten Steigerungen der PT-Produktion und der Isolation des PT aus dem Kulturmedium resultiert.
In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die PT-Produktion unter Verwendung von B. pertussis-Cystein-Desulfinase-Knockout-Mutanten gesteigert. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Herstellen von PT bereitgestellt, die aufweisen: Züchten eines B. pertussis-Cystein-Desufinase-Knockout-Mutanten in einem B. pertussis-Kulturmedium und Isolieren des PT aus dem Kulturmedium.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: ein Diagramm, welches das Wachstum von B. pertussis (OD 650) sowie Änderungen in den PT-Mengen ([Ptx]/OD) zeigt, die als eine Funktion der Fermentationszeit hergestellt werden.
2: ein Bild einer Blut-Agarplatte.
3: ein Balkendiagramm, welches folgendes zeigt: das Wachstum von B. pertussis (OD 650) und die PT-Menge (Ptx-Konz.) in Kontroll-Kulturüberstand (Str.), Kulturmedium, das Moleküle < 3.000 KDa (< 3K) von erschöpftem Kulturmedium enthält, und Kulturmedium, das Moleküle > 3.000 KDa (> 3K) von erschöpftem Kulturmedium enthält.
4A: ein Diagramm der Fermentationszeit (Stunden) gegenüber Asparaginsäure-, Threonincystein- und Lysinkonzentration (mg/l) und Arginin-, Methionin- und Prolinkonzentration (mg/l), das die Aminosäureprofile während der Fermentierung zeigt.
4B: ein Diagramm der Zeit (Stunden) gegenüber der Fläche (mAU·s), das Änderungen in den Konzentrationen von organischer Säure als eine Funktion der Fermentationszeit zeigt.
5: ein Balkendiagramm, das die Sulfatkonzentration (μg/ml) zu verschiedenen Züchtungszeiten zeigt.
6: ein Diagramm, das die Wirkung von erhöhten Konzentrationen von BaCl₂ (mM) auf die PT-Menge zeigt, die für zwei B. pertussis-Stämme hergestellt wird (μg/ml/OD₆₅₀) (Stamm 1 = CS-87, Stamm 2 = ATCC 9797).
7: ein Vergleich der DNA-Sequenz und der translatierten Aminosäuresequenz des Cystein-Desulfinase-Gens, das aus dem B. pertussis-Stamm BP536 isoliert wurde, mit der B. pertussissequenz (benachb. 314), gefunden in der Datenbank The Sanger Centre DNA.
8a: ein Diagramm der gesamten B. pertussis-Toxinherstellung in 20-Liter-Bioreaktoren unter beschränkenden Cystein-Bedingungen, gemessen bei einer Absorption von 600 nm.
8b: ein Diagramm der B. pertussis-Toxinherstellung in 20-Liter-Bioreaktoren unter beschränkenden Cystein-Bedingungen, gemessen als mg/ml Toxin pro optischer Dichteeinheit.
9: ein Diagramm von inneren und äußeren Sulfatkonzentrationen in B. pertussis-Zellen in 20-Liter-Bioreaktoren unter beschränkenden Cystein-Bedingungen.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die schwerwiegendsten Konsequenzen von Bakterieninfektionen resultieren häufig aus Toxinexpression im Wirt. Nicht einschränkende Beispiele umfassen Clostridium tetani, das Tetanustoxin erzeugt, Neurotoxine, die von C. botulinum erzeugt werden, C. difficile, das Toxine erzeugt, die pseudomembranöse Kollitis verursachen; Salmonella typhi erzeugt Enterotoxine, die Gastroenteritits und Typhus verursachen, Staphylococcus aureus kann Toxine exprimieren, die septischen Schock verursachen, und B. pertussis erzeugt Toxine, die für Keuchhusten verantwortlich sind. Andere toxogene Bakteriengenera umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Escherichia, Shigella und Vibrio. Glücklicherweise sind Impfstoffe verfügbar, welche die meisten schwerwiegenden Wirkungen von Bakterientoxinen verhindern und/oder lindern. Diese Impfstoffe bestehen hauptsächlich aus modifizierten Bakterientoxinen, subletalen Dosen von gereinigtem Toxin und/oder Ganzzellenhomogenaten.
Bordetella pertussis-Impfstoffe haben sich als besonders wirksam zum Verhindern von Keuchhusten bei Impfstoff-Empfängern erwiesen. Man hat gefunden, daß azelluläre Pertussisimpfstoffe (AP-Impfstoffe), die Perussistoxin (PT) allein oder in Kombination mit anderen Antigenen von B. pertussis enthalten, zum Verhindern von Pertussisinfektionen sehr wirksam sind. Da jedoch PT und viele von den anderen Pertussisantigenen in winzigen Mengen exprimiert werden, ist es wichtig, die Kulturbedingungen zu optimieren, um die Ausbeuten zu maximieren. Bei Verwendung des Stainer-Schulte-Standardmediums (SS-Mediums) wurde eine Reduzierung des Verhältnisses Pertussistoxin/optische Dichte (PT/OD₆₅₀) mitten in Chargenfermentierungen beobachtet. Um zu bestimmen, ob dieses Phänomen auf einen Mangel an Substratverfügbarkeit oder negative Rückkopplungshemmung zurückzuführen war, wurden Untersuchungen durchgeführt, um festzustellen, ob erschöpftes Medium Hemmungsfaktoren für die PT-Expression enthielt, und um diese Faktoren zu identifizieren. Kulturüberstand-Proben wurden aus verschiedenen Fermentationsstufen entnommen und mit SS-Mediumkomponenten, denen es an den basischen Salzen mangelte, aufgefüllt. Diese Proben wurden dazu verwendet, eine zweite Kultur zu initiieren, und PT/OD₆₅₀-Verhältnisse wurden im Vergleich mit frischem SS-Medium gemessen. Sowohl intaktes erschöpftes Medium als auch eine Fraktion dieses Mediums, das Moleküle < 3.000 kDa enthielt, hemmten die PT-Produktion. Kreuz-Ausstreichexperimente auf Bordet-Gengou-Agar (BGA) bestätigten die Produktion eines Inhibitors (von Inhibitoren) von hämolytischer Aktivität in frisch ausgestrichenen Bakterien. Mit Coomassie angefärbte Gele zeigten daß die Profile von Ganzzellenprotein in dem Fraktionsmedium verglichen mit frischem Medium deutlich verschieden waren, was darauf hindeutete, daß die Hemmungsfaktoren die Zwei-Komponenten-Regulationssysteme beeinflußten. Um diese inhibierende(n) Verbindung(en) weiter zu identifizieren, wurde eine vollständige Flußanalyse des Zwischenmetabolismus von B. pertussis, einschließlich einer Analyse von Aminosäure und organischer Säure, mittels HPLC des erschöpften Mediums sowie von kritischen Enzymen innerhalb dieser Bahnen durchgeführt. Man fand, daß die schwefelhaltige Aminosäure, Methionin und Pyruvat während der späten exponentiellen Wachstumsphase akkumulierten (bis zu 200 mg/l). Die Untersuchung sämtlicher Überstand-Fraktionen durch LC-MS deutet darauf hin, daß Bahnen für den Cysteinverbrauch zu der Bildung von Sulfat führen. Dies wirkte wiederum als ein negativer Rückkopplungsinhibitor der PT-Expression.
Da Sulfat als ein Inhibitor der PT-Expression in B. pertussis wirksam ist, wurden Verfahren zum Reduzieren oder Eliminieren von intrazellulärer und extrazellulärer Sulfatakkumulation mit fortschreitender Fermentierung entwickelt. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen diese Verfahren das Hinzugeben einer wirksamen Menge eines löslichen Salzes auf, das einen im wesentlichen unlöslichen Komplex mit Sulfat bildet. Solche löslichen Salze weisen Erdalkalimetallsalze oder andere Salze von Pb und Ag auf. Bevorzugte Salze der vorliegenden Erfindung sind Erdalkalimetallsalze. Stärker bevorzugte Salze sind Ba(II)-Halogenidsalze. Das am meisten bevorzugte Ba(II)-Halogenidsalz ist BaCl₂ oder BaBr₂.
Bariumchlorid hat sich als wirksam beim Fördern einer Steigerung der durch B. pertussis erzeugten PT-Menge erwiesen. Es wurde eine zehnfache Steigerung pro OD-Einheit in der PT-Ausbeute beobachtet, wenn der ATCC 9797 oder CS87 B. pertussis-Stamm in Anwesenheit von BaCl₂ gezüchtet wurde. Dabei war die PT-Menge in Abwesenheit von BaCl₂ 0,05 μg/ml/OD₆₅₀ gegenüber 0,525 μg/ml/OD₆₅₀ mit 20 mM BaCl₂. Unter einer "wirksamen Menge" eines Salzes wird eine Menge verstanden, welche die Inhibition der PT-Expression durch Sulfat während der Fermentierung verhindert oder reduziert, im Vergleich mit dem Fall der Durchführung einer Fermentierung in Abwesenheit des Salzes.
Die Löslichkeit des Sulfatkomplexes wird durch das Löslichkeitsprodukt (K_sp) definiert. Der Sulfatkomplex wird als "im wesentlichen unlöslich" definiert, wenn K_sp ungefähr 1 × 10^–5 oder weniger bei 25 °C ist. Bevorzugt ist K_sp zwischen ungefähr 1 × 10^–7 und ungefähr 1 × 10^–10 bei 25 °C.
Am meisten bevorzugt ist K_sp zwischen ungefähr 1 × 10^–8 und ungefähr 1 × 10^–10 bei 25 °C. Löslichkeitsprodukte, die in den vorstehend genannten Bereich für ausgewählte Sulfatkomplexe fallen, sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1: K_sp-Werte für ausgewählte Sulfatkomplexe

^a CRC Handbook of Chemistry and Physics – 65th Ed., Weast (ed.), S. B-220 (1984).

Die in Tabelle 1 gezeigten Sulfatkomplexe sollen als Beispiele dienen und sollen als solche den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken. Außerdem ist zu beachten, daß der Sulfatkomplex in dem Wachstumsmedium nicht vollständig unlöslich zu sein braucht. Der Sulfatkomplex muß einfach ausreichend unlöslich sein, um die Inhibition der PT-Expression durch Sulfat zu verhindern oder zu reduzieren.
Die Salze der vorliegenden Erfindung können dem Medium vor oder nach dem Initiieren der Kultivierung von B. pertussis zugegeben werden. Alternativ kann das Salz den anderen Komponenten des Mediums vor oder nach dem Hinzugeben des bei der Herstellung des Mediums verwendeten Wassers, jedoch vor dem Einbringen der B. pertussis-Zellen beigemengt werden.
Eine Menge des Salzes, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um eine Steigerung der während der Fermentierung erzeugten PT-Menge zu fördern, kann zwischen ungefähr 0,05 mM bis ungefähr 50 mM, stärker bevorzugt zwischen ungefähr 10 mM und ungefähr 30 mM, am meisten bevorzugt ungefähr 20 mM betragen. Normalerweise sind ungefähr 10 mM bis ungefähr 20 mM des Salzes wirksam, um die Inhibition der PT-Expression durch Sulfat zu verhindern oder zu reduzieren. Ein Durchschnittsfachmann kann die optimale Salzmenge bestimmen, welche die Inhibition der PT-Expression in einem bestimmten B. pertussis-Stamm wirksam verhindert oder reduziert, und zwar einfach durch Routineexperimente.
Bei einer anderen Ausführungsform haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestimmt, daß regulierende Mediumkonzentrationen von Toxininhibitor-Vorläufern sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Toxininhibitorkonzentrationen reduzieren können. Beispielsweise haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt, was jedoch nicht als eine Einschränkung gedacht ist, daß die PT-Inhibitoren, die Sulfite und Sulfate aufweisen – ohne darauf beschränkt zu sein –, als Endprodukte des Cysteinmetabolismus erzeugt werden. Kurz gesagt, Bordetella verstoffwechselt das schwefelhaltige Aminosäurecystein auf einem Weg, der Enzymcystein-Desulfinase involviert. Während des Cysteinmetabolismus wird eine Sulfhyralgruppe enzymatisch von dem Cysteinmolekül abgespalten. Diese Sulfhyralgruppe wird weiter in Sulfite und Sulfate verstoffwechselt, die innerhalb der Bakterienzelle und dem extrazellulären Milieu akkumulieren. Je länger also Bordetella in Anwesenheit von Cystein gezüchtet wird, desto höher werden die intrazellulären und extrazellulären Sulfatkonzentrationen und desto weniger PT wird produziert.
Auf der Basis der Beziehung zwischen anfänglichen Kulturmedium-Cysteinkonzentrationen und endgültigen Sulfatkonzentrationen haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die nicht einschränkende Theorie entwickelt, daß die Reduzierung der anfänglichen Cysteinkonzentrationen in einer reduzierten intrazellulären und extrazellulären Sulfatakkumulation und infolgedessen in reduzierter PT-Inhibition resultieren würde. Um die Wirkung, die sich verändernde Cysteinkonzentrationen auf die Sulfatkonzentration haben, zu bewerten, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung drei unterschiedliche Kultursysteme entwickelt, die unter Verwendung der folgenden Abkürzungen identifiziert werden: LCMSSB, LCMSSFB und LCMSSBa. Das LCMSSB-Kultursystem (begrenzende cysteinmodifizierte Stainer-Scholte-Charge) bestand aus B. pertussis, gezüchtet im Chargenmodus unter Verwendung des Mediums gemäß der nachstehenden Tabelle 2. Kurz gesagt, "Chargenmodus" ist ein Prozeß, in dem Mikroorganismen in einem einzigen Kulturmedium, gewöhnlich flüssig oder halbflüssig, gezüchtet werden, ohne daß eine signifikante Menge des erschöpften oder verwendeten Kulturmediums ergänzt oder ausgetauscht wird. Bei der vorliegenden Erfindung wurden Chargenmoduskulturen (LCMSSB) zwischen ungefähr 35 °C und 37 °C aerob inkubiert, bis bakterielle optische Dichten > 1,0 Absorptionseinheiten erreichten, spektrophotometrisch bei 600 nm unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Vorgehensweisen gemessen. Das zweite Kultursystem LCMSSFB (begrenzende cysteinmodifizierte Stainer-Scholte-gespeiste Charge) wurde unter Verwendung des in Tabelle 3 angegebenen Kulturmediums aufrechterhalten. Es ist zu beachten, daß dem Basalmedium kein Cystein zugegeben wurde. Stattdessen wurde L-Cystein mit einer Rate von 20 mg/h für die gesamte Inkubationsdauer zugegeben. Das endgültige Kultursystem wurde als LCMSSBa (begrenzende cysteinmodifizierte Stainer-Scholte-Charge plus BaCl₂) bezeichnet und verwendete das in Tabelle 2 angegeben Basalmedium.
Alle drei Kultursysteme wurden beimpft und wie folgt aufrechterhalten: Bordetella-Kulturen wurden zwischen ungefähr 35 °C und 37 °C in 20-Liter-Bioreaktoren (New Brunswick BioFlo IV^® (New Brunswick Scientific, Edison NJ), angeschlossen an einen AFS Biocommand v2.0 (New Brunswick Scientific, Edison NJ) inkubiert, der Daten für pH, Bewegung, gelösten Sauerstoff, Temperatur und Luftdurchflußrate sammelte. Zusätzliche Pumpen für Schaumverhütungsmittel und pH-Kontrollreagenzien wurden nach Bedarf hinzugefügt, wie dem Durchschnittsfachmann bekannt ist. Der Luftdurchfluß wurde auf 4,0 l/min eingestellt, gelöster Sauerstoff wurde auf 40 % gehalten, und der pH wurde bei ungefähr 7,2 gehalten.
Jeder 20-Liter-Bioreaktor enthielt 11 Liter Testmedium und wurde mit einem Liter aktiv wachsender Bakterienstarterkultur beeimpft. Die aktiv wachsenden Starterkulturen wurden durch Beimpfen von Schüttelflaschen hergestellt, die einen Liter Stainer-Scholte-Medium (SS-Medium), dessen Formel in den Tabelle 5 und 6 angegeben ist, mit gefrorenen Impflingen enthielten, und inkubiert, bis eine optische Dichte von > 1,0 OD₆₀₀ erreicht war (ungefähr 20 bis 24 h).
Den beeimpften Bioreaktoren wurden in Abständen von 3 bis 6 h Proben entnommen, und diese wurden unter Zentrifugation in Kulturüberstände und Zellpellets getrennt. Die Kulturüberstände wurden in bezug auf PT, Sulfate, organische Säuren, Aminosäuren und Bakteriendichte analysiert. Bakterienzellpellets wurden auf innere Sulfat- und PT-Konzentrationen analysiert. Jedes Kultursystem erhielt ein bestimmtes Supplement (bestimmte Supplemente), wenn die Kulturbakterienpopulationsdichten ungefähr > 1,0 Absorptionseinheiten erreichten (ungefähr 12 h nach Beimpfen). Sowohl LCMSSB als auch LCMSSBa erhielten 200 ml des Aminosäuresupplements, das in der nachstehenden Tabelle 4 angegeben ist, zusätzlich zu 10,0 mg/l FeSO₄·7H₂O und 5,0 g/l Mononatriumglutamat (das FeSO₄/Glutamat-Supplement). Die LCMSSBa-Kultur erhielt ebenfalls ausreichend 1 mM BaCl₂, um eine endgültige Kulturmediumkonzentration von 20 nM BaCl₂ zu erhalten; die LCMSSFB-Kulturen erhielten das FeSO₄/Glutamat-Supplement mit zusätzlichen Aminosäuren ausschließlich Cystein und kein BaCl₂. Nach der Supplementierung wurden die Bioreaktoren wie vorher inkubiert, bis die Versuche beendet wurden.
Tabelle 2: Komponenten des LCMSSB-Mediums
Tabelle 3: Komponenten des LCMSSFB-Mediums
Tabelle 4: Komponenten des Aminosäure-Supplements
Alle drei reduzierten Cystein-Kultursysteme (LCMSSB, LCMSSFB und LCMSSBa) wurden parallel mit herkömmlichem SS-Medium mit Cysteinkonzentrationen, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, geprüft. Bordetella Bakterien- und PT-Konzentrationen sind in den Diagrammen der 8a und 8b gezeigt. Aus 8a ist ersichtlich, daß maximale Bordetella-Zellkonzentrationen bei ungefähr 32 h erreicht waren. Das maximale Wachstum war bei einem Vergleich von normalem PT-Erzeugungsmedium mit modifiziertem SS im Chargenmodus nahezu identisch. 8b zeigt die maximale PT-Produktion, gemessen in mg/ml Kulturmedium. Es ist ohne weiteres ersichtlich, daß unter Verwendung jedes der Cystein begrenzenden Kultursysteme der vorliegenden Erfindung eine signifikante Verbesserung der PT-Gesamtproduktion im Vergleich mit herkömmlichen Kultursystemen realisiert wird. Außerdem zeigt 9 innere und äußere Sulfatkonzentrationen in B. pertussis-Zellen in 20-Liter-Bioreaktoren unter beschränkenden Cystein-Bedingungen. Das LCMSSBa-Kultursystem zeigte die größte Verbesserung in der PT-Gesamtproduktion. Deshalb kann gemäß der Theorie der Erfinder der vorliegenden Erfindung die PT-Produktion durch Begrenzung der Menge an Inhibitorvorläufer in dem Kulturmedium signifikant verbessert werden.
Außerdem kann bei einer Kombination der den Vorläufer begrenzenden Kultursysteme der vorliegenden Erfindung mit den Systemen zum Entfernen der Toxinexpressions-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung noch eine weitere Verbesserung realisiert werden.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, daß: 1) bestimmte Toxinexpressions-Inhibitoren, die in dem Medium von Toxin erzeugenden Bakterien akkumulieren, die Gesamttoxinproduktion signifikant reduzieren können; und 2) daß das Entfernen von Toxinexpressions-Inhibitoren aus dem Kulturmedium oder die Reduzierung der Toxininhibitorbildung durch Reduzierung von Inhibitorvorläufern in dem Kulturmedium die Gesamttoxinproduktion signifikant steigern kann. Deshalb haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Theorie aufgestellt, daß das genetische Deaktivieren der Fähigkeit eines Toxin erzeugenden Organismus, einen Toxinexpressions-Inhibitor zu erzeugen, ähnliche Steigerungen in der Gesamttoxinproduktion ergeben könnte. Infolgedessen wird in noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein unter einem Mangel an Cystein-Desulfinase-Aktivität leidendes rekombinantes B. pertussis ("Knockout-Mutant"), das kein Sulfat in Kultur erzeugt und das somit keine inhibierte PT-Expression zeigt, bereitgestellt. Solche Knockout-Mutanten können durch eine von einer Reihe von verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 5 557 032 und 5 614 396. Mit solchen Verfahren ist im allgemeinen die homologe Rekombination eines DNA-Konstrukts mit B. pertussis chromosomaler DNA verbunden. Die homologe Rekombination ist ein gut erforschter, natürlicher zellulärer Prozeß, der resultiert in der Spaltung von zwei Nucleinsäuremolekülen, die identische oder im wesentlichen gleichartige (d. h. homologe) Sequenzen haben, und in der Ligasierung der zwei Moleküle derart, daß ein Bereich jedes anfangs anwesenden Moleküls mit einem Bereich des anderen Moleküls ligasiert wird. (Siehe Sedivy, J.M., BioTechnol. 6: 1192 bis 1196 (1988)). Die homologe Rekombination ist also ein sequenzspezifischer Prozeß, durch den Zellen einen "Bereich" einer DNA von einem DNA-Molekül zu einem anderen transferieren können. Damit eine homologe Rekombination zwischen zwei DNA-Molekülen stattfindet, müssen die Moleküle einen "Homologiebereich" in bezug aufeinander aufweisen. Ein solcher Homologiebereich muß mindestens zwei Basenpaare lang sein. Zwei DNA-Moleküle besitzen einen Homologiebereich, wenn eines einen Bereich enthält, dessen Sequenz einem Bereich in dem zweiten Molekül so ähnlich ist, daß eine homologe Rekombination stattfinden kann. Wenn ein bestimmter Bereich von zwei Homologiebereichen flankiert ist, können zwei Rekombinationsereignisse stattfinden, was in einem Austausch von Bereichen zwischen den beiden rekombinierenden Molekülen resultiert. Die homologe Rekombination wird von Enzymen katalysiert, die in B. pertussis natürlich anwesend sind.
In einem derartigen Verfahren wird die Gencodierung für Cystein-Desulfinase (7), beispielsweise in einem Plasmid enthalten, mit Restriktionsenzymen geschnitten, die ausgewählt sind, um innerhalb des Gens so zu schneiden, daß eine neue DNA-Sequenz, die für ein Markergen codiert, in die Cystein-Desulfinase-Gensequenz eingefügt werden kann. Dieses Markergen dient dazu, die Expression des Cystein-Desulfinase-Gens zu verhindern. Das Markergen kann jede Nucleinsäuresequenz sein, die nachweisbar und/analysierbar ist, in einer bevorzugten Ausführungsform ist es jedoch ein Antibiotika-Resistenzgen. Das Markergen kann wirkungsmäßig mit seinem eigenen Promotor oder einem anderen starken Promotor von jeder Quelle gekoppelt werden, die in B. pertussis aktiv oder darin auf einfache Weise aktivierbar ist. In einer anderen Ausführungsform kann das Markergen unter Verwendung des Promotors des Cystein-Desulfinase-Gens transcribiert werden. Das Markergen kann eine Poly(A)-Sequenz haben, die an das 3'-Ende des Gens angeheftet ist, um die Transcription zu beenden. Bevorzugte Markergene weisen ein Antibiotika-Resistenzgen auf, wie etwa ermC' (das Erythromycin-Resistenzgen), neo (das Neomycin-Resistenzgen), amp (das Ampicillin-Resistenzgen), kan (das Kanamycin-Resistenzgen) und Gent (das Gentamicin-Resistenzgen).
Nachdem die DNA-Sequenz mit den geeigneten Restriktionsenzymen, beispielsweise SpII und SphI oder PstI und PvoI, geschnitten worden ist, wird die Markergensequenz unter Anwendung von Methoden, die dem Fachmann wohl bekannt sind und die beispielsweise in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) beschrieben sind, in die Cystein-Desulfinase-DNA-Sequenz ligasiert. Die Enden der zu ligasierenden DNA-Fragmente müssen kompatibel sein; dies wird erreicht, indem entweder sämtliche Fragmente mit Enzymen geschnitten werden, die kompatible Enden erzeugen, oder indem die Enden vor der Ligasierung geglättet werden. Das Glätten wird unter Anwendung von Methoden, die in der Technik wohl bekannt sind, ausgeführt, wie beispielsweise durch Verwendung eines Klenow-Fragments (DNA-Polymerase I) oder einer anderen DNA-Polymerase, um klebrige Ende auszufüllen. Dieses Konstrukt enthält DNA-Sequenzen, die definierten Bereichen des Cystein-Desulfinase-Gens entsprechen, beispielsweise den 3'- und 5'-Enden des Cystein-Desulfinase-Gens entsprechen, was die Integration des Konstrukts durch homologe Rekombination ermöglicht. Dieses DNA-Konstrukt kann in ein Plasmid ligasiert werden, das ein zweites Antibiotika-Resistenzgen hat.
Das Konstrukt kann dann unter Anwendung bekannter Methoden, beispielsweise durch Elektroporation oder durch Paaren mit transfizierten E. coli-Zellen, in B. pertussis transfiziert werden. Das Screening der Zellen wird ausgeführt, indem die Zellen in Anwesenheit von sonst letalen Konzentrationen von einem oder mehreren Antibiotika gezüchtet werden, die den Antibiotika-Resistenzgenen entsprechen, welche anwesend sind. In diejenigen Zellen, die überleben, ist das Knockout-Konstrukt integriert. Man kann ein nicht replizierendes Plasmid verwenden, so daß sich in den gewählten Zellen nicht nur das Plasmid-Konstrukt befinden würde. Um die Integration des Knockout-Konstrukts zu bestätigen, kann ein Southern-Blot der B. pertussis-DNA mit einer Sequenz untersucht werden, die ausgebildet ist, um nur die Markersequenz und/oder den Anteil der Cystein-Desulfinase zu hybridisieren, der entfernt wird. Alternativ oder zusätzlich kann die DNA durch PCR mit Sonden amplifiziert werden, die den 3'- und 5'-Enden des Cystein-Desulfinase-Gens entsprechen. Schließlich kann die Cystein-Desulfinase-Aktivität analysiert werden.
In einer anderen Ausführungsform kann B. pertussis in Anwesenheit von Nucleotidsequenzen gezüchtet werden, die zu der codierenden Sequenz des Cystein-Desulfinase-Gens gegensinnig sind. In dieser Ausführungsform werden die Nucleotidsequenzen von B. pertussis aufgenommen, hybridisieren zu dem für Cystein-Desulfinase codierenden Gen und inhibieren die Translation des Gens. Es können auch modifizierte Nucleotidsequenzen verwendet werden, die mit den Basen des Gens in Wechselwirkung treten, um kovalente Bindungen zu bilden und dadurch die Translation zu inhibieren. Siehe das US-Patent 6 015 676.
Beispiele von Nucleotiden, die zu dem Cystein-Desulfinase-Gen gegensinnig sind, weisen ein Nucleotid mit mindestens 8 Basen, bevorzugt 10 bis 15 Basen auf, die zu dem codierenden Bereich von 7 komplementär sind. Beispiele umfassen:
GATTGCTGAT (SEQ.ID.NO.1)
TAGATGGGGC (SEQ.ID.NO.2)
Bei der vorliegenden Erfindung kann eine Vielfalt von Medien dazu verwendet werden, B. pertussis zu züchten. Nicht einschränkende, beispielhafte Medien umfassen Stainer-Scholte- und die GMAR-modifizierten Medien. Die Komponenten der Stainer-Scholte- und GMAR-modifizierten Medien sind in den Tabellen 2 bzw. 3 angegeben.
Tabelle 5: Komponenten des Stainer-Scholte-Mediums^b

^b Aus: Hewlett und Wolff, J. Bacteriol. 127: 890 bis 898 (1976).

Tabelle 6: Komponenten des GMAR-modifizierten Mediums
Das nach den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte PT-Toxin kann nach der von Sekura et al., J. Biol. Chem. 258: 14647 bis 14651 (1983), beschriebenen Methode gereinigt werden. Kurz gesagt, die Methode von Sekura wendet zwei konsekutive chromatographische Schritte an, um PT zu reinigen. Der erste Schritt umfaßt die Chromatographie an einer Affigelblau-Säule. Der zweite Schritt umfaßt die Chromatographie an einer Fetuin-Agarose-Säule. Die PT-Reinigungsmethode von Sekura et al. ermöglicht die routinemäßige und rasche Reinigung von PT in relativ großen Mengen (über 10 mg). Alternativ kann PT unter Verwendung einer Peptidaffinitätssäule gereinigt werden. Eine solche Säule ist in dem nachstehenden Beispiel 1 beschrieben. In dieser Ausführungsform wird das PT an der Säule adsorbiert, mit Puffer (beispielsweise 50 mM TRIS HCl, pH = 6,2) gewaschen, und dann wird das PT mit 4M MgCl₂ eluiert. Das MgCl₂ wird durch Dialyse entfernt, um ein im wesentlichen reines PT zu ergeben.
Nachdem nun die vorliegende Erfindung allgemein beschrieben worden ist, wird sie unter Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele weiter erläutert, die hier nur zum Zweck der Veranschaulichung angegeben sind und nicht der Beschränkung dienen sollen, soweit nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1
Materialien und Methoden
Organismen: B. pertussis-Stamm CS87 vom Wildtyp wurde für die meisten dieser Untersuchungen verwendet. Dieser Stamm hat seinen Ursprung in China und wurde zu dem National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) in den National Institutes of Health (NIH) gebracht. Zusätzlich wurden mehrere Stämme von BP von der American Type Culture Collection (Manassas, VA) beschafft, einschließlich ATCC Nummer 10380, ohne darauf beschränkt zu sein, wobei beide für die Herstellung der hier beschriebenen Cystein-Desulfinase-Knockout-Mutanten geeignet sind. Die Organismen wurden entweder bei –70 °C gelagert oder auf BGA (BBL, Inc., Rockville, MD) in einem auf 37 °C gehaltenen, feuchten Inkubator gehalten.
Das Medium, das zum Züchten der Zellen verwendet wurde, war dem definierten Medium ähnlich, das von Stainer und Scholte beschrieben wird. J.Gen.Microbiol. 63: 211 bis 220 (1970). Ein Liter des Mediums enthielt: 10,7 g Mononatriumglutamat, 0,24 g Prolin, 2,5 g NaCl, 0,5 g KH₂PO₄, 0,2 g KCl, 0,1 g MgCl₂·6H₂O, 20 mg CaCl₂·2H₂O, 1,52 g Tris, 20 mg Ascorbinsäure, 100 mg Glutathion, 40 mg Cystein und 4 mg Niacin. Die Salze, Glutamat und Prolin wurden als eine Basalformulierung hergestellt und zur Sterilisation autoklaviert. Das restliche Medium (Supplement) wurde in konzentrierter Form (100fach) hergestellt und durch Filtern sterilisiert. Der endgültige pH des Mediums lag zwischen 7,2 und 7,5. In einigen Experimenten wurden 10 mg/l FeSO₄·7H₂O zugegeben. Organismen wurden gezüchtet entweder in dreifach abgeschirmten Erlenmeyer-Kolben in einem Schüttelinkubator New Brunswick Innova Model 4300 (New Brunswick Scientific, Edison, NJ), der auf 37 ° gehalten wurde, oder in einem New Brunswick 20 l BioFlo IV (New Brunswick Scientific), der im Chargenmodus mit einem Arbeitsvolumen von 12 l arbeitete. Der Reaktor war an einen AFS Bio Command v.2.0 (New Brunswick Scientific) angeschlossen, der Daten sammelte in bezug auf pH, Bewegen, gelösten Sauerstoff, Temperatur, Luftdurchflußrate und zusätzliche Pumpen zur Schaumverhütung und Aufrechterhaltung des pH. Die Luftdurchflußrate in dem Bioreaktor wurde in sämtlichen Experimenten auf 0,125 vvm eingestellt, und die Temperatur wurde auf 36,5 °C gesteuert. Der gelöste Sauerstoff (DO) wurde durch Verwendung einer Rührkaskade von 150 bis 1000 Umdrehungen/min auf 40 % gehalten. Der pH wurde durch Hinzugeben von 50 % H₃PO₄ auf 7,2 gesteuert.
Der Reaktor wurde mit einer Charge von ungefähr 11 l definiertem Medium beschickt und mit einem aktiv wachsenden Impfling (1 l) auf ein Gesamtarbeitsvolumen von 12 l beimpft. Proben wurden aus dem Resterilisationsprobenport alle 3 bis 6 h entnommen. Für die Analyse von extrazellulären Metaboliten wurde der Überstand durch ein 0,2 μm Millex-GV-Filter (Millipore Co., Bedford, MA) filtriert und bei –20 °C aufbewahrt.
Das Wachstum der Kultur wurde durch die optische Dichte bei 650 nm (OD₆₅₀) unter Verwendung eines Shimadzu UV Spec 120 (Shimadzu, Columbia, MD) gemessen. Die Kulturreinheit wurde durch Gramfärbung und Aufbringen auf BGA (BBL, Inc. Rockville, MD) und Trypticase-Sojaagar (TSA; BBL, Inc.) verifiziert. Eine reine Kultur von B. pertussis würde sämtliche Organismen, die gram-negativ färben, Wachstum auf BGA-Agar und mangelndes Wachstum auf TSA-Agar demonstrieren.
Aminosäureanalyse: Die Analyse und Quantifizierung von Aminosäuren wurde durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) unter Anwendung einer Online-Vorsäulen-Derivatisierung durchgeführt, wie dies für die Amino Quant-Säule (Hewlett-Packard Co., Wilmington, DE) vorgesehen ist. Primäre Säuren wurden durch das OPA-Reagens (10 mg/ml o-Pthalaldehyd, 10 mg/ml 3-Mercaptopropionsäure in 0,4M Boratpuffer) derivatisiert, während sekundäre Aminosäuren durch FMOC-Reagens (2,5 mg/ml 9-Fluorenylmethylchlorformiat in Acetonitril) derivatisiert wurden. Für primäre Aminosäuren bestand die mobile Phase aus Natriumacetat/Triethanolamin/Tetrahydrofuran (pH 7,2 ± 0,05), und sie wurden bei 338 nm nachgewiesen. Sekundäre Aminosäuren wurden unter Verwendung einer mobilen Natriumacetat/Methanol/Acetonitril-Phase (pH 7,2 ± 0,05) eluiert und bei 262 nm nachgewiesen. Die Identifikation jeder Aminosäure erfolgte mit einem Set von Aminosäurestandards (Hewlett-Packard) bei unterschiedlichen Konzentrationen (100, 250 und 1000 pmol/μl). Das HPLC Model HP-1050 (Hewlett-Packard) wurde für diese Analysen in Verbindung mit der HP ChemStation Software (Hewlett-Packard, v.2.0) verwendet.
Nachweis und Quantifizierung von organischen Säuren: Organische Säuren wurden unter Verwendung von Model HP-1050 HPLC (Hewlett-Packard) in Verbindung mit der Software HP ChemStation v.2.0 und ausgestattet mit einer Säule BioRad Aminex HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Burlingame, CA) nachgewiesen, die eine mobile Gasphase von 4 mM H₂SO₄ hatte. Die Säule wurde bei 35 °C äquilibriert, und die isokratische Durchflußrate war 0,6 ml/min. Der Nachweis erfolgte bei 215 nm. Die Identifikation jeder organischen Säure wurde erreicht durch Injizieren des Bio-Rad Organic Acid Analysis Standard (Bio-Rad Laboratories), der aus einem Gemisch aus Natriumoxalat, Natriumcitrat, Natriummaleat, Natriumsuccinat, Natriumformiat und Natriumacetat bestand. Pyruvat wurde beurteilt durch Zusetzen von 2,5 g/l Pyruvat zu dem organischen Säurestandard.
Jede von den organischen Säuren wurde unter Verwendung von enzymatischem Kits und Einhaltung des vom Hersteller empfohlenen Protokolls wie folgt quantifiziert: Citronensäure, Boehringer-Mannheim Kit 139-076 (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN); Bernsteinsäure, Boehringer-Mannheim Kit 176-281 (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN); Ameisensäure, Boehringer-Mannheim Kit 979-732 (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN); Essigsäure, Boehringer-Mannheim Kit 148-261 (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN); Oxalsäure, Boehringer-Mannheim Kit 755-699 (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN); und Pyruvat, Sigma Kit 726-UV (Sigma Chemicals Co, St. Louis, MO).
Quantiativer PT-ELISA-Assay: Mikrotiterplatten (Nunc-Immuno Plate IIF, Vangard International Neptune, NJ) wurden sensibilisiert durch Hinzugeben von 0,1 ml Fetuin pro Vertiefung (Sigma Chemical Co.) mit 0,2 μg/ml in 0,1M Natriumcarbonat, pH 9,6, und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. Die Platten wurden fünfmal mit einer Lösung gewaschen, die 0,9 % NaCl, 0,05 % Brij 35, 10 mM Natriumacetat mit pH 7,0 und 0,02 % Azid enthielt. Proben, die PT enthielten, wurden in PBS mit 0,5 % Brij 35 verdünnt und der Platte zugefügt und für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden wieder wie vorher gewaschen, und der monoklonale Antikörper für PT (20,6) wurde mit PBS verdünnt. Ibsen et al., Infect. Immun. 61: 2408 bis 2418 (1993). Die Platten wurden erneut gewaschen, und der sekundäre Antikörper, alkalische Phosphatase konjugiert mit Ziege-Antimaus-IgG und -IgM (Tago Inc., Burlingame, CA), wurde in PBS-Brij verdünnt, den Platten zugefügt und dann für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden wie vorher gewaschen, und p-Nitrophenylphosphat (Sigma Phosphatase Substrate 104) (1 mg/ml), in einer Lösung von 0,1M Diethanolamin, 1 mM MgCl₂, 0,1 mM ZnCl₂ und 0,02 % Azid mit pH 9,8 wurde zugegeben. Die Platten wurden bei 37 °C für 1 h inkubiert, und die Absorption bei 405 nm wurde unter Verwendung eines Mikrotiter-Plattenlesers Dynex Model MRX (Dynex Technologies, Inc., Chantilly, VA) bestimmt. Für jede Platte wurde unter Verwendung von gereinigtem PT (North American Vaccine, Inc.), verdünnt in 0,1 % BSA und 0,1 % Glycerin in PBS, eine Standardkurve erzeugt. Die Konzentration von PT aus Kulturproben wurde aus der Standardkurve errechnet.
Sulfatbestimmungen: Sulfatkonzentrationen in dem Medium wurden unter Anwendung der Methoden von Melnicoff et al., bestimmt. Der Assay wurde an einen Mikroplatten-Assay angepaßt. Melnicoff, et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 14: 377 bis 386 (1976).
Klonen des B. pertussis nifS-ähnlichen Gens: Das DNA-Fragment, welches das nifS-ähnliche Gen enthielt, wurde durch einen Perkin-Elmer Thermal Cycler 480 amplifiziert. Das Reaktionsgemisch (50 μl) enthielt: 20 ng gereinigte B. pertussis chromosomale DNA, 0,2 μM von jedem Primer (Hinprimer: 5' ATG AGC AAT CGC CCC ATC TAC 3' (SEQ. ID. NO. 3); Rückprimer: 5' CAC TAT TTG GTC GGT CGG 3' (SEQ. ID. NO. 4), 2 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 400 μM von jedem dNTP und 2,5 Einheiten AmpliTaq Gold (Perkin Elmer, Branchburg, NJ). Die Bedingungen waren wie folgt: erster Zyklus, 2 min bei 94 °C; anschließende 35 Zyklen, 94 °C (2 min), 42 °C (1 min), 72 °C (2 min); und mit einer endgültigen Inkubationszeit bei 72 °C für 8 min. Das PCR-Produkt wurde in einem 1 % Agarosegel gelgereinigt und in pCR^®II-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) ligasiert unter Anwendung der Bedingungen, die von dem Hersteller von pBPfilS empfohlen sind. Das Plasmid pBPfilS wurde zu E. coli-Stamm TOPF' (Invitrogen) transformiert, und Transformanten wurden an LB-amp-Agarmedium ausgewählt. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung eines automatischen Sequenzers Applied Biosystems PRISM Model 310 (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA) unter Anwendung der Empfehlungen und des Sequenzierkits des Herstellers durchgeführt.
Konstruktion eines B. pertussis-Stamms, der eine Nullmutation in dem BPfilS-ähnlichen Gen enthält: Das gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung hergestellte pBPfilS-Plasmid wurde mit SpII und SphI geschnitten, und die Enden wurden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) geglättet. Das geschnittene Plasmid wurde gelgereinigt und ein Erythromycin-resistentes Gen mit glatten Enden (ermC') oder Luciferase wurde in die Plasmidkonstruktion ligasiert. Klugman, et al., Infect. Immun. 57: 2066 bis 2071 (1989). Transformanten von DH5 wurden identifiziert, die eine Resistenz gegenüber 100 μg Erythromycin pro ml hatten. Das konstruierte Plasmid wurde unter Verwendung von Qiagen-Säulen (Qiagen, Inc. Valencia, CA) erneut isoliert, und das mutierte Insert wurde durch Schneiden des Plasmids mit BamHI und XhoI isoliert. Das Insert wurde gelgereinigt und in die BamHI- und XhoI-Stelle des Plasmids pSS1129 ligasiert, um pBPΔfilS zu bilden. Stibitz, J., Bacteriol. 180: 2484 bis 2492 (1998). Dies wurde in den E. coli-Stamm SM10 transformiert, und die Transformanten wurden zur Paarung mit dem B. pertussis-Stamm BP536 verwendet, wie von Stibitz beschrieben ist. "Use of Conditionally Counterselectable Suicide Vectors for Allelic Exchange" in Bacterial Pathogenesis, Clark und Bavoil (eds.), Seiten 301 bis 308 (1997). B. pertussis-Isolate, die das Null-BpfilS-Gen in dem Chromosom enthielten, wurden für Gentamicin-, Streptomycin- und/oder Erythromycin-Resistenz oder Luciferase-Aktivtät an BGA-Agar ausgewählt.
Verschiedenes: Sämtliche Materialien wurden von Sigma Chemical Co. und/oder mit dem höchsten erhältlichen Gütegrad erworben. Das Gesamtprotein wurde durch Coomassie Protein Assay^® (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) quantifiziert. Human-IgG wurde als der Standard verwendet. Bordetella pertussis-Stamm BP536, ein spontaner Streptomycin-resistenter Mutant des Stamms BP338, der in den Transformationsexperimenten verwendet wurde, wurde von Dr. Scott Stibitz im Center for Biological Research and Evaluation, United States Food and Drug Administration (Stibitz, S. und M-S. Yang, 1991, J. Bact. 173: 4288 bis 4296) erhalten. Der davon abgeleitete transformierte B. pertussis-Knockout-Mutant wurde als Stamm BP536pWY bezeichnet und ist bei American Type Culture Collection (Manassas, VA) gemäß den Bedingungen des Vertrags von Budapest hinterlegt worden. Sämtliche angewandten Methoden sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt. Siehe beispielsweise: Methods in Molecular Biology, Vol. XX, B.D. Shepard und M.S. Gilmore (eds.) (1995); DNA-Sequencing, L. Alphey. Bios Scientific Publishers (1997); Diagnostic and Molecular Microbiology: Principles and Applications, D.H. Persing, T.F. Smith, F.C. Tenover und T.J. White (eds.) (1993) American Society for Microbiology; Molecular Biology, D. Freifelder (ed.) (1987), Jones and Bartlett Publishers; und Molecular Biology of the Gene, J.D. Watson, N.H. Hopkins, J.W. Roberts, J.A. Steiz und A.M. Weiner (eds.) (1987), The Bengerman/Cummings Publishing Company, Inc.
Ergebnisse
Nachweis von Inhibitor(en) der PT-Produktion in Kulturlösungen von BP: Proben wurden zu verschiedenen Zeiten während der Wachstumsphase der BP-Kulturen entnommen. Die Proben wurden in bezug auf BP-Wachstum durch Messen des OD₆₅₀ und in bezug auf die Produktion von PT mittels ELISA überwacht. Die Ergebnisse wurden als PT in Mikrogramm/pro ml/OD₆₅₀ berechnet, zum Zweck der Approximation der pro Zelle produzierten PT-Menge. Wie 1 zeigt, fiel die pro Zelle produzierte PT-Menge mitten im Wachstumszyklus drastisch ab. Obwohl B. pertussis logarithmisches Phasenwachstum fortsetzte, schien die PT-Produktion auf nahezu die vollständige Eliminierung der PT-Produktion abzunehmen. Dies legte nahe, daß ein Inhibitor der PT-Produktion während der frühen Phasen der Züchtung erzeugt wurde und daß nach Erreichen der inhibierenden Konzentration die PT-Produktion aufhörte. Um diese Hypothese zu prüfen, wurde Kulturüberstand von einer B. pertussis-Kultur, die bis zur stationären Phase gezüchtet war, lyophilisiert und mit Kulturmedium, dem die basischen Salze fehlten, rekonstituiert. Dieses Gemisch wurde dann dazu verwendet, eine zweite Kultur von B. pertussis zu züchten, und wurde mit dem ursprünglichen Medium verglichen, das für B. pertussis verwendet worden war. Proben wurden wie vorher entnommen und analysiert. Das Wachstum von B. pertussis in jedem von den zwei Medien war ähnlich, wobei OD₆₅₀ nahezu die gleichen Werte erreichte. Die in dem rekonstituierten Gemisch erzeugte Gesamtmenge an PT war jedoch im Vergleich mit derjenigen in dem ursprünglichen Medium drastisch verringert. Eine mehr visuelle Demonstration einer solchen Inhibition und, daß dieser Inhibitor auch die Produktion von Adenylat-Cyclase, die Ursache von Hämolyse an einer Blutagarplatte, beeinflußt, ist in 2 gezeigt. Ein anfänglicher Ausstrich von B. pertussis wurde auf einer BGA-Platte hergestellt, und man ließ ihn für 48 h wachsen. Dann wurden sekundäre Kreuzausstriche hergestellt, und die Agarplatte wurde für zusätzliche 48 h inkubiert. Es ist ersichtlich, daß eine Nicht-Hämolysezone von dem anfänglichen Wachstumsausstrich abstrahlt. Die Charakterisierung des Inhibitors begann durch Filtrieren des erschöpften Kulturmediums durch einen 3.000 MWCO-Filter, der sowohl das Permeat als auch das Filtrat zurückhielt. Beide wurde wie vorher lyophilisiert und rekonstituiert. 3 zeigt die Ergebnisse des in diesen Gemischen gezüchteten B. pertussis im Vergleich mit dem GMAR-Medium. Die PT-Produktion wurde durch das Permeatgemisch inhibiert, was nahelegt, daß der Inhibitor ein Molekulargewicht von weniger als 3.000 hatte.
Analyse von Aminosäure und organischer Säure: Die Analyse sowohl von Aminosäure als auch die von organischer Säure wurden an Proben vorgenommen, die zu verschiedenen Zeiten im Verlauf einer typischen B. pertussis-Züchtung entnommen wurden, um zu bestimmen, ob der Anstieg und/oder der Zeitpunkt der Zunahme dieser Verbindungen mit dem Zeitpunkt der Produktionsinhibition von PT korrelierte. Diese Daten sind in den 4a und 4b gezeigt. Es ist zu beachten, daß der Abfall der PT-Produktion bei ungefähr der Hälfte der Wachstumsphase, typischerweise bei 20 h, stattfindet. Drei Verbindungen erscheinen und nehmen weiterhin in ihrer Konzentration um diesen Zeitraum herum zu: Methionin, Cystein und Pyruvinsäure. Der Anstieg von Methionin scheint zuerst aufzutreten, gefolgt von Cystein und Pyruvinsäure. Viele Bahnen koppeln den Metabolismus von Methionin an Cystein. Wenige Bahnen erzeugen jedoch Pyruvat aus Cystein. Drei derartige Bahnen sind in Leninger, A.L., Biochemistry, Worth Publishers, Seite 441 (1970), gezeigt. In jeder von diesen drei Bahnen wird die Schwefelgruppe von Cystein entfernt und Pyruvat erzeugt, wodurch der Anstieg von jeder dieser Verbindungen aneinander sowie an eine Zunahme von Sulfat in dem Medium gekoppelt ist.
Sulfatproduktion in B. pertussis-Kultur: Die Konzentration von Sulfat wurde an jeder von den Kulturproben bestimmt und mit B. pertussis-Wachstum (OD₆₅₀) und der Zeit verglichen. 5 zeigt die Ergebnisse dieser Bestimmungen an den gleichen Proben, die verwendet wurden, um die Daten in 4 zu erzeugen. Die Daten zeigen, daß ungefähr zu der Zeit, zu der die Konzentration von Methionin, Cystein und schließlich Pyruvat anstieg, auch eine große Zunahme in der Produktion von Sulfat erfolgte.
Züchten von B. pertussis und Produktion von PT in Anwesenheit von BaCl₂: Das Sulfation ist ein Modulator von B. pertussis aus der virulenten Phase zu der avirulenten Phase. Diese Modulation wird durch die Proteine BvgS und BvgA moduliert, die Mitglieder einer großen Familie von Zwei-Komponenten-Regulationsmolekülen sind. Obwohl seit einiger Zeit bekannt ist, daß die Zugabe von Fremdsulfat die Produktion von mehreren von den Virulenzfaktoren einschließlich PT nach unten regulieren würde (Weiß und Hewlett, Ann. Rev. Microbiol. 40: 661 bis 686 (1986)), blieb die Identifikation der Verbindung oder Verbindungen, die mit diesem System in Wechselwirkung treten, unbekannt. Um zu bestimmen, ob die mögliche Erzeugung von Sulfat aus dem Cysteinkatabolismus oder einer anderen Quelle im Verlauf der B. pertussis-Züchtung die PT-Produktion beeinträchtigen könnte, wurde nach einem Weg gesucht, den Einfluß von Sulfat entweder zu inaktivieren oder aus der Kultur zu beseitigen. Barium in Form von BaCl₂ ist in Wasser hochlöslich (1,8M bei 25 °C und 2,8M bei 100 °C), wogegen BaSO₄ hochunlöslich ist (10,7μM bei 25 °C und 17,7μM bei 100 °C). Dieser Unterschied in der Löslichkeit ist oft dazu genutzt worden, Sulfat aus Lösung zur weiteren Messung auszufällen. Unterschiedliche Konzentrationen von BaCl₂ wurden dem Wachstumsmedium zugegeben, und das Wachstum und die Produktion von PT in der Kultur wurden verglichen. Diese Daten sind in 5 gezeigt. Die Zugabe des BaCl₂ in beiden Konzentrationen steigerte die Produktion von PT pro Zelle in beiden B. pertussis-Stämmen, verglichen mit dem normalen Medium, obgleich in größerem Ausmaß in dem Stamm 9797. Es ist ferner zu beachten, daß beobachtet werden konnte, daß ein sichtbares Präzipitat über die Zeit in der Kultur akkumulierte, vermutlich BaSO₄. Diese Daten legen nahe, daß der negative Rückkopplungsinhibitor von PT in der Kultur Sulfat ist.
Klonen eines Cystein-Sulfinat-Desulfinase-Gens aus BP: Eines der möglichen Enzyme, die für das Entfernen von Schwefel aus Cystein, nifS-ähnlichen Genen, verantwortlich sind, ist aus E. coli geklont und charakterisiert worden. Mihara et al., J. Biol. Chem. 272: 22417 bis 22424 (1997). Unter Anwendung dieser Sequenz wurde nach einer Homologie in der teilweisen B.-pertussis-Genom-Datenbank gesucht. Ein offenes Leseraster, das hohe Homologie zu den nifS-Genen zeigte, wurde gefunden, und geeignete PCR-Primer wurden synthetisiert. Ein PCR-Produkt der geeigneten Größe wurde unter Einsatz von B. pertussis chromosomaler DNA erzeugt, zu einem TA-Klonierungsvektor pCR^®II-TOPO geklont und unter Anwendung von dem Durchschnittsfachmann bekannten Methoden sequenziert (7).
Peptid-Synthese und und -Reinigung: Ein Peptid, das die Sequenz GGGDGSFSGFGDGSFSGFG-OH (SEQ. ID. NO. 5) enthielt, wurde von The Rockefeller University Protein Sequencing Facility unter Anwendung der NMP t-Butoxycarbonyl-Chemie an einem ABI 430A Peptid-Synthetisierer (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert. Das Peptid wurde entschützt und aus dem Harz durch Behandlung mit HF in Anwesenheit von Anisol entfernt (0 °C/1 h). Eine vorbereitende Reinigung des Peptids wurde unter Verwendung einer C-18-Säule (2,14 ID × 30 cm) (Dynamax-Rainin, Woburn, MA) durchgeführt. Das Peptid wurde durch PTC-Aminosäure-Analyse unter Verwendung eines Waters Picotag Systems (Waters, Milford, MA) quantifiziert. Das synthetisierte Peptideluat aus der C-18-Säule war ein Hauptpeak, der aus 95 % des gesamten Elutionsprofils bestand. Die Aminosäurezusammensetzung des gereinigten Peptids war in guter Übereinstimmung mit der Sequenz, die zur Synthetisierung des Peptids angewandt wurde.
Konstruktion der Peptidaffinitätssäule: Superose^® 6B wurde unter Anwendng der von Brandt et al., Biochim. Biophys. Acta 386: 196 bis 202 (1975) beschriebenen Methode aktiviert. Kurz gesagt, ein 50 % Gelbrei von vorgewaschener Superose^® 6B in 0,1M NaHPO₄, pH 8,0, wurde mit einer Lösung aus 250 mM p-Benzochinon in Ethanol behandelt, um eine Endkonzentration von 20 % Ethanol und 50 mM p-Benzochinon zu ergeben. Die Suspension wurde für 1 h bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Die aktivierte Superose^® 6B wurde dann an einem groben, scheibenförmigen gesinterten Glastrichter mit zwei Volumen von jeweils 20 % Ethanol, entionisiertem H₂O, 1 M NaCl und wiederum mit entionisiertem H₂O ausgiebig gewaschen. Die aktivierte Superose^® 6B wurde zu einem kompakten Kuchen aspiriert, und ein Volumen einer Lösung, die 2 mg/ml des Peptids in 0,1M NaHPO₄, pH 8,0, enthielt, wurde zugegeben, und das Gemisch wurde für 24 h bei 4 °C aufrecht gedreht. 1,0M Ethanolamin, pH 8,0, wurde dann zugegeben, und das Drehen wurde für 1 h bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Gelmatrix wurde dann mit entionisiertem H₂O, 1,0M NaCl in 0,1M NaHPO₄, pH 7,0, ausgiebig gewaschen. Aliquote der anfänglichen Peptidlösung und des Überstands unmittelbar nach dem Kopplungsschritt wurden zurückgehalten und mit A₂₈₀ unter Verwendung eines Shimadzu UV Spec 120 (Shimadzu, Columbia, MD) gemessen, um den Einbau des Peptids an der Superose^® 6B zu bestimmen.

Claims

Verfahren zur verstärkten Herstellung von Pertussistoxin oder Pertactin, das aufweist: Züchten eines Pertussistoxin oder Pertactin erzeugenden Bakteriums in einem Bakterienkulturmedium, wobei Sulfationen aus dem Bakterienkulturmedium eliminiert oder reduziert werden, wobei das Verfahren einen oder mehrere von den folgenden Schritten aufweist: a) Hinzugeben einer Zusammensetzung zu dem Bakterienkulturmedium, die einen im wesentlichen unlöslichen Komplex mit Sulfationen bildet; b) Bereitstellen eines Bakterienkulturmediums, das einen Mangel an chemischen Spezies oder eine verringerte Konzentration von chemischen Spezies hat, die durch die Pertussistoxin oder Pertactin erzeugenden Bakterien metabolisch in Sulfationen umgewandelt werden; und c) Bereitstellen eines Cystein-Desulfinase-Knockout-Mutantenbakteriums zur Herstellung des Pertussistoxins oder Pertactins, und Reinigen des so hergestellten Pertussistoxins oder Pertactins.
Verwendung einer Zusammensetzung, die imstande ist, einen im wesentlichen unlöslichen Komplex mit Sulfationen zu bilden, um die Herstellung von Pertussistoxin oder Pertactin durch ein Pertussistoxin oder Pertactin erzeugendes Bakterium zu verstärken.
Verwendung eines Bakterienkulturmediums, das einen Mangel an chemischen Spezies oder eine reduzierte Konzentration von chemischen Spezies hat, die durch Pertussistoxin oder Pertactin erzeugende Bakterien metabolisch in Sulfationen umgewandelt werden, um die Herstellung von Pertussistoxin oder Pertactin durch die Bakterien zu verstärken.
Verwendung eines Cystein-Desulfinase-Knockout-Mutantenbakteriums für die Herstellung von Pertussistoxin oder Pertactin.
Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung ein lösliches Metallsalz ist.
Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 1 oder 3, wobei die chemische Spezies, die metabolisch in Sulfationen umgewandelt wird, Cystein ist.
Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Bakterienkulturmedium, das einen Mangel an chemischen Spezies oder eine reduzierte Konzentration von chemischen Spezies hat, die metabolisch in Sulfationen umgewandelt werden, ferner ein lösliches Metallsalz aufweist, das einen im wesentlichen unlöslichen Komplex mit Sulfationen bildet.
Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 1 oder 4, wobei das Cystein-Desulfinase-Knockout-Mutantenbakterium ein rekombiniertes Bordetella pertussis oder Bordetella bronchiseptica ist.
Verfahren zum Züchten von B. pertussis, das aufweist: Züchten von B. pertussis in Anwesenheit einer wirksamen Menge an einem oder mehreren löslichen Metallsalzen, die einen im wesentlichen unlöslichen Komplex mit Sulfat bilden.
Kulturmedium, welches das Wachstum von B. pertussis fördert und B. pertussis und eine Menge an einem oder mehreren löslichen Metallsalzen aufweist, die einen im wesentlichen unlöslichen Komplex mit Sulfat bilden, wobei die genannte Menge die Inhibierung der Expression von Pertussistoxin (PT) durch Sulfat verhindert oder verringert.
Verfahren zur Herstellung von PT, das aufweist: Züchten von B. pertussis in einem B. pertussis-Kulturmedium, das eine wirksame Menge an einem löslichen Metallsalz aufweist, das einen im wesentlichen unlöslichen Komplex mit Sulfat bildet, und Isolieren des PT aus dem Kulturmedium.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 11 oder Kulturmedium nach Anspruch 10, wobei das lösliche Metallsalz ein Ba(II)-Halogenid ist.
Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 5, 9 oder 11 oder Kulturmedium nach Anspruch 10, wobei das lösliche Metallsalz BaCl₂ oder BaBr₂ ist.
Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 5, 9 oder 11 oder Kulturmedium nach Anspruch 10, wobei das lösliche Metallsalz ein lösliches Salz von Pb(II), Sr(II) oder Ag(II) ist.
B. pertussis-Cystein-Desulfinase-Kockout-Mutant.
Verfahren zur Herstellung von PT, das aufweist: Züchten eines B. pertussis-Cystein-Desulfinase-Knockout-Mutanten in einem B. pertussis-Kulturmedium und Isolieren des PT aus dem Kulturmedium.
Verfahren zur verstärkten Herstellung von PT, das aufweist: Züchten eines B. pertussis-Cystein-Desulfinase-Knockout-Mutanten, so daß im Vergleich mit dem Fall der Verwendung eines Nicht-Cystein-Desulfinase-Knockout-Mutanten eine gesteigerte Menge an PT hergestellt wird.