DE19512346C1

DE19512346C1 - Verfahren zur Reinigung von Filamenthämagglutinin und Pertussis-Toxin

Info

Publication number: DE19512346C1
Application number: DE19512346A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr List; Eckhard Dr Schueler; Uwe Lenz
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: GSK Vaccines GmbH
Priority date: 1995-04-01
Filing date: 1995-04-01
Publication date: 1996-06-13
Anticipated expiration: 2015-04-02
Also published as: WO1996031535A1; AU4438896A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Reinigung von Filamenthämagglutinin (FHA) und Pertussis-Toxin (PT) aus einem Bordetella pertussis (B. pertussis) Kulturfiltrat mittels Affinitäts- und Gelchromatographie.

Der Erreger des Keuchhustens, B. pertussis, ist ein kleines, stäbchenförmiges, bekapseltes gram-negatives Bakterium, das keine Sporen bildet, unter aeroben Bedingungen kultiviert werden kann und im Vergleich zu anderen bakteriellen Krankheitserregern eine Vielzahl mehr oder minder gut charakterisierter Virulenz faktoren bildet. Dazu gehören die äußeren Membranproteine (OMP), Lipopolysac charide (LPS), Agglutinogene (AGG), Filamenthämagglutinin (FHA), Pertactin, ein 69 kD großer Strukturbaustein von B. Pertussis, Pertussis-Toxin (PT), Adenylylcy clase-Toxin (ACT), Trachea-Gytotoxin (TCT) und ein hitzelabiles Toxin (HLT). Zu dem wurde gefunden, daß aus Kulturüberständen von B. pertussis isoliertes FHA heterogen ist (Irons L. J. (1983) J. Gen. Microbiol. 129, 2769-2778).

FHA wird von den Bakterien sezerniert und dient als Adhäsionsfaktor zur Anhef tung der Bakterien an die Wirtszellen während der Infektion. FHA ist im allgemeinen ein 3261 Aminosäuren langes und ca. 332 kD schweres Protein. PT, ein wesentlicher Virulenzfaktor, besitzt eine ADP-Ribosyltransferase-Aktivität, ist im allgemeinen 1007 Aminosäuren lang und ein ca. 110 kD schweres Protein. Es ist nun auch bekannt, daß FHA und PT allein oder in Kombination mit o.g. Virulenzfaktoren von B. pertussis gegen Keuchhusten einen ausreichenden Schutz gewährleisten.

Zur Immunisierung gegen B. pertussis gibt es verschiedene Impfstoffe. Zum einen werden ganze, abgetötete B. pertussis Organismen verwendet und zum anderen Vakzine aus Kulturüberständen, sogenannte azelluläre Pertussis-Impfstoffe. Diese Impfstoffe zeichnen sich insbesondere durch eine gute Verträglichkeit aus.

Es gibt nun verschiedene Verfahren, die Antigene FHA und PT aus Kulturüber ständen von B. pertussis zu isolieren. Viele Methoden besitzen als einen Reinigungsschritt eine Affinitätschromatographie mit dem Protein Fetuin als Affinitätsligand, an den PT bindet (z. B. Skelton, S. K. & Wong, K. H. (1990) J. Clin. Microbiol., 1062-1065; Sekura, R. D. et al. (1983) J. Biol. Chem. 258, 14647-14651, No. 23). Ein wesentlicher Nachteil dieser Chromatographie ist jedoch, daß durch das "Bluten" der Säule die Vakzine mit einem Fremdprotein, nämlich Fetuin, verunreinigt wird, das eine unerwünschte allergische Reaktion nach der Impfung auslösen kann. Andere Verfahren enthalten mehrere Chromatographieschritte, z. B. Chromatographie an Hydroxylapatit, gefolgt von Chromatographie an Butyl-TSK, Trisacryl Blue und Sephacryl S-200® HR (EP-A1-0 427 462), welche die produktionsmäßige Herstellung der Vakzine verteuern. Im Gegensatz hierzu erzielt man mit Verfahren mit wenigen Chromatographieschritten, z. B. gemäß dem Verfahren von Arai, H. et al. (1979), Infect. Immun. 25, 460-462, nur geringe Ausbeuten an FHA, welches zudem mit ungewünschtem B. pertussis Endotoxin verunreinigt ist (siehe EP-B1-0 159 003, Seite 3, Zeilen 29-32). Im allgemeinen führen Reinigungsverfahren mit nur einem Chromatographieschritt zu keiner ausreichenden Auftrennung der einzelnen Virulenzfaktoren (siehe z. B. Dias, W. O. et al. (1994) Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 27 (11) 2607-2611).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein wirtschaftliches Verfahren zu finden, das FHA und PT in guten Ausbeuten und ohne wesentliche Verunreinigung mit anderen B. pertussis Antigenen oder Fremdproteinen, wie z. B. Fetuin, gewinnen läßt.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren, bei dem FHA und/oder PT aus einer B. pertussis Fermentationsbrühe oder zellfreiem Kulturüberstand mittels (a) einer Farbstoffaffinitätschromatographie, insbesondere einer Triazinfarbstoffaffini tätschromatographie, vor allem eine mit blauem Farbstoff, z. B. Cibacron Blue der Formel

oder Blue Trisacryl Plus der Formel

vor allem Blue Sepharose®, insbesondere Blue Sepharose 6 Fast Flow® (Pharmacia, Uppsala, Schweden) oder Blue Hyper D® (BioSepra GmbH, Frankfurt, Deutschland) oder funktionelle Äquivalente davon; und (b) einer Gelfiltration. Für die Gelfilftation kann jedes Gelmaterial, vorzugsweise Sephacryl® oder Superdex ® (Pharmacia, Uppsala Schweden) insbesondere Sephacryl S 200® Superdex 75 ® oder Superdex 200pg® verwendet werden. Als funktionelle Äquivalente sind vorzugsweise solche zu verstehen, die eine funktionelle und/oder strukturelle Ähnlichkeit mit Nukleotiden, insbesondere Adenin oder NAD, besitzen, da PT eine ADP-Ribosyltransferase-Aktivität besitzt und folglich derartige Nukleotide binden kann.

Die Fraktionierung von FHA und/oder PT an der Farbstoffaffinitätschromatographie erfolgt vorzugsweise mit zweiwertigen Kationen, insbesondere Mg²⁺. Als Puffer eignet sich z. B. Tris-Puffer mit einem pH-Wert von ungefähr 7-8, insbesondere ungefähr 7. Die Fraktionierung von FHA und/oder PT mittels Gelfiltration erfolgt ebenso vorzugsweise mit zweiwertigen Kationen, insbesondere Mg²⁺. Als Puffer eignet sich hier z. B. Acetatpuffer mit einem pH-Wert von ungefähr 3-5, insbeson dere 4-4,5.

Es ist auch vorteilhaft, wenn die Fermentationsbrühe bzw. der zellfreie Kulturüber stand vor der weiteren Reinigung konzentriert wird, beispielsweise durch Ultrakon zentration über Membranfilter.

Die Fermentation von B. pertussis erfolgt nach dem Fachmann bekannten Verfahren, z. B. gemäß einem Verfahren von Andorn, N. et al. (1988) Appl. Micro biol Biotechnol. 28, 356-360. Es eignen sich jedoch auch andere in der einschlä gigen Literatur beschriebene Verfahren.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigte FHA und PT kann in einem Verfahren zur Herstellung einer Vakzine-Zusammensetzung enthaltend FHA und/oder PT und gegebenenfalls ein Adjuvants verwendet werden. Hierzu ist es notwendig, daß insbesondere PT detoxifiziert wird. Als Detoxifizierungsagentien eignen sich vorzugsweise chemische Mittel, insbesondere Formalin, Glutaraldehyd, Hydrogenperoxid oder Tetranitromethan. Zur Detoxifizierung eignen sich Verfahren wie z. B. in WO 87/07507, WO 91/12020, EP-B1-0 047 802; EP-B1-0 269 729 oder EP-A1-0 377 114 beschrieben. Als Adjuvans eignen sich beispielsweise Adjuvantien wie in WO 90/14837 beschrieben.

Desweiteren kann das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigte FHA und PT in einem Verfahren zur Herstellung einer Multikomponenten-Vakzine, welche FHA und/oder PT und/oder weitere Antigene, z. B. die oben beschriebenen B. pertussis Virulenzfaktoren und/oder Diphtherie-, Tetanus-, Hepatitis-B-Antigene u. a. enthält (siehe z. B. WO 94/03206, EP-A1-0 267 998, EP-A2-0 462 534), verwendet werden. Hierzu werden die weiteren Antigene zu dem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigten FHA und/oder PT gegebenenfalls unter Zugabe eines geeigneten Adjuvants hinzugegeben. Eine besonders bevorzugte Vakzinekombination enthält Diphtherie-, Tetanus- und Pertussisantigene.

Die Eingangsdosis ist hierbei vorzugsweise 3-10 Lf, die bis zu 2mal nach jeweils 1 bis 2 Monaten und einmal nach 5 bis 10 Jahren wiederholt wird. Ein Lf. (limes floculationis; Flockungseinheit) entspricht der Antigenmenge, die durch eine internationale Antitoxineinheit gebunden wird. Dies ist im in vitro Test als Ausflockung zu erkennen. Die Applikation kann beispielsweise oral oder nasal gemäß EP-A-0 544612 oder parenteral (siehe z. B. WO 88/03809) erfolgen.

Beispiele 1. Fermentation

Eine Kultur von B. pertussis Stamm 165 (Sekura, R. D. et al. (1983) J. Biol. Chem. 258, 14647-1 4651, No. 23) wurde in modifiziertem Stainer-Scholte Medium gemäß Andorn, N. et al. (1988) Appl. Microbiol. Biotechnol. 28, 256-360 bei 35°C kultiviert. Am Ende der Kultivierung wurden die festen Kulturbestandteile mittels ei nes Separators abgetrennt und das Klärfiltrat mit Ultrakonzentrierungsmembranen konzentriert. Das Ultrafiltrat der Konzentrierung wurde verworfen. Anschließend wurde das Ultrakonzentrat über Membranfilter (0,65-0,45 µm) klar filtriert.

2. Reinigung 2.1. Affinitätschromatographie

Das auf pH 6,0 eingestellte Kulturfiltrat wurde auf die mit Natriumphosphatpuffer (0,25 mol/l) Natriumphosphat, pH 6,0) äquilibrierte Blue Sepharose 6FF® (Pharmacia, Uppsala Schweden) Affinitätssäule aufgetragen und FHA und PT zusammen in einer Fraktion mit Tris-Puffer (0,05 M Tris(hydroxymethyl)- aminomethan, 1,5 M Magnesiumchlorid, pH 7,0) eluiert.

2.2. Gelfiltration

Das Eluat der Affinitätssäule wurde auf die mit Natriumacetat-Puffer (0,01 mol/l Natriumacetat-3-hydrat, 0,05 mol/l Magnesiumchlorid-Hexahydrat, pH 4,0) äquilibrierte Superdex 200 pg® (Pharmacia, Uppsala Schweden) Gelfiltrationssäule aufgetragen und FHA und PT mit dem Natriumacetat-Puffer als getrennte Fraktionen eluiert. Die Reinheit der mit diesem Verfahren gewonnenen Antigene FHA und PT beträgt jeweils über 90%.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von Filamenthämagglutinin (FHA) und/oder Pertussistoxin (PT) aus einer B. pertussis Fermentationsbrühe oder zellfreiem Kulturüberstand, bestehend aus folgenden Schritten:

(a) Fraktionierung der genannten Fermentationsbrühe oder des zellfreien Kulturüberstandes mittels einer Farbstoffaffinitätschromatographie; und
(b) Fraktionierung des Eluates aus Schritt (a) mittels Gelfiltration.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Fer mentationsbrühe oder der zellfreie Kulturüberstand vor der ersten Fraktionie rung konzentriert wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Farbstoffaffinitätschromatographie eine Triazinfarbstoffaffinitätschro matographie verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß blauer Farbstoff bei der Farbstoffaffinitätschromatographie verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Cibacron Blue oder Blue Trisacryl Plus oder ein funktionelles Äquivalent davon verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Blue Sepharose 6FF® oder Blue-Hyper D® oder ein funktionelles Äquivalent davon verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Sephacryl® oder Superdex® bei der Gelfiltration verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß Sephacryl S 200, Superdex 75 oder Superdex 200 pg verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß FHA und/oder PT mit zweiwertigen Kationen eluiert wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Elutionspuffer der Farbstoffaffinitätschromatographie einen pH-Wert von ungefähr 7 bis 8 hat.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Elutionspuffer der Farbstoffaffinitätschromatographie einen pH-Wert von ungefähr 7 hat.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Elutionspuffer der Gelfiltration einen pH-Wert von ungefähr 3 bis 5 hat.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Elutionspuffer der Gelfiltration einen pH-Wert von ungefähr 4 bis 4,5 hat.