DE60105401T2

DE60105401T2 - Zusammensetzungen, enthaltend blocker des renalen zelltransfers von l-dopa zur behandlung der parkinson-krankheit

Info

Publication number: DE60105401T2
Application number: DE60105401T
Authority: DE
Inventors: Patricio. Soares-Da-Silva
Original assignee: Bial Portela and Cia SA
Current assignee: Bial Portela and Cia SA
Priority date: 2000-03-14
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2021-03-14
Also published as: EP1267853B1; ES2228858T3; SI1267853T1; DE60105401D1; JP2003526658A; ATE275397T1; CZ20023348A3; AU781280B2; JP3677002B2; CN1262269C; RU2266111C2; AU5828301A; MXPA02009043A; CN1429109A; PL359327A1; TR200402661T4; PT1267853E; KR20030095184A; HUP0300130A2; EP1267853A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die für die Behandlung der Parkinson Krankheit verwendbar sind. Insbesondere betrifft sie die Verwendung von Mitteln zum Blockieren des Abtransports von L-DOPA aus den Nierenzellen als Bestandteile der Zusammensetzungen.
Die Parkinson Krankheit (PK) ist eine chronische neurodegenerative Erkrankung unbekannter Ätiologie, die in einem hohen Maße dopaminerge Gehirnneuronen betrifft, die aus der Substantia Nigra stammen und auf das Striatum projektieren. Klinisch zeigen PK-Patienten eine allmähliche motorische Beeinträchtigung, die sich für gewöhnlich durch Zittern (Tremor), Steifheit (Rigor), und einen abnormalen Gang äußert. Personen, die an PK leiden, zeigen eine erhebliche motorische Verbesserung, wenn ihnen L-DOPA, der Vorläufer des Neurotransmitters Dopamin im Gehirn, zusammen mit Carbidopa oder Benserazid veräbreicht wird. Die letzteren Verbindungen sind wirkungsvolle Hemmer der peripheren aromatischen L-Aminosäuredecarboxylase (AADC), und ihre Verabreichung soll die Umwandlung von L-DOPA zu Dopamin in peripheren Geweben beseitigen, und damit das Auftreten von adversen Wirkungen im Bezug auf die Wirkung von Dopamin in peripheren Organen (kardiovaskulären und Magen-Darm-Organen) verhindern. Die Hemmung der peripheren AADC wird zudem von einer verbesserten Bioverfügbarkeit von L-DOPA begleitet, die in einer wirkungsvolleren Auffüllung der Dopaminlager in den nicht betroffenen dopaminergen Gehirnneuronen resultiert.
Die relative geringe Halbwertszeit von L-DOPA stellt jedoch eine Einschränkung bei der Erhaltungstherapie von PK-Patienten dar, da die Verabreichung von mehreren Dosen von L-Dopa notwendig ist. Aus diesem Grund wurden in letzter Zeit Formulierungen zur langsamen Freisetzung von L-DOPA verfügbar gemacht, um eine länger anhaltende motorische Verbesserung zu erzeugen und um die Anzahl der täglichen Verabreichungen zu reduzieren. Diese Vorgehensweise ist immer noch nur beschränkt erfolgreich, das das zirkulierende L-DOPA schnell in den Urin ausgeschieden wird, wobei diesem Weg der Eliminierung große Bedeutung zukommt. Obwohl das meiste L-DOPA, das im Urin auftaucht, seinen Ursprung in gefiltertem L-DOPA hat, weiß man von einer beachtlichen Menge an gefiltertem L-DOPA, die durch Natrium-abhängige und Natriumunabhängige Aminosäuretransporter entlang des Nephrons reabsorbiert wird. Auf dem Niveau der proximalen Tubuli kann das absorbierte L-DOPA leicht in Dopamin umgewandelt werden. Bei PK-Patienten, denen L-DOPA mit einem AADC-Hemmer verabreicht wurde, wird die Umwandlung von L-DOPA zu Dopamin in den proximalen Nierentubuli blockiert und es wird angenommen, dass das meiste des intrazellulären L-DOPA die Zelle durch die apikale Zellgrenze verlässt: dies ist ein durch einen Träger vermitteltes Transportsystem, dessen Hemmung zu einer erheblichen Akkumulation von L-DOPA im intrazellulären Kompartment führen kann.
Es wurde herausgefunden, dass dieses System zum tubulären Abtransport von L-DOPA aus der Niere gegenüber Cyclosporin A (Pestana, et al., 1995, Br. J. Pharmacol. 115, 1349–1358) empfindlich ist. Weitere Nachweise deuteten darauf hin, dass P-Glycoprotein an dem Abtransport von L-DOPA beteiligt ist (Soares-da-Silva, et al., 1998, Br. J. Pharmacol. 123, 13–22 ; Soares-da-Silva & Serrão, 2000, J. Pharmacol. Exp. Ther. 293, 697–704). Da ein größeres Problem bei der Behandlung von PK mit L-DOPA mit dessen kurzer Halbwertszeit und der verringerten biologischen Verfügbarkeit zusammenhängt (Cederbaum, 1989, Clin. Neuropharma-col. 12, 147–166 Koller & Tolosa, 1998, Neurology, 50 (suppl. 6), S1–S48), dachte man, dass die Hemmer des apikalen tubulären Abtransportes von L-DOPA aus der Niere (die deren Nierensekretion fördern) deren Ausscheidung in den Urin verringern und die biologische Verfügbarkeit verbessern könnten. Dies würde die Bewegung von L-DOPA aus dem tubulären Epithel in das Niereninterstitium und dann zurück in den Kreislauf begünstigen. Leider sind die meisten P-Glycoprotein-Hemmer, die sich zur Verbesserung der biologischen Verfügbarkeit von L-DOPA bei PK-Patienten als vorteilhaft herausstellen könnten, bekannte cytotoxische Mittel, oder, wenn sie nicht toxisch sind, sind die zur Herstellung einer Hemmung von P-Glycoprotein benötigten Konzentrationen unter in vivo-Bedingungen nicht realisierbar.
Aus diesem Grund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen für die Behandlung von PK zur Verfügung zu stellen, die Verbindungen umfassen, die in der Lage sind, die Nierenexkretion von L-DOPA zu verringern. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die zur-Verfügung-Stellung von wenigstens einer der oben genannten Verbindungen bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von PK durch sequenzielle oder simultane Verabreichung mit L-DOPA.
Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen für die Behandlung der Parkinson Krankheit, wie in den angehängten Ansprüchen beschrieben, zur Verfügung.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung von wenigstens einem Blocker des Abtransports von L-DOPA aus den Nierenzellen bei der Präparation eines Medikamentes für die Behandlung der Parkinson Krankheit oder für die Behandlung von Bewegungsstörungen durch sequentielle oder simultane Verabreichung mit L-DOPA zur Verfügung, wie in den anhängenden Ansprüchen beschrieben. Die Erfindung stellt zudem die Verwendung einer Zusammensetzung zur Verfügung, die wenigstens eine solche blockierende Verbindung in Kombination mit L-DOPA bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung der Parkinson Krankheit, wie in den anhängenden Ansprüchen beschrieben, umfasst.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung wenigstens einen Blocker des Abtransports von L-DOPA aus den Nierenzellen, in Kombination mit L-DOPA, zur Verwendung bei der Therapie wie in den anhängenden Ansprüchen beschrieben, zur Verfügung.
Gemäß eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung der Parkinson Krankheit zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung zur Hemmung des Abtransports von L-DOPA aus den Nierenzellen in sequentieller oder simultaner Kombination mit L-DOPA an eine Säugetierart, die eine derartige Behandlung benötigt, umfasst.
Zudem wird gemäß eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle der Bewegung eines an Parkinson leidenden Patienten zur Verfügung gestellt, bei dem eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung zur Blockierung des Abtransportes von L-DOPA aus den Nierenzellen verabreicht wird, um die Verfügbarkeit von sequentiell oder simultan verabreichtem L-DOPA für das Gehirn und die Bewegungskontrolle zu verbessern.
Die erfindungsgemäße blockierende Verbindung wird aus den in den anhängenden Ansprüchen 1 bis 6 beschriebenen Verbindungen ausgewählt.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung zudem ein Verfahren sowohl zur Erhöhung des zirkulierenden Spiegels des verabreichten L-DOPA bei einer Säugetierart, als auch zur Verbesserung der Verfügbarkeit von L-DOPA für das Gehirn zur Verfügung, wobei das Verfahren umfasst, dass dieser Säugetierart eine wirksame Menge wenigstens einer der blockierenden Verbindungen wie obenstehend beschrieben in sequentieller oder simultaner Kombination mit L-DOPA verabreicht wird.
Zusätzlich zur Hemmung des apikalen tubulären Abtransports von L-DOPA aus der Niere hemmen die hierin beschriebenen Hemmverbindungen gleichzeitig peripheres AADC. Diese Verbindungen erhöhen die zirkulierenden Spiegel des verabreichten L-DOPA im Plasma, hemmen AADC im äußeren Körperbereich („Peripherie") und verbessern die Verfügbarkeit des verabreichten L-DOPA für das Gehirn.
Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ferner die Verabreichung von bekannten AADC-Hemmern (wie zum Beispiel Benserazid oder Carbidopa) oder Catechol-o-methyltransferase (wie zum Beispiel Entacapon oder Tolcapon), entweder sequentiell oder simultan mit den anderen aktiven Verbindungen. Zusätzlich werden den aktiven Verbindungen inerte pharmazeutisch akzeptable Träger beigemischt. Die pharmazeutisch akzeptablen Träger können entweder fest oder flüssig sein. Präparationen in fester Form umfassen Pulver, Tabletten, dispergierbare Granulate und Kapseln. Ein Feststoffträger kann ein oder mehrere Stoff(e) sein, der/die auch als Verdünnungsmittel fungieren kann/können, als Aromastoffe, als Lösungsmittel, als Gleitmittel, als Suspensionsmittel, als Bindemittel oder als Tablettendisintegrationsmittel; er kann auch ein einkapselndes Material sein.
Bevorzugt liegt die pharmazeutische Präparation in Einheitsdosierungsform vor, zum Beispiel eine gekapselte Präparation, bei der das Paket separate Mengen der Präparation umfasst, wie zum Beispiel verpackte Tabletten, Kapseln und Pulvern in Fläschchen oder Ampullen.
Die Dosierungen können je nach den Bedürfnissen des Patienten, des Schweregrades der Krankheit und der jeweiligen verwendeten Verbindung abgewandelt werden. Die gesamte tägliche Dosis kann aus Bequemlichkeitsgründen aufgeteilt werden und über den Tag hinweg in Portionen verabreicht werden. Die geeignete Dosierung für die jeweilige Situation kann durch den Fachmann durchgeführt werden, liegt aber im Falle der oben genannten blockierenden Verbindungen bevorzugt im Bereich von etwa 40 μg bis etwa 30.000 μg/kg pro Behandlung.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden im Nachfolgenden anhand der Beispiele detailliert beschrieben, und dabei wird auf die beigefügten Figuren Bezug genommen, bei denen:
1 ein Graph ist, der die Wirkung der Testverbindungen auf die Akkumulation von L-DOPA in LLC-PK1-Zellen zeigt, die 6 Minuten lang bei 37°C mit 2,5 μM des Substrats (L-DOPA) inkubiert wurden.
2 ein Graphenpaar ist, das die Wirkung der Testverbindungen auf den apikalen Strom (2a) und die Zellakkumulation (2b) von L-DOPA in LLC-PK1-Zellen zeigt, die bei 37°C 6 Minuten lang mit 25 μM des Substrats (L-DOPA) inkubiert wurden, die aus der basolateralen Zellgrenze angewendet wurde.
3 ein Graph ist, der die Wirkung der Testverbindungen auf die Decarboxylierung von L-DOPA in LLC-PK1-Zellen darstellt, die bei 37°C für 6 Minuten mit 250 μM des Substrates (L-DOPA) inkubiert wurden.
4 ein Graph ist, der die Wirkung von steigenden Konzentrationen von Benserazid auf die Aktivität der aromatischen L-Aminosäurendecarboxylase (AADC) von Gehirn, Leber und Niere, gemessen unter V_max Bedingungen (5 mM L-DOPA ; 15 Minuten Inkubation), darstellt.
5 ein Graph ist, der die Wirkung von Resveratrol auf die Spiegel von L-DOPA im Plasma von Ratten, denen L-DOPA (12mg/kg) plus Benserazid (3 mg/kg) und Resveratrol verabreicht worden war, darstellt.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
IN VITRO-UNTERSUCHUNGEN
Zellen der Zellkultur LLC-PK₁, eine vom Schwein stammende proximate tubuläre Nierenepithelzellinie, die in Kultur einige Eigenschaften von proximalen tubulären Epithelzellinien beibehalten (Hull, R. N., et al., 1976, In Vitro 12, 670–677), wurden von der amerikanischen Kulturensammlung „American Type Culture Collection" (Rockville, MD) erhalten. LLC-PK₁-Zellen (ATCC CRL 1392; Absätze 198–206) und wurden in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂-95% Luft bei 37°C erhalten und im Medium 199 (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo, USA) gezüchtet und mit 100 U/ml Penicillin G, 0,25 μg/ml Amphotericin B, 100, μg/ml Streptomycin (Sigma), 3% fötalem Rinderserum (Sigma) und 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-Ethansulfonsäure (HEPES; Sigma) angereichert. Zur Abimpfung wurden die Zellen mit 0,05 Trypsin-EDTA dissoziiert, 1:4 aufgeteilt, und in Costar-Kolben mit 75- oder 162-cm² Wachstumsgebieten (Costar, Badhoevedorp, Niederlande) abgeimpft. Für die Aufnahmestudien wurden die Zellen in mit Kollagen behandelten 24-Well-Kulturclustern (innerer Durchmesser 16 mm, Costar) in einer Dichte von 40 000 Zellen pro Well oder auf Kollagen behandelten 0,2 μm Polycarbonatfilterträgern (innerer Durchmesser 12 mm Transwell, Costar) bei einer Dichte von 13.000 Zellen pro Well (2,0×10⁴ Zellen cm²) angesät. Das Zellmedium wurde alle 2 Tage gewechselt und die Zellen erreichten nach 3 bis 5 Tagen Inkubation eine Konfluenz. 24 Stunden vor jedem Experiment war das Zellmedium frei von fötalem Rinderserum. Im Allgemeinen wurden die Experimente 2–3 Tage nachdem die Zellen Konfluenz erreicht hatten durchgeführt, und 6–8 Tage nach dem ersten Ansähen umfasste jeder cm² etwa 80 μg Zellprotein.
TRANSPORTUNTERSUCHUNGEN BEI LLC-PK₁-ZELLEN
Am Tag des Experiments wurde das Wachstumsmedium aspiriert und die Zellen wurden mit einem Hanks-Medium gewaschen; danach wurden die Monoschichten der Zellen 15 bei 37°C Minuten lang in einem Hanks-Medium vorinkubiert. Das Hanks-Medium wies die folgende Zusammensetzung (mM) auf : NaCl 137, KCl 5, MgSO₄ 0,8, Na₂HPO₄ 0,33, KH₂PO₄ 0,44, CaCl₂ 0,25, MgCl₂ 1,0, Tris HCl 0,15 und Natriumbutyrat 1,0, pH-Wert=7,4. Das Inkubationsmedium umfasste auch Benserazid (1 μM) und Tolcapon (1 μM) um die Enzyme AADC bzw. Catechol-O-methyltransferase zu hemmen. Zeitverlaufsstudien wurden bei den Experimenten durchgeführt, bei denen die Zellen mit 0,5 μM Substrat für 1, 3, 6 und 12 Minuten inkubiert wurden. Sättigungsexperimente wurden in Zellen durchgeführt, die 6 Minuten mit zunehmenden Konzentrationen von L-DOPA (2,5 bis 250 μM) inkubiert wurden. Testsubstanzen wurden nur von der apikalen Seite aus angewendet und waren während der Vorinkubations- und Inkubationsphasen vorhanden. Während der Vorinkubation und Inkubation wurden die Zellen ständig geschüttelt und auf 37°C belassen. Eine apikale Aufnahme wurde durch das Hinzufügen von 2 ml Hanks-Medium mit einer vorgegebenen Konzentration des Substrats eingeleitet. Die Aufnahme wurde durch das schnelle Entfernen der Aufnahmelösung durch eine Vakuumpume, die mit einer Pasteurpipette verbunden war, beendet, gefolgt von einer schnellen Waschung mit kaltem Hanks-Medium und dem Hinzufügen von 250 μl an 0,2 mM Perchlorsäure. Vor der Injektion in einen Hochdruckflüssigkeitschromatographen für die Prüfung von L-DOPA wurden die angesäuerten Proben bei 4°C gelagert.
Vorausgehende Studien haben gezeigt, dass ein Teil des in den LLC-PK₁-Zellen akkumulierten L-DOPA die Zelle durch (einen) apikale(n) Transporteur e) nach Außen verlassen kann (Soares-da-Silva, et al., 1998, Am. J Physiol. 274, F243–F251). Die Hemmung dieses Vorgangs führt zu einem Anstieg der zellulären Akkumulation von L-DOPA (Soares-da-Silva, et al., 1998, Br. J. Pharmacol. 123, 13–22). Daher wurden bei Experimenten, die die Wirkung der Arzneimittel untersuchen sollten, die die intrazelluläre Akkumulation von L-DOPA erhöhten, die Zellen mit 25 μM L-DOPA, angewendet von der basalen Zellgrenze, inkubiert und die Aufnahme (Akkumulation in der Monoschicht der Zelle) und der Fluss (Transfer in die gegenüberliegende Kammer) wurden über einen Zeitraum von 6 Minuten gemessen. Testarzneimittel wurden nur von der apikalen Seite aus angewendet und waren während der Vorinkubations- und der Inkubationsphasen vorhanden. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen auf Eis angeordnet und das Medium, in dem die apikale Zellgrenze gebadet wurde, wurde gesammelt, mit Perchlorsäure angesäuert, und bei 4°C gelagert, bis es auf L-DOPA analysiert wurde. Die Zellen wurden mit eiskaltem Hanks-Medium gewaschen und es wurde 0,2 mM Perchlorsäure (100 μl und 500 μl in den oberen bzw. unteren Kammern) hinzugefügt; die angesäuerten Proben wurden bei 4°C gelagert, bevor sie für die Analyse auf L-DOPA in den Hochdruckflüssigkeitschromatographen injiziert wurden.
DECARBOXLIERUNGSSTUDIEN
Am Tag des Experiments wurde das Wachstumsmedium aspiriert und die Zellen (LLC-PK₁) wurden mit Hanks-Medium gewaschen; danach wurden die Zellmonoschichten bei 37°C 15 Minuten lang in einem Hanks-Medium vorinkubiert. Das Hanks-Medium wies die folgende Zusammensetzung (mM) auf : NaCl 137, KCl 5, MgSO₄ 0,8, Na₂HPO₄ 0,33, KH₂PO₄ 0,44, CaCl₂ 0,25, MgCl₂ 1,0, Tris HCl 0,15 und Natriumbutyrat 1,0, pH-Wert=7,4. Das Inkubationsmedium enthielt zudem Pyridoxalphosphat (120 μM), Tolcapon (1 μM) und Pargylin (100 μM). Sättigungsexperimente wurden in Zellen durchgeführt, die 6 Minuten lang mit steigenden Konzentrationen von L-DOPA (2,5 bis 250 μM) inkubiert wurden. Bei Experimenten zum Studium der Wirkungen der Testverbindungen auf die Decarboxylierung von L-DOPA, wurden Zellen in Gegenwart der zu testenden Verbindungen 30 Minuten lang vorinkubiert. Nach der Vorinkubation wurden die Zellen 6 Minuten in einem Hanks-Medium mit 250 μM L-DOPA inkubiert. Die Umsetzung wurde durch das Hinzufügen von 250 μl 0,2 mM Perchlorsäure beendet. Die angesäuerten Proben wurden vor der Injizierung in einen Hochdruckflüssigkeitschromatographen für die Analyse auf Dopamin bei 4°C gelagert.
VITALITÄTSTEST DER ZELLEN
Auf Plastikträgern kultivierte Zellen wurden 15 Minuten lang bei 37°C vorinkubiert und dann in Abwesenheit oder in Gegenwart von L-DOPA und Testverbindungen weitere 6 Minuten lang inkubiert.
Danach wurden die Zellen bei 37°C 2 Minuten lang mit Trypanblau (0,2% w/v) in einem Phosphatpuffer inkubiert. Die Inkubation wurde beendet, indem die Zellen zweimal mit Hanks-Medium gespült wurden, und die Zellen wurden unter Verwendung eines Leica-Mikroskops untersucht. Unter diesen Umständen schlossen mehr als 95% der Zellen den Farbstoff aus.
IN VIVO-STUDIEN
Diese Experimente wurden entwickelt, um die Wirkung der Testverbindungen auf die biologische Verfügbarkeit von L-DOPA und auf den Zugang von L-DOPA zum Gehirn zu bewerten. In allen Experimenten wurden männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 170–280 g, von denen jeweils zwei in einem Käfig unter kontrollierten Umweltbedingungen gehalten wurden (Hell-Dunkel-Zyklus 12 Stunden und Raumtemperatur 24°C) verwendet. Die Ratten wurden in vorher bestimmten Intervallen durch Enthauptung getötet und ihre Gehirne, Leber und Nieren wurden entfernt und zur Bestimmung von L-DOPA, Dopamin und DOPAC verwendet.
ANALYSE VON AADC IM RATTENGEWEBE
In einigen Experimenten wurde die AADC Aktivität in Gehirn, Leber und Niere unter Vmax-Bedingungen (5 mM L-DOPA; Inkubation 15 Minuten) wie obenstehend beschrieben (Soares-da-Silva, et al., 1994, Br. J. Pharmacol. 112, 611–615) bestimmt. Die Umsetzung wurde durch das Hinzufügen von 500 μl 2M Perchlorsäure beendet, und die Präparationen wurden 60 Minuten lang auf 4°C behalten. Die Proben wurden danach zentrifugiert (200 g, 2 Minuten, 4°C) und 500 μl Aliquots des auf den Spin-X-Filter-Röhrchen (Costar) gefilterten Überstandes wurden für die Analyse von Dopamin verwendet.
ANALYSE VON L-DOPA, DOPAMIN UND AMINMETABOLITEN
L-DOPA, Dopamin und Aminmetabolite (DOPAC und HVA) wurden unter Verwendung eines Hochdruckflüssigkeitschromatographen mit elekrochemischer Detektion quantifiziert, wie obenstehend berichtet (Soares-da-Silva und Garrett, 1990, Neuropharmacol. 29, 869–874; Soares-da-Silva, et al., 1998, Am. J. Physiol. 274, F243–F251). Das Hochdruckflüssigkeitschromatographensystem bestand aus einer Pumpe (Gilson Modell 302 ; Gilson Medical Electronics, Villiers le Bel, Frankreich), die mit einem manometrischen Modul (Gilson Modell 802C) und einer Edelstahl-5 μm-ODS-Säule (Biophase; Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN) mit einer Länge von 25 cm verbunden war; die Proben wurden mittels eines automatischen Probeninjektors (Gilson Modell 231), der mit einem Gilson-Verdünner verbunden ist (Model 401), eingespritzt. Die mobile Phase war eine entgaste Lösung aus Zitronensäure (0,1 mM), Natriumoctylsulphat (0,5 mM), Natriumacetat (0,1 M), EDTR (0,17 mM), Dibutylamin (1 mM) und Methanol (8% v/v), die mit Perchlorsäure (2 M) auf den pH-Wert 3,5 angepasst, und auf eine Geschwindigkeit von 1,0 ml/min^–1 gepumpt wurde. Die Detektion wurde elektrochemisch mit einer gläsernen Kohlenstoffelektrode, einer Ag/AgCl Referenzelektrode und einem amperometrischen Detektor (Gilson Modell 141) durchgeführt; die Detektorzelle wurde bei 0,75 V betrieben. Der erzeugte Strom wurde unter Verwendung der Gilson 712 HPLC Software überwacht. Die niedrigeren Grenzen für die Detektion von L-DOPA, Dopamin, DOPAC, 3-MT und HVA lagen im Bereich von 350 bis 500 fmol.
DATENANALYSE
K_m- und V_max-Werte für die Aufnahme von L-DOPA, wie in Sättigungsexperimenten bestimmt, wurden aus nichtlinearer Regressionsanalyse unter Verwendung des Software-Pakets „GraphPad Prism statistics software package" (Motulsky, P. Spannard, R. Neubig. GraphPad Prism (Version 1.0) San Diego, USA: GraphPad Prism Software Inc., 1994) berechnet.
Der apikale fraktionelle Ausfluss wurde unter Verwendung der Formel L-DOPA^{Apikalflüssigkeit}/ (L-DOPA^{Apikalflüssigkeit}+L-DOPA^Zelle) berechnet, wobei L-DOPA^{Apikalflüssigkeit} die Menge von L-DOPA (in nmol/mg Protein) angibt, die die apikale Kammer erreichte und L-DOPA^Zelle (in nmol/mg Protein) die Menge an L-DOPA angibt, die in der Zellmonoschicht akkumuliert war. Mit S.E.M. stehen arithmetische Mittel zur Verfügung. Die statistische Analyse wurde durch One-Way-Analyse der Abweichung (ANOVA) durchgeführt, gefolgt von einem Newman-Keuls-Test für multiple Vergleiche.
Es wurde angenommen, dass ein pH-Wert von weniger als 0,05 einen signifikanten Unterschied bedeutet.
ERGEBNISSE
Die Akkumulation einer nicht sättigenden Konzentration (0,5 μM) an L-DOPA bei Zeitverlauf-Experimenten, stieg linear mit der Zeit für einige Minuten an. Nach einer Inkubation von 6 Minuten, wenn die Aufnahme hinsichtlich der Zeit linear war, und intrazelluläres Wasser als 7,0±0,7 μl/mg Protein angesehen wurde (Soares-da-Silva, et al., 1998, Am. J. Physiol. 274, F243-F251), betrug die intrazelluläre L-DOPA Konzentration bei einer Mediumkonzentration von 0,5 μM 4,0±0,4 μM. Dies stellte eine Zellkonzentration von L-DOPA dar, die 8,0±0,8 mal höher war als die entsprechende Mediumkonzentration: Bei den Experimenten zur Bestimmung der kinetischen Parameter des apikalen Transporters von L-DOPA wurden die Zellen 6 Minuten lang mit steigenden Konzentrationen (1 bis 250 μM) des Substrats inkubiert. Die nicht-lineare Analyse der Sättigungskurve für L-DOPA ergab einen K_m-Wert (in μM) von 47±8 und einen V_max-Wert (in pmol mg Protein/6 Minuten) von 3069±224.
Zur Bewertung der metabolischen Anforderungen für die Aufnahme von L-DOPA wurden die Zellen bei 4°C inkubiert. Die Wirkung einer Verringerung der Temperatur von 37 auf 4°C während der Vorinkubation und der Inkubation stellte eine merkliche Abnahme (Verringerung 77±2%) bei der L-DOPA Akkumulation (2,5 μM) dar.
Eine Verringerung des extrazellulären Natriums (von 140 mM auf 70,35 und 0 mM) hatte keine Auswirkung auf die Akkumulation von L-DOPA. Überdies waren in Abwesenheit des extrazellulären Natriums (ersetzt durch eine equimolare Konzentration von Cholin), die K_m- und V_max-Werte für L-DOPA denen, die in der Gegenwart von Natrium beobachtet wurden, ähnlich. N-(Methylamino)isobuttersäure (MeAIB) konnte die Aufnahme von L-DOPA nicht beinflussen, wohingegen 2-Aminobicyclo(2,2,1)heptan-2-carboxylsäure (BHC) eine konzentrationsabhängige Hemmung der L-DOPA-Aufnahme (IC₅₀=407 μM) erzeugte. Die inhibitorische Wirkung von 1 mM BHC auf die Akkumulation von L-DOPA war von konkurrenzbetonter Art, wie durch den Anstieg der K_m- (130±19 μM) aber nicht V_max- (3783±244 pmol/mg Protein/6 Minuten) Werte für die L-DOPA-Aufnahme belegt wurde. Zusammengefasst legen diese Ergebnisse nahe, dass der apikale Transfer von L-DOPA nach innen durch den BHC-sensitiven und Natrium-unabhängigen Aminosäurentransporter vom L-Typ gefördert werden kann (Audus and Borchardt, 1986, J. Neurochem. 47, 484–488).
Es wurde herausgefunden, dass die Hemmer des Abtransportes von L-DOPA aus den Nierenzellen die Akkumulation von L-DOPA (2,5 μM) in einer von der Konzentration abhängigen Art und Weise mit EC₅₀-ern von 6 bis 339 μM (1) erhöhen. Es wurde herausgefunden, dass die Vorbehandlung der Zellen mit den Testverbindungen die Maximalakkumulation (V_max) der steigenden Konzentrationen von L-DOPA deutlich erhöhen (P<0,05), ohne dass dabei die K_m-Werte deutlich verändert werden.
Um darzustellen, dass eine erhöhte Akkumulation von L-DOPA, die durch die Testverbindungen hervorgerufen worden war, auf einen verringerten Abtransport von intrazellulärem (kürzlich akkumulierten) L-DOPA zurückzuführen war, wurden in Polcarbonatfiltern kultivierte Zellen mit L-DOPA (25 μM) von der Basalzellgrenze angewendet, und der Basal-Apikal-Flux von L-DOPA wurde gemessen. Wie in 2 dargestellt, verringerten die Testverbindungen den Basal-Apikal-Flux von L-DOPA und erhöhten die Akkumulierung von L-DOPA in der Zelle, wobei sie Ihre Wirkung als Blocker des Abtransportes von L-DOPA aus den Nierenzellen deutlich zeigten.
Die nächste Experimentenreihe hatte das Ziel, die inhibitorische Stärke der Testverbindungen auf AADC zu bewerten. Zu diesem Zweck wurden LLC-PK₁-Zellen 30 Minuten lang mit steigenden Konzentrationen der Testverbindungen oder Benserzarid vorinkubiert; danach wurden die Zellen mit einer Konzentration von L-DOPA inkubiert, die der Sättigung nahe kam (250 μM). Wie in 3 gezeigt, wurde herausgefunden, dass die Testverbindung die AADC-Aktivität in einer von der Konzentration abhängigen Art und Weise hemmen, wie durch die Umwandlung von L-DOPA zu Dopamin gemessen wurde. Die IC₅₀'s reichten von 0,07 μM (für Benserazid) bis 393 μM (für die weniger starken).
In in vivo-Experimenten wurde Ratten die Restverbindung 30 Minuten vor der Verabreichung von L-DOPA oder L-DOPA und Benserazid oral verabreicht. Da hohe Dosen von Benserazid in der Hemmung von AADC im Gehirn (Da Prada, et al., 1987, Eur. Neurol. 27, 9–20) resultieren können, wurden vorbereitende Experimente durchgeführt, um die Dosis an Benserazid zu bestimmen, die die AADC-Aktivität im Gehirn nicht beeinflusste.
Wie in 4 gezeigt, betrug die Dosis an Benserazid, die die maximale Hemmung des AADC von Leber und Niere erzeugte, ohne Wirkung auf das AADC im Gehirn, 3 mg/kg Benserazid, dies ist völlig konform mit den Daten von anderen (Da Prada, et al., 1987, Eur. Neurol. 27, 9–20). Zur Anpassung an das für gewöhnlich bei Menschen verwendete Verhältnis von L-DOPA/Benserazid (Verhältnis 4:1) wurde die verwendete L-DOPA-Dosis auf 12 mg/kg festgelegt.
Als nicht anästhesierten Ratten Resveratrol 30 Minuten vor der Verabreichung von L-DOPA (12mg/kg) plus Benserazid (3 mg/kg) oral verabreicht wurde, war das Ergebnis ein deutlicher Anstieg der L-DOPA-Werte im Gewebe, ebenso wie der Dopamin- und Aminmetaboliten im Gehirn (Tabelle 1). Der Anstieg der Plasmaniveaus von L-DOPA (5) und der Anstieg der Gewebewerte von L-DOPA und Dopamin in der Niere (Tabelle 1) begleitete diese Effekte. Es ist möglich, dass die AADC hemmende Wirkung von Resveratrol nicht groß dazu beitrug, die Verfügbarkeit von L-DOPA zu verbessern. Erstens waren bei Rattert, denen das Testresveratrol verabreicht wurde, der Dopaminspiegel in der Niere größer als bei den entsprechenden Kontrolltieren (Ratten, denen L-DOPA mit Benserazid verabreicht worden war). Zweitens war die hemmende Wirkung von 30 mg/kg Resveratrol auf die AADC-Aktivität von Leber und Niere (Leber 48% Reduktion; Niere 38% Reduktion) signifikant geringer als diejenige, die für Benserazid beobachtet wurde (4).
Alles in Allem zeigen die obenstehend genannten Daten, dass die Blocker des Abtransportes von L-DOPA aus den Nierenzellen höhere L-DOPA-Niveaus im Plasma zur Folge haben und dessen Verfügbarkeit für das Gehirn verbessern.
Tabelle 1. Niveau (in ng/g) von L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA), Dopamin (DA), 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC) und Homovanillinsäure (HVR) in Gehirn und Niere nach der Verabreichung des Vehikels (0,5% Carboxymethylcellulose, 4 ml/kg), L-DOPA (L, 12 mg/kg), L-DOPA (L, 12mg/kg) mit Benserazid (B, 3 mg/kg) und Resveratrol (R) mit L-DOPA (L ; 12 mg/kg) mit Benserazid (B, 3 mg/kg). Resveratrol wurde 30 Minuten vor dem L-DOPA+Benserazid verabreicht, und die Ratten wurden 60 Minuten nach der Verabreichung von L-DOPA+Benserazid getötet.
Signifikant unterschiedlich von den entsprechenden Werten bei Ratten, die mit L-DOPA (L, 12 mg/kg) mit Benzerazid (B, 3 mg/kg) (*P<0,05) behandelt wurden.

Claims

Eine Zusammensetzung für die Behandlung der Parkinson Krankheit, wobei die Zusammensetzung, in Verbindung mit L-DOPA, wenigstens eine Verbindung umfasst, ausgewählt aus Derivaten von Phenylbenzopyran, trans-Stilben-Derivaten oder 3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-1-propanon (Phloretin) zum Hemmen des Transports von L-DOPA aus den Nierenzellen, was die Verfügbarkeit von L-DOPA für das Gehirn verbessert.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, bei der das Phenylbenzopyranderivat eine Flavonoidverbindung umfasst.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, bei der die Flavonoidverbindung die allgemeine Formel aufweist:
bei der die X Gruppen gleich oder unterschiedlich sind und ausgewählt werden aus H und OH, die Y Gruppen gleich oder unterschiedlich sind und ausgewählt werden aus H und OR, wobei R H, CH₃ und CH₂-Ph darstellt, einschließlich der entsprechenden 3-C₆H₅ (Y₄) Derivate.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, bei der das trans-Stilben-Derivat die allgemeine Formel aufweist:
bei der die X Gruppen gleich oder unterschiedlich sind und H oder OH sind.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, bei der die hemmende Verbindung ausgewählt wird aus: 5,7-Dihydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-on (Acazetin), 5,7-Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-on (Apigenin), 5,6,7-Trihydroxy-2-phenyl-4H-1-benzopyran-4-on (Baicalein), 5,7-Dihydroxy-2-phenyl-4H-1-benzopyran-4-on (Chrysin), ([2R,3R])-2-[3,4-Dihydroxyphenyl]-3,4-dihydro-1[2H]benzopyran-3,5,7-triol((-)-Epicatechin), 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,7-dihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on (Fisetin), 5,7-Dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-on (Genistein), 3,5,7-Trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-on (Kämpferol), 2-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on (Morin), 3,5,7-Trihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-on (Myricetin), 3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-1-propanon (Phloretin), 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on (Quercetin), 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5,6,7-tetrahydroxy-4H-1-benzopyran-4-on (Quercetagetin), 4'-Benzyloxy-3',5'-dimethoxy-3,5,7-trihydroxyflavon, 3,7-Dihydroxy-3',4',5'-trimethoxyflavon, 3',4',7,8-tetrahydroxyflavon, 3,5,7-Trihydroxy-3',4',5'-trimethoxyflavon, 3,3',4,5'-Tetrahydroxy-trans-Stilben (Piceatannol), trans-4-Styrylphenol, und 3,4',5-Trihydroxy-trans-Stilben (Resveratrol).
Eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1, 4 oder 5, bei der die hemmende Verbindung Resveratrol ist.
Eine Zusammensetzung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, die des Weiteren einen Inhibitor des Enzyms Aminosäuredecarboxylase und/oder einen Inhibitor des Enzyms Catechol-O-Methyltransferase umfasst.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, bei der der Aminosäuredecarboxylaseinhibitor Benserazid oder Carbidopa umfasst und der Catechol-O-Methyltransferaseinhibitor Entacapon oder Tolcapon umfasst.
Eine Zusammensetzung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung ferner inerte, pharmazeutisch akzeptable Arzneimittelträger umfasst.
Die Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung der Parkinson Krankheit, oder zur Verhinderung der Verschlimmerung von jeglicher Form der Parkinson Krankheit.
Wenigstens ein Hemmer des Transports von L-DOPA aus den Nierenzellen, ausgewählt aus Phenylbenzopyranderivaten, trans-Stilben-Derivaten, oder 3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-1-propanon (Phloretin), in Verbindung mit L-DOPA, zur therapeutischen Verwendung, entweder durch Verabreichung in einer Abfolge oder durch gleichzeitige Verabreichung.
Wenigstens eine hemmende Verbindung gemäß Anspruch 11, wobei die wenigstens eine hemmende Verbindung aus denjenigen, die in einem der Ansprüche 2 bis 6 beschrieben sind, ausgewählt ist.
Die Verwendung von wenigstens einem Hemmer des Transports von L-DOPA aus den Nierenzellen, ausgewählt aus Phenylbenzopyranderivaten, trans-Stilben-Derivaten oder 3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-1-propanon (Phloretin) bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder zur Verhinderung der Verschlimmerung von jeglicher Form der Parkinson Krankheit durch Verabreichung in einer Abfolge oder durch gleichzeitige Verabreichung mit L-DOPA.
Die Verwendung von wenigstens einem Hemmer des Transports von L-DOPA aus den Nierenzellen, ausgewählt aus Phenylbenzopyranderivaten, trans-Stilben-Derivaten oder 3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-1-propanon (Phloretin) bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Bewegungsstörungen durch die Modifikation der dopaminergen netto Aktivität des nigrostriatalen Reaktionsweges und durch Verabreichung in einer Abfolge oder durch gleichzeitige Verabreichung mit L-DOPA.
Die Verwendung von wenigstens einer hemmenden Verbindung für den Transport von L-DOPA aus den Nierenzellen, ausgewählt von Phenylbenzopyranderivaten, trans-Stilben-Derivaten oder 3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-1-propanon (Phloretin) bei der Herstellung eines Medikamentes zur Steigerung der Zirkulationsniveaus des verabreichten L-DOPA in einem Subjekt.
Die Verwendung von wenigstens einer hemmenden Verbindung für den Transport von L-DOPA aus den Nierenzellen, ausgewählt aus Phenylbenzopyranderivaten, trans-Stilben-Derivaten oder 3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-1-propanon (Phloretin) bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verbesserung der Verfügbarkeit des verabreichten L-DOPA für das Gehirn eines Subjektes.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei die wenigstens eine hemmende Verbindung aus denjenigen, die in den Ansprüchen 2 bis 6 beschrieben sind, ausgewählt wird.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei die hemmende Verbindung in einer Menge vorliegt, die ca. 40 bis ca. 30,000μg/kg pro Dosis zur Verfügung stellt.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei die Behandlung ebenfalls die Verabreichung in einer Abfolge oder die gleichzeitige Verabreichung eines Inhibitors einer Aminosäuredecarboxylase oder eines Inhibitors der Catechol-O-Methyltransferase umfasst.
Die Verwendung gemäß Anspruch 19, wobei der Decarboxylaseinhibitor Benserazid oder Carbidopa umfasst und der Methyltransferaseinhibitor Entacapon oder Tolcapon umfasst.
Die Verwendung von wenigstens einer hemmenden Verbindung ausgewählt aus denjenigen, die in den Ansprüchen 1 bis 6 beschrieben wurden, bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung der Parkinson Krankheit durch Hemmen der peripheren Decarboxylation des in einer Abfolge oder gleichzeitig verabreichten L-DOPA.