DE60103504T2

DE60103504T2 - Nasal verabreichbare cyclische antimykotische peptidzusammensetzungen

Info

Publication number: DE60103504T2
Application number: DE60103504T
Authority: DE
Inventors: Ikuo Yokohama-shi HORII; Kazuko Kamakura-shi KOBAYASHI; Nobuo Chigasaki-shi SHIMMA; Akira Yanagawa
Original assignee: Basilea Pharmaceutica AG
Current assignee: Basilea Pharmaceutica AG
Priority date: 2000-01-20
Filing date: 2001-01-09
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2021-01-10
Also published as: JP2003535042A; CN1406124A; WO2001052894A3; ZA200205240B; ES2220724T3; DK1251827T3; CA2396381A1; AR027244A1; US20010038824A1; KR20020070346A; EP1251827A2; BR0107764A; EP1251827B1; MXPA02007052A; ATE267582T1; DE60103504D1; AU3728001A; WO2001052894A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine nasal verabreichbare Zusammensetzung, welche ein antifungales cyclisches Peptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz von diesem enthält, welche eine verbesserte Absorbierbarkeit des cyclischen Peptids im Körper erzielt, wenn sie nasal verabreicht wird.
Es existieren viele physiologisch aktive cyclische Peptide, die natürlichen Ursprungs sind (z.B. antifungale cyclische Peptide wie z.B. Aureobasidine, Echinocandine, Pneumocandine und Aerothricine; immunsuppressive Mittel wie z.B. Cyclosporin A; Antibiotika wie z.B. Vancomycin und Daptomycin), wie auch cyclische Peptide, welche geplant und synthetisiert wurden, um einen Teil der Struktur von physiologisch aktiven Peptiden in Säugetieren nachzuahmen (z.B. die Wachstumshormonfreisetzung inhibierende Faktoren/Somatostatin-Analoga wie z.B. Lanreotid und Vapreotid; Vasopressinantagonisten (USP 5,095,003) und Fibrinogen-gpIIb/IIIa-Rezeptorantagonisten wie z.B. Eptifibatid). Obwohl diese physiologisch aktiven cyclischen Peptide ein signifikantes therapeutisches Potential haben, ist ihr klinischer Nutzen oft aufgrund ihrer schlechten oralen Bioverfügbarkeit eingeschränkt.
Beispielsweise zeigen antifungale cyclische Peptide wie z.B. Aerothricine (EP-Anmeldungen Nr. 98113744.1 und 99107637.3), Echinocandin-Analoga (LY303366: EP 0 736 541 ; FK463 und dessen Analoga: WO 98/723637, WO 99/740108) und Pneumocandin-Analoga (MK0991: WO 94/721677) eine in hohem Maße potente antifungale Aktivität, wenn diese intravenös verabreicht werden. FK463 und MK0991 werden derzeit im Hinblick auf die i.v.-Infusion klinisch getestet. Jedoch könnte ihr klinischer Nutzen insbesondere für ambulante Patienten aufgrund des Fehlens einer oralen Formulierung recht begrenzt sein. Diese antifungalen cyclischen Peptide können nämlich wegen der Zersetzung durch Proteasen, welche in dem Verdauungssystem existieren, und/oder ihrem recht hohen Molekulargewicht und ihrer Polarität nur in geringem Maße intakt von der Darmschleimhaut absorbiert werden.
Daher besteht ein dringender Bedarf, eine Methode zur Verabreichung physiologisch aktiver cyclischer Peptide über eine nicht-Injektionsroute, und noch bevorzugter Methoden, welche den Patienten ermöglichen, derartige physiologisch aktive cyclische Peptide selbst mit einer einfachen Verabreichungsmethode und mit geringer Häufigkeit sicher zu verabreichen, zu entwickeln. Die nasale Anwendung könnte eine alternative Verabreichungsroute zu einer oralen Verabreichung sein, wenn die Zustimmung des Patienten betrachtet wird.
Vor kurzem wurden einige nasal verabreichbare pulverförmige Präparate mit verbesserter Absorbierbarkeit vorgeschlagen. Sie werden hergestellt, indem physiologisch aktive lineare Polypeptidhormone wie z.B. Insulin und Calcitonin auf einem mehrwertigen Metall wie z.B. Hydroxylapatit oder Calciumcarbonat absorbiert werden ( EP 0 681 833 A2 ). Jedoch ist in diesen Fällen die erreichte Plasmakonzentration der physiologisch aktiven Peptide immer noch sehr gering (Picogramm bis Nanogramm/ml), und ihre Plasmahalbwertszeit ist kurz. Nichtsdestotrotz ist sie aufgrund ihrer hohen Wirksamkeit ausreichend, um die biologische Aktivität auszuüben.
Andererseits werden gewöhnlich zur Chemotherapie, z.B. zur Behandlung systemischer Pilzinfektionen, eine viel höhere Plasmakonzentration des bioaktiven Peptids und eine längere Halbwertszeit benötigt. Es wird berichtet, dass peptidische Verbindungen durch Peptidasen, die in der Nasenschleimhaut lokalisiert sind, metabolisiert werden können (A. Husain et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1985) 133, 923–928). Bis heute sind keine nasalen Formulierungen entwickelt worden, die eine derart hohe Plasmakonzentration von peptidischen Arzneimitteln zur chemotherapeutischen Behandlung erreichen. Die nasal verabreichbaren Präparate, die bisher vorgeschlagen wurden, sind aufgrund der schlechten Absorbierbarkeit des aktiven Bestandteils oder einer lokalen Reizung nicht zufrieden stellend, so dass sie bisher nicht kommerziell verfügbar sind.
Als ein Ergebnis intensiver Studien mit nasalen Formulierungen physiologisch aktiver Peptide haben die gegenwärtigen Erfinder eine nasal verabreichbare Zusammensetzung eines antifungalen cyclischen Peptids oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes von diesem, das höchstwahrscheinlich nicht oral verabreicht werden kann, mit einer höheren Bioverfügbarkeit und weniger Reizung als bei anderen nasal verabreichbaren Präparaten, die bisher für lineare Peptide vorgeschlagen wurden, gefunden und die vorliegende Erfindung vollendet.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine nasal verabreichbare Zusammensetzung, welche (i) ein antifungales cyclisches Peptid, (ii) einen physiologisch verträglichen pulverförmigen oder kristallinen Träger, welcher ein mehrwertiges Metall oder einen organischen Träger enthält, und (iii) einen Absorptionsverstärker umfasst, wobei eine physiologisch wirk same Menge des physiologisch aktiven cyclischen Peptids in dem physiologisch verträglichen pulverförmigen oder kristallinen mehrwertigen Metallträger oder dem organischen Träger homogen dispergiert ist und homogen daran adsorbiert ist, wobei dessen mittlere Partikelgröße in dem Bereich von 20 bis 500 μm liegt.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der obigen nasal verabreichbaren Zusammensetzungen zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krankheiten wie z.B. systemischen Pilz- und Bakterieninfektionen, Herz-Kreislauf-Störung, Akromegalie und Krebs oder zum Regulieren des Immunsystems durch intranasale Verabreichung.
Das physiologisch aktive cyclische Peptid, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, kann irgendein cyclisches Peptid mit antifungaler Aktivität sein. Einige Beispiele solcher physiologisch aktiven cyclischen Peptide werden später detaillierter beschrieben.
Das mehrwertige Metall, welches eine der Komponenten des physiologisch verträglichen pulverförmigen oder kristallinen Trägers ist, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, können Metallverbindungen sein, welche mehr als 2 Valenzen aufweisen und welche z.B. Aluminiumverbindungen, Calciumverbindungen, Magnesiumverbindungen, Siliciumverbindungen, Eisenverbindungen und Zinkverbindungen einschließen können. Solche Metallverbindungen werden gewöhnlich als Bindemittel, Stabilisatoren, Füllmittel, Desintegrationsmittel, Gleitmittel, Adsorptionsmittel und Beschichtungsmittel für medizinische Präparate verwendet.
Die Aluminiumverbindung, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, kann beispielsweise trockenes Aluminiumhydroxygel, Aluminiumhydroxychlorid, synthetisches Aluminiumsilicat, leichtes Aluminiumoxid, kolloidales Aluminiumsilicathydrat, Aluminiummagnesiumhydroxid, Aluminiumhydroxid, Aluminiumhydroxidgel, Aluminiumsulfat, Dihydroxyaluminiumaminoacetat, Aluminiumstearat, natürliches Aluminiumsilicat, Aluminiummonostearat und Kaliumaluminiumsulfat einschließen. Von diesen ist die bevorzugte Aluminiumverbindung Aluminiumhydroxid.
Die Calciumverbindung kann z.B. Apatit, Hydroxylapatit, Calciumcarbonat, Calciumdinatrium-EDTA, Calciumchlorid, Calciumcitrat, Calciumglycerophosphat, Calciumgluconat, Calciumsilicat, Calciumoxid, Calciumhydroxid, Calciumstearat, dreiwertiges Calciumphos phat, Calciumlactat, Calciumpantothenat, Calciumoleat, Calciumpalmitat, Calcium-D-pantothenat, Calciumalginat, Calciumphosphatanhydrid, Calciumhydrogenphosphat, primäres Calciumphosphat, Calciumacetat, Calciumsaccharat, Calciumsulfat, sekundäres Calciumphosphat, Calciumparaaminosalicylat und Biocalcilutitverbindungen einschließen. Biocalcilutitverbindungen wie z.B. kristallines Calciumpyrophosphat (Ca₂(P₂O₇) 2H₂O), sekundäres Calciumphosphat (CaHPO₄ 2H₂O), Octacalciumphosphat (Ca₈H₂(PO₄) 5H₂O), Tricalciumphosphat (Ca₃(PO₄)₂) und kristallines Calciumoxalat (CaC₂O₄ H₂O) sind analog zu Hydroxylapatit (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) und können ebenfalls als ein physiologisch verträglicher pulverförmiger oder kristalliner Träger der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bevorzugte Calciumverbindungen sind Hydroxylapatit, Calciumcarbonat oder Calciumlactat.
Weiterhin umfasst die Magnesiumverbindung, welche eine der Komponenten des physiologisch verträglichen pulverförmigen oder kristallinen Trägers ist, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, z.B. Magnesium-L-aspartat, Magnesiumchlorid, Magnesiumgluconat, Magnesiumaluminatsilicat, Magnesiumsilicat, Magnesiumoxid, Magnesiumhydroxid, Magnesiumstearat, Magnesiumcarbonat, Magnesiumaluminatmetasilicat, Magnesiumsulfat, Natriummagnesiumsilicat und synthetisches Natriummagnesiumsilicat. Von diesen ist die bevorzugte Magnesiumverbindung Magnesiumstearat.
Andere Metallverbindungen mit mehr als 2 Valenzen können Siliciumverbindungen wie z.B. Siliciumoxidhydrat, leichtes Kieselsäureanhydrid, synthetisches Hydrotalcit, Diatomeenerde und Siliciumdioxid; Eisenverbindungen wie z.B. Eisen(II)-sulfat; und Zinkverbindungen wie z.B. Zinkchlorid, Zinkstearat und Zinksulfat sein.
Die obigen Metallverbindungen können allein oder in einer Kombination aus zwei oder mehreren verwendet werden.
Vorzugsweise kann der physiologisch verträgliche pulverförmige oder kristalline Träger der vorliegenden Erfindung eine mittlere Partikelgröße in dem Bereich von 20 bis 250 μm, noch bevorzugter in dem Bereich von 20 bis 100 μm, am meisten bevorzugt in dem Bereich von 20 bis 60 μm aufweisen.
Ein bevorzugter organischer Träger, welcher eine der Komponenten des physiologisch verträglichen pulverförmigen Trägers ist, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann feinkörniges Pulver von Reis, Weizen, Buchweizen, Gerste, Sojabohne, Mais, Hirse, Kolbenhirse und dergleichen sein.
Vorzugsweise liegt die mittlere Partikelgröße des organischen Trägers bei nicht mehr als 300 μm, noch bevorzugter in dem Bereich von 20 bis 180 μm.
Ein bevorzugter Absorptionsverstärker, welcher eine der Komponenten der nasal verabreichbaren Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung ist, ist ein pharmazeutisch verträgliches natürliches (z.B. Cellulose, Stärke und deren Derivate) oder nicht natürliches Polymermaterial. Diese Verbindungen werden normalerweise als ein Bindemittel verwendet, aber bisher wurde nichts über die Anwendbarkeit eines Absorptionsverstärkers für ein nasal verabreichbares Präparat berichtet.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Cellulose und deren Derivate ist mikrokristalline Cellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulosephthalat, Celluloseacetat, Celluloseacetatphthalat, Carboxymethylcellulose, Niedrigcarboxymethylcellulose-Natrium, Carboxymethylethylcellulose und dergleichen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Stärke von den deren Derivaten ist Maisstärke, Kartoffelstärke, Reisstärke, Klebreisstärke, Weizenstärke, vorgelatiniserte Stärke, Dextrin, Natriumcarboxymethylstärke, Hydroxypropylstärke, Pullulan und dergleichen.
Andere natürliche Polymere wie z.B. Agar, Natriumalginat, Chitin, Chitosan, Eigelblecithin, Gummi arabicum, Tragacanth, Gelatine, Kollagen, Casein, Albumin, Fibrinogen und Fibrin können ebenfalls als Absorptionsverstärker verwendet werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des nicht natürlichen Polymers ist Natriumpolyacrylat, Polyvinylpyrrolidon und dergleichen.
Bevorzugte Absorptionsverstärker sind feine Pulver von Reis, Klebreis, Stärke, Gelatine, Dextrin, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Eigelblecithin, Gummi arabicum, Tragacanth oder einer Mischung von diesen. Noch bevorzugtere Absorptionsverstärker sind feine Pulver von Klebreis, Stärke, Gelatine, Hydroxypro pylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Tragacanth oder einer Mischung von diesen. Noch stärker bevorzugte Absorptionsverstärker sind feine Pulver von Klebreis oder Hydroxypropylcellulose. Der am meisten bevorzugte Absorptionsverstärker ist ein feines Pulver von Klebreis.
Die mittlere Partikelgröße des Absorptionsverstärkers beträgt vorzugsweise nicht mehr als 250 μm, noch bevorzugter von 20 bis 180 μm.
Die obigen Absorptionsverstärker können allein oder in Kombination von zwei oder mehreren Absorptionsverstärkern in dem physiologisch verträglichen pulverförmigen oder kristallinen Träger der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Im Hinblick auf nasal verabreichbare Präparate wurde bisher angenommen, dass ein wasserlöslicher Träger helfen würde, eine gute Absorption der aktiven Substanz im Körper zu erreichen. Jedoch wurde gefunden, dass eine ausgezeichnete Absorption von aktiven Substanzen erhalten werden kann, indem die aktive Substanz in einem wasserunlöslichen Träger, z.B. Hydroxylapatit, Calciumcarbonat, Calciumlactat, Aluminiumhydroxid oder Magnesiumstearat, vorzugsweise in Gegenwart eines Absorptionsverstärkers, homogen dispergiert wird und das cyclische Peptid darauf homogen adsorbiert wird.
Das Hydroxylapatit, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst synthetisches Hydroxylapatit und Hydroxylapatit, das aus Organismen erhalten wurde (Biohydroxylapatit). Das Biohydroxylapatit kann hergestellt werden, indem Knochen oder Zähne von Tieren verwendet werden, aus welchen organische Materialien entfernt werden.
Calciumcarbonat, Calciumlactat, Aluminiumhydroxid oder Magnesiumstearat werden gewöhnlich als ein Stabilisator, Gleitmittel, Glanzmittel, Bindemittel, Dispersionsmittel oder Beschichtungsmittel für ein pharmazeutisches Präparat verwendet; es wurde jedoch gefunden, dass diese Verbindungen, welche eine mittlere Partikelgröße von nicht mehr als 500 μm aufweisen, als ein Träger für die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können und die Wirkung haben, dass die Absorption von physiologisch aktiven Substanzen im Körper durch nasale Verabreichung gefördert wird.
Physiologisch aktive cyclische Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung sind antifungale cyclische Peptide [z.B. Aerothricine (wie sie später in dieser Beschreibung beschrieben werden), Echinocandin- und Pneumocandin-Analoge (typische Analoge werden beschrieben in: Current Pharmaceutical Design, 1996, 2, 209–224) und Aureobacidine (JP 03044398)), antibakterielle cyclische Peptide [z.B. Vancomycin, Daptomycin (GB 2,120,257) und dergleichen], Cyclosporin A, Lanreotid (WO 9504752: die Wachstumshormonfreisetzung inhibierender Faktor), Vapreotid ( US 4,650,787 : die Wachstumshormonfreisetzung inhibierender Faktor), Vasopressin-Antagonist ( US 5,095,003 ), Eptifibatid ( US 3,67,509 : Fibrinogen-gpIIb/IIIa-Rezeptorantagonist) und dergleichen.
Beispiele für die obigen antifungalen cyclischen Peptide sind Aerothricine der folgenden Formel (I):
worin
R¹ Guanidino, Tri-niederalkylammonio, -N(R¹⁰)-R¹¹, -N(R¹⁵)-CO-R¹⁴, -N(R¹⁵)-CO- CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³, -NHCOCH(R¹³)-NHCOCH(NH₂)-R¹³,

R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff; Heteroaryl, welches mit einem oder zwei Amino substituiert ist; niederem Alkyl, das gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem oder zwei Amino, Amino-niederalkyl, Cyano, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthalten;
R¹³ ein Rest ist, der von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist;
R¹⁴ niederes Alkyl ist, welches substituiert ist mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem oder zwei Amino, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthalten;
R¹⁵ Wasserstoff, niederes Alkyl, das gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem oder zwei Amino, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthalten, ist;
R² Wasserstoff, Hydroxysulfonyl, niederes Alkyl oder niederes Alkenyl ist, wobei niederes Alkyl und niederes Alkenyl gegebenenfalls substituiert sein können mit Acyl, Carbamoyl, Amino, Mononiederalkylamino oder Diniederalkylamino;
R³ Wasserstoff, Hydroxy, Nitro, Amino, Acylamino, (niederes Alkylcarbamoyl)amino, Carboxyl, niederes Alkoxy, niederes Alkoxycarbonyl, niederes Alkyl, niederes Alkenyl oder niederes Alkinyl ist, wobei niederes Alkyl, niederes Alkenyl und niederes Alkinyl gegebenenfalls substituiert sein können mit Hydroxy, Amino, Mononiederalkylamino, Diniederalkylamino, niederem Alkoxycarbonyl oder Carbamoyl;
R⁴ Alkyl, Alkenyl, Alkoxy oder Alkenyloxy ist, welche gegebenenfalls substituiert sein können mit niederem Alkyl, Aryl, Cycloalkyl oder einem Fluoratom(en);
R⁵ -CONH₂, -CN oder -CH₂NH₂ ist;
X eine Einfachbindung ist oder eine Aryl-, Biphenyl- oder Terphenylgruppe, welche gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatom(e) enthält und/oder mit einem Halogenatom(en) oder niederem Alkyl substituiert ist;
Y eine Einfachbindung, -CH₂-, -CH(niederes Alkyl)-, -CONH- oder -CON(niederes Alkyl)- ist;
Z -O-, -NH- oder -N(niederes Alkyl) ist;
m ein ganze Zahl von 0 bis 4 ist; und
n eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist;
und pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen.
Die Verbindungen der obigen Formel (I) sind neu unter der Voraussetzung, dass R¹ nicht Amino ist, R² und R³ nicht Wasserstoff sind, R⁵ nicht -CONH₂ ist und Z nicht -O- oder -NH- ist, wenn gleichzeitig -Y-(CH₂)_m-X-R⁴ unsubstituiertes Alkyl oder Aralkyl ist.
In dieser Beschreibung bedeutet der Ausdruck „nieder(es)" eine Gruppe, welche aus 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen) besteht, sofern nichts anderes angegeben ist.
Der Ausdruck „Alkyl" bezieht sich auf eine verzweigte oder geradkettige einwertige gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit einem bis zwanzig Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit einem bis sechzehn Kohlenstoffatomen. Der Ausdruck „niederes Alkyl" bezieht sich auf eine verzweigte oder geradkettige einwertige Alkylgruppe mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit einem bis vier Kohlenstoffatomen. Beispiele für diesen Ausdruck sind solche Gruppen wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, i-Butyl, tert.-Butyl und dergleichen.
Der Ausdruck „Alkenyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe, welche eine oder mehrere Doppelbindungen) in der Alkylenkette enthält.
Der Ausdruck „Alkinyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe, welche eine oder mehrere Dreifachbindung(en) in der Alkylenkette enthält.
Der Ausdruck „Alkoxy" bezieht sich auf die Gruppe -O-R', wobei R' ein Alkyl ist. Der Ausdruck „niederes Alkoxy" bezieht sich auf die Gruppe -O-R', wobei R' ein niederes Alkyl ist.
Der Ausdruck „Alkenyloxy" bezieht sich auf eine Alkoxygruppe, welche eine oder mehrere Doppelbindungen) in der Alkylenkette enthält.
Der Ausdruck „Acyl" bezieht sich auf die Gruppe -C(O)-R', wobei R' ein niederes Alkyl ist. Der Ausdruck „Acylamino" bezieht sich auf eine Acylgruppe, welche an einer Iminogruppe, d.h. -NH-, befestigt ist.
Der Ausdruck „Mononiederalkylamino" bezieht sich auf eine niedere Alkylgruppe, welche an einer Iminogruppe, d.h. -NH-, befestigt ist. Der Ausdruck „Diniederalkylamino" bezieht sich auf zwei unabhängig ausgewählte niedere Alkylgruppen, welche an einem Stickstoffatom befestigt sind, d.h. -N(-Niederalkyl)-niederalkyl. Der Ausdruck „Triniederalkylammonio" bedeutet Triniederalkylammonio, welches drei unabhängig ausgewählte C_1-3-Alkylgruppen enthält.
Der Ausdruck „Niederalkoxycarbonyl" bezieht sich auf die Gruppe -C(O)OR', wobei R' ein niederes Alkyl ist.
Der Ausdruck „(Niederalkylcarbamoyl)amino" bezieht sich auf die Gruppe -NHCONH-R', wobei R' ein niederes Alkyl ist.
Der Ausdruck „Halogenatom" bezieht sich auf Fluor, Chlor, Brom und Iod.
Der Ausdruck „Aryl" bezieht sich auf eine einwertige carbocyclische aromatische Gruppe (z.B. Phenyl) oder zwei annelierte carbocyclische Ringe (z.B. Naphtyl), gegebenenfalls unabhängig mono-, di- oder tri-substituiert mit niederem Alkyl, Trifluormethyl, Halogen und dergleichen.
Der Ausdruck „stickstoffhaltiger Heterocyclus" bezieht sich auf eine gesättigte, ungesättigte oder aromatische einwertige cyclische Gruppe, die wenigstens ein Stickstoffatom enthält.
Der Ausdruck „Heteroaryl" bezieht sich auf eine aromatische einwertige mono- oder polycarbocyclische Gruppe, welche wenigstens ein Heteroatom, d.h. Stickstoff, Schwefel oder Sauerstoff, enthält. Beispiele für Heteroarylreste mit einem oder mehreren Stickstoffatomen sind Pyridyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Pyridazinyl, Triazinyl und Imidazolyl.
Der Ausdruck „Cycloalkyl" bezieht sich auf eine einwertige carbocyclische Gruppe mit drei bis zehn Kohlenstoffatomen, vorzugsweise drei bis sechs Kohlenstoffatomen.
Der Ausdruck „pharmazeutisch verträgliche Salze" umfasst Salze der Aerothricine der Formel (I) mit anorganischer oder organischer Säure wie z.B. Salzsäure, Bromwassertstoffsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Zitronensäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Methansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure und dergleichen, welche für lebende Organismen ungiftig sind.
Jeder Substituent der Formel (I) in dem oben Stehenden wird nachfolgend detaillierter erklärt.
In der Definition von R¹ bedeutet der Ausdruck „Triniederalkylammonio" vorzugsweise Trimethylammonio und Triethylammonio.
In der Definition von R¹⁰ und R¹¹ bedeutet der Ausdruck „Heteroaryl" vorzugsweise 2-Pyridyl, 2-Pyrazinyl, 2-Pyrimidinyl, 2-Pyridazinyl, 2-Triazinyl, 2-Imidazolyl und dergleichen, insbesondere 2-Pyridyl und 2-Imidazolyl, am meisten bevorzugt 2-Pyridyl. Der Ausdruck „niederes Alkyl" bedeutet vorzugsweise eine Alkylkette, welche aus 1 bis 6 Kohlenstoffatomen besteht, wie z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, iso-Butyl, sec-Butyl, n-Pentyl, Neopentyl, tert.-Pentyl und n-Hexyl; vorzugsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl oder n-Butyl, am meisten bevorzugt Methyl, Ethyl oder n-Propyl. Der Ausdruck „stickstoffhaltige Heterocyclen" bedeutet vorzugsweise Morpholino, Piperazinyl, N-Methylpiperazinyl, Pyrrolidinyl, Piperidinyl, Imidazolidinyl, Pyrazolidinyl, Imidazolyl, Pyrazonyl, Triazolyl, Pyridinyl, Pyrazinyl und dergleichen, insbesondere Piperazinyl und Morpholino, am meisten bevorzugt Piperazinyl. Der Ausdruck „Phenylgruppe(n), welche eine Amino-, Amidino- oder Guanidi nogruppe enthält (enthalten)" bedeutet vorzugsweise 4-Aminophenyl, 4-Amidinophenyl, 4-Guanidinophenyl und dergleichen.
In der Definition von R¹³ bedeutet der Ausdruck „ein Rest, welcher von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist" vorzugsweise Wasserstoff oder niederes Alkyl, welches mit Hydroxy, Amino, Guanidino, Methylthio, Mercapto, Carbamoyl, Carboxy, Phenyl, Hydroxyphenyl, Aminophenyl, Imidazolyl oder Indolyl und dergleichen substituiert sein kann. Eine bevorzugte Ausführungsform von R¹³ ist niederes Alkyl, das mit Amino oder Guanidino substituiert ist, wie z.B. Aminomethyl, 2-Aminoethyl, 3-Aminopropyl, 4-Aminobutyl, 4-Guanidinobutyl.
In der Definition von R¹⁴ bedeutet der Ausdruck „niederes Alkyl" dasselbe wie für R¹⁰ und R¹¹ definiert wurde. Vorzugsweise, bedeutet er eine Alkylkette, welche aus 2 bis 5 Kohlenstoffatomen besteht, wie z.B. Ethyl, Propyl, Butyl und Pentyl. Der Ausdruck „stickstoffhaltige Heterocyclen" bedeutet dasselbe wie für R¹⁰ und R¹¹ definiert wurde. Vorzugsweise, bedeutet er Morpholino, Piperazinyl, N-Methylpiperazinyl, Pyrrolidinyl, Piperidinyl, Imidazolidinyl, Pyrazolidinyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Triazolyl, Pyridinyl, Pyrazinyl und dergleichen, insbesondere Piperazinyl und Morpholino. Der Ausdruck „Phenylgruppe(n), welche eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthält (enthalten)" bedeutet vorzugsweise 4-Aminophenyl, 4-Amidinophenyl, 4-Guanidinophenyl und dergleichen. Eine bevorzugte Ausführungsform von R¹⁴ ist 2-Aminoethyl, 3-Aminopropyl, 4-Aminobutyl, 2-Guanidinoethyl, 3-Guanidinopropyl, 2-Piperazinoethyl, 2-Morpholinoethyl, 4-Aminophenethyl und dergleichen.
In der Definition von R¹⁵ sind die Ausdrücke „niederes Alkyl", „stickstoffhaltige Heterocyclen" und „Phenylgruppe(n), welche eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthält (enthalten)" genauso wie für R¹⁴ definiert wurde. Eine bevorzugte Ausführungsform von R¹⁵ ist 2-Aminoethyl, 3-Aminopropyl, 4-Aminobutyl, 2-Guanidinoethyl, 3-Guanidinopropyl, 2-Piperazinoethyl, 2-Morpholinoethyl, 4-Aminophenethyl und dergleichen.
Bevorzugte Ausführungsformen von -N(R¹⁰)-R¹¹ [wobei R¹⁰ und R¹¹ wie oben definiert sind] sind Amino, 5-Aminopyrid-2-ylamino, Methylamino, Ethylamino, Propylamino, (2-Aminoethyl)amino, (3-Aminopropyl)amino, [3-[(3-Aminopropyl)amino]propyl]amino, (2-Piperazinylethyl)amino, (2-Morpholinoethyl)amino, N,N-Dimethylamino, N,N-Diethylamino, N,N-Dipropylamino, N,N-Ethylmethylamino, N,N-Bis(2-aminoethyl)amino, N,N-Bis(3-aminopro pyl)amino, N,N-Bis(4-aminobutyl)amino, N,N-Bis(2-piperazinylethyl)amino, N,N-Bis(2-morpholinoethyl)amino, N,N-Bis(2-guanidinoethyl)amino, N,N-Bis(3-guanidinopropyl)amino, N,N-Bis(2-pyridin-2-ylethyl)amino, N,N-Bis(imidazol-2-ylmethyl)amino, N-(2-Aminoethyl)-N-(3-aminopropyl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2-piperazinylethyl)amino, N-(3-aminopropyl)-N-(2-pyridin-2-ylethyl)amino und dergleichen. Noch bevorzugtere Ausführungsformen sind Amino, 5-Aminopyrid-2-ylamino, N,N-Dimethylamino, (2-Aminoethyl)amino, (3-Aminopropyl)amino, [3-[(3-Aminopropyl)amino]propyl]amino, (2-Piperazinylethyl)amino, N,N-Bis(2-aminoethyl)amino, N,N-Bis(3-aminopropyl)amino, N,N-Bis(4-aminobutyl)amino, N,N-Bis(2-piperazinylethyl)amino, N,N-Bis(2-guanidinoethyl)amino, N,N-Bis(3-guanidinopropyl)amino, N-(2-Aminoethyl)-N-(3-aminopropyl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2-piperazinylethyl)amino und dergleichen. Die am meisten bevorzugten Ausführungsformen sind (3-Aminopropyl)amino, N,N-Bis(2-aminoethyl)amino, N,N-Bis(3-aminopropyl)amino und N,N-Bis(2-piperazinylethyl)amino.
In der Definition von -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³, bedeutet die Gruppe -CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ [worin R¹⁰ und R¹¹ Wasserstoff sind; R¹³ ein Rest ist, der von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist] vorzugsweise Sarcosyl, Glycyl, Alanyl, Ornithinyl, Lysyl, Valyl, Leucyl, Isoleucyl, Tryptophyl, Phenylalanyl, Methionyl, Seryl, Tyrosyl, Threonyl, Cysteinyl, Asparaginyl, Glutaminyl, Aspartyl, Glutamyl, Arginyl, Histidyl, 2,3-Diaminopropionyl, 2,4-Diaminobutyryl, 2-Amino-4-triazol-1-ylbutyryl und dergleichen.
Bevorzugte Ausführungsformen von -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ sind Acylaminogruppen, die von basischen Aminosäuren abgeleitet sind. Beispiele für solche Acylaminogruppen sind Ornithinylamino, Lysylamino, Arginylamino, Histidylamino, 3-Aminoprolylamino, 2,3-Diaminopropionylamino, 2,4-Diaminobutyrylamino, 2-Amino-4-triazol-1-ylbutyrylamino, [3-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]propionyl]amino, [4-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]butyryl]amino, [5-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,3-diaminopropionyl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,4-diaminobutyryl)amino, N-(3-aminopropyl)-N-(2,5-Diaminovaleryl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,6-diaminohexanoyl)amino und dergleichen; insbesondere Ornithinylamino, Lysylamino, Arginylamino, Histidylamino, 2,3-Diaminopropionylamino, 2,4-Diaminobutyrylamino, [3-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]propionyl]amino, [4-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]butyryl]amino, [5-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,3-diaminopropi onyl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,4-diaminobutyryl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,5-diaminovaleryl)amino und N-(3-Aminopropyl)-N-(2,6-diaminohexanoyl)amino, am meisten bevorzugt Ornithinylamino, Lysylamino, 2,4-Diaminobutyrylamino, [4-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]butyryl]amino, [5-Amino-2-[bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,4-diaminobutyryl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-(2,6-diaminohexanoyl)amino, N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-2,5-diaminovaleryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-[(2R)-2,5-diaminovaleryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-5-amino-2-[N,N-bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-[(2R)-5-amino-2-[N,N-bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino, N-(3-Aminopropyl)-N-[(2S)-5-amino-2-[N-(3-aminopropyl)amino]valeryl]amino, N-(2-Aminoethyl)-N-[(2S)-5-amino-2-[N,N-bis(2-aminoethyl)amino]valeryl]amino und N-(2-Aminoethyl)-N-[(2R)-5-amino-2-[N,N-bis(2-Aminoethyl)amino]valeryl]amino.
In der Definition von R¹ ist die bevorzugte Ausführungsform von
Bis[2-(ornitylamino)ethyl]amino, Bis-[3-(ornitylamino)propyl]amino, [2-(Lysylamino)ethyl]amino, Bis-[3-(lysylamino)propyl]amino und dergleichen.
In der Definition von R¹ ist die bevorzugte Ausführungsform von
N-Ornityl-N-[2-(ornitylamino)ethyl]-amino, N-Ornityl-N-[3-(ornitylamino)propyl]amino, N-Ornityl-N-[3-(lysylamino)propyl]amino, N-Ornityl-N-[3-(lysylamino)propyl]amino, N-Lysyl-N-[2-(ornitylamino)ethyl]amino, N-Lysyl-N-[3-(ornitylamino)propyl]amino, N-Lysyl-N-[2- (lysylamino)ethyl]amino, N-Lysyl-N-[3-(lysylamino)propyl]amino und dergleichen.
In der Definition von R¹ ist die bevorzugte Ausführungsform von
Prolylamino, 3-Aminoprolylamino, 4-Aminoprolylamino, N-(3-Aminopropyl)-N-prolylamino, (2-Aminoethyl)prolylamino und dergleichen.
Der Ausdruck „-NHCOCH(R¹³)-NHCOCH(NH₂)-R¹³" [worin R¹³ wie oben definiert ist] bedeutet vorzugsweise Ornityl-ornitylamino, Lysyl-ornitylamino, Ornityl-lysylamino, Lysyl-lysylamino und dergleichen.
In dem Ausdruck „-N(R¹⁵)-CO-R¹⁴" [worin R¹⁴ und R¹⁵ wie oben definiert sind], sind der Ausdruck „stickstoffhaltiger Heterocyclus" und der Ausdruck „Phenylgruppe(n), welche eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthält (enthalten)" wie oben definiert.
Bevorzugte Ausführungsformen von -N(R¹⁵)-CO-R¹⁴ sind 3-Aminopropionylamino, 3-Guanidinopropionylamino, 3-Piperazinylpropionylamino, (3-Pyridin-3-ylpropionyl)amino, [3-(4-Aminophenyl)propionyl]amino, N-(3-Aminopropionyl)-N-(3-aminopropyl)amino und dergleichen.
Unter einem bevorzugten Aspekt ist R¹ -N(R¹⁰)-R¹¹, wobei R¹⁰ und R¹¹ wie oben definiert sind. Unter einem anderen bevorzugten Aspekt ist R¹ -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³, wobei R¹⁰, R¹¹, R¹³ und R¹⁵ wie oben definiert sind. Unter einem anderen bevorzugten Aspekt ist R¹ -N(R¹⁵)-CO-R¹⁴, wobei R¹⁴ und R¹⁵ wie oben definiert sind. Unter einem anderen bevorzugten Aspekt ist R¹
wobei R¹⁰ und R¹⁵ wie oben definiert sind. Unter einem anderen bevorzugten Aspekt ist R¹ -NHCOCH(R¹³)-NHCOCH(NH₂)-R¹³, wobei R¹³ wie oben definiert ist. Unter einem anderen bevorzugten Aspekt ist R¹ Triniederalkylammonio. Unter noch einem anderen bevorzugten Aspekt ist R¹ Amino oder Guanidino.
In der Definition von R² bedeutet der Ausdruck „niederes Alkyl, gegebenenfalls substituiert mit Acyl, Carboxy, Carbamoyl, Amino, Mononiederalkylamino oder Diniederalkylamino" vorzugsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, Butyl, Oxo-niederalkyl, Carboxy-niederalkyl, Carbamoyl-niederalkyl, Amino-niederalkyl und dergleichen, insbesondere Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, 2-Oxopropyl, Carboxymethyl, Carbamoylmethyl, 3-Aminopropyl und dergleichen. Der Ausdruck „niederes Alkenyl, gegebenenfalls substituiert mit Acyl, Carboxy, Carbamoyl, Amino, Mononiederalkylamino oder Diniederalkylamino" bedeutet vorzugsweise Allyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl und dergleichen, insbesondere Alkyl.
Unter einem bevorzugten Aspekt ist R² Wasserstoff, Hydroxysulfonyl oder niederes Alkyl wie z.B. Methyl oder Ethyl.
In der Definition von R³ bedeutet der Ausdruck „Acylamino" vorzugsweise Niederalkylcarbonylamino wie z.B. Acetylamino, Propionylamino oder Isobutyrylamino oder eine Acylaminogruppe, die von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist, wie z.B. Sarcosylamino, Glycylamino, Alanylamino, Ornitylamino, Lysylamino, Prolylamino, Valylamino, Leucylamino, Isoleucylamino, Tryptophylamino, Phenylalanylamino, Methionylamino, Serylamino, Tyrosylamino, Threonylamino, Cysteinylamino, Asparaginylamino, Glutamylamino, Aspartylamino, Glutamylamino, Arginylamino, Histidylamino und dergleichen; vorzugsweise Sarcosylamino, Glycylamino, Alanylamino, Lysylamino, Prolylamino und dergleichen. Der Ausdruck „(Niederalkylcarbamoyl)amino" bedeutet vorzugsweise Methylcarbamoylamino, Ethylcarbamoylamino, Propylcarbamoylamino, Butylcarbamoylamino und dergleichen, insbesondere Methylcarbamoylamino oder Ethylcarbamoylamino. Der Ausdruck „niederes Alkoxy" bedeutet vorzugsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Butoxy und dergleichen, insbesondere Methoxy und Ethoxy. Der Ausdruck „niederes Alkoxycarbonyl" bedeutet vorzugsweise Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, Butoxycarbonyl und dergleichen, insbesondere Methoxycarbonyl und Ethoxycarbonyl. Der Ausdruck „niederes Alkyl, welches gegebenenfalls substituiert sein kann mit Hydroxy, Amino, Mononiederalkylamino, Diniederalkylamino, Niederalkoxycarbonyl oder Carbamoyl" bedeutet vorzugsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Aminomethyl, Aminoethyl, Aminopropyl, Hydroxymethyl, Hydroxyethyl, Methylaminomethyl, 2-(Methylamino)ethyl, 3-(Methylamino)propyl, Dimethylaminomethyl, 2-(Dimethylamino)ethyl, 3-(Dimethylamino)propyl, 2-(Methoxycarbonyl)ethyl, 2-(Carbamoyl)ethyl und dergleichen. Der Ausdruck „niederes Alkenyl, welches gegebenenfalls substituiert sein kann mit Hydroxy, Amino, Mononiederalkylamino, Diniederalkylamino, Niederalkoxycarbonyl oder Carbamoyl" bedeutet vorzugsweise Vinyl, 2-(Methoxycarbonyl)vinyl, 2-(Carbamoyl)vinyl und dergleichen. Der Ausdruck „niederes Alkinyl, welches gegebenenfalls substituiert sein kann mit Hydroxy, Amino, Mononiederalkylamino, Diniederalkylamino, Niederalkoxycarbonyl oder Carbamoyl" bedeutet vorzugsweise Ethinyl, Propinyl, Hydroxypropinyl, Aminopropinyl, Diethylaminopropinyl und dergleichen.
Unter einem bevorzugten Aspekt ist R³ Wasserstoff, Hydroxy, Nitro, Amino oder Acylamino. Unter einem anderen bevorzugten Aspekt ist R³ (Niederalkylcarbamoyl)amino, Carboxyl, niederes Alkoxy oder Niederalkoxycarbonyl.
In der Definition von R⁴ bedeutet der Ausdruck „Alkyl, Alkenyl, Alkoxy oder Alkenyloxy" vorzugsweise eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkoxy- oder Alkenyloxygruppe, die 3 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, wie z.B. Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Oct-4-enyl, Oct-6-enyl, Nonanyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Hexadecyl, Propoxy, Butoxy, Pentyloxy, Hexyloxy, Heptyloxy, Octyloxy, Oct-4-enyloxy, Oct-6-enyloxy, Nonanyloxy, Non-5-enyloxy, Decyloxy und dergleichen. Der Ausdruck „niederes Alkyl" bedeutet vorzugsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, insbesondere Methyl oder Ethyl. Der Ausdruck „Aryl" bedeutet eine Arylgruppe, welche gegebenenfalls substituiert sein kann mit niederem Alkyl, Trifluormethyl oder einem Halogenatom(en), wie z.B. Phenyl, Naphtyl, 3-Fluorphenyl, 3-Bromphenyl, 3-Chlorphenyl, 4-Fluorphenyl, 4-Bromphenyl, 4-Chlorophenyl, 3-Methylphenyl, 4-Methylphenyl, 4-Trifluormethylphenyl. Der Ausdruck „Cycloalkyl" bedeutet vorzugsweise Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Adamantyl und dergleichen. Der Ausdruck „Alkyl, Alkenyl, Alkoxy oder Alkenyloxy, welche gegebenenfalls substituiert sein können mit niederem Alkyl, Aryl, Cycloalkyl oder einem Fluoratom(en)" bedeutet vorzugsweise 5-Methylhexyl, 1-Methyltridecyl, 2-Ethylbutoxy, 4-Methylpentyloxy, 2-Propylpentyloxy, 2-Ethylhexyloxy, 3,7-Dimethyloctyloxy, 2-Phenylethoxy, 2-(4-Fluorphenyl)ethoxy, 2-(4-Chlorophenyl)ethoxy, 2-(3-Fluorphenyl)ethoxy, 2-(4-Trifluorphenyl)ethoxy, 3-Phenylpropoxy, 2-Naphtylethoxy, 3-Naphtylpropoxy, 2-Cyclopropylethoxy, 2-Cyclobutylethoxy, 2-Cyclopentylethoxy, 3-Cyclopentylpropoxy, 2-Cyclohexylethoxy, 3-Cyclohexylpropoxy, 3,3-Diphenylpropoxy, 3,3,3-Trifluorpropoxy, 4,4,4-Trifluorbutoxy, 5,5,5-Trifluorpentyloxy und dergleichen.
Unter einem bevorzugten Aspekt ist R⁴ Alkyl oder Alkoxy, welches gegebenenfalls substituiert sein kann mit niederem Alkyl, Aryl, Cycloalkyl oder einem Fluoratom(en).
Bevorzugte Ausführungsformen von R⁵ sind -CONH₂ oder -CH₂NH₂.
In der Definition von X bedeutet der Ausdruck „Heteroatom" vorzugsweise Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff. Der Ausdruck „Aryl, Biphenyl oder Terphenyl, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatom(e) enthalten" bedeutet vorzugsweise
und dergleichen, welche weiter mit einem Halogenatomen) oder niederem Alkyl substituiert sein können. Die Linien mit offenen Enden in den obigen Formeln zeigen die bevorzugte Verknüpfung an der entsprechenden Position an.
Die am meisten bevorzugte Ausführungsform von X ist eine Einfachbindung,
welche weiter mit einem Halogenatomen) oder niederem Alkyl, vorzugsweise Methyl, substituiert sein können.
In der Definition von Y bedeutet der Ausdruck „niederes Alkyl" vorzugsweise eine Alkylgruppe, welche aus 1 bis 3 Kohlenstoffatomen besteht, z.B. Methyl, Ethyl oder Propyl. Die bevorzugte Ausführungsform von Y ist eine Einfachbindung, -CH₂-, -CH(CH₃)-, -CONH- oder -CON(CH₃)-, insbesondere eine Einfachbindung, -CH(CH₃)- oder -CONH-.
In der Definition von Z bedeutet der Ausdruck „-N(niederes Alkyl)-" vorzugsweise eine N-Alkylgruppe, welche aus 1 bis 3 Kohlenstoffatomen besteht, z.B. N-Methyl, N-Ethyl oder N-Propyl. Eine bevorzugte Ausführungsform von Z ist -O-; eine weitere bevorzugte Ausführungsform von Z ist -NH-.
m ist eine ganze Zahl von 0 bis 4, vorzugsweise 0 bis 2.
Bevorzugte Aerothricine gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Aerothricine 2 und 4 bis 137, wie diese beispielhaft in der folgenden Tabelle 1 dargestellt sind.
Tabelle 1
Formel (I)
Formel (I)
Formel (I)
Formel (I)
Formel (I)
Formel (I)
Weitere Beispiele für die obigen antifungalen cyclischen Peptide sind Echinocandin-Analoge (z.B. LY303366: EP 736 541 , FK463 und dessen Analoge wie in der WO 98/23637 und der WO 99/40108 beschrieben wird) und Pneumocandin-Analoge (z.B. MK0991 wie in der WO 94/21677 beschrieben wird):
Noch bevorzugtere Aerothricine im Zusammenhang mit der nasal verabreichbaren Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung sind Aerothricine der vorstehend erwähnten Formel (I), worin
R¹-N(R¹⁰)-R¹¹, -N(R¹⁵)-CO-R¹⁴, -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³, -NHCOCH(R¹³)-NHCOCH(NH₂)-R¹³,

R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff; niederem Alkyl, das gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem oder zwei, Amino, Amino-niederem Alkyl, Cyano, Guanidino oder einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en), der vorzugsweise ausgewählt ist aus Morpholino, Piperazinyl, N-Methylpiperazinyl, Pyrrolidinyl, Piperidinyl, Imidazolidinyl, Pyrazolidinyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Triazolyl, Pyridinyl, Pyrazinyl und dergleichen, insbesondere ausgewählt ist aus Piperazinyl und N-Methylpiperazinyl.
R¹³ ist ein Rest, der von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist, der vorzugsweise ausgewählt ist aus Wasserstoff oder niederem Alkyl, welches substituiert sein kann mit Hydroxy, Amino, Dimethylamino, Guanidino, Methylthio, Mercapto, Carbamoyl, Carboxy, Phenyl, Hydroxyphenyl, Aminophenyl, Imidazolyl oder Indolyl und dergleichen, noch bevorzugter ausgewählt ist aus niederem Alkyl, das substituiert ist mit Amino oder Guanidino, wie z.B. Aminomethy, 2-Aminoethyl, 3-Aminopropyl, 3-(Dimethylamino)propyl, 4-Aminobutyl oder 4-Guanidinobutyl.
R¹⁴ ist niederes Alkyl, welches substituiert ist mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem oder zwei, Amino, Dimethylamino, Guanidino oder einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en), der vorzugsweise ausgewählt ist aus Morpholino, Piperazinyl, N-Methylpiperazinyl, Pyrrolidinyl, Piperidinyl, Imidazolidinyl, Pyrazolidinyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Triazolyl, Pyridinyl, Pyrazinyl und dergleichen, noch bevorzugter ausgewählt ist aus Piperazinyl, N-Methylpiperazinyl und Imidazolyl.
R¹⁵ ist Wasserstoff, niederes Alkyl, welches gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem oder zwei, Amino, Dimethylamino, Guanidino oder einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en), der vorzugsweise ausgewählt ist aus Morpholino, Piperazinyl, N-Methylpiperazinyl, Pyrrolidinyl, Piperidinyl, Imidazolidinyl, Pyrazolidinyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Triazolyl, Pyridinyl, Pyrazinyl und dergleichen, noch bevorzugter ausgewählt ist aus Piperazinyl und N-Methylpiperazinyl.
R² ist Wasserstoff, Hydroxysulfonyl oder niederes Alkyl;
R³ ist Wasserstoff, Hydroxy oder Amino;
R⁴ ist Alkyl
R⁵ ist -CONH₂, -CN oder -CH₂NH₂;
X ist eine Einfachbindung;
Y ist eine Einfachfingung, -CH₂-, -CH(niederes Alkyl)-;
Z ist -O-;
m ist eine ganze Zahl von 0 bis 4; und
n ist eine ganze Zahl von 2 bis 5;
und pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen.
Noch bevorzugtere Aerothricine in Verbindung mit der nasal verabreichbaren Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung sind die Aerothricine 1–5, 14, 15, 17, 31, 32, 63, 96, 101-122, 124, 126–137, wie sie beispielhaft in der obigen Tabelle 1 dargestellt sind. Die am meisten bevorzugten Aerothricine in Verbindung mit der nasal verabreichbaren Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung sind die Aerothricine 132–137.
Aerothricine, welche durch die Formel (I) dargestellt werden, können gemäß den folgenden Methoden hergestellt werden:
Verfahren A
Aerothricine der Formel (II) können hergestellt werden, indem ein Mikroorganismus, welcher zu Deuteromycotina gehört, der in der Lage ist, die Aerothricine 1, 2 und 3 zu produzieren [Aerothricin 3 (=WF11243) wird in Referenzbeispiel 1 beschrieben], unter aeroben Bedin gungen in einem wässrigen oder einem festen Medium kultiviert wird und die Aerothricine 1, 2 und 3 aus der Kultur isoliert werden.
[wobei R³ Wasserstoff oder Hydroxy ist, Y -CH(CH₃)- oder -CH₂- ist]
Verfahren B
Aerothricine der Formel (I) [wobei R¹ Amino ist; Y -CONH-, -CON(niederes Alkyl)-, -CH₂- oder eine Einfachbindung ist; Z -NH- oder -N(niederes Alkyl)- ist; R², R³, R⁴, R⁵, X und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch Kondensation einer Verbindung der Formel (III),
[wobei R⁶ eine Aminoschutzgruppe ist; R², R³ und R⁵ wie oben definiert sind], mit einer Verbindung der Formel (IV),
(wobei R⁷ eine Aminoschutzgruppe ist; R⁸ Wasserstoff oder niederes Alkyl ist; R⁴, X, Y und m wie oben definiert sind],
unter Verwendung eines Carboxylaktivierungsmittels zur Peptidsynthese, gefolgt von der selektiven Entfernung der Aminoschutzgruppe R⁷ des resultierenden linearen Peptids, der darauf folgenden Cyclisierung mit einem Carboxylaktivierungsmittel zur Peptidsynthese und der Entfernung der Aminoschutzgruppe R⁶.
Verfahren C
Aerothricine der Formel (I) [wobei R³ eine Nitrogruppe ist; R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch Nitrierung der Aerothricine der Formel (I) [wobei R³ Wasserstoff ist; R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind].
Verfahren D
Aerothricine der Formel (I) [wobei R³ eine Aminogruppe ist; R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch Reduktion der Nitrogruppe der Aerothricine der Formel (I) [wobei R³ eine Nitrogruppe ist; R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind].
Verfahren E
Aerothricine der Formel (I) [wobei R³ Acylamino oder (niederes Alkylcarbamoyl)amino ist;
R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch Acylierung der Aminogruppe der Aerothricine der Formel (I) [wobei R³ eine Aminogruppe ist;
R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit Säurechlorid, Säureanhydrid, Carbonsäure/Kondensationsmittel oder niederem Alkylcarbamoylchlorid, gefolgt, wenn nötig, von der Entfernung der Aminoschutzgruppe.
Verfahren F
Aerothricine der Formel (I) [wobei R¹ (3-Aminopropyl)amino, (2-Cyanoethyl)amino, 3-Amino-2-(aminomethy)propyl]amino oder -N(R¹⁵)-COCH[NH(CH₂)₃NH₂]-R¹³ ist [wobei R¹³ und R¹⁵ wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch Umsetzen der Aminogruppe der Aerothricine der Formel (I) [wobei R¹ eine Aminogruppe oder -N(R¹⁵)-COCH(NH₂)-R¹³ ist [wobei R¹³ und R¹⁵ wie oben definiert sind]; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit Acrylonitril, Ethoxymethylenmalononitril oder (1-Ethoxyethyliden)malononitril, gefolgt von der Reduktion der resultierenden Nitrilgruppe(n) und, wenn nötig, von der Entfernung der Schutzgruppe(n).
Verfahren G
Aerothricine der Formel (I) [wobei R¹ -N(R¹⁰)-R¹¹ [wobei R¹⁰ und R¹¹jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, niederem Alkyl, welches gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Amino, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthält] oder -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ ist [wobei R¹⁰ und R¹¹jeweils ein niederes Alkyl sind, welches gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Amino, Amino-niederem Alkyl, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthält; R¹³ und R¹⁵ wie oben definiert sind];
R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch reduktive Alkylierung der Aminogruppe der Aerothricine der Formel (I) [wobei R¹ Amino, (2-Cyanoethyl)amino oder -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ ist [wobei R¹⁰ und R" jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom oder (2-Cyanoethyl)amino sind; R¹³ und R¹⁵ wie oben definiert sind]; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einem Aldehyd der Formel (V), R⁹-CHO (V)[wobei R⁹ Wasserstoff, niederes Alkyl, welches weiter substituiert sein kann mit einem oder mehreren geschützten Amino, einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine geschützte Aminogruppe enthält],
gefolgt, wenn nötig, von der Entfernung der Aminoschutzgruppe(n) oder der Reduktion einer Cyanogruppe.
Verfahren H
Aerothricine der Formel (I) [wobei R¹ -N(R¹⁰)-R¹¹ ist [wobei R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff oder einem Heteroaryl, welches mit einer oder zwei Aminogruppe(n) substituiert ist]; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch Umsetzen der Aminogruppe der Aerothricine der Formel (I) [wobei R¹ eine Aminogruppe ist; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einer Verbindung der Formel (VI), R¹²-Q (VI)[wobei R¹² ein stickstoffhaltiges Heteroaryl ist, welches weiter substituiert sein kann mit einer geschützten Amino- oder Nitrogruppe, Q ein Halogenatom wie z.B. Chlor oder Brom ist],
gefolgt, wenn nötig, von der Entfernung einer Aminoschutzgruppe oder der Reduktion einer Nitrogruppe.
Verfahren I-1
Aerothricine der Formel (I) [wobei R¹
-NHCO-CH(NH₂)-R¹³ [wobei R¹³ ein Rest ist, der von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist] oder -NHCO-R¹⁴ ist [wobei R¹⁴ wie oben definiert ist]; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch die Acylierung der Aminogruppe der Aerothricine der Formel (I) [wobei R¹ eine Aminogruppe ist; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einer Säure der Formel (VII) oder (VII'), HO(O=)C-CH(NH-R⁷)-R¹³ (VII)
[wobei R¹³ ein Rest ist, der von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist, deren funktionale Gruppe geeignet geschützt ist, R⁷ eine Aminoschutzgruppe ist], oder einer Säure der Formel (VIII), HO(O=)C-R¹⁴ (VIII)[wobei R¹⁴ niederes Alkyl, welches eine oder mehrere geschützte Aminogruppe(n) aufweist, ein stickstoffhaltiger Heterocyclus(en) oder eine Phenylgruppe(n), welche eine geschützte Aminogruppe enthält, ist];
gefolgt, wenn nötig, von der Entfernung der Schutzgruppe(n).
Verfahren I-2
Aerothricine der Formel (I), wobei R¹
[wobei R¹⁰, R¹¹, R¹³, R¹⁵ und m wie oben definiert sind] oder
[wobei R¹⁰, R¹¹, R¹³, R¹⁵ und m wie oben definiert sind]
ist, können hergestellt werden durch die Acylierung der Aminogruppe der Aerothricine der Formel (I), wobei R¹ -N(R¹⁰)-R¹¹ [wobei R¹⁰ und R¹¹ beide niederes Alkyl, welches mit einer Aminogruppe substituiert ist, sind] oder -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ ist [wobei R¹⁵ niederes Alkyl ist, welches mit einer Aminogruppe substituiert ist; R¹⁰, R¹¹ und R¹³ wie in Anspruch 1 definiert sind, unter dem Vorbehalt, dass die Aminogruppe(n), die in R¹⁰, R¹¹ und R¹³ vorliegen, geschützt sind], mit einer Säure der Formel (VII) HO(O=)C-CH(NH-R⁷)-R¹³ (VII) (wobei R¹³ ein Rest ist, der von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist, deren funktionale Gruppe geeignet geschützt ist, R⁷ eine Aminoschutzgruppe ist]; gefolgt von der Entfernung der Schutzgruppe(n).
Verfahren I
Aerothricine der Formel (I) [wobei R¹ -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ (wobei R¹⁰ und R¹¹ Wasserstoff sind, R¹³ wie oben definiert ist und R¹⁵ niederes Alkyl ist, welches gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Amino, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Amino-,Amidino- oder Guanidinogruppe enthält],
[wobei R¹⁰ Wasserstoff ist und R¹⁵ niederes Alkyl ist, welches gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Amino, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthält] oder -N(R¹⁵)-CO-R¹⁴ ist [wobei R¹⁵ niederes Alkyl ist, welches gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren Amino, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Amino-,Amidino- oder Guanidinogruppe enthält, R¹⁴ wie oben definiert ist]; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch Mono-N-alkylierung der Aminogruppe der Aerothricine der Formel (I) [wobei R¹ eine Aminogruppe ist; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] wie in Verfahren F beschrieben, gefolgt von der Acylierung mit einer entsprechenden Verbindung der Formeln (VII), (VII') oder (VIII) wie in Verfahren I beschrieben, gefolgt, wenn nötig, von der Entfernung der Schutzgruppe(n).
Verfahren K
Aerothricine der Formel (I) [wobei R¹ eine Guanidinogruppe, -N(R¹⁰)-R¹¹ [wobei R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus niederem Alkyl, welches mit einer Guanidino- oder Phenylgruppe(n), welche eine Guanidinogruppe enthält, substituiert ist], -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ [wobei R¹⁰, R¹¹ und R¹³ wie oben definiert sind und R¹⁵ niederes Alkyl ist, welches gegebenenfalls substituiert ist mit einer oder mehreren Guanidinogruppe(n), einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Guanidinogruppe enthält] oder -N(R¹⁵)CO-R¹⁴ ist [wobei R¹⁴ niederes Alkyl ist, welches substituiert ist mit einer oder mehreren Guanidinogruppe(n), einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Guanidinogruppe enthält; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch Umsetzen der Aerothricine der Formel (I) [wobei R¹ eine Aminogruppe; -N(R¹⁰)-R¹¹ [wobei R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus niederem Alkyl, welches substituiert ist mit einer Aminogruppe(n) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Aminogruppe enthält], -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³ [wobei R¹⁰, R¹¹ und R¹³ wie oben definiert sind und R¹⁵ niederes Alkyl ist, welches gegebenenfalls substituiert ist mit einer oder mehreren Aminogruppe(n), einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Aminogruppe enthält]; oder -NHCO-R¹⁴ ist [wobei R¹⁴ niederes Alkyl ist, welches substituiert ist mit einer oder mehreren Aminogruppe(n), einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Aminogruppe enthält; R², R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einem aktivierten Amidinderivat.
Verfahren L
Aerothricine der Formel (I) [wobei R² niederes Alkyl oder niederes Alkenyl ist, welches gegebenenfalls substituiert ist mit Acyl, Carboxy, Carbamoyl, Hydroxy, Amino, Mononiederalkylamino oder Diniederalkylamino; R¹, R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch O-Alkylierung der phenolischen Hydroxylgruppe der Aerothricine der Formel (I) [wobei R² Wasserstoff ist; R¹, R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einem Alkylierungsmittel.
Verfahren M
Aerothricine der Formel (I) [wobei R³ Carboxyl, niederes Alkoxycarbonyl, niederes Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl ist, welche gegebenenfalls substituiert sein können mit Hydroxy, Amino, Mononiederalkylamino, Diniederalkylamino, Niederalkoxycarbonyl oder Carbamoyl;
R² Wasserstoff ist; R¹, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch Iodierung von Aerothricinen der Formel (I) [wobei R² und R³ Wasserstoff sind; R¹, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einem Iodierungsmittel, gefolgt von einer mit Palladium(0) katalysierten Kopplung des resultierenden Iodderivats der Formel (I) [wobei R³ ein Iod ist; R¹, R², R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit Kohlenmonoxid, Methylacrylat und dergleichen, und wenn nötig, durch die Entfernung der Schutzgruppe(n).
Verfahren N
Aerothricine der Formel (I) [wobei R⁵ -CN ist; R¹, R², R³, R⁴, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch Dehydratisierung der Carbamoylgruppe der Aerothricine der Formel (I) [wobei R⁵ -CONH₂ ist; R¹, R², R³, R⁴, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einem Dehydratisierungsmittel, und, wenn nötig, durch die Entfernung der Aminoschutzgruppe(n).
Verfahren O
Aerothricine der Formel (I) [wobei R⁵ -CH₂NH₂ ist; R¹, R², R³, R⁴, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch Reduktion der Carbamoyl- oder Cyanogruppe der Aerothricine der Formel (I) [wobei R⁵ -CONH₂ oder -CN ist; R¹, R², R³, R⁴, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] mit einem Reduktionsmittel und, wenn nötig, durch die Entfernung der Aminoschutzgruppe(n).
Verfahren P
Aerothricine der Formel (I) [wobei R² Hydroxysufonyl ist; R¹, R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch Hydroxysulfonierung des Tyrosinrests der Aerothricine der Formel (I) [wobei R² Wasserstoff ist; R¹, R³, R⁴, R⁵, X, Y, Z und m wie oben definiert sind], gefolgt von der Entfernung der Schutzgruppe(n).
Verfahren Q
Aerothricine der Formel (I) [wobei -Y-(CH₂)_m-X-R⁴ n-Tridecanyl oder 1-Methytridecanyl ist, R⁵ -CONH₂ ist, Z ein Sauerstoffatom ist und R¹, R² und R³ wie oben definiert sind] können hergestellt werden aus dem linearen Peptid der Formel (IX) durch das Verfahren, welches in Schema 1 dargestellt ist.
Die Verbindung der obigen Formel (III), wobei R², R³ und R⁵ wie oben definiert sind und R⁶ eine Aminoschutzgruppe ist, unter dem Vorbehalt, dass, wenn R⁵ -CONH₂ ist, dann R² oder R³ von Wasserstoff verschieden sind, und Salze von dieser sind neu und sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Weiterhin sind die linearen Peptide der Formeln (IX), (X) und (XII), welche in Schema 1 gezeigt sind, und gegebenenfalls Salze von diesen neu und sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Schema 1 (Fortsetzung auf der nächsten Seite)
Schema 1
Die Verfahren A bis Q können wie folgt detaillierter dargestellt werden:
Verfahren A
Die Mikroorganismen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können beliebige Stämme einschließlich Mutanten und Varianten, welche zu Deuteromycotina gehören, sein, die in der Lage sind, die Aerothricine 1, 2 und 3 zu produzieren. Besonders bevorzugt ist der Stamm NR 7379, welcher aus abgefallenen Blättern isoliert wurde, die bei Kagoshima pref. in Japan gesammelt wurden, und welcher als ein Stamm, der zu Deuteromycotina gehört, identifiziert wurde.
Die Kultivierungs- und morphologischen Kennzeichen des Stammes NR 7379 sind wie folgt:
1. Kultivierungskennzeichen
Maismehlagar (CMA): Das Wachstum war nicht ausgedehnt. Die Kolonien erreichten nach 14 Tagen bei 25°C ausgehend vom Inokulum (4,5 mm Durchm. Agarstopfen) 11 mm im Durchmesser. Sie waren flach und blasscremegelb. Die Rückseite war blasscremegelb. Es waren farblose und schleimige Exudate vorhanden.
Miura's Medium (LCA): Das Wachstum war nicht ausgedehnt. Die Kolonien erreichten nach 14 Tagen bei 25°C ausgehend vom Inokulum 11 mm im Durchmesser. Sie waren flach und blasscremegelb. Die Rückseite war blasscremegelb. Exudate fehlten.
Malzextraktagar (MEA): Das Wachstum war nicht ausgedehnt. Die Kolonien waren pustelförmig und erreichten nach 14 Tagen bei 25°C ausgehend vom Inokulum einen Durchmesser von 18 mm. Die Farbe der Kolonien war hellgelblichbraun. Die Rückseite hatte dieselbe Farbe. Die Exudate waren farblos und schleimig.
Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA): Das Wachstum war nicht ausgedehnt. Die Kolonien waren pustelförmig und erreichten nach 14 Tagen bei 25°C ausgehend vom Inokulum 14 mm im Durchmesser. Die Farbe und Textur der Kolonien waren ähnlich zu denen auf MEA. Die Exudate waren farblos und schleimig.
Eine Keimung wurde auf CMA, LCA, MEA und PDA zwischen 5°C und 30°C beobachtet.
2. Morphologische Kennzeichen
Die Mycelien waren teilweise eingetaucht, teilweise oberflächlich, verzweigt, septiert und blassbraun bis cremegelb. Konidiophoren wurden von eingetauchtem Mycel gebildet. Diese waren hyaloid, septiert, verzweigt, unregelmäßig. Konidiogene Zellen befanden sich auf einzelnen Konidiophoren oder unregelmäßigen Hyphen. Diese waren enteroblastisch, phialidisch, endständig oder subterminal. Endständige oder subterminale Phialide waren in der Länge und Form variabel. Sie waren zylindrisch bis flaschenförmig und deren Länge und Breite betrugen bis zu 5,5 bis 10 μm bzw. 2,5 bis 5,5 μm. Unregelmäßig fadenförmige Konidiophoren mit seitlichen konidiogenen Zellen unmittelbar unterhalb der Septa wurden oft gebildet. Die Konidien waren einzellig, hyaloid, glatt, kugelförmig bis kreisförmig, 2,0 bis 5,5 μm in der Länge und 2,0 bis 5,0 μm in der Breite.
Auf der Grundlage dieser einzelnen Kultivierungs- und morphologischen Kennzeichen gehörte der vorliegende Stamm zu Deuteromycotina, bezeichnet als Deuteromycotina NR 7379.
Der Stamm, welcher als Deuteromycotina NR 7379 bezeichnet wurde, wurde bei dem National Institute of Bioscience und Human-Technology, Agency of Industrial Science und Technology, Japan im Namen der Nippon Roche K. K., 6–1, Shiba 2-chome, Minato-ku Tokyo, 105 Japan am 16. Juni 1998 unter dem Budapester Vertrag wie folgt hinterlegt: Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391).
Die Kultivierung gemäß dem Verfahren, das von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, kann in einem Kulturmedium durchgeführt werden, welches gebräuchliche Nährstoffe enthält, die von dem Mikroorganismus, welcher kultiviert wird, verwendet werden können.
Als Kohlenstoffquellen können z.B. Glucose, Sucrose, Stärke, Glycerol, Molassen, Dextrin und Mischungen von diesen erwähnt werden. Stickstoffquellen sind z.B. Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Trockenhefe, Hefeextrakt, Maiseinweichflüssigkeit, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und Mischungen von diesen. Darüber hinaus können zu dem Kulturmedium andere organische oder anorganische Substanzen zur Förderung des Wachstums des Mikroorganismus und zur Erhöhung der Produktion von Aerothricin 1 zuge geben werden. Beispiele für solche Substanzen sind anorganische Salze wie z.B. Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Phosphate und dergleichen.
Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise in einem flüssigen Medium, durch Submersfermentation oder in einem festen Medium durch statische Fermentation durchgeführt. Eine Temperatur von 20°C bis 30°C, mit einer optimalen Temperatur von 27°C, ist zur Kultivierung geeignet. Die Kultivierung wird vorzugsweise bei einem pH von 3 bis 9 durchgeführt. Die Kultivierungsdauer hängt von den Bedingungen ab, unter welchen die Kultivierung durchgeführt wird. Im Allgemeinen ist es ausreichend, die Kultivierung für 20 bis 360 h durchzuführen.
Zum Ernten der betroffenen Aerothricine 1, 2 und 3 aus den Kulturen können Trennmethoden, welche gewöhnlich eingesetzt werden, um Metaboliten, die von Mikroben produziert wurden, aus deren Kulturen zu isolieren, geeignet verwendet werden. Beispielsweise wird Aerothricin 1, welches eine in Methanol extrahierbare amphotere Substanz ist, vorteilhaft durch die folgenden Vorgänge gewonnen.
Das heißt, der gesamte Feststoff der Kultivierung, welcher durch eine Fermentation im festen Zustand erhalten wird, wird mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert, um das vorgeschlagene Produkt zu gewinnen. Die Lösungsmittel, welche verwendet werden können, um die betroffene Verbindung aus dem gesamten kultivierten Feststoff zu isolieren, umfassen wasserlösliche organische Lösungsmittel oder wasserhaltige Lösungen von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln wie z.B. Methanol, Ethanol und wasserhaltige Alkohole.
Zum Entfernen von Salzen, wasserlöslichen Substanzen usw. aus dem resultierenden Extrakt wird vorteilhaft ein Ausschütteln zwischen Wasser und mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln wie z.B. n-Butanol, Ethylacetat usw. eingesetzt. Zum Entfernen von färbenden Substanzen, fettlöslichen Substanzen oder dergleichen aus dem Extrakt wird vorteilhaft eine Lösungsmittelreinigung durch Methanol, Ethanol, eine Mischung von Acetonitril-0,1% wässriger Trifluoressigsäure usw. eingesetzt.
Zur vollständigen Reinigung der Aerothricine wird vorteilhaft eine Säulenchromatographie verwendet. Träger, die bei einer solchen Säulenchromatographie verwendet werden können, sind solche wie YMC-GEL ODS (Yamamura Chemical Laboratories, Japan) oder Preparative C18 (Waters Millipore Corporation). Als ein Elutionsmittel wird ein Lösungsmittelsystem verwendet, welches aus einer Mischung von wässriger Trifluoressigsäure und geeigneten wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln wie z.B. Methanol, Ethanol, Acetonitril usw. besteht. Die so gereinigte Fraktion des Eluats, welche jede Komponente enthält, kann einer Konzentrierung oder einem Gefriertrocknen unterzogen werden, um die Aerothricine 1, 2 und 3 zu pulverisieren.
Die Aerothricine 1, 2 und 3 wurden als ein Trifluoressigsäuresalz isoliert, aber die freien Aerothricine 1, 2 und 3 können durch den folgenden Vorgang hergestellt werden. Die Trifluoressigsäuresalze der Aerothricine 1, 2 und 3 werden nämlich in Wasser gelöst, zu welchem ein Äquivalent an Natriumhydroxid zugegeben wurde, und die Mischung wird einer Sephadex LH-20-Säulenchromatographie unterzogen, worauf die Elution mit einem wasserhaltigen Alkohol wie z.B. Methanol-Wasser usw. folgt, um dadurch die Aerothricine 1, 2 bzw. 3 (freie Form) zu erhalten.
Verfahren B
Die Ausgangsverbindung der Formel (III) kann aus Aerothricinen der Formel (I) [welche die Aerothricine 1 bis 3 wie auch jene, die aus den Aerothricinen 1 bis 3 durch Verwendung eines Verfahrens, das ausgewählt wird aus den Verfahrenes C bis Q, umgewandelt wurden, umfasst) durch ein Verfahren, welches dem ähnelt, das in der WO 96/30399 beschrieben wird, hergestellt werden. Dieses Verfahren umfasst die alkalische Hydrolyse des Lactonrings, gefolgt von der enzymatischen Spaltung der Fettsäurekette. Die bevorzugten Aminoschutzgruppen für R⁶ in der Formel (III) und R⁸ in der Formel (IV) sind tert.-Butoxycarbony (Boc) bzw. 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc).
Die Ausgangsverbindung der Formet (III) kann ebenfalls aus dem linearen Peptid der Formel (IX), welches durch Fermentation von Deuteromycotina erhalten wird, durch eine herkömmliche Peptidsynthese, wie sie nachstehend erwähnt wird, hergestellt werden.
Die Ausgangsverbindung der Formel (IV) [wobei Y -CONH- ist; R⁴, R⁸ und X wie oben definiert sind] kann hergestellt werden durch Kondensation der Verbindung der Formel (XIV),
[wobei R⁷ eine Aminoschutzgruppe wie z.B. eine Fmoc-Gruppe ist, und R⁸ wie oben definiert ist],
mit einer Verbindung der Formel (XV), R⁸NH-(CH₂)_m-X-R⁴ (XV)[wobei R⁴, R⁸, X und m wie oben definiert sind], gefolgt von der Entfernung der tert.-Butylgruppe. Die Verbindung der Formel (XIV) ist im Handel erhältlich.
Die Ausgangsverbindungen der Formel (XV) [wobei X eine Einfachbindung, eine Aryl-, Biphenyl- oder Terphenylgruppe ist, welche gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatom(e) enthält und/oder mit einem Halogenatomen) oder niederem Alkyl substituiert ist] sind im Handel erhältlich oder können durch Verfahren hergestellt werden, welche zu denen ähnlich sind, die in der EP 736 541 und Schema 2 beschrieben werden: z.B. LiAlH₄-Reduktion des Carboxyamids, welches aus den Carbonsäurezwischenprodukten in Schema 2, das im folgenden erwähnt ist, hergestellt wurde, gefolgt von dem Schützen der Aminogruppe mit Fmoc-Chlorid und dergleichen.
Die repräsentativen Verbindungen der Formel (IV) [wobei Y -CONH- oder -CON(niederes Alkyl)- ist; R⁴, R⁷, R⁸ und X wie oben definiert sind] sind

und dergleichen.
Die Ausgangsverbindung der Formel (IV) [wobei Y ist a Einfachbindung oder -CH₂- ist; R⁴,
R⁸ und X wie oben definiert sind] können hergestellt werden durch Michael-Addition von (R)-(+)-N-Benzyl-1-phenylethylamin an eine Verbindung der Formel (XVI),
[wobei R⁴, X und m wie oben definiert sind]
in Gegenwart einer starken Base wie z.B. LDA [siehe Tetrahedron Asymmetry, 2 (3), 183 (1991)], gefolgt von i) einer N-Debenzylierung durch katalytische Hydrierung, ii) Schutz des resultierenden primären Amins mit Fmoc-Chlorid und dergleichen, und iii) Entfernung der tert.-Butylgruppe.
Die Ausgangsverbindungen der Formel (XVI) können hergestellt werden durch das Verfahren, das in dem folgenden Schema 2 dargestellt ist.
Schema 2
Die Verbindungen der Formel (XVI), bei welchen m 4 ist, können hergestellt werden, indem die Schritte 1 bis 3 in Schema 2 vor der letzten Wittig-Reaktion wiederholt werden.
Die repräsentativen Verbindungen der Formel (IV) [wobei Y eine Einfachbindung oder -CH₂ist; R⁴, R⁷ und X wie oben definiert sind] sind:
Die Bildungsreaktion der ersten Peptidbindung wie auch die Cyclisierung des resultierenden linearen Peptids können durch das Verfahren durchgeführt werden, welches den Fachleuten der Peptidchemie bekannt ist [siehe The practice of Peptide Synthesis, M. Bodansky und A. Bodansky / 2. Aufl., 1994 (Springer-Verlag)]. Das bevorzugte Kondensationsmittel ist BOP-HOBt, PyBOP^TM-HOBt, PyBroP^TM-HOBt und dergleichen [Kopplungsreagenzien: im Handel erhältlich (siehe The Combinatorial Chemistry Catalog, Feb., 1997; Novabiochem.)].
Die Reaktion kann in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol, Pyridin, N,N-Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon und dergleichen in Gegenwart oder Abwesenheit einer Base wie z.B. Triethylamin, Diisopropylethylamin, Pyridin und dergleichen bei einer Temperatur zwischen –20°C und +50°C, vorzugsweise bei 0°C bis +25°C durchgeführt werden.
Verfahren C
Die Nitrierung des Aerothricins der Formel (I) kann durch das Verfahren durchgeführt werden, welches den Fachleuten bekannt ist; typischerweise durch Natriumnitrit/Essigsäure, Tetranitromethan/Pyridin und dergleichen.
Die Reaktion kann bei einer Temperatur zwischen –20° und 0°C, vorzugsweise bei 0°C durchgeführt werden.
Verfahren D
Die Reduktion der Nitrogruppe(n) kann durch das Verfahren durchgeführt werden, das den Fachleuten bekannt ist; typischerweise durch katalytische Hydrierung unter Verwendung eines Katalysators wie z.B. Palladium-C, Platinoxid und dergleichen.
Die Reaktion kann bei Raumtemperatur in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol, Essigsäure und dergleichen durchgeführt werden.
Verfahren E und I
Die N-Acylierung von einer Aminogruppe, welche in R¹ oder R³ der Formel (I) vorkommt, kann durch das Verfahren, welches den Fachleuten bekannt ist, mit Säureanhydrid oder Car bamoylchlorid oder mit Carbonsäure unter Verwendung von Kondensationsmitteln wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid, BOP, HBTU, TNTU, PyBroP^TM, PyBOP^TM, TBTU, TSTU, HOBt und dergleichen, oder der Kombination von zwei von diesen durchgeführt werden.
Die Reaktion kann in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol, Pyridin, N,N-Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon und dergleichen in Gegenwart oder Abwesenheit einer Base wie z.B. Triethylamin, Diisopropylethylamin, Pyridin und dergleichen bei einer Temperatur zwischen –20°C und +50°C, vorzugsweise bei 0°C bis +25°C durchgeführt werden.
Die Entfernung der Aminoschutzgruppe, wenn eine N-geschützte Aminosäure für die Kondensationsreaktion verwendet wird, kann durch das Verfahren durchgeführt werden, welches den Fachleuten bekannt ist, z.B. die Behandlung mit Trifluoressigsäure für die Boc-Gruppe oder Piperidin für die Fmoc-Gruppe.
Verfahren F
Die N-Monoalkylierung einer Aminogruppe, welche in R¹ der Formel (I) vorliegt, kann durchgeführt werden, indem Acrylnitril, Ethoxymethylen-malononitril oder (1-Ethoxyethyliden)malononitril gemäß dem Verfahren verwendet werden, das in Organic Synthesis col. Vol. III, Seite 93, beschrieben wird, gefolgt von der Reduktion der resultierenden Nitrilgruppe durch katalytische Hydrierung oder Reduktion mit Natriumborhydrid/Cobaltchlorid, Boran-Methylsulfid-Komplex und dergleichen [siehe 1. Med. Chem., 37, 222 (1994)].
Verfahren G
Die N-Alkylierung der primären oder sekundären Aminogruppe, welche in R¹ der Formel (I) vorliegt, kann durch die herkömmliche reduktive Alkylierung mit Aldehydderivaten der Formel (V) unter Verwendung eines Reduktionsmittels wie z.B. Natriumcyanoborhydrid in Gegenwart oder Abwesenheit einer schwachen Säure wie z.B. Essigsäure durchgeführt werden.
Die Reaktion kann bei Raumtemperatur in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol, Essigsäure und dergleichen durchgeführt werden.
Verfahren H
Beispiele der Verbindung (R¹²-Q) der Formel (VI) für die Substitutionsreaktion sind 2-Brom-5-nitropyridin, 2-Chlorpyrimidin, Chlorpyrazin und dergleichen.
Die Substitutionsreaktion kann bei einer Temperatur zwischen –20°C und +50°C, vorzugsweise bei 0°C bis +25°C, in einem Lösungsmittel wie z.B. Acetonitril, N,N-Dimethylformamid und dergleichen in Gegenwart oder Abwesenheit eines Säurefängers wie z.B. Kaliumcarbonat, Triethylamin, Diisopropylethyamin und dergleichen durchgeführt werden.
Verfahren I
Die erste Mono-N-alkylierung einer Aminogruppe, welche in R¹ der Formel (I) vorliegt, kann durch die Methode, welche in Verfahren F beschrieben wird, durchgeführt werden. Die anschließende N-Acylierung kann durch die Methode, die in Verfahren E und I beschrieben wird, durchgeführt werden.
Verfahren K
Die Umwandlung einer Aminogruppe, welche in R¹ der Formel (I) vorliegt, in eine Guanidinogruppe kann durchgeführt werden durch ein aktiviertes Amidinderivat wie z.B. 3,5-Dimethyl-1H-pyrazol-1-carboxamidin, Formamidinsulfonsäure, Benztriazol-1-carboxamidiniumtosylat und dergleichen.
Die Reaktion kann in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol, Wasser, N,N-Dimethylformamid und dergleichen bei einer Temperatur zwischen 0°C und ~50°C, vorzugsweise bei 20°C bis ~30°C durchgeführt werden.
Verfahren L
Die O-Alkylierung einer Hydroxygruppe des Tyrosinrests in der Formel (I) kann durchgeführt werden durch das Verfahren, welches den Fachleuten bekannt ist, in Gegenwart eines Säurefängers wie z.B. Natriumcarbonat, Diisopropylethylamin und dergleichen [Org. Synth., Coll. Bd. IV 836 (1963)].
Die Reaktion kann in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol, Aceton, N,N-Dimethylformamid und dergleichen bei einer Temperatur zwischen 0°C und +50°C, vorzugsweise bei 0°C bis +25°C durchgeführt werden.
Verfahren M
Die Iodierung an der ortho-Position der Phenolgruppe in einem Tyrosinrest kann durch die Behandlung der Aerothricine der Formel (I), wobei R² Wasserstoff ist, mit Iodmonochlorid oder Natriumiodid/wässrigem Natriumhypochlorit in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol und dergleichen bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Die mit Palladium(0) katalysierte Kopplungsreaktion mit Kohlenmonoxid, Methylacrylat und dergleichen kann unter Verwendung eines Palladium(0)-Katalysators wie z.B. Pd(OAc)₂, Pd(OAc)₂(dppp)₂ in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol, N,N-Dimethylformamid, Acetonitril und dergleichen in Gegenwart einer Base wie z.B. Triethylamin bei einer Temperatur zwischen 20°C und +100°C, vorzugsweise bei 20°C bis +70°C, durchgeführt werden [Bioorg. Med. Chem. Lett., 7 (22), 2879 (1997)].
Verfahren N
Die Dehydratisierung der Carbamoylgruppe (R⁵) der Formel (I) kann über Burgess-Reagenz [erhältlich bei Aldrich], Cyanursäurechlorid, Oxalylchlorid und dergleichen durchgeführt werden [siehe J. Med. Chem, 37, 222 (1994)].
Die Reaktion kann in einem Lösungsmittel wie z.B. N,N-Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon und dergleichen bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Verfahren O
Die Reduktion der Carbamoyl- oder Cyanogruppe (R⁵) der Formel (I) kann durch Natriumborhydrid/Cobaltchlorid, Boran-Methylsulfid-Komplex und dergleichen durchgeführt werden [siehe J. Med. Chem, 37, 222 (1994)].
Die Reaktion kann in einem Lösungsmittel wie z.B. Methanol, Ethanol und dergleichen bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Verfahren P
Die Hydroxysulfonierung des Tyrosinrests der Formel (I) kann durch den Schwefeltrioxid-DMF-Komplex, Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex oder Schwefeltrioxid-Triethylamin-Komplex in einem Lösungsmittel wie z.B. N,N-Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon, 1,4-Dioxan, Tetrahydrofuran und dergleichen bei einer Temperatur zwischen –30 bis +70°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, durchgeführt werden [siehe J. Chem. Soc. Perkin Trans, (6) 1739 (1990)).
Verfahren O
Die Reaktionen, welche an diesem Verfahren beteiligt sind, können durch Methoden durchgeführt werden, die ähnlich sind zu denen, die in den Verfahren B – O beschrieben werden.
Das Ausgangsmaterial, ein lineares Peptid der Formel (IX), kann erhalten werden, indem ein Mikroorganismus, welcher zu Deuteromycotina gehört, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen oder einem festen Medium kultiviert wird und ein lineares Peptid der Formel (IX) aus der Kultur isoliert wird.
Die Mikroorganismen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können beliebige Stämme, einschließlich Mutanten und Varianten, die zu Deuteromycotina gehören, welche in der Lage sind, ein lineares Peptid der Formel (IX) zu produzieren, sein. Besonders bevorzugt ist der Stamm NR 7379, welcher aus abgefallenen Blättern isoliert wurde, die bei Kagoshima pref. in Japan gesammelt wurden, und welcher als ein Stamm, der zu Deuteromycotina gehört, identifiziert wurde.
Der Stamm, welcher als Deuteromycotina NR 7379 bezeichnet wird, wurde bei dem National Institute of Bioscience und Human-Technology, Agency of Industrial Science und Technology, Japan am 16. Juni 1998 unter dem Budapester Vertrag wie folgt hinterlegt: Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391).
Die Kultivierung gemäß dem Verfahren, das von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, kann in einem Kulturmedium durchgeführt werden, welches gebräuchliche Nährstoffe enthält, die von dem Mikroorganismus, welcher kultiviert wird, verwendet werden können. Als Kohlenstoffquellen können z.B. Glucose, Sucrose, Stärke, Glycerol, Molassen, Dextrin und Mischungen von diesen erwähnt werden. Stickstoffquellen sind z.B. Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Trockenhefe, Hefeextrakt, Maiseinweichflüssigkeit, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und Mischungen von diesen. Darüber hinaus können zu dem Kulturmedium andere organische oder anorganische Substanzen zur Förderung des Wachstums der Mikroorganismen und zur Erhöhung der Produktion eines linearen Peptids der Formel (IX) zugegeben werden. Beispiele für solche Substanzen sind anorganische Salze wie z.B. Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Phosphate und dergleichen.
Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise in einem flüssigen Medium, durch Submersfermentation oder in einem festen Medium durch statische Fermentation durchgeführt. Eine Temperatur von 20°C bis 30°C, mit einer optimalen Temperatur von 27°C, ist zur Kultivierung geeignet. Die Kultivierung wird vorzugsweise bei einem pH von 3 bis 9 durchgeführt. Die Kultivierungsdauer hängt von den Bedingungen ab, unter welchen die Kultivierung durchgeführt wird. Im Allgemeinen ist es ausreichend, die Kultivierung für 120 bis 672 h durchzuführen.
Zum Ernten des betroffenen linearen Peptids der Formel (IX) aus den Kulturen können Trennmethoden, welche gewöhnlich eingesetzt werden, um Metaboliten, die von Mikroben produziert wurden, aus deren Kulturen zu isolieren, geeignet verwendet werden. Beispielsweise wird ein lineares Peptid der Formel (IX), welches eine in Methanol extrahierbare amphotere Substanz ist, vorteilhaft durch die folgenden Vorgänge gewonnen.
Das heißt, die kultivierte Nährlösung, welche durch Flüssigfermentation erhalten wird, wird mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert, um das vorgeschlagene Produkt zu gewinnen. Die Lösungsmittel, welche verwendet werden können, um die betroffene Verbindung aus der kultivierten Nährlösung zu isolieren, umfassen wasserlösliche organische Lösungsmittel oder wasserhaltige Lösungen von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln wie z.B. Methanol, Ethanol und wasserhaltige Alkohole oder mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel wie z.B. n-BuOH.
Zum Entfernen von Salzen, wasserlöslichen Substanzen usw. aus dem resultierenden Extrakt wird vorteilhaft ein Ausschütteln zwischen Wasser und mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln wie z.B. n-Butanol, Ethylacetat usw. eingesetzt. Zum Entfernen von färbenden Substanzen, fettlöslichen Substanzen oder dergleichen aus dem Extrakt wird vorteilhaft eine Lösungsmittelreinigung durch Methanol, Ethanol, eine Mischung von Acetonitril-0,1 % wässriger Trifluoressigsäure usw. eingesetzt.
Zur vollständigen Reinigung eines linearen Peptids der Formel (IX) wird vorteilhaft eine Säulenchromatographie verwendet. Träger, die bei einer solchen Säulenchromatographie verwendet werden können, sind solche wie Capcel Pak C18 UG80 (Shiseido Co. LTD, Japan). Als ein Elutionsmittel wird ein Lösungsmittelsystem verwendet, welches aus einer Mischung von wässriger Trifluoressigsäure und geeigneten wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln wie z.B. Methanol, Ethanol, Acetonitril usw. besteht. Die so gereinigte Fraktion des Eluats, welche ein lineares Peptid der Formel (IX) enthält, kann einer Konzentrierung oder einem Gefriertrocknen unterzogen werden, um ein lineares Peptid der Formel (IX) zu pulverisieren.
Ein lineares Peptid der Formel (IX) wurde als ein Trifluoressigsäuresalz isoliert, aber das freie lineare Peptid der Formel (IX) kann durch das folgende Verfahren hergestellt werden. Das Trifluoressigsäuresalz des linearen Peptids der Formel (IX) wird nämlich in Wasser gelöst, zu welchem ein Äquivalent an Natriumhydroxid zugegeben wurde, und die Mischung wird einer Sephadex LH-20-Säulenchromatographie unterzogen, worauf die Elution mit einem wasserhaltigen Alkohol wie z.B. Methanol-Wasser usw. folgt, um dadurch ein lineares Peptid der Formel (IX) zu erhalten.
Das lineare Peptid der Formel (IX), welches durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, zeigt keine fungizide Aktivität gegenüber verschiedenen Pilzen, kann jedoch ein Schlüsselintermediat sein, um potente antifungale Mittel wie z.B. die Aerothricine zu produzieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Säureadditionssalze der Aerothricine. Das Säureadditionssalz kann nach einem normalen Verlauf der Isolation als ein Trifluoressigsäuresalz erhalten werden. Das so erhaltene Salz kann in Wasser gelöst werden und durch eine Anionenaustauschersäule geleitet werden, die das gewünschte Anion trägt. Das Eluat, welches das gewünschte Salz enthält, kann konzentriert werden, um das Salz als ein festes Produkt zu gewinnen.
Die Aerothricine der Formel (I) können mittels des Vorliegens der tertiären Stickstoffatome in ein entsprechendes Salz umgewandelt werden.
Das Säureadditionssalz der Aerothricine der Formel (I) kann durch Behandlung der freien Base der Aerothricine mit wenigstens einer stöchiometrischen Menge einer geeigneten Säure wie z.B. Mineralsäuren, z.B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und dergleichen, und organischen Säuren, z.B. Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Pyruvinsäure, Oxalsäure, Äpfelsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und dergleichen, erhalten werden. Typischerweise wird die freie Base in einem inerten organischen Lösungsmittel wie z.B. Ethanol, Methanol und dergleichen gelöst und die Säure in einem ähnlichen Lösungsmittel zugegeben. Die Temperatur wird bei ca. 40°C gehalten. Das resultierende Salz fällt spontan aus oder kann mit einem weniger polaren Lösungsmittel aus der Lösung geholt werden.
Die Säureadditionssalze der Aerothricine der Formel (I) können durch Behandlung mit wenigstens einer stöchiometrischen Menge einer geeigneten Base wie z.B. Natrium- oder Kaliumhydroxid, Kaliumcarbonat, Natriumbicarbonat, Ammoniak und dergleichen in die entsprechende freie Base umgewandelt werden.
Die obigen Aerothricine zeigen eine breite fungizide Aktivität gegenüber verschiedenen Pilzen und können als Mittel zur Behandlung und Prophylaxe von infektiösen Pilzerkrankungen verwendet werden. Die antifungale Aktivität in vitro und in vivo (siehe Tabellen 2 und 3) wie auch die Toxizität für Hepatozyten (siehe Tabelle 4) der repräsentativen Aerothricine der Formel (I) werden wie folgt gezeigt:
1. Antifungale Aktivitäten in vitro
Die antifungalen Aktivitäten in vitro der repräsentativen Aerothricine der vorliegenden Untersuchung wurden ausgewertet, indem die 50% inhibitorische Konzentration (IC₅₀) bestimmt wurde, welche berechnet wurde als die niedrigste Konzentration eines antifungalen Mittels, um das Wachstum eines Pilzes, im spektrophotometrischen Vergleich zum Wachstum von arzneimittelfreien Kontrollen, auf 20% Trübung zu inhibieren.
Die IC₅₀-Werte wurden durch das Nährlösungsmikroverdünnungsverfahren bestimmt, welches auf dem NCCLS Approved Standard basiert, mit den folgenden kleineren Modifikationen (National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1997) Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing for yeasts. Approved standard. Document M27-A). Hefe-Stickstoffbase (YNB; Difco Lab.), ergänzt mit 1 % Glucose und 0,25% K₂HPO₄, wurde als Testmedium für Hefe verwendet, wobei dasselbe Medium, verfestigt mit 0,2% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (BRL), für filamentöse Pilze verwendet wurde. Die Größe des Inokulums betrug 1–3 × 10⁴ Zellen/ml, und die Inkubation wurde für 1–2 Tage bei 35°C durchgeführt.
Table 2: Antifungale Aktivität in vitro, IC₅₀ (μg/ml)
2. Antifungale Wirksamkeit in vivo
2–1: Systemische Candidiasis bei Mäusen

Die antifungale Wirksamkeit in vivo der Aerothricine der vorliegenden Erfindung gegen systemische Candidiasis ist in der folgenden Tabelle 3–1 gezeigt. Mäuse von einem herkömmlichen immunkompetenten Mäusestamm, Crj: CD-1 (ICR) wurden als experimentelle Infektionsmodelle der systemischen Candidiasis verwendet. 4 Wochen alte Crj: CD-1 (ICR)-Mäuse wurden zur systemischen Candidiasis verwendet, indem Candida albicans 5 × 10⁶ Konidien/Maus über die Schwanzvene injiziert wurden. Die Behandlungen wurden für die systemische Candidiasis zweimal (0,4 h nach der Infektion) am ersten Tag und einmal täglich an den folgenden 2 Tagen (b.i.d × 1 Tag, gefolgt von q.d. × 2 Tage), intravenös (i.v.), durchgeführt. 50%-Werte der wirksamen Dosis (ED₅₀) wurden aus der Überlebenszahl bei jeder Dosis am Tag 14 berechnet. Table 3–1: Antifungale Aktivität in vivo gegen systemische Candidiasis bei Mäusen, ED₅₀ (mg/kg) am Tag 14

Aerothricin 5	0,3
Aerothricin 16	0,3
Aerothricin 18	0,6
Aerothricin 36	0,6
Aerothricin 41	0,3
Aerothricin 42	0,6
Aerothricin 45	0,3
Aerothricin 46	0,4
Aerothricin 50	<0,3
Aerothricin 55	<0,3

Aerothricin 65

0,6

2–2: Pulmonale Aspergillosis bei Mäusen
Die antifungale Aktivität in vivo von Aerothricinen der vorliegenden Erfindung gegen pulmonale Aspergillosis ist der folgenden Tabelle 3–2 gezeigt. Pulmonale Aspergillosis bei Mäusen wurde bei Cortison-behandelten (250 mg/kg, zweimalige subkutane Behandlungen 3 Tage vor und am Tag der Infektion) männlichen ICR-Mäusen erzeugt. Diese Mäuse wurden intratracheal mit Konidien von A. fumigatus (2,5 × 10⁵ Konidien/Maus) infiziert, und Behandlungen wurden einmal täglich für 4 Tage durchgeführt. Die Wirksamkeit jedes Arzneimittels wurde aus der Überlebenszahl bestimmt, und die zu 50% wirksame Dosis (ED₅₀) wurde aus der Überlebenszahl bei jeder Dosis am 14. Tag berechnet. Table 3–2: Antifungale Aktivität in vivo gegen pulmonale Aspergillosis bei Mäusen, ED₅₀ (mg/kg) am Tag 14

Aerothricin 132 5,2

Aerothricin 134 5,8

Aerothricin 135 8,6
3. In vitro-Hepatotoxizitätstest

Die Mäusehepatozyten wurden durch einen Collagenaseverdau isoliert und in Mikrotestplatten kultiviert. Die Hepatozyten-Monolayer wurden den Testaerothricinen in dem Kultursystem für 1 Tag ausgesetzt. Nach dem Kultivierungszeitraum wurden die Hepatozyten unter einem Mikroskop beobachtet und morphologisch ausgewertet. Der Grad der morphologischen Veränderung (Degeneration) der Hepatozyten durch die Testaerothricine wurde mit WF11243 und LY303366 verglichen. Tabelle 4: Zytotoxizität für Hepatozyten (μg/ml)

Aerothricin 14	>100
Aerothricin 15	>100
Aerothricin 21	>100

Aerothricin 34	>100
Aerothricin 38	>100
Aerothricin 45	>100
Aerothricin 47	>100
Aerothricin 48	>100
Aerothricin 53	>100
Aerothricin 65	>100
Aerothricin 67	>100
Aerothricin 72	>100
Aerothricin 81	>100
Aerothricin 132	>100
Aerothricin 134	>100
Aerothricin 135	>100
WF11243 (= Aerothricin 3)	100
LY303366	10

Die Verabreichung von 5 mg/kg und 30 mg/kg Aerothricin 1 an Mäuse für 4 Wochen zeigte keine akute Toxizität.
Daher zeigen die neuen Aerothricine der Formel (I) wie auch pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen bei Mäusen über einen weiten Bereich der Dosierungen hinweg eine starke antifungale Aktivität gegenüber verschiedenen Pilzinfektionen, einschließlich Aspergillosis, und sind als antifungale Mittel nützlich. Darüber hinaus sind die Aerothricine, welche durch diese Erfindung bereitgestellt werden, für Hepatozyten viel weniger zytotoxisch als die bekannten cyclischen Peptidderivate (WF11243 und LY303366).
Die Aerothricine der vorliegenden Erfindung können ebenfalls nützlich sein, um Pneumocystis carinii-Infektionen bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem zu inhibieren oder abzuschwächen.
Die neuen Aerothricine der Formel (I) wie auch pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen sind hochwirksame fungizide Mittel. Sie sind wirksam gegenüber einer Vielzahl von Pilzspe zies, einschließlich Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Mucor spp. und Absidia spp.
Das tägliche Dosierungsniveau der Aerothricine der Formel (I) beträgt von 0,1 bis 50 mg/kg (in unterteilten Dosen), wenn sie entweder auf oralem oder parenteralem Weg verabreicht werden. Somit kann erwartet werden, dass Tabletten oder Kapseln der Aerothricine zur Verabreichung einzeln oder, wie angemessen, von zwei oder mehreren von 5 mg bis 0,5 g der aktiven Verbindung enthalten. In jedem Fall kann die tatsächliche Dosierung von dem Arzt bestimmt werden und sie kann in Abhängigkeit vom Alter, Gewicht und der Reaktion des bestimmten Patienten variiert werden.
Daher ist eine bevorzugte Ausführungsform der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung eine nasal verabreichbare Zusammensetzung, welche ein physiologisch aktives cyclisches Peptid und einen physiologisch verträglichen pulverförmigen oder kristallinen mehrwertigen Metallträger umfasst, wobei eine wirksame Menge von irgendeinem der cyclischen Peptide, wie z.B. Cyclosporin A, Vancomycin, Daptomycin, Aerothricine, Echinocandine und Pneumocandine, in Gegenwart eines Absorptionsverstärkers, dessen mittlere Partikelgröße nicht mehr als 250 μm, vorzugsweise von 20 μm bis 180 μm beträgt, homogen in dem mehrwertigen Metallträger dispergiert wird und homogen an diesem adsorbiert wird, wobei dessen mittlere Partikelgröße in dem Bereich von 20 bis 250 μm, vorzugsweise in dem Bereich von 20 bis 100 μm und noch bevorzugter in dem Bereich von 20 bis 60 μm liegt.
Somit ist eine bevorzugte Ausführungsform der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung des physiologisch aktiven cyclischen Peptids in Pulverform, welche zu einem nasal verabreichbaren Präparat formuliert ist, bei welchem eine physiologisch wirksame Menge eines cyclischen Peptids in Gegenwart eines Absorptionsverstärkers, welcher ausgewählt ist aus einem feinen Pulver von Reis, Klebreis, Stärke, Gelatine, Dextrin, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Eigelblecithin, Gummi arabicum, Tragacanth und einer Mischung von diesen, homogen in einem zweiwertigen Metallträger dispergiert wird und an diesem adsorbiert wird, welcher ausgewählt ist aus einer Aluminiumverbindung, Calciumverbindung, Magnesiumverbindung, Siliciumverbindung, Eisenverbindung und Zinkverbindung, deren mittlere Partikelgröße nicht mehr als 250 μm, vorzugsweise nicht mehr als 100 μm und noch bevorzugter 20 μm bis 60 μm beträgt. Insbesondere ist der Absorptionsverstärker ein feines Pulver von Klebreis, Stärke, Gelatine, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Tragacanth und einer Mischung von diesen. Der am meisten bevorzugte Absorptionsverstärker ist ein feines Pulver von Klebreis. Die mittlere Partikelgröße des Absorptionsverstärkers beträgt nicht mehr als 250 μm, vorzugsweise von 20 μm bis 180 μm.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine nasal verabreichbare physiologisch aktive Zusammensetzung in Pulverform, in welcher eine physiologisch wirksame Menge eines cyclischen Peptids in Gegenwart eines Absorptionsverstärkers, welcher ausgewählt ist aus dem feinen Pulver von Reis, Klebreis, Stärke, Gelatine, Dextrin, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Eigelblecithin, Gummi arabicum, Tragacanth und einer Mischung von diesen, und am meisten bevorzugt dem feinen Pulver von Klebreis, homogen dispergiert und adsorbiert wird an einem Träger, welcher ausgewählt ist aus Hydroxylapatit, Calciumcarbonat, Calciumlactat, Magnesiumstearat, vorzugsweise Calciumcarbonat, dessen mittlere Partikelgröße in dem Bereich von 20 bis 100 μm liegt. Die mittlere Partikelgröße des Absorptionsverstärkers beträgt nicht mehr als 300 μm, vorzugsweise von 20 μm bis 180 μm.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine nasal verabreichbare physiologisch aktive Zusammensetzung in Pulverform, in welcher eine physiologisch wirksame Menge eines cyclischen Peptids homogen in und adsorbiert an dem organischen Träger vorliegt, welcher ausgewählt ist aus dem feinkörnigen Pulver von Reis, Weizen, Buchweizen, Gerste, Sojabohne, Mais, Hirse, Kolbenhirse und dergleichen. Die mittlere Partikelgröße des organischen Trägers beträgt nicht mehr als 300 μm, vorzugsweise von 20 μm bis 180 μm.
Weiterhin ist die am meisten bevorzugte Ausführungsform der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung eine nasal verabreichbare antifungale Zusammensetzung eines cyclischen Peptids in Pulverform, in welcher eine physiologisch wirksame Menge eines Peptids, das ausgewählt ist aus Aerothricinen, Echinocandinen und Pneumocandinen, in Gegenwart eines Absorptionsverstärkers, der ausgewählt ist aus dem feinen Pulver von Reis, Klebreis, Stärke, Gelatine, Dextrin, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Eigelblecithin, Gummi arabicum und Tragacanth, vorzugsweise Klebreis, dessen mittlere Partikelgröße nicht mehr als 250 μm, vorzugsweise von 20 μm bis 180 μm beträgt, oder einer Mischung von diesen, homogen in einem Träger dispergiert wird und an diesem adsorbiert wird, welcher ausgewählt ist aus Hydroxylapatit, Calciumcarbonat, Calciumlactat, Magnesiumstearat, vorzugsweise Calciumcarbonat, dessen mittlere Partikelgröße von 20 μm bis 60 μm reicht.
Die physiologisch wirksame Menge des cyclischen Peptids, das in der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten sein soll, kann mit Faktoren wie z.B. der aktiven Substanz, die ausgewählt werden soll, der zu behandelnden Krankheit, der gewünschten Anzahl an Verabreichungen, der gewünschten Wirkung der Therapie usw. variieren. Wenn die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung durch die Nasenhöhle verabreicht wird, kann die physiologisch wirksame Menge des cyclischen Peptids auf der Basis eines Vergleichs von deren Bioverfügbarkeit in Bezug auf andere bekannte Präparate, welche dieselbe aktive Substanz enthalten, bestimmt werden.
Die physiologisch aktive cyclische Peptidzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein physiologisch aktives cyclisches Peptid in einem Anteil von ungefähr 5% bis ungefähr 50%, vorzugsweise von ungefähr 10% bis ungefähr 40%, insbesondere von ungefähr 20% bis ungefähr 30%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Präparats, enthalten.
Die Zusammensetzung des physiologisch aktiven Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein hohes Ausmaß an nasaler Absorption erreichen, wenn diese einen Träger (z.B. Hydroxylapatit, Calciumcarbonat, Calciumlactat, Magnesiumstearat als typischer Träger) in einem Anteil von 50% bis ungefähr 95%, vorzugsweise von ungefähr 60% bis ungefähr 95%, insbesondere von ungefähr 70% bis ungefähr 90%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Präparats, enthält.
Die Zusammensetzung des physiologisch aktiven Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein hohes Ausmaß an nasaler Absorption erreichen, wenn diese einen Absorptionsverstärker (z.B. ein feines Pulver von Reis, Klebreis, Maisstärke und Hydroxypropylcellulose-H als ein typischer Verstärker) in einem Anteil von 0,5% bis ungefähr 15%, vorzugsweise von ungefähr 1 % bis ungefähr 10%, insbesondere von ungefähr 1 % bis ungefähr 5%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Präparats, enthält.
Die Zusammensetzung des physiologisch aktiven Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden, indem eine physiologisch wirksame Menge des cyclischen Peptids in einem physiologisch verträglichen pulverförmigen oder kristallinen Träger, welcher entweder ein mehrwertiges Metall oder einen organischen Träger enthält, vorzugsweise in einem physiologisch verträglichen pulverförmigen oder kristallinen wasserunlöslichen mehrwertigen Metallträger mit einer mittleren Partikelgröße in dem Bereich von 20 bis 250 μm, in Gegenwart eines Absorptionsverstärkers, dessen mittlere Partikelgröße nicht mehr als 250 μm, vorzugsweise von 20 bis 180 μm beträgt, homogen dispergiert wird und die aktive Substanz darauf adsorbiert wird.
Um beispielsweise die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen, wird ein antifungales cyclisches Peptid als aktive Substanz mit einem Träger [z.B. Hydroxylapatit, Calciumcarbonat oder Calciumlactat als Calciumverbindung; Magnesiumstearat als Magnesiumverbindung; oder Aluminiumhydroxid als Aluminiumverbindung] und einem Absorptionsverstärker [z.B. einem feinen Pulver von Reis, Klebreis, Stärke, Gelatine, Dextrin, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Eigelblecithin, Gummi arabicum, Tragacanth oder einer Mischung von diesen] gemischt. Dann wird destilliertes Wasser zu der Mischung in einem Anteil von 10% bis ungefähr 60%, vorzugsweise von ungefähr 10% bis ungefähr 40%, insbesondere von ungefähr 10% bis ungefähr 30%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Präparats, zugegeben und gut gemischt, bis die Mischung pastös fest wird. Die Mischung wird dann bei einer Temperatur zwischen –5 und –30°C in vacuo getrocknet oder gefriergetrocknet. Der resultierende pulverförmige Rückstand wird, wenn nötig, mit einem Gleitmittel wie z.B. Calciumstearat in einem Anteil von 0,1% bis ungefähr 5%, vorzugsweise von ungefähr 1% bis ungefähr 5%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Präparats, gemischt und durch ein Sieb mit 180 bis 250 μm, vorzugsweise 180 μm im Durchmesser, geführt.
Der Träger, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, kann eine mittlere Partikelgröße von 20 bis 250 μm, vorzugsweise von 20 bis 100 μm und insbesondere von ungefähr 20 μm bis ungefähr 60 μm aufweisen. Andererseits ist es bevorzugt, dass das physiologisch aktive cyclische Peptid zu den kleinstmöglichen Partikeln pulverisiert wird, wobei die mittlere Partikelgröße kleiner als 20 μm, vorzugsweise kleiner als 10 μm ist.
Insbesondere wird, wenn Aerothricin als antifungales cyclisches Peptid ausgewählt wird, eine physiologisch wirksame Menge des Aerothricins mit Calciumcarbonat gemischt. Dann wird destilliertes Wasser zu der Mischung in einem Anteil von ungefähr 10% bis ungefähr 30%, vorzugsweise ungefähr 25%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Präparats, zugegeben und gut gemischt, bis die Mischung pastös fest wird. Die Mischung wird dann bei einer Temperatur zwischen –5 und –30°C in vacuo getrocknet oder gefriergetrocknet. Calciumstearat oder Magnesiumstearat wird als ein Gleitmittel zu dem resultierenden pulverförmigen Rückstand in einem Anteil von 0,1 % bis ungefähr 5%, vorzugsweise von ungefähr 1 % bezogen auf das Gesamtgewicht des Präparats zugegeben und durch das Sieb mit 180 bis 250 μm, vorzugsweise 180 μm im Durchmesser, geführt.
In einer anderen Ausführungsform, wenn Aerothricin als antifungales cyclisches Peptid und Klebreispulver als ein Absorptionsverstärker ausgewählt wird, wird eine physiologisch wirksame Menge des Aerothricins mit Calciumcarbonat und einem feinen Pulver von Klebreis gemischt. Dann wird destilliertes Wasser zu der Mischung in einem Anteil von ungefähr 25%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Präparats, zugegeben und gut gemischt, bis die Mischung pastös fest wird. Die Mischung wird dann bei einer Temperatur von –5 bis –30°C in vacuo getrocknet oder gefriergetrocknet. Calciumstearat oder Magnesiumstearat wird als ein Gleitmittel zu dem resultierenden pulverförmigen Rückstand in einem Anteil von 0,1% bis ungefähr 5%, vorzugsweise von ungefähr 1%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Präparats, zugegeben und durch das Sieb mit 180 bis 250 μm, vorzugsweise 180 μm im Durchmesser, geführt.
Um einen Verlust der Aktivität des physiologisch aktiven cyclischen Peptids zu verhindern, kann die nasal verabreichbare Zusammensetzung dann in Kapseln eines Typs mit wenig Fett gefüllt werden und in einer geeigneten Form, vorzugsweise in einer geschlossenen Form, verpackt werden, indem einem Blisterverpackung mit einer Aluminiumverpackung kombiniert wird.
Die absolute Bioverfügbarkeit (=AUC (i. n.)/AUC (i. v.)) der repräsentativen nasal verabreichbaren antifungalen cyclischen Peptidzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung wurde in Affen nach einmaliger intranasaler Verabreichung bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Die Herstellung von jeder Zusammensetzung wird in den Arbeitsbeispielen beschrieben. Eine nasal anwendbare Zusammensetzung der antifungalen cyclischen Peptide wurde Meerkatzen intranasal verabreicht, wobei ein Jetmizer bei einer Dosis von 80 mg (Gesamtgewicht der Zusammensetzung, welche 20 mg der aktiven Substanz enthielt)/Körper verwendet wurde. Blutproben wurden über eine Vene der Gliedmaßen in heparinisierten Spritzen vor Gabe der Dosis und nach 10 min, 30 min, 1, 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden nach den Verabreichungen entnommen. Die Arzneimittelkonzentration wurde mittels LC-MS gemessen. Um die Bioverfügbarkeit zu berechnen, wurden 20 mg der entsprechenden aktiven Substanz dem Affen intravenös (i. v.) verabreicht, und der Wert der Fläche unter der Kurve (AUC) wurde mit dem verglichen, der nach der intranasalen (i. n.) Verabreichung erhalten wurde.
Tabelle 5
Die höchste absolute Bioverfügbarkeit wurde erreicht, wenn die nasal verabreichbare Zusammensetzung des antifungalen cyclischen Peptids, die aus Calciumcarbonat und Klebreispulver bestand (Beispiel 33), verwendet wird. Die Plasmakonzentration der aktiven Substanz überschritt die therapeutische Konzentration bei der oben erwähnten Dosierung für 24 Stunden.
Daher kann die nasal verabreichbare Zusammensetzung des physiologisch aktiven cyclischen Peptids in der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Krankheiten wie z.B. systemischen Pilzinfektionen verwendet werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen einige bevorzugte physiologisch aktive cyclische Peptide, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie auch bevorzugte Verfahren zur Herstellung der nasal verabreichbaren Zusammensetzung des physiologisch aktiven cyclischen Peptids in der vorliegenden Erfindung.
In den folgenden Beispielen wurden die Produkte durch HPLC analysiert und gereinigt, wobei eine Umkehrphasensäule verwendet wurde, welche aus den nachstehend aufgelisteten ausgewählt wurde. Das gemischte Lösungsmittel bestand aus 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser 0,005% Trifluoressigsäure-Acetonitril, wobei das geeignete Verhältnis in jedem Arbeitsbeispiel beschrieben wird.
HPLC-Säule:

Säule A: CAPCELL PAK18, UG-120, 4,6 × 250 nm
Säule B: CAPCELL PAK18, UG-120, 10 × 250 nm
Säule C: CAPCELL PAK18, UG-80, 20 × 250 nm
Säule D: CAPCELL PAK18, SG-120, 4,6 × 250 nm
Säule E: CAPCELL PAK18, SG-120, 10 × 250 nm
Säule F: ODS-80Ts, 10 × 250 nm

In den folgenden Arbeitsbeispielen wurden, wenn nichts anderes angegeben ist, die Aerothricine als Trifluoressigsäuresalze erhalten.
Beispiel 1
Herstellung von (R)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)-pentansäure
a) Herstellung von 4-Brom-4'-heptyloxybiphenyl
Zu einer gerührten Lösung von 4-Brom-4'-hydroxybiphenyl (5,05 g, 20,2 mmol) in DMF (100 ml) wurden K₂CO₃ (4,20 g, 30,4 mmol) und 1-Bromheptan (4,14 ml, 26,4 mmol) zugegeben, und dann wurde die Mischung bei 80°C erwärmt. Nachdem sie bei 80°C für 20 h gerührt worden war, wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Mischung wurde mit Et₂O (250 ml) verdünnt, und dann wurde die Lösung mit gesätt. Salzlösung (150 ml × 2) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde aus CH₂Cl₂-Petrolether umkristallisiert, was 4-Brom-4'-heptyloxybiphenyl (6,21 g, 88%) als einen weißen Feststoff ergab;
FAB-MS: m/z 347 [MH⁺].
b) Herstellung von 4-Formyl-4'-heptyloxybiphenyl
Zu einer kalten (0°C) gerührten Lösung von 4-Brom-4'-heptyloxybiphenyl (6,21 g, 17,9 mmol) in THF (120 ml) wurde n-BuLi (1,66 M Lösung in Hexan, 32,3 ml, 53,6 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung bei 0°C für 20 min gerührt worden war, wurde DMF (4,85 ml, 62,6 mmol) bei –78°C zugegeben. Die Mischung wurde bei –78°C für weitere 20 min gerührt und dann mit gesätt. wässrigem NH₄Cl gequencht. Die Mischung wurde mit EtOAc (220 ml) verdünnt und dann nacheinander mit gesätt. wässrigem NH₄Cl (125 ml) und gesätt. Salzlösung (100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (EtOAc/Hexan, 1:20) gereinigt, was 4-Formyl-4'-heptyloxybiphenyl (2,21 g, 42%) als ein weißes amorphes Pulver ergab.
c) Herstellung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)acrylsäureethylester
Zu einer gerührten Lösung von 4-Formyl-4'-heptyloxybiphenyl (2,21 g, 7,46 mmol) in Benzol (40 ml) wurde Ph₃P=CHCOOEt (5,19 g, 14,9 mmol) zugegeben, und dann wurde die Mischung bei 60°C erwärmt. Nachdem sie bei 60°C für 3 h gerührt worden war, wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (CH₂Cl₂/Hexan, 1:2) gereinigt, was 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)acrylsäureethylester (2,66 g, 97%) als ein weißes amorphes Pulver ergab.
FAB-MS: m/z 367 [MH⁺],
¹H-NMR: δ 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,25–1,55 (m, 8H), 1,35 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 1,81 (quint, J = 6,6 Hz, 2H), 4,00 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 4,28 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 6,46 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 6,94–7,00 (m, 2H), 7,50–7,60 (m, 6H), 7,72 (d, J = 16,0 Hz, 1H).
d) Herstellung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propionsäureethylester
Zu einer gerührten Lösung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)acrylsäureethylester (2,65g, 7,23 mmol) in CH₂Cl₂ (60 ml) wurde Palladium auf aktiviertem Kohlenstoff (Pd ca. 10 Gew.% 1,07 g) zugegeben, und dann wurde die Mischung unter eine H₂-Atmosphäre gesetzt. Nachdem sie für 2 h gerührt worden war, wurde die Mischung durch ein Celite-Kissen filtriert und mit CH₂Cl₂ gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt und in vacuo konzentriert, was 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propionsäureethylester (roh, 2,74 g) ergab, welcher für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
¹H-NMR: δ 0,90 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1,25 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 1,29–1,56 (m, 8H), 1,75–1,86 (m, 2H), 2,65 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 2,98 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 3,99 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 4,14 (q, J = 7,3 Hz, 2H), 6,93–6,98 (m, 2H), 7,25 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,43–7,52 (m, 4H).
e) Herstellung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propan-1-ol
Zu einer kalten (0°C) gerührten Suspension von LiAlH₄ (0,47 g, 12,4 mmol) in THF (20 ml) wurde eine Lösung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propionsäureethylester (roh, 2,74 g) in THF (30 ml) zugegeben. Nachdem sie für 30 min bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Mischung mit H₂O bei 0°C gequencht. Die Mischung wurde durch ein Celite-Kissen filtriert und mit CH₂Cl₂ gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (EtOAc/Hexan, 2:3) gereinigt, was 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propan-1-ol(2,27 g, 96% für 2 Schritte) als ein weißes amorphes Pulver ergab.
EI-MS: m/z 326 [M⁺],
¹H-NMR: δ 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,21–1,55 (m, 8H), 1,81 (quint, J = 6,6 Hz, 2H), 1,86–2,00 (m, 2H), 2,75 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 3,71 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,99 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 6,92–7,00 (m, 2H), 7,25 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,44–7,55 (m, 4H).
f) Herstellung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propionaldehyd
Zu einer kalten (0°C) gerührten Lösung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propan-1-ol(2,26 g, 6,92 mmol) in CH₂Cl₂ (60 ml) wurden ein Pulver von Molekularsieben 4A (5,17 g) und PCC (5,25 g, 24,4 mmol) zugegeben. Nachdem sie für 2 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde Et₂O (20 ml) zu der Mischung zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde in eine kurze Kieselgelsäule überführt und mit CH₂Cl₂ eluiert. Das Eluat wurde in vacuo kon zentriert, was 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propionaldehyd (roh, 2,45 g) ergab, welcher ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet wurde.
g) Herstellung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)pent-2-ensäure-tert.-butylester
Zu einer gerührten Lösung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)propionaldehyd (roh, 2,45 g) in Benzol (150 ml) wurde Ph₃P=CHCOOt-Bu (5,21 g, 13,8 mmol) zugegeben, und dann wurde die Mischung bei 60°C erwärmt. Nachdem sie für 30 min bei 60°C erwärmt worden war, wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (EtOAc/Hexan, 1:30) gereinigt, was 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)pent-2-ensäure-tert.-butylester (1,95 g, 67% für 2 Schritte) als ein weißes amorphes Pulver ergab.
EI-MS: m/z 422 [M⁺],
¹H-NMR: δ 0,90 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1,21–1,51 (m, 8H), 1,49 (s, 9H), 1,74–1,87 (m, 2H), 2,47–2,58 (m, 2H), 2,79 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 3,99 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 5,81 (d.t., J = 1,5 Hz, 15,5 Hz, 1H), 6,87–7,01 (m, 3H), 7,23 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,44–7,53 (m, 4H).
h) Herstellung von (R)-3-[Benzyl-((R)-1-phenylethyl)amino]-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert.-butylester
Zu einer kalten (0°C) gerührten Suspension von (R)-N-Benzyl-1-phenylethylaminhydrochlorid (3,28 g, 13,2 mmol) in THF (40 ml) wurde n-BuLi (1,61 M Lösung in Hexan, 15,0 ml, 24,2 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung für 25 min bei 0°C gerührt worden war, wurde eine Lösung von 3-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)pent-2-ensäure-tert.-butylester (1,94 g, 4,38 mmol) in THF (30 ml) bei –78°C zugegeben. Nachdem die Mischung für weitere 20 min bei –78°C gerührt worden war, wurde die Reaktionsmischung mit gesätt. wässrigem NH₄Cl gequencht und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde mit gesätt. wässrigem NH₄Cl (200 ml) verdünnt und dann mit CH₂Cl₂ (200 ml × 2) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (EtOAc/Hexan, 1:40) gereinigt, was (R)-3-[Benzyl-((R)-1-phenylethyl)amino]-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert.-butylester (2,83 g, quant.) als ein farbloses Öl ergab.
EI-MS: m/z 633 [M⁺],
¹H-NMR: δ 0,91 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1,24–1,55 (m, 13H), 1,38 (s, 9H), 1,57–2,04 (m, 6H), 2,52–2,69 (m, 1H), 2,97–3,10 (m, 1H), 3,37–3,49 (m, 1H), 3,55 (ABq, J = 15,0 Hz, 1H), 3,85 (ABq, J = 15,0 Hz, 1H), 3,88 (q, J = 6,9 Hz, 1H), 4,00 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,16 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,21–7,53 (m, 16H).
i) Herstellung von (R)-3-Amino-5-(4'-Heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert.-butylester
Zu einer gerührten Lösung von (R)-3-[Benzyl-((R)-1-phenylethyl)amino]-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert.-butylester (2,82 g, 4,45 mmol) in EtOAc (50 ml) wurden AcOH (2,5 ml) und Pd(OH)₂ auf Kohlenstoff (Pd(OH)₂ ca. 20 Gew.-%, 1,07 g) zugegeben, und dann wurde die Mischung unter eine H₂-Atmosphäre gesetzt. Nachdem sie für 15 h gerührt worden war, wurde die Mischung durch ein Celite-Kissen filtriert und mit MeOH gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt und in vacuo konzentriert, was (R)-3-Amino-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert.-butylester (roh, 3,14 g) ergab, welcher für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
j) Herstellung von (R)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert.-butylester
Zu einer gerührten Suspension von (R)-3-Amino-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert.-butylester (roh, 3,14 g) in 50% wässrigem 1,4-Dioxan (40 ml) wurden Na₂CO₃ (1,19 g, 11,2 mmol) und FmocCl (1,28 g, 4,95 mmol) zugegeben. Nachdem sie für 1 h gerührt worden war, wurde die Mischung mit gesätt. Salzlösung (100 ml) verdünnt und mit CH₂Cl₂ (100 ml × 3) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und in vacuo konzentriert, was (R)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert.-butylester (roh, 3,34 g) ergab, welcher für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
FAB-MS: m/z 668 [M⁺ + Li],
1H-NMR: δ 0,81 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1,15–1,44 (m, 8H), 1,35 (s, 9H), 1,62–1,93 (m, 4H), 2,29–2,68 (m, 4H), 3,84–4,02 (m, 1H), 3,88 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 4,13 (t, J = 6,8 Hz, 1H), 4,25–4,41 (m, 2H), 5,27 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 6,85 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,06–7,42 (m, 10H), 7,51 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 7,66 (d, J = 7,6 Hz, 2H).
k) Herstellung von (R)-3-(9-Fluorenylmethyloxycarbonylamino)-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure
Zu einer gerührten Lösung von (R)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl-amino)-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure-tert.-butylester (roh, 3,34 g) in CH₂Cl₂ (20 ml) wurde tropfenweise TFA (20 ml) zugegeben. Nachdem sie für 1 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Mischung in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (MeOH/CH₂Cl₂, 1:20) gereinigt, was (R)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-5-(4'-heptyloxybiphenyl-4-yl)pentansäure (2,07 g, 77% in 3 Schritten) als ein weißes amorphes Pulver ergab.
FAB-MS: m/z 606 [MH⁺],
¹H-NMR: δ 0,88 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1,21–1,51 (m, 8H), 1,64–2,04 (m, 2H), 1,78 (q, J = 6,6 Hz, 2H), 2,27–2,78 (m, 4H), 3,91–4,07 (m, 1H), 3,96 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 4,20 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 4,34–4,56 (m, 2H), 5,09–5,28 (m, 1H), 6,92 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,10–7,49 (m, 10H), 7,57 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 7,73 (d, J = 7,3 Hz, 2H).
Die Ausgangsverbindungen der Formel (IV) [wobei Y eine Einfachbindung oder -CH₂- ist], welche in dem Verfahren B verwendet werden, wurden gemäß einem Verfahren, das zu dem oben beschriebenen ähnlich war, hergestellt.
Beispiel 2
Herstellung von (S)-3-(9H-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-N-undecylsuccinamidsäure
a) Zu einer Lösung von (S)-2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)bernsteinsäure (150 mg, 0,36 mmol), BOP-Reagenz (162 mg, 0,36 mmol) und HOBT-Hydrat (56 mg, 0,36 mmol) in N,N-Dimethylformamid (0,2 ml) wurde N,N-Diisopropylethylamin (64 μl, 0,36 mmol) zugegeben. Nachdem diese für 30 min bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde 1-Aminoundecan (79 μl, 0,37 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 3 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt und mit Et₂O extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Die Reinigung des Rückstands durch Kieselgelsäulenchromatographie (unter Verwendung von n-Hexan:Ethylacetat = 3:1 als Elutionsmittel) ergab (S)-3-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-N-undecylsuccinamidsäure-tert.-butylester (169 mg, 82% Ausbeute) als einen farblosen amorphen Feststoff.
FAB-MS (m/z): 565 [MH⁺],
¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0,88 (3H, t, J = 7 Hz), 1,24 (16H, m), 1,45 (11H, m), 2,58 (1H, dd, J₁= 17 Hz, J₂ = 7 Hz), 2,91 (1H, dd, J₁ = 17 Hz, J₂ = 4 Hz), 3,23 (2H, q, J = 7 Hz), 4,22 (1H, t, J = 7 Hz), 4,424,45 (3H, m), 5,94 (1H, breites d, J = 8 Hz), 6,43 (1H, breites s), 7,31 (2H, t, J = 7 Hz), 7,41 (2H, t, J = 7 Hz), 7,58 (2H, d, J = 7 Hz), 7,77 (2H, d, J = 7 Hz).
b) Eine Lösung von (S)-3-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-N-undecylsuccinamidsäure-tert.-butylester (113 mg, 0,2 mmol) in TFA (2 ml) wurde bei Raumtemperatur für 30 min gerührt. Nach Abschluss der Reaktion wurde TFA durch Verdampfen in vacuo entfernt. Die Reinigung des Rückstands durch Kieselgelsäulenchromatographie (unter Verwendung von Dichlormethan:Methanol= 9:1 als Elutionsmittel) ergab (S)-3-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-N-undecylsuccinamidsäure (101 mg, 99% Ausbeute) als einen farblosen amorphen Feststoff.
FAB-MS (m/z): 507 [MH⁺],
¹H-NMR (CDCl₃) δ: 0,87 (3H, t, J = 7 Hz), 1,23 (16H, m), 1,46 (2H, m), 2,622,80 (1H, m), 2,903,05 (1H, m), 3,21 (2H, m), 4,20 (1H, t, J = 7 Hz), 4,44 (2H, d, J = 6 Hz), 4,53 (1H, breites s), 5,98 (1H, m), 6,52 (1H, breites s), 7,30 (2H, t, J = 7 Hz), 7,40 (2H, t, J = 7 Hz), 7,56 (2H, d, J = 7 Hz), 7,76 (2H, d, J = 7 Hz).
Die Ausgangsverbindungen der allgemeinen Formel (IV) [wobei Y -CONH- oder -CON(CH₃)- ist], welche in dem Verfahren B verwendet wurden, wurden gemäß dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt.
Beispiel 3
Herstellung von N-Boc-Aerothricin 3 (Verbindung A)
Zu einer Lösung von Aerothricin 3 (10,0 g, 6,07 mmol) in MeOH (1500 ml) wurden nacheinander Triethylamin (2,54 ml, 18,2 mmol) und Di-tert.-butyldicarbonat (13,9 ml, 60,7 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung bei Raumtemperatur für 18 h gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde in MeOH (ca. 10 ml) gelöst, und die Lösung wurde zu dem Diethylether (1500 ml) zugegeben. Der resultierende Niederschlag wurde filtriert und mit Diethylether gewaschen, was 9,9 g N-Boc-Aerothricin 3 (Verbindung A) als einen blassgelben amorphen Feststoff ergab, welcher ohne weitere Reinigung in den unten beschriebenen Arbeitsbeispielen für weitere strukturelle Modifikationen verwendet wurde.
Beispiel 4
Herstellung der Aerothricine 1, 2 und 3
a) Feststofffermentation
Eine 0,1 ml-Portion der eingefrorenen Kultur von Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391) in 10% (v/v) Glycerollösung wurde aufgetaut und in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben inokuliert, welcher 100 ml eines Mediums enthielt, das aus 2% Glucose, 1 % Kartoffelstärke, 1,5% Glycerol, 1% Toast Soja (Nissin Seiyu), 0,35% Hefeextrakt (Nippon Seiyaku), 0,25% Polypepton (Nihon Seiyaku), 0,3% NaCl, 0,5% CaCO₃, 0,005% ZnSO₄·7H₂O, 0,0005% CuSO₄·5H₂O und 0,0005% MnSO₄·4H₂O bestand. Der pH des Mediums wurde nicht eingestellt. Die Impfkultur wurde bei 27°C für 7 Tage bei 220 UpM auf einem Rotationsschüttler inkubiert. 2 ml der Impfkultur wurden in einen 3-Liter-Erlenmeyerkolben überführt, welcher ein festes Medium enthielt, das aus 200 g gepresster Gerste, 0,12 g Hefeextrakt (Difco), 0,06 g Natriumtartrat, 0,06 g KH₂PO₄ und 120 ml Wasser bestand. Die Fermentation wurde bei 27°C unter statischen Bedingungen durchgeführt. Die Produktion erreichte bei ca. 240 h Fermentation das Maximum, und die Kultur wurde dem Isolationsverfahren für die Aerothricine 1, 2 und 3 unterzogen.
Der erhaltene kultivierte Feststoff (10 kg) wurde zu Methanol (40 L) zugegeben, und die Mischung wurde gerührt, worauf eine Eliminierungsfiltration folgt, um einen Methanolextrakt (39 L) zu erhalten. Der so erhaltene Methanolextrakt wurde unter vermindertem Druck bis zur Trockenheit konzentriert, und zu dem Rückstand (64,8 g) wurden Ethylacetat (1 L) und Wasser (1 L) zugegeben, und die Mischung wurde gerührt, worauf eine Entfernung der Ethylacetatschicht folgte.
Weiterhin wurde die wässrige Schicht in ähnlicher Weise zweimal mit Ethylacetat (1 L) gewaschen. Die verbleibende wässrige Schicht wurde dreimal mit n-Butanol (1 L) extrahiert. Die so erhaltenen Extrakte wurden vereinigt und unter vermindertem Druck bis zur Trockenheit konzentriert, und der Rückstand (28,5 g) wurde in einer Mischung (250 ml) von Acetonitril-0,1% wässriger Trifluoressigsäure (1:1) gelöst. Nach dem Entfernen des unlöslichen Materials durch Zentrifugation wurde die so erhaltene Lösung unter vermindertem Druck bis zur Trockenheit verdampft, und der Rückstand wurde zu Methanol (300 ml) zugegeben, und die Mischung wurde gerührt, worauf eine Eliminationsfiltration folgte, um die Methanollösung (280 ml) zu erhalten. Die so erhaltenen methanollöslichen Materialien (9,3 g) wurden dann einer Säulenchromatographie auf einem Umkehrphasenkieselgel C18 (1 L) unterzogen. Die Säule wurde stufenweise unter Verwendung einer Mischung von Methanol-0,1% wässriger Trifluoressigsäure (2:8, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3 und 8:2) eluiert. Die Aerothricine 1, 2 und 3, welche in dieser Reihenfolge mit Methanol-0,1% wässriger Trifluoressigsäure (7:3) eluierten, wurden in vacuo bis zur Trockenheit konzentriert, um weißes pulverförmiges Aerothricin 3-Trifluoressigsäuresalz (731 mg) bzw. Aerothricin 1-Trifluoressigsäuresalz (747 mg) zu erhalten. Die Fraktionen, welche Aerothricin 2 enthielten, wurden unter vermindertem Druck konzentriert und weiter unter den folgenden Bedingungen durch HPLC gereinigt: Säule: Capcell Pak C 18 (i.d. 30 × 250 mm, Shiseido Co., LTD.); mobile Phase: Acetonitril-0,1 % wässrige Trifluoressigsäure (45:55); Fließgeschwindigkeit: 40 ml/min; Detektion: UV 220 nm. Die geeigneten Eluate, welche unter den obigen Bedingungen erhalten wurden, wurden in vacuo bis zur Trockenheit konzentriert, um weißes pulverförmiges Aerothricin 2-Trifluoressigsäuresalz (42 mg) zu erhalten.
b) Kolbenfermentation
Eine 2 ml-Portion der eingefrorenen Kultur von Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391) in 10% (v/v) Glycerollösung wurde aufgetaut und in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben inokuliert, welcher 100 ml eines Mediums enthielt, das aus 1% Glucose, 1% Hafermehl, 4% Tomatenpaste, 0,5% Maiseinweichflüssigkeit (Ando kasei), 0,001% FeSO₄·7H₂O, 0,001% MnSO₄·4H₂O, 0,0001% CaCl₂, 0,0002% ZnSO₄·7H₂O, 0,00002% (NH₄)₆MoO₂·4H₂O und 0,00006% H₃BO₃ bestand. Der pH des Mediums wurde vor der Sterilisation auf 6,8 eingestellt. Die Impfkultur wurde bei 27°C für 3 Tage bei 220 UpM auf einem Rotationsschüttler inkubiert. 2 ml der ersten Impfkultur wurden in 500 ml-Erlenmeyerkolben überführt, welche 100 ml desselben Mediums enthielten, und auf einem Rotationsschüttler unter denselben Bedingungen für 3 Tage inkubiert. 2 ml der zweiten Impfkultur wurden in 500 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert, welche 100 ml eines Mediums enthielten, welches aus 8,5% Glycerol, 1% Pektin aus Citrusfrüchten, 0,4% Erdnusspulver, 0,4% Casein aus vitaminfreier Milch, 0,4% Tomatenpaste, 0,4% Maiseinweichflüssigkeit (Ando kasei), 0,2% Glycin und 0,2% KH₂PO₄ bestand. Der pH des Mediums wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt. Die Fermentation wurde bei 27°C unter Schütteln bei 220 UpM durchgeführt. Nach 10 Tagen Kultivierung erreichte die Produktion das Maximum, und die gesamte Kultur wurde dem Isolationsverfahren für die Aerothricine 1, 2 und 3 unterzogen.
c) Fermentation im Gefäß
Eine 2 ml-Portion der eingefrorenen Kultur von Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391) in 10% (v/v) Glycerollösung wurde aufgetaut und in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben inokuliert, welcher 100 ml desselben Mediums, wie es oben beschrieben wurde, enthielt. Der Kolben wurde bei 220 UpM für 3 Tage bei 27°C geschüttelt. 2 ml der ersten Impfkultur wurden in 500-ml-Erlenmeyerkolben überführt, welche 100 ml desselben Impfmediums enthielten, und unter denselben Bedingungen für 3 Tage auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Sechshundert ml der zweiten Impfkultur wurden in einem 50-Litergefäß-Fermenter inokuliert, welcher 30 Liter desselben Produktionsmediums, wie es oben beschrieben wurde, und 0,4% Disfoam (Nissan Disfoam CA-123) enthielt. Die Fermentation wurde bei 27°C unter Belüftung bei 30 Litern/min und unter Schütteln bei 400 UpM durchgeführt. Die Produktion erreichte bei ca. 168 h der Fermentation das Maximum, und die gesamte Kultur wurde dem Isolationsverfahren für die Aerothricine 1, 2 und 3 unterzogen.
Aerothricin 1

1) Erscheinungsbild: Weißer Feststoff
2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode): m/z 1547 (M+H)⁺
3) Molekülformel: C₇₂H₁₁₈N₁₄4₂₃
4) Hochauflösende Massenspektroskopie (für M+H)⁺: Gefunden: 1547,8568 Berechnet für C₇₂H₁₁₉N₁₄O₂₃: 1547,8572
5) UV-Spektrum (1): in Methanol: λ(ε)max (in MeOH): 225±5 (10600 sh), 270±5 (2000), 278±5 (2100) λ(ε)max (in N/10 NaOH-MeOH): 240±5 (7700), 268±5 (1800), 298±5 (1800)
6) IR-Spektrum (KBr) (2): Die Hauptabsorptionswellenzahlen (cm^–1) sind wie folgt: 3379, 2927, 2855, 1740, 1660, 1535, 1453, 1203, 1139, 837
7) ¹H-NMR-Spektrum (3): 400 MHz, in CD₃OD
8) ¹³C-NMR-Spektrum (4): 100 MHz, in CD₃OD
9) Löslichkeit: Löslich: Wasser, Methanol, Dimethylsulfoxid
10) Farbreaktion: Positiv: Ninhydrin, Anisaldehyd-Schwefelsäure, Ioddampf, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz, Molybdatophosphorsäure Negativ: Sakaguchi-Reagenz, Bromcresolgrün, 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Schwefelsäure
11) Dünnschichtchromatographie (TLC):
12) Hochleistungsflüssigchromatographie: Träger: Capcell Pak C18 gel S120A, 4,6 × 250 mm (hergestellt von Shiseido, Co., LTD.) Mobile Phase: Acetonitril : 0,05% wässrige Trifluoressigsäure = 1:1 Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min Rt = 12,1 ± 0,5
13) Aminosäureanalyse: Aerothricin 1 wurde bei 120°C in 6N HCl für 24 h erwärmt, worauf ein Unterziehen unter eine Aminosäureanalyse folgte, wobei Threonin, 3 Einheiten von allo-Threonin, Glycin, Alanin, Valin, Tyrosin, Ornithin, 3-Hydroxyprolin, 4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyglutamin nachgewiesen wurden.

Aerothricin 2

1) Erscheinungsbild: Weißer Feststoff
2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode): m/z 1549 (M+H)⁺
3) Molekülformel: C₇₁H₁₁₆N₁₄O₂₄
4) Hochauflösende Massenspektroskopie (für M+H)⁺: Gefunden: 1549,8384 Berechnet für C₇₁H₁₁₇N₁₄O₂₄: 1549,8365
5) UV-Spektrum (5): in Methanol: λ(ε)max (in MeOH): 225±5 (10200 sh), 275±5 (1900), 278±5 (2000) λ(ε)max (in N/10 NaOH-MeOH): 240±5 (7700), 293±5 (2000)
6) IR-Spektrum (KBr) (6): Die Hauptabsorptionswellenzahlen (cm^–1) sind wie folgt: 3323, 2928, 2856, 1740, 1670, 1531, 1450, 1203, 1137, 837
7) ¹H-NMR-Spektrum (7): 400 MHz, in CD₃OD
8) ¹³C-NMR-Spektrum (8): 100 MHz, in CD₃OD
9) Löslichkeit: Löslich: Wasser, Methanol, Dimethylsulfoxid
10) Farbreaktion: Positiv: Ninhydrin, Anisaldehyd-Schwefelsäure, Ioddampf, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz, Molybdatophosphorsäure Negativ: Sakaguchi-Reagenz, Bromcresolgrün, 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Schwefelsäure
11) Dünnschichtchromatographie (TLC):
12) Hochleistungsflüssigchromatographie: Träger: Capcell Pak C18 gel S120A, 4,6 × 250 mm (hergestellt von Shiseido, Co., LTD.) Mobile Phase: Acetonitril : 0,05% wässrige Trifluoressigsäure = 1:1 Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min Rt = 9,9 ± 0,5
13) Aminosäureanalyse: Aerothricin 2 wurde bei 120°C in 6N HCl für 24 h erwärmt, worauf ein Unterziehen unter eine Aminosäureanalyse folgte, wobei Threonin, 3 Einheiten von allo-Threonin, Glycin, Alanin, Valin, 3-Hydroxytyrosml (DOPA), Ornithin, 3-Hydroxyprolin, 4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyglutamin nachgewiesen wurden.

Aerothricin 3

1) Erscheinungsbild: Weißer Feststoff
2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode): m/z 1533 (M+H)⁺
3) Molekülformel: C₇₁H₁₁₆N₁₄O₂₃
4) UV-Spektrum: in Methanol λ(ε)max (in MeOH): 225±5 (11000 sh), 275±5 (2000), 280±5 (1900) λ(ε)max (in N/10 NaOH-MeOH): 243±5 (7800), 295±5 (1800)
5) IR-Spektrum (KBr): Die Hauptabsorptionswellenzahlen (cm^–1) sind wie folgt: 3334, 2928, 2852, 1742, 1662, 1520, 1449, 1202, 1136, 836
6) Löslichkeit: Löslich: Wasser, Methanol, Dimethylsulfoxid
7) Farbreaktion: Positiv: Ninhydrin, Anisaldehyd-Schwefelsäure, Ioddampft, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz, Molybdatophosphorsäure Negativ: Sakaguchi-Reagenz, Bromcresolgrün, 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Schwefelsäure
8) Dünnschichtchromatographie (TLC):
9) Hochleistungsflüssigchromatographie: Träger: Capcell Pak C 18 gel S120A, 4,6 × 250 mm (hergestellt von Shiseido, Co., LTD.) Mobile Phase: Acetonitril : 0,05% wässrige Trifluoressigsäure = 1:1 Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min Rt = 9,1 + 0,5
13) Aminosäureanalyse: Aerothricin 3 wurde bei 120°C in 6N HCl für 24 h erwärmt, worauf ein Unterziehen unter eine Aminosäureanalyse folgte, wobei Threonin, 3 Einheiten von allo-Threonin, Glycin, Alanin, Valin, Tyrosin, Ornithin, 3-Hydroxyprolin, 4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyglutamin nachgewiesen wurden.

Beispiel 5
Herstellung der Verbindung (IX)
1) Kolbenfermentation
Eine 2 ml-Portion der eingefrorenen Kultur von Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391) in 10% (v/v) Glycerollösung wurde aufgetaut und in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben inokuliert, welcher 100 ml eines Mediums enthielt, das aus 1 % Glucose, 1 % Hafermehl, 4% Tomatenpaste, 0,5% Maiseinweichflüssigkeit (Ando kasei), 0,001% FeSO₄·7H₂O, 0,001% MnSO₄·4H₂O, 0,0001% CaCl₂, 0,0002% ZnSO₄·7H₂O, 0,00002% (NH₄)₆MoO₂·4H₂O und 0,00006% H₃BO₃ bestand. Der pH des Mediums wurde vor der Sterilisation auf 6,8 eingestellt. Die Impfkultur wurde bei 27°C für 4 Tage bei 220 UpM auf einem Rotationsschüttler inkubiert. 2 ml der Impfkultur wurden in 500 ml-Erlenmeyerkolben inokuliert, welche 100 ml eines Mediums enthielten, welches aus 8,5% Glycerol, 1% Pektin aus Citrusfrüchten, 2,0% Erdnusspulver, 0,4% Casein aus vitaminfreier Milch, 0,4% Tomatenpaste, 0,4% Glycin und 0,2% KH₂PO₄ bestand. Der pH des Mediums wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt. Die Fermentation wurde bei 27°C unter Schütteln bei 220 UpM durchgeführt. Nach 14 Tagen Kultivierung erreichte die Produktion das Maximum, und die gesamte Kultur wurde der Isolationsarbeit unterzogen.
Die gesamte erhaltene kultivierte Nährlösung (1,9 L) wurde zu n-Butanol(2 L) zugegeben, und die Mischung wurde gerührt. Die so erhaltenen Extrakte wurden unter vermindertem Druck bis zur Trockenheit konzentriert, und zu dem Rückstand wurden Hexan (500 ml) und Methanol (500 ml) zugegeben, und die so erhaltene Mischung wurde gerührt, worauf die Entfernung der Hexanschicht folgte. Nach der Entfernung des Methanols unter vermindertem Druck wurde der so erhaltene Rückstand mit einer Mischung von Hexan und Ethylacetat (1:1; 200 ml, zweimal) gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.
Zu dem Rückstand (3,9 g) wurde Wasser (20 ml) zugegeben, und die Mischung wurde gerührt, worauf eine Zentrifugation folgte, um die Wasserlösung zu erhalten. Die so erhaltene Lösung wurde dann einer Säulenchromatographie auf einem Umkehrphasenkieselgel C18 (200 L) unterzogen. Die Säule wurde zuerst mit 0,1% wässriger Trifluoressigsäure und dann stufenweise unter Verwendung einer Mischung von Methanol-0,1 % wässriger Trifluoressigsäure (1:9, 3:7, 5:5, 6:4, 7:3 und 8:2) eluiert. Die Verbindung (IX), welche bei Methanol-0,1% wässriger Trifluoressigsäure (7:3) eluierte, wurde vereinigt, und die Lösung wurde mit 1 N wässrigem Natriumhydroxid neutralisiert, worauf eine Konzentrierung in vacuo bis zur Trockenheit folgte. Zu dem so erhaltenen Rückstand wurde Wasser (10 ml) und n-Butanol(10 ml) zugegeben, und die Mischung wurde gerührt. Der so erhaltene Extrakt wurde unter vermindertem Druck konzentriert, um die Verbindung (IX) (96,9 mg) als ein weißes Pulver zu erhalten. Die weitere Reinigung, um die Verbindung (IX) zur Spektroskopie zu erhalten, wurde durch HPLC unter den folgenden Bedingungen erreicht: Säule: Capcell Pak C18 UG80 (i.d. 20 × 250 mm, Shiseido Co., LTD.); mobile Phase: 0,05% Trifluoressigsäure/Acetonitril-0,05% Trifluoressigsäure/Wasser (38:62); Fließgeschwindigkeit: 22,86 ml/min; Detektion: UV 210 nm. Die geeigneten Eluate, welche unter den obigen Bedingungen erhalten wurden, wurden in vacuo bis zur Trockenheit konzentriert, um das weiße pulverförmige Trifluoressigsäuresalz der Verbindung (IX) zu erhalten.
c) Fermentation im Gefäß
Eine 2 ml-Portion der eingefrorenen Kultur von Deuteromycotina NR 7379 (FERM BP-6391) in 10% (v/v) Glycerollösung wurde aufgetaut und in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben inokuliert, welcher 100 ml desselben Mediums, wie es oben beschrieben wurde, enthielt. Der Kolben wurde bei 220 UpM für 4 Tage bei 27°C geschüttelt. Zwei ml der ersten Impfkultur wurden in 500-ml-Erlenmeyerkolben überführt, welche 100 ml desselben Impfmediums enthielten, und unter denselben Bedingungen für 3 Tage auf einem Rotationsschüttler inkubiert. 600 ml der zweiten Impfkultur wurden in einem 50-Litergefäß-Fermenter inokuliert, welcher 30 Liter desselben Produktionsmediums, wie es oben beschrieben wurde, und 0,4% Disfoam (Nissan Disfoam CA-123) enthielt. Die Fermentation wurde bei 27°C unter Belüftung bei 30 Litern min und unter Schütteln bei 400 UpM durchgeführt. Die Produktion erreichte bei ca. 278 h der Fermentation das Maximum, und die gesamte Kultur wurde dem Isolationsverfahren für die Verbindung (IX) unterzogen.
Verbindung (IX)

1) Erscheinungsbild: Weißer Feststoff
2) Molekulargewicht (FAB-MS-Methode): m/z 1317 (M+H)⁺
3) Molekülformel: C₅₉H₁₀₄N₁₂O₂₁
4) Hochauflösende Massenspektroskopie (für M+H)⁺: Gefunden: 1317,7555 Berechnet für C₅₉H₁₀₅N₁₂O₂₁: 1317,7517
5) UV-Spektrum: in Methanol: λ(ε)max (in MeOH): Endabsorption
6) IR-Spektrum (KBr) (9): Die Hauptabsorptionswellenzahlen (cm^–1) sind wie folgt: 3450, 2928, 1665, 1520, 1450, 1225, 1135
7) ¹H-NMR-Spektrum (10): 500 MHz, in DMSO-d₆
8) ¹³C-NMR-Spektrum (11): 125 MHz, in DMSO-d₆
9) Löslichkeit: Löslich: Wasser, Methanol, Dimethylsulfoxid
10) Farbreaktion: Positiv: Ninhydrin, Anisaldehyd-Schwefelsäure, Ioddampf, Vanillin-Schwefelsäure, Rydon-Smith-Reagenz, Molybdatophosphorsäure Negativ: Sakaguchi-Reagenz, Bromcresolgrün, 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Schwefelsäure
11) Hochleistungsflüssigchromatographie: Träger: Capcell Pak C18 UG80A, 4,6 × 250 mm (hergestellt von Shiseido, Co., LTD.) Mobile Phase: 0,05% Trifluoressigsäure/Acetonitril : 0,05% Trifluoressigsäure/Wasser = 38:62 Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min Rt = 7,7 ± 0,5

Beispiel 6
Herstellung des N-Boc-Derivats (N(orn)-Boc-IX) des Ornithinrests der Verbindung (IX): Die Verbindung der Formel (XII: R⁶ = Boc)
Zu einer Lösung der Verbindung (IX), die in dem Beispiel 5 erhalten wurde (10,4 mg, 0,0073 mmol), in Dioxan-H₂O (0,43 ml–0,5 ml) wurden Triethylamin (3 μl) und 0,1 M Lösung von tert.-Butyl-N-succinimidylcarbonat (0,0073 μl, 0,0073 mmol) in Dioxan bei Raumtemperatur zugegeben. Nachdem diese für 1,5 h gerührt worden war, wurde die Mischung mit Essigsäure angesäuert und wurde unter vermindertem Druck verdampft. Die Reinigung des Rückstands durch HPLC ergab N(orn)-Boc-IX als eine farblose amorphe [Substanz] (4,8 mg, 45% Ausbeute);
HPLC (Rt) 18,0 min (Säule: Soken-ODS, 20 × 250 mm, Fließgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: H₂O : CH₃CN = Gradient 1% Essigsäure); FAB-MS [M+Na]⁺ 1440.
Beispiel 7
Herstellung des N-Boc-Derivats (N(val)-Boc-IX) des Valinrests der Verbindung (IX): Die Verbindung der Formel (X: R⁷ = Boc)
Eine Mischung von der Verbindung (IX), welche in dem Beispiel 5 erhalten wurde (15,0 mg, 0,0105 mol), Di-tert.-butyldicarbonat (0,073 M in Methanollösung, 0,20 ml, 0,015 mmol) und Triethylamin (7,8 μl) in MeOH (3 ml) wurde bei 0°C für 24 h gerührt. Die Mischung wurde mit n-Hexan gewaschen und wurde unter vermindertem Druck verdampft. Die Reinigung des Rückstands durch Umkehrphasen-HPLC ergab das (N(val)-Boc-IX) als eine farblose amorphe [Substanz] (1,0 mg, 6% Ausbeute);
HPLC (Rt) 16,0 min (Säule: Soken-ODS, 20 × 250 mm, Fließgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: H₂O : CH₃CN = Gradient 1% Essigsäure); FAB-MS [M+H]⁺ 1418.
Beispiel 8
Herstellung von Aerothricin 33
Zu einer gerührten Lösung von (R)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)-7-(4-pentyloxyphenyl)heptansäure (25,5 mg, 0,048 mmol) in DMF (0,5 ml) wurden BOP-Reagenz (21,3 mg, 0,048 mmol), HOBT-Hydrat (7,5 mg, 0,049 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (0,0095 ml, 0,055 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung bei Raumtemperatur für 1 h gerührt worden war, wurde eine Lösung der Verbindung B [= das lineare Peptid der Formel (III), wobei R² und R³ Wasserstoff sind, R⁵ eine Carbamoylgruppe ist und R⁷ tert.-Butoxycarbonyl ist, welches aus dem Aerothricin 1 oder 3 gemäß dem Verfahren, das in der WO 96/30399 beschrieben wird, hergestellt wurde] (50,7 mg, 0,036 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (0,0095 ml, 0,055 mmol) in DMF (0,6 ml) zu der Reaktionsmischung zugegeben. Nachdem die Mischung für 2,5 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde Piperidin (0,20 ml) zugegeben, und die Mischung wurde für weitere 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt (Säule C, Fließgeschwindigkeit: 9 ml/min; Gradient: Elutionsmittel: 1% AcOH-H₂O : 1% AcOH-CH₃CN = 80:20 → 2:98). Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 49,5 mg des linearen Peptids C, ein Vorläufer für die Cyclisierung, als einen weißen amorphen Feststoff ergab.
Zu einer gerührten Lösung des linearen Peptids C (49,5 mg, 0,029 mmol), das oben erhalten wurde, in DMF (27 ml) wurden HOBT-Hydrat (11,3 mg, 0,074 mmol), N,N-Diisopropyletylamin (0,018 ml, 0,105 mmol) und eine Lösung von BOP-Reagenz (33,1 mg, 0,075 mmol) in DMF (4 ml) zugegeben. Nachdem die Mischung für 3 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel in vacuo verdampft.
Der oben erhaltene Rückstand wurde in TFA (6 ml) gelöst und bei 0°C für 30 min gerührt. Dann wurde TFA in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 19,4 mg Aerothricin 33 als einen weißen amorphen Feststoff ergab.
HPLC (Rt): 12,4 min (Säule C, Fließgeschwindigkeit: 9 ml/min; Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 61:39); FAB-MS (m/z): 1568 [MH⁺].
Die folgenden Aerothricine 34–38, 40–53, 64–73 und 89–95, 97–99 und 123 wurden gemäß einem Verfahren, das zu dem in Beispiel 8 beschriebenen ähnlich war, unter Verwendung des entsprechenden Bausteins, welcher als Formel (IV) dargestellt wird, hergestellt.
Beispiel 9
Herstellung von Aerothricin 16

(a). Zu einer gerührten Lösung der Verbindung A (in Referenzbeispiel 3 beschrieben) (1 g, 0,61 mmol) in Pyridin (2,5 ml) wurde Tetranitromethan (0,365 ml, 3,05 mmol) zugegeben. Nachdem diese für 4 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Reaktionsmischung in vacuo konzentriert. Der dunkelbraune Rückstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt (Lobar RP18, 10 ml/min, 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 50:50 → 33:66 0,05% TFA). Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 711 mg des rohen Nitroderivats der Verbindung A als einen blassgelben amorphen Feststoff ergab.
(b). Eine Mischung des rohen Produkts, das oben erhalten wurde (12 mg, 0,0071 mmol), und TFA (0,5 ml) wurde bei 0°C für 30 min gerührt. TFA wurde unter einem Strom von trockenem Stickstoff verdampft. Der gelbe Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 8 mg Aerothricin 16·TFA-Salz als einen blassgelben amorphen Feststoff ergab.

HPLC (Rt): 15,5 min (Säule B, Fließgeschwindigkeit: 4 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 55:45); FAB-MS (m/z): 1578 [MH⁺].
Die folgenden Aerothricine 39, 54, 55 und 77 wurden gemäß einem Verfahren hergestellt, das zu dem in Beispiel 9 beschriebenen ähnlich war, wobei Aerothricine, die in Beispiel 8 erhalten wurden, als das Ausgangsmaterial verwendet wurden.
Beispiel 10
Herstellung von Aerothricin 17

(a). Zu der Lösung des rohen Nitroderivats der Verbindung A, das in Beispiel 9(a) erhalten wurde (55 mg, 0,033 mmol), in MeOH (5 ml) wurde 10% Palladium auf Holzkohle (20 mg) zugegeben, und das Reaktionsgefäß wurde mit Wasserstoff gefüllt. Nachdem diese für 13,5 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Mischung durch einen Membranfilter (Porengröße: 0,2 μm) filtriert, und das Lösungsmittel wurde verdampft, was 52 mg des rohen Aminoderivats von Aerothricin 3 als braune amorphe [Substanz] ergab, welche in dem nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
(b). Eine Mischung des rohen Aminoderivats der Verbindung A (in Referenzbeispiel 3 beschrieben), das oben erhalten wurde (3,4 mg, 0,0021 mmol), und TFA (0,2 ml) wurde bei 0°C für 30 min gerührt. TFA wurde unter einem Strom von trockenem Stickstoff verdampft. Der braune Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 1,3 mg Aerothricin 17 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.

HPLC (Rt): 12,8 min (Säule A, Fließgeschwindigkeit: 1 min/ml, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 59:41); FAB-MS (m/z): 1548 [MH⁺].
Die folgenden Aerothricine 29, 56 und 78 wurden gemäß einem Verfahren hergestellt, das zu dem in Beispiel 10 beschriebenen ähnlich war, wobei Aerothricine, die in Beispiel 9 erhalten wurden, als das Ausgangsmaterial verwendet wurden.
Beispiel 11
Herstellung von Aerothricin 18

(a). Zu einer Lösung des rohen Aminoderivats der Verbindung A, das in Beispiel 10(a) erhalten wurde (1,7 mg, 0,001 mmol), in Methanol (0,05 ml) und Pyridin (0,025 ml) wurde nacheinander Boc-Gly-OH (18 mg, 0,10 mmol), WSCl (30 mg, 0,15 mmol) und HOBT-Hydrat (24 mg, 0,15 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung für 15 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel durch einen Strom von trockenem Stickstoff entfernt.
(b). Der rohe Rückstand, welcher oben erhalten wurde, wurde in TFA (0,1 ml) gelöst und bei 0°C für 30 min gerührt. TFA wurde mit einem Strom von trockenem Stickstoff entfernt. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 0,54 mg Aerothricin 18 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.

HPLC (Rt): 8,9 min (Säule B, Fließgeschwindigkeit: 4 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 57:43); FAB-MS (m/z): 1605 [MH⁺].
Die folgenden Aerothricine 19–23, 30, 57–62, 79 und 81 wurden gemäß einem Verfahren hergestellt, das zu dem in Beispiel 11 beschriebenen ähnlich war, wobei das entsprechende Acy lierungsmittel und Aerothricine, die in Beispiel 10 erhalten wurden, als das Ausgangsmaterial verwendet wurden.
Beispiel 12
Herstellung von Aerothricin 12
Zu einer Lösung von Aerothricin 5 (7,5 mg, 0,0048 mmol), 37% Formalin (150 μl) und Essigsäure (50 μl) in MeOH (1,0 ml) wurde Natriumcyanoborhydrid (7,5 mg, 0,119 mmol) in MeOH (100 μl) bei Raumtemperatur zugegeben, und die Mischung wurde für 7 h bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem das Lösungsmittel in vacuo verdampft worden war, wurde der Rückstand in n-Butanol gelöst und nacheinander mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 5,4 mg Aerothricin 12 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.
HPLC (Rt): 7,1 min (Säule B, Fließgeschwindigkeit: 4 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 50:50); FAB-MS (m/z): 1575 [MH⁺].
Die folgenden Aerothricine 13, 25, 30 und 75 wurden gemäß einem Verfahren hergestellt, das zu dem in Beispiel 12 beschriebenen ähnlich war.
Beispiel 13
Herstellung von Aerothricin 111

(a). Zu einer Lösung von Aerothricin 3 (500 mg, 0,326 mmol), (2-Oxoethyl)-carbamidsäure-tert.-butylester* (1,66 g, 10,4 mmol) und Essigsäure (5 ml) in MeOH (45 ml) wurde Natriumcyanoborhydrid (410 mg, 6,52 mmol) in MeOH (5 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Die Mischung wurde für 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem das Lösungsmittel in vacuo verdampft worden war, wurde der Rückstand in n-Butanol gelöst und nacheinander mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde in vacuo verdampft. Der rohe Rückstand wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. *CAS Nr. 89711-08-0
(b). Eine Lösung des rohen Rückstands, der oben erhalten wurde, in TFA (20 ml) wurde bei 0°C für 30 min gerührt. TFA wurde in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehr-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 253 mg Aerothricin 111 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.

HPLC (Rt) 18,6 min (Säule F, Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 57:43); FAB-MS (m/z): 1619 [M+H]⁺.
Die folgenden Aerothricine 100, 112, 114 und 115 wurden gemäß einem Verfahren hergestellt, das zu dem in Beispiel 13 beschriebenen ähnlich war.
Beispiel 14
Herstellung von Aerothricin 120
Zu einer Mischung von Aerothricin 3 (500 mg, 0,326 mmol) und Triethylamin (682 μl, 4,89 mmol) in MeOH (10 ml) wurde Acrylnitril (214 μl, 3,27 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Die Mischung wurde für 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem das Lösungsmittel in vacuo verdampft worden war, wurde der Rückstand in n-Butanol gelöst und nacheinander mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde in vacuo verdampft. Der rohe Rückstand wurde durch präparative Umkehr-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die geeigneten Fraktionen wurden ver einigt, eingefroren und lyophilisiert, was 207 mg Aerothricin 120 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.
HPLC (Rt) 27,5 min (Säule F, Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 53:47); FAB-MS (m/z): 1586 [M+H]⁺.
Beispiel 15
Herstellung von Aerothricin 113
Zu einer Mischung von Aerothricin 120 (100 mg, 0,063 mmol) in MeOH (5 ml) wurde 10% Palladium auf Holzkohle (20 mg) zugegeben, und das Reaktionsgefäß wurde mit Wasserstoff gefüllt. Nachdem diese für 20 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Mischung durch einen Membranfilter (Porengröße: 0,2 μm) filtriert, und das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft. Der rohe Rückstand wurde durch präparative Umkehr-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 87,2 mg Aerothricin 113 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.
HPLC (Rt) 23,0 min (Säule F, Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min, mobile Phase: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 57:43); FAB-MS (m/z): 1590 [M+H]⁺.
Aerothricin 129 wurde gemäß einem Verfahren hergestellt, das zu dem in Beispiel 14–15 beschriebenen ähnlich war, worauf die Entfernung der Boc-Gruppe des Ornithinrests mit Trifluoressigsäure folgte. Das Ausgangsmaterial war in diesem Fall das N^δ-Boc-Derivat des (D)-Ornithin-Anteils von Aerothricin 106, das in einem zu Beispiel 16 ähnlichen Verfahren erhalten wurde.
Beispiel 16
Herstellung von Aerothricin 14
Zu einer Lösung von N-Boc-Sarcosin (123 mg, 0,65 mmol), WSC·HCl (240 mg, 1,25 mmol) und DMAP (150 mg, 1,23 mmol) in CH₃CN (10 ml) wurde eine Lösung von Aerothricin 3 (100 mg, 0,065 mmol) in CH₃OH (3 ml) zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 15 h gerührt und dann in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde in n-BuOH (10 ml) gelöst und mit H₂O gewaschen (5 ml × 2, pH eingestellt auf 3~4 mit 1 N HCl). Die n-BuOH-Schicht wurde in vacuo konzentriert, und der Rückstand wurde in TFA (5 ml) bei 0°C gelöst. Nachdem die Lösung bei Raumtemperatur für 1 h gerührt worden war, wurde TFA in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, was 40,8 mg (39% Ausbeute) Aerothricin 14 als ein weißes amorphes Pulver ergab.
HPLC (Rt): 23,1 min (Säule C, Fließgeschwindigkeit: 9 ml/min, 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 60:40); FAB-MS (m/z): 1605 [MH⁺].
Die folgenden Aerothricine 15, 21, 26–29 und 101–107, 109, 110, 118, 130 und 131 wurden gemäß einem Verfahren hergestellt, das ähnlich zu dem in Beispiel 16 beschriebenen war, wobei die entsprechende Säure als ein Baustein verwendet wurde.
Beispiel 17
Herstellung von Aerothricin 74
Eine Mischung von Aerothricin 66 (20 mg, 0,012 mmol), 3,5-Dimethylpyrazol-1-carboxamidinnitrat (13 mg, 0,064 mmol) und Triethylamin (18 ml, 0,13 mmol) in MeOH (1 ml) wurde bei Raumtemperatur für 15 h gerührt. Nachdem das Lösungsmittel verdampft worden war, wurde der rohe Rückstand durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, wobei sich 10,2 mg Aerothricin 74 als ein farbloser amorpher Feststoff ergaben.
HPLC (Rt) 21,2 min (Säule C, Fließgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 54:46); FAB-MS (m/z): 1645 [MH⁺].
Die folgenden Aerothricine 4 und 116 wurden gemäß einem Verfahren hergestellt, das zu dem in Beispiel 17 beschriebenen ähnlich war, wobei Aerothricin 3 bzw. 111 als ein Ausgangsmaterial verwendet wurden.
Beispiel 18
Herstellung von Aerothricin 5

(a). Zu einer Lösung der Verbindung A, welche in Referenzbeispiel 3 erhalten wurde (10 mg, 0,0061 mmol), und Kaliumcarbonat (10 mg, 0,072 mmol) in DMF (1 ml) wurde Methyliodid (8 μl, 0,129 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben, und die Mischung wurde für 43 h bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die Mischung über ein Celite-Kissen filtriert, und das Filtrat wurde in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde in n-Butanol gelöst und nacheinander mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde in vacuo verdampft. Der rohe Rückstand wurde ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet.
(b). Eine Lösung des rohen Rückstands, welcher oben erhalten wurde, in TFA (1,0 ml) wurde bei 0°C für 30 min gerührt. TFA wurde in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 3,8 mg Aerothricin 5 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.

HPLC (Rt): 14,5 min (Säule B, Fließgeschwindigkeit: 4 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 55:45); FAB-MS (m/z): 1547 [MH⁺].
Die folgenden Aerothricine 6–10 und 76 wurden gemäß einem Verfahren hergestellt, das zu dem in Beispiel 18 beschriebenen ähnlich war, wobei das entsprechende Alkylierungsmittel verwendet wurde.
Beispiel 19
Herstellung von Aerothricin 24

(a). Eine kalte Mischung der Verbindung A, welche in Referenzbeispiel 3 erhalten wurde (100 mg), Natriumiodid (29,5 mg, 0,197 mmol) und Natriumhypochlorit-Lösung (250 μl) in Methanol (2 ml) wurde bei 0°C für 2 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit gesättigtem wässrigem Natriumthiosulfat gequencht, mit 1 N HCl angesäuert und mit n-Butanol extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden in vacuo verdampft. An diesem Punkt lag immer noch das Ausgangsmaterial vor. Um die Iodierungsreaktion abzuschließen, wurde derselbe experimentelle Vorgang wiederholt. Nach derselben Aufarbeitung wurde der Rückstand durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, was das Iodderivat der Verbindung A als farblosen Feststoff ergab (54 mg, 50% Ausbeute).
(b). Eine Mischung des Iodidderivats der Verbindung A, das oben erhalten wurde (23,8 mg), Methylacrylat (16 μl), Triethylamin (40 μl) und Palladiumacetat (2,1 mg) in Acetonitril (250 μl) und N,N-Dimethylformamid (750 μl) wurde bei 70°C für 28 h erwärmt. Die resultierende Mischung wurde eine C-18-Kurzsäule geleitet, und der Rückstand wurde mit Trifluoressigsäure (1 ml) bei 0°C für 1 h behandelt. Die resultierende Mischung wurde in vacuo verdampft. Die Reinigung des Rückstands durch präparative Umkehrphasen-HPLC ergab Aerothricin 24 als farblosen Feststoff (8,8 mg, 40% Ausbeute).

HPLC (Rt): 86,3 min (Säule F, Fließgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 58:42); FAB-MS (m/z): 1617 [MH⁺]
Beispiel 20
Herstellung von Aerothricin 96
Eine Mischung des Iodidderivats der Verbindung A (30 mg), das in Beispiel 19(a) erhalten wurde, Kaliumacetat (6,9 mg) und Tetrakis(triphenylphoshin)palladium (4,6 mg) in entgastem Dimethysulfoxid (2 ml) wurde bei 60°C für 20 h unter einer Kohlenmonoxidatmosphäre erwärmt. Die resultierende Mischung wurde durch eine C-18-Umkehrphasenkurzsäule geleitet, und der Rückstand wurde mit Trifluoressigsäure bei 0°C für 1 h behandelt. Die resultierende Mischung wurde unter vermindertem Druck verdampft. Die Reinigung des Rückstands durch präparative Umkehrphasen-HPLC ergab Aerothricin 96 als farblosen Feststoff (2,3 mg, 8% Ausbeute).
HPLC (Rt): 23,2 min (Säule F, Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 52,2:47,8); FAB-MS (m/z): 1677 [MH⁺].
Beispiel 21
Herstellung von Aerothricin 32

(a). Eine Mischung der Verbindung A, welche in Referenzbeispiel 3 erhalten wurde (20 mg), und (Methoxycarbonylsulfamoyl)triethylammoniumhydroxid (26,5 mg, 0,108 mmol) in Acetonitril (3 ml) wurde bei Raumtemperatur für 8 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 1 N HCl angesäuert und wurde in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde mit n-Butanol extrahiert, und die Extrakte wurden in vacuo verdampft.
(b). Das rohe Produkt wurde bei 0°C für 1 h mit Trifluoressigsäure behandelt. TFA wurde in vacuo verdampft. Die Reinigung des Rückstands durch präparative Umkehrphasen-HPLC ergab Aerothricin 32 als farblosen Feststoff (2,0 mg, 10% Ausbeute).

HPLC (Rt): 42,9 min (Säule B, Fließgeschwindigkeit: 4 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 55:45); FAB-MS (m/z): 1516 [MH+].
Beispiel 22
Herstellung von Aerothricin 31

(a). Zu einer kalten Lösung der Verbindung A, welche in Referenzbeispiel 3 erhalten wurde (25,7 mg), in Tetrahydrofuran (5 ml) wurde Boran-Dimethylsulfid-Komplex (25 ml) bei –10°C zugegeben. Nachdem sie bei –10°C für 5 h gerührt worden war, wurde die Reaktionsmischung mit 2 N HCl gequencht und wurde mit n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden in vacuo verdampft.
(b). Das rohe Produkt wurde bei 0°C für 1 h mit Trifluoressigsäure behandelt. THF wurde unter vermindertem Druck verdampft. Die Reinigung des Rückstands durch präparative Umkehrphasen-HPLC ergab Aerothricin 31 als farblosen Feststoff (3,7 mg, 15% Ausbeute).

HPLC (Rt): 25,1 min (Säule B, Fließgeschwindigkeit: 4 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 62:38); FAB-MS (m/z): 1519 [MH⁺].
Beispiel 23
Herstellung von Aerothricin 121
Zu einer Lösung von Aerothricin 3 (50 mg) in DMF (1 ml) und Triethylamin (0,025 ml) wurde Methyliodid (0,010 ml) zugegeben. Nachdem diese für 16 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde zu der Mischung weiterhin Triethylamin (0,025 ml) und Methyliodid (0,05 ml) zugegeben und für 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Eine LCMS-Analyse der Mischung zeigte >90% Umwandlung zu der gewünschten Verbindung an. Das Lösungsmittel wurde mit einem Strom von Stickstoff gespült, und der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden.
Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 23 mg Aerothricin 121 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.
HPLC (Rt): 20,5 min (Säule B, Fließgeschwindigkeit: 4 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 52:48); FAB-MS (m/z): 1576 [M⁺].
Beispiel 24
Herstellung von Aerothricin 122
Zu einer Lösung von Aerothricin 3 (50 mg) in Pyridin (1 ml) wurde Schwefeltrioxid-N,N-dimethylformamid-Komplex (23 mg) zugegeben. Nachdem für 2 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel mit einem Strom von trockenem Stickstoff gespült.
Eine Lösung des rohen Rückstands, der oben erhalten wurde, in TFA (1 ml) wurde bei 0°C für 30 min gerührt. TFA wurde mit einem Strom von trockenem Stickstoff gespült, und der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 5 mg Aerothricin 122 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.
HPLC (Rt): 24,6 min (Säule F, Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 52:48); FAB-MS (m/z): 1613 [MH⁺].
Beispiel 25
Herstellung von Aerothricin 63

(a). Zu einer gerührten Lösung von N^α-Fmoc-N^β-Boc-(S)-2,3-Diaminopropionsäure (343 mg, 0,80 mmol) in DMF (10 ml) wurden BOP-Reagenz (355 mg, 0,80 mmol), HOBT-Hydrat (124 mg, 0,81 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (0,174 ml, 1,00 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung für 1,5 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde eine Lösung von Aerothricin 3 (1,10 g, 0,67 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (0,174 ml, 1,00 mmol) in DMF (9,5 ml) zu der Mischung zugegeben. Nachdem diese für eine weitere h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Mischung in vacuo konzentriert.
(b). Zu einer gerührten Lösung des oben erhaltenen Rückstands in DMF (20ml) wurde Piperidin-4-carbonsäurepolyaminharz (200–400 mesh), HL (1,50 mmol/g, 2,66 g) zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde mit Ultraschall für 6 h beschallt. Das Harz wurde durch Filtration durch ein Celite-Kissen entfernt, mit MeOH gewaschen, und das vereinigte Filtrat und die Waschlösung wurden eingefroren und lyophilisiert, was 1,08 g des rohen Derivats von Aerothricin 3 als einen weißen amorphen Feststoff ergab, welcher für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
(c). Zu einer gerührten Lösung des rohen Derivats von Aerothricin 3, das oben erhalten wurde, (25,6 mg, 0,015 mmol) in MeOH (1 ml) wurden (2-Oxo-ethyl)carbamidsäure-tert.-butylester (roh, 207 mg), AcOH (0,1 ml) und NaBH₃CN (19,1 mg) zugegeben. Nachdem die Mischung für 2 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Reaktionsmischung in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde mit n-BuOH (4 ml) verdünnt und mit H₂O (1 ml × 2, pH 3–4 eingestellt mit 0,1 N HCl) gewaschen. Die n-BuOH-Schicht wurde in vacuo konzentriert. Der rohe Rückstand wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
(d). Eine Lösung des rohen Rückstands, der oben erhalten wurde, in TFA (2 ml) wurde bei 0°C für 2 h gerührt. TFA wurde in vacuo verdampft; und der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 8,8 mg Aerothricin 63 als einen weißen amorphen Feststoff ergab.

HPLC (Rt): 24,8 min (Säule F, Fließgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 54:36); FAB-MS (m/z): 1706 [MH⁺]
Beispiel 26
Herstellung von Aerothricin 127
Aerothricin 127 wurde durch dasselbe Verfahren wie das für Aerothricin 63 beschriebene hergestellt, indem N^α-Fmoc-N^δ-Boc-(D)-Ornithin verwendet wurde. Aerothricin 127 wurde als ein weißer amorpher Feststoff erhalten.
HPLC (Rt): 23,9 min (Säule F, Fließgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 54:36); FAB-MS (m/z): 1734 [MH⁺]
Beispiel 27
Herstellung von Aerothricin 124

(a). Zu einer gerührten Lösung von Boc-D-Orn(Boc)-OH (46 mg, 0,138 mmol) in DMF (2 ml) wurden BOP-Reagenz (62 mg, 0,14 mmol), HOBT-Hydrat (22 mg, 0,144 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (24 μl, 0,138 mmol) zugegeben. Nachdem für 30 min bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde eine Lösung von Aerothricin 120 (100 mg, 0,063 mmol) und N-Diisopropylethylamin (24 μl, 0,138 mmol) in DMF (2 ml) zu der Reaktionsmischung zugegeben. Nachdem diese für 18 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel in vacuo verdampft. Der Rückstand wurde in TFA (4 ml) gelöst, und die Lösung wurde bei 0°C für 30 min gerührt. Nach Entfernen von TFA mit einem Strom trockenem Stickstoff wurde der Rückstand durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 48,6 mg des Nitrilderivats als einen weißen amorphen Feststoff ergab. HPLC (Rt): 20,2 min (Säule F, Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 57:43); FAB-MS (m/z): 1700 [M+H]⁺.
(b). Zu einer Mischung des oben erhaltenen Nitrilderivats (48,6 mg, 0,0286 mmol) in Dioxan (1 ml) und Wasser (1 ml) wurde 10% Palladium auf Holzkohle (10 mg) zugegeben, und die Mischung wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre für 14 h bei Raumtemperatur gerührt.

Dann wurde die Mischung durch einen Membranfilter (Porengröße: 0,2 μm) filtriert, und das Lösungsmittel wurde in vacuo verdampft. Der rohe Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 26,5 mg an Aerothricin 124 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.
HPLC (Rt): 18,2 min (Säule F, Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 60:40); FAB-MS (m/z): 1704 [M+H]⁺.
Die folgenden Aerothricine 132, 134–136 wurden gemäß einem Verfahren hergestellt, das zu dem in Beispiel 27 beschriebenen ähnlich war.
Beispiel 28
Herstellung von Aerothricin 125

(a). Zu einer Lösung von Aerothricin 3-Mono-TFA-Salz (natürliches Produkt: 50 mg) in DMF (1 ml) und Triethylamin (0,126 ml) wurde 2-Brom-S-nitropyridin (185 mg) zugegeben. Nachdem diese für 25 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel mit einem Strom trockenem Stickstoff gespült. Der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 25 mg des 5-Nitropyrid-2-ylderivats von Aerothricin 3 als einen leicht gelben amorphen Feststoff ergab. HPLC (Rt): 29,9 min (Säule F, Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 47:53); FAB-MS (m/z): 1655 [M+H]⁺.
(b). Das 5-Nitropyrid-2-ylderivat von Aerothricin 3, das oben erhalten wurde (10 mg), wurde in Dioxan-H₂O (1 ml – 5 ml) gelöst. 5% Palladium auf Holzkohle (20 mg) wurde zugegeben, und das Reaktionsgefäß wurde mit Wasserstoff gefüllt. Nachdem es für 3 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, ergaben eine Filtration durch einen Membranfilter (Porengröße: 0,2 μm) und das Verdampfen des Lösungsmittels 14 mg des rohen Produkts, welches durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt wurde, deren detaillierte Bedingungen nachstehend gezeigt werden. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 2,5 mg Aerothricin 125 als einen farblosen amorphen Feststoff ergab.

HPLC (Rt): 18,7 min (Säule F, Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 52:48); FAB-MS (m/z): 1625 [M+H]⁺.
Beispiel 29–1
Herstellung von Aerothricin 128

(a). Zu einer gerührten Lösung von Fmoc-D-Orn(Boc)-OH (389 mg, 0,86 mmol) in DMF (10 ml) wurden BOP-Reagenz (378 mg, 0,85 mmol), HOBT-Hydrat (131 mg, 0,86 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (171 μl, 0,98 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung bei Raumtemperatur für 40 min gerührt worden war, wurde eine Lösung von Aerothricin 3 (1,08 g, 0,66 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (171 μl, 0,98 mmol) in DMF (10 ml) zu der Mischung zugegeben. Nachdem diese für 2,5 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde Piperidin (4 ml) zugegeben, und die Mischung wurde für eine weitere h bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde mit n-BuOH (50 ml) verdünnt und mit H₂O (25 ml × 2, pH 3 eingestellt mit 1 N HCl) gewaschen. Die n-BuOH-Schicht wurde in vacuo konzentriert.
(b). Zu einer gerührten Lösung von Boc-D-Orn(Boc)-OH (9,6 mg, 0,029 mmol) in DMF (1 ml) wurden BOP-Reagenz (13,3 mg, 0,030 mmol), HOBT-Hydrat (4,6 mg, 0,030 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (4,8 μl, 0,028 mmol) zugegeben. Nachdem die Mischung bei Raumtemperatur für 30 min gerührt worden war, wurde eine Lösung des rohen Rückstands (31,9 mg), welcher oben erhalten wurde, und N,N-Diisopropylethylamin (4,8 μl, 0,028 mmol) in DMF(1 ml) zu der Mischung zugegeben. Nachdem diese für 4 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde die Reaktionsmischung in vacuo konzentriert.
(c). Der rohe Rückstand, welcher oben erhalten wurde, wurde in TFA (1,5 ml) gelöst und bei 0°C für 1 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in vacuo konzentriert, und der Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 16,6 mg Aerothricin 128 als einen weißen amorphen Feststoff ergab: HPLC (Rt): 27,23 min (Säule F, Fließgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 55:35); FAB-MS (m/z): 1761 [MH⁺].

Beispiel 29–2
Herstellung von Aerothricin 133
Aerothricin 133 wurde gemäß einem Verfahren hergestellt, welches dem in Beispiel 29-1 beschriebenen entsprach.
HPLC (Rt): 19,7 min (Säule F, Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 60:40); FAB-MS (m/z): 1761 [MH⁺].
Beispiel 30
Herstellung von Aerothricin 106 aus der Verbindung (IX)

(a). Eine Mischung von Fmoc-Tyr(Bu^t) (21 mg, 0,0457 mmol), HOBt-Monohydrat (6,6 mg, 0,0431 mmol), BOP-Reagenz (18,8 mg, 0,0424 mmol) und Diisopropylethylamin (DIEA, 20 μl) in DMF (0,5 ml) wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt und wurde dann zu einer Mischung von N(orn)-Boc-IX (19,3 mg, 0,0131 mmol), welche in Beispiel 6 erhalten wurde, und DIEA (10 μl) in DMF (1 ml) zugegeben. Nachdem bei Raumtemperatur für 3 h gerührt worden war, wurde die resultierende Mischung für 1 h mit Piperidin (0,375 ml) behandelt und wurde dann in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan und Diethylether gewaschen, um die Reagenzien zu entfernen. Die Reinigung des Rückstands durch HPLC ergab das gewünschte lineare Peptid A als einen weißen Feststoff (16,6 mg). HPLC (Rt) 19 min (Säule: Soken-ODS/20 × 250 mm, Fließgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: H₂O : CH₃CN = Gradient, 1 % AcOH).
(b). Eine Mischung von Fmoc-D-Ala-Monohydrat (1,2 mg, 0,034 mmol), HOBt-Monohydrat (4,7 mg, 0,031 mmol), BOP-Reagenz (13,6 mg, 0,031 mmol) und DIEA (8 μl) in DMF (0,5 ml) wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt und wurde dann zu einer Mischung des oben erhaltenen linearen Peptids A (16,6 mg, 0,0098 mmol) und DIEA (6 μl) in DMF (1 ml) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur gerührt, und der aktivierte Ester wurde zugegeben, bis das Ausgangsmaterial fast vollständig aufgebraucht war. Die resultierende Mischung wurde in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan und Diethylether gewaschen, um die Reagenzien zu entfernen. Das rohe Produkt wurde bei 0°C für 1 h mit Trifluoressigsäure behandelt. Die Mischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Die Reinigung des Rückstands durch HPLC ergab das gewünschte lineare Peptid B als einen weißen Feststoff (6,1 mg). HPLC (Rt) 19 min (Säule: Soken-ODS/20 × 250 mm, Fließgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: H₂O : CH₃CN = Gradient, 1 % AcOH).
(c). Eine Mischung von Boc-D-Orn(Bu^t) (5,7 mg, 0,017 mmol), HOBt-Monohydrat (2,3 mg, 0,015 mmol), BOP-Reagenz (5,4 mg, 0,012 mmol) und DIEA (6 μl,) in DMF (0,5 ml) wurde bei Raumtemperatur für 1 h gerührt und wurde dann zu einer Mischung des linearen Peptids B (6,1 mg, 0,0033 mmol) und DIEA (3 μl) in DMF (1 ml) zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 2 h wurde die resultierende Mischung für 1 h mit Piperidin (0,375 ml) behan delt und wurde in vacuo konzentriert. Die Reinigung des Rückstands durch HPLC ergab das lineare Peptid C als einen weißen Feststoff (4,1 mg). HPLC (Rt) 16,7 min (Säule: Soken-ODS/20 × 250 mm, Fließgeschwindigkeit: 9 ml/min, Elutionsmittel: H₂O : CH₃CN = Gradient, 1% AcOH).
(d). Das lineare Peptid C wurde mit 0,01 N Hydrochlorid angesäuert und wurde mit n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wurde in vacuo konzentriert. Der Extrakt wurde in DMF (2 ml) gelöst. Dann wurden HOBt-Monohydrat (0,1 M in DMF, 60 μl), BOP-Reagenz (0,1 M in DMF, 60 μl) und DIEA (2 μl) zu der Mischung zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 1 h wurde die resultierende Mischung in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde bei 0°C für 1 h mit Trifluoressigsäure behandelt. Die Mischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Die Reinigung des Rückstands durch HPLC ergab Aerothricin 106 als einen weißen Feststoff (2,2 mg, 9% von N(orn)-Boc-IX).

Die analytischen Daten werden in der Tabelle von Beispiel 16 beschrieben.
Beispiel 31
Herstellung von Aerothricin 137

(a). Zu einer Lösung von Aerothricin 3-Mono-TFA-Salz (622 mg) in Dichlormethan (16 ml) und MeOH (4 ml) wurden N-Boc-Aminoethanal (120 mg) und N-Ethyldiisopropylamin (0,072 ml) zugegeben. Nachdem diese für 1 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurden zu der Reaktionsmischung Natriumcyanoborhydrid (48 mg) und Schwefelsäure (0,04 ml) zugegeben. Nachdem die Reaktionsmischung für 72 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel in vacuo verdampft, und dann wurde 0,1 N HCl zugegeben. Sie wurde mit nBuOH extrahiert und konzentriert.
(b). Der Rückstand wurde in DMF (6 ml) gelöst, wozu 2-(S)-[Bis-(2-Boc-aminoethyl)amino]-5-Boc-aminopentansäure (294 mg), HOAt (77 mg), HBTU (215 mg) und N-Ethyldiisopropylamin (0,148 ml) zugegeben wurden. Nachdem dieses für 48 h bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel in vacuo verdampft, und der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst. Zu dieser Lösung wurde Ether zugegeben, was einen weißen Nieder schlag ergab. Dieser wurde mit Ether gewaschen und in dem nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
(c). Zu der oben erhaltenen Verbindung wurde dann bei 0°C TFA (3 ml) zugegeben. Nachdem diese bei 0°C für 30 min gerührt worden war, wurde Ether zu der Reaktionsmischung zugegeben, was einen weißen Niederschlag ergab. Dieser wurde mit Ether gewaschen und durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, eingefroren und lyophilisiert, was 95 mg Aerothricin 137 als einen farblosen amorphen Fest stoff ergab: HPLC (Rt): 14,6 min (Säule F, Fließgeschwindigkeit: 10 ml/min, Elutionsmittel: 0,05% Trifluoressigsäure-Wasser : 0,05% Trifluoressigsäure-Acetonitril = 61:39); FAB-MS (m/z): 1776 [M+H]⁺.

Beispiel 32
201 mg Aerothricin 106 und 599 mg Calciumcarbonat (mittlere Partikelgröße: 40~60 μm) wurden mit einem Mikrospatel in einem Becherglas gut gemischt. Dann wurden 200 μl destilliertes Wasser zugegeben, und das Mischen wurde fortgesetzt, bis die Mischung pastös wurde. Der resultierende pastöse Feststoff wurde bei –5°C über Nacht gefriergetrocknet und weiterhin für 3 h in vacuo bei 30°C getrocknet. Nachdem große Partikel in dem trockenen Pulver zu kleinen Partikeln aufgebrochen worden waren, wurden 8 mg Calciumstearat zugegeben. Die Mischung wurde dreimal durch ein 180 μm-Sieb geführt.
Beispiel 33
8 mg Klebreispulver und 591 mg Calciumcarbonat (mittlere Partikelgröße: 4060 um) wurden mit einem Mikrospatel in einem Becherglas gut gemischt. Dann wurden 201 mg Aerothricin 106 zugegeben und gut gemischt. Zu der Mischung wurden 200 μl destilliertes Wasser zugegeben, und das Mischen wurde fortgesetzt, bis die Mischung pastös wurde. Der resultierende pastöse Feststoff wurde bei –5°C über Nacht gefriergetrocknet und weiterhin für 3 h in vacuo bei 30°C getrocknet. Nachdem große Partikel in dem trockenen Pulver zu kleinen Partikeln aufgebrochen worden waren, wurden 8 mg Calciumstearat zugegeben. Die Mischung wurde dreimal durch ein 180 μm-Sieb geführt.
Beispiel 34
201 mg Aerothricin 106 und 599 mg Reispulver (mittlere Partikelgröße: 4590 μm) wurden mit einem Mikrospatel in einem Becherglas gut gemischt. Dann wurden 400 μl destilliertes Wasser zugegeben, und das Mischen wurde fortgesetzt, bis die Mischung pastös wurde. Der resultierende pastöse Feststoff wurde bei –5°C über Nacht gefriergetrocknet und weiterhin für 3 h in vacuo bei 30°C getrocknet. Nachdem große Partikel in dem trockenen Pulver zu kleinen Partikeln aufgebrochen worden waren, wurden 8 mg Calciumstearat zugegeben. Die Mischung wurde dreimal durch ein 180 μm-Sieb geführt.
Beispiel 35
201 mg Aerothricin 106 und 599 mg Maisstärke (mittlere Partikelgröße: 20180 μm) wurden mit einem Mikrospatel in einem Becherglas gut gemischt. Dann wurden 500 μl destilliertes Wasser zugegeben, und das Mischen wurde fortgesetzt, bis die Mischung pastös wurde. Der resultierende pastöse Feststoff wurde bei –5°C über Nacht gefriergetrocknet und weiterhin für 3 h in vacuo bei 30°C getrocknet. Nachdem große Partikel in dem trockenen Pulver zu kleinen Partikeln aufgebrochen worden waren, wurden 8 mg Calciumstearat zugegeben. Die Mischung wurde dreimal durch ein 180 μm-Sieb geführt.
Beispiel 36
201 mg Aerothricin 133 und 599 mg Calciumcarbonat (mittlere Partikelgröße: 4060 μm) wurden mit einem Mikrospatel in einem Becherglas gut gemischt. Dann wurden 200 μl destilliertes Wasser zugegeben, und das Mischen wurde fortgesetzt, bis die Mischung pastös wurde. Der resultierende pastöse Feststoff wurde bei –5°C über Nacht gefriergetrocknet und weiterhin für 3 h in vacuo bei 30°C getrocknet. Nachdem große Partikel in dem trockenen Pulver zu kleinen Partikeln aufgebrochen worden waren, wurden 8 mg Calciumstearat zugegeben. Die Mischung wurde dreimal durch ein 180 μm-Sieb geführt.
Beispiel 37
201 mg Aerothricin 132 und 599 mg Calciumcarbonat (mittlere Partikelgröße: 4060 μm) wurden mit einem Mikrospatel in einem Becherglas gut gemischt. Dann wurden 200 μl des tilliertes Wasser zugegeben, und das Mischen wurde fortgesetzt, bis die Mischung pastös wurde. Der resultierende pastöse Feststoff wurde bei –5°C über Nacht gefriergetrocknet und weiterhin für 3 h in vacuo bei 30°C getrocknet. Nachdem große Partikel in dem trockenen Pulver zu kleinen Partikeln aufgebrochen worden waren, wurden 8 mg Calciumstearat zugegeben. Die Mischung wurde dreimal durch ein 180 μm-Sieb geführt.
Beispiel 38
201 mg Aerothricin 133 und 599 mg Calciumcarbonat (mittlere Partikelgröße: 4060 μm) wurden mit einem Mikrospatel in einem Becherglas gut gemischt. Dann wurde eine Lösung von 2,4 mg Gelatine in 500 μl destilliertem Wasser zugegeben, und das Mischen wurde fortgesetzt, bis die Mischung pastös wurde. Der resultierende pastöse Feststoff wurde bei –5°C über Nacht gefriergetrocknet und weiterhin für 3 h in vacuo bei 30°C getrocknet. Nachdem große Partikel in dem trockenen Pulver zu kleinen Partikeln aufgebrochen worden waren, wurden 8 mg Calciumstearat zugegeben. Die Mischung wurde dreimal durch ein 180 μm-Sieb geführt.
Beispiel 39
201 mg MK0991 und 599 mg Calciumcarbonat (mittlere Partikelgröße: 4060 μm) wurden mit einem Mikrospatel in einem Becherglas gut gemischt. Dann wurden 200 μl destilliertes Wasser zugegeben, und das Mischen wurde fortgesetzt, bis die Mischung pastös wurde. Der resultierende pastöse Feststoff wurde bei –5°C über Nacht gefriergetrocknet und weiterhin für 3 h in vacuo bei 30°C getrocknet. Nachdem große Partikel in dem trockenen Pulver zu kleinen Partikeln aufgebrochen worden waren, wurden 8 mg Calciumstearat zugegeben. Die Mischung wurde dreimal durch ein 180 μm-Sieb geführt.

Claims

Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung, umfassend: i) ein antifungales cyclisches Peptid, ii) einen physiologisch verträglichen pulverförmigen oder kristallinen Träger, der entweder ein mehrwertiges Metall oder einen organischen Träger enthält, und iii) einen Absorptionsverstärker, wobei eine antifungal wirksame Menge des antifungalen cyclischen Peptids homogen in dem physiologisch verträglichen pulverförmigen oder kristallinen mehrwertigen Metallträger oder organischen Träger dispergiert wird und homogen daran adsorbiert wird, dessen mittlere Partikelgrösse in dem Bereich von 20 bis 500 μm liegt.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Absorptionsverstärker ein pharmazeutisch verträgliches natürliches oder nicht natürliches Polymermaterial ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Cellulose, Stärke, einem anderen natürlichen Polymer, einem synthetischen Polymer und deren Derivaten.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Cellulose und deren Derivate ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus kristalliner Cellulose, Methylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Ethylcellulose, Celluloseacetat und Carboxymethylcellulose.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Stärke und deren Derivate ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus Maisstärke, Kartoffelstärke, Reisstärke, Klebreisstärke, Weizenstärke, vorgelatinisierter Stärke, Dextrin, Natriumcarboxymethylstärke, Hydroxypropylstärke und Pullulan.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das andere natürliche Polymer ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus Agar, Natriumalginat, Chitin, Chitosan, Eigelblecithin, Gummi arabicum, Tragant, Gelatine, Collagen, Casein, Albumin, Fibrinogen und Fibrin.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das synthetische Polymer ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus Natriumpolyacrylat und Polyvinylpyrrolidon.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Absorptionsverstärker ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus Reis, Klebreis, Stärke, Gelatine, Dextrin, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Eigelblecithin, Gummi arabicum, Tragant und einer Mischung von diesen.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Absorptionsverstärker Klebreis ist.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der physiologisch verträgliche pulverförmige oder kristalline Träger ein organischer Träger ist.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei der organische Träger ein feinkörniges Pulver ist.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das feinkörnige Pulver ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus pulverisiertem Reis, Weizen, Buchweizen, Gerste, Sojabohnen, Mais, Hirse und Kolbenhirse.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der physiologisch verträgliche pulverförmige oder kristalline Träger ein mehrwertiger Metallträger ist.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei der mehrwertige Metallträger eine zweiwertige Metallverbindung ist, die ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus einer Aluminiumverbindung, Calciumverbindung, Magnesiumverbindung, Siliciumverbindung, Eisenverbindung und Zinkverbindung.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Aluminiumverbindung ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus trockenem Aluminiumhydroxygel, Aluminiumhydroxychlorid, synthetischem Aluminiumsilicat, leichtem Aluminiumoxid, kolloidalem Aluminiumsilicathydrat, Aluminiummagnesiumhydroxid, Aluminiumhydroxid, Aluminiumhydroxidgel, Aluminiumsulfat, Dihydroxyaluminiumaminoacetat, Aluminiumstearat, natürlichem Aluminiumsilicat, Aluminiummonostearat und Kaliumaluminiumsulfat.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Aluminiumverbindung Aluminiumhydroxid ist.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Calciumverbindung ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus Apatit, Hydroxyapatit, Calciumcarbonat, Calciumdinatrium-EDTA, Calciumchlorid, Calciumcitrat, Calciumglycerophosphat, Calciumgluconat, Calciumsilicat, Calciumoxid, Calciumhydroxid, Calciumstearat, dreiwertigem Calciumphosphat, Calciumlactat, Calciumpantothenat, Calciumoleat, Calciumpalmitat, Calcium-D-pantothenat, Calciumalginat, Calciumphosphatanhydrid, Calciumhydrogenphosphat, primärem Calciumphosphat, Calciumacetat, Calciumsaccharat, Calciumsulfat, sekundärem Calciumphosphat, Calciumparaaminosalicylat und Biocalcilutit-Verbindungen.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Calciumverbindung Hydroxyapatit, Calciumcarbonat oder Calciumlactat ist.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Magnesiumverbindung ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus Magnesium-L-aspartat, Magnesiumchlorid, Magnesiumgluconat, Magnesiumaluminatsilicat, Magnesiumsilicat, Magnesiumoxid, Magnesiumhydroxid, Magnesiumstearat, Magnesiumcarbonat, Magnesiumaluminatmetasilicat, Magnesiumsulfat, Natriummagnesiumsilicat und synthetischem Natriummagnesiumsilicat.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Magnesiumverbindung Magnesiumstearat ist.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Siliciumverbindung ausgewählt ist aus Siliciumoxidhydrat, leichtem Kieselsäureanhydrid, synthetischem Hydrotalcit, Diatomeenerde oder Siliciumdioxid.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Eisenverbindung Eisen(II)-sulfat ist.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Zinkverbindung ausgewählt ist aus Zinkchlorid, Zinkstearat, Zinkoxid oder Zinksulfat.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 und 12 bis 22, wobei der physiologisch verträgliche pulverförmige oder kristalline Träger, welcher ein mehrwertiges Metall enthält, eine mittlere Partikelgrösse von 20 bis 250 μm, vorzugsweise von 20 bis 100 μm aufweist.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei die mittlere Partikelgrösse des physiologisch verträglichen pulverförmigen oder kristallinen Trägers, welcher ein mehrwertiges Metall enthält, von 20 bis 60 μm reicht.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die mittlere Partikelgrösse des physiologisch verträglichen pulverförmigen oder kristallinen Trägers, welcher einen organischen Träger enthält, von 20 μm bis 300 μm reicht.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 25, wobei das antifungale cyclische Peptid irgendein Aerothricin ist, das durch die Formel (I) dargestellt wird,
worin R¹ Guanidino, Tri-C_1-6-alkylammonio, -N(R¹⁰)-R¹¹, -N(R¹⁵)-CO-R¹⁴, -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³, -NHCOCH(R¹³)-NHCOCH(NH₂)-R¹³,

R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff; Heteroaryl, welches mit ein oder zwei Aminogruppen substituiert ist; C_1-6-Alkyl, das gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem oder zwei Amino, Amino-C_1-6-alkyl, Cyano, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Amino-,Amidino- oder Guanidinogruppe enthalten; R¹³ ein Rest ist, der von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist; R¹⁴ C_1-6-Alkyl ist, welches substituiert ist mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem oder zwei Amino, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Amino-, Amidino- oder Guanidinogruppe enthalten; R¹⁵ Wasserstoff, C_1-6-Alkyl, das gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem oder zwei Amino, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en) oder einer Phenylgruppe(n), welche eine Amino-,Amidino- oder Guanidinogruppe enthalten, ist; R² Wasserstoff, Hydroxysulfonyl, C_1-6-Alkyl oder C_2-6-Alkenyl ist, wobei C_1-6-Alkyl und C_2-6-Alkenyl gegebenenfalls substituiert sein können mit Acyl, Carbamoyl, Amino, Mono-C_1-6-alkylamino oder Di-C_1-6-alkylamino; R³ Wasserstoff, Hydroxy, Nitro, Amino, Acylamino, (C_2-7-Alkylcarbamoyl)amino, Carboxyl, C_1-6-Alkoxy, C_2-7-Alkoxycarbonyl, C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl oder C_2-6-Alkinyl ist, wobei C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl und C_2-6-Alkinyl gegebenenfalls substituiert sein können mit Hydroxy, Amino, Mono-C_1-6-alkylamino, Di-C_1-6-alkylamino, C_2-7-Alkoxycarbonyl oder Carbamoyl; R⁴ Alkyl, Alkenyl, Alkoxy oder Alkenyloxy ist, welche gegebenenfalls substituiert sein können mit C_1-6-Alkyl, Aryl, Cycloalkyl oder einem Fluoratom(en); R⁵ -CONH₂, -CN oder -CH₂NH₂ ist; X eine Einfachbindung ist oder eine Aryl-, Biphenyl- oder Terphenylgruppe, welche gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatom(e) enthält und/oder mit einem Halogenatomen) oder C_1-6-Alkyl substituiert ist; Y eine Einfachbindung, -CH₂-, -CH(niederes Alkyl)-, -CONH- oder -CON(C_1-6-Alkyl)- ist; Z -O-, -NH- oder -N(C_1-6-Alkyl) ist; m ein ganze Zahl von Q bis 4 ist; und n eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist; oder pharmazeutische verträgliche Salze von diesen.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei das antifungale cyclische Peptid irgendeines der Aerothricine ist, welche durch die Formel (I) dargestellt werden, worin R¹-N(R¹⁰)-R¹¹, -N(R¹⁵)-CO-R¹⁴, -N(R¹⁵)-CO-CH[N(R¹⁰)R¹¹]-R¹³, –NHCOCH(R¹³)-NHCOCH(NH₂)-R¹³,
R¹⁰ und R¹¹ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus Wasserstoff, C_1-6-Alkyl, welches gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem oder zwei Amino, Amino-C_1-6-alky, Cyano, Guanidino oder einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en); R¹³ ein Rest ist, der von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren abgeleitet ist; R¹⁴ C_1-6-Alkyl ist, das substituiert ist mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem oder zwei Amino, Guanidino, einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en); R¹⁵ Wasserstoff, C_1-6-Alkyl ist, das gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem oder zwei Amino, Guanidino oder einem stickstoffhaltigen Heterocyclus(en); R² Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl ist; R³ Wasserstoff, Hydroxy oder Amino ist; R⁴ Alkyl ist; R⁵ -CONH₂, -CN oder -CH₂NH₂ ist; X eine Einfachbindung ist; Y eine Einfachbindung, -CH₂-, CH(C_1-6-Alkyl)- ist; Z -O- ist, m eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist; und n eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist; oder pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei das antifungale cyclische Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Aerothricinen 1–5, 14, 15, 17, 31, 32, 63, 96, 101–122, 124, 126–137.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei das antifungale cyclische Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Aerothricinen 132–137.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 25, wobei das antifungale cyclische Peptid irgendeines der Echinocandin-Analogen ist.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei das Echinocandin-Analoge LY303366 oder FK463 ist.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei das Echinocandin-Analoge irgendeines der Pneumocandin-Analogen ist.
Eine nasal verabreichbare Zusammensetzung nach Anspruch 32, wobei das Pneumocandin-Analoge MK0991 ist.
Die Verwendung der nasal verabreichbaren Zusammensetzung, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 33 definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Mykosen.
Ein Verfahren zur Herstellung einer nasal verabreichbaren Zusammensetzung, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 33 definiert, wobei das Verfahren das homogene Dispergieren einer physiologisch wirksamen Menge eines antifungalen cyclischen Peptids in einem physiologisch verträglichen pulverförmigen oder kristallinen Träger, der entweder ein mehrwertiges Metall oder einen organischen Träger enthält, in Gegenwart eines Absorptionsverstärkers und das Adsorbieren der aktiven Substanz auf diesem umfasst.