DE60037126T2

DE60037126T2 - POLYMORPHISMEN DES MENSCHLICHEN HPXR Gens UND IHRE ANWENDUNG IN DIAGNOSE UND THERAPIE

Info

Publication number: DE60037126T2
Application number: DE60037126T
Authority: DE
Inventors: Leszek Wojnowski; Elisabeth Hustert
Original assignee: Epidauros Biotechnologie AG
Current assignee: Epidauros Biotechnologie AG
Priority date: 1999-09-10
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2008-09-18
Anticipated expiration: 2020-09-09
Also published as: AU7001800A; US7122652B1; US7655771B1; WO2001020025A3; DE60037126D1; WO2001020026A2; EP1210462A2; ATE378423T1; EP1210463A2; NO20021147L; WO2001020026A3; EP1210462B1; AU7513300A; CA2381066A1; JP2003509063A; CA2379541A1; NO20021146D0; EP1088900A1; JP2003509064A; NO20021146L

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Mittel und Verfahren für die Diagnose und Behandlung des phänotypischen Spektrums ebenso wie der überlappenden klinischen Charakteristika bei mehreren Formen der vererbten abnormen Expression und/oder Funktion des menschlichen Pregnan X-Rezeptor (hPXR)-Gens. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Polynucleotid eines molekular varianten hPXR-Gens, wie es in SEQ ID NO: 112, 113 oder 174 gezeigt ist, das zum Beispiel mit einer abnormen Reaktion auf Arzneistoffe oder einer individuellen Prädisposition auf mehrere allgemeine Krebsarten assoziiert ist, die von Umweltkarzinogenen verursacht werden, und Vektoren, die solche Polynucleotide umfassen. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die solche Polynucleotide oder Vektoren enthalten, und ihre Verwendung für die Produktion eines varianten hPXR-Proteins. Außerdem betrifft die vorliegende Offenbarung ein variantes hPXR-Protein und sie beschreibt Antikörper, die ein solches Protein spezifisch erkennen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch transgene nicht-menschliche Tiere, die die vorstehend beschriebenen Polynucleotide oder Vektoren enthalten. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren für die Identifikation und Gewinnung von Arzneistoffkandidaten und Inhibitoren für die Therapie von Störungen, die mit der Fehlfunktion des hPXR-Gens zusammenhängen. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen, die die vorstehend beschriebenen Polynucleotide, Vektoren, Wirtszellen oder Proteine enthalten. Die besagten Zusammensetzungen sind insbesondere bei der Diagnose und Behandlung von verschiedenen Krankheiten mit Arzneistoffen von Nutzen, die Substrate, Inhibitoren oder Modulatoren des hPXR-Gens oder ihres Produkts sind. Im Text dieser Beschreibung werden mehrere Dokumente zitiert.
Hintergrund der Erfindung
Die Mitglieder der Cytochrom P-450 (CYP)-Familie der Hämoproteine metabolisieren eine große Vielzahl von endogenen Substraten wie Steroidhormone und Xenobiotika einschließlich Karzinogenen, Toxinen und Arzneistoffen (1, 2). Von den menschlichen CYP-Proteinen sind die der CYP3A-Unterfamilie von größerer Bedeutung, weil sie gemeinsam bei weitem die häufigsten aller menschlichen CYP-Isoformen sind. Darüber hinaus ist ihre Substratspezifität extrem breit; dementsprechend sind viele strukturell verschiedene Verbindungen ausschließlich oder in gewissem Ausmaß Substrate für die CYP3A-Proteine. Auf der Grundlage der verfügbaren Ergebnisse nimmt man im Allgemeinen an, dass alle CYP3A-Isoformen ähnliche Substratspektren haben; beschränkte Untersuchungen legen jedoch die Möglichkeit von Unterschieden nahe (3). Alle CYP3A-Isoformen sind in Organen von besonderer Bedeutung für die Arzneistoffdisposition lokalisiert (Verdauungstrakt, Niere und Leber).
In Menschen existieren mindestens drei funktionelle CYP3A-Proteine. Die CYP3A4-Monooxygenase ist das vorherrschende Cytochrom P450 in menschlicher Leber und im Dünndarm. Das Protein zeigt eine breite Substratspezifität und es metabolisiert mehr als 60% aller Arzneistoffe, die gegenwärtig in Verwendung sind, einschließlich kontrazeptiver Steroide, Antidepressiva, Benzodiazepine, immunsuppressiver Mittel, Imidazol-Antimikotika und Macrolid-Antibiotika (4, 5). Außerdem spielt CYP3A4 eine wichtige Rolle beim Schutz vor Umweltgiften. Zum Beispiel metabolisiert das Protein Aflatoxin B1, das beim Entstehen von Leberkrebs eine Rolle spielt, der in vielen Gebieten von Afrika und Asien eine Hauptursache von frühem Tod ist. Aflatoxin B1 ist ein Mycotoxin, das von Arten von Aspergillus produziert wird, und das Einwirken auf den Menschen ist hauptsächlich das Resultat des Verzehrs von gelagerten Lebensmitteln, die mit dem Schimmel kontaminiert sind. Die karzinogene Eigenschaft ist mit der Umwandlung zu dem 8,9-Oxid durch das von Cytochrom P-450 abhängige Monooxygenase-System der Leber assoziiert. Forrester et al. (6) haben gefunden, dass die Rate der metabolischen Aktivierung von Aflatoxin B1 hoch korreliert war mit dem Spiegel von Proteinen der CYP3A-Genfamilien in den Mikrosomen. Darüber hinaus haben Paolini et al. (7) einen signifikanten Anstieg an CYP3A in der Lunge von Ratten gefunden, die mit hohen Dosen an beta-Carotin behandelt wurden. Folglich wurde vorgeschlagen, dass entsprechend hohe Spiegel an CYP3A4 in Menschen eine Prädisposition eines Individuums für Krebsrisiko durch biologisch aktivierte Tabakrauch-Prokarzinogene bedeuten würden, womit der co-karzinogene Effekt von beta-Carotin bei Rauchern erklärt wäre. All dies legt nahe, dass individuelle Variationen bei der CYP3A4-Aktivität die Wirksamkeit einer Reihe von Arzneistofftherapien beeinflussen könnten, ebenso wie die individuelle Prädisposition für mehrere wichtige Krebsarten, die von Umweltkarzinogenen verursacht werden.
In der Bevölkerung wurde in der Tat eine beträchtliche Variation beim Gehalt und der katalytischen Aktivität von CYP3A4 beschrieben. Zum Beispiel zeigt die metabolische Clearance von Gensubstraten eine unimodale Verteilung mit bis zu 20-facher Variabilität zwischen Individuen. Die Aktivitäten des CYP3A4-Proteins in Leberbiopsien variieren bis zu 30-fach (8). Darüber hinaus verändern viele gewöhnliche Arzneistoffe die Expressionsspiegel des Gens (Induktion oder Repression) und das Ausmaß dieses Phänomens ist individuell variabel. Die Induzierer der CYP3A4-Expression umfassen üblicherweise verwendete Arzneimittel wie Glucocorticoiddexamethason, das Antibiotikum Rifampicin und das Antimycoticum Clotrimazol. Die Induzierbarkeit der CYP3A4-Expression, kombiniert mit verschiedenen Bereichen von Substraten, schafft ein Potential für potentiell schädliche Arzneistoffwechselwirkungen unter Einschluss dieses Isoenzyms in Patienten, die Therapien mit mehreren Arzneistoffen durchlaufen.
CYP3A3 ist eine eng verwandte mit Isoform von CYP3A4 (> mehr als 98% Sequenzähnlichkeit der cDNA), es ist aber nicht bekannt, ob dies ein separates Genprodukt reflektiert oder eine allelische Variante. Im Gegensatz dazu ist CYP3A5 ein von CYP3A4 verschiedenes Gen und es wird polymorph in der Erwachsenenleber und der fötalen Leber und in der Niere und dem Darm exprimiert. Bei erwachsenen Kaukasiern wurden die mRNA und das Protein in der Leber von 10 bis 30% der Proben nachgewiesen, während das Protein in der Niere und dem Darm von 70% der Individuen (Ref (9) und Referenzen dort) nachgewiesen wurde. Eine Punktmutation, die im CYP3A5-Gen beschrieben wird und die möglicherweise in der Synthese eines instabilen Proteins resultiert, könnte für die polymorphe Expression dieses Enzyms verantwortlich sein (9). CYP3A7 ist die dritte funktionelle CYP3A-Isoform. CYP3A7 wurde ursprünglich aus einer fötalen Leber isoliert, wurde dann aber in 54% der Leber von Erwachsenen gefunden (10).
Tests zur Abschätzung der Induzierbarkeit und der Aktivität der CYP3A-Isoenzyme in einem einzelnen Patienten wären von offensichtlicher Relevanz für die Optimierung von Therapien mit Arzneistoffen, die ihre Substrate sind, und für die Verhinderung der assoziierten Nebenwirkungen. Die direkte Abschätzung der Aktivitäten von CYP3A-Isoenzymen in Leberbiopsien ist möglich, aber aus ethischen und Kostengründen nicht praktikabel. Die indirekten in vivo-Tests der CYP3A4-Aktivität wie der Erythromycin-Atemtest oder der 6-β-Hydroxycortisol-Test werfen ethische Probleme auf, wie die invasive Verabreichung von unerwünschten Probensubstanzen, und sie sind offensichtlich nicht geeignet für die Routinetestung. Außerdem stellt das Fehlen einer Korrelation zwischen diesen Tests ihren Informationswert hinsichtlich der CYP3A4-Aktivität in Frage (11).
Ein großer Teil (83%) der Variabilität von CYP3A4 zwischen Individuen wurde genetischen Faktoren zugeordnet (12). Die Erarbeitung eines genetischen Tests für die Aktivität von CYP3A4 und der anderen CYP3A-Isoenzyme sollte unter der Annahme der vorherigen Identifikation dieser Faktoren möglich sein. Die genetische Varianz, die die Aktivität und die Expression der CYP3A-Isoenzyme beeinflußt, könnte in den Genen selbst lokalisiert sein oder in einem oder mehreren ihrer Regulatoren. Ein Vergleich der drei ursprünglich publizierten Sequenzen des am besten charakterisierten CYP3A-Gens, CYP3A4, legte die Existenz von Polymorphismen nahe, die die Aminosäuresequenz des CYP3A4-Proteins beeinflussen (13). Unglücklicherweise wurde diese Beobachtung nach unserem Wissen in der Bevölkerung nicht bestätigt. Kürzlich wurde in dem Nifedipinspezifischen Response-Element des CYP3A4 ein Polymorphismus (CYP3A4-W) beschrieben (14). Seine Anwesenheit ist mit einem fortgeschrittenen Stadium von Prostatatumor (14) assoziiert. Felix et al. (15) untersuchten diesen Polymorphismus in 99 de novo- und 30 mit einer Behandlung zusammenhängenden Leukämien. Bei allen mit einer Behandlung zusammenhängenden Fällen gab es vorher eine Begegnung mit einem oder mehreren Krebsmitteln, die von CYP3A metabolisiert werden, wie Epipodophyllotoxinen. Diese Daten legen nahe, dass Individuen mit dem CYP3A4-W-Polymorphismus ein erhöhtes Risiko für mit einer Behandlung zusammenhängender Leukämie haben könnten und dass der Epipodophyllotoxin-Metabolismus durch CYP3A4 zu dem sekundären Krebsrisiko beitragen könnte. Zur Zeit ist es unklar, ob der Polymorphismus die Expressionshöhe oder die induzierbarkeit des CYP3A4-Proteins beeinflusst. Eine zuerst publizierte Analyse legt nahe, dass er keinen Effekt auf den Grundexpressionsspiegel von CYP3A4 hat (8). In CYP3A5 (9) wurde eine Punktmutation beschrieben, während in CYP3A7 keine Mutationen beschrieben wurden.
Experimente mit Aminosäureaustäuschen, die künstlich in das CYP3A4-Gen eingebracht worden waren, zeigen, dass die Funktion der Familienmitglieder ziemlich sensitiv gegenüber Aminosäureaustäuschen sein können (16–21). Neben Aminosäureaustäuschen könnten auch stille Polymorphismen und diejenigen, die in nicht translatierten oder intronischen Sequenzen lokalisiert sind, das Expressionsniveau dieser Gene beeinflussen. Alternativ könnten solche Polymorphismen als Marker für nicht identifizierte Polymorphismen in der Nähe dienen. Dieser Effekt ist als Kopplung bekannt, d. h. definierte Polymorphismen dienen als Marker für Phänotypen, deren Ursache sie nicht sind.
Ein wichtiger Durchbruch beim Verständnis der CYP3A4-Expression und – Induzierbarkeit entstand 1998, als drei Forschungsgruppen unabhängig zeigten, dass die Expression von CYP3A4 durch ein Mitglied der Orphan Nuclear Receptor-Familie mit dem Namen hPXR (Pregnan X-Rezeptor) oder PAR reguliert wird (22–24). Bei Behandlung mit Induktoren von CYP3A4 bindet hPXR an das Rifampicin/Dexamethason-Response-Element im CYP3A4-Promotor als ein Heterodimer mit dem 9-cis Retinsäure-Rezeptor (RXR). Die Northern-Blot-Analyse wies die stärkste Expression von hPXR in der Leber, dem Colon und dem Dünndarm nach, d. h. in den Hauptorganen, die CYP3A4 exprimieren. Die verfügbaren Befunde legen nahe, dass menschliches hPXR als der entscheidende Transkriptionsregulator des CYP3A4-Gens dient. Ein kürzlicher Bericht beschreibt die von hPXR vermittelte Induktion von CYP3A7, was nahe legt, dass alle Mitglieder der Familie von diesem allgemeinen Transkriptionsaktivator reguliert werden (25).
Es ist klar, dass natürlicherweise vorkommende Mutationen in hPXR, wenn sie existieren, Effekte auf den Arzneistoffmetabolismus und die Wirksamkeit von Therapien mit Arzneistoffen haben können, insbesondere bei der Krebsbehandlung. Es ist jedoch unbekannt, wie viele solche Varianten und mit welcher Häufigkeit und an welchen Positionen im menschlichen hPXR-Gen existieren.
Dementsprechend waren Mittel und Verfahren für die Diagnose und Behandlung einer Vielzahl von Formen von individueller Arzneistoffunverträglichkeit und Arzneistoffwirkungslosigkeit, die von Polymorphismen des hPXR-Gens resultieren, die z. B. mit der chemotherapeutischen Behandlung von Krankheiten, insbesondere Krebs, interferieren, bisher nicht verfügbar, aber dennoch höchst erwünscht.
Das technische Problem der vorliegenden Erfindung ist somit die Lösung des vorstehend beschriebenen Bedarfs.
Die Lösung des technischen Problems wird durch die Bereitstellung der Ausführungsformen erreicht, die in den Ansprüchen gekennzeichnet sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Auffinden von neuen, bislang unbekannten Variationen in der Nucleotidsequenz des hPXR-Gens und der Verteilung dieser Allele in der Bevölkerung. Auf der Basis des Wissens über diese neuen Sequenzen wurden diagnostische Tests und die Reagenzien für solche Tests für den spezifischen Nachweis und die Genotypisierung von hPXR-Allelen in Menschen geplant, einschließlich homozygoter als auch heterozygoter, häufiger ebenso wie seltener Allele des hPXR-Gens. Die Bestimmung des Status der Allele des hPXR-Gens von Menschen mit solchen Tests ist von Nutzen für die Optimierung von Therapien mit den zahlreichen Substraten von CYP3A4 und CYP3A7. Sie kann auch bei der Bestimmung der individuellen Prädisposition für mehrere übliche, von Umweltkarzinogenen verursachten Krebsarten von Nutzen sein.
Bei einer ersten Ausführungsform stellt die Erfindung Polynucleotide eines molekular varianten hPXR-Gens bereit, wie sie in SEQ ID NO: 112, 113 oder 174 gezeigt sind, und Polynucleotide, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 175 hat, und Ausführungsformen, die sich darauf beziehen, wie Vektoren, Wirtszellen, variante hPXR-Proteine und Verfahren für ihre Produktion.
Bei einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren für die Identifikation von Inhibitoren von hPXR für die Therapie von Störungen bereit, die sich auf eine erworbene Arzneistoffhyposensitivität oder Arzneistoffhypersensitivität beziehen, ebenso wie Verfahren für die Diagnose von Krebs, der auf den besagten molekularen Varianten beruht.
Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen bereit, die die vorstehend beschriebenen Polynucleotide enthalten, Vektoren, die dieselben enthalten, Wirtszellen, die dieselben enthalten, oder Proteine.
Die pharmazeutischen und diagnostischen Zusammensetzungen, die Verfahren und Verwendungen der Erfindung sind von Nutzen bei der Diagnose und Behandlung von Krebsarten, deren Therapie abhängig ist von einer Arzneistoffbehandlung und einer Arzneistofftoleranz. Die neue variante Form des hPXR-Gens gemäß der Erfindung stellt das Potential für die Entwicklung eines phamakodynamischen Profils eines Arzneistoffs für einen vorgegebenen Patienten bereit.
Beschreibung der Erfindung
Das Auffinden und die Charakterisierung von Variationen in den hPXR-Genen, und diagnostische Tests für die Unterscheidung von unterschiedlichen hPXR-Allelen in menschlichen Individuen stellen ein sehr wirkungsvolles Werkzeug für die Verbesserung der Therapie von Krankheiten mit Arzneistoffen bereit, die das Ziel der Genprodukte von CYP3A4 oder CYP3A7 sind und deren Metabolismus daher von CYP3A4 oder CYP3A7 abhängig ist. Die Diagnose des individuellen allelischen hPXR-Status erlaubt eine stärker fokussierte Therapie, z. B. durch Eröffnung der Möglichkeit der Anwendung eines individuellen Dosierungsschemas von Arzneistoffen. Sie kann auch als prognostisches Werkzeug für das Ergebnis einer Therapie von Nutzen sein. Darüber hinaus werden die diagnostischen Tests für die Genotypisierung von hPXR und neue hPXR-Varianten nicht nur die Therapie mit etablierten Arzneistoffen verbessern und dabei helfen, Genotypen mit Arzneistoffaktivität und Nebenwirkungen zu korrelieren. Diese Tests und Sequenzen stellen auch Reagenzien für die Entwicklung von neuen Inhibitoren bereit, die spezifisch die Aktivität der individuellen Typen von hPXR modulieren.
Somit stellt die vorliegende Offenbarung einen neuen Weg zur Ausnutzung der Molekularbiologie und der pharmakologischen Forschung für die Arzneistofftherapie bereit, wobei die potentiell schädlichen Effekte der Expression von varianten hPXR-Genen umgangen werden.
Dem entsprechend betrifft die Erfindung ein Polynucleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) einem Polynucleotid, das die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 112, 113 oder 174 hat;
(b) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 175 hat

Das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann auch wie folgt charakterisiert werden:

(c) ein Polynucleotid, das ein hPXR-Polypeptid codiert, wobei das besagte Polynucleotid an einer Position, die der Position 488 des hPXR-Gens (Zugangs-Nr: gi3769538, wobei das C der CTG-Translations-Initiationsstelle an der Position 280 als +1 nummeriert wurde) entspricht, ein G hat; oder
(d) ein Polynucleotid, das ein hPXR-Polypeptid codiert, wobei das besagte Polypeptid eine Aminosäuresubstitution von D zu G an der Position 163 des hPXR-Polypeptids (Zugangs-Nr: gi3769538) enthält.

Weitere Polynucleotide, die Variationen in hPXR-Genen haben und die hier offenbart werden, werden in der SEQ ID NO: 56, 57, 60, 61, 64, 65, 68, 69, 72, 73, 76, 77, 80, 81, 84, 85, 88, 89, 92, 93, 96, 97, 100, 101, 104, 105, 108, 109, 116, 117, 120, 121, 124, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 137, 140, 141, 144, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 157, 160, 161, 164, 165, 166, 168, 170, 172, 174 oder 176 gezeigt. Diese weiteren Polynucleotide sind dadurch gekennzeichnet, dass sie an einer Position, die der Position –201, –131, 52, 106, 418, 834, 1108, 1308 oder 1320 des hPXR-Gens entspricht (Zugangs-Nr: gi3769538, wobei das C der CTG-Translations-Initiationsstelle an der Position 280 als +1 nummeriert wurde), oder an einer Position, die der Position +99 von Intron 6 des hPXR-Gens entspricht (Zugangs-Nr: gi3769538, wobei Exon 6 an der Position 1216 endet), oder an einer Position, die der Position +43 von Intron 8 des hPXR-Gens entspricht (Zugangs-Nr: gi3769538, wobei Exon 8 an der Position 1439 endet), ein A haben, an einer Position, die der Position –57, 79, 315, 543, 696 oder 984 des hPXR-Gens entspricht (Zugangs-Nr: gi3769538, wobei das C der CTG-Translations-Initiationsstelle an der Position 280 als +1 nummeriert wurde), oder an einer Position, die der Position –29 von Intron 2 des hPXR-Gens entspricht (Zugangs-Nr: gi3769538, wobei Exon 3 an der Position 477 startet), an einer Position, die der Position –17 von Intron 6 des hPXR-Gens entspricht (Zugangs-Nr: gi3769538, wobei Exon 7 an der Position 1217 startet), oder an einer Position, die der Position +36 von Intron 7 des hPXR-Gens entspricht (Zugangs-Nr: gi3769538, wobei Exon 7 an der Position 1333 endet), ein T haben, an einer Position, die der Position –20 des hPXR-Gens entspricht (Zugangs-Nr: gi3769536, wobei das A am Startcodon ATG an der Position 60 als +1 nummeriert wurde), eine Deletion haben, an einer Position, die der Position –42, 225 oder 492 des hPXR-Gens entspricht (Zugangs-Nr: gi3769538, wobei das C der CTG-Translations-Initiationsstelle an der Position 280 als +1 nummeriert wurde), ein C haben oder an einer Position, die der Position –100 des hPXR-Gens entspricht (Zugangs-Nr: gi3769536, wobei das A am Startcodon ATG an der Position 60 als +1 nummeriert wurde), an einer Position, die der Position +72 von Intron 3 des hPXR-Gens entspricht (Zugangs-Nr: gi3769538, wobei Exon 3 an der Position 610 endet), oder an einer Position, die der Position –73 von Intron 6 des hPXR-Gens entspricht (Zugangs-Nr: gi3769538, wobei Exon 7 an der Position 1217 startet), ein G haben.
Weitere Polypeptide, die von Variationen in hPXR-Genen resultieren, die hier offenbart werden, sind in SEQ ID NO: 167, 169, 171, 173 oder 177 gezeigt. Diese weiteren Polypeptide sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäuresubstitution von E zu K an Position 18, von P zu S an Position 27, von G zu R an Position 36, von V zu M an Position 140 oder von A zu T an Position 370 des hPXR-Gens (Zugangs-Nr: gi3769538) haben.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "molekular variantes" hPXR-Gen oder -Protein, wie er hier verwendet wird, dass das besagte hPXR-Gen oder -Protein sich vom Wildtyp-hPXR-Gen oder -Protein durch Nucleotidsubstitution(en), -addition(en) und/oder -deletion(en) unterscheidet (cDNA-Sequenzen für das hPXR-Gen in Bertilsson, Proc Natl Acad Sci USA 95 (1998), 12208–13; Lehmann. J Clin Invest. 102 (1998), 1016–23; Zugangsnummern: AF061056 (gi3511137), AF084645 (gi376938), AF084644 (gi376936), AJ009936 (gi5852062), AJ009937 (gi5852066). Die Nummerierung der Polymorphismen bezieht sich auf die Sequenzen gi3769536 für die Varianten, die der Position –100 oder –20 des hPXRGens (Zugangs-Nr: gi3769536, wobei das A am Startcodon ATG an der Position 60 als +1 nummeriert wurde) entsprechen, oder gi3769538 für alle anderen Varianten des hPXR-Gens. Vorzugsweise resultiert/resultieren die Nucleotidsubstitution(en) in einer entsprechenden Veränderung in der Aminosäuresequenz des hPXR-Proteins.
Der Ausdruck "entsprechend", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass eine Position nicht nur durch die Zahl der vorhergehenden Nucleotide bzw. Aminosäuren bestimmt wird. Die Position eines gegebenen Nucleotids oder einer gegebenen Aminosäure gemäß der vorliegenden Erfindung, die deletiert, substituiert sein kann oder ein oder mehrere zusätzliche Nucleotide umfassen kann, kann wegen Deletionen oder zusätzlicher Nucleotide oder Aminosäuren woanders in dem Gen oder Polypeptid variieren. Somit ist unter einer "entsprechenden Position" gemäß der vorliegenden Erfindung zu verstehen, dass Nucleotide oder Aminosäuren bei der angegebenen Nummer differieren können, aber immer noch ähnliche benachbarte Nucleotide oder Aminosäuren haben können. Die Nucleotide oder Aminosäuren, die ausgetauscht oder deletiert werden können oder zusätzliche Nucleotide oder Aminosäuren umfassen können, werden ebenfalls von dem Ausdruck "entsprechende Position" umfasst. Die Nucleotide oder Aminosäuren können zum Beispiel mit ihren Nachbarn Sequenzen bilden, die in die Regulation der Genexpression, die Stabilität der entsprechenden RNA oder das RNA-Editing involviert sein können, ebenso wie sie funktionelle Domänen oder Motive des Proteins der Erfindung codieren können.
Die Nomenklatur der Varianten, die Einzelnucleotid-Polymorphismen (SNPs) umfassen, sind in der Spalte zwei von Tabelle 4 aufgelistet, basierend auf Antonarakis und der Nomenclature Working Group (Antonarakis, Hum Mutat 11 (1998), 1–3). Als Translations-Initiationsstelle wird das CTG mit dem C an Position 280 der cDNA (gi 3769538) als +1 nummeriert. Das Nucleotid 5' von +1 wird als –1 nummeriert. SNPs, die in Introns lokalisiert sind, werden durch die Zahl an Nucleotiden stromaufwärts (+) oder stromabwärts (–) der Nucleotidposition des ersten oder letzten Nucleotids eines Exons bezeichnet. SNPs, die in Exon 1b oder Intron 1b liegen, werden durch die Zahlen bezeichnet, die sich auf das A(+) des Start-ATG beziehen, das bei der Position 60 der vorstehend erwähnten Nomenklatur wäre, die die Zugangs-Nr: gi3769536 hat.
Es sollte weiterhin verstanden werden, dass ein Nucleotid benachbart zu einer Position, wo ein Exon endet oder startet, wie vorstehend angegeben, ein Intron startet oder endet. Eine Sequenz, die den Übergang Exon zu Intron oder Intron zu Exon umfasst, wird hier nachstehend auch als Exon-Intron-Grenze bezeichnet. Üblicherweise wird für alle Exons und/oder Introns eine fortlaufende Nummerierung angewendet. Vorzugsweise folgt Intron 1 auf Exon 1, folgt Intron 2 auf Exon 2 und so weiter und so fort. In Fällen, bei denen alternative Exons verwendet werden können, können die alternativ verwendeten Exons durch Buchstaben bezeichnet werden. Somit können zwei alternativ verwendete "Exons 1" als Exon 1a und Exon 1b bezeichnet werden. Im Falle von Exon 1a folgt Intron 1a auf Exon 1a und Intron 1b folgt auf Exon 1b.
Gemäß der vorliegenden Offenbarung wurde die Art und die Verteilung von neuen, bisher nicht identifizierten genetischen Variationen im hPXR-Gen in der Bevölkerung durch Sequenzanalyse der relevanten Regionen des menschlichen hPXR-Gens von vielen verschiedenen Individuen analysiert. Es ist eine wohl bekannte Tatsache, dass die genomische DNA von Individuen, die die individuelle genetische Zusammenstellung von allen Genen beherbergen, einschließlich hPXR, leicht aus individuellen Blutproben gereinigt werden kann. Diese individuellen DNA-Proben werden dann für die Analyse der Sequenzzusammensetzung der hPXR-Genallele verwendet, die in dem Individuum vorhanden sind, das die Blutprobe zur Verfügung stellte. Die Sequenzanalyse wurde durch PCR-Amplifikation der relevanten Regionen des hPXR-Gens, die anschließende Reinigung der PCR-Produkte, gefolgt von automatisierter DNA-Sequenzierung mit etablierten Verfahren (ABI-dye terminator cycle sequencing) durchgeführt.
Ein wichtiger Parameter, der bei dem Versuch der Bestimmung der individuellen hPXR-Genotypen und der Identifizierung von neuen hPXR-Varianten durch direkte DNA-Sequenzierung von PCR-Produkten von genomischer DNA von menschlichem Blut zu berücksichtigen war, ist die Tatsache, dass jeder Mensch zwei Genkopien (üblicherweise mit sehr wenigen anormalen Ausnahmen) von jedem autosomalen Gen beherbergt (Diploidie). Deswegen musste bei der Bewertung der Sequenzen große Sorgfalt angewendet werden, um in der Lage zu sein, eindeutig nicht nur homozygote Sequenzvariationen zu identifizieren, sondern auch heterozygote Variationen. Die Details der verschiedenen Schritte bei der Identifikation und Charakterisierung der neuen hPXR-Genpolymorphismen (homozygot und heterozygot) werden in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
Die im hPXR-Gen nachgewiesenen Mutationen sind in Tabelle 4, Tabelle 5 und 4 dargestellt. Die Verfahren der Mutationsanalyse folgten Standardprotokollen und sind im Detail in den Beispielen beschrieben. Im Allgemeinen umfassen solche Verfahren, die gemäß der vorliegenden Erfindung für die Bewertung des phänotypischen Spektrums ebenso wie der überlappenden klinischen Charakteristika mit anderen Formen der Arzneistoffmetabolisierung und der veränderten Toleranz gegenüber Arzneistoffen in Patienten mit Mutationen im hPXR-Gen verwendet werden können, zum Beispiel die Haplotyp-Analyse, die Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse (SSCA), PCR und die direkte Sequenzierung. Auf der Basis der sorgfältigen klinischen Charakterisierung von vielen Patienten können die Phänotypen dann mit diesen Mutationen korreliert werden, ebenso wie mit Mutationen, die früher beschrieben wurden.
Wie für den Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet offensichtlich ist, kann dieses neue molekulargenetische Wissen jetzt für die exakte genotypische Charakterisierung des indizierten Patienten und seiner Familie verwendet werden, wenn ein verabreichter Arzneistoff eine ungewöhnliche Wirkung hat.
In den letzten 20 Jahren wurde die genetische Heterogenität in wachsendem Maße als eine signifikante Quelle bei variierender Reaktion auf Arzneistoffe erkannt. Viele wissenschaftliche Mitteilungen (Meyer, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 (1997), 269–296 und West, J. Clin. Pharmacol. 37 (1997), 635–648) haben eindeutig gezeigt, dass einige Arzneistoffe in einigen Patienten besser als in anderen wirken oder sogar hoch toxisch sein können und dass diese Variationen bei der Reaktion des Patienten auf Arzneistoffe auf einer molekularen Basis beruhen. Diese "pharmakogenomische" Konzept erkennt Korrelationen zwischen Reaktionen auf Arzneistoffe und genetischen Profilen von Patienten (Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 954–957; Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 1249–1252).
In diesem Kontext der Variabilität der Bevölkerung hinsichtlich Arzneistofftherapie wurde die Pharmakogenomik als ein nützliches Werkzeug bei der Identifikation und Selektion von Patienten vorgeschlagen, die auf einen speziellen Arzneistoff ohne Nebenwirkungen reagieren können. Diese Identifikation/Selektion kann zum Beispiel auf der molekularen Diagnose von genetischen Polymorphismen durch Genotypisierung von DNA von Leukocyten im Blut von Patienten und der Charakterisierung einer Krankheit beruhen (Bertz, Clin. Pharmacokinet. 32 (1997), 210–256; Engel, J. Chromatogra. B. Biomed. Appl. 678 (1996), 93–103). Für die Bereitsteller von Gesundheitsvorsorge wie die Organisationen zur Erhaltung der Gesundheit in den USA und die staatlichen öffentlichen Gesundheitsdienste in vielen europäischen Ländern kann dieser pharmakogenomische Weg einen Weg zur Verbesserung der Gesundheitsvorsorge und zur Reduzierung von allgemeinen Unkosten bedeuten, weil es hohe Kosten für überflüssige Therapien, unwirksame Arzneistoffe und Arzneistoffe mit Nebenwirkungen gibt.
Die hier offenbarten Mutationen in dem varianten hPXR-Gen resultieren manchmal in Aminosäuredeletion(en), -insertion(en) und insbesondere – substitution(en), entweder allein oder in Kombination. Es ist natürlich auch möglich, solche Mutationen in Wildtypgenen oder anderen mutierten Formen gentechnisch zu erzeugen. Verfahren für die Einführung solcher Modifikationen in die DNA-Sequenz des hPXR-Gens sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wohl bekannt; vgl. z. B. Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y.
Für die Untersuchung der Natur der Veränderungen bei der Aminosäuresequenz des hPXR-Proteins können Computerprogramme wie BRASMOL verwendet werden, die im Internet erhältlich sind. Darüber hinaus können Faltungssimulationen und Computerneuplanung von Strukturmotiven unter Verwendung von anderen geeigneten Computerprogrammen durchgeführt werden (Olszewski, Proteins 25 (1996) 286–299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675–679). Computer können auch für die Konformationsanalyse und die energetische Analyse von detaillierten Proteinmodellen verwendet werden (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995–1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37–45). Diese Analysen können für die Identifikation des Einflusses einer speziellen Mutation auf die Funktion des hPXR-Proteins verwendet werden.
Üblicherweise beruht eine Aminosäuredeletion, -addition oder -substitution in der Aminosäuresequenz des Proteins, das von den hier offenbarten Polynucleotiden codiert wird, auf einer oder mehrerer Nucleotidsubstitutionen, -insertionen oder -deletionen oder jeder Kombination daraus.
Das Polynucleotid der Erfindung kann weiterhin mindestens eine andere Nucleotid- und ggf. Aminosäuredeletion, -addition und/oder -substitution als die hier spezifizierten enthalten, zum Beispiel diejenigen, die im Stand der Technik beschrieben sind; vgl., (13). Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erlaubt die Untersuchung von synergistischen Effekten der Mutationen im hPXR-Gen auf das pharmakologische Profil von Arzneistoffen in Patienten, die solche mutierten Formen des Gens oder ähnlich mutierte Formen tragen, die von den vorstehend beschriebenen Proteinen nachgeahmt werden können. Es wird erwartet, dass die Analyse der synergistischen Effekte einen tieferen Einblick in arzneistofftolerante oder -sensitive Phänotypen gewisser Formen von Krebs und anderer Krankheiten gewährt. Von dem tieferen Einblick wird die Entwicklung von diagnostischen und pharmazeutischen Zusammensetzungen in Bezug auf Krebs stark profitieren.
Somit offenbart die vorliegende Erfindung Polynucleotide des molekular varianten hPXR-Gens, wobei die Nucleotiddeletion, -addition und/oder -substitution in einer veränderten Expression des varianten hPXR-Gens resultiert, im Vergleich mit dem entsprechenden Wildtypgen.
Das Polynucleotid der Erfindung kann z. B. DNA, cDNA, genomische DNA, RNA oder synthetisch produzierte DNA oder RNA oder ein rekombinant produziertes chimäres Nucleinsäuremolekül sein, das eines dieser Polynucleotide umfasst, entweder allein oder in Kombination. Vorzugsweise ist das Polynucleotid Teil eines Vektors, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren und Bakteriophagen, die üblicherweise in der Gentechnik verwendet werden und die ein Polynucleotid der Erfindung umfassen. Solche Vektoren können weitere Gene wie Markergene enthalten, die unter geeigneten Bedingungen die Selektion des Vektors in einer geeigneten Wirtszelle erlauben.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Vektors der Erfindung ist das Polynucleotid der Erfindung funktionell mit Expressionskontrollsequenzen verknüpft, die die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen erlauben. Die Expression des Polynucleotids umfasst die Transkription des Polynucleotids, vorzugsweise in eine translatierbare mRNA. Regulatorische Elemente, die die Expression in eukaryontischen Zellen erlauben, vorzugsweise Säugerzellen, sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wohl bekannt. Sie umfassen üblicherweise regulatorische Sequenzen, die die Initiation der Transkription sicherstellen, und ggf. poly-A-Signale, die die Termination der Transkription und die Stabilisierung des Transkripts sicherstellen. Zusätzliche regulatorische Elemente können transkriptionale ebenso wie translationale Enhancer umfassen. Mögliche regulatorische Elemente, die die Expression in prokaryontischen Wirtszellen erlauben, umfassen z. B. den lac-, trp- oder tac-Promotor in E. coli, und Beispiele für regulatorische Elemente, die die Expression in eukaryontischen Wirtszellen erlauben, sind der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe oder der CMV-, SV40-, RSV-Promotor (Rous-Sarcom-Virus), der CMV-Enhancer, der SV40-Enhancer oder ein Globin-Intron in Säugerzellen und anderen tierisch Zellen. Neben Elementen, die für die Initiation der Transkription verantwortlich sind, können solche regulatorischen Elemente stromabwärts von dem Polynucleotid auch Transkriptionsterminationssignale enthalten, wie die SV40-poly-A-Stelle oder die tk-poly-A-Stelle. In diesem Kontext sind geeignete Expressionsvektoren im Stand der Technik bekannt, wie der Okayama-Berg-cDNA-Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen), pSPORT1 (GIBCO BRL). Vorzugsweise ist der Vektor ein Expressionsvektor und/oder ein Gentransfer- oder Targeting-Vektor. Expressionsvektoren, die von Viren wie Retroviren, Vacciniavirus, Adeno-assoziiertem Virus, Herpesviren oder Rinder-Papillomvirus abgeleitet sind, können für die Verabreichnung der Polynucleotide oder des Vektors der Erfindung in Zielzellpopulationen verwendet werden. Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wohl bekannt sind, können verwendet werden, um rekombinante virale Vektoren zu konstruieren; vgl. zum Beispiel die Verfahren, die in Sambrook, Molecular Cloning A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory (1989) N. Y., und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1994), beschrieben sind. Alternativ können die Polynucleotide und Vektoren der Erfindung für die Verabreichung an Zielzellen in Liposomen eingebaut werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Wirtszellen, die mit einem Polynucleotid oder Vektor der Erfindung transformiert wurden. Die Wirtszelle kann eine prokaryontische oder eine eukaryontische Zelle sein; vgl. vorstehend. Das Polynucleotid oder der Vektor der Erfindung, das oder der in der Wirtszelle vorhanden ist, kann entweder ins Genom der Wirtszelle integriert sein oder es/er kann extrachromosomal aufrechterhalten werden. In diesem Zusammenhang sollte auch verstanden werden, dass das rekombinante DNA-Molekül der Erfindung für "Gen-Targeting" und/oder für "Genersatz" für die Wiederherstellung eines mutierten Gens oder für die Erzeugung eines mutierten Gens über homologe Rekombination verwendet werden kann; vgl. zum Beispiel Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 4712–4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press.
Die Wirtszelle kann jede prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein, wie eine Bakterien-, Insekten-, Pilz-, Pflanzenzelle, tierische oder menschliche Zelle. Bevorzugte Pilzzellen sind zum Beispiel diejenigen der Gattung Saccharomyces, insbesondere diejenigen der Art S. cerevisiae. Der Ausdruck "prokaryontisch" ist so gedacht, dass er alle Bakterien umfasst, die mit einem Polynucleotid für die Expression eines varianten hPXR-Proteins oder eines Fragmentes davon transformiert oder transfiziert werden können. Prokaryontische Wirte können Gram-negative ebenso wie Gram-positive Bakterien umfassen, wie zum Beispiel E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis. Ein Polynucleotid, das eine mutierte Form eines varianten hPXR-Proteins codiert, kann verwendet werden, um den Wirt unter Verwendung jeder Technik, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet üblicherweise bekannt sind, zu transformieren oder transfizieren. Verfahren für die Herstellung von fusionierten, funktionell verknüpften Genen und ihre Expression in Bakterien oder tierischen Zellen sind im Stand der Technik wohl bekannt (Sambrook, vorstehend). Die dort beschriebenen genetischen Konstrukte und Verfahren können für die Expression von varianten hPXR-Proteinen in z. B. prokaryontischen Wirten verwendet werden. Im Allgemeinen werden in Verbindung mit dem Wirt Expressionsvektoren verwendet, die Promotorsequenzen enthalten, die die effiziente Transkription des inserierten Polynucleotids ermöglichen. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsursprung, einen Promotor und einen Terminator, ebenso wie spezifische Gene, die in der Lage sind, eine phänotypische Selektion der transformierten Zellen bereitzustellen. Die transformierten prokaryontischen Wirte können in Fermentatoren wachsen und mit Techniken gezüchtet werden, die im Stand der Technik bekannt sind, um eine optimales Zellwachstum zu erreichen. Die Proteine der Erfindung können aus dem Wachstumsmedium, Zelllysaten oder zellulären Membranfraktionen isoliert werden. Die Isolierung und Reinigung der mikrobiell oder anders exprimierten Polypeptide der Erfindung können mittels jedes herkömmlichen Mittels erfolgen, wie zum Beispiel präparativer chromatographischer Trennungen und immunologischer Trennungen wie derjenigen, die die Verwendung von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern einschließen.
Somit betrifft die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren für die Produktion eines varianten hPXR-Proteins, welches die Züchtung einer wie vorstehend definierten Wirtszelle unter Bedingungen umfasst, die die Expression des Proteins und die Gewinnung des produzierten Proteins oder Fragments aus der Kultur erlauben.
Bei einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Produktion von Zellen, die in der Lage sind, ein variantes hPXR-Gen zu exprimieren, welches die gentechnische Veränderung von Zellen mit dem Polynucleotid oder mit dem Vektor der Erfindung umfasst. Die mit dem Verfahren der Erfindung erhältlichen Zellen können zum Beispiel für die Testung von Arzneistoffen gemäß den Verfahren verwendet werden, wie sie beschrieben sind in Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbour Laborstory Press, Cold Spring Harbour; Peyronneau, Eur J Biochem 218 (1993), 355–61; Yamazaki, Carcinogenesis 16 (1995), 2167–2170. Darüber hinaus können die Zellen für die Untersuchung von bekannten Arzneistoffen und unbekannten Derivaten davon auf ihre Fähigkeit zur Komplementierung des Verlusts an Arzneistoffwirksamkeit verwendet werden, der durch Mutationen im hPXR-Gen verursacht ist. Bei diesen Ausführungsformen fehlt den Wirtszellen ein Wildtypallel, vorzugsweise beide Allele des hPXR-Gens, und/oder sie haben mindestens eine mutierte Form davon. Alternativ kann die stark Überexpression eines mutierten Allels gegenüber dem normalen Allel und der Vergleich mit einer rekombinanten Zelllinie, die das normale Allel auf einem ähnlichen Niveau überexprimiert, als ein Durchmusterungs- und Analysesystem verwendet werden. Die mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhältlichen Zellen können auch für die hier nachstehend erwähnten Durchmusterungsverfahren verwendet werden.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein variantes hPXR-Protein und ein Fragment davon, das das Polypeptid umfasst, das von dem Polynucleotid gemäß der Erfindung codiert wird oder das mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren oder von Zellen erhältlich ist, die mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren produziert wurden. In diesem Kontext ist auch zu verstehen, dass das variante hPXR-Protein gemäß der Erfindung mittels herkömmlicher Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, weiter modifiziert werden kann. Durch die Bereitstellung des varianten hPXR-Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, die Teile zu bestimmen, die für die biologische Aktivität oder Inhibition desselben relevant sind.
Bei einem weiteren Aspekt offenbart die vorliegende Offenbarung Antikörper, die ein variantes hPXR-Protein gemäß der Erfindung spezifisch erkennen. Vorteilhafterweise erkennt der Antikörper spezifisch ein Epitop, das eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, wie vorstehend definiert, enthält.
Antikörper gegen das variante hPXR-Protein der Erfindung können mittels wohl bekannter Verfahren unter Verwendung eines gereinigten Proteins gemäß der Erfindung oder eines davon abgeleiteten (synthetischen) Fragments als Antigen hergestellt werden. Monoclonale Antikörper können zum Beispiel mit der Technik hergestellt werden, wie sie ursprünglich von Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 495, und Galfré, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, beschrieben wurde, was die Fusion von Myelomzellen der Maus mit den Milzzellen umfasst, die von einem immunisierten Säugetier abgeleitet wurden. Die Antikörper können monoclonale Antikörper, polyclonale Antikörper oder synthetische Antikörper sein, ebenso wie Fragmente von Antikörpern wie Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente usw. Darüber hinaus können Antikörper oder Fragmente davon gegen die vorstehend erwähnten Polypeptide unter Verwendung von Verfahren erhalten werden, wie sie z. B. in Harlow und Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988, beschrieben sind. Diese Antikörper können zum Beispiel für die Immunpräzipitation und Immunlokalisierung des varianten hPXR-Proteins der Erfindung ebenso wie für die Feststellung der Anwesenheit solcher varianten hPXR-Proteine in zum Beispiel transgenen Organismen und für die Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, die mit den Proteinen gemäß der Erfindung Wechselwirken. Zum Beispiel kann die Oberflächenplasmonenresonanz, wie sie in dem BIAcore-System verwendet wird, verwendet werden, um die Effizienz von Phagenantikörpern zu verbessern, die an ein Epitop des Proteins der Erfindung binden (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97–105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7–13).
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die den komplementären Strang der vorstehend erwähnten Polynucleotide der vorliegenden Erfindung oder einen Teil davon repräsentieren oder umfassen und die somit mindestens eine Nucleotiddifferenz im Vergleich mit den entsprechenden Wildtyp-hPXR-Gen-Nucleotidsequenzen umfassen, wie sie durch die vorstehend beschriebenen Nucleotidsubstitutionen, -deletionen und -additionen spezifiziert wurde. Ein solches Molekül kann entweder eine Desoxyribonucleinsäure sein oder eine Ribonucleinsäure. Solche Moleküle umfassen zum Beispiel Antisense-RNA. Diese Moleküle können weiterhin mit Sequenzen verknüpft sein, die, wenn sie transkribiert werden, ein Ribozym codieren und damit ein Ribozym produzieren, welches Transkripte der Polynucleotide gemäß der Erfindung spezifisch spaltet.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor, der ein Nucleinsäuremolekül gemäß der Erfindung umfasst. Beispiele für solche Vektoren sind vorstehend beschrieben. Vorzugsweise ist die in dem Vektor vorhandene Nucleinsäure funktionell mit regulatorischen Elementen verknüpft, die die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erlauben; vgl. vorstehend.
Die vorliegende Offenbarung betrifft auch ein Verfahren für die Produktion eines transgenen nicht-menschlichen Tieres, vorzugsweise einer transgenen Maus, welches die Einbringung eines Polynucleotids oder Vektors der Erfindung in eine Keimzelle, eine embryonale Zelle, eine Stammzelle oder ein Ei oder eine davon abgeleitete Zelle umfasst. Das nicht-menschliche Tier kann gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren der Erfindung verwendet werden und kann ein nicht-transgenes gesundes Tier sein, oder es kann eine Krankheit haben, vorzugsweise eine Krankheit, die durch mindestens eine Mutation im hPXR-Gen verursacht wird. Solche transgenen Tiere sind gut geeignet für z. B. pharmakologische Untersuchungen von Arzneistoffen in Verbindung mit varianten Formen der vorstehend beschriebenen varianten hPXR-Proteine, da diese Proteine oder zumindest ihre funktionellen Domänen bei höheren Eukaryonten zwischen den Arten konserviert sind, insbesondere bei Säugern. Die Produktion von transgenen Embryos und ihre Durchmusterung kann, z. B. wie bei A. L. Joyner Hrsg., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press, beschrieben, durchgeführt werden. Die DNA der Embryos kann z. B. unter Verwendung von Southern-Blots mit einer geeigneten Sonde analysiert werden.
Die Erfindung betrifft auch transgene nicht-menschliche Tiere wie transgene Mäuse, Ratten, Hamster, Hunde, Affen, Kaninchen, Schweine, C. elegans und Fische wie Torpedofisch, die ein Polynucleotid oder einen Vektor der Erfindung enthalten oder die mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurden, wobei vorzugsweise das Polynucleotid oder der Vektor stabil in das Genom des nicht-menschlichen Tieres integriert ist, vorzugsweise so, dass die Anwesenheit des Polynucleotids oder Vektors zur Expression des varianten hPXR-Gens der Erfindung führt. Es kann eine oder mehrere Kopien desselben oder verschiedener Polynucleotide des varianten hPXR-Gens haben. Dieses Tier hat zahlreiche Verwendungsmöglichkeiten, einschließlich als ein Forschungsmodell für die Arzneistoffverträglichkeit, und stellt daher ein neues und wertvolles Tier bei der Entwicklung von Therapien, Behandlungen usw. für Krankheiten dar, die durch einen Mangel oder Fehler bei der Arzneistoffmetabolisierung in der Zelle verursacht werden. Dementsprechend ist in diesem Fall das Säugetier vorzugsweise ein Labortier wie eine Maus oder Ratte.
Vorzugsweise umfasst das transgene nicht-menschliche Tier der Erfindung weiterhin mindestens ein inaktiviertes Wildtypallel des hPXR-Gens. Diese Ausführungsform erlaubt zum Beispiel die Untersuchung der Wechselwirkung der verschiedenen varianten Formen der hPXR-Proteine. Es könnte auch wünschenswert sein, die hPXR-Genexpression oder -funktion in einem gewissen Stadium der Entwicklung und/oder des Lebens des transgenen Tieres zu inaktivierten. Dies kann zum Beispiel unter Verwendung von gewebespezifischen, entwicklungsabhängig gesteuerten und/oder zellregulierten und/oder induzierbaren Promotoren erreicht werden, die die Expression von z. B. einem Antisense oder Ribozym antreiben, das gegen das RNA-Transkript des hPXR-Gens gerichtet ist; vgl. auch vorstehend. Ein geeignetes induzierbares System ist zum Beispiel die durch Tetracyclin regulierte Genexpression, wie z. B. von Gossen und Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. 89 USA (1992), 5547–5551) und Gossen et al. (Trends Biotech. 12 (1994), 58–62) beschrieben. In ähnlicher Weise kann die Expression des varianten hPXR-Gens durch solche regulatorischen Elemente kontrolliert werden.
Mit dem varianten hPXR-Polynucleotid und -Protein und den Vektoren der Erfindung ist es jetzt möglich, in vivo und in vitro die Wirksamkeit von Arzneistoffen hinsichtlich spezieller Mutationen im hPXR-Gen eines Patienten und dem betroffenen Phänotyp zu untersuchen. Darüber hinaus kann das variante hPXR-Protein der Erfindung zur Bestimmung des pharmakologischen Profils von Arzneistoffen und für die Identifizierung und Herstellung von weiteren Arzneistoffen verwendet werden, die für die Behandlung von z. B. Krebs wirkungsvoller sind, insbesondere für die Verbesserung bei gewissen Phänotypen, die auf den betreffenden Mutationen beruhen, wie den vorstehend beschriebenen.
Somit betrifft ein besonderes Merkmal der vorliegenden Erfindung die Selektion von Arzneistoffen/Prodrugs und die Formulierung von pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Behandlung von Krankheiten, die der Chemotherapie zugänglich sind, unter Berücksichtigung des Polymorphismus der varianten Form des hPXR-Gens, die gemeinsam mit dem betroffenen Phänotyp des zu behandelnden Patienten segregiert. Dies erlaubt die sichere und ökonomische Anwendung von Arzneistoffen, die zum Beispiel entweder wegen ihrer Nebenwirkungen in einigen Patienten und/oder ihres unzuverlässigen pharmakologischen Profils hinsichtlich desselben oder verschiedener Phänotypen der Krankheit bisher nicht als geeignet für die Therapie von z. B. Krebs erachtet wurden. Die hier beschriebenen Mittel und Verfahren können zum Beispiel zur Verbesserung der Dosierungsempfehlungen verwendet werden und erlauben dem Verschreibenden erforderliche Anpassungen der Dosierung in Abhängigkeit von der in Betracht kommenden Patientengruppe vorauszusehen.
Bei einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Identifizierung und Gewinnung eines hPXR-Inhibitors, der in der Lage ist, die Aktivität einer molekularen Variante des hPXR-Gens oder seines Genprodukts zu modulieren, welches die Schritte umfasst von

(a) Inkontaktbringen des varianten hPXR-Proteins oder einer Zelle, die ein molekular variantes Gen exprimiert, das das Polynucleotid der Erfindung umfasst, in der Anwesenheit von Stoffen, die ein nachweisbares Signal als Antwort auf Arzneistoffmetabolisierung liefern können, mit einer zu durchmusternden Verbindung unter Bedingungen, die CYP3A4- oder CYP3A7-vermittelte Arzneistoffmetabolisierung erlauben, und
(b) dem Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals oder einer Zunahme eines Signals, das von dem metabolisierten Arzneistoff erzeugt wurde, wobei die Anwesenheit oder die Zunahme des Signals auf einen möglichen Inhibitor hinweist.

Der Ausdruck "Verbindung" bei einem Verfahren der Erfindung umfasst eine einzelne Substanz oder eine Vielzahl an Substanzen, die identisch sein können oder auch nicht.
Die Verbindung(en) kann/können chemisch synthetisiert oder mittels mikrobieller Fermentation produziert worden sein, kann/können aber auch in zum Beispiel Proben enthalten sein, z. B. Zellextrakten von z. B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen. Darüber hinaus können die Verbindungen im Stand der Technik bekannt sein, aber bisher nicht bekannt sein als nützlicher Inhibitor. Die Mehrzahl der Verbindungen kann z. B. zu dem Kulturmedium zugegeben werden oder in eine Zelle oder ein nicht-menschliches Tier der Erfindung injiziert werden.
Wenn eine Probe, die (eine) Verbindung(en) enthält, mit dem Verfahren der Erfindung identifiziert wird, dann ist es entweder möglich, die Verbindung aus der ursprünglichen Probe isolieren, die so identifiziert wurde, dass sie die fragliche Verbindung enthält, oder man kann die ursprüngliche Probe weiter aufteilen, wenn sie zum Beispiel aus einer Vielzahl von verschiedenen Substanzen besteht, um damit die Anzahl der verschiedenen Substanzen pro Probe zu reduzieren, und das Verfahren mit den Aufteilungen der ursprünglichen Probe wiederholen. Es kann dann bestimmt werden, ob die Probe oder Verbindung die gewünschten Eigenschaften zeigt, zum Beispiel mit den Verfahren, die hier oder in der Literatur (vgl. (13) und Lehmann, J Clin Invest 102 (1998), 1016–23) beschrieben werden. In Abhängigkeit von der Komplexität der Proben können die vorstehend beschriebenen Schritte mehrmals wiederholt werden, vorzugsweise bis die gemäß dem Verfahren der Erfindung identifizierte Probe nur eine beschränkte Zahl an oder nur eine Substanz(en) enthält. Vorzugsweise enthält die Probe Substanzen ähnlicher chemischer und/oder physikalischer Eigenschaften, und am meisten bevorzugt sind die Substanzen identisch. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet leicht durchgeführt und geplant werden, zum Beispiel in Übereinstimmung mit anderen zellbasierten Tests, die im Stand der Technik beschrieben sind, oder unter Verwendung und Modifikation der hier beschriebenen Verfahren. Darüber hinaus wird der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet leicht erkennen, welche weiteren Verbindungen und/oder Enzyme verwendet werden können, um die Verfahren der vorliegenden Erfindung durchzuführen, zum Beispiel, falls erforderlich, Enzyme, die eine gewisse Verbindung in die Vorläuferverbindung umwandeln, die wiederum ein Substrat für das CYP3A4- oder CYP3A7-Protein darstellt. Eine solche Anpassung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist im Können des Durchschnittsfachmanns auf dem Fachgebiet und kann ohne unangemessene Versuche durchgeführt werden.
Geeignete Tests, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind zum Beispiel beschrieben bei Hashimoto, Eur J Biochem 218 (1993), 585–95, wo Transfektionstests mit chimären CYP3A4-Genen in HepG2-Zellen beschrieben werden. In ähnlicher Weise können die varianten hPXR-Gene in HepG2-Zellen exprimiert oder co-exprimiert werden und auf ihre transkriptionelle Aktivität und die katalytischen Eigenschaften von CYP3A4 oder CYP3A7 analysiert werden. Ein solcher Test kann auch für die Untersuchung der katalytischen Eigenschaften von CYP3A4 oder CYP3A7 auf ihre Substrate wie Steroide (Testosteron, Progesteron, Androstendion, Cortisol, 17β-Östradiol, 17α-Ethinylöstradiol), Antibiotika (Erythromycin), Immunsuppresiva (Cyclosporin A), Benzodiazepin (Midazolam) Benzothiazepin-Derivate (Diltiazem, Triazolam) und Nifedipin verwendet werden. insbesondere sind solche Tests nützlich, um einen Beitrag zur Vorhersage zu leisten, ob ein vorgegebener Arzneistoff in einem Individuum wirken wird, das das entsprechend variante CYP3A4, CYP3A7 und/oder hPXR-Gen trägt. Ein geeignetes Expressionssystem, das in Übereinstimmung mit den vorstehend beschriebenen Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist auch in (22) beschrieben. Zusätzlich können heterologe Expressionssysteme wie Hefe verwendet werden, um die Stabilität, die Bindungseigenschaften und die katalytischen Aktivitäten der Genprodukte des varianten hPXR-Gens im Vergleich mit dem entsprechenden Wildtyp-Genprodukt zu untersuchen. Wie vorstehend erwähnt, können das molekular variante hPXR-Gen der vorliegenden Erfindung und sein Genprodukt, insbesondere wenn sie bei den vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden, für pharmakologische und toxikologische Untersuchungen des Metabolismus von Arzneistoffen verwendet werden. Bevorzugte Arzneistoffe, die gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung getestet werden können, umfassen diejenigen, die vorstehend beschrieben wurden und umfassen Nifedipin, Erythromycin, Troleandomycin, Quinidin, Cyclosporin A, 17α-Ethinylöstradiol, Lidocain, Diltiazem, Dexamethason, RU486, vgl. auch vorstehend, sind aber nicht darauf beschränkt.
Verbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Peptide, Proteine, Nucleinsäuren, Antikörper, kleine organische Verbindungen, Liganden, Peptiden ähnelnde Substanzen, PNAs und dergleichen. Die Verbindungen können auch funktionelle Derivate oder Analoga von bekannten Arzneistoffen sein, wie von den vorstehend beschriebenen. Verfahren für die Herstellung von chemischen Derivaten und Analoga sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wohl bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer-Herausgabe, New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N. Y. 10010 U. S. A. und Organic Synthesis, Wiley, New York USA. Darüber hinaus können die Derivate und Analoga gemäß den Verfahren, die im Stand der Technik bekannt oder wie hier beschrieben sind, auf ihre Wirkungen getestet werden. Darüber hinaus können Peptidnachahmer und/oder computerunterstützte Planung von geeigneten Arzneistoffderivaten und -analoga zum Beispiel gemäß den nachstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden.
Solche Analoga umfassen Moleküle, die als Basis die Struktur von bekannten CYP3A4- und CYP3A7-Substraten und/oder -Inhibitoren und/oder -Modulatoren haben; vgl. nachstehend.
Geeignete Computerprogramme können für die Identifikation von interaktiven Stellen eines mutmaßlichen Inhibitors und des hPXR-Proteins der Erfindung durch computergestützte Suche nach komplementären Strukturmotiven (Fassina, Immunomethods 5 (1994) 114–120) verwendet werden. Weitere geeignete Computersysteme für die computergestützte Planung von Proteinen und Peptiden sind im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033–1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1–13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987–5991. Die mit den vorstehend beschriebenen Computeranalysen erhaltenen Resultate können in Kombination mit dem Verfahren der Erfindung für z. B. die Optimierung von bekannten Inhibitoren verwendet werden. Geeignete Peptidnachahmer und andere Inhibitoren können auch durch die Synthese von kombinatorischen Bibliotheken von Peptidnachahmern durch sukzessive chemische Modifikation und Testung der resultierenden Verbindungen identifiziert werden, z. B. gemäß den hier beschriebenen Verfahren. Verfahren für die Erzeugung von kombinatorischen Bibliotheken von Peptidnachahmern sind im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220–234 und Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709–715. Darüber hinaus kann die dreidimensionale und/oder kristallographische Struktur von Inhibitoren und dem hPXR-Protein der Erfindung für die Planung von Peptidnachahmer-Arzneistoffen verwendet werden (Rose, Biochemistry 35 (1996) 12933–12944; Rutenberg, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545–1558).
Zusammenfassend stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für die Identifizierung von Verbindungen bereit, die in spezifischen Dosen für die Behandlung von spezifischen Formen von Krankheiten verwendet werden können, z. B. Krebs, dessen Chemotherapie durch Fehlfunktionen des hPXR-Gens verkompliziert wird, was oft in einer veränderten Aktivität oder einem veränderten Niveau an Arzneistoffmetabolisierung oder sensitivem Phänotyp resultiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist die Zelle eine Zelle, die mit dem Verfahren der Erfindung erhalten wurde oder in dem vorstehend beschriebenen transgenen nicht-menschlichen Tier enthalten ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Identifizierung und Gewinnung eines hPXR-inhibitors, der in der Lage ist, die Aktivität der molekularen Variante des hPXR-Gens der vorliegenden Erfindung oder ihres Genprodukts zu modulieren, umfassend die Schritte von

(a) Inkontaktbringen des varianten hPXR-Proteins der Erfindung mit einem ersten Molekül, von dem bekannt ist, dass es von dem hPXR-Protein gebunden wird, um einen ersten Komplex des Proteins und des Moleküls zu bilden;
(b) Inkontaktbringen des ersten Komplexes mit einer zu testenden Verbindung; und
(c) Messung, ob die Verbindung das erste Molekül in dem ersten Komplex ersetzt.

Vorteilhafterweise umfasst bei dem Verfahren der Messschritt die Messung der Bildung eines zweiten Komplexes des Proteins und des Inhibitorkandidaten. Vorzugsweise umfasst der Messschritt die Messung der Menge an erstem Molekül, das nicht an das Protein gebunden ist.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist das erste Molekül Nifedipin, Rifampicin oder Corticosteron. Darüber hinaus ist es bevorzugt, dass bei dem Verfahren der Erfindung das erste Molekül markiert ist, z. B. mit einer radioaktiven Markierung oder einer fluoreszierenden Markierung.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein in vitro-Verfahren für die Diagnose von Krebs, der in Beziehung zu der Anwesenheit von molekular variantem hPXR-Gen der vorliegenden Erfindung steht, oder von Anfälligkeit für Krebs, umfassend

(a) die Bestimmung der Anwesenheit eines Polynucleotids der Erfindung in einer Probe von einem Individuum; und/oder
(b) die Bestimmung der Anwesenheit einer varianten Form des hPXR-Proteins zum Beispiel mit einem Antikörper der Erfindung.

Gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren der Testung des Zustands des Krebses oder der Anfälligkeit für Krebs unter Verwendung eines Polynucleotids oder Nucleinsäuremoleküls der Erfindung durchgeführt werden, z. B. in der Form eines Southern- oder Northern-Blots oder der in situ-Analyse. Die Nucleinsäuresequenz kann mit einer codierenden Region von einem der Gene oder mit einer nicht-codierenden Region, d. h. einem Intron, hybridisieren. In dem Falle, in dem bei dem Verfahren der Erfindung eine komplementäre Sequenz verwendet wird, kann das Nucleinsäuremolekül wiederum bei Northern-Blots verwendet werden. Zusätzlich kann die Testung in Verbindung mit tatsächlichem Blockieren z. B. der Transkription des Gens durchgeführt werden, und man somit erwarten kann, dass sie therapeutische Relevanz hat. Darüber hinaus kann ein Primer oder ein Oligonucleotid auch für die Hybridisierung mit einem der vorstehend erwähnten hPXR-Gene oder den entsprechenden mRNAs verwendet werden. Die Nucleinsäuren, die für die Hybridisierung verwendet werden, können natürlich durch den Einbau oder die Anheftung z. B. einer radioaktiven oder anderen Markierung in geeigneter Weise markiert sein. Solche Markierungen sind im Stand der Technik wohl bekannt. Die Markierung der Nucleinsäuremoleküle kann mittels herkömmlicher Verfahren erreicht werden.
Außerdem kann die Anwesenheit oder Expression des varianten hPXR-Gens unter Verwendung eines Primers, der spezifisch mit einer der entsprechenden Nucleinsäuresequenzen hybridisiert, und unter Durchführung einer PCR-Reaktion gemäß Standardverfahren beobachtet werden. Die spezifische Hybridisierung der vorstehend erwähnten Sonden oder Primer erfolgt vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen. Der Ausdruck "stringente Hybridisierungsbedingungen" ist im Stand der Technik wohl bekannt; vgl. zum Beispiel Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", zweite Aufl., CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; "Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach", Hrsg. Harnes und Higgins, IRL Press, Oxford, 1985. Darüber hinaus kann mRNA, cRNA, cDNA oder genomische DNA, die von dem Individuum gewonnen wurde, sequenziert werden, um Mutationen zu identifizieren, die charakteristische Fingerabdrücke von Mutationen im hPXR-Gen sein können. Die vorliegende Offenbarung umfasst weiterhin Verfahren, bei denen mittels RFLPs von DNA oder RNA, die von dem Individuum gewonnen wurde, solch ein Fingerabdruck gewonnen werden kann, ggf. kann die DNA oder RNA vor der Analyse amplifiziert werden; die Verfahren dafür sind im Stand der Technik wohl bekannt. RNA-Fingerabdrücke können zum Beispiel durch Verdau einer RNA-Probe, die von einem Individuum gewonnen wurde, mit einem geeigneten RNA-Enzym, zum Beispiel RNase T₁, RNase T₂ oder dergleichen, oder einem Ribozym und zum Beispiel elektrophoretischer Trennung und Nachweis der RNA-Fragmente, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt werden.
Weitere Modifikationen der vorstehend beschriebenen Ausführungsform der Erfindung können vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet von dieser Offenbarung ohne unangemessene Experimente leicht geplant werden, vgl. z. B die Beispiele. Eine zusätzliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem die Bestimmung durch Anwendung eines Antikörpers oder eines Fragmentes davon durchgeführt wird. Der Antikörper, der bei dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann mit einer nachweisbaren Markierung markiert sein, wie einer Histidin-Markierung oder einem Biotin-Molekül.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die vorstehend beschriebenen Verfahren PCR, die Ligase-Kettenreaktion, den Restriktionsverdau, die direkte Sequenzierung, Nucleinsäure-Amplifikationstechniken, Hybridisierungtechniken oder Immuntests (Sambrook et al., loc. cit. CSH cloning, Harlow und Lane loc. cit. CSH antibodies).
Angesichts des Vorstehenden offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren, bei dem ein weiterer Schritt die Verabreichung eines Medikaments an ein Individuum, um die Variationen im hPXR-Gen aufzuheben oder zu vermindern, in Übereinstimmung mit allen Anwendungen des Verfahrens der Erfindung umfasst, was die Behandlung einer gegebenen Krankheit aufgrund einer phänotypischen Reaktion wegen des hPXR-Gens vor dem Auftreten von klinischen Symptomen erlaubt.
Vorzugsweise besteht das Medikament aus chemotherapeutischen Mitteln wie Substraten von CYP3A4: Paclitaxel (Eur J Drug Metab Pharmacokinet 23 (1998), 417–24), Tamoxifen und Toremifen (Drug Metab Dispos 27 (1999), 681–8; Clin Pharmacol Ther 64 (1998), 648–54; Clin Pharmacol Ther 57 (1995) 628–35), Trofosfamid (Cancer Chemother Pharmacol 44 (1999), 327–334); Cyclophosphamid und Ifosfamid (Drug Metab Dispos 27 (1999), 655–66; Cancer Res 58 (1998), 4391–401; Br J Clin Pharmacol 40 (1995), 523–30), Taxoter (Pharmacogenetics 8 (1998) 391–401; Clarke, Clin Pharmacokinet 36 (1999), 99–114).
Die vorliegende Anmeldung offenbart auch, dass das vorstehend erwähnte Verfahren weiterhin die Einbringung

(i) eines funktionellen und exprimierbaren Wildtyp-hPXR-Gens oder
(ii) eines Nucleinsäuremoleküls oder Vektors der Erfindung in Zellen

In diesem Kontext und wie im Verlauf dieser Beschreibung verwendet, bedeutet "funktionelles" hPXR-Gen ein Gen, bei dem das codierte Protein zum Teil oder insgesamt die primäre Strukturkonformation des Wildtyp-hPXR-Proteins hat, d. h. die biologische Eigenschaft der Metabolisierung von Arzneistoffen besitzt und das CYP3A4- bzw. CYP3A7-Gen kontrolliert. Dieser Aspekt ist geeignet für die Therapie von Krebs, insbesondere bei Menschen. Der Nachweis der Expression eines varianten hPXR-Gens würde den Schluss zulassen, dass die Expression verknüpft ist mit der Bildung oder Aufrechterhaltung eines entsprechenden Phänotyps der Krankheit. Dementsprechend würde ein Schritt zur Anwendung kommen, um das Expressionsniveau auf ein niedriges Niveau zu reduzieren oder es zu beseitigen. Dies kann zum Beispiel durch zumindest partielle Eliminierung der Expression des mutierten Gens mit biologischen Mitteln erreicht werden, zum Beispiel durch die Verwendung von Ribozymen, Antisense-Nucleinsäuremolekülen, intrazellulären Antikörpern oder der vorstehend beschriebenen Inhibitoren gegen variante Formen des hPXR-Proteins der vorliegenden Erfindung. Darüber hinaus können pharmazeutische Produkte entwickelt werden, die die Expressionsniveaus der entsprechenden mutierten Proteine und Gene reduzieren.
Darüber hinaus offenbart die vorliegende Anmeldung ein Verfahren für die Produktion eines Arzneimittels, welches die Schritte von einem der vorstehend beschriebenen Verfahren und die Synthese und/oder Formulierung der bei Schritt (b) identifizierten Verbindung oder eines Derivats oder Homologs davon in einer pharmazeutisch verträglichen Form umfasst. Die gemäß den Verfahren der Erfindung identifizierten therapeutisch nützlichen Verbindungen können formuliert und einem Patienten verabreicht werden, wie vorstehend diskutiert. Für die vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet als geeignet bestimmten Anwendungen und therapeutischen Dosen vgl. nachstehend.
Darüber hinaus offenbart die vorliegende Anmeldung ein Verfahren für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welches die Schritte der vorstehend beschriebenen Verfahren umfasst; und die Formulierung eines Arzneimittels oder einer Arzneimittelvorstufe in der Form, die für die therapeutische Verabreichung geeignet ist und die Verhinderung oder Linderung der Störung des Individuums, das mit den Verfahren der Erfindung diagnostiziert wurde.
Arzneistoffe oder Prodrugs werden nach ihrer in vivo-Verabreichung metabolisiert, um sie entweder durch Ausscheidung oder durch Metabolismus in eine oder mehrere aktive oder inaktive Metabolite zu eliminieren (Meyer, J. Pharmacokinet. Biopharm. 24 (1996), 449–459). Somit kann statt der Verwendung der tatsächlichen Verbindung oder des tatsächlichen Inhibitors, die/der gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert und erhalten wurden, eine entsprechende Formulierung als ein Prodrug verwendet werden, das in dem Patienten in seine aktive Form umgewandelt wird. Vorsichtsmaßnahmen, die bei der Verabreichung von Prodrugs und Arzneistoffen angewendet werden können, sind in der Literatur beschrieben; vgl. zum Überblick Ozama, J. Toxicol. Sci. 21 (1996), 323–329).
Vorzugsweise ist das Arzneimittel oder die Prodrug ein Derivat eines Medikaments, wie hier vorstehend definiert.
Zusätzlich offenbart die vorliegende Erfindung einen Inhibitor, der gemäß den hier beschriebenen Verfahren identifiziert oder erhalten wird. Vorzugsweise bindet der Inhibitor spezifisch an das variante hPXR-Protein der Erfindung. Die hier beschriebenen Antikörper, Nucleinsäuremoleküle und Inhibitoren haben vorzugsweise eine Bindungsspezifität, die im Wesentlichen mindestens identisch ist mit der Bindungsspezifität des natürlichen Liganden oder Bindungspartners des hPXR-Proteins der Erfindung. Ein Antikörper oder Inhibitor kann in den Fällen, in denen die hPXR-Aktivität unterdrückt sein sollte, eine Bindungsaffinität zum hPXR-Protein von mindestens 10⁵ M^–1, vorzugsweise höher als 10⁷ M^–1 und vorteilhafterweise bis zu 10¹⁰ M^–1 haben. Somit hat ein supprimierender Antikörper oder Inhibitor eine Affinität von mindestens etwa 10^–7 M, vorzugsweise mindestens etwa 10^–9 M und am meisten bevorzugt mindestens etwa 10^–11 M.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Oligo- oder Polynucleotids zum Nachweis eines Polynucleotids der Erfindung und/oder für die Genotypisierung der entsprechenden individuellen hPxR-Allele. Vorzugsweise ist das Oligo- oder Polynucleotid ein vorstehend beschriebenes Polynucleotid oder Nucleinsäuremolekül der Erfindung.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Oligonucleotid 15 bis 50, vorzugsweise 20 bis 40, mehr bevorzugt 20 bis 30 Nucleotide lang und umfasst die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 112 oder eine komplementäre Sequenz.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung in noch einer weiteren Ausführungsform einen Primer oder eine Sonde, bestehend aus einem wie vorstehend definierten Oligonucleotid. In diesem Kontext bedeutet der Ausdruck "bestehend aus", dass die vorstehend beschriebene Nucleotidsequenz, die als Primer oder Sonde der Erfindung verwendet wird, keine weiteren Nucleotidsequenzen des hPXR-Gens unmittelbar anschließend an ihrem 5'- und 3'-Ende hat. Es können jedoch andere Gruppen wie Markierungen, z. B. Biotinmoleküle, Histidinmarkierungen, Antikörperfragmente, kolloidales Gold usw., ebenso wie Nucleotidsequenzen, die nicht dem hPXR-Gen entsprechen, in den Primern und Sonden der vorliegenden Erfindung anwesend sein. Darüber hinaus ist es auch möglich, die vorstehend beschriebenen speziellen Nucleotidsequenzen zu verwenden und sie mit anderen Nucleotidsequenzen zu kombinieren, die vom hPXR-Gen abgeleitet sind, wobei in diese zusätzlichen Nucleotidsequenzen andere Gruppen als Nucleinsäuren eingelagert sind oder wobei die Nucleinsäure nicht der Nucleotidsequenz des hPXR-Gens entspricht. Darüber hinaus ist es dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet offensichtlich, dass das Oligonucleotid modifiziert werden kann, zum Beispiel durch ein Thiophosphat-Rückgrat und/oder im Stand der Technik wohl bekannte Basen-Analoga (Flanagan, Proc. Natl. Acad. Sci USA 96 (1999), 3513–8; Witters, Breast Cancer Res. Treat. 53 (1999) 41–50; Hawley, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 9 (1999), 61–9; Peng Ho, Brain Res. Mol. Brain Res. 62 (1998), 1–11; Spiller, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8 (1998), 281–93; Zhang, J. Pharmacol. Exp. Ther. 278 (1996), 971–9; Shoji, Antimicrob. Agents Chemother. 40 (1996), 1670–5; Crooke, J. Pharmacol. Exp. Ther. 277 (1996), 923–37).
Außerdem betrifft die vorliegende Offenbarung die Verwendung eines Antikörpers oder einer Substanz, die in der Lage sind, für den Nachweis des varianten hPXR-Proteins der Erfindung, der Expression eines molekular varianten hPXR-Gens, das ein Polynucleotid der vorliegende Erfindung umfasst, und/oder zur Unterscheidung von hPXR-Allelen, die ein Polynucleotid der vorliegende Erfindung umfassen, spezifisch das Genprodukt eines hPXR-Gens der vorliegenden Erfindung zu binden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, bevorzugt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Nucleinsäuremolekül, den Vektor oder die Wirtszelle, das Protein, den Primer oder die Sonde der vorliegenden Erfindung und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können einfach über jeden der Wege verabreicht werden, wie sie herkömmlich für die Arzneistoffverabreichung verwendet werden, zum Beispiel oral, topisch, parenteral oder durch Inhalation. Verträgliche Salze umfassen Acetat, Methylester, HCl, Sulfat, Chlorid und dergleichen. Die Verbindungen können in herkömmlichen Dosierungsformen verabreicht werden, die durch Kombination der Arzneistoffe mit pharmazeutischen Standardträgern gemäß herkömmlicher Verfahren hergestellt werden. Diese Verfahren können Mischen, Granulation und Zusammenpressen oder Auflösen der Inhaltsstoffe umfassen, wie geeignet für das gewünschte Präparat. Man wird einsehen, dass die Form und der Charakter des pharmazeutisch verträglichen Trägers oder Verdünnungsmittels von der Menge an aktivem Inhaltsstoff, mit dem er kombiniert werden soll, dem Verabreichungsweg und anderen gut bekannten Variablen diktiert wird. Der/die Träger muss/müssen "verträglich" in dem Sinne sein, dass er/sie kompatibel mit den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung und nicht schädlich für den Empfänger ist/sind. Der verwendete pharmazeutische Träger kann zum Beispiel ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein. Beispielhafte feste Träger sind Lactose, Terra alba, Saccharose, Talk, Gelatine, Agar, Pektin, Akaziengummi, Magnesiumstearat, Stearinsäure und dergleichen. Beispielhafte flüssige Träger sind phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Sirup, Öl wie Erdnussöl und Olivenöl, Wasser, Emulsionen, verschiedene Arten von Feuchtigkeitsmitteln, sterile Lösungen und dergleichen. In ähnlicher Weise kann der Träger oder das Verdünnungsmittel im Stand der Technik wohl bekannte Zeitverzögerungsmittel enthalten, wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat allein oder mit Wachs.
Das Dosierungsschema wird von dem behandelnden Arzt und anderen klinischen Faktoren bestimmt; vorzugsweise in Übereinstimmung mit den vorstehend beschriebenen Verfahren. Wie auf dem medizinischen Fachgebiet wohl bekannt ist, hängen die Dosierungen für jeden Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe des Patienten, der Körperoberfläche, dem Alter, der speziellen zu verabreichenden Verbindung, dem Geschlecht, der Zeit und dem Weg der Verabreichung, dem allgemeinen Gesundheitszustand und der gleichzeitigen Verabreichung anderer Arzneistoffe. Der Fortschritt kann durch periodische Bewertung beobachtet werden. Weiterhin ist die Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die Antisense-Oligonucleotide enthalten, die spezifisch mit RNA hybridisieren, die mutierte Versionen eines hPXR-Gens gemäß der Erfindung codiert, oder die Antikörper enthalten, die speziell mutiertes hPXR-Protein erkennen, aber nicht oder im Wesentlichen nicht die funktionelle Wildtypform, in Fällen denkbar, bei denen die Konzentration der mutierten Form in den Zellen reduziert werden sollte.
Dank der vorliegenden Erfindung können die Auswahl des speziellen Arzneistoffs, das Dosierungsschema und die entsprechend zu behandelnden Patienten gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt werden. Die Dosierungsempfehlung wird in der Produktbeschreibung festgehalten werden und wird dem Verschreibenden ermöglichen, in Abhängigkeit von der in Betracht kommenden Patientengruppe Dosierungsanpassungen vorzusehen, wobei Informationen vorhanden sind, die die Verschreibung des falschen Arzneistoffs an die falschen Patienten mit einer falschen Dosis verhindern.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine diagnostische Zusammensetzung, die eines der vorstehend beschriebenen Polynucleotide, Vektoren, Wirtszellen, varianten hPXR-Proteine, Nucleinsäuremoleküle oder der entsprechenden Vektoren der Erfindung und gegebenenfalls geeignete Mittel für den Nachweis enthält.
Die Zusammensetzung kann weitere Inhaltsstoffe enthalten, wie Selektionsmarker und Komponenten für Selektionsmedien, die geeignet sind für die Erzeugung von transgenen Zellen und Tieren. Die Zusammensetzung der Erfindung kann vorteilhafterweise bei der Durchführung eines Verfahrens der Erfindung verwendet werden und könnte unter anderem bei einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, z. B. im diagnostischen Gebiet oder als Forschungswerkzeug. Die Bestandteile der Zusammensetzung der Erfindung können einzeln in Ampullen oder in Kombination in Behältnissen oder Einheiten mit mehreren Behältnissen verpackt werden. Die Herstellung der Zusammensetzung folgt vorzugsweise Standardverfahren, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind. Die diagnostische Zusammensetzung kann bei Verfahren für den Nachweis der Expression einer mutierten Form des hPXR-Gens gemäß einem der vorstehend beschriebenen Verfahren der Erfindung unter Verwendung von zum Beispiel Immunassay-Techniken wie den Radioimmunassay oder den Enzymimmunassay oder vorzugsweise Nucleinsäure-Hybridisierungs- und/oder Amplifikationstechniken wie den hier vorstehend und in den Beispielen beschriebenen verwendet werden.
Einige genetische Veränderungen führen zu geänderten Zuständen der Konformation von Proteinen. Zum Beispiel können einige variante hPXR-Proteine eine Tertiärstruktur besitzen, die ihnen weit weniger die Fähigkeit verleiht, die Arzneistoffmetabolisierung bzw. Transkriptionsinitiation zu ermöglichen. Die Wiederherstellung der normalen oder regulierten Konformation von mutierten Proteinen ist die eleganteste und spezifischste Art der Korrektur dieser molekularen Defekte, obwohl sie schwierig ist. Pharmakologische Manipulationen können somit auf die Wiederherstellung der Wildtyp-Konformation des Proteins zielen. Somit können die Polynucleotide und codierten Proteine der vorliegenden Erfindung auch für die Planung und/oder Identifikation von Molekülen verwendet werden, die in der Lage sind, die Wildtyp-Funktion eines hPXR-Gens oder -Proteins zu aktivieren.
Dementsprechend offenbart die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Arzneistoffs oder eines Prodrugs für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung oder Verhinderung einer Krankheit, die mit dem hier vorstehend beschriebenen Verfahren diagnostiziert wurde.
Weiterhin offenbart die vorliegende Erfindung die Verwendung einer effektiven Dosis einer Nucleinsäuresequenz, die ein funktionelles und exprimierbares Wildtyp-hPXR-Protein codiert, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung, Vermeidung und/oder Verzögerung einer Störung, die mit dem Verfahren der Erfindung diagnostiziert wurde. Ein Gen, das ein funktionelles und exprimierbares hPXR-Protein codiert, kann in Zellen eingebracht werden, die wiederum das Protein von Interesse produzieren. Die Gentherapie, die auf der Einbringung von therapeutischen Genen in Zellen mit ex-vivo- oder in vivo-Verfahren beruht, ist eine der wichtigsten Anwendungen des Gentransfers. Geeignete Vektoren und Verfahren für die in-vitro- und in-vivo-Gentherapie sind in der Literatur beschrieben und sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt; vgl. z. B. Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534–539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911–919; Anderson, Science 256 (1992), 808–813; Isner, Lancet 348 (1996), 370–374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077–1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714–716; WO 94/29469 ; WO 97/00957 oder Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635–640, und dort zitierte Referenzen. Das Gen kann für die direkte Einbringung in die Zelle oder für die Einbringung mit Liposomen oder viralen Vektoren (z. B. adenoviral, retroviral) geplant werden. Vorzugsweise ist die Zelle eine Keimbahnzelle, eine embryonale Zelle oder eine Eizelle oder davon abgeleitet, am meisten bevorzugt ist die Zelle eine Stammzelle.
Wie von dem Vorstehenden offensichtlich ist, wird es bevorzugt, dass bei der vorstehend beschriebenen Verwendung die Nucleinsäuresequenz funktionell mit regulatorischen Elementen verknüpft ist, die die Expression und/oder Steuerung des hPXR-Gens zu spezifischen Zellen erlauben. Geeignete Genverabreichungssysteme, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, können Liposomen, Rezeptor-vermittelte Verabreichungssysteme, nackte DNA und virale Vektoren wie Herpesviren, Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren unter anderen umfassen. Die Verabreichung von Nucleinsäuren zu einer spezifischen Stelle im Körper für die Gentherapie kann auch unter Verwendung eines biolistischen Verabreichungssystems erreicht werden, wie das von Williams (Proc. Natl. Acad. Sci USA 88 (1991), 2726–2729) beschriebene. Standardverfahren für die Transfektion von Zellen mit rekombinanter DNA sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet der Molekularbiologie wohl bekannt; vgl. z. B. WO 94/29469 ; vgl. auch vorstehend. Die Gentherapie kann durch direkte Verabreichung des rekombinanten DNA-Moleküls oder Vektors der Erfindung an einen Patienten oder mittels Transfektion von Zellen mit dem Polynucleotid oder Vektor der Erfindung ex vivo und Infusion der transfizierten Zellen in den Patienten durchgeführt werden.
Diese und andere Ausführungsformen sind offenbart in oder offensichtlich von und umfasst von der Beschreibung und den Beispielen der vorliegenden Erfindung. Weitere Literatur hinsichtlich der Verfahren, Verwendungen und Verbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, kann von öffentlichen Bibliotheken erhalten werden, zum Beispiel unter Verwendung von elektronischen Mitteln. Zum Beispiel kann die öffentliche Datenbank "Medline" verwendet werden, die im Internet verfügbar ist, z. B. unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Weitere Datenbanken und Adressen wie http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html; http://www.tigr.org/ sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt und können auch unter Verwendung von z. B. http://www.lycos.com erhalten werden. Einen Überblick über Patentinformation in der Biotechnologie und einen Überblick über relevante Quellen von Patentinformation, die für eine retrospektive Recherche und das laufende Bewusstsein von Nutzen sind, werden in Berks, TIBTECH 12 (1994), 352–364 gegeben.
Die pharmazeutischen und diagnostischen Zusammensetzungen, Verwendungen und Verfahren der Erfindung können auch für die Diagnose und Behandlung von allen Arten von Krankheiten verwendet werden, von denen bisher nicht bekannt ist, dass sie mit varianten hPXR-Genen in Beziehung stehen oder davon abhängen. Die Zusammensetzungen, Verfahren und Verwendungen der vorliegenden Erfindung können wünschenswerterweise in Menschen angewendet werden, obwohl auch die Behandlung von Tieren von den hier beschriebenen Verfahren und Verwendungen umfasst wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Unterschiede im genetischen Aufbau beeinflussen die Wirksamkeit und Sicherheit der Behandlung mit Arzneistoffen
2: Ein gegenwärtiges Modell der Regulation von CYP3A4 durch hPXR.
3: A) die Struktur des hPXR-Gens. Die codierenden Regionen sind als gefüllte Rechtecke dargestellt, die nicht codierenden untranslatierten 5'- und 3'-Regionen sind gestrichelte Rechtecke. Pfeile kennzeichnen die Positionen der Oligonucleotide, die für die Durchmusterung der codierenden Region des Gens verwendet wurden. Die horizontalen Balken, die mit DBD und LDB gekennzeichnet sind, markieren die Lage der DNA bindenden Region bzw. der Liganden bindenden Region. Die horizontalen Linien unten zeigen die menschlichen genomischen BAC-Clone GS21907 und GS21908, einschließlich der Restriktionsstellen für ApaI (A), BgIII (B), EcoRI (E), EcoRV (EV), HindIII (H) und XbaI (X). B) Die differentielle Expression der Exons 1a und 1b von hPXR in der Leber und dem Darm, wie sie mittels PCR-Amplifikation von von Gewebe abgeleiteten cDNAs untersucht wurde. Die für die Amplifikation verwendeteten Primer werden unterhalb des Agarosegels und mit Pfeilen in den Exons 1a und 1b und 2 dargestellt.
4: Genomische Sequenzen und Polymorphismen in den hPXR-Genen. Die für die Amplifikation und Sequenzierung verwendeten Primer (Tabelle 3) ebenso wie die Spleiß-Stellen sind unterstrichen. Dick unterstrichen sind polymorphe Stellen und sie werden als die Wildtyp- und die variante Base gezeigt, getrennt durch einen Pfeil.
5: Die Western-Blot-Analyse des gesamten zellulären Proteins von COS-1-Zellen, die transient mit 5 μg Expressionsplamiden für Wildtyp- oder variante hPXR-Proteine transfiziert wurden. Die Proteinmengen wurden entsprechend der Transfektionseffizienz eingestellt, geschätzt durch die Aktivität der β-Galactosidase, die gleichzeitig in die Zellen transfiziert wurde. Die Blots wurden mit einem hPXR-spezifischen Antikörper hybridisiert. Molekulargewichtsmarker (in kD) sind links gezeigt.
6: LS174T-Zellen wurden gleichzeitig mit dem Promotor-künstlichen hPXR-abhängigen Reportergens pGL3(DR3)₃Tk(-105), pCMVβ und Expressionsplasmiden für hPXR-Varianten transfiziert, wie angegeben. Die Zellen wurden 42 Stunden mit 10 μM Rifampicin oder 0,1%-igem DMSO behandelt, dann geerntet und auf ihre Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivitäten analysiert. Die Daten werden als Mittelwert ±SA gezeigt. Die Aktivität jeder hPXR-Varianten in der Gegenwart von nur DMSO wurde als 1 (A, B) oder 100% (C) genommen. A) Die Effekte von hPXR-Varianten nach 10 μM Rifampicin. B) Die Effekte von hPXR-Varianten in der Abwsenheit von exogenen Induktoren.
Beispiele
Beispiel 1: Genomische Organisation und Oligonucleotide für die Amplifikation der codierenden Regionen von hPXR
Die genomische Struktur von hPXR wurde durch Sequenzierung von PCR-Fragmenten, die mit Oligonucleotiden erzeugt worden waren, die in zwei benachbarten Exons liegen, ebenso wie durch direkte Sequenzierung eines hPXR enthaltenden BAC (Genome Systems GS21908) bestimmt. Der Vergleich zwischen den erhaltenen genomischen und GenBank-cDNA-Sequenzen (gi 3769538, gi 3769536, gi 5852062, gi 5852066, gi 3511137) offenbarte, dass das Gen aus 10 Exons und 9 Introns besteht und mindestens 20 kb genomischer DNA überspannt. Die ungefähre Größe von Intron 1b wird auf etwa > 7 kb geschätzt (3, Tabellen 1 und 2), basierend auf der Restriktionskartierung der BACs GS21908 und GS21907, gefolgt von Hybridisierung mit mehreren Sonden, die von dem Gen abgeleitet sind. Die Exon- und Intron-Größen ebenso wie die Sequenzen an den Exon-Intron-Grenzen sind in Tabelle 2 angegeben.
Die Sequenz- und Genexpressionsanalysen offenbarten, dass die Exons 1a und 1b als alternative 5'-Enden von hPXR-Transkripten verwendet werden (Bertilsson, Proc Natl Acad Sci U S A 95 (1998), 12208–13). Somit fehlt dem Intron 1a eine 3'-Konsensus-Spleiß-Stelle (nicht gezeigt). Die zwei Exons werden in Geweben, in denen hPXR transkribiert wird, verschieden exprimiert. Exon 1a wird in der Leber und dem Dünndarm exprimiert, während Exon 1b nur in der Leber exprimiert wird (3B).
Beispiel 2: Isolierung von genomischer DNA, Amplifikation, Reinigung und Sequenzierung von hPXR-Genfragmenten.
Genomische DNA wurde unter Verwendung von Standardtechniken aus Blut- oder Leberproben von Kaukasiern oder Schwarzafrikanern isoliert. Die Bedingungen für die Amplifikation von hPXR-Genfragmenten sind in Tabelle 3 angegeben. Die vollständigen Sequenzen der Amplicons sind in 4 dargestellt. Die Qualität der Amplicons wurde routinemäßig mit Agarosegelelektrophorese überprüft. Die Fragmente wurden dann über PCR-Reinigungssäulen (Qiagen) verarbeitet, was alle Komponenten der PCR entfernte, die ansonsten bei der anschließenden Sequenzierungsreaktion stören könnten.
Die Sequenzierungsreaktion wurde unter Verwendung des Farbstoffterminator-Verfahrens durchgeführt und die Proben wurden dann auf Polyacrylamid-Gelen aufgelöst (Perkin-Elmer-377- und -3700-Sequenzierungsgeräte). Beide Stränge wurden routinemäßig sequenziert, um die hohe Qualität der Resultate und das Auffinden von Heterozygoten sicher zu stellen. Die Sequenzen wurden visuell auf ihre Qualität überprüft und dann unter Verwendung des PHRED/PHRAP/POLYPHRED/CONSED-Softwarepakets (University of Washington, Seattle, USA) auf die Anwesenheit von Polymorphismen analysiert.
Beispiel 3: Polymorphismen im hPXR-Gen
Die codierende Region von hPXR, Teile des 5'- und 3'-UTR ebenso wie einige Intronsequenzen, die die Exons des Gens flankieren, wurden mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert und sequenziert (Tabelle 3). Die Durchmusterung wurde bei 300 bis 418 kaukasischen und 54 bis 74 afrikanischen Chromosomen vorgenommen (Tabellen 4 und 5). Insgesamt wurden 28 Varianten in den durchsuchten Proben gefunden (Tabellen 4 und 5). Neun Variante wurden nur bei Kaukasiern gefunden, 14 waren exklusiv für die Afrikaner, während nur fünf bei beiden ethnischen Gruppen gemeinsam vorkamen. 13 Varianten sind innerhalb der Protein-codierenden Sequenz lokalisiert, 8 in den flankierenden Intronsequenzen und sieben in dem 5'- oder 3'-UTR. Von den 13 Varianten, die in der Protein-codierenden Region gefunden wurden, wirkten sich sechs auf die hPXR-Proteinsequenz aus, während 7 still sind (Tabellen 4 und 5). Drei Proteinvarianten (E18K, P27S und G36R) liegen in Exon 2. Zwei von ihnen (E18K und P27S) wurden nur bei Afrikanern identifiziert. Der häufigste Proteinpolymorphismus (P27S) tritt bei 14,9% der afrikanischen Chromosomen auf. Die Variante G36R wird nur bei Kaukasiern gefunden und sie hat eine allelische Frequenz von 3%. 0,5% der Kaukasier sind heterozygot hinsichtlich der Variante V104M und 2,7% der Afrikaner hinsichtlich der Variante D163G). 3,1% der Afrikaner sind heterozygot hinsichtlich der Variante A370T. Innerhalb der konservierten Spleißstellen (AG und GT) wurden keine Mutationen gefunden. Insgesamt ist die Protein-codierende Sequenz von hPXR, wie sie bei der Mehrheit der Kaukasier und Afrikaner gefunden wird, identisch mit der berichteten cDNA-Sequenz (gi 3769538), außer der Position 112, wo bei allen analysierten Proben ein A durch ein G ersetzt wurde.
Beispiel 4: Funktionelle Charakterisierung der hPXR-Proteinvarianten
Im Folgenden untersuchten wir den Effekt der Unsinn-hPXR-Mutationen auf die Expression und Aktivität des hPXR-Proteins. Wir untersuchten auch den Effekt der hPXR-2-Spleiß-Variante, die von einer kryptischen Spleiß-Akzeptorstelle innerhalb von Exon 5 resultiert, die zu einer Deletion von 37 Aminosäuren aus der Liganden-Bindungsdomäne von hPXR führt (Dotzlaw, Clin Cancer Res 5 (1999), 2103–7). Dazu konstruierten wir eukaryontische Expressionsplasmide für alle sechs hPXR-Proteinvarianten und für die hPXR-2-Deletionsvariante. Die Sequenz des vom "Wildtyp"-Konstrukt codierten Proteins ist identisch mit der bei den meisten Kaukasiern und Afrikanern gefundenen. Die Western-Blot-Analyse von COS-1-Zellen, die transient mit diesen Plasmiden transfiziert waren, zeigte, dass alle Varianten die Expression ähnlicher Mengen an Protein steuerten (5). Die offensichtlichen Größen der Varianten waren in Übereinstimmung mit dem berechneten Molekulargewicht von hPXR (49,7 kD) und hPXR-2 (45,7 kD), mit der Ausnahme der E18K-Varianten, die ein offensichtliches Molekulargewicht von 47–48 kD zeigte (5).
Die funktionellen Konsequenzen der Proteinvarianten wurden in LS174T-Zellen untersucht. LS174T-Zellen wurden zuerst mit Wildtyp- oder varianten hPXR-Expressionsplasmiden gleichzeitig zusammen mit dem hPXR-abhängigen Promotor-Reportergen-Plasmid pGL3(DR3)₃TK(-105) transfiziert. Das Plasmid enthält drei Kopien des DR3-Motivs des CYP3A23-Promotors, von dem gezeigt wurde, dass er das hPXR-Response-Element ist (Kliewer, Cell (1998), 73–82), und der stromaufwärts eines minimalen Thymidinkinase-Promotors und von Luciferase inseriert ist. Diese Zellen wurden mit dem Xenobioticum Rifampicin behandelt, einem bekannten Aktivator des menschlichen hPXR (Slumberg, Genes Dev (1998), 3195–3205; Lehmann, J Clin Invest (1998), 1016–1023). 6a zeigt, dass die Varianten E18K, P27S und G36R die Transkription des Reportergens in diesem Test ebenso effizient stimulierten wie Wildtyp-hPXR nach Behandlung mit Rifampicin. Im Gegensatz dazu war die von hPXR vermittelte transkriptionelle Aktivierung bei den V140M-, D163G- und hPXR-2-Varianten vermindert. Nach der Behandlung mit Rifampicin zeigen die V140M- und D163G-Varianten nur 50% der Wildtyp-Aktivität, während hPXR-2 nur eine Aktivität von etwa 25% hatte (6A). A370T zeigte nach Behandlung mit Rifampicin auch eine leicht verminderte transkriptionelle Aktivierung, aber diese Reduktion war in der besagten Serie von Experimenten nicht signifikant und muss durch weitere Experimente oder in anderen Testsystemen bestätigt werden (6A). Wie in 6B in der Abwesenheit von zugesetzten hPXR-Aktivatoren zusammengefasst, zeigten die Varianten E18K, P27S und G36R eine niedrigere Grundaktivität als Wildtyp-hPXR, während V140M und A370T eine erhöhte Grundaktivität zeigten (130% oder 207%). Im Gegensatz dazu zeigten D163G und hPXR-2 eine stark reduzierte Grundaktivität (etwa 10% vom Wildtyp). Die Veränderungen in der Grundaktivität von Varianten sind unabhängig von der Aktivator-abhängigen Aktivität. Während V140M und A370T eine höhere Grundaktivität hatten, aber eine reduzierte oder gleiche Aktivität bei Aktivierung des mutierten hPXR, hatten D163G und hPXR-2 beide eine niedrigere Grundaktivität ebenso wie eine reduzierte Aktivität nach Aktivierung.
Tabelle 1: Bei der Bestimmung der Struktur und der Exon/Intron-Grenzen des hPXR-Gens verwendete Oligonucleotide
50 ng genomische DNA wurden zu einem Reaktionsgemisch (Gesamtvolumen 30 oder 50 μl) zugegeben, das 1 × PCR-Puffer (Q = Qiagen, Kat. Nr. 1005479, oder B2 = Boehringer (nunmehr Roche) Expand Long Template PCR Buffer, Nummer 2, Kat. Nr. 1742655), 0,25 μM jedes Oligonucleotids, 200 μM dNTPs und 1 E Taq-Polymerase (Qiagen) enthielt. Amplifikationen wurden auf einem RoboCycler Gradient 96 (Stratagene) durchgeführt, mit einem anfänglichen Denaturierungsschritt von 2 Min. bei 94°C, gefolgt von 32 Amplifikationszyklen von Denaturierung (40 Sek., 94°C), Anlagerung (45 Sek., Temperaturen 56–60°C) und Verlängerung (60–150 Sek., 72°C). Dem folgte ein finaler Verlängerungsschritt von 5 Min., 72°C. Alle Sequenzierungsreaktionen wurden auf einem GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer) unter Verwendung des dye-terminator DNA sequencing-Kits (Perkin Elmer, Kat. Nr. 4303154) gemäß den Vorschriften des Herstellers durchgeführt.
Tabelle 2. Exon-Intron-Organisation des hPXR-Gens*

*Exonsequenzen sind in großen Buchstaben gezeigt, Intronsequenzen in kleinen Buchstaben. Wegen der alternativen Verwendung der Exons 1a und 1b in den hPXR-Transkripten ist keine 3'-Spleiß-Stelle in Intron 1 angegeben.

Tabelle 5: Genetische Varianten von hPXR
Referenzen

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Sequenzprotokoll

Claims

Polynucleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polynucleotid mit der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NOs: 112, 113 oder 174; und (b) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 175 codiert.
Vektor, der das Polynucleotid nach Anspruch 1 umfasst.
Vektor nach Anspruch 2, wobei das Polynucleotid funktionell mit Expressionskontrollsequenzen verbunden ist, die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen erlauben.
Wirtszelle, die mit dem Polypeptid nach Anspruch 1 oder dem Vektor nach Anspruch 2 oder 3 genetisch verändert ist.
Verfahren zur Herstellung einer molekularen Variante des hPXR-Proteins, umfassend: (a) das Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 4; und (b) das Ernten des Proteins aus der Kultur.
Verfahren zur Herstellung von Zellen, die eine molekulare Variante des hPXR-Gens exprimieren können, umfassend das genetische Verändern der Zellen mit dem Polynucleotid nach Anspruch 1 oder dem Vektor nach Anspruch 2 oder 3.
hPXR-Protein oder Fragment davon, umfassend das Polypeptid, das von dem Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert wird, oder erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 5 oder von den Zellen, die gemäß dem Verfahren nach Anspruch 6 hergestellt wurden.
Transgenes nicht-menschliches Tier, umfassend zumindest ein Polynucleotid nach Anspruch 1 oder den Vektor nach Anspruch 2 oder 3.
Transgenes nicht-menschliches Tier nach Anspruch 8, weiterhin umfassend zumindest ein inaktiviertes Wildtyp-Allel des hPXR-Gens.
Transgenes nicht-menschliches Tier nach Anspruch 8 oder 9, das eine Maus oder Ratte ist.
Verfahren zum Auffinden eines hPXR-Inhibitors, der die Aktivität einer molekularen Variante des hPXR-Gens oder seines Genprodukts modulieren kann, umfassend die Schritte (a) des Inkontaktbringens des Proteins nach Anspruch 7 oder einer Zelle, die eine molekulare Variante des hPXR-Gens exprimiert, die ein Polynucleotid nach Anspruch 1 umfasst, in der Anwesenheit von Stoffen, die ein nachweisbares Signal als Antwort auf Arzneistoffverstoffwechslung liefern können, mit einer zu durchmusternden Verbindung unter Bedingungen, die CYP3A4- oder CYP3A7-vermittelte Arzneimittelverstoffwechslung erlauben, und (b) des Nachweisens der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals oder einer Zunahme eines Signals, das von der Arzneistoffverstoffwechslung erzeugt wurde, wobei die Anwesenheit oder die Zunahme des Signals auf einen möglichen Inhibitor hinweist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Zelle eine Zelle nach Anspruch 4 ist, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 6 oder enthalten in dem transgenen nicht-menschlichen Tier nach einem der Ansprüche 8 bis 10.
Verfahren zum Auffinden eines hPXR-Inhibitors, der die Aktivität einer molekularen Variante des hPXR-Genprodukts modulieren kann, umfassend die Schritte (a) des Inkontaktbringens des Proteins nach Anspruch 7 mit einem ersten Molekül, von dem bekannt ist, dass es vom hPXR-Protein gebunden wird, um einen ersten Komplex zwischen dem Protein und dem ersten Molekül zu bilden; (b) des Inkontaktbringens des ersten Komplexes mit einer zu durchmusternden Verbindung; und (c) des Messens, ob die Verbindung das erste Molekül aus dem ersten Komplex verdrängt.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Messschritt das Messen der Bildung eines zweiten Komplexes zwischen dem Protein und der Verbindung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei der Messschritt das Messen der Menge des ersten Moleküls, das nicht von dem Protein gebunden ist, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei das erste Molekül Nifedipin, Rifampicin oder Corticosteron ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei das erste Molekül markiert ist.
In vitro-Verfahren zur Diagnose von Krebs, der im Zusammenhang steht mit der Anwesenheit einer molekularen Variante des hPXR-Gens, oder einer Anfälligkeit für Krebs, umfassend (a) das Bestimmen der Anwesenheit eines Polynucleotids nach Anspruch 1 in einer Probe eines Individuums; und/oder (b) das Bestimmen der Anwesenheit eines Proteins nach Anspruch 7.
Verfahren nach Anspruch 18, umfassend PCR, Ligase-Kettenreaktion, Restriktionsverdau, direktes Sequenzieren, Nucleinsäure-Amplifikationstechniken, Hybridisierungstechniken oder Immunassays.
Verwendung eines Oligo- oder Polynucleotids zum Nachweisen eines Polynucleotids nach Anspruch 1 und/oder zum Genotypisieren von einzelnen hPXR-Allelen.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Oligonucleotid 15 bis 50 Nucleotide in der Länge hat und die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 112 oder eine komplementäre Sequenz umfasst.
Primer oder Sonde, bestehend aus einem wie in Anspruch 21 definierten Oligonucleotid.
Zusammensetzung, die das Polynucleotid nach Anspruch 1, den Vektor nach Anspruch 2 oder 3, die Wirtszelle nach Anspruch 4 oder die erhältlich ist durch das Verfahren nach Anspruch 6, das Protein nach Anspruch 7 oder den Primer oder die Sonde nach Anspruch 22 umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, die ein diagnostisches Mittel oder Arzneimittel ist.