DE60035154T2

DE60035154T2 - Verbindungen zum spalten von doppelstrang-dns sowie verfahren zu deren verwendung

Info

Publication number: DE60035154T2
Application number: DE60035154T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Shinjuku-ku Sugiyama; Zhi-Fu Charlottesville Tao; Isao Kyoto-shi SAITO
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2020-03-11
Also published as: WO2000058312A1; TWI267515B; EP1083177A4; JP3649617B2; CA2328903C; KR20010043207A; CA2328903A1; EP1083177A1; JP2000281679A; DE60035154D1; KR100745440B1; US6713633B1; EP1083177B1

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung, die durch chemische Synthese erzeugt werden kann und die eine doppelsträngige DNA gleichzeitig alkylieren und spalten kann, eine Methode zum Alkylieren von DNA unter Verwendung dieser Verbindung, eine Methode zum Spalten von doppelsträngiger DNA und eine pharmazeutische Zusammensetzung unter Verwendung dieser Verbindung.
Hintergrund
Die Basensequenz des Gesamtgens, unsere menschliche "Blaupause des Lebens", wird innerhalb weniger Jahre durch das Humane Genomprojekt aufgeklärt sein. Die Tatsache, dass eine Erkrankung oder ein Alterungsprozess auftritt, wenn diese Blaupause beschädigt ist oder einen Schaden erwirbt, ist wohl bekannt. Als Ergebnis der Fortschritte im Humanen Genomprojekt können viele Krankheiten, einschließlich Krebs, auf der DNA-Ebene verstanden werden und kann die gesamte medizinische Wissenschaft, einschließlich der Diagnose und Prophylaxe, in revolutionärer Weise verändert werden. Weiterhin wird in hohem Maße eine therapeutische Methode erwartet, die auf einem Verständnis dieser Krankheiten auf der DNA-Ebene basiert, nämlich die Entwicklung pharmazeutischer Produkte, die auf das Verursachergen einer Erkrankung und sein Produkt gerichtet sind, wobei aber Vermittlerstudien zur Anwendung von Grundlagenstudien auf die klinischen Studien soeben erst aufgenommen worden sind. Die derzeit verwendeten Antikrebsmittel sind Antibiotika, die in erster Linie durch Screening ausgewählt werden und die ursprünglich nicht durch Mi kroorganismen für den Zweck ihrer zytotoxischen Wirkung auf Krebszellen produziert worden sind, und unter welchen nahezu keine auf molekularbiologischen Kenntnissen von Krebs basierenden Substanzen bekannt sind. Wenn die Expression des intrazellulären spezifischen Gens extrazellulär frei kontrolliert werden kann, so kann schließlich eine therapeutische Methode auf der Genebene gefunden werden.
Vor kurzem haben wir festgestellt, dass das Antibiotikum Duocarmycin einen Heterodimer mit einem Molekül einer anderen Spezies bildete, wie etwa Distamycin, und in der Zusammenwirkung eine molekulare Erkennung von DNA erreichten, wobei eine wirksame Alkylierung der Basensequenz im Vergleich zur lediglichen Nutzung von Duocarmycin erreicht werden kann (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14405, 1996). Ausgehend von dem Ergebnis dieser Entdeckung wird Pyrrol-Imidazol-Polyamid an die Alkylierungsstelle von Duocarmycin als einer DNA-Erkennungsstelle gebunden, und so haben wir erfolgreich ein Molekül synthetisiert, das DNA an irgendeiner ihrer Basensequenzen selektiv alkylieren kann ( Japanische Patentanmeldung Nr. Hei 10-260710 ). Allerdings können die Verbindungen, die lediglich mit Pyrrol-Imidazol-Polyamid als der DNA-Erkennungsstelle in der Alkylierungskomponente von Duocarmycin binden, nicht nur eine ungenügende Alkylierungsaktivität aufweisen, sondern auch lediglich die Basensequenz eines Stranges alkylieren.
Wir haben die Alkylierungsreaktion mit diesen Molekülen und der DNA unter Anwendung eines Computermodells, etwa der Molekulardynamik dieser Verbindungen, detailliert untersucht und dabei festgestellt, dass als ein Ergebnis der Insertion des Linkers, wie etwa einer Vinylgruppe, in die Lokalisation der Cyclopropan-Komponente (Segment A), welches eine reaktive Stelle von Duocarmycin ist, eine verbesserte Alkylierungsleistung der DNA erwartet werden könnte.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Alkylierungsmittel mit einer verbesserten Leistung der DNA-Alkylierung bereit. Weiterhin haben wir in der vorliegenden Studie festgestellt, dass das Alkylierungsmittel der vorliegenden Erfindung ein Dimer-artiges Verhalten als auch eine gleichzeitige Alkylierung und Spaltung der doppelsträngigen DNA zeigte und eine Wirkung als ein künstliches Restriktionsenzym für die spezifische Basensequenz aufwies.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine neue chemische Spezies bereit, die doppelsträngige DNA gleichzeitig alkylieren und spalten kann. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung eine Methode zur Alkylierung und Spaltung von DNA unter Verwendung dieser chemischen Spezies bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Antikrebsmittel unter Verwendung der Verbindung bereit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine zeichnerische Darstellung einer Fotografie, die das Ergebnis einer Reaktion von ImPyLDu86 der vorliegenden Erfindung und DNA zeigt.
2 zeigt die Basensequenz von DNA und die chemische Struktur von ImPyLDu86, das in dem Experiment verwendet wurde.
3 zeigt eine schematische Darstellung der Spaltstelle von DNA durch eine Verbindung der vorliegenden Erfindung.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist eine durch die folgende Formel dargestellte Verbindung (im Folgenden bezeichnet als "PyPyLDu86"):
oder eine durch die folgende Formel dargestellte Verbindung (im Folgenden bezeichnet als "ImPyLDu86"):
Die obigen Verbindungen erkennen eine Basensequenz TGACG oder CGACG, oder den komplementären Strang davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung der Erfindung in einem Prozess zur Alkylierung einer spezifischen Basensequenz eines Doppelstrangs von DNA.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Verbindung der Erfindung in einem Prozess zur Spaltung einer spezifischen Basensequenz eines Doppelstrangs von DNA.
Bei diesen Verwendungen ist es bevorzugt, dass die spezifische Basensequenz TGACG oder CGACG, oder ein komplementärer Strang davon, ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung der Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger dafür.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus eine Verbindung der Erfindung zur Verwendung bei einer Methode zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus die Verwendung einer Verbindung der Erfindung in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einer Methode zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers auf Krebs.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können gemäß einer bekannten Me thode erzeugt werden.
Beispiele der Herstellung der obigen ImPyLDu86 (7a) und IPyPyLDu86 (7b) sind in dem folgenden chemischen Reaktionsschema gezeigt. Die Zahlen unter jeder Verbindung in dem Reaktionsschema geben die Verbindungs-Nr. an.
Jede Reaktion verläuft wie folgt: a) eine Behandlung mit Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP) und NaBH₄ in THF; b) eine Behandlung mit MnO₂ in THF; c) eine Behandlung mit Triethylphosphonacetat und NaH in THF; d) eine Behandlung mit Natriumhydroxid in Wasser/Methanol; e) eine Behandlung mit 1,1'-Carbonyldiimidazol in DMF; und f) eine Behandlung mit Segment A von DU86 unter Verwendung von NaH in DMF.
Die Reaktivitäten des derart erhaltenen PyPyLDu86 und ImPyLDu86 mit DNA wurden untersucht. Das Ergebnis der Alkylierung unter Verwendung von ImPyLDu86 ist in 1 gezeigt. Die bei diesem Experiment verwendete DNA und eine Struktur des verwendeten ImPyLDu86 sind in 2 gezeigt.
Das linke Elektrophoresemuster ist das Ergebnis des oberen Strangs der doppelsträngigen DNA, und das rechte Elektrophoresemuster ist das Ergebnis des unteren Strangs der doppelsträngigen DNA. Die Alkylierungsstelle kann durch wärmeinduzierte Strangspaltung beobachtet werden. Als ein Ergebnis wird die doppelsträngige DNA hauptsächlich an der Stelle 1 und der Stelle 2 der beiden Stränge durch die niedrigere Konzentration gespalten, wobei eine gleichzeitige Alkylierung der beiden Stränge bestätigt werden kann. Von keinen Verbindungen ist eine derartige Spaltung bekannt, weshalb die Verbindung der vorliegenden Erfindung in diesem Sinne als ein künstliches Restriktionsenzym bezeichnet werden kann. Die Leistung der Spaltung wurde als sich einem hohem Verhältnis von 70 % annähernd befunden, wie anhand einer Menge des verwendeten ImPyLDu86 errechnet, was eine ungewöhnlich hohe Leistung im Vergleich zu der des zuvor synthetisierten Moleküls darstellt (siehe japanische Patentanmeldung Nr. Hei 10-260710 ).
Ein Grund für das Auftreten der gleichzeitigen Alkylierung an den beiden Strängen kann der sein, wie in 3 gezeigt, dass eine Dimerisation von ImPyLDu86 das GC-Basenpaar durch Konstruieren der bevorzugten Stapelung der Linker-Komponente und des Imidazols erkennt und es spezifisch mit der Erkennungssequenz auf der doppelsträngigen DNA bindet. Als Folge wurde gezeigt, dass der Linker, der vorgeschlagen und durch molekulares Designing inseriert wurde, die Reaktivität der Ver bindung erhöhen könnte und als eine Erkennungseinheit durch Paarung mit Imidazol verwendet werden könnte. Basierend auf dieser Kenntnis können wir behaupten, dass wir einen Schritt zu auf das molekulare Design dieses neuen Typs von Wirkstoffen für die auf eine spezifische Sequenz der DNA zielende Gentherapie unternommen haben.
Die zytotoxische Aktivität der Verbindung der vorliegenden Erfindung, die auf den im Vorangegangenen beschriebenen Eigenschaften basiert, wurde untersucht. Die zytotoxischen Aktivitäten von PyPyLDu86 und ImPyLDu86 der vorliegenden Erfindung und des bekannten Antikrebsmittels Duocarmycin auf HeLaS₃-Zellen (uterozervikale Plattenepithelkarzinomzellen) wurden getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung etwa 3-7-fache Aktivitäten im Vergleich zu Duocarmycin aufweisen.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist als ein Antikrebsmittel nützlich und kann als eine pharmazeutische Zusammensetzung unter Hinzufügung eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers hergestellt werden. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann in Abhängigkeit von den Symptomen oral oder parenteral verabreicht werden. Eine wirksame Dosis der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann, in Abhängigkeit von den Bedingungen und Symptomen des Patienten, generell innerhalb eines Bereichs von 1 μg-100 mg/kg/Tag gewählt werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann mittels einer herkömmlichen Methode für die Präparierung zur Injektion formuliert werden.
Beispiele
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung konkreter.
Die Abkürzungen der in den folgenden Beispielen verwendeten Reagentien sind wie folgt.

DIEA:: N,N-Diisopropylethylamin,
DMF:: N,N-Dimethylformamid,
THF:: Tetrahydrofuran und
BOP:: Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat.

In den folgenden Beispielen wurden die Reaktionen mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung von 0,25 mm-Kieselgel 60-Platten, imprägniert mit 254 nm-Fluoreszenzindikator (Merck), überwacht. Die TLC-Platten wurden mittels UV-Licht sichtbar gemacht.
Im NMR-Spektrum wurde Tetramethylsilan als dem internen Standard verwendet, und die chemischen Verschiebungen der ¹H-NMR-Spektren wurden in ppm aufgezeichnet.
Die EI-(Elektronenimpakt)-Massenspektren wurden auf einem JNM-AX 505 aufgezeichnet, und ESIMS (Elektrosprayionisations-Massenspektren) wurden auf einem PE SCIEX API 165 aufgezeichnet. Ex Taq DNA-Polymerase und das Filterrohr (Suprec-02) wurden bezogen von Takara Shuzo Co., der Thermosequenase-Core-Sequenzierkit und der Ladefarbstoff (Dimethylformamid mit Fushin-Rot) von Amersham Co., am 5'-Ende Texas-Rot-modifiziertes DNA-Oligomer (18mer) von Kurabo Co. und 50 % Long Ranger-Gellösung von FMC Bioproducts. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde auf einem HITACHI 5500-S DNA-Sequenzierer vorgenommen.
Beispiel 1: Herstellung der Verbindung 2a (X = N)
NaBH₄, 98 mg (2,59 mmol) wurde einer Lösung von 204,8 mg (0,67 mmol) der Verbindung 1a, BOP 326,3 mg (0,74 mmol) und DIEA, 170 μl in THF, 30 ml, zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und das Lösungsmittel wurde in vacuo herausdestilliert, um einen Rückstand zu erhalten, dem CH₃OH, 20 ml, und Wasser, 5 ml, zugegeben wurde. Die Lösung wurde für 1 Stunde bis zum Erhalt einer klaren Lösung gerührt. Die Lösungsmittel wurden in vacuo entfernt, und der resultierende gelbe Rückstand wurde mittels Flashchromato graphie unter Verwendung von CH₃OH und CH₂Cl₂ gereinigt, wodurch die angestrebte Verbindung 2a erhalten wurde, 92,6 mg, Ausbeute 47,4 %.
¹H NMR(DMSO-d₆) δ
10,24 (s, 1H), 9,62 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 7,10 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,09 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,86 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 4,34 (d, J = 5,5 Hz, 2H), 3,93 (s, 3H), 3,54 (s, 3H), 2,01 (s, 3H).
Beispiel 2: Herstellung der Verbindung 2b (X = CH)
Verbindung 2b wurde in einer Ausbeute von 68,5 % in einer ähnlichen Weise wie die Verbindung 2a erhalten.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ
9,76 (s, 1H), 9,64 (s, 1H), 7,10 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,05 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,01 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,82 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 4,34 (d, J = 5,5 Hz, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,53 (s, 3H), 1,96 (s, 3H).
Beispiel 3: Herstellung der Verbindung 3a (X = N)
Ein Gemisch aus 85 mg (0,29 mmol) der Verbindung 2a und aktiviertes MnO₂ (85 %), 550 mg, wurde in THF, 30 ml, eingebracht, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden gerührt und filtriert. Der durch Entfernung des Lösungsmittels in vacuo erhaltene Rückstand wurde mittels ¹H NMR analysiert, um zu bestätigen, dass der Rückstand eine ausreichende Reinheit zur Verwendung im nächsten Reaktionsschritt ohne weitere Reinigung aufwies.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ
10,21 (s, 1H), 10,18 (s, 1H), 9,50 (s, 1H), 7,63 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,10 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 3,94 (s, 3H), 2,84 (s, 3H), 2,02 (s, 3H).
Beispiel 4: Herstellung der Verbindung 3b (X = CH)
Verbindung 3b wurde in einer Ausbeute von 68,5 % in einer ähnlichen Weise wie die Verbindung 3a erhalten.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ
9,99 (s, 1H), 9,80 (s, 1H), 9,49 (s, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,14 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 6,98 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 3,87 (s, 3H), 3,82 (s, 3H), 1,97 (s, 3H).
Beispiel 5: Herstellung der Verbindung 4a (X = N)
NaH (60 %), 23,1 mg (0,58 mmol) wurde in THF, 6 ml, gelöst und Triethylphosphonacetat, 116 ml, wurde dem unter Eiskühlung zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 5 Minuten gerührt, und eine Lösung der in 25 ml THF gelösten Verbindung 3a wurde dem zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde über Nacht gerührt. THF wurde in vacuo heraus destilliert. Der erhaltene Rückstand wurde unter Verwendung von Ethylacetat einer Flashchromatographie unterzogen. Verbindung 4a wurde als ein gelber Feststoff zu 88,5 mg in einer Ausbeute von 84 % erhalten (Ausbeute aus zwei Schritten, basierend auf 2a).
¹H NMR (DMSO-d₆) δ
10,25 (s, 1H), 9,87 (s, 1H), 7,51 (d, J = 15,9 Hz, 1H), 7,44 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,42 (s, 1H), 6,84 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 6,11 (d, J = 15,9 Hz, 1H), 4,16 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 4,13 (s, 3H), 3,70 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,24 (t, J = 7,0 Hz, 3H).
Beispiel 6: Herstellung der Verbindung 4b (X = CH)
Verbindung 4b wurde in einer Ausbeute von 55 % in einer ähnlichen Weise wie die Verbindung 4a erhalten.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ
9,87 (s, 1H), 9,78 (s, 1H), 7,51 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 7,39 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,13 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,85 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,73 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,07 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 4,16 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 3,82 (s, 3H), 3,68 (s, 3H), 1,97 (s, 3H), 1,23 (t, J = 7,0 Hz, 3H).
Beispiel 7: Herstellung der Verbindung 5a (X = N)
2N verdünntes NaOH, 1,5 ml, und 3 ml Wasser wurden einer Lösung von 70 mg (0,2 mmol) der Verbindung 4a in CH₃OH, 5 ml, zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 4,5 Stunden gerührt.
Nach der Entfernung des Lösungsmittels durch Vakuumdestillation wurden 20 ml Wasser dem Rückstand zugegeben. Die resultierende Lösung wurde filtriert, und das Filtrat wurde mit 2N HCl auf pH 2–3 angesäuert. Das derart erhaltene gelartige Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt und getrocknet, wodurch 43 mg der Verbindung 5a in einer Ausbeute von 67 % erhalten wurden.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ
10,24 (s, 1H), 9,84 (s, 1H), 7,43 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 6,78 (s, 1H), 6,03 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,67 (s, 3H), 3,86 (s, 3H);
ESIMS m/e

Als C₁₅H₁₆N₅O₄: Berechneter Wert (M-H) 330,3

Beobachteter Wert 330,2
Beispiel 8: Herstellung der Verbindung 5b (X = CH)
Verbindung 5b wurde in einer Ausbeute von 57 % in einer ähnlichen Weise wie die Verbindung 5a erhalten.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ
9,83 (s, 1H), 9,78 (s, 1H), 7,38 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 7,34 (s, 1H), 7,13 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,84 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,64 (s, 1H), 5,99 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,65 (s, 3H), 1,99 (s, 3H);
ESIMS m/e

Als C₁₆H₁₇N₄O₄: Berechneter Wert (M-H) 329,3

Beobachteter Wert 329,4
Beispiel 9: Herstellung der Verbindung 6a (X = N)
1,1'-Carboxyldiimidazol, 49,9 mg (0,31 mmol), wurde einer Lösung von 26,4 mg (0,08 mmol) der Verbindung 5a in 2 ml DMF zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, und 20 ml Wasser wurden zugegeben. Das Gemisch wurde filtriert, wodurch 20,5 mg der Verbindung 6a als ein gelbes Präzipitat in einer Ausbeute von 68 % erhalten wurden.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ
10,23 (s, 1H), 10,04 (s, 1H), 8,67 (s, 1H), 7,90 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,44 (s, 1H), 7,32 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,16 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 7,10 (s, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,79 (s, 3H), 2,03 (s, 3H);
ESIMS m/e

Als C₁₈H₁₈N₇O₃: Berechneter Wert (M-H) 380,4

Beobachteter Wert 380,4
Beispiel 10: Herstellung der Verbindung 6b (X = CH)
Verbindung 6b wurde in einer Ausbeute von 80 % in einer ähnlichen Weise wie die Verbindung 6a erhalten.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ
10,1 (s, 1H), 9,82 (s, 1H), 8,68 (s, 1H), 7,91 (t, J = 2,0 and 2,0 Hz, 1H), 7,87 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 7,48 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 722 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,16 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 7,14 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 7,10 (s, 1H), 6,89 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,78 (s, 3H), 1,97 (s, 3H);
ESIMS m/e

Als C₁₉H₁₉N₆O₃: Berechneter Wert (M-H) 379,4

Beobachteter Wert 379,4
Beispiel 11: Herstellung der Verbindung 7a (X = N)
Eine Lösung von 6,1 mg (0,024 mmol) des Segments A von DU86, gelöst in 0,3 ml DMF, wurde einer Lösung von 3,2 mg (0,08 mmol) Natriumhydrid (60 %), gelöst in 0,3 ml DMF bei –50°C, zugegeben. Das Gemisch wurde bei –50 bis –40°C für 3 Stunden gerührt. Danach wurde eine Lösung von 10,8 mg (0,028 mmol) der Verbindung 6a, gelöst in 1 ml DMF, bei –50°C zugegeben, das Reaktionsgemisch weiter bei –40°C für 5 Stunden gerührt und bei –30°C in einem Kühlschrank für 2 Tage stehen gelassen. Dann wurden 3 ml Natriumphosphatpuffer (0,01 M) zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 5 Minuten gerührt. Der durch Herausdestillieren des Lösungsmittels in vacuo erhaltene gelbe Rückstand wurde mittels Flashchromatographie unter Verwendung von CH₃OH und CHCl₃ gereinigt, wodurch 12,3 mg der Verbindung 7a in einer Ausbeute von 91 % erhalten wurden.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ
12,36 (s, 1H), 10,24 (s, 1H), 9,97 (s, 1H), 7,58 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,41 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,85 (s, 1H), 6,58 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 4,29 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 4,19 (dd, J = 5,0 Hz und 4,5 Hz, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,73 (s, 3H), 3,72 (s, 3H), 3,46 (m, 1H), 2,47 (s, 3H), 2,08 (m, 1H), 2,02 (s, 3H), 1,29 (t, J = 4,5 und 3,5 Hz, 1H);
ESIMS m/e

Als C₂₉H₂₈N₇O₆: Berechneter Wert (M-H) 570,6

Beobachteter Wert 570,4
Beispiel 12: Herstellung der Verbindung 7b (X = CH)
Verbindung 7b wurde in einer Ausbeute von 77 % in einer ähnlichen Weise wie die Verbindung 7a erhalten.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ
12,36 (s, 1H), 9,90 (s, 1H), 9,80 (s, 1H), 7,57 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 7,38 (d, 1,5 Hz, 1H), 7,14 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,88 (d, 1,5 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,84 (s, 1H), 6,56 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 4,29 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 4,19 (dd, J = 4,0 und 4,5 Hz, 1H), 3,83 (s, 3H), 3,73 (s, 1H), 3,71 (s, 1H), 3,46 (m, 1H), 2,47 (s, 3H), 2,09 (m, 1H), 1,97 (s, 3H), 1,29 (t, J = 4,5 und 3,5 Hz, 1H);
ESIMS m/e

Als C₃₀H₂₉N₆O₆: Berechneter Wert (M-H) 569,6

Beobachteter Wert 569,5
Beispiel 13: Alkylierung von 450 bp-DNA-Fragmenten
(1) Präparierung von am 5'-Ende Texas-Rot-modifiziertem 450 bp-DNA-Fragment
Die am 5'-Ende Texas-Rot-modifizierten 450 bp-DNA-Fragmente pUC18 F780*-1229 und pUC18 R1459*-1908 (diese sind komplementär) wurden mittels der PCR-Methode unter Verwendung von am 5'-Ende Texas-Rot-modifizierten 18-meren als Primern präpariert und mittels Filtration unter Verwendung von Suprec-02 gereinigt. Die Konzentration wurde durch Ethidiumbromid-Färbung bestimmt. Das Sternchen (*) zeigt die Stelle der Texas-Rot-Modifikation an, und die Ziffern zeigen die Nukleotid-Nummerierung vom Replikationsursprung aus.
(2) Hochauflösende Gelelektrophorese
Ein standardmäßiges Reaktionsgemisch, das am 5'-Ende Texas-Rot-markierte DNA-Fragment, 60 nM, DMF 5 % (v/v) und verschiedene Konzentrationen an Wirkstoffen in insgesamt 10 μl Natriumphosphatpuffer (pH 7,0), 12,5 mM, enthielt, wurde in ein Mikrozentrifugierröhrchen (Eppendorf-Röhrchen) eingebracht und bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen. Kälberthymus-DNA (5 mM, 1 μl) wurde dem zugegeben und bei 90°C für 5 Minuten erhitzt. Die DNA wurde mittels Ethanol-Präzipitation abgesammelt. Die derart erhaltene DNA wurde in Ladefarbstoff (DMF-Lösung von Fushin-Rot), 8 μl, gelöst. Die Probenlösung wurde bei 94°C für 20 Minuten zur Denaturierung der DNA erhitzt und sofort auf 0°C abgekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wurde auf Polyacrylamidgel unter Verwendung von 6 % Long Ranger (Markenname)-Gellösung unter Verwendung eines 5500-S DNA Sequenziersystems elektrophoretisch behandelt.
Beispiel 14: Wachstums-inhibitorischer Test auf HeLaS₃-Zellen
Eine 0,75 ml-Suspension von HeLaS₃-Zellen, 2,67 × 10⁴ Zellen/ml, in MEM-Medium, das 10 % fötales Rinderserum und 2 mM Glutamin enthielt, wurde in jedes Well einer 24-Well-Zellkulturplatte dispensiert. Nach der Inkubation in einem CO₂-Inkubator bei 37°C über Nacht wurden 0,25 ml-Portionen jeder der in Tabelle 1 gezeigten Testverbindungen, die entsprechend mit Medium verdünnt waren, in jedes Well eingebracht.
Nachdem die Zellen für 72 Stunden im CO₂-Inkubator inkubiert waren, wurde der Kulturüberstand entfernt und die Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) dispergiert und abgesammelt. Die Zellzählungen wurden auf einem Zellzähler vorgenommen, und die Zellzählungen ohne Behandlung und die Zellzählungen, die mit bekannten Konzentrationen der Testverbindung behandelt waren, wurden verglichen, um die Konzentration der Testverbindung zu berechnen, die 50 % des Zellwachstums hemmt (IC₅₀). Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.

Testverbindung IC₅₀ (nM)

PyPyLDu86 1,5

ImPyLDu86 0,7

Duocarmycin 4,7
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt eine chemisch synthetisierte Verbindung bereit, die doppelsträngige DNA gleichzeitig alkylieren und spalten kann. Die Verbindung ist nicht nur als künstliches Restriktionsenzym nützlich, sondern auch für das gentherapeutische Anzielen der spezifischen Basensequenz nützlich.

Claims

Verbindung, dargestellt durch die folgende Formel
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, in einem Prozess zur Alkylierung einer spezifischen Basensequenz eines Doppelstrangs von DNA.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, in einem Prozess zur Spaltung einer spezifischen Basensequenz eines Doppelstrangs von DNA.
Verwendung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei die spezifische Basensequenz TGACG oder CGACG, oder ein komplementärer Strang davon, ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger dafür.
Verbindung nach Anspruch 1, zur Verwendung bei einer Methode zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einer Methode zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers auf Krebs.