DE60034676T2

DE60034676T2 - Verdrängungsreagenzien mit niedrigem molekulargewicht und hoher affinität zur reinigung von oligonukleotiden

Info

Publication number: DE60034676T2
Application number: DE60034676T
Authority: DE
Inventors: Abhinav A. Bothell SHUKLA; Ranjit R. San Diego DESHMUKH; Steven M. Schenectady CRAMER; James A. Troy MOORE
Original assignee: Rensselaer Polytechnic Institute; Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc; Rensselaer Polytechnic Institute
Priority date: 1999-06-29
Filing date: 2000-06-28
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2020-06-29
Also published as: EP1192172A4; US6828436B2; WO2001000642A9; EP1192172B1; WO2001000642A1; US6573373B1; US20020156267A1; AU5774000A; JP2003503418A; EP1192172A1; ATE361308T1; DE60034676D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verdrängungs-Chromatographie von Oligonukleotiden unter Verwendung eines anionischen Verdrängungsmittels mit niedrigem Molekulargewicht und hoher Affinität.
ANGABE ÜBER MÖGLICHE RECHTE UNTER BUNDESGEFÖRDERTER FORSCHUNG
Diese Erfindung wurde mit Unterstützung des National Institute of Health unter der Grant Nr. GM47372 gemacht. Die Regierung der Vereinigten Staaten könnte Rechte an dieser Erfindung haben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Oligonukleotide haben signifikantes Interesse als Arzneimittel Kandidaten für eine breite Vielfalt an Erkrankungen erzeugt, insbesondere als Antisense Therapeutika und als potente Antibiotika. Mehrere Antisense Oligonukleotid Arzneimittel durchlaufen derzeit humane klinische Untersuchungen, und viele andere sind in einer präklinischen Phase.
Oligonukleotide sind einzelne Stränge von Nukleinsäuren mit DNA oder RNA Basen in einer Länge, die von zwei bis 50 Basen oder Nukleotide reicht.
Phosphorthioat Derivate von Oligonukleotiden sind auch aufgrund ihrer höheren in vivo Stabilität im Vergleich zu den Vorgänger Phosphodiester Verbindungen verwendet worden. In den Phosphorthioat Derivaten wird ein nicht Brücken bildendes Sauerstoffatom im Phosphodiester Rückgrat durch ein Schwefelatom ersetzt. Diese Substitution verstärkt eine Nukleaseresistenz und somit in vivo Stabilität.
Festphasen Syntheseverfahren sind nun zur Herstellung von Oligonukleotiden im großen Maßstab verfügbar. Eine Festphasensynthese eines Oligonukleotids führt zu einem Rohprodukt, das nicht nur das erwünschte Oligonukleotid der vollen Länge (n-Länge oder n-mer), sondern auch mehrere eng verwandte Deletions- oder "Fehlfunktionssequenzen", hauptsächlich der Länge n-1 enthält. Diese so genannten Fehlfunktionssequenzen entstehen durch die Fehlfunktion, eine Base an der erforderlichen Position hinzuzufügen. Solche Fehlfunktionen oder Deletionen können an mehreren Positionen entlang der Kette entstehen. Mehrere Fehlfunktionssequenzen, der Länge (n-1, n-2, n-x), sind auch für jede gegebene Länge vorhanden. Zusätzlich können (n+1)mere vorhanden sein. Deshalb werden Reinigungsverfahren benötigt, die in einem präparativen Maßstab ablaufen.
Die chromatographische Herstellung und Reinigung von Oligonukleotiden kann potenziell den erforderlichen Maßstab und die erforderliche Reinheit bereitstellen, kann aber auch einzigartige Herausforderungen darstellen. Erstens zeigen Oligonukleotide eine extrem hohe Bindungsaffinität für chromatographische Anionenaustausch Harze im Vergleich zu Molekülen, die typischerweise in einer biopharmazeutischen Reinigung angetroffen werden (zum Beispiel Proteine). Zweitens sind die vorhandenen Fehlfunktionssequenzen so eng mit dem erwünschten Produkt verwandt, dass die Bestandteile schwierig zu trennen sind. Schließlich zeigen Oligonukleotide mehrere Isomeriezentren, die zu der Möglichkeit beachtlicher Heterogenität der Mischungen aus Produkt und Fehlfunktionssequenzen führen.
Ein Chromatographiesystem kann in einem von zwei Hauptmodi ablaufen, Flution (einschließlich einem linearen Gradienten, Schrittgradienten und isokratischer Flution) oder Verdrängung. Diese zwei Modi können sowohl in der Theorie als auch in der Praxis unterschieden werden. In der Elutions-Chromatographie wird eine Lösung der Probe, die gereinigt werden soll, auf eine stationäre Phase, üblicherweise in einer Säule, aufgetragen. Eine mobile Phase wird so ausgewählt, dass die Probe weder irreversibel adsorbiert, noch völlig nicht adsorbiert wird, sondern eher reversibel bindet. Da die mobile Phase über die stationäre Phase fließt, wird ein Gleichgewicht zwischen der mobilen Phase und der stationären Phase aufgebaut, wobei Bestandteile der Probe entlang der Säule mit Geschwindigkeiten laufen, die ihre Affinität für die stationäre Phase relativ zu den anderen Bestandteilen widerspiegeln, die in der Ursprungsprobe vorkommen können. Der differenzielle Bewegungsvorgang ist in 1 schematisch skizziert, und ein typisches Chromatogramm ist in 2 gezeigt. Insbesondere anzumerken ist die Tatsache, dass die eluierende Lösungsmittelfront oder das Nullsäulenvolumen in einer isokratischen Flution immer der Probe aus der Säule heraus voran geht.
Eine Modifikation und Erweiterung isokratischer Elutions-Chromatographie wird in der Schrittgradienten Chromatographie nachgewiesen, wobei eine Reihe von Elutionsmitteln variierender Zusammensetzung über die stationäre Phase laufen gelassen wird.
In der Ionenaustausch Chromatographie werden Schrittänderungen in der Salzkonzentration und/oder dem pH-Wert der mobilen Phase eingesetzt, um Materialien, wie zum Beispiel Proteine, zu eluieren oder zu desorbieren.
Ein Schema, das den Ablauf eines Chromatographiesystems im Verdrängungsmodus darstellt, ist in 3 gezeigt. Die Säule wird einleitend mit einem Puffer äquilibriert, in dem die meisten der Bestandteile, die getrennt werden sollen, eine relativ hohe Affinität für die stationäre Phase aufweisen. Nach dem Aquilibrierungsschritt wird eine Zugabemischung, welche die Bestandteile enthält, die getrennt werden sollen, in die Säule eingeführt und der dann eine konstante Infusion der Verdrängungslösung folgt. Ein Verdrängungsmittel wird so ausgewählt, dass es eine höhere Affinität für die stationäre Phase aufweist als jeder der Zugabebestandteile. Als ein Ergebnis kann das Verdrängungsmittel wirksam die Zugabebe standteile vor seiner Front aus der Säule treiben. Unter geeigneten Bedingungen induziert das Verdrängungsmittel, dass sich die Zugabebestandteile zu angrenzende "Viereckwellen" Zonen von hochkonzentriertem, häufig reinem Material entwickeln. Das Verdrängungsmittel tritt nach den Zonen gereinigter Bestandteile aus der Säule. Nach dem Durchbruch des Verdrängungsmittels mit der Säulenabflusslösung wird die Säule regeneriert und ist für einen weiteren Durchlauf bereit.
Eine wichtige Unterscheidung zwischen Verdrängungs-Chromatographie und Elutions-Chromatographie ist, dass sich in der Elutions-Chromatographie Desorptionsmittel, die Salze für eine Ionenaustausch Chromatographie einschließen, durch die Zugabezonen bewegen, während in der Verdrängungs-Chromatographie die Verdrängungsmittel Front immer hinter den angrenzenden Zugabezonen im Verdrängungszug bleiben. Diese Unterscheidung ist wichtig, da im Allgemeinen relativ große Trennungsfaktoren benötigt werden, um eine zufrieden stellende Auflösung in der Elutions-Chromatographie zu erreichen, während die Verdrängungs-Chromatographie potenziell Bestandteile von Mischungen niedriger Trennungsfaktoren reinigen kann.
Ein Schlüsselfunktionsmerkmal, das Verdrängungs-Chromatographie von Elutions-Chromatographie unterscheidet, ist die Verwendung eines Verdrängungsmoleküls. In der Elutions-Chromatographie weist das Elutionsmittel gewöhnlich eine niedrigere Affinität für die stationäre Phase auf, als jeder der Bestandteile in der Mischung, die getrennt werden soll, wobei in der Verdrängungs-Chromatographie das Elutionsmittel, welches das Verdrängungsmittel ist, eine höhere Affinität aufweist.
Die Verdrängungs-Chromatographie hat einige besonders vorteilhafte Eigenschaften für Chromatographie im Verfahrensmaßstab von biologischen Makromolekülen, wie Oligonukleotiden. Erstens kann die Verdrängungs-Chromatographie Bestandteile von Mischungen konzentrieren. Im Vergleich dazu führt eine isokratische Elutions-Chromatographie zu Produktverdünnung während der Trennung. Zweitens kann Verdrängungs-Chromatographie Produkttrennung und -konzentration in einem einzigen Schritt erreichen. Da der Verdrängungsvorgang im nichtlinearen Bereich der Gleichgewichtsisotherme abläuft, sind ferner große Säulenladungen möglich. Dies ermöglicht verbesserte Säulenverwendung im Vergleich zur Elutions-Chromatographie. Ferner kann Verdrängungs-Chromatographie Bestandteile aus Mischungen mit niedrigen Trennungsfaktoren reinigen, während relative große Trennungsfaktoren für eine zufrieden stellende Auflösung in der Desorptions-Chromatographie benötigt werden.
Präparative Ionenaustausch Chromatographie, die im Verdrängungsmodus abläuft, ist deshalb, aufgrund der hohen Auflösung und dem hohen Durchsatz, die erreicht werden können, ein potentiell attraktives Verfahren zum Reinigen von Oligonukleotiden. Jedoch weist die Verdrängungs-Chromatographie, wie sie herkömmlich bekannt ist, eine Anzahl von Nachteilen im Vergleich zur Elutions-Chromatographie für die Reinigung von Oligonukleotiden auf. Zwei der Hauptprobleme sind die Schwierigkeit in der Regeneration der Säule und die Anwesenheit von Verdrängungsmittel in einigen der gereinigten Fraktionen.
Da das Verdrängungsverfahren eine Verbindung mit hoher Affinität als das Verdrängungsmittel verwendet, kann die Zeit für eine Regeneration und Reäquilibrierung im Vergleich zur Elutions-Chromatographie lange sein. Das zweite Problem, das der Kontamination durch das Verdrängungsmittel, ist entstanden, da eine übliche Eigenschaft von Verdrängungsmitteln, die in Ionenaustauschsystemen verwendet wurden, ihr relativ hohes Molekulargewicht gewesen ist. Zuvor hat der Stand der Technik die Verwendung von Polyelektrolytverdrängungsmitteln mit hohem Molekulargewicht ausgehend von der Annahme gelehrt, dass es erforderlich ist, ein großes Polyelektrolyt zu haben, um einen höhere Bindungskoeffizienten als den des Biomoleküls, das verdrängt werden soll, sicherzustellen. Die Begründung hinter einer solchen Annahme ist, dass die Bindung eines Moleküls an eine Adsorptionsoberfläche einer stationären Anionenaustausch Phase nur mit seiner charakteristischen Ladung zusammenhängt. Die charakteristische Ladung ist die durchschnittliche Anzahl an Stellen der Interaktion eines gelösten Stoffs mit einer stationären Phase. Verdrängungsmittel mit hohem Molekulargewicht zeigen beide der oben aufgezählten Nachteile: Sie binden fest an die stationäre Phase und benötigen deshalb stringente Bedingungen zum Regenerieren der Säule, und Spuren des Verdrängungsmittels, welche die Produktfraktion kontaminieren können, sind schwierig zu entfernen.
Verdrängungsmittel mit niedrigem Molekulargewicht zur Proteintrennung, die keine aufwändige Regeneration der Säule benötigen und die leicht vom Produkt entfernt werden können, sind von Cramer et al. (U.S. Patent 5,606,033, am 25. Februar 1997 erteilt; U.S. Patent 5,478,924, am 26. Dezember 1995 erteilt) beschrieben worden. Während jedoch die so weit identifizierten Verdrängungsmittel mit niedrigem Molekulargewicht erfolgreich im Verdrängen mäßig gebundener Biomoleküle, wie Proteine, gewesen sind, sind sie im Verdrängen sehr fest zurückgehaltener Verbindungen in Ionenaustauschsystemen, zum Beispiel Oligonukleotide, nicht erfolgreich gewesen. Offenbarungen des Standes der Technik, welche die Reinigung von Oligonukleotiden in Ionenaustauschsystemen betreffen, haben nur die Verwendung von relativ großen Polyelektrolyten (> 40.000 Dalton) als Verdrängungsmittel beschrieben. Zum Beispiel ist über die Verwendung von Verdrängungs-Chromatographie mit einem Polyelektrolyt Verdrängungsmittel mit hohem Molekulargewicht, ein sulfoniertes Polysaccharid, für die Reinigung von Oligonukleotiden von Gerstner et al. (J. Nucl. Acids Res. 1995, 23, 2292–2299) berichtet worden.
Deshalb besteht ein Bedarf an einem Trennungsverfahren von Oligonukleotiden mit den Vorteilen der Verdrängungs-Chromatographie (hohe Auflösung und hoher Durchsatz), während die Nachteile (schwierige Säulenregeneration und Kontamination des Produkts mit dem Verdrängungsmittel) vermieden werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Reinigen eines Oligonukleotids oder mehrerer Nukleotide umfassend:

(a) das Laden des Oligonukleotids auf die stationäre Phase einer Anionenaustausch Säule; und
(b) das Verdrängen des Oligonukleotids von der stationären Phase durch ein anionisches Verdrängungsmittel mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000, wobei das anionische Verdrängungsmittel eine höhere Affinität zu der stationären Phase als das Oligonukleotid aufweist. Vorzugsweise beträgt das Molekulargewicht des Verdrängungsmittels weniger als etwa 5.000. Weiter bevorzugt beträgt das Molekulargewicht des Verdrängungsmittels weniger als etwa 2.500.

Eine bevorzugte Zusammensetzung für das Verdrängungsmittel ist eine substituierte oder nicht substituierte aromatische Verbindung, die mindestens einen anionischen Substituenten aufweist. Eine andere bevorzugte Zusammensetzung für das Verdrängungsmittel ist eine substituierte oder nicht substituierte aliphatische Verbindung, die mindestens einen anionischen Substituenten aufweist. Bevorzugte anionische Substituenten sind Sulfat-, Sulfonat-, Phosphat-, Phosphonat- und Carboxylatgruppen. Weiter bevorzugte anionische Substituenten sind Sulfonatgruppen. Eine bevorzugte aromatische Verbindung ist eine substituierte oder nicht substituierte, aromatische Verbindung, die mindestens einen anionischen Substituenten aufweist. Bevorzugte polycyclische aromatische Sulfonate sind Amaranth und Calcion.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung einer isokratischen linearen Elutions-Chromatographie, wie sie typischerweise durchgeführt wird.
2 ist ein typisches HPLC Elutions-Chromatogramm.
3 ist eine schematische Darstellung einer Verdrängungs-Chromatographie.
4 ist ein Diagramm dynamischer Affinität für drei Verdrängungsmittel, ein typisches 20mer Phosphorthioat Oligonukleotid (SEQ ID NR. 2, ISIS-2105) und ein Protein.
5 ist ein Verdrängungs-Chromatogramm für SEQ ID NR. 1 (ISIS-2302), das unter Verwendung von Amaranth als dem Verdrängungsmittel gereinigt wurde (Beispiel 1).
6a ist ein analytisches Anionenaustausch Chromatogramm der in 5 gezeigten Oligonukleotid Zugabe.
6b ist ein analytische Anionenaustausch Chromatogramm einer der gereinigten Fraktionen von der in 5 gezeigten Verdrängung.
7a ist ein analytisches Kapillargel Elektroferrogramm der Zugabe von der Verdrängung des Oligonukleotids in 5.
7b ist ein analytisches Kapillargel Elektroferrogramm des gereinigten Pools von der Verdrängung des Oligonukleotids in 5.
8 zeigt ein HPLC Chromatogramm, das die wirksame Regeneration der in 5 verwendeten Säule darstellt (Beispiel 2).
9a ist ein analytisches Kapillargel Elektroferrogramm des rohen Phosphodiester 20mers SEQ ID NR. 1 (ISIS-2302), das mehrere weniger fest zurückgehaltene Verunreinigungen enthält, die als Schultern am Höchstwert des Hauptprodukts erscheinen (Beispiel 3).
9b ist ein Verdrängungs-Chromatogramm für den in 9a dargestellten Phosphodiester.
9c ist ein analytisches Kapillargel Elektroferrogramm des gereinigten Pools von der Verdrängung des in 9a dargestellten Phosphodiesters.
10 ist ein Verdrängungs-Chromatogramm für ein Phosphorthioat 20mer SEQ ID NR. 2 (ISIS-2105), das unter Verwendung von Verdrängungs-Chromatographie gereinigt wurde (Beispiel 4).
11 ist ein Anionenaustausch Chromatogramm für die Zugabe der in 10 gezeigten Verdrängungs-Chromatographie.
12 ist ein Anionenaustausch Chromatogramm des gereinigten Pools der in 10 gezeigten Verdrängungs-Chromatographie.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung betrifft ein Trennen und Reinigen von Oligonukleotiden durch Ionenaustausch Chromatographie, die im Verdrängungsmodus abläuft. Ein anionisches Verdrängungsmittel mit niedrigem Molekulargewicht und höherer Affinität für die stationäre Phase als die Oligonukleotide, die getrennt oder gereinigt werden sollen, wird verwendet. Das Oligonukleotid, das gereinigt werden soll, wird in einem Lösungsmittel gelöst und auf eine Anionenaustausch Säule mit einer stationären Phase geladen. Das Oligonukleotid wird mit einem anionischen Verdrängungsmittel eluiert, welches das Oligonukleotid von der Ionenaustauschsäule verdrängt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet niedriges Molekulargewicht ein Molekulargewicht von weniger als 10.000. Vorzugsweise weist ein Verdrängungsmittel, das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ein Molekulargewicht von weniger als 5.000 auf. Weiter bevorzugt weist das Verdrängungsmittel ein Molekulargewicht von weniger als 2.500 auf.
Die Affinität des Verdrängungsmittels für die stationäre Phase des Chromatographiesystems relativ zu den Oligonukleotiden, die getrennt oder gereinigt wer den sollen, wird unter Bezugnahme auf ein verbessertes mathematisches Modell für Verdrängungs-Chromatographie definiert: sterisches Massenwirkungs-(SMA (engl.: Steric Mass Action))Ionenaustauschmodell. Das SMA Ionenaustauschmodell ist fähig, komplexes Verhalten in Ionenaustauschsystemen vorauszusagen. Dieses Modell weist drei Parameter des gelösten Stoffs auf: die charakteristische Ladung ν ist die Anzahl an Salz Gegenionen, die durch den gelösten Stoff verdrängt werden, wenn sie an die Oberfläche der stationären Phase bindet; der sterische Faktor σ ist die Anzahl der Salz Gegenionen Stellen an der Oberfläche, die durch den adsorbierten gelösten Stoff abgeschirmt werden und daher für einen Austausch mit irgendwelchen anderen gelösten Molekülen nicht verfügbar sind; und die Gleichgewichtskonstante κ ist die für jene Austauschreaktion zwischen den Salz Gegenionen und dem Lösungsmittel.
Entsprechend dem SMA Modell ist der bestimmende Parameter, der die Fähigkeit eines Lösungsmittels ein anderes zu verdrängen reguliert, die dynamische Affinität. Die dynamische Affinität wird definiert als:
wobei λ die dynamische Affinität ist, Δ das Verdrängungsmittel Teilungsverhältnis ist, und κ und ν wie oben definiert sind. Δ ist gleich zu Q_d/C_d, wobei Q_d und C_d die Verdrängungsmittel Konzentrationen in der stationären bzw. mobilen Phase sind. Der Wert von Parameter Δ variiert mit den Ablaufbedingungen für die Verdrängung, welche die Konzentrationen des Verdrängungsmittels und des Salzes einschließen.
Die Affinität des Verdrängungsmittels für die stationäre Phase eines Anionenaustauschsystems, die höher ist als die der Oligonukleotide, die getrennt oder gereinigt werden sollen, für dieselbe stationäre Phase, wird unter Bezugnahme auf das SMA Modell definiert. Höhere Affinität bedeutet, dass das Verdrängungsmittel eine größere dynamische Affinität λ als die Oligonukleotide aufweist. Die dynamische Affinität des Verdrängungsmittels und der Oligonukleotide kann leicht durch Erstellen eines Diagramms von log κ gegen ν für das Verdrängungsmittel und die Oligonukleotide bestimmt werden. Dies wird als Diagramm dynamischer Affinität bezeichnet. Die Steigung der Linie ist die dynamische Affinität λ der Verbindung oder der Mischung der Verbindungen. Wo die Linie für das Verdrängungsmittel über oder gegen den Uhrzeigersinn von der Linie für die Oligonukleotide abfällt, weist das Verdrängungsmittel eine höhere Affinität für die stationäre Phase unter jenen Ablaufbedingungen auf als es das Oligonukleotid oder die Mischung der Oligonukleotide tut. Das Diagramm wird deshalb verwendet, um die Fähigkeit eines Verdrängungsmittels zu bestimmen, ein gegebenes Oligonukleotid unter den Ablaufbedingungen für die Verdrängung zu verdrängen.
Ein exemplarisches Diagramm dynamischer Affinität ist in 4 gezeigt. Die Werte von log κ und ν sind für ein typisches Phosphorthioat Antisense Oligonukleotid, ein typisches Protein und mehrere potentielle Verdrängungsmittel dargestellt. In einer Gegenuhrzeigerrichtung betrachtet, das heißt in einer Folge zunehmender Steigungen, wobei mit der Linie für ein typisches Protein begonnen wird, zeigt dieses Diagramm eine zunehmende Affinität der gelösten Stoffe unter den experimentellen Bedingungen. Es ist offensichtlich, dass selbst das Verdrängungsmittel mit der höchsten Affinität und einem niedrigen Molekulargewicht, das zuvor für Anionenaustausch identifiziert wurde, Sucroseoctasulfat, nicht genug Affinität besitzt, dieses Oligonukleotid zu verdrängen. In der Tat weist das Oligonukleotid eine Gleichgewichtskonstante auf, die mehrere Größenordnungen höher ist als die eines typischen anionischen Proteins, β-Lactoglobulin A, wie in 4 gezeigt.
Die drei SMA Parameter, ν, σ und κ, können experimentell bestimmt werden. Die charakteristische Ladung und Gleichgewichtskonstante der Oligonukleotide, die gereinigt werden sollen, können unter Verwendung linearer Gradienten Elutionsretentionsdaten mit unterschiedlichen Steigungen des linearen Gradienten bestimmt werden (Shukla et al., Ιnd. Eng. Chem. Res., 1998, 37, 4090–4098, das hier als Referenz aufgenommen ist). Der sterische Faktor der Oligonukleotide kann dann aus den Kapazitäten bestimmt werden, die aus frontalen Experimenten bei zwei oder mehr Verdrängungsmittel Konzentrationen erhalten wurden (Gadam et al., J. Chromatogr., 1993, 630, 37–52, das hier als Referenz aufgenommen ist). Die Größenordnung des induzierten Gradienten, der während dieser frontalen Experimente erhalten wurde, kann ein unabhängiges Maß für die charakteristische Ladung ν bereitstellen.
Ein leicht unterschiedliches Verfahren kann auch eingesetzt werden, um die SMA Parameter des Verdrängungsmittels zu erhalten. Isokratische Experimente können bei unterschiedlichen Salzkonzentrationen einer mobilen Phase durchgeführt werden, und ein Diagramm von log k' gg. log (Salzkonzentration) kann erstellt werden, wobei k' die dimensionslose Retentionszeit eines Lösungsmittels bei einer spezifischen Salzkonzentration einer mobilen Phase ist. Die Werte der Steigung und des Abschnitts der Linie werden verwendet, um die charakteristische Ladung ν bzw. die Gleichgewichtskonstante κ zu berechnen (Gadam et al., J. Chromatogr., 1993, 630, 37–52). Die oben beschriebenen frontalen Experimente können dazu verwendet werden, den sterischen Faktor und ein unabhängiges Maß von ν zu bestimmen.
Der Retentionsvorgang beim Ιonenaustausch ist nicht nur durch elektrostatische Interaktionen bestimmt, sondern kann stark durch unspezifische Interaktionen verstärkt werden. Einer der dominanten Faktoren, der eine Hauptrolle im Bestimmen der Retention bei einem Anionenaustausch Harz spielt, sind hydrophobe Interaktionen. Zum Beispiel können aromatische Verbindungen mit mehreren Sulfonsäure Funktionalitäten wirksame Verdrängungsmittel für Oligonukleotide sein.
Deshalb kann ein Anionenverdrängungsmittel mit hoher Affinität für eine stationäre Phase eines Anionenaustauschsystems eine aromatische, substituierte aromatische, aliphatische oder substituierte aliphatische Verbindung sein, die mindestens einen an ionischen Substituenten enthält. Bevorzugte anionische Substituenten sind Sulfat-, Sulfonat-, Phosphat-, Phosphonat- und Carboxylatgruppen. Weiter bevorzugt ist ein substituiertes oder nicht substituiertes aromatisches anionisches Verdrängungsmittel, das mindestens eine Sulfonatgruppe enthält. Das anionische Verdrängungsmittel kann auch eine polycyclische aromatische oder substituierte, aromatische Verbindung sein, die mindestens einen anionischen Substituenten enthält. Bevorzugte anionische Substituenten sind Sulfat-, Sulfonat-, Phosphat-, Phosphonat- und Carboxylatgruppen. Ein bevorzugtes substituiertes oder nicht substituiertes, polycyclisches aromatisches, anionisches Verdrängungsmittel enthält mindestens eine Sulfonatgruppe. Beispiele polycyclischer aromatischer Sulfonat Verdrängungsmittel mit höherer Affinität für eine stationäre Phase als ein Oligonukleotid sind Amaranth (I) und Calcion (II), beide von Aldrich Chemical Company verfügbar. Die Strukturen von Ι und II sind unten gezeigt:
Andere exemplarische aromatische Sulfonate, die eine höhere Affinität für eine stationäre Phase eines Anionenaustauschsystems als ein Oligonukleotid zeigen können, das unter den Ablaufbedingungen des Systems gereinigt werden soll, sind New Coccine, Ponceau S, Ponceau SS, Hydroxy Naphthol Blue, Brilliant Black, Anthrachinon Disulfonsäure, Kalium Indigotetrasulfonat, Sulfazo III, Reactive Orange 16, Acid Alizarin Violet N, Acid Black 24, Acid Blue 29, Acid Blue 80, Acid Blue 92, Acid Blue 113, Acid Blue 120, Acid Green 25, Acid Green 27, Acid Orange 8, Acid Orange 51, Acid Orange 63, Acid Orange 74, Acid Red 1, Acid Red 4, Acid Red 8, Acid Red 97, Acid Red 106, Acid Red 114, Acid Red 151, Acid Red 183, Acid Violet 5, Acid Violet 7, Acid Yellow 17, Acid Yellow 25, Acid Yellow 29, Acid Yellow 34, Acid Yellow 38, Acid Yellow 40, Acid Yellow 42, Acid Yellow 65, Acid Yellow 76 und Acid Yellow 99. All diese Verbindungen sind kommerziell von Aldrich Chemical Company verfügbar.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit herkömmlichen Anionenaustauschsystemen und herkömmlichen Verdrängungs-Chromatographieverfahren verwendet werden. Ein Beispiel einer nützlichen Anionenaustausch Säule ist eine Poros HQ/M Säule, die eine stationäre Phase enthält, die aus einem starren Polystyroldivinylbenzen Kügelchen zusammengesetzt ist, das mit einer hydrophilen Schicht bedeckt ist. Die Säule ist von PerSeptive Biosystems, Inc. verfügbar. Verdrängungs-Chromatographie Abläufe werden typischerweise durch einleitendes Äquilibrieren der Säule mit einer Trägerlösung und dann folgendes Perfundieren mit Zugabe, Verdrängungsmittel und Regenerationslösung durchgeführt. Die Zugabe und die Verdrängungsmittel Lösung werden üblicherweise in derselben Pufferlösung wie der Träger hergestellt.
Wie hier verwendet schließt die Bezeichnung Oligonukleotid Oligomere ein, die zwei oder mehr Nukleosid Untereinheiten mit Phosphor Internukleosid verbindenden Resten enthalten. Erfindungsgemäße Nukleosid Untereinheiten haben einen Ribofuranose Rest, der an eine Nukleobase durch eine Glykosyl Bindung gebunden ist. Erfindungsgemäße Oligonukleotide umfassen vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 50 Nukleoside. Weiter bevorzugt ist es, dass solche Verbindungen von etwa 8 bis etwa 30 Nukleoside umfassen. Am meisten bevorzugt ist es, dass solche Verbindungen von etwa 5 bis etwa 25 Nukleoside umfassen.
Zusätzliche Ziele, Vorteile und neue Merkmale der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann nach Betrachtung der folgenden Beispiele klar werden. Die folgenden Beispiele stellen die Erfindung dar und beabsichtigen nicht, sie zu beschränken. Der Fachmann wird erkennen oder durch Routineexperimente fähig sein, zahlreiche Äquivalente zu den spezifischen Substanzen, Zusammensetzungen und Verfahren zu bestimmen, die hier beschrieben sind. Solche Äquivalente werden als innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung liegend erachtet.
BEISPIELE
Beispiel 1
Verdrängungs-Chromatographie eines Phosphorthioats 20mers, SEQ ID NR: 1 (ISIS-2302) GCC CAA GCT GGC ATC CGT CA (P=S)
4 zeigt ein Diagramm dynamischer Affinität für bevorzugte Verdrängungsmittel für ein typisches Phosphorthioat Oligonukleotid, Amaranth (I) und Calcion (II) im Vergleich zu einem Disaccharid, das acht Sulfatgruppen trägt, Sucroseoctasulfat. Die Linie für Sucroseoctasulfat fällt unter der des Oligonukleotids ab, während jene für Amaranth und Calcion gegen den Uhrzeigersinn (oberhalb) zu der des Oligonukleotids abfallen. Deshalb haben sowohl Amaranth als auch Calcion eine höhere Affinität für die stationäre Phase als das Oligonukleotid.
Die Fähigkeit der dynamischen Affinitätsparameter realistisches Verhalten vorauszusagen, wurde für Amaranth in einer Trennung eines typischen Phosphorthioat Oligonukleotids bestätigt. 5 zeigt ein Histogramm einer Verdrängungstrennung von SEQ ID NR: 1, eines 20mer Phosphorthioat Antisense Oligonukleotids, wobei Amaranth als Verdrängungsmittel auf einer Poros HQ/M Säule (4,6 × 100 mm I.D., 20 μm Partikel) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min verwendet wird. Die Trägerlösung und mobile Phase war eine 20 mM NaOH/500 mM NaCl Lösung. Die Zugabe und Verdrängungsmittel Lösung wurde aus der Trägerlösung erstellt, und die Zugabe bestand aus 11,98 mg Oligonukleotid. Eine wirksame Verdrängung wurde mit einer scharfen Grenze zwischen Zonen gezeigt, welche die Verunreinigungen und das erwünschte Oligonukleotid enthielten, und zwischen Zonen, welche das Oligonukleotid und das Amaranth Verdrängungsmittel enthielten. Somit zeigt das Histogramm die Auflösungskraft von Amaranth in einer Verdrängungs-Chromatographie von Oligonukleotiden.
Eine Hochtemperatur Anionenaustausch Analyse der Zugabe und der Fraktion, die das erwünschte Oligonukleotid enthielt, bestätigte die Reinheit des Produkt Oligonukleotid. Die Chromatogramme von dem Verdrängungsexperiment zeigen die gesammelte Oligonukleotid Fraktion (6a) und den Zugabebestandteil aus dem Verdrängungsexperiment (6b). Trotz dass die Zugabe nur etwa 58 % rein war, wies die Oligonukleotid Fraktion eine Reinheit von etwa 99 % durch Anionenaustausch Analyse auf. Kapillar Elektroferrogramme für die Zugabe und den Produkt Pool von dem Beispiel in 5 sind in 7a und 7b gezeigt.
Das Verdrängungshistogramm, das in 5 dargestellt ist, wurde unter Verwendung der oben aufgeführten Trennungsparameter und des unten dargestellten allgemeinen Verfahrens erstellt. Es wurde eine Fraktion pro Minute gesammelt und durch einen analytischen Anionenaustausch Test analysiert, um die Konzentration der Bestandteile und deren Reinheiten zu bestimmen. Standardkurven für den Höchstwertbereich gegen die Oligonukleotid Konzentration und den Höchstwertbereich gegen die Verdrängungsmittel Konzentration wurden unter Verwendung der Probe von reinem Oligonukleotid bzw. einer Probe von bekannter Konzentration für das Verdrängungsmittel erzeugt. Die Konzentration von Oligonukleotid und Amaranth in jeder der Fraktionen wurde dann unter Verwendung dieser Standardkurve bestimmt, um einen Wert des Extinktionskoeffizienten zu berechnen (Höchstwertbereich pro Konzentrationseinheit). Derselbe Extinktionskoeffizient wurde für den Monophosphodiester (P = O) 1 Bestandteil und andere Verunreinigungsarten angenommen, da diese chemisch sehr ähnlich sind. Für diese Experimente wurde die kumulative Verunreinigungskonzentration durch Subtraktion der Haupthöchstwert-, d.h. der ganzen Phosphorthioat (P = S) Vorgängerhöchstwert-Konzentration von der gesamten Oligonukleotid Konzentration in jeder Fraktion, bestimmt. Ein Histogramm wurde erzeugt, um diese experimentellen Daten durch Auftragen der kumulierten Konzentration von Verunreinigungen, Produkt Oligonukleotid und Amaranth für jede der Fraktionen gg. das Volumen der Säulen Abflusslösung darzustellen.
Beispiel 2
Säulenregeneration nach Verdrängungs-Chromatographie
Nach Reinigung des Phosphorthioat Oligonukleotids in Beispiel 1 oben wurde die Säule regeneriert. Eine wirksame Regeneration der stationären Phase nach einem Verdrängungslauf zu zeigen, ist wichtig, um die Verwendung einer Verbindung als ein wirksames Verdrängungsmittel zu ermöglichen. 8 zeigt ein HPLC Chromatogramm mit den Durchbruchkurven für Nitrat Ionen bevor und nachdem die Säule durch mehrere aufeinanderfolgende Verdrängungsschritte geführt wurde, wie in Beispiel 1 dargestellt. Wie gesehen werden kann, überlappen die Durchbruchkurven einander, was eine effektive Säulenregeneration unter Verwendung von Standardprotokollen bedeutet. Das 4-Schritt Regenerationsprotokoll ist unten gezeigt.

1) Elutionssäule mit 5 Säulenvolumina 2,5 M NaCl und 20 mM NaOH.
2) Elutionssäule mit 5 Säulenvolumina Wasser.
3) Elutionssäule mit 5 Säulenvolumina 25 % v/v Acetonitril und 20 mM NaOH.
4) Elutionssäule mit 5 Säulenvolumina Wasser.

Beispiel 3
Verdrängungs-Chromatographie eines Phosphodiester 20mers, SEQ ID NR: 1 (ISIS-2302) GCC CAA GCT GGC ATC CGT CA (P=O)
Die Säule, die nach etwa 3 Verdrängungsdurchläufen in Beispiel 2 regeneriert wurde, wurde verwendet, um SEQ ID NR: 1 als einen Phosphodiester zu reinigen. Das allgemeine Verfahren, das in Beispiel 1 dargestellt ist, war wie folgt. Eine Hochtemperatur Anionenaustausch Analyse der Zugabemischung für diese Trennung wird in 9a gezeigt. Die Mischung enthielt mehrere weniger fest zurückgehaltene Verunreinigungen, die als Schultern am Hauptprodukt Höchstwert erscheinen. Das Verdrängungs-Chromatogramm, das sich aus der Verdrängung dieses Oligonukleotids unter Verwendung von Amaranth ergibt, ist in 9b gezeigt. Wieder wurde eine wirksame Trennung erreicht, die zu einer Ausbeute von 69,7 % bei 99 % Reinheit durch den Anionenaustausch Test führte. Das analytische Kapillargel Elektroferrogramm des gereinigten Pools des gereinigten Phosphodiesters ist in 9c gezeigt.
Beispiel 4
Reinigung eines Phosphorthioat 20mers unter Verwendung von Verdrängungs-Chromatographie, SEQ ID NR: 2 (ISIS-2105) TTG CTT CCA TCT TCC TCG TC (P=S)
SEQ ID NR: 2, ein Phosphorthioat 20mer, wurde durch Verdrängungs-Chromatographie unter Verwendung von Amaranth als dem Verdrängungsmittel gereinigt. Die Chromatographie wurde wie das Verfahren, das in Beispiel 1 oben dargestellt ist, durchgeführt. Säule: 4,6 × 100 mm, Poros HQ/M; mobile Phase: 20 mM NaOH/500 mM NaCl; Ladung: 10 mg Phosphorthioat Oligonukleotid; Fließgeschwindigkeit: 0,2 ml/min; Zugabereinheit = 91,22 %. 10 zeigt das Verdrängungs-Chromatogramm. 11 zeigt das Anionenaustausch Chromatogramm und 12 zeigt das Anionenaustausch Chromatogramm des gereinigten Pools.
Während die Erfindung insbesondere unter Bezugnahme auf die bevorzugten Ausführungsformen davon gezeigt und beschrieben worden ist, wird es vom Fachmann verstanden werden, dass andere Änderungen in Form und Details gemacht werden können, ohne den Sinn und Schutzbereich der Erfindung zu verlassen.

Claims

Verfahren zum Reinigen eines Oligonukleotids, umfassend: (a) das Laden des Oligonukleotids auf die stationäre Phase einer Anionenaustauschsäule, und (b) das Verdrängen des Oligonukleotids von der stationären Phase durch ein anionisches Verdrängungsmittel mit einem Molekulargewicht von weniger als 10 000 Dalton, wobei das anionische Verdrängungsmittel eine höhere Affinität zu der stationären Phase als das Oligonukleotid aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das anionische Verdrängungsmittel ein Molekulargewicht von weniger als 5000 Dalton aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das anionische Verdrängungsmittel ein Molekulargewicht von weniger als 2500 Dalton aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das anionische Verdrängungsmittel eine aromatische Verbindung ist, welche mindestens einen anionischen Substituenten aufweist, wobei die aromatische Verbindung gegebenenfalls ein oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus C₁-C₄ Alkyl, Halogen, Hydroxyl, Methoxy, Ethoxy, Phenyl, Amino, Acetamid (-N(H)Ac), Benzamid (-C(=O)N(H)Phenyl) und Nitro (-NO₂), einschließt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der anionische Substituent aus der Gruppe, bestehend aus Sulfat-, Sulfonat-, Phosphat-, Phosphonat- und Carboxylatgruppen, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der anionische Substituent eine Sulfonatgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das anionische Verdrängungsmittel eine polycyclische aromatische Verbindung ist, welche mindestens einen anionischen Substituenten aufweist, wobei die polycyclische aromatische Verbindung gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus C₁-C₄ Alkyl, Halogen, Hydroxyl, Methoxy, Ethoxy, Phenyl, Amino, Acetamid (-N(H)Ac), Benzamid (-C(=O)N(H)Phenyl) und Nitro (-NO₂), einschließt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der anionische Substituent aus der Gruppe, bestehend aus Sulfat-, Sulfonat-, Phosphat-, Phosphonat- und Carboxylatgruppen, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der anionische Substituent eine Sulfonatgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Verdrängungsmittel Amaranth ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Verdrängungsmittel Calcion ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das anionische Verdrängungsmittel eine aliphatische Verbindung ist, welche mindestens einen anionischen Substituenten aufweist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der anionische Substituent aus der Gruppe, bestehend aus Sulfat-, Sulfonat-, Phosphat-, Phosphonat- und Carboxylatgruppen, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der anionische Substituent eine Sulfonatgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid von 10 bis 40 Nukleotidbasen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend: – das Eluieren der Anionenaustauschsäule mit etwa 5 Systemvolumina von 2,5 M NaCl und 20 mM NaOH, – das Eluieren der Anionenaustauschsäule mit etwa 5 Systemvolumina Wasser, – das Eluieren der Anionenaustauschsäule mit etwa 5 Systemvolumina von 25% v/v Acetonitril und 20 mM NaOH, und – das Eluieren der Anionen-Austauschsäule mit etwa 5 Systemvolumina Wasser.
Verfahren zum Reinigen eines Oligonukleotids, umfassend: (a) das Laden des Oligonukleotids in einer geeigneten mobilen Phase auf eine stationäre Phase eines Anionenaustauschsystems, und (b) das Verdrängen des Oligonukleotids von dem Anionenaustauschsystem durch Flution mit einem polycyclischen aromatischen Sulfonat-Verdrängungsmittel.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das polycyclische aromatische Sulfonat-Verdrängungsmittel Amaranth umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das polycyclische aromatische Sulfonat-Verdrängungsmittel Calcion umfaßt.