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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft DNA-Trennsysteme, die zur Durchführung einer
größenbasierten
(Basenpaarlängen-)Trennung
von DNA geeignet sind. Insbesondere betrifft diese Erfindung ein
Verfahren zur Wiederherstellung von Säulen für übereingestimmte Ionen-Polynucleotidchromatographie
(„matched
ion polynucleotide chromatography", MIPC), ohne diese vom Trennsystem
zu entfernen. Dieses Verfahren kann eingesetzt werden, um DNA-Rückstände zwischen
Trennungen von der Säule
zu entfernen oder Säulen
wiederherzustellen, die aufgrund übermäßiger Verwendung weniger wirksam
geworden sind.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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DNA-Moleküle sind
Polymere, die Untereinheiten umfassen, die Desoxynucleotide genannt
werden. Die vier Desoxynucleotide, die in DNA zu finden sind, umfassen
einen gewöhnlichen
zyklischen Zucker, Desoxyribose, der kovalent an jede beliebige
der vier Basen, Adenin (ein Purin), Guanin (ein Purin), Cytosin
(ein Pyrimidin) und Thymin (ein Pyrimidin) gebunden ist, die hierin
als A, G, C bzw. T beschrieben werden. Eine Phosphatgruppe verbindet
ein 3'-Hydroxyl
eines Desoxynucleotids mit dem 5'-Hydroxyl
eines anderen Desoxynucleotids, um eine Polymerkette zu bilden.
In doppelsträngiger
DNA werden Stränge
in einer Helixstruktur durch Wasserstoffbrücken zwischen so genannten
komplementären
Basen zusammengehalten. Die Komplementarität von Basen wird über ihre
chemische Struktur bestimmt. In doppelsträngiger DNA paart sich jedes
A mit einem T und jedes G mit einem C, d.h. ein Purin paart sich
mit einem Pyrimidin. Idealerweise wird DNA durch DNA-Polymerasen
während
der Zellteilung im menschlichen Körper oder in anderen lebenden
Organismen in exakten Kopien repliziert. DNA-Stränge können auch mittels Polymerasekettenreaktion
(PCR) in vitro repliziert werden.
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Manchmal
versagt die exakte Replikation, und eine inkorrekte Basenpaarung
tritt auf. Eine weitere Replikation des neuen Strangs produziert
doppelsträngige
DNA-Nachkommen,
deren Basensequenz einen vererbbaren Unterschied zu jener der Eltern
aufweist. Solche erblichen Veränderungen
in der Basenpaarsequenz werden Mutationen genannt.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich doppelsträngige DNA auf einen Duplex.
Wenn eine Basensequenz eines Strangs vollständig komplementär zu einer
Basensequenz des anderen Strangs ist, wird der Duplex Homoduplex
genannt. Wenn ein Duplex zumindest ein Basenpaar enthält, das
nicht komplementär
ist, wird der Duplex Heteroduplex genannt. Ein Heteroduplex wird
durch DNA-Replikation gebildet, wenn durch ein DNA-Polymeraseenzym
ein Defekt verursacht wird und eine nicht-komplementäre Base zu einer Polynucleotidkette
hinzugefügt
wird, die repliziert wird. Weitere Replikationen eines Heteroduplex
produzieren idealerweise Homoduplexe, die heterozygot sind, d.h.
diese Homoduplexe weisen im Vergleich zum ursprünglichen Eltern-DNA-Strang
eine geänderte
Sequenz auf. Wenn die Eltern-DNA eine Sequenz aufweist, die in einer
natürlich
auftretenden Population vorherrscht, wird die Sequenz im Allgemeinen
als „Wildtyp" bezeichnet.
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Viele
verschiedenen Arten von DNA-Mutationen sind bekannt. Beispiel für DNA-Mutationen umfassen, einschließlich aber
nicht ausschließlich, „Punktmutationen" oder „Einzelbasenpaarmutationen", in welchen eine
inkorrekte Basenpaarung auftritt. Die häufigsten Punktmutationen umfassen „Transitionen", in welchen eine
Purin- oder Pyrimidin-Base durch eine andere ersetzt ist, und „Transversionen", worin ein Purin
durch ein Pyrimidin (und vice versa) ersetzt ist. Punktmutationen
umfassen auch Mutationen, in welchen eine Base zu einer DNA-Kette
hinzugefügt
oder entfernt wird. Solche „Insertionen" oder „Deletionen" sind auch als „Rasterverschiebungsmutationen" bekannt. Obwohl
sie weniger häufig
auftreten als Punktmutationen, können
auch größere Mutationen
auftreten, die multiple Basenpaare betreffen und wichtig sein können. Eine
detailliertere Diskussion von Mutationen ist in US-Patent Nr. 5.459.039
an Modrich (1995) und US-Patent Nr. 5.698.400 an Cotton (1997) zu
finden.
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Die
Sequenz der Basenpaare in einer DNA ist ein Code für die Produktion
von Proteinen. Insbesondere kodiert eine DNA-Sequenz im Exonabschnitt
einer DNA-Kette für
eine entsprechende Aminosäuresequenz
in einem Protein. Deshalb kann eine Mutation in einer DNA-Sequenz
zu einer Änderung
der Aminosäuresequenz
eines Proteins führen.
Eine solche Änderung
der Aminosäuresequenz
kann vollständig
gutartig sein oder kann ein Protein inaktivieren oder seine Funktion ändern, um
lebensbedrohlich oder tödlich
zu sein. Andererseits wird von Mutationen in einem Intronabschnitt
einer DNA-Kette nicht erwartet, dass sie biologische Wirkung zeigen,
da ein Intronabschnitt keinen Code für die Proteinproduktion enthält. Dennoch
kann die Mutationdetektion in einem Intronabschnitt wichtig sein,
z.B. bei einer forensischen Untersuchung.
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Die
Detektion von Mutationen ist deshalb von großer Bedeutung bei der Diagnose
von Erkrankungen, beim Verständnis
der Ursprünge
der Erkrankung und bei der Entwicklung potenzieller Behandlungen.
Die Detektion von Mutationen und die Identifikation von Ähnlichkeiten
oder Unterschieden in DNA-Proben ist auch zur Steigerung der weltweiten
Nahrungsmittelversorgung durch die Entwicklung von krankheitsresistenten und/oder
ertragreicheren Getreidestämmen,
in der forensischen Wissenschaft, im Studium der Evolution und Populationen
und in der wissenschaftlichen Forschung im Allgemeinen von besonderer
Bedeutung (Guyer et al., Proc. Natl, Acad. Sci,. USA 92, 10841 (1995);
Cotton, TIG 13, 43 (1997)).
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Änderungen
einer DNA-Sequenz, die gutartig sind oder keine negativen Folgen
haben, werden manchmal Polymorphismen genannt. Zum Zwecke dieser
Anwendung werden alle Änderungen
der DNA-Sequenzen, ob sie negative Folgen haben oder nicht, hierin
als Mutationen definiert. Der Einfachheit halber steht der Begriff „Mutation" hierin für die Änderung
der Basensequenz eines DNA-Strangs verglichen mit einem Referenzstrang
(im Allgemeinen einem Wildtyp). Wie hierin verwendet umfasst der
Begriff „Mutation" den Begriff „Polymorphismus" oder jeden beliebigen
anderen ähnlichen
oder äquivalenten
Begriff des Fachgebiets.
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Mittels
Standard-Gelelektrophorese (GEP) ist eine größenbasierte Analyse der DNA-Proben erreicht worden.
Kapillargelelektrophorese (CGE) ist auch zur Trennung und Analyse
von Gemischen aus DNA-Fragmenten verwendet worden, die unterschiedliche
Längen
aufweisen, z.B. die Verdaue, die durch Restriktionsenzymspaltung
von DNA-Proben produziert werden. Diese Verfahren können jedoch
keine DNA-Fragmente unterscheiden,
die über
dieselben Basenpaarlängen
verfügen,
jedoch eine unterschiedliche Basensequenz aufweisen. Dies ist eine
schwerwiegende Einschränkung
von GEP.
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Mutationen
in Heteroduplex-DNA-Strängen
unter „partiell
denaturierenden" Bedingungen
können
mittels gelbasierten analytischen Verfahren wie z.B. denaturierender
Gradientengelelektrophorese (DGGE) und denaturierender Gradientengelkapillarelektrophorese
(DGGC) detektiert werden. Der Begriff „partiell denaturierend" ist als Trennung
eines fehlgepaarten Basenpaares (verursacht durch Temperatur, pH,
Lösungsmittel oder
andere Faktoren) in einem DNA-Doppelstrang definiert, während andere
Abschnitte des Doppelstrangs intakt bleiben, d.h. nicht getrennt
werden. Das Phänomen
der „partiellen
Denaturierung" tritt
ein, weil ein Heteroduplex an der Stelle einer Basenpaarfehlpaarung
bei einer geringeren Temperatur denaturiert als erforderlich ist,
um den Rest des Strangs zu denaturieren.
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Diese
gelbasierten Verfahren sind schwierig und erfordern hochqualifizierte
Wissenschafter. Außerdem
erfordert jede Analyse einen langwierigen Aufbau und Trennung. Eine
denaturierende Kapillargelelektrophoreseanalyse kann nur aus relativ
kleinen Fragmenten hergestellt werden. Eine Trennung eines 90-Basenpaarfragments
erfordert mehr als 30 Minuten. Ein denaturierendes Gradientengel
läuft über Nacht
und erfordert etwa 1 Tag Zeit zur Anordnung. Weitere Nachteile von
Gradientengelen sind die Schwierigkeit, diese Verfahren zur Isolation
getrennter DNA-Fragmente anzupassen (das spezielle Verfahren und
Ausrüstung
erfordert) und Schaffung von Bedingungen, die zur Isolation erforderlich
sind. Die Bedingungen müssen
experimentell für
jedes einzelne Fragment entwickelt werden, (Laboratory Methods for
the Detection of Mutations and Polymorphisms, G.R. Taylor (Hrsg.),
CRC Press (1997)). Die lange Analysezeit des Gelverfahrens wird
durch die Tatsache, dass die Bewe gung von DNA-Fragmenten in einem
Gel, in geometrischer Beziehung, umgekehrt proportional zu den Längen der
DNA-Fragmenten ist, weiter verschlimmert. Deshalb kann die Analysezeit
längerer
DNA-Fragmente oft unhaltbar sein.
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Zusätzlich zu
den Nachteilen der oben beschriebenen denaturierenden Gelverfahren
sind diese Verfahren nicht immer reproduzierbar oder akkurat, da
sich die Herstellung eines Gels und das Laufen einer Analyse stark
von einer Bedienungsperson zu einer anderen unterscheiden kann.
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Die
Trennung von Gemischen doppelsträngiger
Nucleinsäurefragmente
durch GEP oder DGGE produziert eine lineare Anordnung von Banden,
wobei jede Bande in der Anordnung für eine getrennte doppelsträngige Nucleinsäurekomponente
dieses Gemisches steht. Da viele Gemische typischerweise gleichzeitig getrennt
und in getrennten Spuren auf derselben Gelplatte analysiert werden,
wird eine parallele Reihe solch linearer Anordnungen von Banden
produziert. Die Banden sind oft eher gekrümmt als gerade, ihre Mobilität und Form
können
sich über
die Breite des Gels ändern,
und die Spuren und Banden können
sich miteinander vermischen. Die Quellen solcher Ungenauigkeiten
rühren
von der fehlenden Gleichförmigkeit
und Homogenität des
Gelbetts, der Elektroendosmose, dem Temperaturgradienten und Diffusionswirkungen
wie auch Wirt oder anderen Faktoren her. Ungenauigkeiten dieser
Art sind auf dem Gebiet der GEP bekannt und können zu ernsthaften Verzerrungen
und Ungenauigkeiten bei der Anzeige von Trennergebnissen führen. Zusätzlich dazu
sind die Bandendisplaydaten, die aus GEP-Trennungen erhalten werden,
aufgrund der Ungenauigkeiten in Bezug auf Form und Integrität der Banden
weder quantitativ noch akkurat. Es kann keine wahre Quantifizierung
der Displays linearer Bandenanordnungen, die durch GEP-Trennungen
produziert werden, erreicht werden, sogar wenn die linearen Bandenanordnungen
mit einem Detektor gescannt werden und die resultierenden Daten
integriert werden, weil die linearen Bandenanordungen nur über das
Zentrum der Banden gescannt werden. Da der Detektor nur einen kleinen
Teil einer beliebigen Bande erkennt und die Banden nicht einheitlich
sind, sind die Ergebnisse, die durch das Scanverfahren produziert
werden, nicht genau und können
sogar irreführend sein.
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Verfahren
zur Veranschaulichung von GEP- und DGGE-Trennungen, wie z.B. Färbung und
Autoradiographie, sind ebenfalls beschwerlich und zeitaufwendig.
Außerdem
liegen die Trennungsdaten nur in Druckform vor und können weder
zum einfachen Abrufen und Vergleichen elektronisch abgespeichert
werden, noch können
sie optimiert werden, um die Veranschaulichung enger Trennungen
zu verbessern.
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Die
Trennung von doppelsträngigen
Desoxyribonucleinsäure-(dsDNA-)Fragmenten
und die Detektion von DNA-Mutationen ist in der Medizin, den Naturwissenschaften,
Sozialwissenschaften und bei forensischen Untersuchungen von großer Bedeutung.
Das „Human
Genome Project" stellt
eine große
Menge an Geninformationen bereit und erbringt neue Informationen
zur Evaluation der Verbindungen zwischen Mutationen und menschlichen
Funktionsstörungen
(Guyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10841 (1995)). Zum
Beispiel ist der endgültige
Krankheitsauslöser
durch den genetischen Code beschrieben, der sich vom Wildtyp stark unterscheidet
(Cotton, TIG 13, 43 (1997)). Das Verständnis der genetischen Grundlage
der Erkrankung kann der Ausgangspunkt für eine Heilung sein. Auf ähnliche
Art und Weise kann die Bestimmung von Unterschieden des genetischen
Codes starke und vielleicht maßgebliche
Einblicke in das Studium der Evolution und Populationen geben (Cooper
et al., Human Genetics, Band 69, 201 (1985)). Das Verständnis dieser
und anderer Themen, die mit dem genetischen Code in Zusammenhang
stehen, erfordert die Fähigkeit,
Anomalien, d.h. Mutationen, in einem DNA-Fragment in Bezug auf den
Wildtyp zu identifizieren.
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Die
traditionelle Chromatographie ist ein Trennungsverfahren basierend
auf einer Trennung von Gemischkomponenten zwischen einer „stationären Phase" und einer „mobilen
Phase". Die stationäre Phase
wird durch die Oberfläche
fester Materialien bereitgestellt, die viele verschiedene Materialien
in Form von Teilchen oder Durchgangsoberflächen von Cellulose, Kieselgel,
beschichtetes Kieselgel, Polymerperlen, Polysaccharide und dergleichen
umfassen kann. Diese Materialien können auf festen Oberflächen wie
z.B. Glasplatten getragen werden oder in eine Säule gepackt werden. Die mobile
Phase kann eine Flüssigkeit
oder ein Gas in Gaschromatographie sein. Diese Erfindung betrifft
flüssige
mobile Phasen.
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Die
Trennprinzipien sind im Allgemeinen dieselben, unabhängig vom
verwendeten Material, von der Form der Materialen oder dem verwendeten
Apparat. Die verschiedenen Komponenten eines Gemisches haben in
der stationären
Phase und der mobilen Phase jeweils verschiedene Lösungsgrade.
Deshalb, weil die mobile Phase über
die stationäre
Phase fließt,
besteht ein Gleichgewicht, bei welchem die Probenkomponenten zwischen
der stationären
Phase und der mobilen Phase aufgeteilt werden. Wenn die mobile Phase
durch die Säule
läuft,
wird das Gleichgewicht konstant zugunsten der mobilen Phase verschoben.
Dies trifft auf, weil das Gleichgewichtsgemisch zu jeder beliebigen
Zeit eine frische mobile Phase sieht und sich auf eine frische mobile
Phase aufteilt. Wenn die mobile Phase die Säule hinuntergetragen wird,
sieht die mobile Phase eine frische stationäre Phase und verteilt sich
auf die stationäre
Phase. Letztendlich gibt es am Ende der Säule keine stationäre Phase
mehr, und die Probe verlässt
ganz einfach die Säule
in der mobilen Phase.
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Eine
Trennung von Gemischkomponenten tritt ein, weil die Gemischkomponenten
geringfügig
unterschiedliche Affinitäten
für die
stationäre
Phase und/oder Löslichkeiten
in der mobilen Phase aufweisen, und weisen deshalb verschiedene
Verteilungsgleichgewichtswerte auf. Deshalb bewegen sich die Gemischkomponenten
auf der Säule
in unterschiedlichen Geschwindigkeiten.
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Da
chromatographische Trennungen von Wechselwirkungen mit der stationären Phase
abhängen,
ist es bekannt, dass eine Trennung durch die Erhöhung der Oberfläche der
stationären
Phase verbessert werden kann.
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Bei
der traditionellen Flüssigkeitschromatographie
wird eine Glassäule
mit Teilchen einer stationären Phase
gepackt, und die mobile Phase passiert die Säule rein von der Schwerkraft
gezogen. Wenn jedoch kleinere stationäre Phasenteilchen in der Säule verwendet
werden, ist der Zug der Schwerkraft alleine nicht ausreichend, um
zu bedingen, dass die mobile Phase durch die Säule fließt. Anstelle dessen muss Druck
angewendet werden. Die Glassäulen
können
nur etwa 200 psi (13,8 bar) standhalten. Das Leiten einer mobilen Phase
durch eine Säule,
die mit Teilchen einer Größe von 5 μm gepackt
ist, erfordert einen Druck von etwa 2000 psi (138 bar) oder mehr,
der auf die Säule
aufgetragen werden muss. Heute sind Teilchen mit einer Größe von 5
bis 10 μm
Standard. Teilchen, die kleiner als 5 μm sind, werden für besonders
schwierige Trennungen oder bestimmte Sonderfälle verwendet. Dieses Verfahren
wird durch den Begriff „Hochdruckflüssigkeitschromatographie" oder PLC beschrieben.
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HPLC
hat die Verwendung einer weit größeren Zahl
verschiedener Teilchenarten ermöglicht,
die verwendet werden, um eine größere Zahl
chemischer Strukturen zu trennen, als mit Schwerkraftsäulen mit
großen Teilchen
möglich
war. Das Trennprinzip ist jedoch noch immer dasselbe.
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Bestimmte
Komponenten und Operationen der HPLC-Trennsysteme sind teilweise
automatisiert worden, um die traditionellen teilchenbasierten Trennungen
zu erleichtern. Ein Beispiel ist das HSM-Kontrollsystem, bereitgestellt
durch den HPLC-Chromatographieapparat
von Hitachi. Durch die Verwendung dieser Kontrollen gibt ein Chromatographiefachmann
manuell detaillierte Anweisungen an einen Autosampler, um eine spezifische
Probe für
die Trennung zu erhalten, detaillierte einfache Anweisungen an Dosierventile,
um einen gewünschten
Lösungsmittelgradienten
zu erreichen, und spezifische Temperaturanweisungen an einen Säulenofen.
Das Kontrollsystem setzt diese Anweisungen automatisch um, um eine
HPLC-Trennung durchzuführen.
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Es
wurde kürzlich
ein HPLC-basiertes Ionenpaarchromatographieverfahren eingeführt, um
Gemische aus doppelsträngigen
Polynucleotiden im Allgemeinen wirksam und DNA im Besonderen wirksam
zu trennen, worin die Trennungen auf Basenpaarlängen basieren (US-Patent Nr.
5.585.236 an Bonn (1996); Huber et al., Chromatographia 37; 653
(1993); Huber et al., Anal. Biochem. 212, 351 (1993)). Der Begriff „übereingestimmte Ionen-Polynucleotidchromatographie" (MIPC) wird hierin
definiert und auf dieses Verfahren angewendet, weil herausgefunden
wurde, dass der Trennmechanismus auf der Bindung und der Freisetzung
von DNA von den Trennoberflächen
anstelle von traditionellem Aufteilen basierte. MIPC trennt DNA-Frag mente
auf der Basis von Basenpaarlängen
und ist nicht durch jene Nachteile eingeschränkt, die mit gelbasierten Trennverfahren
in Zusammenhang stehen.
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Übereingestimmte
Ionen-Polynucleotidchromatographie ist wie hierin verwendet als
Verfahren zur Trennung einzel- und doppelsträngiger Polynucleotide unter
Einsatz von nicht-polaren Trennmedien definiert, worin das Verfahren
ein Gegenionmittel und ein organisches Lösungsmittel verwendet, um die
Polynucleotide aus dem Trennmedium freizusetzen. MIPC-Trennungen
sind in weniger als 10 Minuten und häufig in weniger als 5 Minuten
vollständig
durchgeführt.
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Als
sich die Verwendung und das Verständnis der MIPC entwickelten,
wurde entdeckt, dass, bei Durchführung
der MIPC-Analysen bei einer partiell denaturierenden Temperatur,
d.h. einer Temperatur, die ausreicht, um einen Heteroduplex an der
Stelle der Basenpaarfehlpaarung zu denaturieren, Homoduplexe von Heteroduplexen
getrennt werden können,
welche dieselben Basenpaarlägen
aufweisen (US-Patent
Nr. 5.795.976 A; Hayward-Lester et al., Genome Research 5, 494 (1995);
Underhill et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 93, 193 (1996); Doris
et al., DHPLC Workshop, Stanford University (1997)). Daher wurde
die Verwendung der denaturierender HPLC (DHPLC) dazu verwendet,
um Mutationen zu detektieren (Underhill et al., Genome Research
7, 996 (1997); Liu et al., Nucleic Acid Res. 26, 1396 (1998)).
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DHPLC
kann Heteroduplexe trennen, die sich durch nur ein Basenpaar unterscheiden.
Jedoch können Trennungen
von Homoduplexen und Heteroduplexen nur schlecht aufgelöst werden.
Artefakte und Verunreinigungen können
auch mit der Interpretation von DHPLC-Trennchromatogrammen interferieren,
insofern, als dass es schwierig sein kann, zwischen einem Artefakt
oder einer Verunreinigung und einer vermeintlichen Mutation zu unterscheiden
(Underhill et al., Genome Res. 7, 996 (1997)). Die Gegenwart von
Mutationen kann auch vollständig übersehen
werden (Liu et al., Nucleic Acid Res. 26, 1396 (1998)).
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Die
Genauigkeit, Reproduzierbarkeit, Bequemlichkeit und Geschwindigkeit
von DNA-Fragmenttrennungen
und Mutationsdetektionstests basierend auf DHPLC sind in der Vergangenheit
aufgrund von Problemen mit dem DHPLC-System beeinträchtigt gewesen.
Wichtige Aspekte der DNA-Trennung und Mutationsdetektion durch HPLC
und DHPLC, die bisher nicht angesprochen worden sind, umfassen die
Behandlung von Materialien, die Chromatographiesystemkomponenten
umfassen, die Behandlung von Materialien, die Trennmedien umfassen;
Lösungsmittelvorauswahl
zur Minimierung der Entwicklungszeit des Verfahrens; optimale Temperaturvorauswahl
zur Durchführung
einer partiellen Denaturierung eines Heteroduplexes während MIPC; und
Optimierung von DHPLC für
automatisierte Hochdurchsatzmutationsdetektionscreeningtests. Diese
Faktoren sind notwendig, um eindeutige, akkurate, reproduzierbare
und Hochdurchsatz-DNA-Trennungen und Mutationsdetektionsergebnisse
zu erzielen.
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Es
besteht daher Bedarf für
ein HPLC-System, das DNA-Fragmente basierend auf Größenunterschieden
trennen kann und auch DNA mit derselben Länge, aber einer unterschiedlichen
Basenpaarsequenz (Mutationen vom Wildtyp) auf akkurate, redproduzierbare
und verlässliche
Art und Weise trennen kann. Ein solches System sollte automatisiert
werden und wirksam sein, sollte an routinemäßige Hochdurchsatzprobenscreeninganwendungen
anpassbar sein und sollte Hochdurchsatzprobenscreenings mit einem
Minimum von Aufmerksamkeit des Bedienungspersonals bereitstellen.
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Das
MIPC-Trennverfahren unterscheidet sich von traditionellen HPLC-Trennverfahren
insofern, als dass die Trennung nicht durch eine Reihe von Gleichgewichtstrennungen
zwischen der mobilen Phase und der stationären Phase erreicht wird, wenn
die Flüssigkeiten
durch die Säule
geleitet werden. Stattdessen wird die Probe unter Verwendung einer
Lösungsmittelstärke, die
der Proben-dsDNA ermöglicht,
sich an die Oberfläche
des Trennmediums zu binden, auf die Säule aufgetragen. Stränge einer
spezifischen Basenpaarlänge werden
von der stationären
Phasenoberfläche
entfernt und durch die Säule
mit einer speziellen Lösungsmittelkonzentration
hinunter transportiert. Durch das Leiten eines ansteigenden Lösungsmittelgradienten
durch die Probe werden in der Folge immer größere Basenpaarlängen entfernt
und durch die Säule
geleitet. Die Trennung ist nicht von der Säulenlänge oder der Fläche der
stationären
Phase abhängig.
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Dieses
MIPC-Verfahren ist temperaturempfindlich, und die genaue Temperaturkontrolle
ist z.B. in den in
US
6287822 A beschriebenen MIPC-Trennverfahren besonders wichtig.
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Bei
der DMIPC ist eine genaue Temperaturkontrolle zur Aufrechterhaltung
sowohl der mobilen als auch der stationären Phase bei einer partiell
denaturierenden Temperatur erforderlich, d.h. eine Temperatur, bei
welcher fehlgepaarte DNA, die an der Mutationsstelle eines Heteroduplexstrangs
gegenwärtig
ist, denaturiert, aber bei welcher die korrekt gepaarte DNA in den
Doppelstrang gebunden bleibt.
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Die
Anwendung der übereingestimmten
Ionen-Polynucleotidchromatographie (MIPC) unter partiell denaturierenden
Bedingungen, die zur Trennung von Heteroduplexen von Homoduplexen
bei der Mutationsdetektion verwendet werden, wird hierin nachstehend
als DMIPC bezeichnet.
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Die
MIPC-Systeme haben Betriebssystemerfordernisse eingeführt, die
von bestehenden Kontrollsystemen nicht erfüllt werden können. Es
sind Probenschalen mit einer erhöhten
Anzahl an Wells eingeführt
worden, die entsprechende detaillierte Autosampleranweisungen zur
Extraktion einer Trennaliquote jeder der Proben erfordert. Es sind
komplexere und variierendere Lösungsmittelkonzentrations-
und Gradientenanweisungen erforderlich. Es ist eine genauere Temperaturkontrolle
notwendig, und bei manchen Betriebsweisen sollen Aliquoten aus derselben
Probe bei unterschiedlichen voreingestellten Temperaturen getrennt
werden. Das MIPC-System wird verwendet, um reine Fraktionen zu isolieren,
wobei jede eine einzelne Basenpaargröße aufweist, diese werden zur
PCR und/oder Klonierungsamplifikationsverfahren benötigt. Dies
erfordert die Verwendung eines Fragmentsammlers, der gemeinsam mit
dem MIPC-Trennverfahren wirkt. Außerdem erfordert die erweiternde
Anwendung von MIPC-Trennverfahren, dass das System von einem erfahrenen
Fachmann anstelle eines Chromatographiefachmanns betrieben wird.
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US-Patent
Nr.
US 5.772.889 A ,
US 5997742 A ,
US 6066258 A und
US 6056877 A beschreiben
Verfahren zur Entfernung oder Vermeidung von Metallkationen von
der Vorrichtung, dem Trennmedium und von Lösungen, um eine maximal wirksame
Trennung von DNA-Fragmenten zu erreichen. Wenn diese Vorsichtsmaßnahmen
und Verfahren befolgt werden, können
die Trennsäulen
für mehr
als 1000 Trennschritte eingesetzt werden, bevor ein signifikanter
Verlust der Wirksamkeit und Effizienz beobachtet werden kann und
routinemäßige Reinigungsverfahren
die Säule
nicht vollständig
wiederherstellen können.
Letztlich nimmt die Wirksamkeit der Säule ab.
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DNA-Trennungen
zur Herstellung von Materialien zum Klonieren oder für PCR sollten
frei von Kreuzkontaminationen früherer
Trennungen sein, die auf dem Trennsystem und der Trennsäule durchgeführt wurden.
Es besteht Bedarf an einem Verfahren zur Sicherstellung der Entfernung
aller DNA-Rückstände von
der Säule
in Vorbereitung auf die Trennung gereinigter DNA-Fragmente zur Amplifikation.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
ist ein Ziel dieser Erfindung, ein Reinigungsverfahren zur Regeneration
oder Wiedererstellung einer MIPC-Säule bereitzustellen, die aufgrund übermäßiger Verwendung
weniger wirksam geworden ist.
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Es
ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein säulenregenerierendes Verfahren
bereitzustellen, das keine Entfernung der Trennsäule zur Durchführung des
Reinigungsverfahrens erfordert.
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Es
ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein In-situ-Reinigungsverfahren
bereitzustellen, um die Entfernung von DNA-Resten vor Trennungen
zu garantieren, die zur Produktion gereinigter Fraktionen zum Klonieren
oder zur PCR-Amplifikation beschaffen sind.
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Eine
Vorrichtung zur Durchführung
von Basenpaarlängentrennungen
von DNA-Fragmenten durch übereingestimmte
Ionenpaarchromatographie umfasst eine Trennsäule, die Trennmedien mit nicht-polaren DNA-Trennoberflächen enthält, ein
Ventil zur Injektion einer Reinigungslösung, das über eine Einlassöffnung für das DNA-Trennlösungsmittel
verfügt,
die mit einem Zufuhrmittel für
das Trennlösungsmittel
in Verbindung steht, eine Reinigungslösungsöffnung, die mit dem Zufuhrmittel
für die
Reinigungslösung
in Verbindung steht, eine Reinigungslösungsschleife, eine Abfallproduktauslassöffnung und
eine Auslassöffnung,
die mit der Trennsäule
in Verbindung steht. Die Reinigungslösungsschleife steht an einer
ersten Position mit dem Zufuhrmittel für das Reinigungslösungsmittel
und der Abfallproduktauslassöffnung
in Verbindung, wodurch die Reinigungslösungsschleife mit Reinigungslösung gefüllt werden
kann. Die Reinigungslösungsschleife
steht mit dem Zufuhrmittel für
das Trennlösungsmittel
in Verbindung, und die Auslassöffnung
steht an einer zweiten Stelle mit der Trennsäule in Verbindung, wodurch
die Reinigungslösung
in der Reinigungslösungsschleife
durch ein Trennlösungsmittel über die
Auslassöffnung,
die mit der Trennsäule
in Verbindung steht, ersetzt werden kann.
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 1.
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Zusammengefasst
umfasst ein Verfahren dieser Erfindung zur Reinigung nicht-polarer DNA-Trennoberflächen mit
der obigen Vorrichtung die Unterbrechung des Flusses des Trennlösungsmittels
mit einem Block einer Reinigungslösung, die in den Fluss der
Trennlösung,
die durch die Säule
geleitet wird, injiziert wird, das Mittel, das die Reinigungslösung enthält, welches
akkumulierte Reste von der nicht-polaren Oberfläche entfernt. Die Reinigungslösung kann
einen alkalischen pH aufweisen, z.B. einen pH von 8 bis 13. Die
Reinigungslösung
kann einen Chelatbildner und ein organisches Lösungsmittel enthalten. Bevorzugte
Ausführungsformen
sind in den abhängigen
Ansprüchen
beschrieben.
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KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1 ist
eine schematische Darstellung eines Einzelsäulen-MIPC-Systems unter Einsatz
von Ventilen und Ventilkontrollen zur Herstellung von Elutionslösungsmittelgradienten.
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2 ist
eine partielle schematische Darstellung eines Pumpensystems zur
Herstellung von Elutionslösungsmittelgradienten.
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3 ist
eine Vorderansicht der Trennsäule
und des Lösungsvorheizsystems
in einem Umluftofen.
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4 ist
eine Darstellung der physischen Struktur einer repräsentativen
Trennsäule.
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5 ist
eine schematische Darstellung eines Injektionsventils, das im MIPC-System
angewendet wird.
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6 ist
eine schematische Darstellung eines Injektionsventils in der Belastungsposition
der gefüllten Schleife.
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7 ist
eine schematische Darstellung eines Injektionsventils in der Injektionsposition
der gefüllten Schleife.
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8 veranschaulicht
ein Chromatogramm eines MIPC-Trenngradientenverfahrens, das auf
einer kontaminierten Säule
durchgeführt
wurde.
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9(a) veranschaulicht ein Chromatogramm
einer MIPC-Trennung eines Standardgemisches aus DNA-Fragmenten vor
einem Säulenreinigungsverfahren.
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9(b) veranschaulicht ein Chromatogramm
einer MIPC-Trennung eines Standardgemisches aus DNA-Fragmenten nach
einem Säulenreinigungsverfahren.
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10 veranschaulicht
ein Chromatogramm einer MIPC-Trennung eines Standardgemisches aus DNA-Fragmenten
unter Einsatz einer Säule,
die einem Reinigungsverfahren unterworfen worden war.
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11 ist
ein Trennprofil eines Standardgemisches aus DNA-Fragmenten unter
Einsatz einer ID-MIPC-Säule
mit 50 mm × 4,6
mm vor Injektion eines Pfu-Puffers.
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12 ist
ein Trennprofil eines Standardgemisches aus DNA-Fragmenten unter
Einsatz einer in 11 verwendeten Säule nach
wiederholten Injektionen eines Pfu-Puffers.
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13 ist
ein Trennprofil eines Standardgemisches aus DNA-Fragmenten unter
Einsatz einer in 12 verwendeten Säule nach
weiteren Injektionen eines Pfu-Puffers.
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14 ist
ein Trennprofil eines Standardgemisches aus DNA-Fragmenten unter
Einsatz einer in 13 verwendeten Säule nach
weiteren Injektionen eines Pfu-Puffers.
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15 ist
eine schematische Darstellung einer Hybridisierung zur Bildung von
Homoduplex und Heteroduplex.
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16 ist
ein Mutationstrennprofil eines 209-bp-Homoduplex/Heteroduplexgemisches
unter Einsatz einer ID-MIPC-Säule
mit 50 mm × 4,6
mm vor Injektion eines Pfu-Puffers.
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17 ist
ein Mutationstrennprofil eines 209-bp-Homoduplex/Heteroduplexgemisches
unter Einsatz einer in 16 verwendeten Säule nach
wiederholten Injektionen eines Pfu-Puffers.
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18 ist
ein Mutationstrennprofil eines 209-bp-Homoduplex/Heteroduplexgemisches
unter Einsatz einer in 17 verwendeten Säule nach
wiederholten Injektionen eines Pfu-Puffers.
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19 ist
ein Mutationstrennprofil eines 209-bp-Homoduplex/Heteroduplexgemisches
unter Einsatz einer in 18 verwendeten Säule nach
weiteren. Injektionen eines Pfu-Puffers.
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20 ist
ein Trennprofil eines Standardgemisches aus DNA-Fragmenten unter
Einsatz einer ID-MIPC-Säule
mit 50 mm × 4,6
mm vor Injektion einer Tensidlösung.
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21 ist
ein Trennprofil eines Standardgemisches aus DNA-Fragmenten unter
Einsatz der in 20 verwendeten Säule nach
wiederholten Injektionen einer Tensidlösung.
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22 ist
ein Trennprofil eines Standardgemisches aus DNA-Fragmenten unter
Einsatz der in 21 verwendeten Säule nach
weiteren Injektionen einer Tensidlösung.
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23 ist
ein Trennprofil eines Standardgemisches aus DNA-Fragmenten unter
Einsatz der in 22 verwendeten Säule nach
Behandlung mit einer mobilen Phase, die Acetonitril enthält.
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24 ist
ein Trennprofil eines Standardgemisches aus DNA-Fragmenten unter
Einsatz der in 23 verwendeten Säule, die
Fragmente werden jedoch mit einer mobilen Phase, die gegen die Packungsrichtung läuft, eluiert.
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25 ist
ein Trennprofil eines Standardgemisches aus DNA-Fragmenten unter
Einsatz der in 23 verwendeten Säule nach
Methanolwaschbehandlung.
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26 ist
ein Trennprofil eines Standardgemisches aus DNA-Fragmenten unter
Einsatz der in 25 verwendeten Säule nach
wiederholten Injektionen des Standardgemisches.
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27 veranschaulicht
die Wirkung von Tensidinjektionen auf die MIPC-Retentionszeit eines
Standard-DNA-Fragments.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Ziele dieser Erfindung werden im Verfahren dieser Erfindung bereitgestellt.
Wie in früheren,
gleichzeitig anhängigen
und gemeinsam übertragenen
Patentanmeldungen können
MIPC-Trennverfahren angewendet werden, um größenbasierte Trennung von DNA-Fragmenten,
Mutationsdetektion, DNA-Fragmentreinigung, PCR-Verfahrensmonitoring und andere neue
Verfahren durchzuführen.
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Injektion einer Reinigungslösung zur
Wiederherstellung der Trennsäule
vor Ort im System und um beliebige DNA-Reste von der Säule zwischen
den Trennverfahren zu entfernen.
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In
der folgenden Beschreibung umfasst der Begriff „Mutationstrennprofil" ein DMIPC-Trennchromatogramm,
das die Trennung von Heteroduplexen von Homoduplexen zeigt. Solche
Trennprofile sind für
Proben charakteristisch, die Mutationen oder Polymorphismen enthalten
und vor der Trennung durch DMIPC hybridisiert worden sind.
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Ein „Homoduplex" ist hierin als doppelsträngiges DNA-Fragment
definiert, worin die Basen in jedem Strang in Bezug auf ihre Gegenstückbasen
in dem anderen Strang komplementär
sind.
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Ein „Heteroduplex" ist hierin als doppelsträngiges DNA-Fragment
definiert, worin zumindest eine Base in jedem Strang zu zumindest
einer Gegenstückbase
im anderen Strang nicht komplementär ist. Dies kann auf eine fehlgepaarte
Base oder Deletion zurückzuführen sein.
Da zumindest ein Basenpaar in einem Heteroduplex nicht komplementär ist, ist
weniger Energie erforderlich, um die Basen an dieser Stelle zu trennen,
verglichen mit seinem vollständig
komplementären
Basenpaaranalogon in einem Homoduplex. Dies resultiert in einer
geringeren Schmelztemperatur an der Stelle der fehlgepaarten Base
eines Heteroduplexes im Vergleich zu einem Homoduplex.
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Der
Begriff „Hybridisierung" betrifft ein Verfahren
der Erwärmung
und Kühlung
einer dsDNA-Probe, z.B. Erwärmen
auf 95°C
gefolgt von langsamem Kühlen.
Das Erwärmungsverfahren
bringt die DNA-Stränge zum
Denaturieren. Nach dem Kühlen
rekombinieren die Stränge
in Duplexe auf eine weitgehend statistische Art und Weise. Wenn
die Probe ein Gemisch aus Wildtyp- und Mutant-DNA enthält, dann
bildet die Hybridisierung ein Gemisch aus Hetero- und Homoduplexen.
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1 ist
eine schematische Darstellung eines MIPC-Systems. Chromatographische
Lösungen
wie z.B. Lösungsmittel,
Gegenionen und andere Lösungen,
die mit den Lösungsmitteln
gemischt werden sollen, sind in Lösungsmittelbehälter 2,
Trägerflüssigkeitsbehälter 4 und
einem Behälter 6 für eine Hilfsflüssigkeit
(z.B. ein Co-Lösungsmittel)
enthalten, die jeweils über
eine Lösungsmitteltransportleitung 8,
eine Trägertransportleitung 10 und
Transportleitung 12 für
eine Hilfsflüssigkeit
verfügt,
die damit in Verbindung stehen und zum Entgaser 14 führen.
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Die
Säulenreinigungslösung ist
in Reinigungslösungsbehälter 16 enthalten,
der ebenso über
eine Reinigungslösungstransportleitung 18 verfügt, die
damit in Verbindung steht und zum Entgaser 14 führt. In
dieser Ausführungsform
kann die Reinigungslösung
aufgrund der Schwerkraft fließen,
wenn der Behälter 16 sich über dem
Entgaser 14 und dem Injektionsventil 54 befindet.
Alternativ dazu kann auf die Abfallproduktleitung 58 ein Vakuum
angewendet werden oder eine Pumpe wie in 2 dargestellt
bereitgestellt werden, um den Fluss der Reinigungslösung zu
erreichen.
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Leitung 20 für entgastes
Lösungsmittel,
Leitung 22 für
entgaste Trägerflüssigkeit
und Leitung 24 für entgaste
Hilfsflüssigkeit,
die vom Entgaser 14 wegführen, stehen mit dem jeweiligen
Lösungsmitteldosierventil 26,
Trägerflüssigkeitsdosierventil 28 und
Dosierventil 28 für
die Hilfsflüssigkeit
in Verbindung. Die Leitungen 32, 34 und 36 führen von
den jeweiligen Dosierventilen 26, 28 und 30 zum
Einlass von Pumpe 38. Entgaser 14 entfernt gelöste Gase
von den Flüssigkeiten.
Die Entfernung von gelöstem
Sauerstoff ist besonders wichtig, weil seine Gegenwart das Risiko
für Oxidation
von Eisen- und anderen oxidierbaren Metallen in den Systemkomponenten
erhöht
und somit die entsprechenden Kationen in die Flüssigkeit einführt.
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Die
Reinigungslösungstransportleitung 31 führt zu einem
Reinigungslösungsventil 40.
Eine optionale Reinigungslösungsleitung 42 führt von
Ventil 40 weg und steht mit dem Einlass von Pumpe 38 in
Verbindung.
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Die Öffnungen
der Ventile 26, 28 und 30 legen genau
die relativen Verhältnisse
des Lösungsmittels oder
der Lösungsmittel
zur Trägerflüssigkeit
fest, der wichtigste Teil dieses Systems, weil die größenbasierte Trennung
durch MIPC eine Funktion der Lösungsmittelkonzentration
ist. Wie hinsichtlich der verschiedenen DNA-Fragmenttrennverfahren
beschrieben wird, wird der Anstieg des Lösungsmittelgradienten als Funktion der
Zeit während
des Trennverfahrens verändert,
und die kritischste Phase kann einen ganz genauen Gradienten erfordern
oder für
manche Verfahren eine hoch präzise
isokratische (konstante Lösungsmittelkonzentration)
Zusammensetzung. Die Einstellungen der Ventile 26, 28 und 30 werden
durch herkömmliche
Ventilaktuatoren festgelegt, die ferngesteuert mithilfe von Signalen
an ein herkömmliches
Ventilkontrollgerät
festgelegt werden können.
Wie nachstehend detaillierter beschrieben stellt das Kontrollsystem
computergesteuerte Anweisungen bereit, welche die Einstellungen
der Ventile 26, 28 und 30 zu geeigneten
Zeitpunkten während
des Betriebs des Systems auf genaue Fließwerte festlegen.
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Auf ähnliche
Art und Weise stellt das Kontrollsystem computergesteuerte Anweisungen
zur Bereitstellung von Parametern für den Betrieb von Pumpe 38 bereit,
wie z.B. den Ein/Aus-Status der Pumpe und den Druck und die Fließgeschwindigkeiten
der Pumpe.
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Abflussleitung 44 der
Pumpe steht mit dem Inline-Mischer 46 in Verbindung, welche
den Flüssigkeitsfluss
zur vollständigen
Mischung der Komponenten durch den Mischer 46 leitet. Abflussleitung 48 für das Flüssigkeitsgemisch
steht mit der Schutzsäule 50 in
Verbindung, um das Flüssigkeitsgemisch
zu behandeln, um mehrwertige Metallkationen und andere Kontaminanten
zu entfernen, welche mit der Trennung der DNA-Fragmente interferieren
würden.
Schutzsäule 50 kann
ein Kationenaustauschharz in Natrium- oder Wasserstoffform zur Entfernung
von mehrwertigen Metallkationen mittels herkömmlichem Ionenaustausch enthalten.
Leitung 52 steht mit dem Abfluss der Schutzsäule und
einer Zuflussöffnung
eines Einspritzventils 54 für die Reinigungslösung in
Verbindung. Die Reinigungslösungszufuhrleitung 56 verbindet
Ventil 40 mit dem Reingungslösungseinspritzventil 54,
und Abfallproduktabflussleitung 58 führt zu Abfallprodukt. Leitung 60 führt vom
Reinigungslösungseinspritzventil 54 zum
Einspritzventil 62 für
die Probe.
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Der
Probenaliquotenselektierer 64 steht mit dem Probeneinspritzventil 62 durch
Probenleitung 66 in Verbindung. Abfallproduktleitung 68 führt vom
Einspritzventil weg und entfernt Abfallproduktflüssigkeiten. Details über den
Probenaliquotenselektierer 64 werden hierin nachstehend
in Bezug auf 3 bereitgestellt, und Details über die
Reinigungslösung
und die Probeneinspritzventile 54 und 62 und deren
Betrieb sind hierin nachstehend in Bezug auf 4–8 detaillierter
dargestellt.
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Im
Einspritzventil 62 wird die Probe in einen Strom von Lösungsmittel
und Trägerflüssigkeit
eingeführt, der
durch das Ventil von Leitung 60 geleitet wird. Die Probenleitung 70 steht
mit einer Abflussöffnung
des Einspritzventils 62 und mit dem Säulenvorfilter 74 im
Umluftofen 72 in Verbindung. Die Kapillarleitungsschlange 76 steht
mit dem Vorfilter 74 und dem Einlass von Trennsäule 78 in
Verbindung. Die ausgedehnte Länge
der Kapillarschlange 76 ermöglicht, dass von der im Umluftofen
erwärmten
Luft viel Wärme
in die Flüssigkeit
geleitet wird, die durch die Schlange geleitet wird, wodurch die
Flüssigkeit
in einem Bereich von ± 0,05°C einer gewählten Temperatur
gebracht wird. Der Umluftofen 72 schafft diese Temperatureinheitlichkeit
im Vorfilter 74, Schlange 76 und Trennsäule 78.
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Die
Trennsäule 78 wird
in eine herkömmliche
Säulenkonstruktion
mit Perlen gepackt, die eine einzigartige Trennoberfläche besitzt,
welche eine größenbasierte
Trennung von DNA-Fragmenten in Gegenwart eines übereingestimmten Gegenions
durch das MICP-Verfahren bewirkt. Das Trennverfahren und Details über die
Perlen sind hierin nachstehend detailliert beschrieben. Ein Strom
(Eluent), der nach Basenpaarlängen
getrennte DNA-Fragmente enthält,
fließt
von der Trennsäule 78 durch
eine Eluentenleitung 80.
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Analysatorleitung 82 steht
mit Leitung 80 in Verbindung, um einen Flüssigkeitsanteil
davon zur kontinuierlichen Messung mit einer Analysatorzelle 84 zu
entfernen. Die Analysatorzelle kann ein herkömmliches UV-Absorptionsmessgerät sein,
das das UV-Absorptionsausmaß der
nativen DNA-Fragmentstrukturen in der Flüssigkeit misst. Das Absorptiansausmaß ist eine
Funktion der Konzentration der DNA-Fragmente in der getesteten Flüssigkeit.
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Alternativ
dazu kann, wenn die DNA mit einem Fluoreszenzmarker markiert ist,
der Analysator, der das Ausmaß des
Fluoreszenzmarkers in der Flüssigkeit
kontinuierlich misst, durch die Detektion des Emissionsausmaßes bei
der Frequenz, die für
den Marker am angemessensten ist. Es ist offensichtlich, dass jedes
beliebige Analysesystem, das eine Eigenschaft einer Flüssigkeit,
die eine Funktion der sich darin befindenden Konzentration der DNA-Fragmente
ist, kontinuierlich messen kann, geeignet ist und dazu gedacht ist,
im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten zu sein. Abfallproduktleitung 86 entfernt
die getestete Flüssigkeit.
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Der übrige Abschnitt
des Eluenten wird zum Fragmentsammler 88 geleitet. Im Fragmentsammler 88 werden
die ausgewählten
Teile des Eluenten, der eine getrennte DNA-Fraktion enthält, in Phiolen
gesammelt, um später
verarbeitet und analysiert zu werden. Ungesammelte Fraktionen werden
durch Abfallproduktleitung 90 entfernt.
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Das
DNA-Trennverfahren wird durch die Gegenwart von mehrwertigen Kationen
gestört.
In der obigen Beschreibung wird das Flüssigkeitsfließsystem
als Reihe von Leitungen beschrieben. Die Leitungen sind Kapillarleitungen,
die ausgewählt
worden sind, um die Einführung
von mehrwertigen Kationen in die Flüssigkeiten zu vermeiden. Die
bevorzugten Kapillarleitungsmaterialien sind Titan und PEEK. Aus ähnlichen
Gründen
werden die anderen Komponenten des Systems bevorzugt aus Titan oder
PEEK hergestellt oder haben gegenüber der Flüssigkeit ausgesetzte Oberflächen, die
mit PEEK beschichtet sind, um sie vor Oxidation zu schützen und
die Einführung
von mehrwertigen Kationen in die Flüssigkeit zu vermeiden. Edelstahl
kann auch verwendet werden, unter der Voraussetzung, dass er behandelt
worden ist, um alle oxidierten Oberflächenmaterialien zu entfernen,
und die Lösungen,
welche die Edelstahloberflächen
kontaktieren, frei von gelöstem
Sauerstoff sind.
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2 ist
eine partielle schematische Darstellung eines Pumpensystems zur
Herstellung von Elutionlösungsmittelgradienten.
Dieses System beruht auf Dosierpumpen zur Kontrolle des Verhältnisses
von Lösungsmitteln
zu Trägerflüssigkeiten.
Die Einlässe
der Dosierpumpen 92, 94 und 96 stehen über ihre
jeweiligen Versorgungsleitungen 98, 100 und 102 mit
dem Entgaser 14 und über
ihre jeweiligen Abflussleitungen 104, 106, und 108 mit
dem Inline-Mischer 46 in Verbindung. Eine Pumpe 110 versorgt
das System durch eine optionale Leitung 112 mit Reinigungsflüssigkeit
aus Leitung 109. Eine optionale Leitung 113 kann
von Leitung 112 wegführen
und mit dem Inline-Mischer 46 in Verbindung stehen.
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3 ist
eine Vorderansicht einer Trennsäule
und eines Lösungsvorheizsystems
in einem Umluftofen. Das Verfahrenskompartiment der in 3 dargestellten
Ausführungsform
ist vom Heizkompartiment durch Rückenwand 114 getrennt,
in welcher sich eine Entlüftungsöffnung 116 befindet.
Ein Metallbalken 118, der einen Temperatursensor, wie z.B.
ein Thermoelement oder Thermister enthält, wird an Öffnung 116 positioniert,
um die Temperatur der durch diese Öffnung tretenden Luft zu messen.
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Kapillarleitung
120 führt von
Probeneinspritzer (nicht dargestellt) zu einem Vorfilter
122.
Vorfilter
122 ist ein Inline-Filter oder eine Schutzpatrone,
wie in US-Patent Nr. 5.772.889 beschrieben. Er entfernt Kontaminanten
von der einfließenden
Flüssigkeit.
Eine verlängerte
Schlange
124 der Kapillarleitung weist eine Zuflussendverbindung
mit Vorfilter
122 für
die Aufnahme von daraus herrührender
Flüssigkeit
auf. Die verlängerte Schlange
124 hat
ein Abflussende, das mit dem Zuflussende
126 der Trennsäule
128 in
Verbindung steht. Trennsäule
128 enthält MICP-Trennmedien,
die in
US 5.585.236
A , WO 9923257,
US 6066258 und
US 6056877 A beschrieben
sind. Abflussleitung
130 führt vom Abflussende
132 der
Trennsäule
128 zu
Detektor
76 (
1).
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Die
Schlange
124 ist eine Heizschlange für Flüssigkeiten, die aus einer DNA-kompatiblen Leitung,
die frei von mehrwertigen Kationen ist, bestehen, wie z.B. Titan
oder PEEK, wie in
US
5.772.889 A und
US 5997742
A beschrieben. Die verwendete Leitung kann eine beliebige
Länge und
einen beliebigen Durchmesser aufweisen, solange die Länge ausreicht,
um das Hindurchleiten der Flüssigkeit
zu ermöglichen,
um die Gleichgewichtstemperatur der Luft im Verarbeitungskompartiment
zu erreichen. Eine Leitungslänge
von 6 bis 400 cm und ein Leitungsinnendurchmesser von 0,14 bis 0,4
mm ist für
gewöhnlich
ausreichend. Da die Länge der
Leitung
124 die durch das System erreichte Trennung der
Komponenten nicht verschlechtert, kann die Länge basierend auf jener Länge ausgewählt werden,
die erforderlich ist, um eine wirkungsvolle Erwärmung der Verfahrensflüssigkeiten
zu erreichen.
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Luft
aus dem Verarbeitungsfach, das die Säule 128 enthält, wird
durch Öffnung 116 in
Wand 114 über ein
Heizungs-/Belüftungssystem
zur Temperaturmessung geleitet. Die angepasste Luft rezykliert zurück zum Verarbeitungskompartiment.
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Die
Heizschlange 124 stellt eine Fluidtemperaturgenauigkeit
im Bereich von ± 0,2°C bereit
und reduziert die Temperaturgleichgewichtszeit zwischen Temperatureinstellungen
auf unter 5 Minuten für
Temperaturänderungen
von 5°C
und unter 2 Minuten für
Temperaturänderungen
von bis zu 1°C.
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4 ist
eine partielle Explosionsdarstellung der physischen Struktur einer
repräsentativen
Trennsäule.
Die Säule
umfasst ein Säulenrohr 134 mit
externen Schrauben an beiden Enden. Das Rohr ist mit Trennmedium 136 gefüllt. Eine
Fritte 138 wird durch den Frittenstoppel 140 gegen
die obere Fläche
des Trennmediums gehalten. Eine interne Schraubkupplung 142 wird
am Ende des Rohrs 134 befestigt und erhält die Fritte 138 und
den Frittenstopel 140. Die interne Schraubkupplung 142 erhält die externe
Schraubkupplung 144 in einem verschraubten Verbund. Die
externe Schraubkupplung 144 hat einen intern verschraubten
Endrezeptor 146 zum Empfang einer Kapillarleitungsendverbindung
(nicht dargestellt).
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Das
Trennmedium
136 besteht aus organischen Polymermaterialien
oder anorganischen Materialien, die über die erforderliche Struktur
und nicht-polare Oberflächen
verfügen.
Geeignete Materialien sind in
US 6066258 A und
US 6056877 A beschrieben.
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Bei
wiederholter Verwendung wird das Trennmedium 136 aufgrund
von allmählicher
Verschmutzung der Medienoberfläche
durch Lösungen
und Proben, mit denen sie während
der Verwendung in Kontakt kommen, weniger wirksam. Weiters können wenig
Reste von DNA-Fragmenten sich der Entfernung während der normalen Reinigungsphase
des Verfahrens, bei welcher ein konzentriertes Antriebslösungsmittel
durch die Säule
geleitet wird, entziehen. Das Verfahren und das System dieser Erfindung
trägt hoch
wirksame Reinigungslösungen
auf die Oberfläche
des Trennmediums auf, um diese Reste und Kontaminanten zu entfernen, wodurch
das Trennmedium in einen voll wirksamen Zustand gebracht wird.
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5 ist
eine schematische Darstellung eines Reinigungslösungseinspritzventils 54,
das in 1 dargestellt ist. Dieselbe Struktur kann im Probeneinspritzventil 62,
das in 1 dargestellt ist, verwendet werden. Das Einspritzventil 150 ist
ein rotierendes Ventil mit sechs Anschlussstellen, das durch einen
herkömmlichen Ventilmotor
wie z.B. einen Schrittmotor (nicht dargestellt) betrieben werden
kann. Das Ventil hat sechs externe Anschlussstellen, die permanent
mit den Einlass- und Abflussleitungen verbunden sind. Die externe
Anschlussstelle 152 ist mit einer Einspritzleitung 154
zum Empfang der Reinigungslösung
verbunden. Der externe Anschluss 156 ist mit einer Säulenzufuhrleitung 158 verbunden,
die mit der Trennsäule 78 (1)
in Verbindung steht. Die externe Anschlussstelle 160 ist
mit einer Zuflussleitung 162 verbunden, die mit dem Abfluss von
Pumpe 38 (1) in Verbindung steht. Der
externe Anschluss 164 ist mit einer Abfallproduktleitung 166 verbunden.
Gegenüberliegende
Abflussanschlussstellen 168 und 170 stehen mit
den gegenüberliegenden Reinigungslösungseinlass-
und -abflussenden einer Reinigungslösungsschleife 172 in
Verbindung.
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Die
Verbindungen zwischen externen Anschlussstellen und internen Leitungen
und deren Betrieb im Reinigungslösungseinspritzventil 54 sind
in den 6 und 7 beschrieben. 6 und 7 beschreiben die
Verwendung des Ventils für
die Einspritzung in die gefüllte
Schleife, den Modus, der verwendet wird, wenn eine Reinigungsflüssigkeit
eingespritzt wird. 6 ist eine schematische Darstellung
eines Einspritzventils in der Reinigungslösungsbeladungsposition, und 7 ist
eine schematische Darstellung des Einspritzventils in der Einspritzposition.
In der in 6 dargestellten Beladungsposition
verbindet eine erste interner Leitung 174 des Ventils 150 das
erste Ende 176 der Schleife 172 mit der Reinigungslösungseinspritzleitung 154,
und eine zweite interne Leitung 178 verbindet das zweite
Ende 180 der Schleife 172 mit der Abfallproduktleitung 166. Eine
dritte interne Leitung 182 verbindet die Pumpenabflussleitung 162 mit
der Leitung 158 zur Trennsäule 78. Während die
Reinigungslösung
von der Einspritzstelle 154 in die Probenschleife 172 durch
Leitung 174 eingeführt
wird, wird jeglicher Überschuss
oder jegliche Flüssigkeit
in der Schleife 172 durch Leitung 178 in die Abgasleitung
ausgestoßen.
Gleichzeitig fließen
die Verfahrenslösungen
durch eine dritte Leitung 182 von der Pumpenleitung 162 zur
Trennsäule 70.
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Die
Rotation von Ventil 150 in die in 7 dargestellte
Einspritzposition bewegt die internen Leitungen, um eine andere
Reihe von Verbindungen mit den Zufluss- und Abflussleitungen herzustellen.
Die zweite Leitung 178 verbindet ein Ende 180 der
Schleife 172 mit Leitung 158, die zur Trennsäule führt, und
die erste Leitung 174 verbindet das andere Ende 176 der
Schleife 172 mit der Zuflussleitung 162, die zur
Pumpe führt. Die
Lösung
aus der Pumpe dringt in Leitung 174 ein und fließt durch
Schleife 172, wobei die Reinigungslösung in Leitung 158 ausgestoßen wird,
die zur Säule
führt,
und reinigt die Schleife weiterhin, wobei ein beliebiger Rest in
die Säulenleitung 158 transportiert
wird. Inzwischen verbindet Leitung 182 die Reinigungslösungseinspritzleitung 154 mit
Abfall, wobei das Durchfließen
der Reinigungslösung,
wenn gewünscht,
durch Leitung 182 ermöglicht
wird.
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Die
hierin beschriebenen Verfahren haben sich auf die Wiederherstellung
der Trennmedienoberflächen
durch Einspritzung einer Reinigungslösung mit Einspritzventil 54 konzentriert.
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Die
letzte Phase jeder Trennung umfasst das Durchleiten einer wässrigen
Lösung
mit einer maximalen (z.B. 25%) Konzentration eines Strippinglösungsmittels
aus Reservoir 4, um eine beliebige verbleibende DNA von
der Oberfläche
des Trennmediums zu entfernen und die Säule für den nächsten Durchgang vorzubereiten. Die
Einstellungen der Ventile 26, 28 und 30 werden
auf die Ausgangsposition zurückgebracht,
d.h. auf die erforderlichen Einstellungen zur Durchführung der
Bindung der nächsten
Proben-DNA-Fragmente auf die Oberfläche des Trennmediums. Als alternatives
Verfahren können
am Ende jedes Durchgangs die Reinigungslösungen von Reservoir 16 routinemäßig durch
Ventil 54 in das System eingespritzt werden, um die Oberflächen des
Trennmediums in Trennsäule 76 zu
regenerieren und zu reinigen. Während
dieses alternative Verfahren läuft,
können
die Ventile 26, 28 und 30 wieder in die
Ausgangsposition zurückgebracht
werden. Dies kann die Zeit für
jeden Trennzyklus verringern und den tatsächlichen Durchsatz des Säulensystems
erhöhen.
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Dieses
Verfahren stellt eine verlässliche
Einspritzung eines Volumens einer Reinigungslösung in die Leitung bereit,
die zu Trennsäule 78 (1)
führt,
wobei die Flüssigkeit
durch Vorfilter 74, die temperaturregulierende Schleife 76 fließt, bevor
die Trennsäule 78 erreicht
wird, wobei alle Oberflächen
gereinigt werden, mit welchen sie durch die Einspritzung über das übrige System
in Kontakt treten.
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Die
Reinigungslösungen,
die durch die Trennsäulen
geleitet werden, können
aus jedem beliebigen Material bestehen, das die akkumulierten Oberflächenrückstände und
alle beliebigen anderen verbleibenden DNA-Materialien aus der Trennsäule, dem
Vorfilter und allen Kapillarleitungsoberflächen stromab der Einspritzung
wirkungsvoll entfernt. Die Reinigungslösung darf keine der Oberflächen angreifen
oder verschlechtern, mit welchen sie in Kontakt tritt. Geeignete
Reinigungslösungen
und Materialien, die sie von der Säule entfernen, sind in Tabelle
A angeführt.
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Zur
Entfernung von DNA-Resten sind Natrium-EDTA-Lösungen mit einem pH von bis
zu 13 und solche, die erwärmt
werden können,
besonders zur Einspritzung zweckdienlich, obwohl niedrigere pHs
empfohlen sind, wenn das Trennmedium empfindlich auf alkalische
Lösungen
reagiert, z.B. Kieselgelteilchen und dergleichen.
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Größere DNA-Kontaminanten
wie z.B. genomische DNA können
nicht mit normalen Lösungsmittellösungen von
der Säule
entfernt werden. Diese und andere Polynucleotidkontaminanten können durch
den Verdau dieser in kleinere Fragmente unter Einsatz von Enzymen,
wie z.B. RNAse und DNAZAP (Ambion, Austin, TX), entfernt werden.
Die Verdauprodukte werden durch den Fluss von Lösungsmittellösungen durch
die Säule entfernt.
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Diese
Erfindung wird durch die folgenden spezifischen, aber nicht einschränkenden
Beispiele veranschaulicht, worin Laborverfahren, die beendet worden
waren, im Perfekt präsentiert
werden und Verfahren, die nicht beendet worden sind und konstruktiv
auf die Praxis in dieser Anwendung reduziert worden sind, im Präsens präsentiert
werden.
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BEISPIEL 1
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Reinigung
einer kontaminierten Säule
mit einem Methanolreinigungsmittel
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Ein
Trenngradientenverfahren wurde auf einer Trennsäule durchgeführt, die
alkylierte Styrol-Divinylbenzol-Perlen (DNASepTM-Säule, 50
mm × 4,6
mm Innendurchmesser, Transgenomic, Inc.) enthielt, die bei wiederholter
Anwendung wirkungslos geworden sind. Der Grund für einen Verlust der Trennwirksamkeit
ist unbekannt.
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Die
Säule wurde
dreimal getestet, die Detektorausgabechromatogramme für jeden
Test sind in den 8 und 9 dargestellt.
Im Verfahren, das 8 produzierte, wurde die Säule durch
das Leiten eines Standardlösungsmittelgradienten
durch die Säule
getestet, während
die Ausgabefraktionen detektiert wurden. Es wurden vor diesem Verfahren
keine DNA-Fragmente injiziert, und beliebige eluierte Materialien
repräsentierten
Kontaminanten in der Säule.
In diesem Verfahren bestand die mobile Phase mit pH 7 aus Komponente A,
0,1 M Triethylammoniumacetat (TEAA), und einer Komponente B, 0,1
M TEAA und 25% Acetonitril. Die durch die Säule geleitete Flüssigkeit
wurde durch Mischung von Teilen von Komponente B mit Komponente
A geformt. Die bei der Trennung verwendeten Gradientenbedingungen
waren 35 bis 55% B in drei Minuten, gefolgt von 55 bis 65% B in
sieben Minuten, 65% B für
2,5 Minuten, 100% B (Säulenwaschung)
für 1,5
Minuten und 35% B für
2 Minuten, um die Säule
für die
nächste
Probenanwendung zu äquilibrieren.
Der Gegendruck lag bei 2100 psi, die Temperatur bei 50°C, die UV-Detektion
bei 260 nm, die Fließgeschwindigkeit
bei 0,75 ml/min. Das bei dieser Elution erhaltene Chromatogramm
ist in 8 dargestellt. Obwohl kein Polynucleotid in die
Säule injiziert
worden ist, wurden einige Materialien auf der Säule eluiert und erschienen
im Chromatogramm als Peak bei einer Retentionszeit von 16 Minuten.
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Das
Chromatogramm aus 9(a) vor der Reinigung
wurde mit einem Standardgemisch aus DNA-Fragmenten mithilfe eines
Testtrennverfahrens erhalten, um die Trennleistung der Säule zu bestimmen. In
diesem Verfahren wurde eine 5-μl-Standardprobe
von 0,2 μg
pUC18-HeaIII-Restriktionsverdau (Nr. D6293, Sigma/Aldrich Chemical
Co.), der 80, 102, 174, 257, 167, 298, 434, 458, 587 Basenpaar-DNA-Fragmente enthielt,
auf die Säule
injiziert und die Fragmente unter Gradientenbedingungen eluiert.
Die mobile Phase mit pH 7 enthielt Komponente A, 0,1 M Triethylammoniumacetat
(TEAA), und Komponente B, 0,1 M TEAA, 25% Acetonitril. Die Gradientenbedingungen,
die bei der Trennung angewendet wurden, waren 35 bis 55% B in drei Minuten,
gefolgt von 55 bis 65% B in sieben Minuten, 65% B in 2,5 Minuten,
100% B (Säulenwaschung)
für 1,5
Minuten und 35% B für
2 Minuten, um die Säule
für die
nächste
Probenanwendung zu äquilibrieren.
Der Gegendruck betrug 2100 psi, die Temperatur 50°C, die UV-Detektion
lag bei 260 nm, die Fließgeschwindigkeit bei
0,75 ml/min. Das Chromatogramm aus 9 wurde
erhalten. Es sollte erwähnt
werden, dass zusätzlich zu
den Peaks, die Peaks darstellen, die den Fraktionen der getrennte
DNA entsprechen, weitere Säulenverunreinigung
als Peak bei 16 Minuten auftrat.
-
Die
Säule wurde
dann gereinigt, indem sie mit 100% Methanol 45 Minuten lang (1 ml/min,
T = 50°C) gewaschen
wurde, um Kontaminanten von der stationären Phase zu entfernen. Nach
etwa 10–15
min nahm der Druck von 120 bar auf 240–260 bar zu. Nach weiteren
20 min sank der Druck wieder auf 110–115 bar. Er blieb bei 110
bar bis zum Ende des Waschverfahrens konstant.
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Das
Chromatogramm aus 9(b) nach der Waschung
wurde durch Wiederholung des Trennverfahrens mit dem Standardgemisch
aus DNA-Fragmenten erhalten. Eine S-μl-Standardprobe aus 0,2 μg pUC18-HeaIII-Restriktionsverdau
(Nr. D6293, Sigma/Aldrich Chemical Co.), der 80, 102, 174, 257,
167, 298, 434, 458, 587 Basenpaar-DNA-Fragmente enthielt, wurde
auf die gereinigte Säule
injiziert. Die mobile Phase mit pH 7 enthielt Komponente A, 0,1
M Triethylammoniumacetat (TEAA), und Komponente B, 0,1 M TEAA, 25%
Acetonitril. Die Gradientenbedingungen, die bei der in 9 gezeigten
Trennung verwendet wurden, waren 35 bis 55% B in drei Minuten, gefolgt
von 55 bis 65% B in sieben Minuten, 65% B für 2,5 Minuten, 100% B (Säulenwaschung)
für 1,5
Minuten und 35% B für
2 Minuten, um die Säule
für die
nächste
Probenanwendung zu äquilibrieren.
Der Gegendruck war 2100 psi, die Temperatur lag bei 50°C, die UV-Detektion
bei 260 nm, die Fließgeschwindigkeit
bei 0,75 ml/min.
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Im
Chromatogramm aus 9 sind die mV-Zahlen auf der
rechten Seite des Chromatogramms dargestellt, um die Chromatogramme
der 9(a) und 9(b) zum
einfachen Vergleich gemeinsam zu präsentieren. Es ist kein ausgeprägter Kontaminantenpeak
bei 16 Minuten sichtbar, was zeigt, dass der Kontaminant entfernt
worden war. Die Retentionszeiten der Fragmente wurden auf jene Zeiten
erhöht,
die für
eine wirksame Säule
erwartet wurden. Anzumerken ist der Anstieg der Abstände zwischen
den Peaks.
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BEISPIEL 2
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Reinigung einer kontaminierten
Säule mit
erwärmten
Tetranatrium-EDTA in Pufferlösung
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Eine
kontaminierte Trennsäule,
die alkylierte Styrol-Divinylbenzol-Perlen (DNASepTM-Säule, 50 mm × 4,6 mm Innendurchmesser,
Transgenomic Inc.) enthielt, ist bei wiederholter Verwendung wirkungslos
geworden. Es wird davon ausgegangen, dass der Grund für den Verlust
der Trennwirksamkeit die Anhäufungen mehrwertiger
Ionen und/oder genomischer DNA auf der Säule sind.
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Die
Säule wurde
mit 50% Puffer B (0,1 M TEAA, 25% Acetonitril) und 50% Puffer C
(50 mM Tetranatrium-EDTA) 30 Minuten lang bei 1 ml/min bei 75°C behandelt.
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Die
Säule wurde
dann mithilfe eines Trennverfahrens unter Einsatz von pUC18-HeaIII-Verdau als Standardtestgemisch
der DNA-Fragmente getestet. Eine 5-μl-Standardprobe des Verdaus wurde auf
die Säule injiziert,
und die Fragmente wurden unter Gradientenbedingungen eluiert, um
ein Referenzchromatogramm wie in 10 dargestellt
zu produzieren. Das Chromatogramm zeigt, dass die Säule auf
die ursprünglichen Leistungseigenschaften
zurückgebracht
worden war, was zeigte, dass das Reinigungsverfahren die Kontaminanten
entfernte.
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BEISPIEL 3
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Reinigung
einer kontaminierten Säule
mit einem Acetonitril-Reinigungsmittel
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Ein
Trenngradientenverfahren wurde auf einer Trennsäule durchgeführt, die
alkylierte Styrol-Divinylbenzol-Perlen (DNASep®-Säule, 50
mm × 4,6
mm Innendurchmesser, Transgenomic, Inc.) enthielt, die bei wiederholter
Anwendung wirkungslos wurden. Der Grund für den Verlust der Trennwirksamkeit
war unbekannt.
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Die
Säule wurde
durch die Ausführung
von 60 Injektionen von 5 μl
1X Pfu-Puffer (Stratagene) getestet, der TritonX-100 und BSA enthielt.
Bei diesem Verfahren bestand die mobile Phase aus Komponente A,
0,1 M Triethylammoniumacetat (TEAA), Konponente B, 0,1 M TEAA und
25% Acetonitril, und Komponente C, 75% Acetonitril in Wasser. Die
Flüssigkeit,
die durch die Säule
geleitet wurde, wurde durch die Mischung von Anteilen der drei Komponenten
hergestellt. Die bei der Trennung verwendeten Gradientenbedingungen
waren folgende:
-
Die
Temperatur betrug 50°C,
die UV-Detektion lag bei 260 nm, und die Fließgeschwindigkeit betrug 0,75
ml/min.
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In
diesem Verfahren wurde eine 7-μl-Standardprobe
von 0,2 μg
pUC18-HAEIII-Restriktionsverdau
(Nr. D6293, Sigma/Aldrich Chemical Co.), der 80, 102, 174, 257,
267, 298, 434, 458, 587 Basenpaar-DNA-Fragmente enthielt, auf die
Säule injiziert,
und die Fragmente wurden unter den oben angeführten Gradientenbedingungen
eluiert.
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11 zeigt
die Trennung von pUC-HeaIII-Verdau vor Injektion eines Pfu-Puffers
auf die Säule.
Die 12 bis 14 zeigen
die Trennung des pUC-HeaIII-Verdaus nach jeweils 20 Injektionen
eines Pfu-Puffers für
drei Reihen von 20 Injektionen.
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In 11 wies
das 587-bp-Fragment eine Retentionszeit von 13,11 Minuten auf. 12 zeigt
dasselbe Fragment, das 13,08 Minuten nach 20 Pfu-Puffer-Injektionen
auftrat. Die 13 und 14 zeigen
dasselbe Fragment nach 40 bzw. 60 Pufferinjektionen. Die Retentionszeiten
dieser betragen beide 13,11 Minuten.
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BEISPIEL 4
-
Reinigung
einer kontaminierten Säule
mit einem Acetonitrilreinigungsmittel
-
Ein
Trenngradientenverfahren wurde auf einer Trennsäule durchgeführt, die
alkylierte Styrol-Divinylbenzol-Perlen enthielt (DNASep®-Säule, 50
mm × 4,6
mm Innendurchmesser; Transgenomic, Inc.), die bei wiederholter Verwendung
wirkungslos wurden. Der Grund für
den Verlust der Trennwirksamkeit war unbekannt.
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Die
Säule wurde
durch die Ausführung
von 60 Injektionen von 5 μl
1X-Pfu-Puffer (Stratagene), der TritonX-100 und BSA enthielt, durchgeführt. In
diesem Verfahren bestand die mobile Phase aus Komponente A, 0,1
M Triethylammoniumacetat (TEAA), Komponente B, 0,1 M TEAA und 25%
Acetonitril, und Komponente C, 75% Acetonitril in Wasser. Die Flüssigkeit,
die durch die Säule
geleitet wurde, wurde durch die Mischung von Anteilen der drei Komponenten
gebildet. Die bei den Pfu-Injektionen
verwendeten Gradientenbedingungen waren folgende:
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Die
Temperatur betrug 50°C,
die UV-Detektion lag bei 260 nm, und die Fließgeschwindigkeit betrug 0,9
ml/min.
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In
diesem Verfahren wurde eine Standardprobe eines 209-Basenpaarfragments
(als Mutationsstandard von Transgenomic, Inc. zu beziehen) des menschlichen
Y-Chromosoms, Locus
DYS271 mit einer A-zu-G-Mutation an Position 168, hybridisiert.
Die Standardprobe, die ein heterozygotes Gemisch aus 209-Basenpaarhomoduplexfragmenten
enthielt, worin die mutierten Fragmente eine Einzelbasenpaarabweichung vom
Wildtyp enthielten, wurde durch Erwärmung und Kühlung hybridisiert. Das Hybridisierungsverfahren
schuf wie in 15 schematisch dargestellt zwei
Homoduplexe und zwei Heteroduplexe.
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5 μl der hybridisierten
Probe wurden nach jeder Reihe von 20 Pfu-Injektionen für insgesamt
drei Reihen auf die Säule
injiziert, und die 209-Mutationsstandardfragmente wurden unter den
folgenden Gradientenbedingungen eluiert:
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16 zeigt
die Trennung des hybridisierten 209-Mutationsstandards vor einer
Injektion des Pfu-Puffers auf die Säule. Die 17 bis 19 zeigen
die Trennung des 209-Standards nach jeweils 20 Injektionen des Pfu-Puffers
für drei
Reihen von 20 Injektionen. Alle 16 bis 19 zeigen,
dass Heteroduplexe bei 3,5 bis 4 Minuten beständig eluieren und die Homoduplexe
bei 4,5 bis 5 Minuten eluieren, mit vergleichbarer Auflösung und
Trennung.
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BEISPIEL 5
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Einfluss des TWEEN-20-Tensids
auf die Säulenleistung
und die Lebenszeit der Säule
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Tenside,
wie z.B. TWEEN-20, TRITON-X100 und N-40, liegen in PCR-Reagenzien
vor, um Enzyme zu solubilisieren und sie in Lösung zu behalten. (TWEEN ist
eine registrierte Marke von ICI America Inc. TRITON ist eine registrierte
Marke der Rohm und Haas Company). Jedoch können die Tenside aufgrund ihrer
hydrophoben und oberflächenaktiven
Eigenschaften mit dem Trennmechanismus auf der Säule interferieren und die verwendbare
Lebenszeit der Säule
verringern.
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Für dieses
Beispiel wurde eine DNASep®-Säule mit 50 mm × 4,6 mm
Innendurchmesser (Transgenomic, Inc.) mit Aufschraub-PEEK-Enden
verwendet. Die Säulenleistung
wurde nach einer Reihe von Tensidbehandlungen durch die Analyse
von Standard-pUC18-HeaIII getestet.
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20 veranschaulicht
eine pUC18-HeaIII-Verdautrennung, bevor die Säule dem Tensid gegenüber exponiert
wurde. Die Probe wurde injiziert, und die Säule wurde unter den in Beispiel
1 beschriebenen Bedingungen eluiert.
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21 zeigt
die Säule
nach 20 15-μl-Injektionen
von 0,1% (Vol.-%) wässriger
TWEEN-20-Lösung (Sigma
Chemicals, P-7949). Die Retentionszeiten und die Auflösung ging
zurück,
und es wurde Ansteigen der Peaks beobachtet.
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22 zeigt
dieselbe Säule
nach weiteren 20 15-μl-Injektionen
von 0,1% TWEEN-20.
An diesem Punkt war eine Gesamtzahl von 600 μl von 0,1% TWEEN-20 auf die
Säule injiziert
worden, was zu einer weiteren Verschlechterung der Trennleistung
führte.
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23 zeigt
das Ergebnis einer Injektion von pUC18-HeaIII-Verdau, nachdem die
mobile Phase, die 35% B enthielt, etwa 5 Stunden lang bei 50°C und bei
einer Geschwindigkeit von 0,75 ml/min durch die Säule gepumpt
worden war. Die Peaks zeigten ein Ansteigen, die Auflösung war
verschlechtert, und die Retentionszeiten nahmen ab.
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24 zeigt
das Ergebnis einer Injektion von pUC18-HeaIII-Verdau auf die in 23 beschriebene Säule, die
mobile Phase wird aber gegen die Packrichtung laufen gelassen. Dies
wurde durchgeführt,
um zu zeigen, ob das Ansteigen auf ein gebrochenes Säulenbett
zurückzuführen war.
Das Ansteigen war noch immer sichtbar, was anzeigte, dass das Säulenbett
nicht gebrochen war.
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25 zeigt
das Ergebnis einer Injektion von pUC18-HeaIII-Verdau auf die in 24 verwendete Säule nach
einem 45-minütigen
Waschschritt (bei einer Säulentemperatur
von 50°C)
mit 100% Methanol.
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26 zeigt
das Ergebnis einer Injektion von pUC18-HeaIII-Verdau auf die in 25 verwendete Säule nach
3 Tagen, an welchen etwa 30 pUC18-HeaIII-Verdautrennungen durchgeführt wurden.
Es war keine Verschlechterung der Trennleistung sichtbar.
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27 fasst
Ergebnisse der 20-22 zusammen.
Datenpunkt 200 zeigt die Retentionszeit (Rt) des 587-bp-Peaks
vor den TWEEN-20-Injektionen. Datenpunkt 202 zeigt die
Rt des 587-bp-Peaks nach 20 15-μl-Injektionen
von 0,1% TWEEN-20-Lösungen.
Datenpunkt 204 gibt die Rt des 587-bp-Peaks nach zwanzig weiteren
Injektionen von 0,1% TWEEN-20-Lösung
an.
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BEISPIEL 6
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Behandlung
der Trennsäule
mit EDTA-Lösung
-
Nach
jeweils 200 Injektionen wird die Säule mit zwei Injektionen von
100 μl von
0,2 M wässriger
EDTA-Lösung
und durch die Elution der Säule
nach jeder Injektion unter Einsatz der in Beispiel 1 beschriebenen Elutionsbedingungen
behandelt.