DE60032184T2

DE60032184T2 - Verfahren zur verbesserung der gentransfer-effizienz in pflanzenzellen

Info

Publication number: DE60032184T2
Application number: DE60032184T
Authority: DE
Inventors: Yukoh Japan Tobacco Inc. Plant Breed Toyoda-cho HIEI; Keisuke Japan Tobacco Inc. Plant Bre Toyoda-cho Iwata-gun KASAOKA; Yuji Japan Tobacco Inc. Plant Breedi Toyoda-cho Iwata-gun ISHIDA
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 2000-08-03
Filing date: 2000-08-03
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2020-08-04
Also published as: AU785287B2; US20110030100A1; AU6317900A; EP1306440A1; KR20020092915A; US20110209251A1; CA2386125C; EP1306440A4; US9840714B2; US7960611B2; ES2277592T3; CN1268752C; PT1306440E; KR100807434B1; CA2386125A1; WO2002012520A1; EP1306440B1; DE60032184D1; CN1377420A; DK1306440T3

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Fördern der Effizienz der Geneinführung in Pflanzenzellen.
STAND DER TECHNIK
Das Verfahren zur Transformation unter Verwendung von Agrobacterium hat eine Anzahl ausgezeichneter Merkmale einschließlich im allgemeinen der hohen Effizienz, der kleinen Anzahl von Kopien des eingeführten Gens, des Merkmals, daß das Gen ohne Fragmentierung einer T-DNA genannten speziellen Region eingeführt werden kann, und des Merkmals, daß die Frequenz der Mutation, erfolgt während der Kultivierung, niedrig ist, weil Transformanten durch Kultivierung für einen kurzen Zeitraum erhalten werden können. Daher wird das Verfahren weitverbreitet als das brauchbarste Verfahren zum Transformieren verschiedener Pflanzen verwendet.
Wenn auch das Agrobacterium-Verfahren ein äußerst ausgezeichnetes Verfahren zum Transformieren von Pflanzen ist, ist, ob die Transformation erfolgreich ist oder nicht, von der Pflanzenspezies, dem Genotyp und dem Pflanzengewebe, die verwendet werden, abhängig und variiert die Transformationseffizienz in großem Maße (Potrykus et al. 1998 (Referenz (33))). Das heißt, es gibt Spezies, bei denen die Transformation nicht erfolgreich gewesen ist, und Spezies, bei denen die Transformation nur mit begrenzten Varietäten erreicht werden kann. Weiterhin gibt es Spezies, bei denen das zu verwendende Gewebe begrenzt ist, so daß eine große Menge von Materialien nicht behandelt werden kann. Um eine praktische Varietät durch genetische Rekombination herzustellen, ist es notwendig, eine große Anzahl transformierter Pflanzen herzustellen und die Linie mit dem gewünschten Charakter daraus auszuwählen. Jedoch ist gegenwärtig der Typ von Pflanzen, bei denen eine große Anzahl transformierter Pflanzen für diesen Zweck hergestellt werden kann, begrenzt. So wird nachdrücklich gefordert, ein verbessertes Verfahren auszuwählen, durch welches dieses Problem überwunden werden kann.
Obwohl das Verfahren zur Transformation über Agrobacterium sich in dem Ausgangsmaterial, der Zusammensetzung des Kulturmediums und dergleichen unterscheidet, ist es für das Agrobacterium-Verfahren fast allgemein üblich, daß das Verfahren Herstellen des Kontakts eines Gewebes, welches ein Ausgangsmaterial ist, mit einer Suspension von Agrobacterium, Auswählen transformierter Zellen nach dem Cokultivieren und Züchten transformierter Pflanzen umfaßt. Das Agrobacterium wird infiziert, ohne eine spezielle Behandlung durchzuführen, ausgenommen eine Sterilisationsbehandlung, die wie erforderlich ausgeführt wird (Rogers et al. 1988 (Referenz 34)), Visser 1991 (Referenz 38)), McCormick 1991 (Referenz 29)), Lindsey et al. 1991 (Referenz 28))).
EP-A-0116718 (Max Planck Gesellschaft) offenbart die Zentrifugation von Protoplastmaterial vor der Infektion durch Agrobakterien. WO 96/29419 A offenbart die Zentrifugation von Mikrosporen nach der Cokultivierung mit Agrobakterien.
So sind Untersuchungen zum Verbessern des Transformationssystems hauptsächlich mit dem Agrobacterium-Stamm, der Konstitution des Vektors, der Zusammensetzung des Mediums, den Typen von Selektionsmarkergen und Promotor, dem Typ des als Material verwendeten Gewebes und dergleichen ausgeführt worden.
Andererseits sind Untersuchungen zum Verändern der Pflanzengewebe vor der Infektion mit Agrobacterium zu einem physiologischen Zustand, in welchem es wahrscheinlich ist, daß die Gene eingeführt werden, kaum gemacht worden. Wenn der physiologische Zustand des Gewebes durch eine einfache Behandlung zu einem derartigen physiologischen Zustand verändert werden kann, ist das Verfahren sehr nützlich, und es wird erwartet, daß zusätzlich zu der Förderung der Transformationseffizienz Transformation für die Spezies oder die Genotypen erreicht werden kann, mit denen Transformation bisher schwierig gewesen ist, das ist ein hervorragender Effekt. Bekannte Untersuchungen über die Vorbehandlung von Pflanzengewebe schließen Behandlung mit der Teilchenkanone (Bidney et al., 1992 (Referenz (5))) und Ultraschallbehandlung (Trick et al., 1997 (Referenz (37))) ein. Beide von diesen Verfahren haben das Ziel, die Invasion von Bakterien in das Pflanzengewebe zu fördern, indem physikalisch das Gewebe verletzt wird, um die Anzahl von infizierten Pflanzenzellen zu erhöhen. Jedoch sind diese Verfahren nicht mehr als Entwicklungen des Blattscheibenverfahrens (Horsch et al., 1985 (Referenz (17))) und nicht Behandlungen, die auf neuen Konzepten basieren. Der Grad der Wirksamkeit und die Universalität der Verfahren sind nicht geklärt worden und sie werden nicht als allgemeine Verfahren verwendet.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Fördern der Effizienz der Geneinführung in Pflanzenzellen bereitzustellen, durch welches Geneinführung einfach mit einer höheren Effizienz als der der herkömmlichen Geneinführung durch das Agrobacterium-Verfahren erreicht werden kann, ohne das Gewebe zu verletzen.
Die Erfinder haben intensiv geforscht, um zu entdecken, daß in dem Geneinführungsverfahren unter Verwendung von Agrobacterium die Geneinführungseffizienz signifikant durch Zentrifugieren der Pflanzenzellen oder des Pflanzengewebes, die der Geneinführung unterworfen werden, gefördert werden kann, wodurch die vorliegende Erfindung abgeschlossen wurde.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Fördern der Effizienz der Geneinführung in Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe von einkeimblättrigen Angiospermen durch ein Bakterium, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, bereit, wobei das Verfahren Zentrifugieren der Zellen der einkeimblättrigen Pflanzen oder des Pflanzengewebes unter einer zentrifugalen Beschleunigung von 1000 g bis 150000 g für 1 Sekunde bis 4 Stunden umfaßt, wobei die Geneinführung nach dem Zentrifugieren der Pflanzenzellen oder des Pflanzengewebes ausgeführt wird; oder die Pflanzenzellen oder das Pflanzengewebe mit dem Bakterium in Kontakt gebracht werden, während die Zentrifugation durchgeführt wird.
Durch die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zum Fördern der Effizienz der Geneinführung in Pflanzenzellen, durch welches Geneinführung einfach mit einer höheren Effizienz als der der herkömmlichen Geneinführung durch das Agrobacterium-Verfahren erreicht werden kann, ohne das Gewebe zu verletzen, bereitgestellt worden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Zeichnung, um ein Verfahren zum Konstruieren von pTOK233 zu zeigen, welches ein Beispiel von superbinären Vektoren ist, das vorzugsweise in der vorliegenden Erfindung angewendet werden kann.
2 ist eine Genkarte von pSB133, welches ein Beispiel von superbinären Vektoren ist, das vorzugsweise in der vorliegenden Erfindung angewendet werden kann.
3 ist eine schematische Ansicht, um das intermediäre Vektorsystem und binäre Vektorsystem zu zeigen, welche die hauptsächlichen zwei Vektorsysteme von Bakterien, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, sind.
4 ist eine schematische Ansicht, die zwei binäre Vektorsysteme, abgeleitet von dem supervirulenten Stamm A281 von Agrobacterium tumefaciens, zeigt.
In den vorstehenden Zeichnungen bezeichnen die folgenden Referenzsymbole die folgenden Bedeutungen.

virB: das virB-Gen in der Virulenzregion des Ti-Plasmids pTiBo542, enthalten in Agrobacterium tumefaciens A281
virC: das virC-Gen in der Virulenzregion des Ti-Plasmids pTiBo542, enthalten in Agrobacterium tumefaciens A281
virG: das virG-Gen in der Virulenzregion des Ti-Plasmids pTiBo542, enthalten in Agrobacterium tumefaciens A281
BL: linke Grenzsequenz von T-DNA von Bakterien, gehörend zu der Gattung Agrobacterium
BR: rechte Grenzsequenz von T-DNA von Bakterien, gehörend zu der Gattung Agrobacterium
TC: Tetracyclin-resistentes Gen
SP: Spectinomycin-resistentes Gen
IG: Intron-GUS-Gen
HPT: Hygromycin-resistentes Gen
K: Stelle des Restriktionsenzyms KpnI
H: Stelle des Restriktionsenzyms HindIII
Ampr: Ampicillin-resistentes Gen
BAR: bar-Gen
Pnos: Promotor von Nopalin-Synthetase-Gen
Tnos: Terminator von Nopalin-Synthetase-Gen
P35S: CaMV-355-Promotor
COS, cos: COS-Stelle des λ-Phagen
ORI, ori: Replikationsursprung von ColE1
NPT, NPTII Kanamycin-resistentes Gen
Vir: gesamte vir-Region des Ti-Plasmids von Bakterien, gehörend zur Gattung Agrobacterium
S Vir: gesamte vir-Region des Ti-Plasmids pTiBo542 von supervirulenten Bakterien, gehörend zur Gattung Agrobacterium
s vir*: Fragment, enthaltend einen Teil der vir-Region des Ti-Plasmids pTiBo542

BESTE ART ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Fördern der Effizienz der Geneinführung in Pflanzenzellen durch ein Bakterium, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, umfaßt Zentrifugieren der Pflanzenzellen oder des Pflanzengewebes. Die Pflanzenzellen oder das Pflanzengewebe können mit dem Bakterium, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, unter normaler Schwerkraft nach dem Zentrifugieren der Pflanzenzellen oder des -gewebes in Kontakt gebracht werden oder die Pflanzenzellen oder das -gewebe können mit dem Bakterium, gehörend zur Gattung Agrobacterium, während des Zentrifugieren der Pflanzenzellen oder des -gewebes in Kontakt gebracht werden.
Die Bedingungen für die Zentrifugation sind 1000 g bis 150000 g. Die Zeit für die Zentrifugation kann abhängig von der zentrifugalen Beschleunigung, dem Typ der verwendeten Pflanze und so weiter geeignet ausgewählt werden und beträgt nicht weniger als eine Sekunde. Wenn die zentrifugale Beschleunigung groß ist, kann die Effizienz der Einführung von Genen signifikant gefördert werden, sogar wenn die Zentrifugationszeit sehr kurz, zum Beispiel 1 Sekunde, ist. Andererseits kann, wenn die zentrifugale Beschleunigung klein ist, die Effizienz der Einführung von Genen signifikant gefördert werden, indem die Zentrifugation für eine lange Zeit durchgeführt wird. Die geeigneten Zentrifugationsbedingungen für die speziellen Pflanzenzellen oder das Gewebe können leicht durch ein Routineexperiment ausgewählt werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist durch Verwendung der Pflanzenzellen oder des Pflanzengewebes, welche zentrifugiert werden, oder durch Inkontaktbringen der Pflanzenzellen oder des Pflanzengewebes mit einem Bakterium, gehörend zur Gattung Agrobacterium, während des Durchführens der Zentrifugation gekennzeichnet und als Verfahren zur Geneinführung oder Transformation per se unter Verwendung des Bakteriums, gehörend zur Gattung Agrobacterium, kann ein bekanntes Verfahren angewendet werden wie es ist.
Das Verfahren zur Geneinführung oder Transformation per se in Pflanzen unter Verwendung eines Bakteriums, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, ist auf dem Fachgebiet bekannt und wird weitverbreitet verwendet.
Es ist seit einer langen Zeit bekannt, daß ein Bodenbakterium Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens) Wurzelhalskrankheit in einer Anzahl von zweikeimblättrigen Pflanzen verursacht. In den 1970ern wurde entdeckt, daß das Ti-Plasmid die Virulenz betrifft und daß die T-DNA, welche ein Teil des Ti-Plasmids ist, in das Pflanzengenom eingeschlossen wird. Danach wurde nachgewiesen, daß die T-DNA Gene enthält, die an der Synthese von Hormonen (Cytokine und Auxine) teilnehmen, die zur Induktion von Tumor erforderlich sind, und daß die Gene trotz der Tatsache, daß die Gene bakterielle Gene sind, in Pflanzen exprimiert werden. Eine Gruppe von Genen, existierend in der Virulenzregion (vir-Region) in dem Ti-Plasmid, ist für die Excision von T-DNA und ihren Transfer in Pflanzen erforderlich und die Grenzsequenzen, existierend an beiden Enden der T-DNA, sind notwendig, damit die T-DNA exzidiert wird. Agrobacterium rhizogenes, welches ein anderes Bakterium, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, ist, hat ein ähnliches System an dem Ri-Plasmid (3 und 4).
Da T-DNA in das Pflanzengenom durch Infektion mit Agrobacterium eingeschlossen wird, wird erwartet, daß ein gewünschtes Gen in das Pflanzengenom durch Insertieren des gewünschten Gens in die T-DNA eingeschlossen werden kann. Jedoch war es, da das Ti-Plasmid so groß wie nicht weniger als 190 kb ist, schwierig, ein Gen durch eine Standardtechnik der genetischen Manipulation in die T-DNA zu insertieren. So wurde ein Verfahren zum Einführen eines fremden Gens in die T-DNA entwickelt.
Zuerst wurden entschärfte Stämme wie beispielsweise LBA4404 (Hoekema et al., 1983 (Referenz (12))), C58C1(pGV3850) (Zambryski et al., 1983 (Referenz (40))), und GV3Ti11SE (Fraley et al., 1985 (Referenz (9))), die tumorerzeugende Ti-Plasmide haben, aus welchen Hormonsynthetasegene eliminiert wurden, hergestellt (3). Zwei Verfahren, die einen derartigen Stamm anwenden, das heißt ein Verfahren, durch welches ein gewünschtes Gen in das Ti-Plasmid von Agrobacterium eingeführt wird, und ein Verfahren, durch welches eine T-DNA mit einem gewünschten Gen in Agrobacterium eingeführt wird, wurden entwickelt. Eines dieser Verfahren ist das Verfahren mit dem sogenannten intermediären Vektor (Fraley et al., 1985 (Referenz (9)); Fraley et al., 1983 (Referenz (10)); Zambryski et al., 1983 (Referenz (40)), die japanische offengelegte Patentanmeldung (Kokai) Nr. 59-140885 ( EP116718 )). In diesem Verfahren wird ein intermediärer Vektor, welcher durch Techniken genetischer Manipulation leicht zu handhaben ist, in welchen ein gewünschtes Gen insertiert werden kann und welcher in E. coli repliziert werden kann, in die T-DNA in dem Ti-Plasmid vom entschärften Typ von Agrobacterium durch Drei-Eltern-Paarung eingeführt (Ditta et al., 1980 (Referenz (8))). Ein anderes Verfahren ist das Verfahren mit dem sogenannten binären Vektor (3), welches auf der Tatsache basiert, daß, obwohl die vir-Region für die T-DNA notwendig ist, es, um in Pflanzen eingeschlossen zu werden, nicht notwendig ist, daß die T-DNA und die vir-Region in dem gleichen Plasmid existieren ((Hoekema et al., 1983). Die vir-Region enthält virA, virB, virC, virD, virE und virG (Plant Biotechnology Encyclopedia (Enterprise Co., Ltd. (1989))), und die vir-Region ist definiert als diejenige, die alle von virA, virB, virC, virD, virE und virG enthält. So ist der binäre Vektor ein kleines Plasmid, welches in sowohl Agrobacterium als auch E. coli replizierbar ist, und dieses Plasmid wird in Agrobacterium mit einem Ti-Plasmid vom entschärften Typ eingeführt. Die Einführung des binären Vektors in Agrobacterium kann durch Elektroporationsverfahren, Drei-Eltern-Paarung oder dergleichen ausgeführt werden). Binärer Vektor schließt pBIN19 (Bevan, 1984 (Referenz (4))), pB1121 (Jefferson, 1987 (Referenz (19))), pGA482 (An et al., 1988 (Referenz (2))), die japanische offengelegte Patentanmeldung (Kokai) Nr. 60-70080 ( EP120516 )) ein, und basierend auf diesen Vektoren ist eine Anzahl neuer binärer Vektoren konstruiert worden. In dem System des Ri-Plasmids sind ähnliche Vektoren konstruiert worden und werden zur Transformation verwendet.
Agrobacterium A281 (Watson et al., 1975 (Referenz (39))) ist ein supervirulenter Stamm, dessen Wirtsspektrum weit ist und dessen Effizienz der Transformation höher ist als die anderer Stämme (Hood et al., 1987 (Referenz (13)); Komari 1989 (Referenz (21))). Dieses Merkmal wird durch ein Ti-Plasmid pTiBo542, enthalten in A281, zustandegebracht (Hood et al., 1984 (Referenz (16)); Jin et al., 1987 (Referenz (20)); Komari et al., 1986 (Referenz (24))).
Zwei neue Systeme unter Verwendung von pTiBo542 sind entwickelt worden. Ein System benutzt die Stämme EHA101 (Hood et al., 1986) und EHA105 (Hood et al., 1993), die ein Ti-Plasmid enthalten, welches ein entschärfter Typ von pTiBo542 ist. Durch Anwenden dieser Stämme auf das vorstehend erwähnte binäre Vektorsystem wurde ein System mit einer hohen Effizienz der Transformation erreicht, welches zur Transformation verschiedener Pflanzen weitverbreitet verwendet wird. Ein anderes System ist ein „super-binäres" Vektorsystem (Hiei et al., 1994 (Referenz (11)); Ishida et al., 1996 (Referenz (18)); Komari et al., 1999 (Referenz (26)), WO94/00977, WO95/06722) (4). Da dieses System ein Ti- Plasmid vom entschärften Typ mit der vir-Region (virA, virB, virC, virD, virE und virG) (jede von diesen kann nachstehend auch als „vir-Fragment-Region" bezeichnet werden) und ein Plasmid mit T-DNA umfaßt, ist dieses eine Art des binären Vektorsystems. Jedoch ist es von dem binären Vektor insofern verschieden, als ein superbinärer Vektor (Komari, 1990a (Referenz (22))), in dem ein vir-Region-Fragment (vorzugsweise ein Fragment, enthaltend mindestens virB oder virG, stärker bevorzugt ein Fragment, mindestens enthaltend virB und virG), dem im wesentlichen mindestens eines von den Fragmenten der vir-Region fehlt, in das Plasmid mit der T-DNA, d.h. den binären Vektor, eingeschlossen wird. Um eine T-DNA-Region einzuführen, in welche ein gewünschtes Gen in ein Agrobacterium mit dem superbinären Vektor insertiert worden ist, kann homologe Rekombination über das Verfahren der Drei-Eltern-Paarung als leichtes Verfahren angewendet werden (Komari et al., 1996 (Referenz (25))). Es wurde nachgewiesen, daß der superbinäre Vektor für eine Anzahl von Pflanzenspezies viel höhere Transformationseffizienz als die vorstehend beschriebenen verschiedenen Vektorsysteme ergibt (Hiei et al., 1994 (Referenz (11)); Ishida et al., 1996 (Referenz (18)); Komari, 1990b (Referenz (23)); Li et al., 1996 (Referenz (27)); Saito et al., 1992 (Referenz (35))).
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist das Wirtsbakterium, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, nicht beschränkt und Agrobacterium tumefaciens (z.B. das vorstehend beschriebene Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Hoekema et al., 1983 (Referenz (12))) und EHA101 (Hood et al., 1986 (Referenz (15))) können vorzugsweise angewendet werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auf ein beliebiges der Geneinführungssysteme angewendet werden, so lange wie es auf der Expression der Gruppe von Genen in der vir-Region in dem Bakterium, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, beruht, um signifikante Wirkung zu erhalten. So kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung auf ein beliebiges der Vektorsysteme, wie beispielsweise die vorstehend beschriebenen intermediären Vektoren, binären Vektoren, supervirulenten binären Vektoren und superbinären Vektoren, angewendet werden, um die vorteilhafte Wirkung der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch auf die Vektorsysteme angewendet werden, die durch Modifizierung dieser Vektoren erhalten werden (z.B. diejenigen, wobei die gesamte oder ein Teil der vir-Region eines Bakteriums, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, exzidiert und zusätzlich in das Plasmid eingeschlossen wird, oder die gesamte oder ein Teil der vir-Region eines Bakteriums gehörend zu der Gattung Agrobacterium, exzidiert wird und in Agrobacterium als Teil eines neuen Plasmids eingeführt wird). Weiterhin ist es unnötig zu sagen, daß durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Effizienz der Einführung der T-DNA-Region von Wildtyp-Agrobacterium gefördert wird, so daß die Effizienz der Infektion gefördert wird.
Das gewünschte Gen, das in die Pflanze eingeführt werden soll, kann in eine Restriktionsstelle in der T-DNA-Region des vorstehend beschriebenen Plasmids durch ein herkömmliches Verfahren insertiert werden, und das Agrobacterium, in welches das gewünschte Gen eingeschlossen wurde, kann basierend auf einem geeigneten Selektionsmarker wie beispielsweise einem arzneimittelresistentem Gen gegen ein Arzneimittel wie beispielsweise Kanamycin oder Paromomycin ausgewählt werden. In Fällen, wo das Plasmid groß ist und eine Anzahl von Restriktionsstellen hat, ist es nicht immer leicht, die gewünschte DNA durch ein gewöhnliches Subklonierungsverfahren in die T-DNA-Region zu insertieren. In einem derartigen Fall kann die gewünschte DNA durch das Verfahren der Drei-Eltern-Paarung unter Nutzung der homologen Rekombination in der Zelle des Bakteriums, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, insertiert werden.
Einführung des Plasmids in ein Bakterium, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, wie beispielsweise Agrobacterium tumefaciens kann durch ein bekanntes Verfahren einschließlich des vorstehend erwähnten Verfahrens der Drei-Eltern-Paarung, des Elektroporationsverfahrens, des Elektroinjektionsverfahrens und chemischer Behandlungen mit PEG oder dergleichen ausgeführt werden.
Das Gen, welches in die Pflanze eingeführt werden soll, ist im Prinzip wie in dem herkömmlichen Verfahren zwischen der linken und rechten Grenzsequenz der T-DNA angeordnet. Jedoch kann, da das Plasmid ringförmig ist, das Plasmid nur eine Grenzsequenz enthalten. Alternativ kann in Fällen, wo eine Mehrzahl von Genen an verschiedenen Stellen angeordnet werden soll, das Plasmid drei oder mehrere Grenzsequenzen enthalten. Alternativ kann die Anordnung des gewünschten Plasmids in dem Ti- oder Ri-Plasmid in der Zelle des Bakteriums, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, durchgeführt werden oder das gewünschte Gen kann in einem anderen Plasmid angeordnet werden. Weiterhin kann das gewünschte Gen in einer Mehrzahl von Typen von Plasmiden angeordnet werden.
Einführung eines Gens in die Pflanzenzellen über ein Bakterium, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, kann erreicht werden, indem einfach der Kontakt der Pflanzenzellen oder des Pflanzengewebes mit dem Bakterium, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, hergestellt wird. Zum Beispiel wird eine Zellsuspension des Bakteriums, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, mit einer Populationsdichte von etwa 10⁶ bis 10¹¹ Zellen/ml hergestellt, und die Pflanzenzellen oder das Pflanzengewebe werden für etwa 3 bis 10 Minuten in die Suspension eingetaucht, nachfolgend das Reaktionsergebnis auf einem festen Medium für mehrere Tage cokultiviert, wodurch die Einführung des Gens erreicht wird.
Die Zellen oder das Gewebe, die der Geneinführung unterworfen werden sollen, sind überhaupt nicht eingeschränkt und können ein Blatt, eine Wurzel, ein Stamm, eine Frucht oder irgendein anderer Teil der Pflanze sein. Weiterhin können dedifferenziertes Gewebe wie beispielsweise ein Kallus oder ein nicht dedifferenziertes Gewebe wie beispielsweise ein Embryo angewendet werden.
Wie in den folgenden Beispielen konkret gezeigt werden wird, wird durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Effizienz der Geneinführung signifikant gefördert, wenn mit dem herkömmlichen Agrobacterium-Verfahren verglichen wird.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird jetzt durch Beispiele davon beschrieben. Es sollte bemerkt werden, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele eingeschränkt ist.
BEISPIEL 1
(1) Agrobacterium-Stämme und Plasmide
Als das Agrobakterium und seine Vektoren wurden LBA4404(pBI121) (pBI121 ist im Handel von CLONETECH, US, erhältlich) (Jefferson RA 1987 (Referenz (19))), LBA4404(pIG1121Hm) (Hiei, Y. et al., 1994 (Referenz (11))), LBA4404(pTOK233) (Hiei et al., 1994 (Referenz (11))) und LBA4404(pSB133) (2) verwendet.
Die Konstruktion von pSB133 wurde wie folgt ausgeführt: Ein DNA-Fragment mit einer Größe von 6,2 kb, erhalten durch Digestieren von pGA482 (An G et al., 1985 (Referenz (3))) mit einem Restriktionsenzym SalI, wurde mit einem DNA-Fragment mit einer Größe von 5,1 kbp, erhalten durch Digestieren von pSB11 (Komari et al., (Referenz (25))) mit SalI, ligiert, um ein Plasmid herzustellen. Dieses Plasmid wurde dann mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BglII digestiert, um ein DNA-Fragment mit einer Größe von 8,6 kb zu erhalten. Dieses DNA-Fragment wurde abgestumpft und ein BglII-Linker (im Handel erhältlich von TaKaRa) wurde darin insertiert, um ein Plasmid pSB27 zu erhalten. Das pSB27 wurde mit einem Restriktionsenzym HindIII digestiert, und ein DNA-Fragment mit einer Größe von 3,1 kb, enthaltend 35S-Promotor und ein Intron-GUS-Gen, welches Fragment durch Digestieren von pIG221 erhalten wurde (Ohta S et al., 1990 (Referenz (32)), wurde darin insertiert, um pSB33 zu erhalten. Das pSB33 wurde in E. coli LE392 eingeführt und dann in Agrobacterium LBA4404, enthaltend pSB1 (Komari et al., 1996 (Referenz (25))) durch das Verfahren der Drei-Eltern-Paarung eingeführt (Ditta G et al., 1980 (Referenz (8))). Das pSB133 wurde durch homologe Rekombination zwischen pSB1 und pSB33 in der Zelle von Agrobacterium erhalten. Die T-DNA-Region von pBI121 enthält ein Kanamycinresistentes Gen (nptII), gesteuert durch den Promotor des Nopalin-Synthetase-Gens (nos), und ein GUS-Gen, gesteuert durch den 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV). Jede der T-DNA-Regionen von pIGl21Hm und pTOK233 enthält ein nptII-Gen, gesteuert durch den nos-Promotor, ein hpt-Gen, gesteuert durch den 35S-Promotor, und ein GUS-Gen, gesteuert durch den 35S-Promotor, welches GUS-Gen Intronen des Katalase-Gens der Kastor-Bohne enthält. Die T-DNA-Region von pSB133 enthält ein nptII-Gen, gesteuert durch den nos-Promotor, und ein GUS-Gen, gesteuert durch den 35S-Promotor von CaMV, welches GUS-Gen Intronen des Katalase-Gens der Kastor-Bohne enthält (2). Die Plasmide pSB133 und pTOK233 sind superbinäre Vektoren mit hohen Fähigkeiten zur Transformation (Komari, T. et al., 1999 (Referenz (26))).
(2) Probenvarietäten und Gewebe
Als Probenvarietäten wurden Koshihikari und Tsukinohikari verwendet, welche Varietäten von japanischem Reis sind. Spelzen von unreifen Samen wurden 8 bis 14 Tagen nach dem Blühen entfernt und die Samen wurden mit 70 %igem Ethanol für mehrere Sekunden und mit 1 %iger wässeriger Natriumhypochloritlösung, enthaltend Tween 20, für 15 Minuten sterilisiert. Nachdem die Samen mehrere Male mit sterilisiertem Wasser gewaschen worden waren, wurden unreife Embryos mit Längen von 1,5 bis 2 mm exzidiert und als Probengewebe verwendet.
(3) Zentrifugationsbehandlung
Die unreifen Embryos von Reis wurden in Röhrchen, enthaltend sterilisiertes Wasser, plaziert und unter Verwendung einer Mikrohochgeschwindigkeitszentrifuge, einer großen Hochgeschwindigkeitszentrifuge oder einer Ultrahochgeschwindigkeitszentrifuge unter einer Beschleunigung von 760 g bis 150000 g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die unreifen Embryos mit Agrobacterium infiziert.
(4) Infektion und Cokultivieren
Das Verfahren zur Infektion der unreifen Embryos und das Verfahren zum Cokultivieren waren in Übereinstimmung mit den Verfahren von Hiei et al. (1994) (Referenz (11)). Das heißt, nach der Zentrifugation wurde das sterilisierte Wasser in jedem Röhrchen entfernt und eine Suspension von Agrobacterium wurde hinzugegeben, nachfolgend das Gemisch mit einem Vortex-Mischer für 5 bis 30 Sekunden gerührt.
Die Suspensionen von Bakterien wurden hergestellt, indem Kolonien von Agrobacterium, kultiviert auf AB-Medium (Chilton, M-D et al., 1974 (Referenz (6))), mit einer Platinschleife gesammelt wurden und die gesammelten Bakterien in modifiziertem AA-Medium (hauptsächliche anorganische Salze von AA, AA-Aminosäuren und AA-Vitamine (Toriyama K. et al., 1985 (Referenz (36))), nebensächliche Salze von MS (Murashige, T et al., 1962 (Referenz (30))), 1,0 g/l Casaminosäure, 100 μM Acetosyringon, 0,2 M Saccharose, 0,2 M Glucose) suspendiert wurden. Nachdem das Gemisch von unreifen Embryos und die Suspension von Agrobacterium bei Raumtemperatur für etwa 5 Minuten stehen gelassen wurden, wurden die unreifen Embryos zum Cokultivieren auf ein Gewebe aufgebracht. Als Medium zum Cokultivieren wurde 2N6-AS-Medium (Hiei et al. 1994 (Referenz (11))) verwendet, außer daß die anorganischen Salze davon zu der Zusammensetzung von R2-Medium (Ohira et al. 1973 (Referenz (31))) verändert wurden. Es sollte jedoch bemerkt werden, daß die hauptsächlichen anorganischen Salze (KNO₃, KH₂PO₄, CaCl₂2H₂O, MgSO₄7H₂O) zu dem Medium mit halber Konzentration hinzugegeben wurden. Die Dichte der Bakterienzellen, die infiziert werden sollten, wurde auf 1 × 10⁸ bis 1 × 10⁹ cfu/ml eingestellt. Das Cokultivieren wurde für 3 bis 13 Tage ausgeführt und ein Teil des unreifen Embryos wurde mit X-Gluc behandelt, um die Expression des GUS-Gens zu überprüfen (Hiei et al. 1994) (Referenz (11)). Das heißt, sofort nach dem Cokultivieren wurde das Gewebe in 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 6,8), enthaltend 0,1% Triton X-100, eingetaucht und wurde bei 37°C für 1 Stunde stehen gelassen. Nach dem Entfernen von Agrobacterium mit Phosphatpuffer wurde Phosphatpuffer, enthaltend 1,0 mM 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäure (X-gluc) und 20% Methanol, hinzugegeben. Nach dem Inkubieren des Reaktionsergebnisses bei 37°C für 24 Stunden wurden unter dem Mikroskop Gewebeteilchen, gefärbt in blau, beobachtet.
(5) Auswahl von transformierten Zellen
Nach dem Cokultivieren wurden die unreifen Embryos und Kalli in ein primäres Selektionsmedium, enthaltend 250 mg/l Carbenicillin und 250 mg/l Cefotaxim und weiterhin enthaltend 200 mg/l Paromomycin oder 10 bis 30 mg/l Hygromycin, überführt und bei 30°C unter Lichtbedingungen für 1 bis 2 Wochen kultiviert. Als primäres Selektionsmedium wurde 2N6K-Medium, beschrieben bei Hiei et al. (1994) (Referenz (11)), ergänzt mit D-Sorbitol zu 30 g/l, verwendet (K-Medium). Weiterhin wurde ein Medium (N-Medium), welches das gleiche wie das 2N6-Medium war (anorganische Salze und Vitamine von N6 (Chu C. C. 1978 (Referenz (7))), 1 g/l Casaminosäure, 2 mg/l 2,4-D), außer daß die Konzentration von (NH₄)₂SO₄ zu 232 mg/l verändert wurde und daß die Aminosäuren des AA-Mediums (Toriyama et al., 1985 (Referenz (36))) ergänzt wurden, ebenfalls im Test verwendet.
Die Kalli, erzeugt auf dem primären Selektionsmedium, wurden in ein sekundäres Selektionsmedium, enthaltend 250 mg/l Cefotaxim und 250 mg/l Carbenicillin und weiterhin enthaltend 200 mg/ml Paromomycin oder 80 mg/l Hygromycin, überführt und bei 30°C unter Lichtbedingungen für 1 bis 2 Wochen kultiviert. Als sekundäres Selektionsmedium wurde ein Medium, welches das gleiche war wie das N6-7-Medium, beschrieben bei Hiei et al. (1994) (Referenz (11)), außer daß die Konzentration von (NH₄)₂SO₄ zu 232 mg/l verändert wurde und daß die Aminosäuren des AA-Mediums (Toriyama et al., 1985 (Referenz (36))) ergänzt wurden, verwendet. Zu dem Paronomycin enthaltenden primären und sekundären Selektionsmedium wurde als Verfestiger Agarose zu 8 g/l hinzugegeben. Die Rate der auftauchenden resistenten Kalli wurde nach der sekundären Selektion untersucht.
(6) Regeneration von Transformanten
Die Kalli, resistent gegenüber den Arzneimitteln der Selektion, erhalten aus den Scutella von unreifen Embryos, wurden auf N6S3-Medium (Hiei et al. 1994 (Referenz (11))) zur Regeneration, enthaltend 250 mg/l Carbenicillin und 250 mg/l Cefotaxim und weiterhin enthaltend 100 mg/l Paromomycin oder 50 mg/l Hygromycin, aufgebracht.
(7) Überprüfen der GUS-Expression in regenerierten Pflanzen
Blätter von regenerierten Pflanzen, resistent gegenüber den Arzneimitteln, erhalten durch Kultivieren zur Regeneration bei 25°C unter Lichtbedingungen für 4 bis 5 Wochen, wurden auf die Expression von GUS-Gen überprüft, indem sie mit X-Gluc in der gleichen Weise wie vorstehend erwähnt behandelt wurden (Hiei et al. 1994 (Referenz (11))). Die regenerierten Pflanzen wurden in 500-fach verdünnte wässerige Hyponex-Lösung transplantiert und bei 25°C unter Lichtbedingungen für etwa 2 Wochen kultiviert, nachfolgend in Töpfe in einem Gewächshaus transplantiert.
(8) Ergebnisse
(i) Diskussion über Auswirkungen durch Zentrifugationsbehandlung
Unter Verwendung einer Mikrohochgeschwindigkeitszentrifuge, großen Hochgeschwindigkeitszentrifuge und einer Ultrahochgeschwindigkeitszentrifuge wurde die Auswirkung durch die Zentrifugationsbehandlung auf die unreifen Embryos von Reis getestet. Das Ergebnis war, daß die Effizienz der Geneinführung gefördert wurde, wenn die Beschleunigung innerhalb des Bereichs von 10 kg bis 100 kg war (Tabellen 1, 2, 3 und 6). Was die Behandlungszeit betrifft, wurde vorteilhafte Wirkung klar bei der Behandlung für 10 Minuten beobachtet (Tabellen 4 und 5). Die Frequenz der transienten Expression von GUS war zwischen den Varietäten, das heißt zwischen Koshihikari und Tsukinohikari, nicht unterschiedlich. Da nicht nur die Auswirkung zum Fördern der Effizienz der Geneinführung, sondern auch die Auswirkung zum Induzieren der Erzeugung von Kallus beobachtet wurde, ließ das darauf schließen, daß Zentrifugationsbehandlung für Induktion und Wachstum von Kalli und beim Kultivieren von Pflanzen, die andere Spezies einschließen, wirksam ist.
Wie in Tabelle 6 angegeben ist, wurde die Induktion von Kalli aus den unreifen Embryos von Tsukinohikari überhaupt nicht beobachtet, wenn die Zentrifugation mit 250 kg für 60 Minuten unter Verwendung der Ultrahochgeschwindigkeitszentrifuge ausgeführt wurde. Jedoch wurde Induktion von Kalli beobachtet, wenn die Zentrifugation mit 110 kg für 60 Minuten ausgeführt wurde, und Expression von GUS wurde ebenfalls mit hoher Rate beobachtet. Ähnlich wurde, wie für Koshihikari, Induktion von Kalli aus den unreifen Embryos von Tsukinohikari überhaupt nicht beobachtet, wenn die Zentrifugation mit 250 kg für 60 Minuten unter Verwendung der Ultrahochgeschwindigkeitszentrifuge ausgeführt wurde. Ausgehend von diesen Ergebnissen denkt man, daß der vorteilhafte Effekt durch Zentrifugation für den unreifen Embryo von Reis bei einer Beschleunigung zwischen 5 kg bis 200 kg erhalten wird. So wird angesichts der Einfachheit der Behandlung gedacht, daß, wenn eine Mikrohochgeschwindigkeitszentrifuge oder eine große Hochgeschwindigkeitszentrifuge verwendet wird, die Behandlung mit 20 kg oder 40 kg geeignet ist. Weiterhin wurde, wie in den Tabellen 9, 10 und 11 angegeben, nachgewiesen, daß durch die Zentrifugationsbehandlung mit 20 kg für 60 Minuten Transformation unter Verwendung eines unreifen Embryos nicht nur für LBA4404(pSB1333) mit einem superbinären Vektor, von dem bekannt ist, eine hohe Transformationsfähigkeit zu haben, sondern auch für LBA4404 (pIG121Hm), enthaltend einen gewöhnlichen binären Vektor, erreicht werden kann.
(ii) Diskussion über Zentrifugationsbehandlung und Dauer des Cokultivierens
Wie in den Tabellen 7 und 8 angegeben ist, war die Effizienz der GUS-Expression, beobachtet in dem transienten Assay, höher, wenn die Dauer des Cokultivierens 6 oder 13 Tage betrug, als wenn die Dauer des Cokultivierens 3 Tage betrug. In einem anderen Experiment wurde eine hohe GUS-Expression beobachtet, wenn die Dauer des Cokultivierens 9 Tage betrug. Verschiedene unreife Embryos, welche einer verschiedenen Dauer des Cokultivierens unterzogen wurden, werden jetzt auf einem primären Selektionsmedium (10 ppm Hygromycin, 200 ppm Paromomycin) kultiviert und es gibt eine Tendenz, daß die Rate des Auftauchens von Arzneimittel-resistenten Kalli in der für 9 oder 13 Tage cokultivierten Gruppe kleiner als in der für 3 oder 6 Tage cokultivierten Gruppe ist.
(iii) Untersuchung der Effizienz der Transformation durch Zentrifugationsbehandlung
Jetzt werden die GUS-positiven Transformanten (Tabelle 4 und 5), hergestellt wie vorstehend beschrieben, akklimatisiert und das Kultivieren wird fortgesetzt. Für einige Linien wurden Samen gesammelt und die Fruchtbarkeit wurde überprüft. Das Ergebnis war, daß keine Unterschiede in Morphologie und Fruchtbarkeit zwischen den zentrifugierten Transformanten und den nichtbehandelten Transformanten (Koshihikari und Tsukinohikari) beobachtet wurden.
Hiei et al. (1994 (Referenz (11))) berichteten, daß Transformation mit einer relativ hohen Effizienz unter Verwendung von Kalli von Reis erreicht werden kann. Aldemita RR et al. 1996 (Referenz (1)) berichteten einen Fall von Transformation unter Verwendung eines unreifen Embryos von Reis. Um diese Transformationsverfahren wirksamer und stabiler auszuführen, ist das vorstehend beschriebene Verfahren der Zentrifugationsbehandlung sehr wirksam. Insbesondere kann es, obwohl die Qualität des unreifen Embryos wahrscheinlich abhängig von der Umgebung des Kultivierens variiert, so daß es nicht leicht ist, immer ein zur Transformation geeignetes unreifes Embryo zu erhalten, möglich sein, hohe Effizienz der Transformation zu halten, indem der unreife Embryo der Zentrifugationsbehandlung unterworfen wird. Hiei et al. (1994) (Referenz (11)) zeigten, daß ein superbinärer Vektor mit einer hohen Transformationsfähigkeit die Effizienz der Transformation von Reis fördert. Nach Aldemita RR et al. 1996 (Referenz (1)) wurden Transformanten nur in dem Test unter Verwendung von LBA4404(pTOK233), enthaltend einen superbinären Vektor, erhalten. Durch das Verfahren der Zentrifugationsbehandlung gemäß der vorliegenden Erfindung wird, sogar wenn ein gewöhnlicher binärer Vektor verwendet wird, eine hohe Effizienz der Transformation erreicht, welche vergleichbar mit oder sogar höher ist als die, die in der Transformation unter Verwendung eines superbinären Vektors erreicht wird. Weiterhin kann durch Anwenden sowohl des superbinären Vektors als auch des Verfahrens der Zentrifugationsbehandlung die Effizienz noch stärker gefördert werden. Weiterhin wird noch erwartet, daß Transformanten durch Anwenden des Verfahrens der Zentrifugationsbehandlung für die Varietäten, mit welchen ein Transformant bisher nicht erhalten worden ist, erhalten werden können. TABELLE 1 Verschiedene Zentrifugationsbehandlungen und Ergebnisse der GUS-Expression nach dem Cokultivieren (Probenstamm: LBA4404/pSB133)

Zeit der Zentrifugationsbehandlung: 10 Minuten; Dauer des Cokultivierens: 3 bis 5 Tage; Anzahl der GUS-positiven unreifen Embryos/Anzahl der unreifen Embryos der Probe
Die Symbole in Klammern zeigen das Gebiet der Region in den Scutella an, in welchen GUS exprimiert wurde: –: keines; +: klein; ++: mittel; +++: groß

Anzahl der unreifen Embryos, von welchen resistente Kalli erhalten wurden/Anzahl der unreifen Embryos der Probe, überprüft nach Vervollständigung der sekundären Selektion
Zeit der Zentrifugationsbehandlung: 10 Minuten; Dauer des Cokultivierens: 3 bis 5 Tage

Zentrifugale Beschleunigung: 20000 g; Probenvarietät: Koshihikari;
Anzahl von GUS-positiven unreifen Embryos/Anzahl von unreifen Embryos der Probe des Gebiets in den Scutella, in welchen GUS exprimiert wurde. +: klein; ++: mittel; +++: groß

Zentrifugale Beschleunigung: 20000 g; Dauer des Cokultivierens: 3 bis 5 Tage, überprüft nach Vervollständigung der sekundären Selektion;
Anzahl von unreifen Embryos, von welchen resistente Kalli erhalten wurden/Anzahl von unreifen Embryos der Probe

Probenstamm: LBA4404/pIG121Hm; Zeit der Zentrifugationsbehandlung: 60 Minuten
1) Mikrohochgeschwindigkeitszentrifuge; 2) große Hochgeschwindigkeitszentrifuge; 3) Ultrahochgeschwindigkeitszentrifuge
Rate von GUS-exprimiertem Gebiet in den Scutella: –: keines: ±: <1/8; +: 1/8-1/4; ++: >1/4

Probenstamm: LBA4404/pIG121Hm; 1) Mikrohochgeschwindigkeitszentrifuge; 2) große Hochgeschwindigkeitszentrifuge; Zentrifugation wurde für 60 Minuten mit der angezeigten Umdrehung ausgeführt
Rate von GUS-exprimiertem Gebiet in den Scutella: -: keines: ±: <1/8; +: 1/8-1/4; ++: >1/4

Probenstamm: LBA4404/pIG121Hm; 1) Mikrohochgeschwindigkeitszentrifuge; 2) große Hochgeschwindigkeitszentrifuge; Zentrifugation wurde für 60 Minuten mit der angezeigten Umdrehung ausgeführt
Rate von GUS-exprimiertem Gebiet in den Scutella: –: keines: ±: <1/8; +: 1/8-1/4; ++: >1/4

Zentrifugationsbehandlung: 20 kg – 60 Minuten; Dauer des Cokultivierens: 5 Tage TABELLE 10 Ergebnisse der Transformation durch LBA4404(pIG121Hm) (Varietät: Tsukinohikari)

Zentrifugationsbehandlung: 20 kg – 60 Minuten; Dauer des Cokultivierens: 5 Tage TABELLE 11 Ergebnisse der Transformation durch LBA4404(pBI121) (Varietät: Koshihikari)

Zentrifugationsbehandlung: 20 kg – 60 Minuten; Dauer des Cokultivierens: 5 Tage TABELLE 12 Ergebnisse der Transformation durch LBA4404(pSB133) (Varietät: Koshihikari)

Zentrifugationsbehandlung: 20 kg – 60 Minuten; Dauer des Cokultivierens: 3 Tage

BEISPIEL 2
Unreife Embryos von Mais mit einer Größe von etwa 1,2 mm (Varietät: A188, erhalten vom National Institute of Agrobiological Resources, The Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries) wurden aseptisch gesammelt und einmal mit flüssigem LS-inf-Medium gewaschen. In ein Zentrifugenröhrchen, enthaltend den unreifen Embryo und 2,0 ml LS-inf-Medium, enthaltend 100 μM Acetosyringon, wurde eine Suspension von Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB131) (Ishida et al. 1996 (Referenz (18))) zu einer Populationsdichte von etwa 1 × 10⁹ cfu/ml hinzugegeben und das resultierende Gemisch wurde mit 40000 g bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert. Der Kontrollembryo wurde in der gleichen Zellsuspension bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehen gelassen. Nach der Behandlung wurde das Gemisch sanft gerührt und auf LS-AS-Medium derart aufgebracht, daß die Oberfläche des Hypocotyls das Medium berührte. Andererseits wurde die Infektion von unreifen Embryos nach der Zentrifugationsbehandlung wie folgt ausgeführt: Aseptisch gesammelte Embryos wurden einmal mit flüssigem LS-inf-Medium gewaschen und in Zentrifugenröhrchen, enthaltend das gleiche Medium, überführt, nachfolgend mit 20 kg oder 40 kg bei 4°C für 1 Stunde zentrifugationsbehandelt. Die Kontrollprobe wurde in dem flüssigen Medium bei Raumtemperatur für 1 Stunde stehen gelassen. Nach der Behandlung wurde das flüssige Medium entfernt und eine Suspension von LBA4404(pSB131) mit einer Populationsdichte von etwa 1 × 10⁹ cfu/ml wurde hinzugegeben, nachfolgend das Gemisch sanft gerührt. Nachdem das Gemisch bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehen gelassen worden war, wurden die Embryos auf LS-AS-Medium, enthaltend 10 μM AgNO₃, derart aufgebracht, daß die Oberfläche jedes Hypocotyls das Medium berührte. Nach dem Cokultivieren in der Dunkelheit bei 25°C für 3 Tage wurde ein Aliquot der unreifen Embryos als Probe genommen und die transiente Expression des GUS-Gens wurde durch die Behandlung mit X-gluc wie in Beispiel 1 überprüft. Das vorstehend beschriebene Medium und das Verfahren zum Kultivieren waren in Übereinstimmung mit Ishida, Y. et al. 1996 (Referenz (18)).
Die transiente Expression des GUS-Gens in den unreifen A188-Embryos, infiziert mit LBA4404(pSB131), wird in Tabelle 13 gezeigt. Obwohl jeder Embryo Expression des GUS-Gens zeigte, zeigte eine Anzahl der unreifen Embryos, unterworfen der Zentrifugationsbehandlung, Expression in größerem Gebiet als die unreifen Embryos der Kontrolle. Die Zunahme in den Gen-eingeführten Stellen durch die Zentrifugationsbehandlung wurde in beiden Fällen beobachtet, wobei die Zentrifugationsbehandlung zusammen mit dem Agrobacterium durchgeführt wurde und wobei das Agrobacterium nach der Zentrifugationsbehandlung infiziert wurde. Weiterhin wurde Expression des GUS-Gens in größerem Gebiet beobachtet als in dem der Kontrolle, sogar wenn die Intensität der Zentrifugation und die Zeit der Behandlung verändert wurden.
Durch diese Ergebnisse ließ sich auf die Möglichkeit schließen, daß durch Kultivieren der unreifen Embryos nach der Zentrifugationsbehandlung auf einem Selektionsmedium transformierte Pflanzen mit höherer Effizienz als der der Kontrolle erhalten werden. Weiterhin ließ sich auf die Möglichkeit schließen, daß die Maisvarietäten (Ishida et al. 1996 (Referenz (18))) anders als A188, welche bisher nicht durch das herkömmliche Agrobacterium-Verfahren transformiert werden konnten, durch die Zentrifugationsbehandlung transformiert werden können. TABELLE 13 Transiente Expression von GUS-Gen in unreifen A188-Embryos

Die Kontrolle wurde unter 1 g behandelt.
In Test 1 wurde die Zentrifugationsbehandlung in Anwesenheit von Agrobacterium durchgeführt.
In Test 2 wurde Agrobacterium nach der Zentrifugationsbehandlung infiziert.

REFERENZEN

(1) Aldemita RR, Hodges TK (1996) Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties (Durch Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation von Varietäten von japanischem und indischem Reis). Planta 199:61217.
(2) An, G., Evert, P.R., Mitra, A. und Ha, S.B. (1988) Binary vectors (Binäre Vektoren). In Gelvin, S.B. und Schilperoort, R.A. (Hrsg.), Plant Molecular Biology Manual (Handbuch der Pflanzenmolekularbiologie) A3. Kluwer Academic Press, Dordrecht, S. 1-19.
(3) An, G., Watson, BD., Stachel, S., Gordon, MP. & Nester, EW., (1985) New cloning vehicles for transformation of higher plants (Neue Klonierungsvehikel zur Transformation von höheren Pflanzen). EMBO J., 4:277-288.
(4) Bevan, M. (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation (Binäre Agrobacterium-Vektoren für Pflanzentransformation). Nucleic Acids Res., 12, 8711-8721.
(5) Bidney, D., Scelonge, C., Martich, J., Burrus, M., Sims, L., und Huffman, G. (1992) Microprojectile bombardment of plant tissues increases transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens (Mikroprojektilbombardierung von Pflanzengeweben vergrößert die Transformationsfrequenz von Agrobacterium tumefaciens). Plant Mol. Biol., 301-313.
(6) Chilton, M-D., Currier, TC. Farrand, SK. Bendich, AJ. Gordon, MP. & Nester EW. (1974) Agrobacterium tumefaciens DNA and PS8 bakteriophage DNA not detected in crown gall tumers (Agrobacterium-tumefaciens-DNA und PS8-Bakteriophagen-DNA, nicht nachgewiesen in Wurzelhalstumoren). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71:3672-3676
(7) Chu, C. C., (1978) Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking, S. 43-50
(8) Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D. und Helinski, D.R. (1980) Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: Construction of gene bank of Rhizobium meliloti (DNA-Klonierungssystem mit breitem Wirtsbereich für Gram-negative Bakterien: Konstruktion einer Genbank von Rhizobium meliloti). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7347-7351.
(9) Fraley, R.T., Rogers, S.G., Horsch, R.B., Eicholtz, D.A. und Flick, J.S. (1985) The SEV system: a new disarmed Ti plasmid vector for plant transformation (Das SEV-System: ein neuer entschärfter Ti-Plasmid-Vektor zur Pflanzentransformation). Bio/technology, 3, 62935.
(10) Fraley, R.T., Rogers, S.G., Horsch, R.B., Sanders, P.R., Flick, J.S., Adams, S.P., Bittner, M.L., Brand, L.A., Fink, C.L., Fry, J.S., Galluppi, G.R., Goldberg, S.B., Hoffmann, N.L. und Woo, S.C. (1983) Expression of bacterial genes in plant cells (Expression von bakteriellen Genen in Pflanzenzellen). Proc Natl Acad Sci USA, 80, 4803807.
(11) Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T. und Kumashiro, T. (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA (Wirksame Transformation von Reis (Oryza sativa L.), vermittelt durch Agrobacterium, und Sequenzanalyse der Grenzen der T-DNA). The Plant Journal, 6, 271-282.
(12) Hoekema, A., Hirsch, P.R., Hooykaas, P.J.J. und Schilperoort, R.A. (1983) A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-Plasmid (Eine Strategie mit binärem Pflanzenvektor, basierend auf der Trennung von vir- und T-Region des Agrobacterium-tumefaciens-Ti-Plasmids). Nature, 303, 179-180.
(13) Hood, E.E., Fraley, R.T. und Chilton, M.-D. (1987) Virulence of Agrobacterium tumefaciens strain A281 on legumes (Virulenz des Agrobacterium-tumefaciens-Stammes A281 auf Gemüsen). Plant Physiol. 83, 529-534.
(14) Hood, E.E., Gelvin, S.B., Melchers, L.S. und Hoekema, A. (1993) New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants (Neue Agrobacterium-Helferplasmide zum Gentransfer in Pflanzen). Transgenic Res., 2, 208-218.
(15) Hood, E.E., Helmer, G.L., Fraley R.T. und Chilton, M.-D. (1986) The hypervirulence of Agrobacterium tumefaciens A281 is encoded in a region of pTiBo542 outside of T-DNA (Die Hypervirulenz von Agrobacterium tumefaciens A281 wird in einer Region von pTiBo542 außerhalb von T-DNA kodiert). J. Bacteriol., 168, 1291-1301.
(16) Hood, E.E., Jen, G., Kayes, L., Kramer, J., Fraley, R.T. und Chilton, M.-D. (1984) Restriction endonuclease map of pTiBo542, a potential Ti-Plasmid vector for genetic engineering of plants (Restriktionsendonuclease-Karte von pTiBo542, einem potentiellen Ti-Plasmid-Vektor für genetische Manipulation von Pflanzen). Bio/technology, 2, 702-709.
(17) Horsch, R. B., Fry, J. E., Hoffmann, N. L., Eichholtz, D., Rogers, S. G. und Fraley, R. T. (1985) A simple and general method for transferring genes into plants (Ein einfaches und allgemeines Verfahren zum Überführen von Genen in Pflanzen). Science 227, 1229-1231.
(18) Ishida, Y., Saito, H., Ohta, S., Hiei, Y., Komari, T. und Kumashiro, T. (1996) High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens (Transformation mit hoher Effizienz von Mais (Zea mays L.), vermittelt durch Agrobacterium tumefaciens). Nature Biotechnol, 14, 745-750.
(19) Jefferson, R.A. (1987) Assaying chimeric genes in Plants: the GUS gene fusion system (Assaydurchführung zu chimären Genen in Pflanzen: Das GUS-Genfusionssystem). Plant Mol. Biol. Rep., 5, 38705.
(20) Jin, S., Komari, T., Gordon, M.P. und Nester, E.W. (1987) Genes responsible for the supervirulence phenotype of Agrobacterium tumefaciens A281 (Gene, verantwortlich für den Supervirulenzphänotyp von Agrobacterium tumefaciens A281). J. Bacteriol. 169, 4417425.
(21) Komari, T. (1989) Transformation of callus cultures of nine plant species mediated by Agrobacterium (Transformation von Kallus-Kulturen von neun Pflanzenspezies, vermittelt durch Agrobacterium). Plant Sci., 60, 223-229.
(22) Komari, T. (1990a) Genetic characterization of double-flowered tobacco plant obtained in a transformation experiment (Genetische Charakterisierung einer doppelt blühenden Tabakpflanze, erhalten in einem Transformationsexperiment). Theor. Appl. Genet., 80, 167-171.
(23) Komari, T. (1990b) Transformation of cultured cells of Chenopodium quinoa by binary vectors that carry a fragment of DNA from the virulence region of pTiBo542 (Transformation kultivierter Zellen von Chenopodium quinoa durch binäre Vektoren, die ein Fragment von DNA aus der Virulenzregion von pTiBo542 tragen). Plant Cell Reports, 9, 303-306.
(24) Komari, T., Halperin, W. und Nester, E.W. (1986) Physical and functional map of supervirulent Agrobacterium tumefaciens tumor-inducing plasmid pTiBo542 (Physikalische und funktionelle Karte von supervirulentem Tumor-induzierenden Agrobacterium-tumefaciens-Plasmid pTiBo542). J. Bacteriol., 166, 88-94.
(25) Komari, T., Hiei, Y., Saito, Y., Murai, N. und Kumashiro, T. (1996) Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers (Vektoren, tragend zwei separate T-DNAs für Cotransformation von höheren Pflanzen, vermittelt durch Agrobacterium tumefaciens, und Absonderung von Transformanten, frei von Selektionsmarkern). Plant J, 10, 165-174.
(26) Komari, T., und Kubo, T. (1999) Methods of Genetic Transformation: Agrobacterium tumefaciens (Methoden genetischer Transformation: Agrobacterium tumefaciens). In Vasil, I.K. (Hrsg.) Molecular improvement of cereal crops (Molekulare Verbesserung von Getreideernten). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, S. 43-82.
(27) Li, H.-Q., Sautter, C., Potrykus, I. und Puonti-Kaerlas, J. (1996) Genetic transformation of cassava (Manihot esculenta Crantz) (Genetische Transformation von Maniok (Manihot esculenta Crantz)). Nature Biotechnol., 14, 736-740.
(28) Lindsey, K., Gallois, P. und Eady, C. (1991) Regeneration and transformation of sugarbeet by Agrobacterium tumefaciens (Regeneration und Transformation der Zuckerrübe durch Agrobacterium tumefaciens). Plant Tissue Culture Manual B7:1-13. Kluwer Academic Publishers.
(29) McCormick, S. (1991) Transformation of tomato with Agrobacterium tumefaciens (Transformation der Tomate mit Agrobacterium tumefaciens). Plant Tissue Culture Manua (Handbuch für Pflanzengewebekultur) B6:1-9. Kluwer Academic Publishers.
(30) Murashige, T. und Skoog, F. (1962) Physiol. Plant 15:473-497.
(31) Ohira, K., Ojima, K., Fujiwara, A. (1973) Studies on the nutrition of rice cell culture I. A simple, defined medium for rapid growth in suspension culture (Untersuchungen über die Ernährung von Reiszellkultur I. Ein einfaches, definiertes Medium für schnelles Wachstum in Suspensionskultur). Plant Cell Physol., 14:1113-1121.
(32) Ohta, S., Mita, S., Hattori, T., Namamura, K. (1990) Construction and expression in tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) reporter gene containing an intron within the coding sequence (Konstruktion und Expression in Tabak eines β-Glucuronidase-(GUS)-Reportergens, enthaltend ein Intron innerhalb der Codierungssequenz). Plant Cell Physiol. 31:805-813.
(33) Potrykus, I., Bilang, R., Futterer, J., Sautter, C. und Schrott, M. (1998) Agricultural Biotechnology (Landwirtschaftliche Biotechnologie), NY: Mercel Dekker Inc. S. 119-159.
(34) Rogers, S.G., Horsch, R.B. und Fraley, R. T. (1988) Gene transfer in plants: Production of transformed plants using Ti plasmid vectors (Gentransfer in Pflanzen: Erzeugung von transformierten Pflanzen unter Verwendung von Ti-Plasmid-Vektoren). Method for Plant Molecular Biology (Verfahren für Pflanzenmolekularbiologie), CA: Academic Press Inc. S. 423136.
(35) Saito, Y., Komari, T., Masuta, C., Hayashi, Y., Kumashiro, T. und Takanami, Y. (1992) Cucumber mosaic virus-tolerant transgenic tomato plants expressing a satellite RNA (Gurkenmosaikvirus tolerante transgene Tomatenpflanzen, exprimierend eine Satelliten-RNA). Theor. Appl. Genet., 83, 679-683.
(36) Toriyama, K. und Hinata, K. (1985) Plant Sci. 41:179-183
(37) Trick, H.N. und Finer, J.J. (1997) SAAT: sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation (SAAT: Ultraschall-unterstützte Agrobacterium-vermittelte Transformation). Transgenic Research 6:329-336.
(38) Visser, R.G.F. (1991) Regeneration and transformation of potato by Agrobacterium tumefaciens (Regeneration und Transformation von Kartoffel durch Agrobacterium tumefaciens). Plant Tissue Culture Manual (Handbuch für Pflanzengewebekultur) B5:1-9. Kluwer Academic Publishers.
(39) Watson, B., Currier, T.C., Gordon, M.P., Chilton, M.-D. und Nester, E.W. (1975) Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens (Plasmid, erforderlich für Virulenz von Agrobacterium tumefaciens). J Bacteriol, 123, 255-264.
(40) Zambryski, P., Joos, H., Genetello, C., Leemans, J., Van Montagu, M. und Schell, J. (1983) Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity (Ti-Plasmid-Vektor für die Einführung von DNA in Pflanzenzellen ohne Veränderung ihrer normalen Regenerationskapazität). EMBO J, 2, 2143-2150.

Claims

Verfahren zum Fördern der Effizienz der Geneinführung in Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe von einkeimblättrigen Angiospermen durch ein Bakterium, gehörend zu der Gattung Agrobacterium, wobei das Verfahren Zentrifugieren der einkeimblättrigen Pflanzenzellen oder des einkeimblämigen Pflanzengewebes unter einer zentrifugalen Beschleunigung von 1000 G bis 150000 G für 1 Sekunde bis 4 Stunden umfaßt, wobei: die Geneinführung nach dem Zentrifugieren der Pflanzenzellen oder des Pflanzengewebes ausgeführt wird; oder die Pflanzenzellen oder das Pflanzengewebe mit dem Bakterium in Kontakt gebracht werden, während die Zentrifugation durchgeführt wird.
Verfahren zum Herstellen einer Pflanze, gekennzeichnet durch Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 1.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanzenzellen oder das Pflanzengewebe von einer Pflanze, gehörend zu der Familie Gramineae, stammen.
Verfahren zum Herstellen einer Pflanze, gehörend zu der Familie Gramineae, gekennzeichnet durch Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 1.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanzenzellen oder das Pflanzengewebe von Reis oder Mais sind.
Verfahren zum Herstellen von Reis oder Mais, gekennzeichnet durch Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 5.