DE60031826T2

DE60031826T2 - Trennung von Viren und Nachweis von Viren

Info

Publication number: DE60031826T2
Application number: DE60031826T
Authority: DE
Inventors: Kouei Sashima-gun Sato; Takeshi Tanaka; Mitsuhiro Ushiku-shi Murata; Shozou Iizuka-shi Nishida; Mikio Tsuchiura-shi Hikata; Kiyoshi Kameyama-Shi Kasai
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2020-12-09
Also published as: US20030087284A1; EP1108743B1; EP1108743A2; US20010009759A1; EP1108743A3; DE60031826D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Abtrennung von Viren und ein Verfahren zum Nachweis von Viren mittels Anwendung desselben.
2. Beschreibung des in Beziehung stehenden Stands der Technik
Viren können verschiedene Krankheiten in Menschen, Tieren und Pflanzen auslösen. Um für die Diagnose von Krankheiten Viren nachzuweisen, ist es sehr wichtig, die krankheitsauslösenden Viren zu bestimmen. Als herkömmliche Verfahren zum Nachweis von Viren zur Erstellung einer Diagnose ist es üblich, Virus-Antigene oder antivirale Antikörper immunologisch nachzuweisen. Da Viren oder antivirale Antikörper einige Wochen bis einige Monate nach der Virusinfektion nur in kleiner Menge vorliegen, können die Viren jedoch in einigen Fällen nicht mittels solch eines immunologischen Nachweises bzw. Immunassays ermittelt werden. Die Zeitdauer, während der sie nicht nachgewiesen werden können, wird als Fensterperiode (Blindperiode) bezeichnet. Wenn Patienten, die sich in solch einer Periode befinden, Blut spenden, kann das so gespendete Blut ebenfalls oft infektiös sein und es besteht die Möglichkeit, dass eine große Zahl von Blutübertragungs-Patienten oder Patienten, die Blutpräparate nutzen, Gefährdungen ausgesetzt sind. Um die Fensterperiode so kurz wie möglich zu machen, besteht die dringende Notwendigkeit nach der Entwicklung einer Technik, mit der jedes Virus, das unter der immunologischen Nachweisgrenze liegt, mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden kann.
In den letzten Jahren ermöglichten Nucleinsäure-Amplifikationstechniken, wie sie durch das Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren (nachstehend als "PCR-Verfahren" bezeichnet) veran schaulicht werden, sogar den Nachweis von Viren, die nur in Spuren vorlagen. Das PCR-Verfahren und ähnliches erfordert jedoch eine spezielle Ausrüstung und hochwertige Techniken für den Nachweis solcher in Spuren vorhandener Viren, weshalb es sehr schwer ist, es mit einer gewöhnlichen Ausrüstung und auf einfache Weise zu praktizieren. Um solche Probleme zu lösen, werden deshalb Verfahren zur Abtrennung der in einer Probe vorhandenen Viren eingesetzt.
Als typisches Beispiel für herkömmliche Verfahren zur Abtrennung von Viren, ist die Ultrazentrifugation verfügbar, die jedoch teure Geräte und eine lange Zeitdauer erfordert. Außerdem können damit weder eine grobe Zahl an Proben gleichzeitig noch auf einfache Weise behandelt werden und das Verfahren kann kaum als einfaches Verfahren angesehen werden. Es wird auch von einem Chromatografie-Verfahren berichtet, in dem ein Heparin-Sepharose-Träger verwendet wird, welches die Tatsache nutzt, dass ein Antigen der Oberfläche des Hepatitis-Virus vom Typ B (HBs-Antigen) mit Heparin kombiniert. Es ist mittels dieses Verfahrens ebenfalls schwierig, eine große Zahl an Proben gleichzeitig zu behandeln. Als andere Verfahren sind u.a. Verfahren verfügbar, in den die Viren veranlasst werden, sich abzusetzen, etwa mittels eines Verfahren unter Verwendung von Ammoniumsulfat oder einer Kombination aus Polyethylenglykol oder einem Polyanion mit einem zweiwertigen Ion, z.B. einer partikulären Substanz mit sauren Gruppen (japanische Nachveröffentlichung (Kokoku) Nr. 6-22627) oder einer Kombination aus Teilchen mit einem zweiwertigen Metall (japanische Offenlegungsschrift (Kokai) Nr. 6-217767), oder mittels eines Verfahrens, in dem eine wasserlösliche polymere Substanz mit kationischen Gruppen zugegeben wird, um die Viren zu entfernen (japanische Offenlegungsschrift (Kokai) Nr. 4-342536). Diese Verfahren sind jedoch mit der Schwierigkeit verbunden, dass die Proben nach der Abtrennung der Viren mittels Sedimentation gereinigt werden müssen, da die Probleme auftreten, dass die Reagentien und Proteine, die zugegeben werden mussten, in großer Menge in die so abgetrennten Viren eingemischt werden und zu einer Hemmung der PCR führen.
Die Patentschrift WO-A-99/35500 offenbart magnetische und wärmeempfindliche Teilchen mit einer Teilchengröße zwischen 0,05 und 10 μm, die für Diagnosetests zum Nachweis von infektiösen Genen und zur Extraktion von DNA oder RNA oder von Proteinen verwendet wurden.
Die Patentschrift WO-A-97/00896 offenbart mono-dispergierte magnetisierbare Mikrosphären-Latexteilchen, die aus einer hydrophoben Polymermatrix und magnetisierbaren Füllstoffen bestehen. Diese Latizes können in der Biologie verwendet werden, insbesondere für diagnostische und Affinitätschromatografie-Verfahren, um zwei biologische Moleküle zu binden.
Die europäische Patentschrift EP-A-0,709,680 offenbart magnetische Teilchen, die in einem Immunassay-Verfahren eingesetzt werden, in dem mit Gelatine überzogene magnetische Teilchen mit einer Teilchengröße von 1,0 bis 10 μm verwendet werden. Solche Teilchen können zur Bindung von Antikörpern, Hormonen, viralen Antigenen, DNA und RNA von Viren verwendet werden.
Die französische Patentschrift FR-A-2,463,807 offenbart ein Verfahren der Bindung biologischer Moleküle auf magnetischen Trägern, das das Kontaktieren einer Lösung, die ein biologisches Molekül enthält, mit einem magnetischen Träger, der aus magnetischen Teilchen aus aromatischen Vinylpolymeren besteht, um die biologischen Moleküle auf dem Träger zu adsorbieren, und der Abtrennung des biologischen Trägers von der Lösung umfasst.
Die deutsche Patentschrift DE-A-19800294 offenbart magnetische Teilchen, die aus einem magnetischen Kern und einer Polymermatrix bestehen, in der der magnetische Kern vollständig eingekapselt ist, so dass eine chemische Kopplung biologischer Moleküle möglich wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, die vorstehend erwähnten Probleme der Viren-Abtrennverfahren zu lösen und Teilchen zur Virenbindung zur Verfügung zu stellen, die eine gleichzeitige und einfache Behandlung einer großen Zahl an Proben mittels einer einfachen Vorrichtung ermöglichen, und leicht an eine Automatisierung angepasst werden können und keinen schädlichen Einfluss auf Nucleinsäure-Amplifikationstests ausüben, und darin, ein Reagenz zur Virenabtrennung, ein Verfahren zur Virenabtrennung und eine Virennachweisverfahren zur Verfügung zu stellen, in denen von solchen Teilchen Gebrauch gemacht wird.
Als Ergebnis von Forschungen nach Mitteln und Maßnahmen zum Lösen der vorstehenden Probleme entwickelten die Erfinder die nachstehenden Verfahren, die viren-bindende Teilchen einschließen.
Die Erfindung stellt ein Verfahren der Abtrennung von Viren zur Verfügung, das die nachstehenden Schritte umfasst:
die Zugabe von viren-bindenden Teilchen, wie sie in Anspruch 1 definiert sind, zu einer Probe, die möglicherweise Viren enthält, um eine Bindung der Viren an die Teilchen zu ermöglichen;
das Abtrennen der Teilchen, an die die Viren gebunden wurden, von der Probe.
Die Erfindung stellt des Weiteren ein Verfahren zum Nachweis von Viren zur Verfügung, das die nachstehenden Schritte umfasst:
Zugabe von viren-bindenden Teilchen, wie sie in Anspruch 4 definiert sind, zu einer Probe, die möglicherweise Viren enthält, um eine Bindung der Viren an die Teilchen zu ermöglichen;
das Abtrennen der Viren von der Probe durch Abtrennen der Teilchen, an die die Viren gebunden wurden, von der Probe, um die Viren zu gewinnen; und
das Unterziehen der so abgetrennten Viren einem Nucleinsäure-Amplifikationstest.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird nun im Detail beschrieben.
– Viren-bindende Teilchen –
In der Erfindung bezieht sich der Begriff viren-bindende Teilchen auf Teilchen, die Viren adsorbieren, die im Blut oder Körperflüssigkeiten vorhanden sind, von denen die darauf adsorbierten Viren abgetrennt werden sollen. Die mittels der Teilchen abgetrennten Viren werden zur Nucleinsäureextraktion, Untersuchung und Diagnose verwendet, insbesondere zu einer Untersuchung und Diagnose, die eine Nukleinsäure-Amplifikation einschließt. Die viren-bindenden Teilchen der Erfindung weisen mindestens eine Gruppe, d.h. eine kationische Gruppe oder eine anionische Gruppe (beides einschließlich der Salzform) an den Teilchenoberflächen und einen Teilchendurchmesser von 0,05 bis 300 μm auf.
Bei den in der Erfindung verwendeten viren-bindenden Teilchen kann es sich ohne besondere Einschränkungen um wasserunlösliche Materialien handeln, und sie bestehen aus Teilchen, die aus solchen Materialien und mindestens einer kationischen Gruppe und mindestens einer anionischen Gruppe, die sich auf den Teilchenoberflächen befindet, gebildet sind.
Die kationische Gruppe in der Erfindung kann eine Aminogruppe, wie eine primäre Aminogruppe, eine sekundäre Aminogruppe und eine tertiäre Aminogruppe, eine quartäre Ammoniumgruppe, eine Iminogruppe, wie eine primäre Iminogruppe, eine sekundäre Iminogruppe und eine tertiäre Iminogruppe, eine quartäre Iminiumgruppe, eine Amidinogruppe, wie eine primäre Amidinogruppe, eine sekundäre Amidinogruppe und eine tertiäre Amidinogruppe, eine quartäre Amidiniumgruppe, eine Hydradinogruppe, wie eine primäre Hydradinogruppe, eine sekundäre Hydradinogruppe und eine tertiäre Hydradinogruppe, und eine quartäre Hydraziniumgruppe einschließen oder eine anionische stickstoffhaltige cyclische Gruppe, wie Pyridylgruppen und eine quartäre Pyridiniumgruppe.
In der Erfindung schließt die kationische Gruppe eine Gruppe ein, die geeignet ist, mit einem Proton zu kombinieren, wie eine Aminogruppe, um ein Kation zu bilden, und eine Gruppe, die durch die Umsetzung solch einer Gruppe mit einer Säure gebildet wird, um ein Salz zu erzeugen, in dem die Gruppe eine kationische Komponente bildet.
In der Erfindung kann die kationische Gruppe eine Nucleinsäure-Amplifikation wie eine PCR hemmen, wenn sie sich in Wasser, Pufferlösungen, Blut und Körperflüssigkeiten löst, und muss somit chemisch mit den Teilchen kombiniert werden. Sie kann in einer Menge von mindestens 1 × 10^–10 mol, typischerweise von 1 × 10^–10 bis 1 × 10^–2 mol, bevorzugt von 1 × 10^–9 bis 1 × 10^–3 mol, und bevorzugter von 1 × 10^–8 bis 1 × 10^–3 mol, pro g der Teilchen, bezogen auf den Durchschnitt, vorhanden sein. Wenn die kationische Gruppe in einer Menge von kleiner 1 × 10^–10 mol vorhanden ist, können die Teilchen eine unzureichende Eignung zur Virenabtrennung aufweisen. Obwohl die obere Grenze nicht kritisch ist, ist es oft schwierig, die kationische Gruppe in einer Menge von größer 1 × 10^–2 mol einzuführen.
Die Teilchen mit einer kationischen Gruppe können z.B. mittels der nachstehenden Verfahren hergestellt werden: (1) ein Verfahren, in dem Monomerbestandteile, die ein kationisches Monomer enthalten, polymerisiert werden, (2) ein Verfahren, in dem ein Monomer in Gegenwart eines radikalischen Polymerisationsinitiators, der eine kationische Gruppe aufweist, polymerisiert wird; und (3) ein Verfahren, in dem eine Verbindung mit einer kationischen Gruppe zur Kombination mit den Teilchen veranlasst wird.

(1) Verfahren, in dem Monomerbestandteile, die ein kationisches Monomer enthalten, polymerisiert werden: In diesem Verfahren können verwendbare kationische Monomere z.B. die nachstehenden Verbindungen einschließen: Aminoalkylgruppen enthaltende (Meth)acrylate [mit "(Meth)acryl ..." ist Acryl ... oder Methacryl ... oder eine Mischung davon gemeint; das gleiche gilt nachstehend], wie 2-Dimethylaminoethyl-(meth)acrylat, 2-Diethylaminoethyl-(meth)acrylat, 2-Dimethylaminopropyl-(meth)acrylat und 3-Dimethylaminopropyl-(meth)acrylat, und quartäre Salze davon mit Methylenchlorid, Dimethylsulfat, Diethylsulfat oder ähnliches; Aminoalkoxyalkylgruppen enthaltende (Meth)acrylate, wie 2-(Dimethylaminoethoxy)ethyl-(meth)acrylat, 2-(Diethylaminoethoxy)ethyl-(meth)acrylat und 3-(Dimethylaminoethoxy)propyl-(meth)acrylat, und quartäre Salze davon mit Methylenchlorid, Dimethylsulfat, Diethylsulfat oder ähnliches; N-Aminoalkylgruppen enthaltende (Meth)acrylamide, wie N-(2-Dimethylaminoethyl)-(meth)acrylamid, N-(2-Diethylaminoethyl)-(meth)acrylamid, N-(2-Dimethylaminopropyl)-(meth)acrylamid und N-(3-Dimethylaminopropyl)-(meth)acrylamid, und quartäre Salze davon mit Methylenchlorid, Dimethylsulfat, Diethylsulfat oder ähnliches. Insbesondere 2-Dimethylaminoethyl-(meth)acrylat, N-(2-Diethylaminoethyl)-(meth)acrylamid und quartäre Salze davon mit Methylenchlorid sind bevorzugt.

Jedes davon kann alleine oder in Kombination aus zwei oder mehreren verwendet werden.
Das mit dem kationischen Monomer copolymerisierbare Monomer kann wie nachstehend gezeigt vernetzbare Monomere und nicht-vernetzbare und nicht-ionische Monomere einschließen.
Die vernetzbaren Monomere können zum Beispiel Divinylmonomere, Trivinylmonomere und Tetravinylmonomere, wie Divinylbenzol, Divinylbiphenyl, Ethylenglykol-di(meth)acrylat, Diethylenglykol-di(meth)acrylat, Triethylenglykol-di(meth)acrylat, Tetraethylenglykol-di(meth)acrylat, Propylenglykol-di(meth)acrylat, Dipropylenglykol-di(meth)acrylat, Tripropylenglykol-di(meth)acrylat, Tetrapropylenglykol-di(meth)acrylat, 1,4-Butandiol-di(meth)acrylat, 1,6-Hexandiol-di(meth)acrylat, Neopentylglykol-di(meth)acrylat, 2,2'-Bis[4-(meth)acryloyloxypropioxyphenyl]propan, 2,2'-Bis[4-(meth)acryloyloxydiethoxydiphenyl]propan, Glyceroltri(meth)acrylat, Trimethylolpropan-tri(meth)acrylat und Pentaerythritol-tetra(meth)acrylat, einschließen. Insbesondere Divinylbenzol, Ethylenglykol-dimethacrylat und Trimethylolpropan-trimethacrylat sind bevorzugt.
Jedes davon kann alleine oder in Kombination aus zwei oder mehreren verwendet werden.
Bei den copolymerisierbaren nicht-vernetzbaren und nicht-ionischen Monomeren handelt es sich um Monomere, die entweder mit dem kationischen Monomer oder den vernetzbaren Monomeren oder beiden copolymerisiert werden können, und nicht-vernetzbar und nicht-ionisch sind.
Solche Monomere können aromatische Vinylmonomere, wie Styrol, α-Methylstyrol, p-Methylstyrol und halogenierte Styrole; ungesättigte Nitrile, wie Acrylonitril; Acrylate und Methacrylate, wie Methylacrylat, Methylmethacrylat, Ethylacrylat, Ethylmethacrylat, Butylacrylat, Butylmethacrylat, Cyclohexylmethacrylat, 2-Ethylhexylacrylat, 2-Ethylhexylmethacrylat, Laurylacrylat, Laurylmethacrylat, Glycidylacrylat, Glycidylmethacrylat, 2-Hydroxyethylacrylat und 2-Hydroxyethylmethacrylat; Diolefine, wie Butadien und Isopren; Vinylcarboxylatester, wie Vinylacetat; und Vinyl- oder Vinylidenchloride, wie Vinylchlorid und Vinylidenchlorid, einschließen. Insbesondere Styrol, α-Methylstyrol, Acrylonitril, Methylmethacrylat, Butylmethacrylat, 2-Hydroxyethylacrylat und Cyclohexylmethacrylat sind bevorzugt.
Jedes dieser Monomere kann alleine oder in Kombination aus zwei oder mehreren verwendet werden.
Polymere Bestandteile, die das vorstehend beschriebene kationische Monomer enthalten, können mittels Emulsionspolymerisation, Suspensionspolymerisation oder ähnlichem in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators in einem wässrigen Dispersionsmedium erhalten werden.
Der Polymerisationsinitiator wird durch wasserlösliche Polymerisationsinitiatoren vom Redox-Typ, wie Persulfate, Wasserstoffperoxid-Eisen(II)-chlorid und Cumolhydroperoxid-Natriumascorbat; und öllösliche Polymerisationsinitiatoren, wie Benzoylperoxid, Lauroylperoxid, t-Butylperoxy-2-ethylhexanoat und Azobisisobutyronitril beispielhaft veranschaulicht.
Grenzflächenaktive Mittel, Dispersionsstabilisatoren und ähnliches können gegebenenfalls ebenfalls verwendet werden.

(2) Verfahren, in dem von einem radikalischen Polymerisationsinitiator mit einer kationischen Gruppe Gebrauch gemacht wird: Bei diesem radikalischen Polymerisationsinitiator handelt es sich um einen Polymerisationsinitiator, in dessen Gegenwart ein Polymer, das mittels Radikalkettenpolymerisation erhalten wurde, an seinem Ende bzw. Terminus eine kationische Gruppe aufweist, die von dem radikalischen Polymerisationsinitiator stammt.

Bevorzugte radikalische Polymerisationsinitiatoren mit einer kationischen Gruppe können Initiatoren vom Azobis-Typ mit einer Amidinogruppe, einer Imidinogruppe oder einer Pyridiniumgruppe einschließen. Diejenigen mit einer 10 Stunden-Halbwertszeit-Temperatur in einem Bereich von 40 bis 95°C sind bevorzugt, da die Polymerisation unter milden Bedingungen erfolgen kann.
Bevorzugte spezielle Beispiele für solche radikalischen Polymerisationsinitiatoren mit einer kationischen Gruppe können die nachstehenden Verbindungen einschließen:
2,2'-Azobis(2-methyl-N-phenylpropionamidin)-dihydrochlorid (als VA-545, Handelsname, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich);
2,2'-Azobis[N-(4-chlorphenyl)-2-methylpropionamidin)]-dihydrochlorid (als VA-546, Handelsname, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich);
2,2'-Azobis[N-(4-hydroxyphenyl)-2-methylpropionamidin)]-dihydrochlorid (als VA-548, Handelsname, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich);
2,2'-Azobis[2-methyl-N-(phenylmethyl)-propionamidin]-dihydrochlorid (als VA-552, Handelsname, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich);
2,2'-Azobis[2-methyl-N-(2-propenyl)propionamidin]-dihydrochlorid (als VA-553, Handelsname, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich);
2,2'-Azobis(2-methylpropionamidin)-dihydrochlorid (als V-50, Handelsname, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich);
2,2'-Azobis[N-(2-hydroxyethyl)-2-methylpropionamidin]-dihydrochlorid (als VA-558, Handelsname, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich);
2,2'-Azobis[N-(2-carboxyethyl)-2-methylpropionamidin]-hydrat (als VA-057, Handelsname, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich);
2,2'-Azobis[2-methyl-(5-methyl-2-imidazolin-2-yl)propan]-dihydrochlorid (als VA-041, Handelsname, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich);
2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propan]-dihydrochlorid (als VA-044, Handelsname, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich);
2,2'-Azobis[2-(4,5,6,7-tetrahydro-1H-1,3-diazepin-2-yl)propan]-dihydrochlorid (als VA-054, Handelsname, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich);
2,2'-Azobis[2-(3,4,5,6-tetrahydropyrimidin-2-yl)propan]-dihydrochlorid (als VA-058, Handelsname, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich);
2,2'-Azobis[2-(5-hydroxy-3,4,5,6-tetrahydropyrimidin-2-yl)-propan]-dihydrochlorid (als VA-059, Handelsname, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich);
2,2'-Azobis{2-[1-(2-hydroxyethyl)-2-imidazolin-2-yl]propan}-dihydrochlorid (als VA-060, Handelsname, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich); und
2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propan]-dihydrochlorid (als VA-061, Handelsname, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich);
Insbesondere die Verwendung von 2,2'-Azobis(2-methylpropionamidin)-dihydrochlorid (V-50), 2,2'-Azobis[N-(2-carboxyethyl)-2-methylpropionamidin]-hydrat (VA-057) oder 2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propan]-dihydrochlorid (VA-044) ist bevorzugt.
Der radikalische Polymerisationsinitiator mit einer kationischen Gruppe kann bevorzugt in einer Menge von 0,1 bis 10 Gewichtsteilen, und bevorzugter von 0,5 bis 5 Gewichtsteilen, bezogen auf 100 Gewichtsteile der Gesamtsumme der bei der Polymerisation verwendeten Monomere, eingesetzt werden. Seine Verwendung in einer Menge von kleiner 0,1 Gewichtsteilen, was zu wenig ist, kann dazu führen, dass die resultierenden Teilchen zu wenig kationisch sind, und seine Verwendung in einer Menge von mehr als 10 Gewichtsteilen, was übermäßig ist, kann die Polymerisation instabil werden lassen, was unerwünscht ist.

(3) Verfahren, in dem eine Verbindung mit einer kationischen Gruppe veranlasst wird, mit Teilchen zu kombinieren: Ein Monomer mit einer funktionellen Gruppe, wie einer Carboxylgruppe, einer Hydroxylgruppe, einer Epoxygruppe, einer Aminogruppe oder einer Amidgruppe, wird einer Copolymerisation oder einer Keimpolymerisation (seed polymerization) unterzogen, um ein Polymer mit funktionellen Gruppen herzustellen, und diesen funktionellen Gruppen wird es gestattet, als Verknüpfungskomponenten zu reagieren, wodurch eine Verbindung mit einer kationischen Gruppe in die Teilchenoberflächen eingeführt werden kann.

Das Monomer mit einer funktionellen Gruppe zum Einführen der funktionellen Gruppe kann Acrylsäure, Methacrylsäure, Crotonsäure, Itaconsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Hydroxyethylmethacrylat, 2-Hydroxyethylacrylat, Glycidylmethacrylat, Acrylamid, Methacrylamid, N-Methylolmethacrylamid und N-Isopropylacrylamid einschließen.
Kationische Verbindungen, die mit funktionellen Gruppen umgesetzt werden sollen, die wie vorstehend beschrieben in die Teilchenoberflächen eingeführt wurden, sind Polyaminverbindungen, die als Polyalkylimine klassifiziert werden, wie Polyvinylamin, Polyallylamin, Polyethylenimin und Polypropylenimin.
Die anionische Gruppe in der vorliegenden Erfindung kann eine Carboxylgruppe und eine Sulfonsäuregruppe (-SO₃H) einschließen. Diese anionischen Gruppen können in dem Zustand, in dem sie Salze bildeten, vorliegen. In der Erfindung kann die anionische Gruppe, deren Vorhandensein in mindestens einem Teil der Teilchen, und bevorzugt auf den Oberflächen der Teilchen, veranlasst wurde, die Nucleinsäure-Amplifikation, wie eine PCR, hemmen, wenn sie sich in Wasser, Pufferlösungen, Blut oder Körperflüssigkeiten löst, und muss deshalb chemisch mit den Teilchen kombiniert werden. Sie kann in einer Menge von mindestens 1 × 10^–10 mol, typischerweise von 1 × 10^–10 bis 1 × 10^–2 mol, bevorzugt von 1 × 10^–9 bis 1 × 10^–3 mol, und bevorzugter von 1 × 10^–8 mol bis 1 × 10^–3 mol, pro 1 g der Teilchen, bezogen auf den Durchschnitt, vorhanden sein. Wenn die anionische Gruppe in einer Menge von kleiner 1 × 10^–10 mol vorhanden ist, können die Teilchen eine unzureichende Eignung zur Virenabtrennung aufweisen. Obwohl die obere Grenze nicht kritisch ist, ist es oft schwer, die anionische Gruppe in einer Menge von größer 1 × 10^–2 mol einzuführen.
Solche Teilchen schließen z.B. oberflächen-sulfonierte Teilchen, Carboxylgruppen enthaltende Teilchen, Teilchen, die synthetische Polymerteilchen umfassen, mit denen ein Sulfonsäuregruppen enthaltendes Monomer und/oder ein Carboxylgruppen enthaltendes Monomer keim- oder pfropf-polymerisiert worden ist oder sind, Hydrogelteilchen, die aus einem Sulfonsäuregruppen enthaltenden Monomer und einem wasserlöslichen vernetzbaren Monomer bestehen, Teilchen, an die polyanionische Verbindungen gebunden sind, und anorganische anionische Teilchen ein. Ohne Festlegung darauf können alle Teilchen verwendet werden, solange sie eine anionische Gruppe auf mindestens einem Teil der Oberfläche aufweisen.
Als die oberflächen-sulfonierten Teilchen können z.B. Teilchen verwendet werden, die aus einem Polymer oder Copolymer einer polymeren Verbindung bestehen, die zumindestens auf der Oberfläche des Teilchens eine funktionelle Gruppe aufweisen, die geeignet ist, sulfoniert zu werden, wie sie beispielhaft durch eine ungesättigte Doppelbindung einer Hauptkette oder einer Seitenkette, eine aromatische Gruppe, eine primäre oder sekundäre Aminogruppe, eine primäre Alkylhalogenidgruppe, einen aliphatischen Aldehyd, ein aliphatisches Keton, eine aliphatische Carbonsäure, eine Gruppe eines aliphatischen Carbonsäureanhydridrestes oder eine Hydroxylgruppe veranschaulicht wird, die auf den Hauptketten- oder Seitenketten vorhanden ist, und mindestens auf einem Teil der Oberfläche sulfoniert wurde, um eine Sulfonsäuregruppe zu tragen. Beispiele für die polymere Verbindung, die die Teilchen bildet, die geeignet sind, auf ihren Oberflächen sulfoniert zu werden, können Polymerverbindungen vom Additionspolymerisationstyp, wie Polymere oder Copolymere von Monomeren, die geeignet sind, sulfoniert zu werden, wie sie beispielhaft durch Styrol, α-Methylstyrol, Vinylnaphthalin, Divinylbenzol, Butadien, Isopren und Vinylalkohol veranschaulicht werden, und Copolymere aus einem dieser Monomere mit unterschiedlichen polymerisierbaren Monomeren; und Polymerverbindungen vom Kon densationspolymerisationstyp, wie Polycarbonate, Polyester, Polyesterether, Polyarylether, Polyalkylenoxide, Polysulfone, Polyethersulfone, Polyamide, Polyimide, Polyetherimide, Polyetherketone, Polyurethane, Acetaldehydkondensationsprodukte von aromatischen Verbindungen, und Polyether, einschließen.
Die Teilchen, die aus einer dieser polymeren Verbindungen bestehen, können durch die Behandlung der Teilchen mit konzentrierter Schwefelsäure, rauchender Schwefelsäure, Schwefelsäureanhydrid, einem Schwefelsäureanhydrid-Dioxan-Komplex, einem Schwefelsäureanhydrid-Pyridinkomplex, Chlorsulfonsäure oder ähnlichem sulfoniert werden.
Die carboxylhaltigen Teilchen können Polymer- oder Copolymerteilchen eines Carboxylgruppen enthaltenden Monomers einschließen. Das Carboxylgruppen enthaltende Monomer (nachstehend als "Carbonsäuremonomer" bezeichnet) bezieht sich auf ein polymerisierbares Monomer, das im Molekül eine additions-polymerisierbare ungesättigte Bindung und eine Carboxylgruppe aufweist. Spezielle Beispiele dafür können Acrylsäure, Methacrylsäure, Crotonsäure, Itaconsäure, Fumarsäure und Maleinsäure einschließen.
Diese Polymer- oder Copolymerteilchen können mittels eines herkömmlichen Verfahrens der Emulsionspolymerisation oder der Suspensionspolymerisation hergestellt werden.
Die Teilchen, die synthetische Polymerteilchen umfassen, mit denen ein Sulfonsäuregruppen enthaltendes Monomer(nachstehend als "Sulfonsäuremonomer" bezeichnet) und/oder ein Carboxylgruppen enthaltendes Monomer keim- oder pfropf-polymerisiert worden ist oder sind, können Teilchen einschließen, die dadurch erhalten wurden, dass Keimteilchen (seed particles), die aus einem synthetischen Makromolekül bestanden, einer Keimpolymerisation oder -copolymerisation oder Pfropfpolymerisation oder -copolymerisation zusammen mit einem Sulfonsäuremonomer und/oder einem Carbonsäuremonomer und des Weiteren gegebenenfalls mit einem davon unterschiedlichen copolymerisierbaren Monomer unterzogen wurden. Solche Teilchen können durch die Zugabe eines Monomers und eines Radikalerzeugers zu Keimteilchen, die in Wasser, das ein grenzflächenaktives Mittel enthält, oder in einer Wasser/polares Lösungsmittel-Mischung dispergiert sind, gefolgt von einer Umsetzung, die bei 50 bis 100°C durchgeführt wird, synthetisiert werden. Die Keimteilchen, die aus einem synthetischen Makromolekül bestehen, können Polymer- oder Copolymerteilchen aromatischer Verbindungen, die eine polymerisierbare Doppelbindung enthalten, wie Styrol, α-Methylstyrol, Vinyltoluol und Vinylnaphthalin; von Cyanverbindungen, die eine polymerisierbare Doppelbindung enthalten, wie Acrylonitril, Methacrylonitril und Vinylidencyanid; polymerisierbarer vernetzbarer Verbindungen, wie Divinylbenzol und Ethylenglykol-dimethacrylat; organischer Verbindungen, die eine polymerisierbare Doppelbindung enthalten, wie Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Vinylmethyletylketon, Vinylmethylether, Vinylacetat, Vinylformiat, Allylacetat, Methallylacetat, Acrylamid, Methacrylamid, N-Methylolmethacrylamid, N-Isopropylacrylamid, Glycidylacrylat, Glycidylmethacrylat, Acrolein, Methacrolein, Allylalkohol, 2-Hydroxyethylacrylat, 2-Hydroxyethyl-methacrylat, 2-Methoxyethylacrylat, n-Butylacrylat, sec-Butylacrylat, Isobutylacrylat, t-Butylacrylat, n-Butylmethacrylat, sec-Butylmethacrylat, Isobutyl-methacrylat, t-Butyl-methacrylat, Methylacrylat, Ethylacrylat, n-Propylacrylat, iso-Propylacrylat, Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, n-Propyl-methacrylat und Isopropylmethacrylat; und polymerisierbarer cyclische Verbindungen, wie Ethylenoxid, Propylenoxid, 2-Methyltetrahydrofuran, Styroloxid, Butylenoxid und Glycidylether, einschließen.
Das Sulfonsäuremonomer kann Isoprensulfonsäure, Ethylensulfonsäure, Vinylsulfonsäure, Styrolsulfonsäure, α-Methylstyrolsulfonsäure, 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure, Sulfoethylacrylat und sulfoniertes Dicyclopentadien einschließen.
Das unterschiedliche polymerisierbare Monomer kann aliphatische Dienverbindungen, wie 1,3-Butadien und Isopren; aromatische Verbindungen, die eine polymerisierbare Doppelbindung enthalten, wie Styrol, α-Methylstyrol und Vinyltoluol; Alkyl(meth)acrylate, wie Methylacrylat, Ethylacrylat, 2-Ethylhexyl acrylat, Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, 2-Hydroxyethylacrylat und 2-Hydroxyethyl-methacrylat; polymerisierbare Cyanverbindungen, wie Acrylonitril und Methacrylonitril; organische Verbindungen, die eine polymerisierbare Doppelbindung enthalten, wie Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Vinylmethylethylketon, Vinylmethylether, Vinylacetat, Vinylformiat, Allylacetat, Methallylacetat, Acrylamid, Methacrylamid, N-Methylolmethacrylamid, N-Isopropylacrylamid, Glycidylacrylat, Glycidylmethacrylat, Acrolein, Methacrolein und Allylalkohol; und polymerisierbare cyclische Verbindungen, wie Ethylenoxid, Propylenoxid, 2-Methyltetrahydroxyfuran, Styroloxid, Butylenoxid und Glycidylether, einschließen.
Als Hydrogelteilchen, die aus einem Sulfonsäuremonomer und einem wasserlöslichen vernetzbaren Monomer bestehen, sind z.B. Hydrogelteilchen, die aus einem Polymer des vorstehend beschriebenen Sulfonsäuremonomers mit einem wasserlöslichen vernetzbaren Monomer, wie N,N'-Methylenbisacrylamid, bestehen, verwendbar. Solche Teilchen können durch das kräftige Mischen einer wässrigen Lösung des Sulfonsäuremonomers, des wasserlöslichen vernetzbaren Monomers und eines Radikalreaktionsinitiators mit einem nicht-polaren Lösungsmittel, zu dem ein grenzflächenaktives Mittel gegeben wurde, um eine reversible Mizelle vom Wasser-in-Öl-Typ zu bilden, gefolgt von einer bei 50 bis 100°C durchgeführten Umsetzung, erhalten werden.
Die Teilchen, an denen polyanionische Verbindungen gebunden sind, können Teilchen einschließen, die Teilchen mit einer funktionellen Gruppe, wie einer Epoxygruppe, einer Aminogruppe, einer Aldehydgruppe, einer Carboxylgruppe, einer Hydroxylgruppe oder einer Säurechloridgruppe, auf den Teilchenoberflächen umfassen, die ein Polyanion mit einer Vielzahl an Sulfonsäuregruppen und/oder Carboxylgruppen im Molekül direkt oder über einen Haftvermittler oder ein Trennelement tragen. Das Polyanion kann z.B. polymere Verbindungen, die mittels Polymerisation oder Copolymerisation eines Sulfonsäuregruppen enthaltenden Monomers und/oder eines Carbonsäuremonomers und des Weiteren gegebenenfalls eines davon verschie denen Monomers erhalten wurden; Wolframatophosphorsäuren; und Polyphosphorsäuren einschließen.
Als die anionischen anorganischen Teilchen können bevorzugt auf SiO₂-Al₂O₃-basierende Teilchen, in die Sulfonsäuregruppen eingeführt wurden, wie aktivierter Ton oder ähnliches, verwendet werden. Im Falle partikulärer Materialien aus Glas, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Aktivkohle und ähnlichem können deren Oberflächen mit einem Polymer mit einer Sulfonsäuregruppe oder einer Carboxylgruppe beschichtet sein. Solch ein Polymer kann Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Polystyrolsulfonsäure und Copolymere aus einem Monomer, das eine Aufbaueinheit eines dieser Polymere ist, mit einem hydrophilen Monomer einschließen. Das hydrophile Monomer kann hydrophile Acrylatmonomere und hydrophile Methacrylatmonomere einschließen. Daneben kann die Carboxylgruppe im Falle von Glas oder Siliciumdioxid mittels einer ersten Einführung einer Aminogruppe unter Verwendung eines Silanhaftmittels, wie γ-Aminopropyltriethoxysilan, gefolgt von einer Umsetzung mit Bernsteinsäureanhydrid oder Bernsteinsäure in Gegenwart von Carbodiimid eingeführt werden. Die Sulfonsäuregruppe kann mittels einer ersten Einführung einer Aldehydgruppe durch die Behandlung mit Glutaldehyd nach der Behandlung mit dem Silanhaftmittel, gefolgt von der Umsetzung mit 2-Aminoethansulfonsäure, eingeführt werden.
Die in der Erfindung verwendeten viren-bindenden Teilchen können ein magnetisches Material im Inneren oder auf den Oberflächen der Teilchen umfassen.
Dieses magnetische Material kann bevorzugt nur im Inneren eingearbeitet sein und auf den Oberflächen nicht frei vorliegen. In der Erfindung ermöglicht die Einarbeitung des magnetischen Materials in die viren-bindenden Teilchen das Sammeln der Teilchen auf Grund des den Teilchen eigenen Magnetismus, und macht eine Gewinnung mittels Zentrifugation oder ähnlichem überflüssig. Dies ermöglicht nicht nur eine Verkürzung der Untersuchungsdauer, sondern vereinfacht eine Automation der Untersuchung und Diagnose. Solch ein magnetisches Material kann z.B. Ferrite verschiedener Typen, wie Eisen(II, III)-oxid (Fe₃O₄) und γ-Eisen(III)-oxid (γ-Fe₂O₃), oder Metalle, wie Eisen, Mangan, Kobalt, Chrom, oder Legierungen jeder dieser Metalle einschließen, wobei jede davon verwendet werden kann.
Das magnetische Material kann in einer Menge von nicht weniger als 10 Gew.-% enthalten sein, und insbesondere von 20 bis 100 Gew.-%, bevorzugt von 20 bis 90 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der viren-bindenden Teilchen. Wenn es in zu geringer Menge vorliegt, können keine gute magnetischen Trenneigenschaften in den viren-bindenden Teilchen erreicht werden. Als Ergebnis dauert es in dem später beschriebenen verfahren der Virenabtrennung ziemlich lange, die viren-bindenden Teilchen von den Proben, wie Blut oder Körperflüssigkeiten, abzutrennen und somit kann in einigen Fällen unerwünschterweise keine große Zeiteffizienz erreicht werden.
Um das magnetische Material in die viren-bindenden Teilchen einzuarbeiten, können die nachstehenden Verfahren eingesetzt werden.

(a) das magnetische Material wird in einem Polymerisationsbestandteil dispergiert, der das kationische Monomer oder das anionische Monomer enthält, und die Polymerisation erfolgt in diesem Zustand. Die Polymerisation kann mittels eines Verfahrens, wie einer herkömmlichen Emulsionspolymerisation, Suspensionspolymerisation oder Dispersionspolymerisation, durchgeführt werden.
(b) ein Polymerisationsbestandteil, der das kationische Monomer oder das anionische Monomere enthält, wird polymerisiert, um Polymerteilchen zu synthetisieren, und danach werden Schichten eines magnetischen Materials auf den Teilchenoberflächen gebildet.
(c) auf den Oberflächen der im vorstehenden (a) oder (b) erhaltenen Teilchen werden des Weiteren Polymerschichten gebildet, die aus einem Polymerisationsbestandteil bestehen, der das kationische Monomer oder das anionische Monomer enthält.

In einigen Fällen enthalten die so erhaltenen viren-bindenden Teilchen in ihrem Dispersionsmedium ein Emulgiermittel, ein Dispersionsmittel, nicht-umgesetzte Monomere, ein wasserlösliches Polymer, ein Polymerisationsinitiator-Zersetzungsprodukt und ähnliches. Diese Substanzen weisen ein hohes Potential auf, im Schritt des Nucleinsäure-Amplifikationstests zu Reaktionsinhibitoren zu werden. Dementsprechend werden sie bevorzugt aus dem Dispersionsmedium der viren-bindenden Teilchen, z.B. mittels des in Adv. Colloid Interface Sci., 81, 77–165 (1999) offenbarten Verfahrens, entfernt.
(Mehrwertige Metallverbindung)
In der Erfindung kann zusammen mit den viren-bindenden Teilchen eine mehrwertige Metallverbindung zu der Probe gegeben werden, wodurch die Viren in einigen Fällen in einem größeren Ausmaß an die viren-bindenden Teilchen gebunden werden können.
Hier schließen die mehrwertigen Metalle z.B. Be, Mg, Sr, Ba, Ti, Zr, Cr, Mo, W, Mn, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Zn, Cd, Hg, Al, Ga, Si, Ge, Sn, Pb, P, As, Sb und Bi ein. Die mehrwertige Metallverbindung bezieht sich auf eine Verbindung, die bei der Dissoziation in Wasser zur Bildung von zwei- oder höherwertigen Kationen geeignet ist, darunter Chloride, Hydroxide, Carbonsäureverbindungen, Schwefelsäureverbindungen, Salpetersäureverbindungen, Essigsäureverbindungen und Salzsäureverbindungen dieser mehrwertigen Metalle. Unter diesen mehrwertigen Metallverbindungen ist Magnesiumchlorid und ähnliches bevorzugt.
Die mehrwertige Metallverbindung kann in solch einer Menge verwendet werden, dass sie in einer Reaktionsmischung, die gebildet wird, wenn die viren-bindenden Teilchen und die Probe gemischt werden, üblicherweise in einer Konzentration von 0,1 bis 100 mmol/l vorliegt.
– Reagenz zur Virenabtrennung –
In der Erfindung umfasst das Reagenz zur Virenabtrennung die vorstehenden viren-bindende Teilchen und die vorstehende mehrwertige Metallverbindung.
Für das Herstellungsverfahren für das Reagenz gibt es keine Einschränkungen. Das Reagenz zur Virenabtrennung kann in einer Form vorliegen, in der die mehrwertige Metallverbindung zu einer Dispersion gegeben wurde, die durch das Dispergieren der viren-bindenden Teilchen in einem wässrigen Medium hergestellt wurde, oder in einer Form, in der die Dispersion und die mehrwertige Metallverbindung getrennt aufbewahrt werden, so dass sie unmittelbar vor ihrer Verwendung gemischt werden.
Jeder Virus in einer Probe, wie Plasma oder Serum, wird mit hoher Effizienz abgetrennt, und somit werden die viren-bindenden Teilchen üblicherweise nicht in der Säulenchromatografie, sondern in einem Chargenverfahren verwendet. Dementsprechend weisen die Teilchen Teilchendurchmesser von 0,05 μm bis 300 μm, bevorzugt von 0,1 μm bis 100 μm und bevorzugter von 0,2 μm bis 80 μm auf. Solange die Teilchen Teilchendurchmesser in diesem Bereich aufweisen, sind sie für die Zwecke der Erfindung verwendbar. Teilchen mit Teilchendurchmessern von kleiner 0,05 μm sind unerwünscht, da solche Teilchen die Durchführung einer Zentrifugation mit einer größerer Umdrehungszahl oder einer längeren Umdrehungsdauer erforderlich machen, wenn sie von Blut oder Körperflüssigkeit abgetrennt werden, so dass das Gerät eine größere Größe aufweisen muss oder keine hohe Zeiteffizienz erreicht werden kann. Teilchen mit Teilchendurchmessern von größer 300 μm sind ebenfalls unerwünscht, da solche Teilchen eine geringere Effizienz aufweisen, was das Einfangen von Viren angeht, und es in einigen Fällen unmöglich machen, die Viren gut abzutrennen. Was die Teilchenform der viren-bindenden Teilchen der Erfindung angeht, so müssen die Teilchen nicht kugelförmig sein und können unregelmäßige Formen aufweisen. Was den Teilchendurchmesser der Teilchen angeht, die nicht kugelförmig sind, so wird ein Mittelwert der größten Längen und der kleinsten Breiten der einzelnen Teilchen gefunden.
– Abtrennung der Viren –
Das erfindungsgemäße Verfahren der Virenabtrennung umfasst die nachstehenden Schritte:
Zugabe der vorstehenden viren-bindenden Teilchen zu einer Probe, die möglicherweise Viren enthält, um eine Bindung der Viren an die Teilchen zu ermöglichen; und
das Abtrennen der Teilchen, an die die Viren gebunden wurden, von der Probe, um die Viren zu gewinnen.
Ein Verfahren zur Abtrennung von Viren mittels des Reagenzes zur Virenabtrennung der Erfindung wird nachstehend genauer beschrieben.
Das in der Erfindung verwendete Reagenz zur Virenabtrennung weist die Eignung auf, Viren verschiedener Art abzutrennen. Beispielsweise können damit Hepadna-Viren (wie der Hepatitis B-Virus), Adeno-Viren, Flavi-Viren (wie der Japanische B-Enzephalitis-Virus), Herpes-Viren (wie der Herpes-simplex-Virus, der Varicella-zoster-Virus, der Cytomegalo-Virus oder der EB-Virus), Poken-Viren, Parvo-Viren (wie der adenoverwandte Virus), Orthomyxo-Viren (wie der Influenza-Virus), Rhabdo-Viren (wie der Rabies-Virus), Retro-Viren (wie der Human Immunodeficiency-Virus) und der Hepatitis C-Virus abgetrennt werden.
Proben, die einer Virenabtrennung mittels des Reagenzes zur Virenabtrennung der Erfindung unterzogen werden sollen, können Körperflüssigkeiten, wie Plasma, Serum, Zell-Lysat, Harnstoff und Speichel und die Flüssigkeit kultivierter Zellfragmente einschließen. Solche Proben können so wie sie sind verwendet werden, oder sie können als Proben verwendet werden, nachdem sie für verschiedene Zwecke verdünnt wurden.
Die in der Erfindung verwendeten viren-bindenden Teilchen werden wünschenswerterweise in Form eines Reagenzes zur Virenabtrennung, das durch viren-bindende Teilchen in einem Medium, wie Kochsalzlösung, hergestellt wurde, zu der Probe gegeben. Die Menge in der das in der Erfindung verwendete Reagenz zur Virenabtrennung zu einer Probe gegeben wird, hängt von der Konzentration der in der Probe vorhandenen Viren ab. Es kann so zugegeben werden, dass die viren-bindenden Teilchen in dem Reagenz zur Virenabtrennung üblicherweise in einer Menge von 0,05 bis 50 Gewichts-%, und bevorzugter von 0,1 bis 20 Gewichts-%, bezogen auf das Gewicht der Probe, vorhanden sind. Wird es in einer zu kleinen Menge zugegeben, so ist die Zahl der Viren, die an die viren-bindenden Teilchen binden können, beschränkt, was zu einer schlechten Abtrenneffizienz führt. Eine Zugabe in zu großer Menge erfordert die Verwendung einer Lösung zum Ablösen in großer Menge, wenn die gebundenen Viren auf einer späteren Stufe abgelöst werden, was zu einer geringeren Abtrenneffizienz führt.
Die viren-bindende Teilchen, die die Viren in einer Probe adsorbiert haben, werden mittels Zentrifugation oder natürlicher Sedimentation oder in dem Fall, in dem die viren-bindenden Teilchen ein magnetisches Material enthalten, mittels magnetischer Trennung von der Probe abgetrennt. Da die in der Erfindung verwendeten Teilchen Teilchendurchmesser in einem Bereich von 0,05 bis 300 μm aufweisen, können die Teilchen mittels einer Zentrifuge gut abgetrennt werden.
Die so abgetrennten viren-gebundenen Teilchen werden gegebenenfalls mit einem niedrig-konzentrierten Puffer gewaschen und danach üblicherweise zum Schritt der Abtrennung der Viren von den Teilchen bewegt. Als das Verfahren zum Abtrennen der Viren von den Teilchen ist ein Verfahren verfügbar, in dem eine Salzlösung veranlasst wird, eine Dissoziation der Viren von den viren-gebundenen Teilchen zu bewirken. Als die Salzlösung kann eine hochkonzentrierte Kaliumbromid-, Natriumbromid-, 1,5 M Natriumchlorid-, 1 mM Wolframatophosphorsäure-Lösung oder 1 M Natriumthiocyanat verwendet werden. Die so von den Teilchen abgetrennten Viren werden entsprechend dem Abtrennungszweck weiterbehandelt. Beispielsweise werden die Viren einer Extraktion der Nucleinsäuren unterzogen. Die Extraktion der Nucleinsäure kann erfolgen, während die Viren an den Teilchen gebunden sind. Beispielsweise kann ein Puffer in kleiner Menge zu den von der Probe abgetrennten viren-bindenden Teilchen gegeben werden, gefolgt von einem Erwärmen, um die Nucleinsäure der Viren direkt zu extrahieren, oder es kann ein im Handel erhältliches Extraktionsreagenz direkt zu den viren-gebundenen Teilchen gegeben werden, um die Nucleinsäure der Viren zu extrahieren.
– Virennachweis –
Das erfindungsgemäße Verfahren des Virennachweises umfasst, nach dem Schritt, in dem die in der Erfindung verwendeten Teilchen, an die die Viren wie vorstehend beschrieben gebunden wurden, von der Probe abgetrennt und gesammelt wurden, den nachstehenden Schritt:
Unterziehen der so abgetrennten Viren einem Nucleinsäure-Amplifikations-Test.
Für den Nucleinsäure-Amplifikations-Test (NAT) der Viren gibt es keine besonderen Einschränkungen. Beispielsweise können das PCR-Verfahren (polymerization chain reaction – Polymerase-Kettenreaktion) von F. Hoffman-La Roche Ltd., das TMA-Verfahren (transcription mediated amplification-hybridization protection assay) von Gen-Probe Inc., das LCR-Verfahren (ligase chain reaktion – Ligase-Kettenreaktion) von Abbott Laboratories, das ICAN-Verfahren (Isothermal und chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid) von Takara Shuzo Co. und das LAMP-Verfahren (Loop-mediated isothermal amplification of DNA – Schleifen vermittelte isotherme DNA-Amplifikation) von Eiken Chemical Co. eingesetzt werden.
In dem Virennachweisverfahren, in dem dieses Verfahren der Abtrennung von Viren angewandt werden, sind die Viren in der Probe, die einem Nucleinsäure-Amplifikations-Test unterzogen werden sollen, bereits abgetrennt worden, und somit können die Viren selbst dann wirkungsvoll nachgewiesen werden, wenn die in der Originalprobe oder in der Probe enthaltenen Viren in sehr kleiner Menge vorliegen.
Die in der Erfindung verwendeten viren-bindenden Teilchen können auch zum Nachweis von viralen Proteinen in einer Probe verwendet werden.
Genauer gesagt ist ein Verfahren verfügbar, in dem die in der Erfindung verwendeten viren-bindenden Teilchen mit einer Probe gemischt werden und das auf den Teilchen adsorbierte Virus-Exosporium-Protein mit einem markierten Antikörper nachgewiesen wird. In diesem Verfahren kann die Art des markierten Antikörpers verändert werden, um Virus-Exosporium-Proteine verschiedener Arten nachzuweisen.
BEISPIELE
Beispiele der Erfindung sind nachstehend angegeben. Die Erfindung soll in keinster Weise durch diese Beispiele eingeschränkt werden. Nachstehend sind mit "Teil(e)" "Gewichtsteil(e)" gemeint, solange nichts anderes angegeben ist.
Der Teilchendurchmesser der in diesen Beispielen erhaltenen viren-bindenden Teilchen und die Menge der in den Teilchen vorhandenen kationischen Gruppen wurden auf die nachstehende Weise gemessen.
– Messung des Teilchendurchmesser:
Eine Fotografie der Teilchen wurde mittels eines optischen Mikroskops, eines Rasterelektronenmikroskops oder eines Transmissionselektronenmikroskops angefertigt und die Teilchendurchmesser von 200 Teilchen wurden gemessen, um ihren Mittelwert zu bestimmen.
– Menge der in den Teilchen vorhandenen kationischen Gruppen:
(1) Leitfähigkeits-Titrieranalyse
Die viren-bindenden Teilchen wurden zweimal mittels Zentrifugation oder magnetischer Abtrennung mit reinem Wasser gewaschen und ein Ionenaustauscherharz vom Mischbett-Typ wurde in einer Menge von 5 g pro 1 g der Teilchen zugegeben. Die erhaltene Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt und danach wurde das Ionenaustauscherharz vom Mischbett-Typ abfiltriert. Diese Reinigung mit dem Ionenaustauscherharz vom Mischbett-Typ wurde zweimal wiederholt. Die resultierenden gereinigten Teilchen wurden unter Verwendung einer normalen Schwefelsäurelösung als Titrant titriert. Dieses Verfahren wurde in den Beispielen 1 bis 3 eingesetzt.
(2) Nicht wässrige Titrieranalyse
Die viren-bindenden Teilchen wurden auf die gleiche Weise wie im vorstehenden Punkt (1) gereinigt. Danach wurde das gereinigte Produkt getrocknet und in Chloroform dispergiert, und anschließend wurde das chloroform-unlösliche Material abfiltriert, und danach wurde das erhaltene Filtrat einer Titration unter Verwendung einer Normallösung aus Perchlorsäure/Essigsäure-Lösung unterzogen, um die Menge der kationischen Gruppen zu bestimmen. Dieses Verfahren wurde in den Beispielen 4 bis 6 eingesetzt.
– Menge der in den Teilchen vorhandenen anionischen Gruppen:
Zu ungefähr 10 g Teilchen wurden 90 g ionen-ausgetauschtes Wasser und 30 g einer Anion/Kation-Austauscherharz-Mischung (AMBERLITE MB3, Handelsname, von Organo K. K. erhältlich) gegeben und die erhaltene Mischung wurde 1 Stunde lang vorsichtig gerührt. Das Ionenaustauscherharz wurde mit einem Nylonsieb (48 Maschen; Porengröße: 295 μm) abfiltriert und die Menge der Teilchen wurde ermittelt, gefolgt von einer Leitfähigkeits-Titrieranalyse unter Verwendung einer 0,01 mol/l Natriumhydroxidlösung, um die Menge der anionischen Gruppen zu ermitteln.
Bezugsbeispiel 1
Aceton wurde zu einem öligen magnetischen Fluid MARPO MAGNA FV 55, Handelsname, von Matsumoto Yushi Seiyaku, Co., Ltd. erhältlich, gegeben, um eine Fällungssedimentation von Teilchen zu veranlassen, gefolgt von einem Trocknen, um ein superparamagnetisches Material vom Ferrit-Typ mit lipophil-behandelten Teilchenoberflächen (Teilchendurchmesser: 0,01 μm) zu erhalten.
Danach wurden zu 40 Teilen (bezogen auf das Gewicht; das gleiche gilt nachstehend) des superparamagnetischen Materials 90 Teile Cyclohexyl-methacrylat, 10 Teile des Chlorids von Trimethylaminoethyl-methacrylat und 3 Teile Benzoylperoxid (Polymerisationsinitiator) gegeben, und das resultierende System wurde gemischt und gerührt, um das superparamagnetische Material gleichmäßig zu dispergieren, wodurch eine Monomerzusammensetzung hergestellt wurde.
Inzwischen wurden 10 Teile Polyvinylalkohol, 0,5 Teile Natriumlaurat und 0,1 Teile Polyethylenoxid-nonylphenylether in 1.000 Teilen Wasser gelöst, wodurch eine wässrige Monomerzusammensetzung hergestellt wurde.
In die so erhaltene wässrige Monomerzusammensetzung wurde die vorstehende Monomerzusammensetzung gegeben, in der das superparamagnetische Material dispergiert worden war, und die Mischung wurde vorausgehend mittels eines Homogenisators gerührt, gefolgt von einer Dispersionsbehandlung mittels eines Ultraschall-Dispersionsgeräts, wodurch eine Suspension (eine Öltropfendispersion) hergestellt wurde, in der Öltropfen (Ölphase) mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 1 μm in dem wässrigen Medium dispergiert waren.
Anschließend wurde die so erhaltene Suspension in einen Dreihalskolben mit einem Volumen von 2 Litern, der mit einem Rührer ausgestattet war, eingebracht, und dieses System wurde auf eine Temperatur von 75°C erwärmt, um die Monomere in den Öltropfen über einen Zeitraum von 5 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre und unter Rühren zu polymerisieren (Suspensionspolymerisation), wodurch die viren-bindenden Teilchen der Erfindung hergestellt wurden.
Bezugsbeispiel 2
Viren-bindende Teilchen wurden auf die gleiche Weise wie in Bezugsbeispiel 1 hergestellt, außer dass die darin verwendeten 10 Teile des Chlorids von Trimethylaminoethyl-methacrylat durch 10 Teile Dimethylaminoethyl-methacrylat ersetzt worden waren.
Bezugsbeispiel 3
Viren-bindende Teilchen wurden auf die gleiche Weise wie in Bezugsbeispiel 1 hergestellt, außer dass das darin verwendete Cyclohexyl-methacrylat in einer Menge von 100 Teilen verwendet worden war, kein Chlorid des Trimethylaminoethyl-methacrylats verwendet worden war und die 3 Teile Benzoylperoxid (Polymerisationsinitiator) durch 5 Teile eines zweiwertiges Säuresalzes von 2,2'-Azobis(2-amidinopropan) ersetzt worden waren.
Beispiel 4

(1) Magnetische Polymerteilchen wurden auf die gleiche Weise wie in Bezugsbeispiel 1 hergestellt, außer dass das darin verwendete Cyclohexyl-methacrylat in einer Menge von 95 Gewichtsteilen verwendet worden war, und die 10 Teile des Chlorids von Trimethylaminoethyl-methacrylat durch 5 Teile Methacrylsäure ersetzt worden waren.
(2) Die im vorstehenden Punkt (1) erhaltenen magnetischen Polymerteilchen wurden in 5 mM wässriger Natriumhydroxidlösung dispergiert, gefolgt von einer 12 Stunden langen Behandlung bei 80°C, um carboxy-modifizierte magnetische Polymerteilchen zu erhalten.
(3) 1 g der so erhaltenen carboxy-modifizierten magnetischen Polymerteilchen wurde zu 20 ml eines 10 mM MES-Puffers (pH-Wert von 6) gegeben, und 1 ml einer wässrigen 30%igen Lösung von Polyethylenimin (Zahlenmittel des Molekulargewichts: 70.000) und 0,2 g eines wasserlöslichen Carbodiimid-Reagenzes, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid (EDC-Hydrochlorid), wurden des Weiteren zugegeben, wobei 2 Stunden lang eine Umsetzung bei 20°C durchgeführt wurde, um die viren-bindenden Teilchen der Erfindung zu erhalten.
(4) Zu der erhaltenen Reaktionsmischung wurden 5 g Ionenaustauscherharz vom Mischbett-Typ gegeben, und danach wurde das Ionenaustauscherharz vom Mischbett-Typ mittels Filtration entfernt. Diese Reinigung mit dem Ionenaustauscherharz vom Mischbett-Typ wurde zweimal wiederholt, gefolgt von einem Trocknen.

Die so getrockneten magnetischen Polymerteilchen wurden in 10 ml Chloroform gelöst, und das magnetische Material wurde mittels Filtration abgetrennt und einer nicht-wässrigen Titration mit 0,01 mol/l einer Perchlorsäure/Essigsäure-Lösung unterzogen, und es wurde gefunden, dass der Gesamtamino-Stickstoff, der mit den im vorstehenden Punkt (2) erhaltenen magnetischen Polymerteilchen kombiniert worden war, in einer Menge von 45,0 μmol/g vorlag.
Bezugsbeispiel 5

(1) 1 g (Trockengewicht) der auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4, Schritt (2) erhaltenen carboxy-modifizierten magnetischen Polymerteilchen wurde zu 20 ml eines 10 mM MES-Puffers gegeben, und 1 ml eines wässrigen 1%igen Poly-L-lysin-hydrogenbromids (Zahlenmittel des Molekulargewichts: 300.000) und 0,2 g eines wasserlöslichen Carbodiimid-Reagenzes, EDC-Hydrochlorid (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid), wurden des Weiteren zugegeben, wobei 2 Stunden lang eine Umsetzung bei 20°C durchgeführt wurde, um viren-bindende Teilchen zu erhalten, die aus magnetischen Teilchen, an denen Poly-L-lysin gebunden war, bestanden.
(2) Die so erhaltenen Poly-L-lysin-gebundenen magnetischen Teilchen wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel (4), Schritt (4) gereinigt, gefolgt von einer Trocknung. Die resultierenden Teilchen wurden in 10 ml Dimethylsulfoxid gelöst und das magnetische Material wurde mittels Filtration abgetrennt, und anschließend einer nicht-wässrigen Titration mit einer 0,01 mol/l Perchlorsäure/Essigsäure-Lösung unterzogen, wobei gefunden wurde, dass der Gesamtamino-Stickstoff, der mit den im vorstehenden Punkt (1) erhaltenen magnetischen Polymerteilchen kombiniert worden war, in einer Menge von 22,0 μmol/g vorlag.

Beispiel 6

(1) Glycidyl-modifizierte magnetische Teilchen wurden auf die gleiche Weise wie in Bezugsbeispiel 1 erhalten, außer dass die 10 Teile des Chlorids von Trimethylaminoethyl-methacrylat durch 10 Teile Glycidyl-methacrylat ersetzt worden waren.
(2) 1 g (Trockengewicht) der erhaltenen glycidyl-modifizierten magnetischen Teilchen wurden in 20 ml destilliertem Wasser suspendiert, das 1% Pyridin enthielt, und 1 ml einer wässrigen 30%igen Lösung von Polyethylenimin (Zahlenmittel des Molekulargewichts: 70.000) wurde des Weiteren dazugegeben, wobei 24 Stunden lang eine Umsetzung bei 60°C durchgeführt wurde, um die viren-bindenden Teilchen der Erfindung zu erhalten, die aus magnetischen Teilchen, an denen Polyethylenimin gebundenen war, bestanden.
(3) Die so erhaltenen polyethylenimin-gebundenen magnetischen Teilchen wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4, Schritt (4) gereinigt, gefolgt von einer Trocknung. Die resultierenden Teilchen wurden in 10 ml Chloroform gelöst, das magnetische Material wurde mittels Filtration abgetrennt und anschließend einer nicht-wässrigen Titration mit einer 0,01 mol/l Perchlorsäure/Essigsäure-Lösung unterzogen, wobei gefunden wurde, dass der Gesamtamino-Stickstoff, der mit den im vorstehenden Punkt (2) erhaltenen magnetischen Polymerteilchen kombiniert worden war, in einer Menge von 20,0 μmol/g vorlag.

Tabelle 1

* Bezugsbeispiel

Beispiel 7 (Test 1)

(1) Wässrige Dispersionen der in den Bezugsbeispielen 1 bis 3 und 5 und den Beispielen 4 und 6 erhaltenen viren-bindenden Teilchen wurden gereinigt und danach wurde die Konzentration des Teilchen-Feststoffs unter Verwendung einer physiologischen Kochsalzlösung auf 5% eingestellt (Experiment Nr. 1 bis 6). Eine wässrige Dispersion der in Bezugsbeispiel 2 erhaltenen viren-bindenden Teilchen wurde ebenfalls gereinigt und danach wurde die Konzentration des Teilchen-Feststoffs unter Verwendung einer physiologischen Kochsalzlösung auf 5% eingestellt, und anschließend wurde Mangandichlorid so zugegeben, dass die Konzentration einen Wert von 100 mmol/l (Experiment Nr. 7) annahm.
(2) Zu 1 ml menschlichem Plasma, das 10⁴ Kopien/ml HBV (Hepatitis B-Virus) enthielt, wurden 100 μl der im vorstehenden Punkt (1) erhaltenen Teilchensuspension (5 Gewichts-%) gegeben, gefolgt von einem 10 Minuten langen Drehrühren bei Raumtemperatur.

Nachdem die Umsetzung beendet worden war, wurde die Mischung auf einem Stativ für eine magnetische Abtrennung angeordnet, um eine Trennung in Teilchen und Überstand zu bewirken, woraufhin der Überstand verwarfen und die Teilchen erhalten wurden. Zu den auf diese Weise erhaltenen Teilchen wurden 50 μl wässriges 1 M Natriumthiocyanat gegeben, und die erhaltene Mischung wurde 5 Minuten lang gerührt und danach auf einem Stativ für eine magnetische Abtrennung in Teilchen und Überstand getrennt, um den Überstand zu erhalten (abgetrennte Fraktion). Sein Endvolumen betrug ungefähr 50 μl.
Die abgetrennte Überstand-Fraktion wurde für eine Nucleinsäure-Extraktion mittels eines herkömmlichen Verfahrens verwendet, und die Menge der DNA wurde mittels des TaqMan-PCR-Verfahrens unter Anwendung des ABI PRISM TM7700 Sequenzermittlungssystems (von Perkin Elmer Applied Biosystems Corp. hergestellt) ermittelt. Um die DNA zu bestimmen, wurde im Verlauf einer 40fachen Amplifikation die Anzahl der Zyklen (Th-Zyklen), in denen die Fluoreszenzintensität einen gegebenen Referenzwert (Schwellenwert: Th) überschritt, auf einer Kalibrierungskurve aus DNA-Menge zu Th-Zyklen extrapoliert, die durch eine gleichzeitige Messung unter Verwendung der Verdünnungsreihe einer Probe, deren Viruskonzentration bekannt war, erstellt worden war.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 1
10 μl einer Heparin-Lösung (durch Lösen von 160/USP-Einheiten/mg Heparin in 5 ml einer 0,15 M Natriumchloridlösung hergestellt) und 75 μl 1 M MnCl₂ wurden zu 1 ml menschlichem Plasma gegeben, das 10⁴ Kopien/ml HBV enthielt, gefolgt von einem 20 Minuten langen Drehrühren bei Raumtemperatur.
Nachdem die Umsetzung beendet worden war, wurde die Mischung mittels einer Mikrozentrifuge mit geringer Geschwindigkeit 10 Minuten lang mit 15.000 UpM getrennt, und der gebildete Überstand wurde verworfen, um das Sediment zu erhalten. Zu dem auf diese Weise erhaltenen Sediment wurden 50 μl gesättigtes Kaliumbromid gegeben, um das Sediment aufzulösen (abgetrennte Fraktion). Sein Endvolumen betrug ungefähr 50 μl.
Die abgetrennte Fraktion wurde für eine Nucleinsäure-Extraktion mittels eines herkömmlichen Verfahrens verwendet, und die Menge der DNA wurde mittels des TaqMan-PCR-Verfahrens unter Anwendung des ABI PRISM TM7700 Sequenzermittlungssystems (von Perkin Elmer Applied Biosystems Corp. hergestellt) ermittelt. Um die DNA zu bestimmen, wurde im Verlauf einer 40fachen Amplifikation die Anzahl der Zyklen (Th-Zyklen), in denen die Fluoreszenzintensität einen gegebenen Referenzwert (Schwellenwert: Th) überschritt, auf einer Kalibrierungskurve aus DNA-Menge zu Th-Zyklen extrapoliert, die durch eine gleichzeitige Messung unter Verwendung der Verdünnungsreihe einer Probe, deren Viruskonzentration bekannt war, erstellt worden war.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

* Bezugsbeispiel

Wie vorstehend beschrieben ermöglicht die Verwendung der viren-bindenden Teilchen der Erfindung auf einfache Weise die gleichzeitige Behandlung einer großen Anzahl an Proben und die Abtrennung und Anreicherung bzw. Konzentrierung von Viren mittels einfacher Maßnahmen, wie einer Zentrifugation oder magnetischer Einwirkung. Außerdem beeinflussen die resultierenden Proben, die die abgetrennten, konzentrierten Viren enthalten, die Behandlung zur Nucleinsäure-Amplifikation nicht negativ. Das verfahren zur Abtrennung von Viren unter Verwendung solcher Teilchen ermöglicht, dass die Viren mit hoher Effizienz und in kurzer Zeit von Proben abgetrennt werden, die die Viren in sehr kleiner Menge enthalten. Das Verfahren der Virenbestimmung ermöglicht eine Bestimmmung der Viren mit hoher Genauigkeit.
Die in der Erfindung verwendeten viren-bindenden Teilchen mit den darauf aus den Proben adsorbierten Viren können auch für einen immunologischen Nachweis bzw. einen Immunassay verwendet werden.

Claims

Verfahren zur Abtrennung von Viren, das die nachstehenden Schritte umfasst: die Zugabe von viren-bindenden Teilchen zu einer Probe, die möglicherweise Viren enthält, um eine Bindung der Viren an die Teilchen zu ermöglichen; wobei die viren-bindenden Teilchen einen Teilchendurchmesser von 0,05 μm bis 300 μm aufweisen und ein Polyalkylimin auf ihren Oberflächen tragen; und das Abtrennen der Teilchen, an die die Viren gebunden wurden, von der Probe, um die Teilchen zu gewinnen.
Verfahren zur Abtrennung von Viren nach Anspruch 1, in dem eine mehrwertige Metallverbindung zusammen mit den Teilchen zu der Probe gegeben wird.
Verfahren zur Abtrennung von Viren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in dem es sich bei dem Polyalkylimin um Polyethylenimin handelt.
Verfahren zum Nachweis von Viren, das die nachstehenden Schritte umfasst: die Zugabe von viren-bindenden Teilchen zu einer Probe, die möglicherweise Viren enthält, um eine Bindung der Viren an die Teilchen zu ermöglichen; wobei die viren-bindenden Teilchen einen Teilchendurchmesser von 0,05 μm bis 300 μm aufweisen und ein Polyalkylimin auf ihren Oberflächen tragen; das Abtrennen der Viren von der Probe durch Abtrennen der Teilchen, an die die Viren gebunden wurden, von der Probe, um die Viren zu gewinnen; und das Unterziehen der so abgetrennten Viren einem Nucleinsäure-Amplifikationstest.
Verfahren zum Nachweis von Viren nach Anspruch 4, in dem eine mehrwertige Metallverbindung zusammen mit den Teilchen zu der Probe gegeben wird.
Verfahren zum Nachweis von Viren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, in dem es sich bei dem Polyalkylimin um Polyethylenimin handelt.
Verfahren zum Nachweis von Viren, das die nachstehenden Schritte umfasst: die Zugabe von viren-bindenden Teilchen zu einer Probe, die möglicherweise Viren enthält, um eine Bindung der Viren an die Teilchen zu ermöglichen; wobei die viren-bindenden Teilchen einen Teilchendurchmesser von 0,05 μm bis 300 μm aufweisen und ein Polyalkylimin auf ihren Oberflächen tragen; das Abtrennen der Viren von der Probe durch Abtrennen der Teilchen, an die die Viren gebunden wurden, von der Probe; und das Unterziehen der an die Teilchen gebundenen Viren einem Immunassay.
Verfahren zum Nachweis von Viren nach Anspruch 7, in dem eine mehrwertige Metallverbindung zusammen mit den Teilchen zu der Probe gegeben wird.
Verfahren zum Nachweis von Viren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, in dem es sich bei dem Polyalkylimin um Polyethylenimin handelt.