DE69027803T2

DE69027803T2 - Polymerträger

Info

Publication number: DE69027803T2
Application number: DE69027803T
Authority: DE
Inventors: Patrick L Coleman; Steven M Heilmann; Larry R Krepski; Dean S Milbrath; Jerald K Rasmussen; Margaret M Walker
Original assignee: Minnesota Mining and Manufacturing Co
Current assignee: 3M Co
Priority date: 1989-04-10
Filing date: 1990-04-04
Publication date: 1997-01-30
Anticipated expiration: 2010-04-05
Also published as: DE69027803D1; EP0392735A2; EP0392735A3; EP0392735B1; JPH02294308A; US5292840A; HK1008029A1; ES2088966T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Herstellen von Azlacton-funktionellen Trägern, einschließend polymeren Kügelchen, Membranen, Folien und Beschichtungen, und betrifft die so hergestellten Azlacton-funktionellen Träger. Die Azlacton-funktionellen Träger sind zur Anbringung funktioneller Materialien für die Schaffung neuartiger Addukt-Träger verwendbar. Die Addukt-Träger sind verwendbar als Komplexbildner, Katalysatoren und polymere Reagenzien, als Enzyme oder andere Protein-haltende Träger und als chromatographische Träger.

Ausgangssituation

Die Anbringung nützlicher Materialien, wie beispielsweise Katalysatoren, Reagenzien, Chelatbildner oder Komplexbildner und Proteine, an unlöslichen Trägern ist bekannt. Mit den zur Verfügung stehenden Vorteilen der leichten Entfernung von dem System und der Wiederherstellung, z.B. durch einfache Filtration, Regenerierung (sofern erforderlich) und Recyclieren in Verbindung mit der verbesserten Nutzung von Durchflußsystemen sowohl allgemeiner chemischer Bearbeitungsverfahren als auch diagnostischer Überwachungsprozeduren sind Materialien mit Trägerstoffen in der heutigen Technologie allgegenwärtig. Eine Bestätigung dieser Tatsache ist die Auflistung von "Polymer- Supported Reagents" ((Reagenzien auf Polymer-Trägern)) als ein separates Stichwort im Allgemeinen Sachregister der Chemical Abstracts beginnend ab 1982.
Was die Beschaffenheit des unlöslichen Trägermaterials betrifft, so wurden sowohl anorganische Polymere (als besonders bemerkenswert Silicagel und Aluminiumoxid) als auch organische Polymere eingesetzt. Zu einer allgemeinen Bevorzugung der organischen Polymer-Träger haben jedoch Faktoren beigetragen, wie beispielsweise erhöhte Kapazität aufgrund einer höheren Porosität (speziell bei den sogenannten Polymeren vom "Gel-Typ", die etwas quellen und einen relativ freien Zugriff durch Lösemittel und gelösten Stoff zu der innerhalb des Trägers gebundenen Funktionalität ermöglichen) und aufgrund der besseren Kontrolle der polaren Beschaffenheit des Trägers (durch Auswahl geeigneter Comonomere), von denen sich gezeigt hat, daß sie die Reaktionsgeschwindigkeit direkt beeinflussen. Das am umfangreichsten eingesetzte feste Trägermaterial war Polystyrol.
Die am häufigsten eingesetzte "anlagernde" Funktionalität bei Polystyrol-Trägern war die Chlormethylphenyl- Gruppe. Diese reaktionsfähigen festen Träger sind die sogenannten "Merrifield-Harze", so bezeichnet nach R.B. Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963)), der 1984 für diese und andere Leistungen den Nobelpreis für Chemie erhalten hat. Merrifield-Harze sind außerordentlich nützlich zur Ausführung von Festphasen-Peptidsynthesen, wobei jedoch ihre breite Anwendung als reaktionsfähige feste Träger beschränkt ist, und zwar wegen der relativen Unpolarität des hydrophoben Polystyrol-Grundgerüsts, wegen einer oftmals unvorhersagbaren Bindungsreaktion, die bei der nudeophilen Verdrängung von Chloridion auftritt, und wegen einer relativ geringen Kapazität von reaktionsfähigen Chlormethylphenyl- Gruppen pro Gramm Polymer. Das Chlormethylphenyl und andere reaktionsfähige Funktionalitäten wurden von N.K. Mathur, C.K. Narang und R.E. Williams, "Polymers as Aids in Organic Chemistry", Kapitel 2, Academic Press: New York (1980), diskutiert.
Der gegenwärtige Stand bei den reaktionsfähigen unlöslichen Trägern kann mit der Feststellung zusammengefaßt werden, daß es keinen Träger gibt, der für die vielen Anwendungen von Materialien mit festen Trägern umfassend geeignet ist. Das Spektrum der erforderlichen Eigenschaften variiert erstaunlich und hängt von der Endanwendung ab, worin so unterschiedliche Einsätze enthalten sind, wie beispielsweise das Vermitteln synthetischer organischer Umsetzungen, Entfernen von Edelmetallen aus Meereswasser oder von Schwermetallverunreinigungen aus Industrieabwassern, der Einsatz von Metallen auf Trägern als Katalysatoren zum Ausführen organischer Reaktionen und Polymerisationen, das Auflösen optischer Isomere, das Trennen von Biomakromolekülen und Anlagern von Biomakromolekülen.
Azlactone wurden bisher als Gruppen eingesetzt, die sich an unlöslichen Träger(stoffen) anlagern. Azlactone wurden jedoch auch in zwei Fällen als verwendbar vorgeschlagen.
Die US-P-4 070 348 lehrt die Darstellung von im Wasser quellfähigen, vernetzten von Perlen-Copolymeren mit 0,2 % ... 5 Molprozent vernetzendem Monomer und mindestens 10 Molprozent darin eingebautes wasserlösliches Comonomer. Die Copolymere sind mit Proteinen hauptsächlich über den Einschluß von Oxiran-Gruppen reaktionsfähig, die die einzigen, reaktionsfähigen beanspruchten Gruppen sind. Es wurden jedoch mehrere "aktivierte Carboxyl-Gruppen " (Spalte 4; Zeile 42) aufgelistet, die ein 2-Alkenylazlacton, 2- Isopropenyl-4,4-dimethyloxazolon-5 (Spalte 5; Zeilen 2-3) umfassen, wobei schematisch die Reaktion dieser Verbindung mit einer primären Amino-Gruppe eines Proteins dargestellt wird (Spalte 5; Zeilen 6...14). Keine zusätzliche Information oder hinweisende Offenbarung wird über den Einbau des Azlactons in ein hydrophiles, vernetztes Perl-Copolymer gegeben oder für die Reaktion eines Azlacton-funktionellen unlöslichen Trägers mit einem Protein oder einem beliebigen anderen funktionellen Material. Die vernetzten Perl- Copolymere nach US-P-4 070 348 werden alle zweckmäßig und im wesentlichen in einem wasserfreien Zustand dargestellt, d.h. es wird darauf Wert gelegt, Wasser auszuschließen.
L.D. Taylor, et al., "Makromol. Chem., Rapid Commun.", 3, 779 (1982), haben Azlactone vorgeschlagen, die als reaktionsfähige Gruppen an polymeren Trägern verwendbar sind. Es wird lediglich die Homopolymerisation in Masse von 2-Vinyl-4,4- dimethylazlacton zur Erzeugung eines polymeren "Pfropfens" beschrieben. Ein Vernetzen und die Erzeugung von polymeren Perlen finden keinerlei Erwähnung. Darüber hinaus wird mit einer gewissen Ausführlichkeit die Empfindlichkeit der Poly(azlactone) gegenüber Hydrolyse, d.h. Ringöffnungsreaktion mit Wasser (Gleichung (1)) beschrieben. Die Hydrolyse wird leicht durchführbar angesehen und läuft selbst bei Spuren von Feuchtigkeit ab, die oftmals in organischen Lösemitteln für das Homopolymer vorhanden sind:
Aufgrund dieser Neigung zur Hydrolyse ist es völlig überraschend, daß ein Azlacton-funktioneller Träger selektiv mit einem funktionellen Material im wäßrigen Medium reagieren könnte.

Zusammenfassung

Die vorliegende Erfindung gewährt drei Verfahren zur Darstellung von erfindungsgemäßen Trägern. Für die Darstellung von Azlacton-funktionellen Trägern sind mehrere Verfahren verfügbar. Eines der Verfahren besteht in der Aufbringung eines Alkenylazlacton-Monomers auf den Träger (wahlweise gemeinsam mit anderen Comonomeren) und der Polymerisation des Monomerslder Monomere am Ort, z.B. durch Photopolymerisation (unter Einsatz eines entsprechenden Photoinitiators).
Im Prozeß II der vorliegenden Erfindung werden funktionelle Trägerpartikel über eine Umkehrphasen-Suspensionspolymerisation dargestellt, worin in einer Suspension gemeinsam polymerisiert werden:
(i) 0 ... 89 Teile mindestens eines durch radikalische Additionspolymerisation polymerisierbaren, wasserlöslichen Monomers,
(ii) 1 ... 99,9 Molanteile mindestens eines Alkenylazlactons und
(iii) 0,1 ... 99 Molanteile mindestens eines hydrophilen vernetzenden Monomers.
Im Prozeß III der vorliegenden Erfindung werden die Azlacton-funktionellen Trägerpartikei dargestellt über eine Dispersionspolymerisationsreaktion, worin gemeinsam eine homogene Mischung polymerisiert wird, umfassend Lösemittel und:
(i) 0 ... 99 Molanteile mindestens eines Comonomers,
(ii) 1 ... 100 Molanteile mindestens eines Alkenylazlactons und
(iii) 0 ... 99 Molanteile mindestens eines vernetzenden Monomers.
Im Prozeß IV der vorliegenden Erfindung werden Azlacton-funktionelle Träger geschaffen, indem eine Lösung mit Azlacton-funktionellem Polymer auf einen festen Träger aufgetragen wird.
Die vorliegende Erfindung gewährt ebenfalls einen hydrophilen, Azlacton-funktionellen Träger, der nach dem vorgenannten Verfahren dargestellt wird.
In einem weiteren Aspekt gewährt die vorliegende Erfindung Addukt-Träger, die durch eine Ringöffnungsreaktion zwischen den Azlacton-funktionellen Träger der vorliegenden Erfindung und den funktionellen Materialien nach Anspruch 7 erzeugt werden. Die Addukt-Träger sind als Mittel zum Komplexieren, Katalysatoren, Reagenzien, Adsorbentien, chromatische Trägerstoffe und als biologisch aktive Träger verwendbar.
Die Reaktion der erfindungsgemäßen Azlactonfunktionellen Träger mit funktionellen Materialien, die mit dem Azlacton-Ring reagieren können (d.h. durch Ringöffnungsreaktion), liefern die Addukt-Träger der vorliegenden Erfindung. Wir haben entdeckt, daß diese Reaktion der Addtukt-Erzeugung in hohem Maße mit aufgelöstem Nucleophil in wäßriger Lösung abläuft, besonders wenn das Nucleophil eine primäre Amin-Funktionalität ist. Diese Selektivität der Reaktion ist noch überraschender, wenn man bedenkt, daß die Konzentration des Amin-Nucleophils an einem Proteinfunktionellen Material sehr häufig beispielsweise geringer ist als die von Wasser als Lösemittel. Bisher wurde angenommen, daß Azlacton-Gruppen überwiegend mit Wasser reagieren würden, d.h. hydrolysieren würden, anstatt mit einem aufgelösten Nucleophil zu reagieren.
Die hydrophile oder hydrophobe Beschaffenheit eines Trägers ist zum Festlegen seiner Einsatzfähigkeit außerordentlich wichtig. Ein offensichtlicher Vorteil eines hydrophilen Trägers besteht darin, daß viele der Operationen von Materialien auf Trägern in wäßrigen Medien ausgeführt werden können. Wasser ist scheinbar das ausschließliche Lösemittel für die Durchführung der Beseitigung von Edelmetallen oder giftigen Metallen bei der diagnostischen Überwachung von Biofluid-Komponenten und Biosystemen, sowie bei einer Reihe von chemischen Reaktionen, und oftmals ist es vorteilhaft, einen polymeren Träger einzusetzen, der in Wasser quillt. Das Lösemittel Wasser kann das zusätzliche Auftreten und die Wechselwirkung eines gelösten Stoffes und reaktionsfähiger Gruppen in dem hydrophilen Träger sowie an der Grenzfläche Träger/Wasser erleichtern.
Hydrophile Materialien auf polymeren Trägern finden ihre Anwendung und sind in nichtwäßrigen Systemen ebenfalls nützlich. Funktionelle Gruppen, die eine Hydrophilie vermitteln, sind stark polar, und die Funktionen von Material auf Trägern, die gegenüber Lösemitteleinwirkungen empfindlich sind, werden von der Polarität des polymeren Grundgerüsts stark beeinträchtigt, insbesondere hinsichtlich der Geschwindigkeit. Die Bedeutung des polymeren Grundgerüsts für die Festlegung der örtlichen Umgebung für ein Material auf Träger wurde von H. Morawetz, J. Macromol. Sci.- Chem., A-13, 311 (1979) erörtert.
Wie bereits erwähnt, offenbart die US-P-4 070 348 in Wasser quellfähige, vernetzte Perl-Copolymere ((auch bezeichnet als Copolymerkügelchen)) mit 0,2 ... 5 Molprozent vernetzendem Monomer und mindestens 10 Molprozent eines darin eingebauten wasserlöslichen Comonomers. Von dem Patentinhaber werden Kügelchen mit einem hohen Quellvermögen in Wasser angestrebt, d.h. das 5- ... 100-fache entsprechend der Offenbarung in Spalte 6, Zeilen 66 ... 67. Dieses hohe Quellvermögen wird als wichtig betrachtet, um für Proteine ein hohes Bindungsvermögen zu erreichen. In Spalte 9, Zeilen 30 ... 32 der US-P-4 070 348 wird ausgeführt, daß "der größte Teil der biologisch aktiven Substanzen im Inneren der gequollenen Partikel in den weitmaschigen "Hohlräumen" angetroffen werden".
Bei zahlreichen Anwendungen und speziell in der Chromatographie können Trägermaterialien, die ein hohes Quellvermögen in wäßrigen Medien zeigen, nicht ohne weiteres eingesetzt werden.
Wir haben unerwartet festgestellt, daß Azlacton-Träger mit bemerkenswert hohem Bindungsvermögen für funktionelle Materialien aus stark vernetzten Trägern erhalten werden können, die in Wasser nur sehr mäßig quellen, z.B. dreifach oder weniger. Bei Bedarf wird ein hoher Vernetzungsgrad durch Einbau von mehr als 5 und bis zu 99 Molanteilen (Molprozent) vernetzendes Monomer, vorzugsweise 7 ... 99 Molanteile, und mehr bevorzugt 10 ... 99 Molanteile und am meisten bevorzugt 30 ... 99 Molanteile von mindestens einem vernetzenden Monomer in die Azlacton-funktionellen polymeren Träger erzielt.
In der vorliegenden Patentschrift bedeuten:
"Azlacton-funktioneller Träger" ... ein Artikel, umfassend ein Azlacton-funktionelles Polymer oder ein mit mindestens auf einer Oberfläche eines Substrats beschichtetes Azlacton-funktionelles Polymer;
"Acryloyl" ... nicht nur 1-Oxo-2-propenyl, sondern auch 1-Oxo-2-methyl-2-propenyl, welches aus den Reaktionen der Methacryloylierung resultiert;
"Alkyl" ... den einwertigen Rest, der nach der Entfernung eines Wasserstoff-Atoms von einem gesättigten, linearen oder verzweigten Kohlenwasserstoff mit 1 bis 14 Kohlenstoff-Atomen verbleibt;
"Aryl" ... der einwertige Rest, der nach Entfernung eines Wasserstoff-Atoms von einer aromatischen oder heteroaromatischen Verbindung verbleibt, welche Verbindung aus einem Ring oder zwei kondensierten oder verketteten Ringen mit 5 bis 12 Ring-Atomen bestehen kann, die bis zu 3 Heteroatome einschließen, ausgewählt aus S, N und nichtperoxidischen Sauerstoff. Die Kohlenstoff-Atome können substituiert sein durch bis zu 3 Halogen-Atome, C&sub1;...C&sub4;- Alkyl, C&sub1;...C&sub4;-Alkoxy, N,N-Di(C&sub1;...C&sub4;-Alkyl)amino, Nitro, Cyano und C&sub1;...C&sub4;-Alkylcarboxylsäureester;
"Arenyl" ... den einwertigen Rest, der nach Entfernung eines Wasserstoff-Atoms von dem Alkyl-Abschnitt eines Kohlenwasserstoffes verbleibt, welcher Kohlenwasserstoff sowohl Alkyl- als auch Aryl-Gruppen mit 6 bis 26 Kohlenstoff-Atomen und Hetero-Atome umfaßt (worin die Hetero-Atome bis zu drei S, N- und nichtperoxidische Sauerstoff-Atome sind);
"Azlacton" ... 2-Oxazolin-5-on-Gruppen der Formel 1 und 2-Oxazin-6-on-Gruppen der Formel II;
"Teile" ... Teile bzw. Anteile bedeuten, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsanteile;
"Carboxylat" ...
worin M Wasserstoff, Ammonium oder ein Alkalimetall ist, wie beispielsweise Li, Na oder K;
"makroporös" ... vernetzte Polymere, bei denen die Konzentration der Vernetzungsmittel oder der bifunktionellen Monomere größer ist als 20 Teile und wobei kein Polymer, lsemittelfrei, oder porogen eingesetzt werden brauchen; "biologisch aktiv" ... Substanzen, die biochemisch, immunchemisch, physiologisch oder pharmazeutisch aktiv sind, wie beispielsweise Antikörper, antigene Substanzen, Enzyme, Cofaktoren, Inhibitoren, Lektine, Hormone, Rezeptoren, Koagulationsfaktoren, Aminosäuren, Histone, Vitamine, Drogen, Oberfächenmarker und mit ihnen wechseiwirkende Substanzen;
"Gel-Typ" ... bezieht sich auf die vernetzten Polymere, in denen die Konzentration von Vernetzungmitteln oder bifunktionellen Monomeren kleiner ist als 20 Teile.
Strukturen und Formeln, die in Klammern gesetzt dargestellt werden, sind Teilstrukturen der Polymere.

Detaillierte Beschreibung

Die vorliegende Erfindung gewährt Azlacton-funktionelle Träger, die auf mindestens einer ihrer Oberflächen Einheiten der Formel V aufweisen:
worin sind:
R¹ Wasserstoff oder CH&sub3;;
R² und R³ jedes unabhängig eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 14 Kohlenstoff-Atomen, eine Cycloalkyl-Gruppe mit 3 bis 14 Kohlenstoff-Atomen, eine Aryl-Gruppe mit 5 bis 12 Ring- Atomen, eine Arenyl-Gruppe mit 6 bis 26 Kohlenstoff-Atomen und Null bis 3 S-, N- und nichtperoxidischen O-Hetero-Atomen; oder R² und R³ können zusammengenommen mit dem Kohlenstoff- Atom, mit dem sie verbunden sind, einen carbozyklischen Ring bilden, der 4 bis 12 Ring-Atome enthält; sowie
n eine ganze Zahl Null oder 14
Diese Träger können vernetzte Azlacton-funktionelle polymere Kügelchen sein oder sie können feste Substrate sein, die auf mindestens einer Oberfläche mit einer Schicht eines Azlacton-funktionellen Polymers beschichtet sind. Diese Schicht kann eine Dicke im Bereich von 1 Nanometer bis 5 Millimeter haben. Verwendbare feste Substrate umfassen anorganische Feststoffe, wie beispielsweise Glas, Keramik, nichtgeglühtes Metall und Nichtmetalloxide, Tone, Zeolite und organische Polymere.
Die vorliegende Erfindung gewährt ebenfalls Addukt- Träger der Formel:
worin sind:
R¹, R², R³ und n wie vorstehend festgelegt, x -O-, -5-, - H- oder - R&sup4;, worin R&sup4; Alkyl oder Aryl ist, sowie
G der Rest HXG, der die Funktion des Adsorbierens, Komplexierens, Katalysierens, Separierens oder des Reagierens der Addukt-Kügelchen ((Addukt-Perlen)) übernimmt.
HXG kann beispielsweise eine biologisch aktive Substanz, ein Farbstoff, Katalysator, Reagens sein.
Die erfindungsgemäßen Azlacton-funktionellen Träger werden nach einem von mehreren Prozessen geschaffen:

Prozeß 1:

Zweistufige Umkehrphasen-Suspensionspolymerisation

Das Polymer und die Addukt-Träger von Prozeß 1, bei dem es sich nicht um einen Prozeß der vorliegenden Erfindung handelt und der in der US-A-4 737 560 beschrieben wurde, können nach dem im Reaktionsschema I nachfolgend dargestellten Prozeß geschaffen werden. Reaktionsschema (Prozeß I) I wasserlösliche Monomere vernetzende Monomere N-Acryloylaminosäuresalz Schritt Carboxylat-funktionelle Träger Cyclisierungsmittel Azlacton-funktionelle Träger funktionelles Material HXG Addukt-Träger
Die vernetzten, hydrophilen, Azlacton-funktionellen polymeren Träger der Formel V können in einem zweistufigen Prozeß hergestellt werden. Im ersten Schritt wird die folgende Gruppe von Monomeren in einer radikalischen Polymensationsreaktion umgesetzt:
(i) 0 ... 89 Molanteile mindestens eines wasserlöslichen Monomers;
(ii) 1 ... 99,9 Molanteile mindestens eines wasserlöslichen Salzes der N-(meth)acryloylaminosäure sowie
(iii) im Bereich von 0,1 ... 99 Molanteilen, vorzugsweise 7 ... 99, mehr bevorzugt 10 ... 99 und am meisten bevorzugt 30 ... 99 Molanteile mindestens ein vernetzendes Monomer.
Das Produkt der vorstehend beschriebenen Polymensationsreaktion sind vernetzte, hydrophile, Carboxylatfunktionelle Träger der Formel IV. Der zweite Schritt des Prozesses umfaßt das Behandeln der Carboxylat-funktionellen Träger mit einem Cyclisierungsmittel zur Bildung Azlactonfunktioneller Träger der Erfindung.
Der Grad der Hydrophilie des polymeren Trägers wird hauptsächlich von der eingesetzten Menge des wasserlöslichen Monomers bestimmt, obgleich eine gewisse Hydrophilie durch das Vernetzungsmittel und durch die erzeugten funktionellen Gruppen vermittelt wird, d.h. Amid-Amid, Amid-Ester oder Amid-Thiolester mit Amin, Alkohol oder Thiol-Nucleophilen (HXG wie vorstehend festgelegt), durch die Ringöffnungsreaktion Azlacton/Nucleophil (Schritt 3 des Reaktionsschemas 1). Im engeren Sinn der vorliegenden Erfindung erfolgt die Einbeziehung eines wasserlöslichen Monomers daher wahlweise. Geeignete wasserlösliche Monomere zeigen eine Löslichkeit von mindestens 3 Teilen in 100 Teilen Wasser. Bevorzugte Monomere umfassen Vinyl-Gruppen-enthaltende und Acryloyl- Gruppen-enthaltende Verbindungen. Eine repräsentative Zusammenstellung derartiger Monomere umfaßt Acrylamid, Methacrylamid, N,N-Dimethylacrylamid, Diacetonacrylamid, N-Vinylpyrrolidon, Hydroxyethylmethacrylat, 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure und ihre Salze, N-(3-Methacrylamidopropyl)- N,N,N-trimethylammoniumsalze, N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, Itaconsäure und Kombinationen davon. Bevorzugte wasserlösliche Monomere sind N,N- Dimethylacrylamid und N-Vinylpyrrolidon.
Die Monomere des N-Acryloylaminosäuresalzes umfassen Ammonium-, Natrium-, Kalium- und Lithiumsalze der N-Acrylaminosäuren der Formel VII und werden dargestellt durch Mischen (bei weniger als 30 ºC) gleicher molarer Mengen wäßriger Lösungen beispielsweise von Ammoniumhydroxid, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Lithiumhydroxid, sowie die Verbindungen der Formel VII.
worin R¹, R², R³ und n wie vorstehend festgelegt sind.
Die N-Acryloylaminosäure-Verbindungen sind gut bekannt und lassen sich synthetisch leicht darstellen. Hinsichtlich der Verbindungen der Formel VII, bei denen n Null ist, lassen sich entweder das Natriumsalz der entsprechenden Aminosäure z.B. nach K. Hübner et al., Makromol. Chem., 11, 109 (1970), acryloylieren, oder, was wirkungsvoller ist, es kann nach dem in der US-P-4 694 103 beschriebenen Verfahren vorgegangen werden, welches die einstufige Umwandlung eines Ketons in eine N-Acryloylaminosäure umfaßt. Bei den Verbindungen der Formel VII, bei den n 1 ist, ist eine brauchbare Darstellung die Umwandlung von 3,3-disubstituierten Arylsäuren entsprechend der Offenbarung von D.I. Hoke et al., J. Polym. Sci.: Polym. Chem. Ed., 10, 3311 (1972).
Das Unlöslichmachen ist eine notwendige Bedingung zur leichten Entfernung des Trägers (z.B. Kügelchen bzw. Perlen) aus dem System. Dieses wird durch Einbeziehung eines Monomers erreicht, das eine Vielzahl von polymerisierbaren Gruppen enthält und deren Teilnahme in der Polymerisationsreaktion die physikalische Verbindung von Polymer- Grundgerüsten oder ein Vernetzen zur Folge haben. Bei Materialien auf polymeren Trägern ist das Vernetzen ebenfalls wünschenswert, insbesondere bei Kügelchen bzw. Perlen, da die mechanische Stabilität im allgemeinen wesentlich verbessert ist und durch Beeinflussung des Vernetzungsgrades ein gewisser Grad der Kontrolle der Größe des Kügelchens vorgenommen werden kann, d.h. bei einer vorgegebenen Polymerisationsbedingung ist mit größerer Menge des Vernetzungsmittels die Größe des Kügelchens bzw. der Perle kleiner. Der Grad des Vernetzens hängt hauptsächlich von der vorgesehenen Verwendung des Trägermaterials ab. In allen Fällen sind die Polymere in sämtlichen Lösemitteln unlöslich und besitzen eine im wesentlichen unbegrenzte relative Molekülmasse. Da bei vielen Anwendungen verhältnismäßig hohe Kapazitäten verlangt werden und relativ kleine Reaktionspartner als gelöster Stoff auftreten, die in den gequollenen polymeren Träger eindiffundieren können, werden geringe bis mittlere Vernetzungsgrade angestrebt. Nach D.C. Sherrington, Br. Polym. J., 16, 164 (1984), resultieren diese vernetzten, quellfähigen Träger (bezeichnet als Polymere vom "Gel-Typ") aus der Einbeziehung von 1 ... 20 Teilen eines multifunktionellen Monomers. Bei bestimmten Anwendungen, bei denen ein geringer Grad der physikalischen Ausdehnung infolge des Quellens verlangt wird und bei denen geringere Kapazitäten toleriert werden können (wie bei bestimmten Operationen, die in geschlossenen Durchflußsystemen ausgeführt werden, wie beispielsweise chromatographischen Säulen oder Säulenreaktoren) werden hochvernetzte hydrophobe Systeme eingesetzt, die aus der Copolymerisation von mehr als 20 Teilen eines multifunktionellen Monomers resultieren. Dabei handelt es sich um sogenannte "makroporöse" Polymere, die im allgemeinen als nichtquellend bezeichnet werden, so daß die Reaktionen von gelöstem Stoff/Träger überwiegend an der Grenzfläche Lösungsmittel/Träger stattfinden. Anwendungen dieser Träger können große gelöste Stoffe umfassen, z.B. Biomakromoleküle, die wegen ihrer großen Größe nicht in das polymere Netzwerk diffundieren können.
Zusammengefaßt ist zu sagen, daß der Stand der Technik lehrt, daß in hydrophoben Systemen 20 Teile oder mehr Vernetzungsmittel zu einem nichtquellenden System führen.
Wir haben jedoch mit den hydrophilen Trägern der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß, um eine Bedingung des geringen Quellens in wäßrigen Medien zu erreichen, eine wesentlich größere Konzentration von multifunktionellem Monomer erforderlich ist, als die beschriebenen, üblicherweise eingesetzten 20 Teile in den sogenannten nicht- quellenden, hydrophopen, makroporösen Harzen. Dieses kann eine Folge des Einsatzes dieser hydrophilen Träger in Wasser und des hohen Grads der Hydrophilie sein, die durch die multifunktionellen Monomere selbst herbeigeführt wird, da sie hauptsächlich aus starkpolaren funktionellen Gruppen bestehen.
Nach dem Stand der Technik wurden im allgemeinen polymere Träger (Kügelchen bzw. Perlen) gelehrt, umfassend hydrophobe Comonomere und hydrophobe vernetzende Monomere, um vernetzte Polymerkügelchen zu erhalten. Von diesen war bekannt, daß sie quellfähig sind, wenn 1 bis 20 Teile Vernetzungsmittel vorliegen. Mehr als 20 Teile bifunktionelles Monomer (Vernetzungsmittel) lieferten im wesentlichen nichtquellende Kügelchen. Die US-P-4 070 348 lehrt, daß 0,2 ... 5 Molprozent vernetzendes Monomer Kügelchen mit einem hohen Quellvermögen in Wasser liefern. Die Patentanmelder sind der Ansicht, daß dieser geringe Vernetzungsgrad und der ihn begleitende hohe Grad des Quellens erforderlich sind, um eine hohes Bindungsvermögen zu erzielen.
In der vorliegenden Erfindung werden hydrophile Comonomere und hydrophile Vernetzer eingesetzt. Das Quellen von so erzeugten Trägern ist umgekehrt proportional der Menge des vorliegenden multifunktionellen Vernetzers. Polymere Träger (z.B. gepackte Kügelchen) mit einem geringen Quellgrad (kleiner als das Dreifache des nichtgequollenen Volumens) erfordern in der Regel wesentlich mehr als 20 Teile bifunktionelle Vernetzer.
Überraschenderweise kann es immer noch einen relativ geringen Grad des Quellens und hohes Bindungsvermögen von polymeren Trägern in Wasser mit mehr als 5 Molprozent Vernetzer (in hydrophilen Systemen) geben. Derartige Träger sind verwendbar als Mittel zum Komplexieren, Katalysatoren, polymere Reagenzien, chromatographische Träger und Träger für Enzyme, andere Proteine und andere Biomakromoleküle.
Um in hydrophilen Systemen polymere Träger mit einem geringen Grad des Quellens zu erzielen und ein noch hohes Bindungsvermögen zu bewahren, werden wesentlich größere Mengen Vernetzer benötigt. Derartige polymere Träger sind besonders nützlich bei chromatographischen Anwendungen und Säulenreaktoren.
Geeignete multifunktionelle, vernetzende Monomere umfassen ethylenisch ungesättigte (α,β-ungesättigte) Ester, wie beispielsweise Ethylendiacrylat, Ethylendimethacrylat, Trimethylolpropantriacrylat und -trimethacrylat, sowie α,β- ungesättigte Amide, wie beispielsweise Methylenbis(acryl amid), Methylenbis (methacrylamid), N,N'-Diacryloyl-1,2-diaminoethan, N,N'-Dimethacryloyl-1,2-diaminoethan und Reaktionsprodukte von 2-Alkenylazlactonen und kurzkettigen Diaminen, wie sie beispielsweise in den Formeln VII und IX dargestellt sind:
Die vernetzenden Monomere sollten mindestens etwas löslich sein in Wasser, müssen jedoch nicht in dem Maße wasserlöslich sein, wie für die wasserlöslichen Monomerkomponente festgelegt wurde. Dieses ist im allgemeinen für die Darstellung von Polymeren vom Gel-Typ kein Problem, da relativ kleine Menge der vernetzenden Monomere mit relativ großen Mengen Wasser als Lösemittel eingesetzt werden und oftmals die wasserlösliche Monomerkomponente, speziell N,N- Dimethylacrylamid und N-Vinylpyrrolidon, die Auflösung des vernetzenden Monomers erleichtert. Bei makroporösen Polymeren, bei denen die Konzentration des vernetzenden Monomers größer ist als 20 Teile, kann es jedoch notwendig werden, ein Co-Lösemittel zuzusetzen, welches die Auflösung des vernetzenden Monomers erleichtert. Geeignete Co- Lösemitteln umfassen N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon und Dimethylsulfoxid.
Die in dem vorgenannten Prozeß I eingesetzte Methode der Polymerisation wird oftmals bezeichnet als "Umkehrphasen-Suspensionspolymerisation" oder als "inverse" Suspensionspolymerisation. Eine allgemeine Diskussion dieser Methode wurde offenbart von M. Munzer et al. "Suspension Polymerizations from Non-Aqueous Media" in "Polymerization Processes", herausgegeben von C.E. Schildknecht und I. Skeist, Wiley-Interscience, New York, S. 123-124 (1977). Die Umkehrung der Methode der normalen Suspensionspolymerisation (bei der Wasser in der Regel das Suspensionsmittel ist) wird erforderlich, da die erfindungsgemäßen Monomere in Wasser löslich sind und dadurch ein in Wasser nicht mischungsfähiges Suspensionsmittel benötigen.
Die Hauptaufgabe des suspendierenden Mediums ist abgesehen davon, daß es als ein inertes Medium für die Dispersion der polymerisierbaren Phase dient, die Verteilung der in der Polymerisationsreaktion erzeugten Wärme. Ein wichtiges Merkmal des suspendierenden Mediums ist seine Dichte. Um kugelförmige Polymerkügelchen in gleichförmiger Größe zu erhalten, sollten die einmal erzeugten Kügelchen keine Neigung zeigen, sich in dem suspendierenden Medium abzusetzen oder zu flotieren. Das suspendierende Medium und die wäßrigen Phasen sollten daher näherungsweise die gleiche Dichte haben.
Die eigentliche Polymerisation erfolgt in einzelnen Wassertröpfchen, die die aufgelösten Monomere und den Initiator enthalten. Die Tröpfchen werden gebildet und in dem suspendierenden Medium durch heftiges Rühren erhalten, wobei die Größe der resultierenden Kügelchen und ihre Individualität (d.h. das Fehlen von Aggregation) durch Zusatz verschiedener Suspendiermittel kontrolliert wird, bei denen es sich um oberflächenaktive Moleküle handelt, die im allgemeinen sowohl hydrophobe als auch hydrophile Teile besitzen.
Von sich aus ist der Polymerisationsschritt (Schritt 1) kein neuartiger Aspekt der vorliegenden Erfindung. Für den Fachmann ist offensichtlich, daß die Beschaffenheit des suspendierenden Mediums, die Menge des eingesetzten Wassers, das Initiatorsystem, die Menge des vernetzenden Mittels, der Rührgeschwindigkeit und des suspendierenden Mittels insgesamt unabhängige und wichtige Variablen sind, die die Form und Größe der polymeren Kügelchen bestimmen. Ohne an irgendwelche speziellen Polymerisationsbedingungen gebunden zu sein, haben wir festgestellt, daß die von G.L. Stahl et al., J. Org., Chem., 44, 3424 (1979), beschriebene Prozedur der Umkehrphasen-Suspensionspolymerisation außerordentlich nützlich ist. In dieser Prozedur wird eine Mischung von Heptan und Tetrachlorkohlenstoff als das suspendierende Medium eingesetzt. Das Initiatorsystem besteht aus Ammoniumpersulfat/N,N,N',N'-Tetramethyl-1,2-diaminethan als Redox-Paar, die Rührgeschwindigkeit beträgt 300 U/min und das Suspendiermittel ist Sorbitansesquioleat. Die verschiedenen Komponenten können ohne weiteres durch vergleichbare Materialien ausgetauscht werden, ohne den Erfindungsgedanken und die Tragweite der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Beispielsweise wurde festgestellt, daß der Einsatz eines polymeren Stabilisiermittels, wie beispielsweise Copoly(isooctylacrylat/Arcylsäure) oder Copoly(hexylacrylat/Natriumacrylat) anstelle von Sorbitansesquioleat zuverlässiger nichtaggregierte Perlprodukte liefert.
Schritt 2 im vorgenannten Prozeß I besteht aus der Umwandlung der Carboxylat-funktionellen Träger in Azlactonfunktionelle Träger. Dieses wird durch Verwendung eines Mittels zum Cyclisieren (CA) erreicht. Ein Mittel zum Cyclisieren ist ein Reagens, das mit den Carboxylatfunktionellen Trägern unter Bildung eines intermediären Adduktes reagieren kann, welches für den intramolekularen Angriff durch die Amidcarbonyl-Gruppe unter Bildung von Azlacton-Gruppen gemäß dem Reaktionsschema IA empfänglich ist. Diese Bereitschaft wird hauptsächlich durch Erzeugen einer guten Austrittsgruppe (&supmin;O(CA) nachfolgend) für den nucleophilen Angriff durch die Carbonyl-Gruppe erreicht. Reaktionsschema IA

Cyclisierungsmittel (CA)

worin R¹, R², R³ und n wie vorsehend festgelegt sind.
(Die in Klammern dargestellten Strukturen und Formeln sind Teilstrukturen von Polymeren, welche Seitenketten darstellen, die an der Reaktion der Cyclisierung teilnehmen. Die Verwendung von Klammerausdrücken hat im allgemeinen die Bedeutung von chemischen Intermediaten oder aktivierten Komplexen. Gepunktete Linien bedeuten partielle Bindungen und δ (delta) bedeutet partielle ionische Ladungen.)
Verwendbare Mittel zum Cyclisieren für die Umwandlung der Carboxylat-funktionellen Träger umfassen beispielsweise Essigsäureanhydrid, Trifluoressigsäureanhydrid und Alkylchlorformiate, wie beispielsweise Methyl-, Ethyl- und Isopropylchlorformiate. Carbodiimide, wie beispielsweise N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, lassen sich in wirksamer Weise einsetzen, erfordern jedoch einen zusätzlichen Schritt des Ansäuerns der Carboxylat-funktionellen Träger, um Carboxylfunktionelle Träger zu erzeugen, die sodann zu Azlactonfunktionellen Trägern unter Verwendung des Carbodiimid- Reagens cyclisiert werden können. Zum besseren Verständnis des Cyclisierungsschrittes der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend in der Reihenfolge der Nennung die Intermediate dargestellt, die sich aus dem Einsatz der vorgenannten Mittel zum Cyclisieren ergeben würden.
Der Ablauf der Cyclisierungsreaktion kann leicht durch Untersuchung des Infrarotspektrums der polymeren Träger überwacht werden. Das Auftreten einer verbreiteten Carbonyl- Absorption bei etwa 1.820 cm&supmin;¹ ist eine Bestätigung für Azlacton-Gruppen. So ist eine Ursache dafür, daß die Azlacton-Gruppen als Verknüpfungen für die kovalente Bindung an Polymere verwendbar sind, die Möglichkeit zur Überwachung der Reaktionen durch Beobachtung dieser Infrarot-Absorption entweder als ihr Auftreten bei der synthetischen Darstellung von Azlacton-funktionellen Trägern oder bei ihrem Verschwinden in der nachfolgenden Reaktion mit einem funktionellem Material. Diese Absorption ist stark, für Azlacton sehr charakteristisch und in einem Bereich des Infrarotspektrums angeordnet, wo im wesentlichen keinerlei andere übliche Absorptionen beobachtet werden. Dieses ist ein entscheidender Vorteil gegenüber anderen verknüpfenden funktionellen Gruppen, wie beispielsweise des Chlormethylphenyls und Oxirang, die über diese einmaligen Merkmale in ihren Infrarotspektren nicht verfügen. Bei diesen letzteren Gruppen existiert praktisch keine bequeme analytische Methode zur Überwachung der Bindungsreaktionen.
Ein bevorzugtes Mittel zum Cyclisieren ist Essigsäureanhydrid wegen seiner geringen Kosten, seiner Verfügbarkeit und seines flüssigen Zustandes bei Temperaturen der Cyclisierung. Die Carboxylat-funktionellen Träger werden typischerweise mit Essigsäureanhydrid bedeckt und die Mischung auf Temperaturen von 40 ºC ... 100 ºC und vorzugsweise 80 ºC ... 100 ºC für eine Dauer von 2 ... 24 Stunden angewärmt. Nach der Cyclisierungsreaktion werden die polymeren Träger filtriert. Außerdem ist Essigsäureanhydrid besonders deswegen bevorzugt, weil das Nebenprodukt der Cyclisierung, das Alkalimetallazetatsalz, verhältnismäßig gut löslich ist in Essigsäureanhydrid und von den Azlacton-funktionellen Trägern leicht entfernt werden kann. Die Träger können sodann direkt getrocknet werden oder, was oftmals der Fall ist, sie werden vor dem Trocknen einer Reihe von Waschoperationen mit nichtreagierenden organischen Lösemitteln unterworfen, wie beispielsweise Aceton, Toluol, Ethylacetat, Heptan und Chloroform.

Prozeß II

Einstufige Umkehrphasen-Suspensionspolymerisation

Polymere Träger nach dem Prozeß II der vorliegenden Erfindung werden nach dem nachfolgend dargestellten Reaktionsschema II hergestellt. Reaktionsschema II (Prozeß II) wasserlösliche Monomere vernetzende Monomere Alkenylazlacton Azlacton-funktionelle Träger
Dieses Verfahren wird nach der gleichen Polymensationsmethode ausgeführt, wie sie beim Prozeß I eingesetzt wird, wobei die gleichen wasserlöslichen Monomere und Vernetzer zum Einsatz gelangen. Der Hauptunterschied besteht in der Nutzung eines Alkenylazlacton-Monomers X anstelle des Salzes der N-Acryloylaminosäure III. Die Mengen der Reaktanten können die gleichen sein wie im Prozeß 1 mit der Ausnahme, daß Azlacton für das Salz der N-(meth)acryloylaminosäure ersetzt wird. Dieser Prozeß gewährt vorteilhaft Azlacton-funktionelle polymere Träger V in einem einzelnen Schritt im Gegensatz zu dem zweistufigen Prozeß 1. Angesichts des Standes der Technik sind mehrere Aspekte dieses Prozesses überraschend. Zunächst sind vor allem die Alkenylazlactone x verhältnismäßig gut löslich in dem suspendierenden Medium, obwohl sie leicht in den polymeren Träger (z.B. Kügelchen bzw. Perlen) ohne nachteilige Auswirkungen auf den Polymerisationsprozeß eingebaut werden. (Dieses steht im scharfen Kontrast zu dem, was unter Einsatz der Lehre der US-P-4 070 348 (siehe Beispiele 27 und 28 nachfolgend) beobachtet wird). Zweitens, wird der Azlacton- Ring nicht durch Wasser während dieses Polymerisationsprozesses in der wäßrigen Phase hydrolysiert. Angesichts der Lehre der US-P-4 070 348 und der von Taylor (siehe oben) ist dieses ebenfalls bemerkenswert. Nach dem Polymerisationsprozeß lassen sich die Kügelchen beispielsweise durch Filtration abtrennen und werden, sofern gewünscht, einer Reihe von Waschschritten unterworfen und getrocknet.
Verwendbare Azlacton-Monomere und ihre synthetischen Darstellungen wurden beschrieben in: US-P-4 378 411 und in "Polyazlactones", Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Bd. 11, 2. Ausgabe, Wiley, N.Y., 1988, S. 558 ... 571, und schließen ein:
2-Vinyl-4,4-dimethyl-2-oxazolin-5-on,
2-Isopropenyl-4,4-dimethyl-2-oxazolin-5-on,
2-Vinyl-4,4-diethyl-2-oxazolin-5-on,
2-Vinyl-4-dodecyl-4-methyl-2-oxazolin-5-on,
2-Vinyl-4-ethyl-4-methyl-2-oxazolin-5-on,
2-Vinyl-4,4-pentamethylen-2-oxazolin-5-on,
2-Vinyl-4-methyl-4-phenyl-2-oxazolin-5-on,
2-Isopropenyl-4-benzyl-4-methyl-2-oxazolin-5-on und
2-Vinyl-4,4-dimethyl-1,3-oxazolin-6-on.
Bevorzugte Azlacton-Monomere sind 2-Vinyl-4,4-dimethyl- 2-oxazolin-5-on (das kommerziell bei SNPE, Inc., Princeton, NJ, verfügbar ist), 2-Isopropenyl-4,4-dimethyl-2-oxazolin-5- on und 2-Vinyl-4,4-dimethyl-1,3-oxazolin-6-on.

Prozeß III

Dispersionspolymerisation

Die polymeren Träger nach Prozeß III der Erfindung werden nach einem als "Diserpersionspolymerisation" bezeichneten Polymerisationsprozeß und speziell durch Dispersionspolymerisation in organischen Medien geschaffen. In diesem Prozeß, der in gewisser Weise analog zu dem Prozeß II ist, liegen die Monomere und das Lösemittel zu Anfang homogen vor. Kurz nach Beginn der Polymerisation trennt sich das Polymer als Partikel ab und die Polymerisation läuft dann in heterogener Form weiter. Zur Verhinderung der Aggregation von Polymerpartikeln während des Polymerisationsprozesses werden typischerweise "Dispergiermittel" oder "Stabilisatoren" verwendet. Die Methoden der Dispersionspolymerisation nicht nichtwäßrigen Medien sind in der Technik gut bekannt und wurden im Detail beispielsweise von K. E. J. Barrett in "Dispersion Polymerization in Organic Media", Wiley, N.Y., 1975, beschrieben. Eine Methode der Dispersionspolymerisation, die sich bei der Darstellung von erfindungsgemäßen Azlacton-funktionellen Trägern nach Prozeß III als vorteilhaft erwiesen hat, wurde von Y. Alnog et al., Brit. Polym. J., 1982, 131, beschrieben.
Im allgemeinen werden Azlacton-funktionelle polymere Träger der Formel V nach Prozeß III dadurch dargestellt, daß die folgende Gruppe von Monomeren einer radikalischen Polymerisationsreaktion unterworfen wird:
(i) 1 ... 100 Molanteile von mindestens einem Alkenylazlacton der Formel X;
(ii) 0 ... 99 Molanteile von mindestens einem vernetzenden Monomer sowie
(iii) 0 ... 99 Molanteile von mindestens einem Comonomer.
Geeignete vernetzende Monomere zur Verwendung in dem vorliegenden Polymerisationsprozeß schließen die für die Prozesse I und II verwendbaren ein. Da bei der Dispersionspolymerisation die Wasserlöslichkeit jedoch nicht entscheidend ist, wohl aber die Löslichkeit im dispergierenden Medium, können andere Vernetzer eingesetzt werden, wie beispielsweise Divinyl-Verbindungen, z.B. Divinylbenzol.
Comonomere, die für die Darstellung der Träger nach Prozeß III verwendbar sind, schließen die in Prozeß I und II verwendbaren wasserlöslichen Comonomere ein, wobei jedoch wiederum zusätzlich Comonomere eingeschlossen sind, die nicht wasserlöslich sind. Es kann nahezu jedes beliebige radikalisch polymerisierbare Monomer als das Comonomer unter der Voraussetzung eingesetzt werden, daß es über eine anfängliche Löslichkeit in dem dispergierenden Medium verfügt.
Beispiele schließen ein: die Vinyl-aromatischen Monomere, wie beispielsweise Styrol, α-Methylstyrol, 2- und 4-Vinylpyridin; α,β-ungesättigte Carbonsäuren, wie beispielsweise Acrylsäure, Methacrylsäure, Itaconsäure, Maleinsäure, Fumarsäure und Crotonsäure; α,β-ungesättigte Carbonsäurederivate, wie beispielsweise Methylmethacrylat, Butylmethacrylat, 2-Ethylhexylmethacrylat, Ethylacrylat, Butylacrylat, Isooctylacrylat, Octadecylacrylat, Cyclohexylacrylat, Tetrahydrofurylmethacrylat, Phenylacrylat, Phenethylacrylat, Benzylmethacrylat, α-Cyanoethylacrylat, Maleinsäureanhydrid&sub1; Diethylitaconat, Acrylamid, Methacrylnitril, N,N-Dimethylacrylamid und N-Butylacrylamid; Vinylester von Carbonsäuren, wie beispielsweise Vinylacetat und Vinyl-2-ethylhexanoat; Vinylhalogenide, wie beispielsweise Vinylchlorid und Vinyhdenchlorid; Vinylalkylether, wie beispielsweise Methylvinylether, 2-Ethylhexylvinylether und Butylvinylether; Olefine, wie beispielsweise Ethylen; N-Vinyl-Verbindungen, wie beispielsweise N-Vinylpyrrolidon und N-Vinylcarbazol; Vinylketone, wie beispielsweise Methylvinylketon; sowie Vinylaldehyde, wie beispielsweise Acrolein und Methacrolein.
Dem Fachmann auf dem Gebiet der Dispersionspolymerisation ist bekannt, daß ein inertes Streckmittel oder dispergierendes Medium gewählt werden müssen, die das Monomer oder die Monomermischung auflöst, jedoch das Polymer bei seiner Erzeugung ausfällt. Dieses stellt bei der Darstellung von vernetzten Polymeren ein spezielles Problem dar, da sie in allen Lösemitteln ünlöslich sind. Es muß daher ein Dispersionsmittel gewählt werden, welches die Abtrennung diskreter Partikel während des Ablaufs des Polymerisationsprozesses begünstigt und weniger die Bildung einer vernetzten Masse. Ein brauchbares Konzept zur Unterstützung der Festlegung von dispergierenden Medien oder zur Wahl geeigneter Monomermischungen, die in einem partikulären Medium einer Dispersionspolymerisation unterworfen werden, ist das Konzept der Löslichkeitsparameter. Dieses Konzept und sein Zusammenhang mit der Dispersionspolymerisation wurden im Detail von Barrett (wie oben) (Kapitel 4) diskutiert. Tabelle für die Werte der Löslichkeitsparameter für viele Lösemittel und einige Polymere, sowie Methoden für die Ermittlung der Löslichkeitsparameter für Polymere und Copolymere finden sich im "Polymer Handbook", J. Brandrup and E. H. Immergut, Herausg., 2. Ausg., Wiley, New York, 1975, S. IV-337ff. Im allgemeinen sollten bei einer erfolgreichen Dispersionspolymerisation die Löslichkeitsparameter des dispergierenden Mediums und des sich bildenden Polymers um mindestens etwa 1 1,5 Einheiten das Löslichkeitsparameters und vorzugsweise um 1,5 ... 2 oder mehr Einheiten des Löslichkeitsparameters differieren. Als dispergierendes Medium verwendbare Lösemittel sind daher für die meisten Monomermischungen nichtpolare Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise Pentan, Hexan, Petrolether, Cyclohexan und Toluol, sowie polare hydroxylische Lösemittel, wie beispielsweise die Alkohole Methanol, Ethanol, Isopropanol und tert-Butanol.
Für den erfindungsgemäßen Prozeß III verwendbare Initiatoren schließen alle radikalische Initiatoren ein, die in dem dispergierenden Medium löslich sind. Die Wahl des Initiators hängt bekanntlich von der Temperatur ab, bei der die Polymerisation ausgeführt wird. Bei erhöhten Temperaturen, beispielsweise bei 50 ºC oder höher, verwendbare Initiatoren schließen Azo-Verbindungen ein, wie beispielsweise Azobisisobutyronitril, sowie Peroxide oder Hydroperoxide, wie beispielsweise Benzoylperoxid, Di-tert- butylperoxid, tert-Butylhydroperoxid und Cumenhydroperoxid. Für Reaktionen bei niedrigerer Temperatur, beispielsweise bei Raumtemperatur, können Redox-Initiatoren eingesetzt werden, wie beispielsweise Peroxide oder Hydroperoxide in Kombination mit tertiärem Amin. Ein solches Redox-System ist Benzoylperoxid/N,N-Dimethylanilin. Initiatoren können in Mengen im Bereich von 0,1 % ... 10 Gewichtsprozent der Monomerzusammensetzung und vorzugsweise 0,5 % ... 2, Gewichtsprozent der Monomerzusammensetzung vorliegen.
Wie bereits erwähnt wurde bei der Darstellung von Azlacton-funktionellen Trägern nach Prozeß III mit Erfolg die Dispersionspolymerisation von Almog et al. eingesetzt. Bei dieser Prozedur wird als das dispergierende Medium Alkohol und als Initiator Azobisisobutyronitril verwendet. Ein polymerer Stabilisator, wie beispielsweise Polyvinylpyrrolidon, Poly(vinylmethylether), Polyacrylsäure oder Polyethylenimin, wird in Verbindung mit Aliquat 336 (Henkel Corporation) als Cotensid verwendet. Ein wiederum überraschendes und unerwartetes Resultat dieser Prozedur bestand darin, daß sowohl vernetzte als auch nichtvernetzte Azlacton-funktionelle polymere Träger in einem Schritt in diesem hydroxylischen Medium ohne Reaktion des Alkohollösemittels mit dem Azlacton hergestellt werden können. Die Abtrennung besteht in einer einfachen Filtration, Waschen sofern erforderlich und Trocknen.
Obgleich alle nach den drei vorstehend beschriebenen Prozessen hergestellten Kügelchen auf ihren Oberflächen Azlacton-Funktionalität zeigen, können ihre physikalischen Eigenschaften je nach dem für ihre Herstellung eingesetzten Prozeß stark variieren. Die auf dem Wege der Umkehrphasen- Suspensionspolymerisation hergestellten Kügelchen sind im allgemeinen stark porös (d.h. 10 ... 90 Volumenprozent Hohlräume und vorzugsweise 20 ... 75 % Hohlräume) mit großen Oberflächen und Porenvolumina und haben eine hohe Dichte von reaktionsfähigen Gruppen. Diese Kügelchen sind bei Anwendungen einsetzbar, bei denen das Bindungsvermögen eine relativ größere Bedeutung hat als die Reaktionskinetik. Andererseits haben die mit Hilfe von Dispersionspolymerisationen hergestellten Kügelchen im allgemeinen eine geringere Größe und sind sehr viel weniger porös und in einigen Fällen nahezu porenlos. Bei diesen Kügelchen ist die Reaktionskinetik sehr schnell, ein Merkmal, das bei bestimmten Anwendungen, die beispielsweise höhere Durchsatzraten fordern, besonders nützlich sein kann.

Prozeß IV

(Beschichten von festen Trägern mit nichtvernetzten Azlacton-Polymeren)

Wie bereits erwähnt, können die erfindungsgemäßen polymeren Träger die Form von Kügelchen bzw. Perlen haben. Hierbei handelt es sich um eine physikalische Form, bei der die Träger einen hohen Nutzwert besitzen, wie beispielsweise bei Anwendungen zum Packen von chromatographischen Säulen. Die neuartigen Materialien beschränken sich jedoch nicht auf die physikalische Form von Kügelchen. Es wurde festgestellt, daß bestimmte lösliche Azlacton-Polymere (nichtvernetzt) ebenfalls auf eine Reihe von Substraten aufgetragen werden können und die gleiche reaktionsfähige Azlacton-Funktionalität in diesen Formen zeigen wie die Kügelchen. Diese Substrate lassen sich daher für die Reaktion mit funktionellen Materialien verwenden. Beispielsweise können mit den erfindungsgemäßen Azlacton-Polymeren Nylon-Filtermembranen und Glasoberf lächen beschichtet werden, indem der zu beschichtende Gegenstand in eine Lösung des Polymers getaucht wird und der getauchte Gegenstand trocknen gelassen wird. In ähnlicher Weise läßt sich partikuläres Material, wie beispielsweise Keramik (z.B. Zirconiumdioxid) oder nichtreaktionsfähige Polymere, wie beispielsweise Partikel aus Polyethylen, mit Azlacton-funktionellen Polymeren beschichten. Je nach der physikalischen Form des Substrats können weitere Verfahren des Beschichtens aus der Lösung nach bekannter Ausführung eingesetzt werden, wie beispielsweise Spritzbeschichten und Rakelbeschichten.
Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn als Substrat Silica-Kügelchen verwendet wurden; auf die die erfindungsgemäßen Azlacton-funktionellen Polymere aufgetragen wurden. Diese Art des Kügelchens wird üblicherweise als Packungsmaterial in chromatographischen Säulen verwendet. In ähnlicher Weise hat sich bei Verwendung einer Azlactonfunktionellen Beschichtung eine signifikant verbesserte Proteinbindung und kovalente Bindung bei Verwendung von Glaskügelchen kontrollierter Porengröße gezeigt, was ebenfalls ein gebräuchliches Säulenpackungsmaterial ist. Besondere Vorteile von Azlacton-funktionellen Trägern nach Prozeß IV sind ihre Inkompressibilität und zumeist das vollständige Fehlen des Quellens.
Die Azlacton-funktionellen Polymere, die zur Herstellung von Beschichtungen auffesten Substraten verwendbar sind, sind in der Technik gut bekannt oder können nach Verfahren bekannter Ausführung hergestellt werden. Diese Polymere werden in der Regel mit Hilfe der radikalischen Polymerisation von einem oder mehreren Alkenylazlactonen, wahlweise mit einem oder mehreren radikalisch polymerisierbaren, ethylenisch ungesättigten Comonomeren, unter Anwendung der Polymerisationsverfahren bekannter Ausführung hergestellt. Geeignete Azlactonenthaltende Polymere und Copolymere wurden beispielsweise beschrieben von R. Hübner et al., "Angew. Maktromol. Chem.", 1970, 11, 109, sowie in der US-P-4 378 411. Besonders geeignete Azlacton-funktionelle Polymere zur Herstellung von Beschichtungen auffesten Trägern können durch Umsetzen eines Teils der Azlacton-Gruppen der vorgenannten Azlactonenthaltenden Homopolymere oder Copolymere mit einem niederen Alkylamin oder Alkohol hergestellt werden.
Weitere Verfahren zur Herstellung von Azlacton-funktionellen Trägern sind verfügbar. Eines der Verfahren besteht in der Aufbringung eines Alkenylazlacton-Monomers auf den Trhger (wahlweise gemeinsam mit weiteren Comonomeren) und dem Polymerisieren des Monomersider Monomere am Ort. Verfahren zur Polymerisation schließen die auf dem Gebiet bekannte Photopolymerisation ein (Einsetzen eines geeigneten Photoinitiators).
Damit sind jetzt die Azlacton-funktionellen polymeren Träger der vorliegenden Erfindung gebildet und für die Reaktion mit einem funktionellen Material bereit. Wie bereits ausgeführt, bestand eine überraschende Entdeckung darin, daß funktionelle Materialien oftmals in Losemitteln wie beispielsweise Wasser an Azlacton-funktionellen Trägern der vorliegenden Erfindung angebracht werden können, von denen bisher angenommen wurde, daß sie mit Azlactonen reaktionsfähig sind. Der hierin verwendete Begriff "Material" bedeutet das chemische Hauptgebilde, von dem angestrebt wird, dieses auf einen polymeren Träger für einen speziellen Zweck zu binden. In einer anderen verwendeten Form bedeutet "Material" denjenigen Teil oder Rest des "funktionellen Materials", der eigentlich die Endanwendung des Adsorbierens, Komplexierens, die katalytische Endanwendung oder die Endanwendung als Reagens ausführt. "Funktionell" im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet denjenigen Teil des "funktionellen Materials", der eine Gruppe enthält, die mit einem Azlacton reagieren kann. "Funktionelle" Gruppen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, schließen ein: Hydroxy, primäres Amin, sekundäres Amin und Thiol. Diese Gruppen reagieren entweder in Anwesenheit oder bei Abwesenheit geeigneter Katalysatoren mit Azlactonen durch nudeophile Addition entsprechend der Darstellung in der nachfolgenden Gleichung (2).
worin R¹, R², R³, n, X und G wie vorstehend festgelegt sind.
In Abhängigkeit von der in dem funktionellen Material vorhandenen funktionellen Gruppe können zum Erzielen effektiver Reaktionsgeschwindigkeiten des Bindens Katalysatoren benötigt werden. Funktionelle Gruppen aus primärem Amin erfordern keine Katalysatoren. Säurekatalysatoren, wie beispielsweise Trifluoressigsäure, Ethansulfonsäure und Toluolsulfonsäure sind mit funktionellen Hydroxy-Gruppen und sekundären Amin-Gruppen wirksam. Amin-Basen, wie beispielsweise Triethylamin, 1,8-Diazabicyclo[5-4-0]undec-7-en (DBU) und 1,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en (DBN) (beide verfügbar bei der Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wi) sind sowohl für funktionelle Hydroxy-Gruppen als auch für funktionelle Thiol-Gruppen wirksam. Die Menge des eingesetzten Katalysators beträgt in der Regel 1 ... 10 Teile und vorzugsweise 1 ... 5 Teile bezogen auf 100 Teile Azlacton.
Der Fachmann erkennt, daß je nach dem funktionellen Material, das gebunden werden soll, die speziellen Reaktionsbedingungen, wie beispielsweise Lösemittel, Temperatur, Katalysatormenge, stark variieren. Aufgrund der großen Vielzahl funktioneller Materialien, die an polymeren Trägern gebunden worden sind oder gebunden werden könnten, wäre jede Aufzählung funktioneller Materialien über das generische HXG der Gleichung (2) und der Reaktionsschemen 1 hinaus unvollständig und in gewissem Maße unnötig, da der erfinderische Aspekt der vorliegenden Erfindung nicht auffunktionelle Materialien beruht. Neuartig ist, daß diese funktionellen Materialien an Azlacton-funktionellen Trägern kovalent gebunden werden können.
Nachdem die Erfindung in allgemeiner Form beschrieben wurde, werden Gegenstände und Vorteile der Erfindung spezieller anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht. Die in den Beispielen angegebenen Materialien und ihre Menge sowie übriger Bedingungen und Einzelheiten dürfen die vorliegende Erfindung nicht unzulässig beschränken. In den nachfolgenden Beispielen bedeuten die in runden Klammern angegebenen Zahlen Gewichtsprozent und die in eckigen Klammern angegebenen Zahlen Molprozent.

Referenzbeispiel 1 (Vergleichsbeispiele)

Dieses Beispiel lehrt die Herstellung eines Azlactonfuntionellen Trägers nach Prozeß 1.

Herstellung von Copoly(N,N-Dimethylacrylamid: 2-Vinyl-4,4- dimethylazlacton:Methylenbisacrylamid) (46:46:8) [54.8:39.0:6.1]

Schritt 1: Herstellung von Copoly(N,N-Dimethylacrylamid (DMA):N-Acryloylmethylalanin-Natriumsalz (NAAMA):Methylenbisacrylamid (MBA)) (44,6:50,4:7,8): In einem mit einem Rührwerk (Rührgeschwindigkeit etwa 300 U/min), Stickstoffeinlaß, Thermometer und Kühler ausgestatteten gerillten 2 l-Rundkolben wurde Heptan (1.043 ml) und Tetrachlorkohlenstoff (565 ml) gegeben. Diese Lösung wurde gerührt und mit Stickstoff für 15 Minuten durchgesprudelt. Es wurde eine separate Lösung hergestellt, bestehend aus einer Natriumhydroxidlösung (6,6 g; 0,165 Mol aufgelöst in 85 ml Wasser), N-Acryloylmethylalanin (AMA) (25,98 g; 0,165 Mol), DMA (23 g; 0,232 Mol), MBA (4 g; 0,026 Mol) und Ammoniumpersulfat (1 g; 0,004 Mol) und dem organischen suspendierenden Medium zugesetzt. Es wurde Sorbitansesquioleat (Arlacel 83, ICI America, Inc., Wilmington, DE) (2 ml) zugesetzt und das Gemisch gerührt und mit Stickstoff für 15 Minuten durchgesprudelt. Es wurde N,N,N',N'-Tetramethyl- 1,2-diaminoethan (2 ml) zugesetzt und die Reaktionstemperatur verhältnismäßig rasch von 21 ºC auf 33 ºC erhöht. Das Gemisch wurde unter Verwendung eines Sinterglastrichters "D" (größer als 21 Mikrometer) gründlich filtriert und der Filterkuchen gründlich und wiederholt mit Azeton gewaschen. Nach dem Trocknen bei 60 ºC und weniger als 133 Pa (1 Torr) für 12 Stunden wurde der trockene Feststoff (52 g) gesiebt und in 4 Fraktionen unterteilt: Kügelchen mit weniger als 38 Mikrometern, 12,32 g; Kügelchen zwischen 38 und 63 Mikrometer, 19,83 g; Kügelchen zwischen 63 und 90 Mikrometer, 4,56 g; sowie Kügelchen größer als 90 Mikrometer, 13,95 g. Unter Einsatz einer Lichtmikroskop-Anordnung, bestehend aus einem Differentialinterferenz-Kontrastmikroskop von Nikon Nomarski, einer Videokamera von Dage Newvicon, einem 109 cm (3/4")-Videorekorder von Sony und einer digitalen Bildverarbeitungsanlage mit zugehöriger Software von Perceptiv Systems, Inc., wurde festgestellt, daß die Probe mit 38 63 Mikrometer aus durchaus kugelförmigen Kügelchen bzw. Perlen bestand (mittleres Höhen/Breitenverhältnis = 0,87), die in Wasser eine Quellung mit einer Durchmesserzunahme von 35 ... 50 % zeigte.
Schritt 2: Cyclisierung zu Copoly(DMA: 2-Vinyl-4,4dimethylazlacton (VDM):(MBA) (46:46:8): Zu 15,1 g der in Schritt 1 hergestellten 38 ... 63 Mikrometer-Perlen wurde Essigsäureanhydrid (100 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde für 2 Stunden auf 100 ºC erhitzt. Nach dem Kühlen und Filtrieren wurden die Perlen in eine Soxhlet-Extraktionsapparatur gegeben und mit Ethylacetat für 16 Stunden extrahiert. Nach dem Trocknen bei 60 ºC und weniger als 133 Pa (1 Torr) hatten die Perlen ein Gewicht von 12,6 g.

Reverenzbeisoiel 2 (Vergleichsbeispiel 1

Dieses Beispiel lehrt die Reaktion eines Kügelchens aus Azlacton-funktionellem Polymer mit einem Proteinfunktionellen Material.

Herstellung von radiomarkiertem Protein A

Zur Katalysierung der Addition von bd zu Tyrosin Resten wurde Protein A (2,5 mg) (von Staphylococcus aureus) (Genzyme Corp., Boston, MA) aufgelöst in 10 mmol Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0; 0,6 ml) und zwei Iodobeads (eine unlösliche Form von Chloramin T; Pierce Chemical Co., Rockford, IL) zugesetzt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 0,1 mCi NaI (trägerfreies ¹²&sup5;I, New England Nuclear Co., N. Billerica, MA) gestartet. Die Reaktion wurde für 30 Minuten bei 20 ºC mit heftigem manuellem Schütteln in Abständen von 5 Minuten inkubiert. Von dem NaI wurde Protein A (sowohl iodierte als auch unmodifizierte Formel) durch Eluieren durch eine Pharmacia-Exklusionssäule der Größe PD- in dem gleichen Phosphat-Puffer abgetrennt. Die Fraktionen, die Protein enthielten, wurden vereinigt, in aliquote Teile unterteilt und bis zum Gebrauch bei -15 ºC tiefgefroren. Die spezifische Radioaktivität am Tage Null betrug 154.000 Zählpulse pro Minute (cpm)/Mikrogramm. Alle nachfolgenden Berechnungen wurden auf die radioaktive Halbwertzeit von ¹²&sup5;I von 60 Tagen korrigiert. Das radiomarkierte Protein A wurde nicht nach mehr als sechs Wochen nach der Iodierung verwendet.

Reaktion von radiomarkiertem Protein A mit einem Azlactonfunktionellen Kügelchen

Ein Azlacton-funktionelles Polymer, das eingesetzt wurde, war das im Beispiel 1 unter Anwendung von DMA:VDM:MBA (62,2:34,4:3,3 Molprozent) hergestellte. Die Polymerkügelchen (0,10 g) wurden in ein Zentrifugenröhrchen gegeben und mit einer Lösung bedeckt, die aus dem vorgenannten markierten Protein A-Präparat (100 Mikroliter) und 400 Mikroliter Phosphat-Pufferlösung (pH 7,5) bestand. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 90 Minuten leicht geschüttelt. Das Röhrchen wurde zentrifugiert und der ursprüngliche Überstand sowie fünf nachfolgende Waschlösungen (1 ml pH 7,5-Puffer) aufgenommen und ihr ¹²&sup5;I-Gehalt unter Verwendung eines Auto-Gammascintillationsspektrometers von Packard Modell 5230 bestimmt. Der ursprüngliche Überstand zeigte 42.415 cpm (über Hintergrund); die erste Waschlösung 6.722; die zweite Waschlösung 836; die dritte Waschlösung 202; die vierte 48 und die fünfte Waschlösung 18 cpm. Es wurde Ethanolamin (400 Mikroliter 0,5 M in pH 7,5- Phosphat-Puffer) zugesetzt und mit den Kügelchen für 90 Minuten geschüttelt, um sämtliche Azlacton-Reste umzusetzen. Abschließend wurden nach zusätzlichen vier Waschungen mit Pufferlösung die Kügelchen und das Reaktionsgefäß gezählt und 7.002 bzw. 1.865 cpm erhalten. Dieses korreliert mit einer Konzentration von 2,54 Mikrogramm Protein A/10 mg Kügelchen.
In der gleichen Weise wurde ein Vergleichsexperiment ((Kontrolle)) mit der Ausnahme durchgeführt, daß die Reihenfolge des Zusatzes von Protein A und Ethanolamin umgekehrt waren. Die Kontrolle zeigte eine Konzentration von 0,14 Mikrogramm Protein A/10 mg Kügelchen.
In ähnlicher Weise wurden die Einflüsse des Katalysators DBU untersucht, wobei das DBU (25 Mikroliter)
zu der anfänglichen Protein A-Pufferlösung zugesetzt wurden. Das Ergebnis war eine Konzentration von 3,90 Mikrogramm Protein A/10 mg Kügelchen.

Beispiel 3

Dieses Beispiel lehrt die Herstellung eines stark vernetzten Kügelchenpolymers der vorliegenden Erfindung mit Hilfe des Verfahrens der Umkehrphasen-Suspensionspolymerisation unter Verwendung von monomerem 2-Vinyl-4,4-dimethylazlacton anstelle seines Präkursors (Prozeß II).

Herstellung von Copoly(methylenbisacrylamid:2-Vinyl-4,4- dimethylazlacton) (58:42) [55,5:44,5]

In einen mit einem Rührwerk (Rührgeschwindigkeit 300 U/min), Stickstoffeinlaß, Thermometer und Kühler ausgestatteten gerillten 3 l-Rundkolben wurde Heptan (1.043 ml) und Tetrachlorkohlenstoff (565 ml) gegeben. Diese Lösung wurde gerührt und mit Stickstoff für 15 Minuten durchgesprudelt. Die abgetrennte Lösung wurde folgendermaßen zubereitet: Es wurde Methylenbisacrylamid (29 g, 0,188 Mol) in Dimethylformamid (160 ml) aufgelöst; nachdem die Lösung erhalten wurde, wurde Wasser (160 ml) zugesetzt und die resultierende Lösung mit Stickstoff für 15 Minuten durchgesprudelt. Es wurde Sorbitansesquioleat (3 ml) zugesetzt und das Durchsprudeln für weitere 5 Minuten fortgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt wurde Ammoniumsulfat (1 g) zugesetzt und das Durchsprudeln für eine weitere Minuten fortgesetzt. Sodann wurde die Lösung rasch dem organischen suspendierenden Medium zugegeben. Unmittelbar nach der Zugabe wurde VDM (21 g, 0,151 Mol) zugesetzt und die gesamte Mischung für weitere 5 Minuten durchgeperlt. Es wurde N,N,N',N'-Tetramethyl-1,2-aminethan (2 ml) zugesetzt, wobei die Reaktionstemperatur verhältnismäßig rasch von 22 ºC auf 29 ºC anstieg. Das Reaktionsgemisch wurde von dem Zeitpunkl der Zugabe des Diamins ab insgesamt 4 Stunden gerührt und danach unter Verwendung eines Sinterglastrichters "D" (größer als 21 Mikrometer) filtriert. Der Filterkuchen wurde auf dem Filter mit Aceton (2 x 500 ml) gewaschen und sodann bei 60 ºC und weniger als 133 Pa (1 Torr) für 24 Stunden getrocknet. Die IR-Analyse zeigte eine starke Azlacton-Carbonyl-Absorption.

Beispiel 4A

Nach einer ähnlichen Prozedur wie in Beispiel 3 wurde eine Umkehrphasen-Suspensionspolymerisation (Prozeß II) mit der Ausnahme durchgeführt, daß anstelle eines polymeren Stabilisators das Sorbitansesquioleat eingesetzt wurde. Der polymere Stabilisator wurde folgendermaßen hergestellt. Es wurde eine Lösung von Copoly(isooctylacrylat:VDM) (95:5) (31,68 g einer Lösung von 38,7 % Feststoffen in Ethylacetat) verdünnt mit Aceton (20,54 g). Zu dieser Lösung wurde Cholinsalicylat (1,06 g, 0,0044 Mol) und 1,8- Diazabicyclofs.4.0]undec-7-en (DBU) (0,1 g) zugesetzt und das resultierende Gemisch für 15 Stunden bei 55 ºC erhitzt. Die IR-Analyse zeigte die Bildung des angestrebten Reaktionsprodukts.
Bei der Herstellung des Polymers für die Kügelchen wurden 6,0 g der vorgenannten polymeren Stabilisatorlösung eingesetzt. Nach Ausführung der Polymerisation entsprechend der Beschreibung in Beispiel 3, dem Abtrennen und dem Trocknen des Polymers für die Kügelchen zeigte die IR- Analyse, daß sämtliche Azlacton-Gruppen hydrolysiert worden waren. Die Cyclisierung wurde unter Verwendung von Essigsäureanhydrid wie in Schritt 2 von Beispiel 1 erzielt. Die Kügelchen wurden sodann filtriert, mit Ethylacetat (2 x 500 ml) und Diethylether (1 x 500 ml) gewaschen und sodann unter Pumpenvakuum bei weniger als 133 Pa (1 Torr) für 24 Stunden bei 65 ºC getrocknet.

Beispiel 4B

Es wurde eine Umkehrphasen-Suspensionspolymerisation nach einer Prozedur ähnlich der von Beispiel 4A mit der Ausnahme ausgeführt, daß der verwendete polymere Stabilisator Copoly(isooctylacrylat:N-acryloylmethylalanin, Natriumsalz) (90,5:9,5) war. Die IR-Analyse der erhaltenen Kügelchen zeigte, daß während der Polymerisation keine Hydrolyse des Azlacton-Ringes aufgetreten war.

Beispiele 4C, 4D und 4E

Es wurden nach der Prozedur von Beispiel 4A Umkehrphasen-Suspensionspolymerisationen mit der Ausnahme ausgeführt, daß der verwendete polymere Stabilisator 90:10 Copoly(isooctylacrylat:acrylsäure, Natriumsalz) (4C) 90:10 Copoly(isooctylacrylat:acrylsäure) (4D) und 91,8:8,2 Copoly(isooctylacrylat:N-acryloyl-(-Aminoisobutyramid) (4E) war
Die IR-Analyse der erhaltenen Kügelchen zeigte für alle Fälle, daß keine Hydrolyse des Azlacton-Ringes während der Polymerisation aufgetreten war.

Beispiel 5a

Die folgenden Beispiele lehren die Herstellung von Azlacton-funktionellen Polymeren für Kügelchen durch Dispersionspolymerisationin alkoholischen Medien (Prozeß III).

Herstellung von Copoly(2-vinyl-4,4- dimethylazlacton:ethylenglykoldimethylacrylat 42:58

In einen wie in Beispiel 3 ausgestatteten gerillten 1 1-Rundkolben wurde tert-Butanol (400 ml), Polyvinylpyrrolidon (7,0 g) und Aliquat 336 (2,0 g) (verfügbar bei Henkel Corp., Kankakee, IL) gegeben. Es wurden VDM (21 g), Ethylenglykoldimethacrylat (EGDMA, 29 g) und Azobis(isobutyronitril) (AIBN) (0,5 g) gemischt und die resultierende Lösung dem Reaktionsgefäß zugegeben. Es wurde für 10 Minuten Stickstoffgas durch das gerührte Reaktionsgemisch durchgeperlt und danach der Kolben in ein Ölbad getaucht, das auf 70 ºC eingestellt war. Das Rühren und Erhitzen wurde für 2,5 Stunden fortgesetzt und danach die Mischung abkühlen gelassen und filtriert. Der Filterkuchen wurde zweimal mit Aceton gewaschen und bei 50 ºC in einem Heißluftofen getrocknet, um 43 g farblose Polymerkügelchen zu ergeben. Die IR-Analyse zeigte, daß der Azlacton-Ring intakt war und das keine offensichtliche Reaktion mit dem Alkohollösemittel stattgefunden hatte.
Weitere Beispiele von Polymerkügelchen wurden ähnlich nach den in diesem Beispiel beschriebenen Prozeduren mit der Ausnahme hergestellt, daß andere dispergierende Lösemittel, andere Monomeranteile oder andere Comonomere eingesetzt wurden. Die Kügelchen wurden separat hergestellt unter Verwendung von Isopropanol, Ethanol und Methanol als das dispergierende Lösemittel und Methylmethacrylat, Hydroxyethylmethacrylat und 2-Isopropenyl-4,4-dimethylazlacton als die Monomere. Die IR-Analyse zeigte in allen Fällen, daß der Azlacton-Ring in den Produktkügelchen erhalten geblieben war. Tabelle I zeigt die verschiedenen Zusammensetzungen, die nach diesem Verfahren hergestellt worden sind. Tabelle I Nach der Dispersionpolymerisation hergestellte Polymerkügelchen
a ... Methylmethacrylat
b ... 2-Hydroxyethalmethacrylat
c ... 2-Isopropenyl-4,4-dimethylazlacton

Beispiel 6

Die polymeren Kügelchen der vorangegangenen Präparate wurde auf ihre Fähigkeit zum Binden von Protein A unter Verwendung von markiertem Protein ausgewertet. Es wurde radioiodiertes Protein A (Beispiel 2) mit nichtmarkiertem Protein A verdünnt, um eine spezifische Target-Radioaktivität von 2.000 cpm/Mikrogramm Protein, aufgelöst in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit 25 mmol Natriumphosphat, 150 mmol NaCl-Puffer, pH 7,5, mit einer Protein-Endkonzentration von 250 Mikrogramm/ml zu ergeben. In den dreifach ausgeführten Proben wurden 200 Mikroliter Protein A-Lösung zu 10 mg Kügelchen gegeben und bei Raumtemperatur für eine Stunde umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Entfernung der Proteinlösung beendet und 500 Mikroliter 3,0 molares Ethanolamin, pH 9,0, zum Quenchen der nichtreagierten Azlacton-Stellen zugesetzt. Nach 30 Minuten wurden die Kügelchen dreimal mit 500 Mikroliter PBS gewaschen, in saubere Reagensgläser gegeben und auf gebundenes radioaktives Protein entsprechend Beispiel 2 geprüft. Am folgenden Tag wurden die Kügelchen mit 500 Mikroliter 1%iger SDS (Natriumdodecylsulfat) in PBS für 4 Stunden bei 37 ºC inkubiert, um nichtkovalent gebundenes Protein zu entfernen. Nach der Inkubation wurden die Kügelchen dreimal mit 500 Mikroliter SDS durchgesprudelt und die verbleibende Radioaktivität bestimmt. Die Daten aus diesen Experimenten sind in der nachfolgenden Tabelle II zusammengestellt. Tabelle II Eigenschaften von Azlacton-Polymeren Kügelchen
Die Daten von Tabelle II zeigen, daß die nach den Prozessen II und III hergestellten Kügelchen ähnlich den im Prozeß I erhaltenen über ein hohes Protein-Bindungsvermögen verfügen.

Beispiel 7

Nach Standardmethoden, der BET-Methode (isotherme Stickstoffabsorption) und der Quecksilber-Porosimetrie wurde die Oberfläche und die Porengröße von Azlacton-Polymerkügelchen gemessen, die nach den Verfahren der Beispiele 3 und 5A hergestellt worden waren. Die reaktionsfähigen Gruppen wurden ermittelt, indem die Methode von Beispiel 3 der US-P-4 737 560 derart modifiziert wurde, daß die Kügelchen in 0,1 molarem NaOH über Nacht vor der Titration mit der Standardsäurelösung reagiert wurden. Die Ergebnisse in Tabelle III zeigen, daß die nach dem Verfahren von Beispiel 3 hergestellten Kügelchen ein Material ergeben, das wesentlich poröser als Eupergit-C ist (Angaben nach Informationen des Händlers), während die nach dem Verfahren von Beispiel 5A hergestellten Kügelchen nahezu porenfrei waren. Tabelle III Eigenschaften von polymeren Kügelchen
Kügel- Oberfläche mittlere reaktionsfähige
Die gemessene mittlere Porengröße der porösen Azlacton- Kügelchen von Beispiel 3 war etwas größer als die von Eupergit-C. Es wird angenommen, daß die große gemessene Porengröße (2,5 Mikrometer) der Azlacton-Kügelchen von Beispiel 5A das Zwischenraumvolumen zwischen den Kügelchen repräsentiert und das Fehlen einer porösen Struktur anzeigt. Die Zahl der reaktionsfähigen Gruppen, die an porösen Azlacton-Kügelchen verfügbar ist, war größer als die an Eupergit-C verfügbare, was bei Verwendung für chromatographische Zwecke von großem Nutzen sein könnte. Beim Vergleich der reaktionsfähigen Gruppen pro Flächeneinheit waren die porenfreien Azlacton-Kügelchen und die porösen Kügelchen dem Eupergit-C weit überlegen.

Beispiel 8

Dieses Beispiel demonstriert die Herstellung von Azlacton-funktionellen Polymeren mit verbesserten Beschichtungseigenschaften für organische und anorganische Substrate (Prozeß IV).
Es wurde durch radikalische Polymerisation des Monomers unter Verwendung von 2,2'-Azobisisobutyronitril (AIBN) als Initiator mit 30 % Feststoffen in Methylethylketon (MEK) ein Homopolymer von VDM hergestellt. Die Proben dieser Polymerlösung wurden mit Methanol unter Verwendung von DBU (2 % ... 5 Molprozent bezogen auf das eingesetzte Methanol) als Katalysator umgesetzt. Die Menge des eingesetzten Methanols wurde so gewählt, daß eine bestimmte Fraktion von Azlacton-Ringen des Polymers intakt gelassen wurde. Das Homopolymer und 5 modifizierte Polymere mit verbleibenden 100, 80, 60, 40, 20 und 0 Molprozent wurden hergestellt. Diese werden in den nachfolgenden Beispielen bezeichnet als VDM-100, VDM-80, VDM-60, VDM-40, VDM-20 und VDM-0.
In ähnlicher Weise wurde Ethylamin mit einer Fraktion der Homopolymer-Lösung zur Erzeugung eines 60 % Ethylamid/40 % Azlacton-Polymers (VDM-60N) umgesetzt.

Beispiel 9

Dieses Beispiel zeigt die überlegenen Beschichtungseigenschaften von modifiziertem Poly-VDM (Prozeß IV).
Es wurden Mikroskop-Objektträger aus Glas (2,5 cm x 7,6 cm) (SurgiPath ) dreimal in einer 10%ige Lösung von VDM-60 oder VDM-100 (Beispiel 8) in Ethylacetat eingetaucht und für eine Stunde bei Raumtemperatur (Prozeß IV) lufttrocknen gelassen. Die Objektträger wurden sodann in destilliertes Wasser für 5 bis 15 Minuten eingetaucht und die verbleibende VDM-Beschichtung untersucht. Nach dem Spülen bestätigten die mit VDM-60-Polymer beschichten Objektträger durch das Auftreten eines blassen opalisierenden Schimmers die intakte VDM-Polymer-Beschichtung. Von den mit VDM-100 beschichteten Objektträgern wurde das Abheben eines Polymerfilms von der Oberfläche beobachtet. Dieses zeigt, daß das partiell mit Methanol umgesetzte Azlacton-Polymer sich wesentlich besser an einer Glasoberfläche bindet als das nichtumgesetzte Polymer. In ähnlicher Weise wurden Objektträger aus Glas in 10%ige Lösungen von VDM-100 und VDM-60N getaucht und luftgetrocknet. Die Objektträger wurden paarweise für 10 und für 40 Minuten in 0,1 molarer HCl-Lösung getaucht. Die VDM- 100-Beschichtung entwickelte Bläschen und wurde in jedem Fall abgehoben, während die VDM-60N-Beschichtung bei der Behandlung haften und unverändert blieb.
Zur Bestätigung dieser qualitativen Beobachtungen wurden Abschnitte von einfachem Mikrohämatokrit-Kapillarrohr (American Scientific Products, McGaw Park, IL) mit VDM-60 (Beispiel 8) beschichtet und luftgetrocknet (1,2 mm Innendurchmesser, 6 mm Länge; 2 Abschnitte pro Assay mit 0,90 cm² Gesamtoberfläche). Diese Proben (in dreifacher Ausführung) wurden mit radioiodiertem Protein A entsprechend der vorstehenden Beschreibung (Beispiel 26) inkubiert. Die Ergebnisse zeigen (siehe die nachfolgende Tabelle IV), daß Azlacton-funktionelle Polymer-Beschichtung des Glases sowohl die Menge des kovalent gebundenen Proteins (17-fach größer als nichtbehandeltes Glas) als auch die prozentuale SDS- Beständigkeit (4,5-fache Erhöhung) erhöhte. Außerdem führte die Inkubation in der wäßrigen PBS-Lösung bei Raumtemperatur für 16 Stunden zu keinem signifikanten Verlust an gebundenem Protein, was eine minimale Auflösung der Azlactonfunktionellen Polymer-Beschichtung durch wäßrige Lösung im Verlaufe dieser verlängerten Zeitdauer bestätigt. Tabelle IV Das Binden von Protein A an VDM-60-beschichtetem Glas

Beispiel 10

Dieses Beispiel veranschaulicht das Beschichten von Silica-Gel mit Azlacton-funktionellem Polymer und die Fähigkeit des beschichteten Produkts zum kovalenten Binden von Protein (Prozeß IV).
Es wurden in einem Ofen bei 135 ºC und weniger als 133 Pa (1 Torr) für 24 Stunden Silica-Kügelchen chromatographischer Reinheit (Silicar CC-4TM, Mallinkrodt Chemical, St. Louis, MO) getrocknet. Eine Probe dieses Silicagels (9,81 g) wurde mit einer Lösung mit 30 % Feststoffen VDM-100 Polymer aus Beispiel 8 in MEK (1,63 g) gemischt. Diese Mischung wurde mit weiterem MEK (50 ml) bedeckt und bei Raumtemperatur für 3 Stunden unter gelegentlichem Aufwirbeln stehen gelassen. Sodann wurde das Lösemittel unter verringertem Druck entfernt und das aufgetragene Silicagel, das jetzt 5 Gewichtsprozent Azlacton-Polymer enthielt, bei weniger als 133 Pa (1 Torr) bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet. In ähnlicher Weise wurden VDM-80, VDM-60, VDM- 40, VDM-20 und VDM-0 auf Silicagel aufgetragen. Näherungsweise 10 mg jedes beschichteten Silicagels und eines unbehandelten Silicagels wurden an markiertem Protein A exponiert und auf Protein-Bindung wie in Beispiel 6 ausgewertet.
In der nachfolgenden Tabelle V sind die Ergebnisse des Radioaktivitätsmonitorings der Protein-behandelten Kügelchen und der nachfolgenden SDS-Behandlung dargestellt. Tabelle V Das Binden von Protein A an Silica-Kügelchen, die mit Azlacton-funktionellem Polymer beschichtet sind
Die Daten von Tabelle V zeigen, daß ein Beschichten der Kügelchen mit Polymer, das 20 % Restazlacton enthielt (VDM- 20) zu einer 14-fachen Erhöhung der gebundenen Proteinmenge führte und sich die SDS-Beständigkeit mehr als verdoppelte. Lösungen von Polymer mit 40 % Azlacton-Funktionalität oder mehr lieferten eine Protein-Bindung mit einer gegenüber dem unbeschichteten Silica 17-fachen Erhöhung. Die SDS- Beständigkeit nahm auf 98 % als Ergebnis der Beschichtung mit Azlacton-funktionellem Polymer auf diesem anorganischen Trägermaterial zu.

Beispiel 11

Dieses Beispiel veranschaulicht die Möglichkeit von partiell umgesetztem Azlacton-Polymer zum Beschichten von Keramikkügelchen aus Zirconiumdioxid (Prozeß IV).
Entsprechend der Beschreibung von M. P. Rigney, Doktorarbeit, "The Development of Porous Zirconia as a Support for Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography" (("Entwicklung von poröserem Zirconiumdioxid als Träger für Hochleistungs-Umkehrphasenflüssigchromatographie")), University of Minnesota, Minneapolis, MN (1988), hergestellte Keramikkügelchen aus Zirconiumdioxid wurden wie in Beispiel 10 mit VDM-60 bis zu einer Endbeladung von 5 Gewichtsprozent beschichtet. Es wurden beschichtete und nichtbeschichtete Kügelchen auf Protein-Bindung unter Anwendung von radioiodiertem Protein A ausgewertet.
Von jedem Typ des Kügelchens wurden näherungsweise 20 mg (in dreifacher Ausführung) mit 400 Mikroliter einer verdünnten Lösung von markiertem Protein A (spezifische Radioaktivität bei 2.000 cpm/Mikrogramm; 250 Mikrogramm Protein/ml) für eine Stunde inkubiert und dann 800 Mikroliter 3,0 molares Ethanolamin, pH 9,0, dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Nach dem Zentrifugieren und der Entfernung des Überstandes wurden weitere 800 Mikroliter Amin zum Quenchen mit den Kügelchen für 30 Minuten inkubiert. Diesem Quenchen folgten 3 x 800 Mikroliter Spülungen mit PBS. Die Kügelchen wurden sodann auf Radioaktivität (10 Minuten pro Röhrchen) untersucht und an dem folgenden Tag einer 1%igen SDS-Behandlung unterzogen (siehe Beispiel 6).
Die Beschichtung der Kügelchen mit Azlacton-funktionellem Polymer resultierte zu einer 24-fachen Erhöhung der Protein-Bindung an dem keramischen Material mit 0,72 Mikrogramm Protein pro mg Kügelchen im Vergleich zu 0,03 Mikrogramm pro mg bei unbeschichteten Kügelchen. Darüber hinaus war das gebundene Protein gegenüber einer SDS- Behandlung um mehr als 99 % beständig, was auf eine Verknüpfung des Proteins mit kovalenter Bindung an dem mit Azlacton-funktionellem Polymer beschichteten Zirconiumdioxid-Träger hinweist

Beispiel 12

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer mit Polyazlacton beschichteten Nylon-Membran und das Binden von Protein daran (Prozeß IV).
Es wurden kleine Plättchen einer Nylon-Filtermembran (Filter)Pure Nylon-66, 0,2 Mikrometer; Perce, Rockford, IL) mit einem Durchmesser von 0,635 cm (1/4") und einer Gesamtoberfläche von 0,61 cm²/Plättchen zugeschnitten und in eine 1%ige Lösung von VDM-60 (Beispiel 8) in Ethylacetat für eine Stunde bei Raumtemperatur eingetaucht und danach luftgetrocknet. Die Bindung von Protein A wurde mit Hilfe der Prozedur von Beispiel 6 mit der Ausnahme ausgewertet, daß Polyazlacton-beschichtete Plättchen und unbehandelte Plättchen (in dreifacher Ausführung) mit 250 Mikroliter markierter Protein A-Lösung behandelt und bei Raumtemperatur für eine Stunde reagieren gelassen wurden, wobei die ersten 30 Minuten der Inkubation unter Vakuum ausgeführt wurden, um eine vollständige Benetzung der Membran zu gewährleisten. Die Reaktion wurde durch Entfernung der Proteinlösung abgebrochen und 500 Mikroliter 3,0 M Ethanolamin, pH 9,0, zum Quenchen der nichtreagierten Azlacton-Stellen in der bereits beschriebenen Weise zugesetzt.
Die mit VDM-60 behandelten Nylon-Membranplättchen zeigten einen 60%igen Zuwachs von kovalent gebundenem Protein gegenüber unbehandelten Plättchen (757 ng/Protein A/cm² gegenüber 472 ng/cm²) mit einem signifikanten sechsfachen Anstieg der prozentualen SDS-Beständigkeit (71 % im Vergleich zu 11 %). Diese Ergebnisse zeigen, daß die Protein-Bindung an dieser Membran durch einfache Behandlung mit dem Azlactonfunktionellen Polymer erhöht werden könnte.

Beispiel 13

Dieses Beispiel demonstriert das Beschichten von Polyethylen-Partikeln mit partiell umgesetzem Azlacton- Polymer und die Möglichkeit der beschichteten organischen Partikel zum Binden von Protein (Prozeß IV).
Nach der in der AU-P-551 446 offenbarten Prozedur wurden hochdichte poröse Polyethylen-Partikel (hergestellt nach der Offenbarung der US-P-4 539 256) kryogenisch gemahlen und sodann mit einer Beladung von 5 Gewichtsprozent VDM-60 nach einer ähnlichen Prozedur wie der von Beispiel 10 beschichtet. Es wurden nichtbehandelte und VDM-60 behandelte Partikel auf das Binden von Protein A in der vorstehend ausgeführten Weise (Beispiel 6) unter Verwendung von 10 mg Partikel pro Röhrchen, 200 Mikroliter Protein A-Lösung und 500 Mikroliter Reagens zum Quenchen, PBS- und SDS-Lösung ausgewertet.
Die radioaktiven Bestimmungen ergaben eine 65%ige Zunahme von kovalent gebundenem Protein auf den mit VDM-60 behandelten Partikeln im Vergleich zu nichtbehandeltem Polyethylen. Die SDS-Beständigkeit nahm von 24 % auf 65 % zu, was eine zwei- bis dreifache Zunahme der relativen Mengen von kovalent gebundenem Protein entspricht.

Beispiel 14

Dieses Beispiel zeigt, daß Pfropfpolymere von VDM und Polystyrol zum Beschichten von Glaskügelchen (Corning Glass Works, Corning, NY) verwendet werden können (Prozeß IV).
Wie in Beispiel 10 wurden Glaskügeichen mit kontrollierter Porengröße in (("CPG")) mit einer ausreichenden 1%igen Lösung eines VDM-gepfropften Polystyrols )(2 % VDM) in Toluol behandelt, um eine Beladung von 1 % des CPG nach dem Verdampfen zu ergeben. Als Kontrolle wurde nicht- gepfropftes Polystyrol ebenfalls auf CPG mit Hilfe einer ähnlichen Prozedur aufgetragen. Die beschichteten CPG wurden sodann auf das Binden von Protein A im Vergleich mit dem nichtbehandelten Glasmaterial entsprechend der bereits in Beispiel 6 ausgeführten Weise unter Verwendung von 10 mg Trägermaterial pro Röhrchen getestet.
Die Bestimmung von kovalent gebundenem, radioaktiven Protein zeigt eine neunfache Zunahme des gebundenen Gesamtproteins an den mit Polystyrol beschichteten Kügelchen gegenüber unbeschichteten Kügelchen mit einer zusätzlichen dreifachen Zunahme an mit VDM-gepfropften Polystyrol beschichtetem Material. Die SDS-Ergebnisse zeigten ein zweifache prozentuale Beständigkeit des gebundenen Proteins an VDM-gepfropftem Polystyrol im Vergleich zu den mit einfachen Polystyrol beschichteten Kügelchen. Diese Daten zeigen eine signifikante Zunahme im kovalent gebundenen Protein als unmittelbares Ergebnis des auf die Glaskügelchen aufgetragenen VDM-gepfropften Polymers.

Beispiel 15

Derivatisieren von VDM-Copolymerkügelchen und Nachweis der Eigenschaften der hydrophoben Wechselwirkung

Es wurden VDM-Copolymerkügelchen von Beispiel 18 der US-P-4 871 824 für 96 Stunden bei Raumtemperatur mit 0,5 molarem Phenethylamin (Aldrich Chem. Co., Milwaukee, WI) in 25 mMol Phosphat-Puffer, pH 7,5, derivatisiert. Die Kügelchen wurden ausgiebig mit Phosphat-Pufferlösung gewaschen und von Hand in 0,35 ml Omni -Glassäulen (3 mm x 5 cm; Ramm Instrument Co., Woburn, MA) gepackt. Die Säule wurde auf dem FPLC-System (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) mit 1,7 molarem Ammoniumsulfat in 50 mmol Phosphat-Pufferlösung, pH 6,8, äquilibriert. Es wurde Ovalbumin (5 mg/ml; Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) aufgelöst in dem Ammoniumsulfat-Puffer auf die Säule geladen. Zur Auswertung der Elution des Proteins durch hydrophobe Wechselwirkung wurde eine Flußrate von 1, ml/min, ein Gradient von 15 ml (1,7 Mol Ammoniumsulfat zu 0,0 Mol in Phosphat-Puffer) eingestellt. In diesem Beispiel wurden 0,53 mg des Proteins nachlaufend in dem Gradienten bei 10,45 ml des Elutionsvolumens (1,16 Mol Ammoniumsulfat) eluiert, wobei das verbleibende Protein in dem Porenvolumen zurückgewonnen wurde. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu einer Kontrollsäule unter Verwendung des identischen Lösemittelsystems, jedoch gepackt mit VDM-Kügelchen, die in Phosphat-Pufferlösung hydrolysiert worden waren. Die Kontrolle zeigte keine Wechselwirkung mit dem Ovalbumin, d.h. das gesamte Protein passierte am Porenvolumen unverzögert die hydrolysierte Copolymersäule.
Rinderserumalbumin (BSA; Sigma) wurde mit 25 mg/ml in Ammoniumsulfat-Pufferlösung auf die Säule injiziert und mit dem gleichen Gradienten wie vorstehend eluiert, jedoch mit einer Flußrate von 0,3 ml/min. Diese hohe Konzentration (5 mg-Injektion) von Protein hatte eine Elution von 32 % des Gesamtproteins bei 10,53 ml (1,17 Mol Salz) zur Folge, wobei der Rest dem Porenvolumen wiedergewonnen wurde. Bei erneuter Injektion wurde eine Fraktion des ungebundenen Proteins vom Porenvolumen an der Säule gebunden und bei 10,49 ml eluiert, was nahelegt, daß die Säule mit der ersten Injektion überladen wurde. Diese Daten legen nahe, daß bei herabgesetzter Salzkonzentration die Proteine von der Matrix auf der Grundlage ihrer Hydrophobie eluiert werden. Diese Demonstration zeigt die mögliche Anwendung des VDM- Copolymers in der Chromatographie mit hydrophober Wechselwirkung.

Beispiel 16

Demonstration der Ionenaustauscheigenschaften

Die VDM-Copolymerkügelchen von Beispiel 15 wurden mit 0,7 Mol Taurin (Aldrich Chem., Milwaukee, WI) in 25 mmol Phosphat-Puffer, pH 7,5, für 72 Stunden bei Raumtemperatur derivatisiert. Das überschüssige Reagens wurde von den Kügelchen mit Pufferlösung vor dem Packen in eine 0,35 ml Omni -Glassäule (3 mm x 5 cm) abgespült. Die Säule wurde mit 50 ml Essigsäure, pH 5,0, äquilibriert. In dem Puffer zum Äquilibrieren wurde das BSA aufgelöst und 0,8 mg auf die Säule injiziert. Nach dem Beladen des Proteins in 5 ml Puffer zum Äquilibrieren wurde bei einer Flußrate von 0,5 ml/min ein 25 ml Salzgradient von 0 bis 2 Mol NaCl (in 50 mMol Acetat, pH 5,0) für die Ionenaustauscheluierung aufgebracht. Wie anhand der UV-Absorptionswerte bei 280 nm nachgewiesen wurde, wurden 0,54 mg des BSA von der Säule bei einem Elutionsvolumen von 8,8 ml eluiert. Das verbleibende Protein wurde in dem Porenvolumen wiedergewonnen.
Die vorstehende Anwendungsvorschrift wurde mit Rinder- Antikörper IgG (Sigma) als das experimentelle Protein ausgeführt, um Unterschiede der Elution zwischen zwei Proteinen zu bewerten. Nach dem Beladen von 0,68 mg IgG wurden näherungsweise 0,52 mg (64 %) bei 8,4 ml eluiert, wobei das verbleibende IgG im Porenvolumen wiedergewonnen wurde. Diese Ergebnisse korrelieren mit vorangegangenen Versuchen unter Verwendung kommerzielle Ionenaustausch-Matrixstoffe, bei denen IgG geringfügig vor dem BSA auf einer Mono S-Säule (Pharmacia Co., Piscataway, NJ) eluiert wurde.
Es wurde eine Mischung der vorgenannten zwei Proteine unter Verwendung der Taurin/Azlacton-Säule beim Injizieren auf die Säule aufgelöst und bei 0,2 ml/min entsprechend dem folgenden mehrfachen Gradienten eluiert: Ein 30 ml-Gradient von 0 bis 0,30 M NaCl, gefolgt von einem 15 ml-Gradienten bis zu 1,0 M NaCl und abschließendem Reinigen von gebundenem Protein mit 2 M NaCl. Die Proteine wurden in Haupt-Peaks bei 17,8 ml (0,13 M NaCl) und bei 21,5 ml (0,16 M NaCl) eluiert. Diese Elutionsvolumina variieren infolge der veränderten Flußrate gegenüber den vorangegangenen Beispielen.

Beispiel 17

Demonstration der Anionaustauscheigenschaften von Azlacton- Kügelchen

Es wurden VDM-Polymerkügelchen aus Beispiel 15 mit einem Überschuß von 4-Dimethylamino-1-butylamin in Aceton für 12 Stunden unter dem Rückfluß umgesetzt. Nach der Filtration und dem Waschen mit Aceton zur Entfernung von nichtumgesetztem Amin wurden die Kügelchen unter Vakuum bei 60 ºC getrocknet. Die Kügelchen wurden sodann in eine 2, ml-Glassäule mit 5 mm x 10 cm (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsalla, Schweden) gepackt und mit 20 mMol Tris(hydroxymethyl)aminmethan (Tris), pH 8,0, äquilibriert Das BSA und das Rinder-IgG wurden auf die Säule injiziert und mit einem 20 ml-Gradienten von 0 bis 2 Mol NaCl, 20 mMol Tris, pH 8,0, eluiert. Die Retentionsvolumina für die Proteine betrugen 17,0 bzw. 21,7 mit einem Porenvolumen von 4,1 ml. Dieses demonstriert die Verwendung von kationischen Derivaten der VDM-Polymerkügelchen für Anionenaustausch- Trennungen.

Beispiel 18

Demonstration der Ausschlußeigenschaften

Die VDM-Polymerkügelchen vom Beispiel 15 wurden in 10 mmol Phosphat-Puffer bei pH 7,5 für mehr als 72 Stunden bei Raumtemperatur hydrolysiert. Die Kügelchen wurden in eine 2 ml-Glassäule mit 5 mm x 10 cm gepackt und in 50 ml Natriumsulfat in Phosphat-Puffer (10 mmol), pH 7,2, äquilibriert. Die in der nachfolgenden Tabelle VI angegebenen Materialien wurden in Wasser aufgelöst und vor der Injektion auf die Säule filtriert (0,2 Mikrometer): Tabelle VI Trennung biologischen Molekülen durch Ausschlußchromatographie unter Verwendung von Porösen Polymerkügelchen
Jedes Material (100 Mikroliter) wurde auf die Säule geladen und in dem durchlaufenden Puffer bei einer Flußrate von 0,2 ml/min eluiert. Die Detektion des Elutionsvolumens erfolgte mit Hilfe der UV-Absorption bei 280 nm. Das 6 M Natriumsulfat lieferte eine Absorptionsverschiebung infolge einer durch die erhöhte Salzkonzentration hervorgerufenen Änderung der Brechzahl und schuf einen Nichtprotein-Marker mit sehr geringem Molekulargewicht.
Die graphische Darstellung der Ergebnisse zeigt einen linearen Zusammenhang zwischen dem Logarithmus des Molekulargewichts und des Elutionsvolumens. Diese Daten sind kennzeichnend für breitbandige Ausschlußeigenschaften des hydrolysierten VDM-Polymers. Auf der Grundlage dieser Standardkurve kann dieses spezielle Präparat der Azlacton- Copolymerkügelchen für die Ausschlußchromatographie über einen Bereich der relativen Molekülmasse von 4 logarithmischen Einheiten (100 ... 1.000.000) verwendet werden.

Beispiel 19

Ausschluß-Charakteristik von derivatisiertem VDM

Das VDM-Copolymer von Beispiel 15 wurde mit 2 Aminreagenzien mit kurzen Kettenlängen für weitere Ausschluß- Untersuchungen derivatisiert. Die Kügelchen wurden entweder an 2 molarem Ethylamin in Phosphat-Puffer (25 mmol, pH 7,5) oder 0,5 M Butylamin (im gleichen Puffersystem) für mindestens 72 Stunden bei Raumtemperatur exponiert. Der Überschuß der Amine wurde durch Spülen in Pufferlösung entfernt und die einzelnen 5 mm x 10 cm-Säulen vorbereitet. Die Säulen wurden beladen mit Blue Dextran , Thyroglobulin, Katalase und Rinderserumalbumin und entsprechend der Beschreibung von Beispiel 18 eluiert. Die Ergebnisse zeigen wiederum eine lineare Beziehung zwischen dem Logarithmus der relativen Molekülmasse und dem Elutionsvolumen.

Beispiel 20

Demonstration der Umkehrphasenchromatographie

Es wurden Azlacton-Polymerkügelchen von Beispiel 15 mit 1 Mol Octylamin in Phosphat-Puffer (25 mmol), pH 7,2, für 72 Stunden bei Raumtemperatur derivatisiert. Die Kügelchen wurden von überschüssigem Alkylamin mit Pufferlösung abgewaschen und in eine Omni-3 mm x 5 cm-Gaschromatographiesäule gepackt. Die 0,35 ml-Säule wurde in 1,7 M Ammoniumsulfat (pH 7,0) äquilibriett. In dem Puffer zum Äquilibrieren wurde Myoglobin aufgelöst und 1,25 mg auf die Säule geladen. Die Elution mit einem abnehmenden Salzgradienten von Amoniumsulfat wie in Beispiel 15 führte zu keiner Protein-Wiedergewinnung. Die Anwendung typischer Bedingungen für die Protein-umkehrphasenelution, ein 30 ml- Gradient von 1 % Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser zu 1 % TFA in 70 % Methanol, führte zu einer Wiedergewinnung des Proteins. Diese Demonstration wurde mit ähnlichen Ergebnissen mit Polymerkügeichen wiederholt, die mit 0,5 M Methylamin (C1), 2 M Ethylamin (C2) und 0,5 M Butylamin (C4) umgesetzt worden waren.
Unter Verwendung der Kügelchen mit gebundenen C8- Gruppen wurden Injektionen von Myoglobin, BSA und Lysozym ausgeführt und mit einem 30 ml-Gradienten von 1 % TFA in Wasser zu 1 % TFA in 70 % Methanol bei einer Flußrate von 0,1 ml/min ausgeführt. Die Elutionsprofile sind in Tabelle VII zusammengestellt. Tabelle VII Umkehrphasen-Trennungen von Proteinen unter Verwendung von Octylamin-derivatisierten Copolymerkügelchen
Die Unterschiede in diesen Elutionsprofilen sind kennzeichnend für die Unterschiede in der Größe und der hydrophoben Natur dieser Proteine und demonstrieren die Verwendung von mit C1- ... C8-Gruppen derivatisierten VDM- Kügelchen in der Umkehrphasenchomatographie.

Beispiel 21

Umkehrphasenchromatographie von niedermolekularen Materialien

Es wurden VDM-Kügelchen aus Beispiel 15 mit einem Überschuß von n-Hexadecylamin (C16) in Diethylether für eine Stunde umgesetzt. Das nichtumgesetzte Amin wurde durch Futration und Waschen mit Diethylether entfernt. Die derivatisierten Kügelchen wurden sodann in Methanol dispergiert und in eine 4,6 mm x 100 mm HPLC-Säule aus rostfreiem Stahl gepackt. Nach dem Äquilibrieren in 45:55 Methanol:Wasser wurden Injektionen von organischen Substanzen mit kleinen Molekühlen vorgenommen und bei 0,25 ml/min mit UV- Detektion bei 280 nm eluiert. Tabelle VIII faßt die Retentionszeiten zusammen und demonstriert ferner die Verwendung von mit Alkylamin derivatisierten VDM-Polymerkügelchen als Träger für Umkehrphasenchromatographie. Tabelle VIII Umkehrphasen-Trennung von niedermolekularen Materialien

Beispiel 22

Beschichtung von Azlacton-Monomer auf Polystyrol- Mikrotiterplatten

Es wurde ein 2-Vinyl-4,4-dimethylazlacton-Monomer (VDM) mit 0,25 Gewichtsprozent Photomitator (IRGACURE 651 (Ciba Geigy)) zubereitet und sodann auf die Oberfläche von Polystyrol-Mikrotiterplatten (Immulon II, Dynatech, Springfield, VA) aufgetragen. Die Mikrotiterplatten wurden sodann unter Stickstoffatmosphäre und unter Verwendung eines Lampenaggregats mit 4 Fluoreszens-Schwarzlichtlampen (GTE Sylvania, Inc.) für 30 Minuten bestrahlt. Dieses führte zur Polymerisation des Azlacton-Monomers auf der Oberfläche der Mikrotiterplatten. Weitere Monomere, wie beispielsweise 4-Isopropenyl-4,4- dimethylazlacton (IDM) lassen sich in ähnlicher Weise auftragen.

Beispiel 23

Beschichten von Azlacton-funktionellen Copolymeren auf Polystyrol-Mikrotiterplatten

Nach einem Standardverfahren der radikalischen Lösungspolymerisation wurden Copolymere aus VDM und Methylmethacrylat (MMA) hergestellt. Die Copolymerproben enthielten VDM/MMA-Anteile (Mol/Mol) von 85:15, 70:30 und 50:50 und wurden jeweils in Ethylacetat auf 10 % Feststoffe verdünnt. Das Beschichten der Mikrotiterplatten erfolgte unter Verwendung einer Einwegpipette durch Einbringen von 3 Tropfen Polymerlösung in jede Mulde und nachfolgenden Verdampfeu in einem Heißluftofen bei 60 ºC für 30 Minuten. Alternativ wurde die Copolymerlösung auf die Mikrotiterplatten aufgestrichen, wonach eine Verdampfung des Lösemittels folgte.

Beispiel 24

Verwendung von Polystyrol-Mikrotiterplatten für verbesserte Immunoassays

Die Bewertung der modifizierten Oberflächen der Mikrotiterplatten aus Beispiel 22 erfolgte durch Zusetzen wäßriger Lösungen von Maus-IgG (Sigma Chemical) oder Anti- Ziegen-IgG (Cooper-Biomedical, Malvern, PA) mit 50 Mikrogramm/ml in PBS, pH 7,0, in 48-Mulden-Mikrotiterplatten und Inkubieren dieser Platten bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Die Lösungen wurden abgesaugt und eine Fixierlösung von BSA (2,5 mg/ml) und Saccarose (5 % ) in PBS für 30 Minuten inkubiert. Die beschichteten Mikrotiterplatten wurden sodann abgesaugt und getrocknet. Nach dieser Prozedur wurde eine ähnliche Zahl von nichtmodifizierten Mikrotiterplatten beschichtet.
Die Menge des gebundenen Proteins wurde ausgewertet, indem in Mikrotiterplatten, die mit Maus-IgG und Anti- Ziegen-IgG behandelt worden waren, Enzym-markierte Reagenzien, Anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase und Ziegen- IgG-Meerrettich-Peroxidase gegeben wurden, für eine Stunde inkubiert und die Mikrotiterplatten dreimal mit einer bei pH 7,5 abgepufferten, nichtionischen Tensidlösung gewaschen wurden. Nach Zusetzen der geeigneten Enzymsubstrate wurde die durch die gebundenen und Enzym-markierten Reagenzien erzeugte Färbung gemessen. Die Daten von diesen Mikrotiterplatten sind in der nachfolgenden Tabelle IX zusammengestellt. Tabelle IX Binden von Antikörpern an Azlacton-Copolymer-beschichteten Mikrotiterplatten
*SD ... Standardabweichung
**CV ... relative Standardabweichung (SD/Mittelwert)
Die mit Maus-IGG behandelten Mikrotiterplatten erzeugten ein um mehr als 75 % stärkeres Signal als unbehandelte Mikrotiterplatten, während die Mikrotiterplatten mit Anti-Ziegen-IGG ein mehr als 20 % erhöhtes gekoppeltes Signal erzeugten. Die relative Standardabweichung der modifizierten Mikrotiterplatten war etwa um ein Drittel kleiner als die von nichtbehandelten Mikrotiterplatten.
Die Daten von Tabelle IX zeigen, daß sowohl die Menge des gebundenen Proteins als auch die Reproduzierbarkeit der Behandlung gegenüber der normalen Methode der passiven Adsorption verbessert sind.

Beispiel 25

Verbessertes Binden von allergenen Proteinen an beschichteten Polystyrol-Mikrotiterplatten

Extrakt aus Deutschem Weidelgras (PRG) ((auch genannt Englisches Raygras; Lohum-perenne)) und Chymopapain (CP) (3M Diagnostic Systems, Santa Clara, CA) wurden isotopisch mit ¹²&sup5;I markiert und in Kontroll-Mikrotiterplatten (unbehandelt) und mit VDM/MMA-behandelten Polystyrol-Mikrotiterplatten, hergestellt wie in Beispiel 23, für 2 Stunden bei Außentemperatur inkubiert. Die radioaktive Lösung wurde durch Absaugen entfernt und die nichtumgesetzen/ungebundenen Stellen an der Oberfläche durch Inkubation mit Serumalbumin für eine Stunde geblockt. Die Restradioaktivität der getrockneten Mikrotiterplatten wurde bestimmt und die entsprechenden Menge von gebundenem Protein berechnet und in der nachfolgend gezeigten Tabelle X angegeben. Tabelle X Binden von allergenen Proteinen an beschichteten und Kontroll-Polystyrol-Mikroplatten
Die Daten in Tabelle X zeigen, daß mit VDM beschichtete Polystyrol-Mikrotiterplatten mit ähnlicher Genauigkeit wie die Kontrolle 20 ... 25 % mehr allergenes Protein gebunden hat.

Beispiel 26

Erhöhtes irreversibles Binden von allergenen Proteinen an beschichteten Polystyrol-Mikrotiterplatten

Es wurden Mikrotiter-Testplatten, die wie in Beispiel 25 mit ¹²&sup5;I markierten Allergenen beschichtet wurden, mit 0,1 % SDS bei 37 ºC oder in Phosphat-Pufferlösung bei Außentemperatur inkubiert. Es wurden nach 4 Stunden die Lösungen durch Absaugen entfernt, zweimal mit deionisiertem Wasser gespült und das restliche gebundene ¹²&sup5;I bestimmt. Das zurückbleibende prozentuale Protein ist in der nachfolgenden Tabelle XI angegeben. Tabelle XI Erhöhte Beständigkeit von Azlacton-gebundenem Protein gegenüber Solubilisierung durch Denaturierungsmittel
*PRG ... Deutsches Weidelgras
**CP ... Chymopapain
Mit der möglichen Ausnahme der Isopropenyl-Derivate mit PRG zeigen die Daten von Tabelle XI, daß es eine wesentlich höhere Restbindung an Azlacton-behandelten Mikrotiterplatten gibt als in den Kontrollen, was auf das kovalente Binden von Allergenprotein hinweist.

Vergleichsbeispiel 27

Das folgende Beispiel ist ein Versuch zur Herstellung von Azlacton-funktionellen Kügelchen nach einer ähnlichen Prozedur wie in Beispiel 3 der US-P-4 070 348.
Es wurden Heptan (42 g), Perchlorethylen (84 g) und Benzoylperoxid (0,5 g) in einen 500 ml-Rundkolben gegeben. In DMF (20 g) wurden Acrylamid (15 g), VDM (15 g), Ethylenglykoldimethacrylat (0,76 g und polymerer Stabilisator (0,025 g) aufgelöst und diese Lösung sodann dem Reaktionskolben bei Raumtemperatur zugesetzt. Der verwendete polymere Stabilisator war ein Isobutylacrylat/n-Butylacrylat/VDM (45:45:10)-Copolymer, das mit Cholinsalicylat in einer ähnlichen Prozedur wie Beispiel 4A umgesetzt worden war. Die monomere Phase wurde in der organischen Phase durch Rühren mit einer Geschwindigkeit 350 U/min verteilt und mit Stickstoff für 45 Minuten durchgesprudelt. Unter externem Kühlen wurde die Polymerisation durch Zusatz von Dimethylanilin (0,25 g) gestartet. Innerhalb von 3 Minuten setzte sich die Monomermischung als eine große, vernetzte Masse um den Rührstab ab. Es waren keine Kügelchen festzustellen.

Beispiel 28 (Vergleich)

Das nachfolgende Beispiel ist ein Versuch zur Herstellung von Azlacton-funktionellen Kügelchen nach den Lehren der US-P-4 070 348. Die Reaktion wurde unter Verwendung der gleichen Bestandteile und gleicher Mengen wie in Beispiel 25 der US-P-4 070 348 mit der Ausnahme ausgeführt, daß VDM für Glycidylacrylat ersetzt wurde. Wiederum setzte sich innerhalb von 2 Minuten nach dem Start der Reaktion eine vernetzte Polymermasse ab. Es wurden keine Kügelchen festgestellt.
Für den Fachmann sind zahlreiche Modifikationen und Änderungen an der vorliegenden Erfindung offensichtlich, ohne vom Erfindungsgedanken und Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen, wobei davon ausgegangen wird, daß die vorliegende Erfindung durch die hierin ausgeführten veranschaulichenden Ausführungsformen nicht unzulässig beschränkt wird.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen von Azlacton-funktionellem Träger, umfassend die Schritte eines der Prozesse II, III oder IV:

Prozeß II

(a) Polymerisieren einer wässrigen Suspension mit Hilfe einer Methode der Umkehrphasen-Suspensionspolymerisation, welche Suspension aufweist:

(i) 0 ... 89 Teile mindestens eines durch radikalische Additionspolymerisation polymerisierbaren wasserlöslichen Monomers,

(ii) 1 ... 99,9 Molanteile mindestens eines Alkenylazlactons und

(iii) 0,1 ... 99 Molanteile mindestens eines hydrophilen vernetzenden Monomers; sowie

(b) Isolieren der resultierenden Azlacton-funktionellen polymeren Trägerpartikel;

Prozeß III

(a) Schaffen einer homogenen Mischung, umfassend Lösemittel und:

(i) 1 ... 100 Molanteile mindestens eines Alkenylazlactons,

(ii) 0 ... 99 Molanteile mindestens eines vernetzenden Monomers und

(iii) 0 ... 99 Molanteile mindestens eines Comonomers;

(b) Polymerisieren dieser Mischung mit Hilfe einer Methode der Dispersionspolymerisation, um polymere Trägerpartikel zu schaffen; und

(c) Isolieren der resultierenden Azlacton-funktionellen polymeren Trägerpartikel,

Prozeß IV

(a) Schaffen einer Lösung, umfassend ein Azlactonfunktionelles Polymer mit Einheiten der Formel:

worin sind:

R¹ Wasserstoff oder CH&sub3;

R² und R³ jedes unabhängig eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 14 Kohlenstoff-Atomen, eine Cycloalkyl-Gruppe mit 3 bis 14 Kohlenstoff-Atomen, eine Aryl-Gruppe mit 5 bis 12 Ring-Atomen, eine Arenyl-Gruppe mit 6 bis 26 Kohlenstoff-Atomen und Null bis 3 S-, N- und nichtperoxidischen O-Heteroatomen; oder R² und R³ können zusammengenommen mit dem Kohlenstoff-Atom, mit dem sie verbunden sind, einen carbocyclischen Ring bilden, der 4 bis 12 Ring- Atome enthält; sowie

n eine ganze Zahl Null oder 1,

(b) Auftragen der Lösung mit dem Azlacton-funktionellen Polymer auf ein festes Substrat, um einen Azlactonfunktionellen polymeren Träger zu schaffen; und

(c) wahlweise Umsetzen des Azlacton-funktionellen Trägers mit einem funktionellen Material, das mit dem Azlacton in einer wässrigen Ringöffnungsreaktion reagieren kann, wobei diese Reaktion wahlweise in wässriger Lösung stattfinden kann; sowie

(d) wahlweise Isolieren des resultierenden polymeren Trägers oder Addukt-Trägers.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das funktionelle Material ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Adsorbentien, biologisch aktiven Substanzen, Katalysatoren, Reagentien und Farbstoffen.

3. Hydrophiler, Azlacton-funktioneller polymerer Träger, hergestellt nach Anspruch 1 oder 2.

4. Azlacton-funktioneller Träger näch Anspruch 3 mit Einheiten der Formel:

worin R¹, R², R³ und n wie in Anspruch 1 festgelegt sind.

5. Azlacton-funktioneller Träger nach Anspruch 3 oder 4, der vernetzt ist.

6. Azlacton-funktioneller Träger nach einem der Ansprüche 3 bis 5 in Form eines Kügelchens, einer Membran, Folie oder Beschichtung auf einem Substrat.

7. Addukt-Träger, hergestellt nach Anspruch 1 oder 2, der Einheiten der Formel aufweist:

worin sind:

R¹, R², R³ und n wie in Anspruch 1 festgelegt,

X -O-, -S-, - H- oder - R&sup4;, worin R&sup4; Alkyl oder Aryl ist, sowie

G der Rest HXG, der die Funktion des Adsobierens, Komplexierens, Katalysierens, Separierens oder des Reagierens der Addukt-Träger übernimmt,

wobei der Träger ein Kügelchen, eine Membran, eine Folie oder eine Beschichtung auf einem Substrat ist.

8. Addukt-Träger nach Anspruch 7, wobei HXG ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Adsorbentien, biologisch aktiven Substanzen, Katalysatoren, Reagentien und Farbstoffen.

9. Addukt-Träger nach Anspruch 7 oder 8, der ein Kügelchen, eine Membran, eine Folie oder eine Beschichtung auf einem Substrat ist.

10. Addukt-Träger nach einem der Ansprüche 7 bis 9, der ein Komplexbildner, einchromatographischer Träger, ein Katalysator, ein polymeres Reagens oder ein Adsorbens ist.