DE60026584T2

DE60026584T2 - Microbielles wirkstoffabgabesystem

Info

Publication number: DE60026584T2
Application number: DE60026584T
Authority: DE
Inventors: Michael Woodbridge CAPLAN
Original assignee: Seer Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Allertein Therapeutics Fairfield Conn Us LLC
Priority date: 2000-04-06
Filing date: 2000-12-06
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2020-12-07
Also published as: US20040208894A1; US20110027298A1; DE60026584D1; EP1272213A2; US20130243814A1; CA2403292A1; WO2001066136A3; ATE319475T1; DK1272213T3; CY1105216T1; CA2403292C; US20030035810A1; US8153414B2; AU2001219510B2; US20040234548A1; JP2012207032A; JP2009242427A; JP2004527450A; EP1272213B1; ES2260078T3

Description

Prioritätsinformation
Die vorliegende Anmeldung beansprucht Priorität unter 35 U.S.C. 119(e) für die vorläufige U.S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 60/195,035 und dem Titel „Bacterial Polypeptide Delivery", die am 06. März 2000 eingereicht wurde.
Verwandte Anmeldungen
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen den Bereich der kontrollierten Bereitstellung von Antigenen zur Verwendung bei Impfung oder Induzierung von Toleranz gegen Allergene und insbesondere betrifft sie die zelluläre Bereitstellung von Proteinen und Polypeptiden. Diese Anmeldung ist verwandt mit U.S.S.N. 60/169,330 mit dem Titel „Controlled Delivery of Antigens", die am 06. Dez. 1999 eingereicht wurde; U.S.S.N. 09/141,220 mit dem Titel „Methods and Reagents for Decreasing Clinical Reaction to Allergy", die am 27. Aug. 1998 eingereicht wurde; U.S.S.N. 09/455,294 mit dem Titel "Peptide Antigens", die am 06. Dezember 1999 eingereicht wurde; U.S.S.N. 09/494,096, die am 28. Januar 2000 eingereicht wurde, mit dem Titel „Methods and Reagents for Decreasing Clinical Reaction to Allergy" von Bannon et al.; und U.S.S.N. 09/527,083 mit dem Titel "Immunostimulatory Nucleic Acids and Antigens" von Caplan, die am 16. März 2000 eingereicht wurde.
Hintergrund der Erfindung
Allergische Reaktionen werfen weltweit schwerwiegende öffentliche Gesundheitsprobleme auf. Pollenallergie alleine (allergische Rhinitis oder Heuschnupfen) betrifft etwa 10 bis 15% der Bevölkerung und verursacht sehr große wirtschaftliche Kosten. Zum Beispiel schätzen Berichte, dass Pollenallergie 1990 1,8 Milliarden $ an direkten und indirekten Kosten in den Vereinigten Staaten verursacht hat (Fact Sheet, National Institute of Allergy and Infectious Diseases; McMenamin, Annals of Allergy 73: 35, 1994). Asthma, das durch Einwirken von Antigenen ausgelöst werden kann, ist auch ein schwerwiegendes öffentliches Gesundheitsproblem und wie anaphylaktische allergische Reaktionen kann es in extremen Fällen zum Tod führen. Asthma ist momentan für Millionen von Aufenthalten in Krankenhäusern pro Jahr verantwortlich und seine Häufigkeit steigt. Die einzige Behandlung, die momentan verfügbar ist, ist für eine Linderung der Symptome, zum Beispiel zur Erleichterung der Konstriktion der Atemwege. Schwerwiegender als die wirtschaftlichen Kosten, die mit Pollen und anderen inhalierten Allergenen (z.B. Schimmelpilzen, Staubmilben, Tierhautschuppen) in Zusammenhang stehen, ist das Risiko einer anaphylaktischen allergischen Reaktion, die bei Allergenen wie Nahrungsmittelallergenen, Insektengiften, Arzneistoffen und Latex beobachtet wird.
Allergische Reaktionen resultieren, wenn das Immunsystem eines Individuums auf ein auftretendes Antigen überreagiert oder unangemessen reagiert: Typischerweise tritt keine allergische Reaktion auf, wenn ein Individuum einem besonderen Antigen das erste Mal ausgesetzt ist. Jedoch ist es die anfängliche Reaktion auf ein Antigen, welche das System für darauf folgende allergische Reaktionen vorbereitet. Insbesondere wird das Antigen von Antigen-präsentierenden Zellen (APC; z.B. Makrophagen und dendritischen Zellen) aufgenommen, die das Antigen abbauen und dann Antigenfragmente für T-Zellen bereitstellen. T-Zellen, insbesondere CD4⁺ „Helfer" T-Zellen, reagieren durch eine Sekretion einer Reihe von Zytokinen, die Wirkungen auf andere Immunsystemzellen haben. Das Profil der Zytokine, die durch reagierende CD4⁺ T-Zellen sekretiert werden, bestimmt, ob darauf folgende Einwirkungen des Antigens allergische Reaktionen induzieren werden. Zwei Klassen von CD4⁺ T-Zellen (Th1 und Th2) beeinflussen den Typ der Immunreaktion, die gegen ein Antigen aufgeboten wird.
Th2-Zellen können eine Vielzahl von Zytokinen und Interleukinen, einschließlich IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13, sekretieren. Eine Wirkung von IL-4 ist die Stimulierung der Reifung von B-Zellen, die IgE-Antikörper produzieren, welche spezifisch für das Antigen sind. Allergische Reaktionen gegen Allergene sind durch die Produktion von Antigen-spezifischen IgE-Antikörpern charakterisiert, die von der Hilfe von IL-4-sekretierenden CD4⁺ T-Zellen abhängig sind. Diese Antigen-spezifischen IgE-Antikörper binden an Rezeptoren auf der Oberfläche von Mastzellen, Basophilen und Eosinophilen, wo sie als ein Auslöser zur Initiierung einer schnellen allergischen Reaktion über das nächste Einwirken des Antigens wirken. Wenn bei dem Individuum das Antigen ein zweites Mal auftritt, wird das Antigen schnell durch diese Oberflächen-assoziierten IgE-Moleküle gebunden. Jedes Antigen hat typischerweise mehr als eine IgE-Bindungsstelle, so dass die Oberflächen-gebundenen IgE-Moleküle durch ihre gleichzeitigen (direkten oder indirekten) Assoziationen mit dem Antigen schnell miteinander vernetzt werden. Eine solche Vernetzung induziert eine Mastzellendegranulation, was in der Freisetzung von Histaminen und anderen Substanzen resultiert, die allergische Reaktionen auslösen. Es ist bekannt, dass Individuen mit hohen Levels an IgE-Antikörpern besonders zu Allergien neigen.
Momentane Behandlungen von Allergien beziehen Versuche zur „Impfung" eines empfindlichen Individuums gegen ein besonderes Allergen durch periodisches Injizieren oder Behandeln des Individuums mit einer Rohsuspension des Rohallergens ein. Das Ziel ist, durch kontrollierte Verabreichung von bekannten Mengen eines Antigens die IgE-Reaktion, die in dem Individuum aufgeboten wird, zu modulieren. Wenn die Therapie erfolgreich ist, wird die IgE-Reaktion des Individuums vermindert und kann sogar verschwinden. Jedoch erfordert die Therapie mehrere Impfzyklen über einen ausgedehnten Zeitraum (3 bis 5 Jahre) und bringt sehr häufig nicht die gewünschten Ergebnisse. Darüber hinaus leiden bestimmte Individuen unter anaphylaktischen Reaktionen gegen die Impfstoffe, trotz ihrer beabsichtigten, kontrollierten Verabreichung.
Vrtala et al. (Int Arch Allergy Immunol 1995; 107; 290-294) beschreiben die Expression von rekombinanten Baumpollenallergenen (Bet v I und Bet v II) in nicht pathogenen Salmonella-Stämmen und die Immunisierung von Mäusen mit den resultierenden Allergenen.
Medaglini et al. (Proc Natl Acad Sci USA, Bd. 2, Seiten 6868-6872, Juli 1995) beschreiben Streptococcus gordonii-Stämme, die ein Fusionsprotein exprimieren, welches das Allergen Ag 5.2 von Hornissengift umfasst.
WO 99/25387 beschreibt die Verwendung von attenuierten Salmonella-Bakterien, die Allergene als Impfstoffe exprimieren.
US 5,389,368 beschreibt Impfstoffe, die lebende nicht-virulente Bakterien umfassen. Die Bakterien können ein heterologes Gen exprimieren, das ein Antigen von einem pathogenen Mikroorganismus codiert, und der resultierende Impfstoff kann eine Immunreaktion gegen das Pathogen induzieren.
WO 99/38978 beschreibt ein Verfahren zur Modifizierung von Allergenen, um sie durch Modifizieren der IgE-Bindungsstellen an den Allergenen weniger allergen zu machen.
WO 98/44096 beschreibt die Verwendung von Mycobacterium-Zellen als rekombinante Impfstoffe. Die Mycobacterium-Zellen können einen Vektor umfassen, der ein Gen enthält, welches ein Allergen codiert.
EP 0 080 806 beschreibt Impfstoffe, die einen nicht pathogenen Mikroorganismus umfassen, der ein Allergen produziert.
Mekalanos (Adv. Exp. Med. Biol., 1992, Bd. 327, Seiten 43-50) beschreibt verschiedene Typen von bakteriellen Impfstoffen.
Hansen et al. (J. Immunol, 2000, Bd. 164, Seiten 223-230) beschreiben die Verwendung von Listeria als ein Adjuvans bei Immuntherapie.
WO 96/14876 beschreibt die Verwendung von Hefen als Bereitstellungsvehikel für heterologe Verbindungen, die verwendet werden können, um die Immunreaktion eines Organismus zu modulieren.
Eko et al. (Vaccine 1999, Bd. 17, Seiten 1643-1649) beschreiben die Verwendung von bakteriellen Ghosts als Träger für Antigene.
Eindeutig besteht ein Bedarf für Behandlungen und vorbeugende Verfahren für Patienten mit Allergien gegen Allergene, die schwerwiegende allergische Reaktionen, einschließlich anaphylaktischen Schock, hervorrufen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zur Modulierung der Immunreaktion in einem Subjekt bereit. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von unerwünschten allergischen Reaktionen und anaphylaktischen allergischen Reaktionen gegen Allergene in einem Subjekt. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind zur Verabreichung an Subjekte, Mikroorganismen, die Allergene von Interesse exprimieren oder produzieren, nützlich. Ohne auf den vorgeschlagenen Wirkmechanismus eingeschränkt zu sein, werden nach der Verabreichung die Mikroorganismen durch Antigen-präsentierende Zellen in dem Subjekt aufgenommen, wo die exprimierten Antigene freigesetzt werden. Nachdem sie in den Antigen-präsentierenden Zellen verarbeitet und auf der Zelloberfläche bereitgestellt worden sind, aktivieren die verarbeiteten Antigene die T-Zellen-vermittelten Immunreaktionen. Deshalb reduzierte die Verwendung von genetisch modifizierten Mikroorganismen zur Exprimierung und Bereitstellung von Allergenen bei einem Subjekt das Einwirken der Allgene auf die IgE-Antikörper des Subjekts, was zu allergischen Reaktionen und möglicherweise anaphylaktischem Schock führt. Die vorliegende Erfindung reduziert deshalb das Risiko von anaphylaktischem Schock während einer Immuntherapie. Darüber hinaus können die Mikroorganismen als ein natürliches Adjuvans zur Steigerung von gewünschten Immunreaktionen vom Th1-Typ wirken.
Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die Erfindung eine pharmazeutisch Zusammensetzung bereit, die tote E. coli Mikroorganismen umfasst, die ein Protein als Allergen produziert haben, und des Weiteren einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, worin die pharmazeutische Zusammensetzung die allergischen Immunreaktionen in Subjekten reduziert, die gegen das Protein als Allergen allergisch sind, worin das Protein als Allergen in den Mikroorganismen verkapselt ist und worin die Mikroorganismen unter Verwendung von Hitze oder Chemikalien getötet worden sind.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform schließt die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend tote E. coli Mikroorganismen, die ein Protein als Allergen produziert haben, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Allergie in einem Subjekt, das für das Protein als Allergen empfänglich ist, ein, worin das Protein als Allergen in den Mikroorganismen verkapselt ist und worin die Mikroorganismen unter Verwendung von Hitze oder Chemikalien getötet worden sind.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die tote E. coli Mikroorganismen umfasst, die ein Protein als Allergen produziert haben, und des Weiteren einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, worin das Protein als Allergen so modifiziert ist, dass es eine reduzierte Fähigkeit aufweist, IgE-Antikörper zu binden oder zu vernetzen, worin das Protein als Allergen in den Mikroorganismen verkapselt ist und worin die Mikroorganismen unter Verwendung von Hitze oder Chemikalien getötet worden sind.
Die Erfindung schließt auch die Verwendung einer Zusammensetzung, die tote E. coli Mikroorganismen umfasst, die ein Protein als Allergen produzieren oder produziert haben, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Allergie in einem Subjekt, das für das Protein als Allergen empfänglich ist, ein, worin das Protein als Allergen so modifiziert ist, dass es eine reduzierte Fähigkeit aufweist, IgE-Antikörper zu binden oder zu vernetzen, worin das Protein als Allergen in den Mikroorganismen verkapselt ist und worin die Mikroorganismen unter Verwendung von Hitze oder Chemikalien getötet worden sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Mikroorganismen genetisch modifiziert, damit sie ausgewählte Polypeptide oder Proteine exprimieren, und sie werden als Bereitstellungsvehikel gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Solche Mikroorganismen sind Bakterien, nämlich E. coli.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Bakterien als Mikroorganismen zur Exprimierung und Bereitstellung von allergenen Proteinen bei Individuen verwendet, um allergische Reaktionen, einschließlich anaphylaktische allergische Reaktionen, gegen die Allergene zu behandeln oder diesen vorzubeugen. Wie hier beschrieben, können in der vorliegenden Erfindung Gram-negative Bakterien als Bereitstellungsvehikel verwendet werden. Durch die Bakterien exprimierte Antigene können sekretiert oder nicht sekretiert werden. Eine Sekretion von Proteinen kann eine Sekretion in das Zellmedium einbeziehen. Für Gram-negative Bakterien kann eine Sekretion eine Sekretion in das Periplasma einbeziehen. Eine Sekretion von Polypeptiden kann durch Sekretionssignalpeptide ermöglicht werden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen können Mikroorganismen, die allergene Verbindungen exprimieren, an Subjekte in Zusammensetzungen als attenuierte Mikroorganismen, nicht pathogene Mikroorganismen, nicht infektiöse Mikroorganismen oder als getötete Mikroorganismen verabreicht werden. Bevorzugt werden die getöteten Mikroorganismen getötet, ohne die Antigeneigenschaften der Polypeptide zu verschlechtern.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die verwendeten Allergene Allergene, die in Nahrungsmitteln, Gift, Arzneistoffen und auf einem Gummi basierenden Produkten gefunden werden. Besonders bevorzugte Proteine als Allergene werden in Nahrungsmitteln und Giften gefunden, die anaphylaktische allergische Reaktionen in Subjekten, die gegen die Allergene allergisch sind, hervorrufen. In der vorliegenden Erfindung sind Peptide und Polypeptide eingeschlossen, deren Aminosäuresequenzen in den Proteinen als Allergene in der Natur gefunden werden. Auch in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind Allergene, die Modifizierungen aufweisen, die die Fähigkeit der Peptide, Polypeptide und Proteine,
IgE-Antikörper zu binden und zu vernetzen, reduzieren. Auch in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind Nichtpeptid-Allergene, die durch Mikroorganismen produziert werden, und sie schließen zum Beispiel Antibiotika wie Penicillin ein.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfassen Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung von allergischen und anaphylaktischen allergischen Reaktionen in einem Subjekt Mikroorganismen, die durch Menschenhand technologisch gestaltet wurden und bevorzugt durch die Einbringung von einer oder mehreren eingebrachten Nukleinsäuren, um Allergene gemäß der vorliegenden Erfindung zu produzieren. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen sind die produzierten Allergene Peptide, Polypeptide oder Proteine, die durch die eingebrachten Nukleinsäuren codiert werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1. Experimente, die zur Bestimmung der optimalen Temperatur zum Töten von Bakterien (E. coli) durch Hitze gestaltet wurden, sind in graphischer Form gezeigt. Die Anzahl der überlebenden Kolonien in Aliquoten von Proben ist als eine Funktion der Temperatur (Celsius) gezeigt.
2. Bestimmung des pro Zelle produzierten Proteins. Die optische Dichte (O.D.) des HIS-markierten Ara h 2-Allergens wurde aus einem Immunoblot bestimmt, wobei unterschiedliche Konzentrationen des E. coli Extrakts an SDS-PAGE-Gelen elektrophoretisiert worden waren. Die O.D. des Allergens wurde zur Abschätzung der Menge des Proteins, das durch diesen Extrakt produziert wurde, verwendet.
3. Ergebnisse der ELISA-Analyse von Ara h 2-spezifischen IgG-Antikörpern, die in Mäusen nach einer Injektion von Ara h 2-produzierenden E. coli produziert wurden. IgG1 ist auf der linken Seite und IgG2a ist auf der rechten Seite.
4. Ergebnisse der ELISA-Analyse von Ara h 3-spezifischen IgG-Antikörpern, die in Mäusen nach einer Injektion von Ara h 3-produzierenden E. coli produziert wurden. IgG1 ist auf der linken Seite und IgG2a ist auf der rechten Seite.
Definitionen
„Allergen": Ein „Allergen" ist ein Antigen, das (i) eine IgE-Reaktion in einem Individuum hervorruft; und/oder (ii) eine asthmatische Reaktion (z.B. chronische Atemwegsentzündung, die durch Eosinophilie, Atemwegshyperreaktivität und überschüssige Schleimproduktion gekennzeichnet ist) hervorruft, gleichgültig, ob eine solche Reaktion eine nachweisbare IgE-Reaktion einschließt oder nicht. Bevorzugte Allergene für den Zweck der vorliegenden Erfindung sind Peptide, Polypeptide und Proteine als Allergene. Eine beispielhafte Auflistung von Proteinen als Allergene wird als ein Anhang bereitgestellt. Diese Auflistung wurde von ftp://biobase.dk/pub/who-iuis/alleregen.list (überarbeitet am 01. März 2000), worin Auflistungen von bekannten Allergenen bereitgestellt werden, übernommen. Andere bevorzugte Allergene sind chemische Verbindungen wie kleine Moleküle, die durch Proteine produziert werden.
„Allergische Reaktion": Eine allergische Reaktion ist eine klinische Reaktion von einem Individuum gegen ein Antigen. Symptome von allergischen Reaktionen können kutane (z.B. Urtikaria, angioneurotisches Ödem, Pruritus), Atemwegs- (z.B. Keuchen, Husten, Larynxödem, Rhinorrhoe, tränende/juckende Augen), gastrointestinale (z.B. Erbrechen, Abdominalschmerz, Diarrhoe) und/oder kardiovaskuläre (wenn eine systemische Reaktion stattfindet) Systeme beeinflussen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird eine asthmatische Reaktion als eine Form von allergischer Reaktion angesehen.
„Anaphylaktisches Antigen": Ein „anaphylaktisches Antigen" gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Antigen (oder Allergen), von welchem bekannt ist, dass es ein Risiko von anaphylaktischer Reaktion in allergischen Individuen darstellt, wenn es in seinem natürlichen Zustand unter natürlichen Bedingungen auftritt. Zum Beispiel nimmt man nicht an, dass für die Zwecke der vorliegenden Erfindung Pollen und Tierhautschuppen oder -ausscheidungen (z.B. Speichel, Urin) anaphylaktische Antigene sind. Auf der anderen Seite nimmt man im Allgemeinen an, dass Nahrungsmittelantigene, Insektenantigene, Arzneistoffe und Gummi (z.B. Latex)-Antigene anaphylaktische Antigene sind. Nahrungsmittelantigene sind besonders bevorzugte anaphylaktische Antigene zur Verwendung in der Praxis der vorliegenden Erfindung. Besonders interessante anaphylaktische Antigene sind jene (z.B. Nüsse, Samen und Fisch), auf welche die Reaktionen im Allgemeinen so schwerwiegend sind, dass sie ein Todesrisiko verursachen.
„Anaphylaktischer Schock" oder „anaphylaktische Reaktion", wie hier verwendet, betreffen eine Immunreaktion, die durch Mastzellendegranulation charakterisiert ist, sekundär zum Antigen-induzierten Vernetzen des IgE-Rezeptors mit hoher Affinität auf Mastzellen und Basophilen mit darauf folgender Mediatorfreisetzung und der Produktion von pathologischen Reaktionen in Zielorganen, z.B. Atemwege, Haut, Verdauungstrakt und kardiovaskulärem System. Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, kann die Schwere einer anaphylaktischen Reaktion zum Beispiel durch Testen der kutanen Reaktionen, der Schwellung um die Augen und den Mund und/oder Diarrhoe, gefolgt von Atemwegsreaktionen wie Keuchen und Atemnot beobachtet werden. Die schwerwiegendsten anaphylaktischen Reaktionen können in einem Verlust des Bewusstseins und/oder Tod resultieren.
„Antigen": Ein „Antigen" ist (i) jedwede Verbindung oder Zusammensetzung, die eine Immunreaktion hervorruft; und/oder (ii) jedwede Verbindung, die an einen T-Zellen-Rezeptor (z.B. wenn durch ein MHC-Molekül präsentiert) oder einen Antikörper, der durch eine B-Zelle produziert wurde, bindet. Der Fachmann wird erkennen, dass ein Antigen eine Ansammlung von unterschiedlichen chemischen Verbindungen (z.B. ein Rohextrakt oder eine Zubereitung) oder eine einzelne Verbindung (z.B. ein Protein) sein kann. Bevorzugte Antigene sind Peptide, Polypeptide oder Proteine als Antigene.
„Antigen-präsentierende Zellen": „Antigen-präsentierende Zellen" oder „APCs" schließen bekannte APCs wie Langerhans-Zellen, Schleierzellen von afferenten Lymphgefäßen, dendritische Zellen und interdigitierende Zellen von lymphatischen Organen ein. Der Ausdruck schließt auch mononukleäre Zellen wie Lymphozyten und Makrophagen ein, die Polypeptide und Proteine gemäß der Erfindung aufnehmen.
„Attenuierung": „Attenuierung" von Mikroorganismen, wie hier verwendet, betrifft die Manipulation der Mikroorganismen, so dass die Mikroorganismen keine wesentlichen toxischen Reaktionen in Individuen oder Labortesttieren induzieren. Die Manipulationen schließen genetische Verfahren ein und sind auf dem Fachgebiet bekannt.
„IgE-Bindungsstelle": Eine IgE-Bindungstelle ist ein Bereich eines Antigens, der durch ein anti-Antigen-IgE-Molekül erkannt wird. Ein solcher Bereich ist notwendig und/oder ausreichend, um in (i) Binden des Antigens an IgE; (ii) Vernetzen des anti-Antigen-IgE; (iii) Degranulation von Mastzellen, die Oberflächen-gebundenes anti-Antigen-IgE enthalten; und/oder (iv) Entwicklung von allergischen Symptomen (z.B. Histaminfreisetzung) zu resultieren. Im Allgemeinen werden IgE-Bindungsstellen für ein besonderes Antigen oder Antigenfragment durch Einwirken des Antigens oder des Fragments auf Serum von allergischen Individuen (bevorzugt der Spezies, an welche erfindungsgemäße Zusammensetzungen verabreicht werden) definiert. Man wird erkennen, dass unterschiedliche Individuen IgE erzeugen können, das unterschiedliche Epitope am selben Antigen erkennt. Folglich ist es typischerweise wünschenswert, das Antigen oder das Fragment einem repräsentativen Pool von Serumproben auszusetzen. Wo es zum Beispiel gewünscht ist, dass Stellen, die durch IgE des Menschen erkannt werden, in einem gegebenen Antigen oder Fragment identifiziert werden, wird Serum bevorzugt von mindestens 5 bis 10, bevorzugt mindestens 15, Individuen, die eine Allergie gegen das Antigen gezeigt haben, vereinigt. Der Fachmann kennt eine nützliche Strategie zur Vereinigung aus anderen Zusammenhängen.
„Immunität induzierende Mittel": Der Ausdruck „Immunität induzierende Mittel" wird hier für Mittel verwendet, die die Expression von Th1-stimulierenden Zytokinen durch T-Zellen veranlassen und Faktoren wie CD40, CD40-Ligand, Oligonucleotide, die CpG-Motive enthalten, TNF und mikrobielle Extrakte wie Zubereitungen von Staphylococcus aureus, durch Hitze getötete Listeria und modifiziertes Choleratoxin einschließen.
„Induzierbarer Promotor": Der Ausdruck „induzierbarer Promotor", wie hier verwendet, bedeutet eine Promotorstelle, die direkt durch die Gegenwart oder Abwesenheit eines chemischen Mittels oder indirekt durch einen Umweltstimulus wie Temperaturveränderungen aktiviert wird. Ein Promotor ist der Bereich der DNA, an welchem das Enzym RNA-Polymerase bindet und der den Vorgang der Gentranskription initiiert.
„Mastzelle": Wie aus dem Zusammenhang ersichtlich ist, wird der Ausdruck „Mastzelle" hier oft verwendet, um auf eine oder mehere Mastzellen, Basophile und andere Zellen mit IgE-Rezeptoren, die, wenn sie durch Vernetzen von gebundenen IgE-Molekülen aktiviert sind, Histamine, Vasodilatoren und/oder andere Mediatoren von allergischen Reaktionen freisetzen, Bezug zu nehmen.
„Mikroorganismen": „Mikroorganismen", wie hier verwendet, sind Zellen, Bakterien, Pilze, Viren, Algen und Protozoen. Bevorzugte Mikroorganismen können genetisch manipuliert werden, um ein gewünschtes Polypeptid(e) zu produzieren.
„Peptid": Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein „Peptid" einen Strang von mindestens drei Aminosäuren, die durch Peptidbindungen aneinander gebunden sind. Erfindungsgemäße Peptide enthalten bevorzugt nur natürliche Aminosäuren, obwohl nicht natürliche Aminosäuren (d.h. Verbindungen, die nicht in der Natur vorkommen, aber die in eine Polypeptidkette eingebracht werden können; siehe zum Beispiel http://www.cco.caltech.edu/~dadgrp/Unnatstruct.gif, welches Strukturen von nicht natürlichen Aminosäuren zeigt, die erfolgreich in funktionelle Ionenkanäle eingebracht wurden) und/oder Aminosäureanaloga, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, alternativ verwendet werden können. Auch können eine oder mehrere der Aminosäuren in einem erfindungsgemäßen Peptid modifiziert werden, zum Beispiel durch das Hinzufügen einer chemischen Einheit wie eines Kohlenwasserstoffrests, einer Phosphatgruppe, einer Farnesylgruppe, einer Isofarnesylgruppe, eines Fettsäurerests, eines Linkers für Konjugation, Funktionalisierung oder einer anderen Modifizierung, usw.
Ein Peptid oder Polypeptid ist von einem Protein abgeleitet, wenn die Aminosäuresequenz des Peptids oder Polypeptids in der Aminosäuresequenz des Proteins gefunden wird. Die Sequenzen sind bevorzugt identisch, können aber eine Sequenzhomologie zwischen ungefähr 80 bis 100% aufweisen. Man erkennt auch, dass Aminosäurereste mit anderen Aminosäureresten mit ähnlichen physikalischen Eigenschaften wie Hydrophobie, Hydrophilie, Ladung, aromatischen Strukturen und Polarität ersetzt werden können.
„Reduzierte IgE-Bindung": Man nimmt an, dass eine erfindungsgemäße Zusammensetzung oder Antigen eine „reduzierte IgE-Bindung" aufweist, wenn sie (es) einen niedrigeren Level von Wechselwirkung mit IgE zeigt, wenn mit unmodifiziertem Antigen in jedwedem verfügbarem Test verglichen wird. Zum Beispiel nimmt man an, dass ein modifiziertes Antigen eine reduzierte IgE-Bindung aufweist, wenn (i) seine Affinität für anti-Antigen-IgE (getestet zum Beispiel unter Verwendung von direkten Bindungsstudien oder indirekten Konkurrenzstudien) um mindestens etwa zwei- bis fünffach, bevorzugt mindestens etwa zehn-, zwanzig-, fünfzig- oder hundertfach im Vergleich zum intakten Antigen reduziert ist; (ii) die Fähigkeit des modifizierten Antigens zur Unterstützung des Vernetzens des anti-Antigen-IgE um mindestens etwa zweifach, bevorzugt mindestens etwa fünf-, zehn-, zwanzig-, fünfzig- oder hundertfach im Vergleich zum intakten Antigen reduziert ist; (iii) Mastzellen, die Oberflächen-gebundenes anti-Antigen-IgE enthalten, weniger degranulieren (mindestens etwa zweifach, bevorzugt mindestens etwa drei-, fünf-, zehn-, zwanzig-, fünfzig- oder hundertfach weniger), wenn sie mit dem modifizierten im Vergleich zum unmodifizierten Antigen in Kontakt gebracht werden; und/oder (iv) Individuen, die mit dem modifizierten Antigen in Kontakt gebracht wurden, weniger (mindestens etwa zweifach, bevorzugt mindestens etwa drei-, fünf-, zehn-, zwanzig-, fünfzig- oder hundertfach weniger) allergische Symptome entwickeln oder entwickelte Symptome in der Intensität reduziert sind, wenn sie modifizierten Antigenen im Vergleich zu unmodifizierten Antigenen ausgesetzt werden.
„Sekretionssignale": Ein Sekretionssignal ist jedwede Aminosäuresequenz, die, wenn sie an ein Peptid, Polypeptid oder Protein konjugiert ist, den Transport der Konjugatfusionsproteine durch Zellmembrane ermöglicht. Für Verwendungen von Sekretionssignalen in Mikroorganismen bezieht der Transport von Fusionsproteinen das Durchqueren einer inneren Membran in das Periplasma ein. Es ist bevorzugt, dass Sekretionssignale auch den Transport von Fusionsproteinen durch eine äußere Membran in ein extrazelluläres Medium ermöglichen. Die Sekretion von Proteinen in das extrazelluläre Medium wird als „Ausscheidung" betrachtet.
„Empfindlich gemachte Mastzelle": Eine „empfindlich gemachte" Mastzelle ist eine Mastzelle, die Oberflächen-gebundene Antigen-spezifische IgE-Moleküle aufweist. Der Ausdruck ist notwendigerweise Antigen-spezifisch. Das heißt, zu jeder gegebenen Zeit wird eine besondere Mastzelle für bestimmte Antigene (jene, die durch das IgE auf ihrer Oberfläche erkannt werden) „empfindlich gemacht", wobei sie aber nicht für andere Antigene empfindlich gemacht wird.
„Kleine Moleküle": Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „kleines Molekül" eine Verbindung, die entweder im Labor synthetisiert oder in der Natur gefunden wird. Typischerweise ist ein kleines Molekül organisch und ist dadurch charakterisiert, dass es mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen enthält und ein Molekulargewicht von weniger als 1500 Dalton aufweist, obwohl nicht beabsichtigt ist, mit dieser Charakterisierung für die Zwecke der vorliegenden Erfindung einschränkend zu sein. Beispiele von „kleinen Molekülen", die Allergene sind, schließen ohne Einschränkung Penicillin, Alkohole und Aspirin ein. Nicht organische kleine Moleküle als Allergene schließen zum Beispiel in Wein vorhandene Sulfite ein.
„Empfängliches Individuum": Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Person für eine allergische Reaktion empfänglich, wenn (i) diese Person jemals Symptome einer Allergie nach dem Einwirken eines gegebenen Antigens gezeigt hat; (ii) Mitglieder der genetischen Familie dieser Person Symptome einer Allergie gegen das Allergen gezeigt haben, insbesondere wenn bekannt ist, dass die Allergie eine genetische Komponente aufweist; und/oder (iii) Antigen-spezifisches IgE in dem Individuum gefunden wird, entweder im Serum oder an Mastzellen.
„Th1-Reaktion" und „Th2-Reaktion": Bestimmte bevorzugte Peptide, Polypeptide, Proteine und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind durch ihre Fähigkeit charakterisiert, eine Th2-Reaktion zu supprimieren und/oder eine Th1-Reaktion zu stimulieren, vorzugsweise im Vergleich zu ihrer Fähigkeit, eine Th2-Reaktion zu stimulieren. Th1- und Th2-Reaktionen sind gut etablierte alternative Immunsystemreaktionen, die durch die Produktion von unterschiedlichen Reihen von Zytokinen und/oder Cofaktoren charakterisiert sind. Zum Beispiel stehen Th1-Reaktionen im Allgemeinen mit der Produktion von Zytokinen wie IL-1β, IL-2, IL-12, IL-18, IFNα, IFNγ, TNFβ, usw. in Zusammenhang; Th2-Reaktionen stehen im Allgemeinen mit der Produktion von Zytokinen wie IL-4, IL-5, IL-10, usw. in Zusammenhang. Das Ausmaß der T-Zellenuntermenge-Suppression oder -Stimulierung kann durch jedwede verfügbaren Mittel bestimmt werden, einschließlich zum Beispiel der Bestimmung von Intrazytoplasmazytokin. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird die Th2-Suppression getestet, zum Beispiel durch die Quantifizierung von IL-4, IL-5 und/oder IL-13 im stimulierten T-Zellen-Kulturüberstand oder durch die Abschätzung des intrazytoplasmatischen IL-4, IL-5 und/oder IL-13 der T-Zellen (z.B. durch Proteinanfärbung oder Analyse von mRNA); die Th1-Stimulierung wird zum Beispiel durch die Quantifizierung von IFNα, IFNγ, IL-2, IL-12 und/oder IL-18 im aktivierten T-Zellen-Kulturüberstand oder durch die Abschätzung der Intrazytoplasmalevels dieser Zytokine getestet.
Beschreibung von bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zur Modulierung der Immunreaktion in einem Subjekt bereit. Es ist eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, dass unerwünschte allergische Immunreaktionen gegen Antigene in einem Subjekt durch Verabreichen von modifizierten Zellen, Virionen oder Sporen („Mikroorganismen"), die Allergene von Interesse exprimieren, behandelt werden oder diesen so vorgebeugt wird. Durch die Verwendung von genetisch modifizierten Mikroorganismen zur Expression und Bereitstellung von Allergenen wird die Einwirkung der Allergene auf die IgE-vermittelte allergische Immunreaktion des Subjekts reduziert oder eliminiert. Ohne Einschränkung auf die vorgeschlagenen Mechanismen wird erwartet, dass die modifizierten Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung in Antigen-präsentierende Zellen (APCs) wie Makrophagen und dendritische Zellen ohne Einwirken von Allergenen auf IgE-Antikörper penetrieren. Wenn sie in den APCs sind, werden die exprimierten Allergene durch Lyse der Mikroorganismen oder durch Sekretion des Antigens durch die Mikroorganismen freigesetzt. Die Allergene werden dann verarbeitet, zum Beispiel durch teilweises Verdauen durch die APCs, und auf der Zelloberfläche bereitgestellt.
Nachdem die verarbeiteten Antigene auf der Zelloberfläche bereitgestellt sind, fördert die Aktivierung der zytotoxischen T-Zellen-Reaktion und der Helfer T-Zellen-Reaktion die zelluläre Immunreaktion und die Th1-vermittelte B-Zellen-Reaktion gegen die Proteine als Allergene. Zusätzlich weisen die verarbeiteten Antigene eine reduzierte Fähigkeit (oder keine Fähigkeit) zum Binden oder Vernetzen von IgE-Antikörpern, die auf der Oberfläche von Mastzellen und Basophilen lokalisiert sind, was zur Freisetzung von Histaminen und anderen Vasodilatoren führt, die für allergische und manchmal fatale anaphylaktische Reaktionen verantwortlich sind, auf.
WIRTMIKROORGANISMEN
Jedweder Mikroorganismus, der zur Expression (z.B. durch Expression von Polypeptiden oder Proteinen als Allergene oder durch Expression von Polypeptiden oder Proteinen als Enzyme, die in die Synthese von kleinen Molekülen als Antigene einbezogen sind) von Allergenen in der Lage ist, kann als Bereitstellungsvehikel gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Mikroorganismen schließen Bakterien, Viren, Pilze (einschließlich Hefen), Algen und Protozoen ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Im Allgemeinen sind Mikroorganismen einzelne Zell-, einzelne Sporen- oder einzelne Virionorganismen. Zusätzlich sind innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung Zellen von multizellulären Organismen eingeschlossen, die modifiziert worden sind, damit sie ein Polypeptid von Interesse produzieren. Mikroorganismen, die genetisch manipuliert werden können, um ein gewünschtes Polypeptid zu produzieren, sind bevorzugt (Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley and Sons, Inc. 1999). Genetische Manipulation schließt Mutation des Wirtgenoms, Insertion von genetischem Material in das Wirtgenom, Deletion von genetischem Material des Wirtgenoms, Transformation des Wirts mit extrachromosomalem genetischem Material, Transformation mit linearen Plasmiden, Transformation mit Ringplasmiden, Insertion von genetischem Material in den Wirt (z.B. Injektion von mRNA), Insertion von Transposonen und chemische Modifizierung von genetischem Material ein. Verfahren zum Aufbauen von Nukleinsäuren (einschließlich einem exprimierbaren Gen) und Einbringen von solchen Nukleinsäuren in ein Expressionssystem zum Exprimieren des codierten Proteins sind auf dem Fachgebiet etabliert (siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Die Verwendung von Mikroorganismen wie Bakterien und Hefen für die Allergenbereitstellung gemäß der vorliegenden Erfindung bietet für eine Immuntherapie viele Vorteile gegenüber der Bereitstellung von Allergenen, die nicht in Mikroorganismen verkapselt sind. Im Allgemeinen ist es bekannt, dass Mikroorganismen, wie Bakterien, als ein Adjuvans wirken (für einen Überblick siehe zum Beispiel Freytag et al. Curr Top Microbiol Immunol 236: 215-36, 1999). Deshalb stellt die Verwendung von Mikroorganismen zur Bereitstellung von Allergenen bei Subjekten und APCs von Subjekten einen Schutz des Allergens vor IgE-vermittelten allergischen Reaktionen bereit und stellt auch eine Adjuvanswirkung bereit, die eine Immunreaktion vom Th1-Typ bei einem Individuum, das für allergische Reaktionen empfänglich ist, hervorruft. Zusätzlich reduziert oder eliminiert die Verwendung von nicht pathogenen, nicht infektiösen, attenuierten und/oder getöteten Mikroorganismen die Toxizität, die mit Allergenbereitstellungsvehikeln in Zusammenhang stehen kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Bakterien als Proteinbereitstellungsmikroorganismen verwendet. Im Allgemeinen werden Bakterien abhängig von der Struktur der Zellwände als Gram-negativ oder Gram-positiv klassifiziert. Der Fachmann ist in der Lage, Gram-negative und Gram-positive Bakterien zu identifizieren, die zur Expression von Proteinen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Nicht einschränkende Beispiele der Gattungen und Spezies von Gram-negativen Bakterien schließen Escherichia coli, Vibro cholera, Salmonella, Listeria, Legionella, Shigella, Yersenia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Plesiomonas, Aeromonas ein. Nicht einschränkende Beispiele der Gattungen und Spezies von Gram-positiven Bakterien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Bacillus subtilis, Sporolactobacillus, Clostridium, Arthrobacter, Micrococcus, Mycobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus und Lactococcus ein.
Gram-negative bakterielle Systeme zur Verwendung als Bereitstellungsvehikel sind bekannt und können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel ist E. coli ein gut untersuchtes Bakterium und Verfahren zur Proteinexpression in E. coli sind gut etabliert. Die meisten Stämme von E. coli weisen den Vorteil auf, dass sie nicht pathogen sind, da E. coli natürlich im Darm gefunden wird. Deshalb ist E. coli als ein Bereitstellungsvehikel in der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Zusätzlich verwenden Calderwood et al. (US Patent 5,747,028) Vibrio cholerae als ein Bereitstellungsvehikel zur Produktion von Antigenen zur Verwendung als ein lebender Impfstoff gegen infektiöse Organismen. Miller und Mekalanos (US Patent 5,731,196) verwenden Salmonella als Bereitstellungsvehikel zur Produktion von Antigenen zur Verwendung als ein lebender Impfstoff gegen infektiöse Organismen. Hess et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1458-1463, 1996) verwenden rekombinante attenuierte Salmonella, die entscheidende antigene Faktoren von Listeria als einen lebenden Impfstoff zum Schutz gegen Listeriose sekretieren. Donner et al. (WO 98/50067) verwenden attenuierte Salmonella typhimurium als einen Gram-negativen Wirt zur Sekretion von Polypeptiden zur Kontrolle der Fertilität und sie lehren auch, dass andere attenuierte Gram-negative Stämme, einschließlich Yersinia, zur Expression und Sekretion von solchen Polypeptiden verwendet werden können.
Gram-positive Bakterien wurden auch als Bereitstellungsvehikel für Proteine zur Modulierung einer Immunreaktion in einem Subjekt untersucht. WO 97/14806 beschreibt die Verwendung von Lactococcus zur Bereitstellung von Polypeptiden in einem Körper, um die Immunreaktion gegen die Polypeptide zu steigern. Jedoch lehrt WO 97/14806 nicht die Verwendung von Lactococcus zur Behandlung von Patienten mit Nahrungsmittelallergien und Giftallergien, die in einem anaphylaktischen Schock resultieren können.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Hefen als ein Proteinbereitstellungsmikroorganismus verwendet. Es ist bekannt, dass Hefen für eine genetische Manipulation zur Exprimierung eines Proteins oder von Proteinen nach Wahl verwendet werden können (Ausubel et al. vorstehend). Darüber hinaus sind die meisten Hefen im Allgemeinen nicht pathogen. Ohne Einschränkung auf diese Spezies sind zwei gut charakterisierte Spezies von Hefen die Knospungshefe Saccharomyces cerevisiae und die Spaltenhefe Schizosaccharomyces pombe. Darüber hinaus wurde die Verabreichung von Hefen, die Proteine als Antigene exprimieren, um eine Immunreaktion zu verändern, untersucht. Duke et al. (US Patent Nr. 5,830,463; „Duke") beschreiben die Verwendung von Hefen zur Expression von Proteinen nach der Verabreichung der Hefen an einen Säuger. Jedoch lehrt Duke nicht die Verwendung von Hefen zur Behandlung von Patienten mit Nahrungsmittelallergien und Giftallergien, die in anaphylaktischem Schock resultieren können.
Die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung können an ein Subjekt als lebende oder tote Mikroorganismen verabreicht werden. Wenn die Mikroorganismen als lebende Mikroorganismen verabreicht werden, sind sie bevorzugt nicht pathogene oder attenuierte pathogene Mikroorganismen. Für die Verwendungen der Erfindung, wobei lebende Mikroorganismen an Individuen verabreicht werden, sind die Mikroorganismen bevorzugt attenuiert und/oder werden in geeigneten Verkapselungsmaterialien und/oder als pharmazeutische Zusammensetzungen als Impfstoffe verabreicht, um die Immunreaktion des Individuums gegen den Mikroorganismus und/oder die allergenen Verbindungen zu erniedrigen. Im Allgemeinen bezieht eine Attenuierung genetisches Modifizieren der infektiösen pathogenen Mikroorganismen ein, um die Infektionsfähigkeit des Mikroorganismus zu reduzieren oder zu eliminieren. Bevorzugt wird der Mikroorganismus so attenuiert, dass ein Individuum, welches mit dem Mikroorganismus geimpft wurde, nicht an jedweden zytotoxischen Wirkungen durch die Gegenwart des Mikroorganismus leidet. Besonders bevorzugte attenuierte Mikroorganismen sind infektiöse intrazelluläre Pathogene, die durch Antigen-präsentierende Zellen in Individuen, welche dem Mikroorganismus ausgesetzt waren, eine Phagozytose durchlaufen haben. Beispiele der Mikroorganismen, die intrazelluläre Pathogene sind, schließen Salmonella, Mycobacterium, Leishmania, Legionella, Listeria und Shigella ein.
Die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung können nach dem Töten der Mikroorganismen an Subjekte verabreicht werden. Jedwedes Verfahren zum Töten der Mikroorganismen, das die Antigeneigenschaft der exprimierten Polypeptide nicht stark verändert, kann verwendet werden. Verfahren zum Töten eines Mikroorganismus schließen die Verwendung von Hitze, Antibiotika, Chemikalien wie Iod, Bleiche, Ozon und Alkohole, Radioaktivität (d.h. Bestrahlung), UV-Licht, Elektrizität und Druck ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Bevorzugte Verfahren zum Töten von Mikroorganismen sind reproduzierbar und töten mindestens 99% der Mikroorganismen. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Hitze von über 50 Grad Celsius über einen Zeitraum, was mehr als 99% der Zellen und bevorzugt 100% der Zellen tötet.
INDUZIERBARE SYSTEME
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Expression von Allergenen durch Mikroorganismen so reguliert, dass die Synthese in einer kontrollierten Zeit, nachdem der lebende Mikroorganismus an ein Individuum verabreicht wurde, stattfindet. Bevorzugt wird die Induktion der Proteinsynthese so reguliert, dass die Aktivierung stattfindet, nachdem der Mikroorganismus (Mikroorganismen) von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) aufgenommen wurde und in das Endosom durch Phagozytose eingeschleust wurde. Ein wünschenswertes Ergebnis dieser Regulation ist, dass die Produktion des Allergens von Interesse in den APCs stattfindet und deshalb das Einwirken des Allergens auf die IgE-Moleküle, die an der Oberfläche der Histamin-freisetzenden Mastzellen und Basophilen gebunden sind, reduziert oder eliminiert wird. Dies reduziert und eliminiert das Risiko von anaphylaktischem Schock während der Verabreichung der Mikroorganismen, die die anaphylaktischen Antigene produzieren.
Jedwedes Verfahren zur Kontrolle der Proteinsynthese in dem Mikroorganismus kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bevorzugt verwendet das Verfahren zur Kontrolle der Proteinsynthese einen induzierbaren Promotor, der mit dem Gen von Interesse operativ verknüpft ist (z.B. ein Gen, das ein Signalpeptid und ein Protein als Antigen codiert). Viele Systeme zur Kontrolle der Transkription eines Gens unter Verwendung eines induzierbaren Promotors sind bekannt (Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley and Sons. New York. 1999). Im Allgemeinen verwenden induzierbare Systeme entweder die Aktivierung des Gens oder die Derepression des Gens. Es ist bevorzugt, dass die vorliegende Erfindung die Aktivierung eines Gens zur Induktion der Transkription verwendet. Jedoch können auch induzierbare Systeme unter Verwendung der Derepression eines Gens in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Systeme unter Verwendung von Aktivierung sind bevorzugt, da diese Systeme in der Lage sind, streng die Inaktivierung zu kontrollieren (und folglich die Synthese des basalen Levels), da Derepression in niedrigen Levels von Transkription resultieren kann, wenn die Derepression nicht streng ist.
Verfahren zur Induzierung der Transkription schließen eine Induzierung durch die Gegenwart oder die Abwesenheit eines chemischen Mittels, eine Induzierung unter Verwendung eines induzierbaren Nährstoffmangel-Promotors, eine Induzierung unter Verwendung eines induzierbaren Phosphatmangel-Promotors und eine Induzierung unter Verwendung eines induzierbaren temperaturempfindlichen Promotors ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Ein besonders bevorzugtes System zur Regulierung der Genexpression verwendet ein kontrollierbares Tetracyclin-Expressionssystem. Systeme, die das kontrollierbare Tetracyclin-Expressionssystem verwenden, sind kommerziell erhältlich (siehe zum Beispiel Clontech, Palo Alto, CA).
Ein anderes besonders bevorzugtes System zur Regulierung der Genexpression verwendet ein Ecdyson-induzierbares Expressionssystem, das auch kommerziell verfügbar ist (Invitrogen, Carlsbad, CA). Das Ecdyson-induzierbare Expressionssystem basiert auf der Fähigkeit von Ecdyson, das ein Insektenhormon ist, die Genexpression durch Binden an den Ecdysonrezeptor zu aktivieren. Das Expressionssystem verwendet ein modifiziertes heterologes Protein, das den Ecdysonrezeptor, eine virale Transaktivierungsdomäne (von VP16) und den von Säugerzellen abgeleiteten Retinoid-X-Rezeptor enthält, um an ein modifiziertes Ecdyson-Responseelement in der Gegenwart eines Liganden wie Ecdyson oder eines Analogen (z.B. Muristeron A, Ponasteron A) zu binden.
Es ist bevorzugt, dass induzierbare Systeme zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung induzierende Mittel verwenden, die für Säugerzellen, einschließlich Menschen, nicht toxisch sind. Darüber hinaus ist es bevorzugt, dass induzierende Transkriptionsmittel Zellmembrane permeieren. Genauer müssen zur Aktivierung der Proteinsynthese in Mikroorganismen nach einer Phagozytose durch APCs induzierende Transkriptionsmittel Zellmembrane der APC und Zellmembrane des Mikroorganismus passieren können, um die Expression von Genen zu aktivieren, die Proteine als Allergene gemäß der vorliegenden Erfindung codieren. Da sowohl Tetracyclin als auch Ecdyson Zellmembrane passieren können und nicht toxische Tetracyclin-induzierbare Systeme und Ecdyson-induzierbare Systeme sind, sind sie zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung in idealer Weise geeignet. Jedoch ist die Verwendung von induzierbaren Systemen in der vorliegenden Erfindung nicht auf diese Systeme eingeschränkt.
Es ist auch bevorzugt, dass Bakterien, die keine Phagozytose durchlaufen haben, vor der Induzierung von Genen, die Polypeptide als Allergene von Interesse exprimieren, getötet werden. Ein bevorzugtes Verfahren zum Töten von Bakterien ist die Verwendung von Antibiotika, die nicht in Säugerzellmembrane permeieren können, so dass nur Bakterien getötet werden, die keine Phagozytose durchlaufen haben. Die Verwendung von Antibiotika gemäß der vorliegenden Ausführungsform reduziert oder eliminiert die Produktion von Polypeptiden durch Bakterien außerhalb der Antigen-präsentierenden Zellen. Es ist wichtig, das Einwirken von Allergen-produzierenden Bakterien auf das Immunsystem. zu reduzieren oder zu eliminieren, insbesondere von Bakterien, die Polypeptide sekretieren, die in einem Individuum eine möglicherweise letale anaphylaktische Reaktion hervorrufen können. Der Fachmann kennt Antibiotika, die verwendet werden können. Solche Antibiotika schließen Penicillin, Ampicillin, Cephalosporin, Griseofulvin, Bacitracin, Polymyxin b, Amphotericin b, Erythromycin, Neomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Vancomycin, Gentamicin und Rifamycin ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
SEKRETIONSSIGNALE
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden exprimierte Allergene (und/oder Immunmodulationsmoleküle, wie Zytokine; siehe nachstehend) durch die Mikroorganismen sekretiert. Bevorzugt findet die Sekretion der Allergene in einer Säugerzelle statt, um das Einwirken der Allergene auf die allergische Immunreaktion des Subjekts zu reduzieren oder zu eliminieren. Eine Sekretion von Polypeptiden schließt die Sekretion in das extrazelluläre Medium und die Sekretion von Polypeptiden in das Periplasma der Mikroorganismen wie Gram-negative Bakterien und Hefen ein. Vorteile einer Sekretion von Allergenen in das Periplasma schließen eine Reduzierung eines Durchbruchs der Allergene vor der Phagozytose des Mikroorganismus ein. Dieser Vorteil ist bei nicht induzierbaren Systemen am stärksten verwendbar. Vorteile einer Sekretion von Allergenen in das extrazelluläre Medium in induzierbaren Systemen schließen eine Maximierung der Menge an Allergenen, die zur Verarbeitung durch Antigen-präsentierende Zellen nach der Phagozytose der Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung verfügbar sind, ein.
Um sekretierte Polypeptide in Bakterien zu exprimieren, kann eine Vielzahl von bakteriellen Sekretionssignalen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden. Zum Beispiel ist das Sec-abhängige Verfahren in E. coli eines, das bekannt ist (für einen Überblick siehe Driessen et al. Curr. Opin. Microbiology 1: 216-22). Zusätzlich wurde das OmpA-Signalpeptid in E. coli von Wong und Sutherland beschrieben (US Patent 5,223,407). Fusionsproteine, die eines dieser Sekretionssignalpeptide enthalten, werden durch die Bakterien nicht vollständig sekretiert, sondern vielmehr durch die innere Membran der Gramnegativen Bakterien in das Periplasma transportiert. Diese Sekretionssignale können in der vorliegenden Erfindung zum Transportieren von allergenen oder Immunmodulationspolypeptiden in das Periplasma der Bakterien verwendet werden. Nach der Verabreichung der genetisch-technologisch gestalteten Bakterien an ein Individuum und der darauf folgenden Phagozytose durch APCs werden die allergenen oder Immunmodulationspolypeptide im Periplasma nach der Degenerierung der äußeren Membran durch Enzyme im Endosom der APCs freigesetzt. Bevorzugt synthetisieren und sekretieren die Bakterien die Polypeptide in das Periplasma und werden vor der Verabreichung getötet, bevorzugt durch Hitze getötet. Jedoch erkennt man, dass attenuierte Bakterien zur Sekretion von erfindungsgemäßen Allergenen in das Periplasma und zur Verabreichung an Individuen verwendet werden können.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der sekretierten Proteine oder Polypeptide werden Fusionsproteine, die Sekretionssignalsequenzen und allergene oder Immunmodulationssequenzen enthalten, vollständig in das extrazelluläre Medium durch einen Mikroorganismus nach der Synthese des Proteins sekretiert. Solche Sekretionssignale schließen jene ein, die in Hämolysin und Listeriolysin gefunden werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Hämolysin-Komplex von E. coli zum Transportieren von allergenen oder Immunmodulationspolypeptiden durch die innere und äußere Membran eines Mikroorganismus (z.B. E. coli, Salmonella, Shigella, Vibrio, Yersinia, Citrobacter, Serratia, Pseudomonas) in das extrazelluläre Medium verwendet (Spreng et al. Mol. Microbiol. 31: 1589-1601, 1999 und Bezugnahmen darin). Es wurde gezeigt, dass eine Fusion von HlyAs mit Proteinen und Polypeptiden in einer Sekretion dieser Fusionsproteine unter Verwendung des Hämolysin-Sekretionssystems resultiert (Blight und Holland, Trends Biotechnol., Nov. 1994; 12(11): 450-5; Gentschev et al., Behring Inst Mitt., Dez. 1994; (95): 57-66).
Das Hämolysinprotein (HlyA) enthält ein C-terminales Transportsignal (HlyAs), das eine Länge von ungefähr 50 bis 60 Aminosäuren aufweist (Hess et al., Mol Gen Genet., Nov. 1990; 224(2): 201-8; Jarchau et al., Mol Gen Genet., 17. Okt. 1994; 245(1): 53-60). Das HlyA-Protein wird durch die inneren und äußeren Zellmembrane durch das Hämolysinsekretionssystem sekretiert. Dieser Komplex enthält drei Membranproteine. Zwei dieser Proteine, HlyB und HlyD, sind in der inneren Membran lokalisiert und das dritte TolC ist an der äußeren Membran lokalisiert. Gene, die diese Proteine codieren, sind Teil des Hämolysinoperons, das aus vier Genen hlyC, hlyA, hlyB und hlyD besteht (Wagner et al., J Bacteriol., Apr. 1983; 154(1): 200-10; Gentschev. Gene., 07. Nov. 1996; 179(1): 133-40).
In einer bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung des Hly-Sekretionssystems werden DNA-Plasmide (Vektoren) zur Expression von Fusionsproteinen, die das HlyAs-Signalpeptid und allergene oder Immunmodulationspolypeptide enthalten, verwendet. Die Gene, die den Transportkomplex (hlyB und hlyD) codieren, werden durch den selben Vektor codiert. Man erkennt, dass multiple Vektoren zum Codieren und Exprimieren dieser Gene verwendet werden können oder dass Sequenzen, die diese Gene codieren, in das Wirtgenom zur Expression insertiert werden können. Bevorzugt enthält ein einzelner Vektor das gesamte Hämolysinoperon, einschließlich den hly-spezifischen Promotor und einen Regulator hlyR vom Enhancer-Typ; das HlyA-Gen, wobei nur die minimale Polypeptidsequenz, die zum Transportieren eines Fusionsproteins notwendig ist, vorhanden ist; und das Antigen von Interesse. Das TolC-Protein wird im Allgemeinen durch das E. coli-Wirtsystem produziert.
Jedoch kann in Systemen, wobei tolC-DNA nicht durch einen Wirtorganismus codiert wird, tolC durch einen Vektor codiert werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das in WO 98/50067 („Donner") beschriebene Sekretionsplasmid pMOhlyl verwendet, um Fusionsproteine, die Sekretionssignalsequenzen und Polypeptide enthalten, die mit der Induzierung von anaphylaktischem Schock in Individuen in Zusammenhang stehen, zu exprimieren. Der Sekretionsvektor pMOhlyl enthält das vollständige Hämolysinoperon, einschließlich den hly-spezifischen Promotor und den Regulator hlyR vom Enhancertyp. Ein Großteil des hlyA-Gens wurde so deletiert, dass HlyA nur die 34 Amino-terminalen und die 61 Carboxyl-terminalen Aminosäuren (HlyAs) codiert. Eine einmalige Nsi-Restriktionsenzymstelle zwischen den Amino-terminalen und den Carboxyl-terminalen Resten von HlyA ermöglicht die Insertion von heterologen Genen oder Genfragmenten in den Leserahmen von HlyA_s. Die genetische Information für Antigene der Größe 10 bis 1000 Aminosäuren kann in diesen Sekretionsvektor pMOhlyl insertiert werden, was die Sekretion dieser Antigene in attenuierten Salmonella oder anderen Gram-negativen attenuierten Impfstämmen (z.B. E. coli, Vibrio cholera, Yersina enterocolitica) ermöglicht. Im Gegensatz zu anderen Sekretionssystemen wird die Sekretion von Fusionsproteinen unter Verwendung eines einzelnen Plasmids durch Donner beschrieben. Ein Vorteil des Hämolysinsekretionssystems im Vergleich zu herkömmlichen Transportsystemen ist die größere Größe der Fusionsproteine, die gemäß der in Donner gelehrten Verfahren synthetisiert und sekretiert werden. Herkömmliche Sekretionssysteme für die Präsentation von Antigenen sind nur zur Sekretierung von relativ kurzen Peptiden in den äußeren Teil der Bakterienzelle in der Lage (Cardenas und Clements, Clin Microbiol Rev., Jul. 1992; 5(3): 328-42).
ANTIGENE UND ALLERGENE
Im Allgemeinen kann jedwedes Allergen durch Mikroorganismen gemäß der vorliegenden Erfindung produziert werden. Bevorzugte Allergene werden in bestimmten Nahrungsmitteln, Gift, Arzneistoffen oder Gummi gefunden und sind zum Hervorrufen von allergischen Reaktionen und insbesondere von anaphylaktischen allergischen Reaktionen in einem Individuum in der Lage. Besonders bevorzugte Allergene sind Proteine oder Polypeptide als Allergene.
In einer bevorzugten Ausführungsform produzieren die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung allergene Proteine, die Allergien, möglicherweise anaphylaktischen Schock, hervorrufen und werden in Nahrungsmitteln, Giften, Arzneistoffen und auf Gummi basierenden Produkten gefunden. Besonders bevorzugte allergene Proteine, die anaphylaktischen Schock induzieren, wie mehrere Proteine als Allergene, werden in Nahrungsmitteln (Erdnuss, Milch, Ei, Weizen), Insektengift (z.B. Bienen, Reptilien), Arzneistoffen und Latex gefunden. Nicht einschränkende Beispiele von Proteinen als Allergene, die in Nahrungsmitteln gefunden werden, schließen Proteine ein, die in Nüssen (z.B. Erdnuss, Walnuss, Mandel, Pekannuss, Cashewnuss, Haselnuss, Pistazie, Pinienkern, Paranuss), Meeresfrüchten (z.B. Garnele, Krabbe, Hummer, Muscheln), Früchten (z.B. Pflaumen, Pfirsichen, Nektarinen; Ann Allergy Asthma Immunol 7(6): 504-8 (1996); Kirschen, Allergy 51(10): 756-7 (1996)), Samen (Sesam, Mohn, Senf) und Soja- und Milchprodukten (z.B. Ei, Milch) gefunden werden.
Einige Proteine als Allergene, die in Nüssen gefunden werden, stehen mit Hülsenfruchtallergien in Zusammenhang und können anstelle der Hülsenfruchtproteine (z.B. Erdnüsse, Sojabohnen, Linsen; Ann Allergy Asthma Immunol 77(6): 480-2 (1996)) verwendet werden. Auch können Proteine als Antigene verwendet werden, die bei mit Pollen in Zusammenhang stehenden Nahrungsmittelallergien gefunden werden (z.B. Birkenpollen in Zusammenhang mit Apfelallergien). Andere Proteine als Allergene, die in Nahrungsmitteln gefunden werden, schließen jene ein, die in jungem Knoblauch gefunden werden (Allergy 54(6): 626-9 (1999), und für Kinder, die gegen Hausstaubmilben allergisch sind, Allergene, die in Schnecken gefunden werden (Arch Pediatr 4(8): 767-9 (1997)). Es ist bekannt, dass Proteine als Allergene in Weizen Belastungs-induzierte Allergien verursachen (J Allergy Clin Immunol, Mai 1999; 103(5 Pt 1): 912-7).
Es ist bekannt, dass Stiche von Organismen, die Gifte injizieren, wie Insektenstiche, bei Individuen mit Allergien gegen das Gift einen anaphylaktischen Schock verursachen. Im Allgemeinen schließt Insektengift Gift von Hymenoptera wie Bienen, Hornissen, Wespen, Yellow Jacket-Wespen, Samtameisen und Feuerameisen ein. Insbesondere kann zum Beispiel Gift von Honigbienen der Gattung Apis einen anaphylaktischen Schock bei gestochenen Opfern, die allergisch sind, verursachen (Weber et al. Allergy 42: 464-470). Das Gift von Honigbienen enthält zahlreiche Verbindungen, die sehr umfangreich untersucht und charakterisiert wurden (siehe als eine Bezugnahme, Banks und Shipolini. Chemistry and Pharmacology of Honey-bee Venom. Kapitel 7 von Venoms of the Hymenoptera. Herausg. T. Piek. Academic Press. London. 1986). Die zwei Hauptkomponenten von Bienengift sind Phospholipase A2 und Melittin und sind bevorzugt Proteine als Allergene zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zur Behandlung und Vorbeugung von Allergien gegen Bienengift.
Bei bestimmten Verwendungen der vorliegenden Erfindung wird es wünschenswert sein, in Systemen zu arbeiten, bei welchen eine einzelne Verbindung (z.B. ein einzelnes Protein) für die am häufigsten beobachtete Allergie verantwortlich ist. In anderen Fällen kann die Erfindung bei komplexeren Allergenen verwendet werden. Deshalb können Ansammlungen von mehr als einem Antigen verwendet werden, so dass Immunreaktionen gegen multiple Antigene gleichzeitig moduliert werden können.
Anhang A stellt eine repräsentative Auflistung von bestimmten bekannten Proteinen als Antigene dar. Wie angegeben, ist die Aminosäuresequenz für viele oder alle dieser Proteine bekannt, entweder durch die Kenntnis der Sequenz ihrer verwandten Gene oder durch direkte Kenntnis der Proteinsequenz oder durch beides. Von besonderem Interesse sind anaphylaktische Antigene.
In einer anderen Ausführungsform der allergenen Antigene werden Mikroorganismen genetisch-technologisch gestaltet, um modifizierte allergene Polypeptide zu synthetisieren und zu sekretieren, die anaphylaktischen Schock hervorrufen, wenn sie auf Individuen einwirken, welche für einen anaphylaktischen Schock empfänglich sind. Bevorzugt werden die Allergene so modifiziert, dass die Fähigkeit zum Hervorrufen von anaphylaktischem Schock reduziert oder eliminiert ist. Wie vorausgehend erörtert, rufen Allergene durch Vernetzen von IgE-Antikörpern, die an der Oberfläche von Mastzellen und Basophilen gebunden sind, allergische Reaktionen hervor, die manchmal schwerwiegend genug sind, um einen anaphylaktischen Schock zu induzieren. Das IgE-Vernetzen setzt Verbindungen wie Histamine frei, die Symptome verursachen, die mit Allergien und anaphylaktischem Schock verwandt sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Mikroorganismen zur Synthese und Sekretion von Antigenen, die modifiziert sind, verwendet, um IgE-Bindungsstellen zu reduzieren oder zu eliminieren, während die Antigeneigenschaft oder die Immunmodulationsaktivität noch erhalten wird (WO 99/38978). Dies reduziert das Risiko von allergischen oder anaphylaktischen Reaktionen bei Individuen, die mit Impfstoffen, die diese technologisch gestalteten Mikroorganismen enthalten, behandelt werden.
Die Menge an Antigen, die in jedweder besonderen Zusammensetzung oder Verwendung verwendet wird, wird von der Natur des besonderen Antigens oder von der Verwendung, für welche es verwendet wird, abhängen, wie der Fachmann einfach erkennen wird. Die in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Experimente schlagen vor, dass größere Mengen an Polypeptiden zur Induzierung von Th1-Reaktionen nützlich sind. Die Menge an Antigen kann durch eine Vielzahl an Faktoren, einschließlich der, aber nicht eingeschränkt auf die Expressionssysteme, induzierbaren Expressionssysteme, Sekretions- und Ausscheidungslevel, Verfahren zum Töten der Bakterien vor der Bereitstellung, kontrolliert werden. Der Fachmann wird zur Bestimmung der gewünschten Levels an Antigenen, die durch die Bakterien produziert und bei den Individuen bereitgestellt werden, in der Lage sein.
Man erkennt, dass multiple antigene Moleküle durch Bakterien gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung gleichzeitig bereitgestellt werden können. Ohne Einschränkung können unterschiedliche entscheidende antigene Faktoren für ein antigenes Protein bereitgestellt werden. Unterschiedliche entscheidende antigene Faktoren von unterschiedlichen antigenen Proteinen können auch bereitgestellt werden. Des Weiteren können multiple antigene Polypeptide und Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden. Man erkennt auch, dass einzelne oder multiple antigene Polypeptide und einzelne oder multiple Zytokine bei Individuen durch Bakterien gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden können. Zum Beispiel, aber ohne Einschränkung, können allergene Antigene der vorliegenden Erfindung und Immunmodulationsmoleküle wie Interleukine durch Bakterien unter Verwendung von sekretierenden oder nicht sekretierenden Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden.
ADJUVANZIEN UND IMMUNSTIMULIERUNGSMITTEL
Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen die Verwendung von Adjuvanzien und Immunmodulationspolypeptiden oder Immunstimulierungsfaktoren zur Modulierung einer Immunreaktion eines Individuums ein. Immunologische Adjuvanzien sind Mittel, die spezifische Immunreaktionen auf Impfstoffe steigern. Eine Formulierung von Impfstoffen mit wirksamen Adjuvanzien ist wünschenswert, um die Leistung von Impfstoffen, die aus Antigenen zusammengesetzt sind, zu verbessern. Adjuvanzien können verschiedenartige Wirkmechanismen aufweisen und sollten zur Verwendung gezogen auf den Verabreichungsweg und den Typ der Immunreaktion (Antikörper-, Zell-vermittelte oder Schleimhautimmunität), die für einen besonderen Impfstoff gewünscht ist, ausgewählt werden.
Im Allgemeinen schließen Immunmodulationspolypeptide Zytokine ein, die kleine Proteine oder biologische Faktoren sind (im Bereich von 5 bis 20 kD), die von Zellen freigesetzt werden und spezifische Wirkungen auf die Zell-Zell-Wechselwirkung, die Kommunikation und das Verhalten von anderen Zellen haben. Wie vorstehend beschrieben, sind Zytokine gemäß der vorliegenden Erfindung Proteine, die von T-Zellen sekretiert werden, um eine Th1- oder Th2-Reaktion zu induzieren. Bevorzugt wird das Zytokin(e), das verabreicht wird, ausgewählt, um die Produktion einer Th2-Reaktion gegen Antigene, die mit anaphylaktischem Schock in Zusammenhang stehen, zu reduzieren. Ein bevorzugtes Verfahren zur Reduzierung einer Th2-Reaktion erfolgt über die Induzierung der alternativen Reaktion. Zytokine, die, wenn sie während einer Antigenbereitstellung in Zellen exprimiert werden, eine Th1-Reaktion in T-Zellen induzieren (d.h. „Th1-stimulierende Zytokine"), schließen IL-12, IL-2, I-18, IL-1 oder Fragmente davon, IFN und/oder IFNγ ein.
Andere Verbindungen, die Immunmodulationseigenschaft aufweisen, schließen Immunität induzierende Mittel ein. Diese induzierenden Mittel veranlassen die Expression von Th1-stimulierenden Zytokinen durch T-Zellen und schließen Faktoren wie CD40, CD40-Ligand, Oligonucleotide, die CpG-Motive enthalten, TNF und mikrobielle Extrakte wie Zubereitungen von Staphylococcus aureus, durch Hitze getötete Listeria und modifiziertes Choleratoxin, usw. ein.
Der Fachmann erkennt einfach die bevorzugten Typen von Adjuvanzien zur Verwendung mit besonderen Antigenzusammensetzungen. Im Allgemeinen schließt ein immunologisches Adjuvans Adjuvanzien vom Gel-Typ (z.B. Aluminiumhydroxid/Aluminiumphosphat, Calciumphosphat), mikrobielle Adjuvanzien (z.B. DNA wie CpG-Motive; Endotoxin wie Monophosphoryllipid A; Exotoxine wie Choleratoxin, Hitze-labiles E. coli-Toxin und Pertussistoxin; und Muramyldipeptid), Ölemulsion- und auf Emulgiermittel basierende Adjuvanzien (z.B. Freund's Incomplete Adjuvant, MF59 und SAF), besondere Adjuvanzien (z.B. Liposome, bioabbaubare Mikrokügelchen und Saponine) und synthetische Adjuvanzien (z.B. nicht-ionische Blockcopolymere, Muramylpeptidanaloga, Polyphosphazen und synthetische Polynucleotide) ein.
Adjuvanzien, von welchen bekannt ist, dass sie Th2-Reaktionen stimulieren, werden bevorzugt vermieden. Besonders bevorzugte Adjuvanzien schließen zum Beispiel Zubereitungen (einschließlich durch Hitze getötete Proben, Extrakte, teilweise gereinigte Isolate oder jedwede andere Zubereitung eines Mikroorganismus oder einer Makroorganismuskomponente, die ausreichend ist, um Adjuvansaktivität zu zeigen) von Mikroorganismen wie Listeria monocytogenes oder anderen (z.B. Bacille Calmette-Guerin [BCG], Corynebacterium-Spezies, Mycobacterium-Spezies, Rhodococcus-Spezies, Eubacteria-Spezies, Bortadella-Spezies und Nocardia-Spezies) und Zubereitungen von Nukleinsäuren, die nicht methylierte CpG-Motive einschließen (siehe zum Beispiel U.S. Patent Nr. 5,830,877; und veröffentlichte PCT-Anmeldungen WO 96/02555, WO 98/18810, WO 98/16247 und WO 98/40100), ein. Andere bevorzugte Adjuvanzien, von welchen berichtet wird, dass sie Reaktionen vom Th1-Typ induzieren und nicht Reaktionen vom Th2-Typ, schließen zum Beispiel Aviridin (N,N-Dioctadecyl-N',N'-bis(2-hydroxyethyl)propandiamin) und CRL 1005 ein. Besonders bevorzugt sind welche, die die IL-12-Produktion induzieren, einschließlich mikrobielle Extrakte wie nicht-flüssige Staphylococcus aureus, Streptococcal-Zubereitungen, Mycobacterium tuberculosis, Lipopolysaccharid (LPS), Monophosphoryllipid A (MPLA) von Gram-negativen bakteriellen Lipopolysacchariden (Richards et al. Infect Immun, Jun. 1998; 66(6): 2859-65), listeria monocytogenes, toxoplasma gondii, leishmania major. Einige Polymere sind auch Adjuvanzien. Zum Beispiel werden Polyphosphazene in U.S. Patent Nr. 5,500,161 von Andriavnov, et al. beschrieben. Diese können nicht nur zum Verkapseln der Mikroorganismen verwendet werden, sondern auch zur Steigerung der Immunreaktion gegen das Antigen.
Wenn Adjuvanzien nicht durch Mikroorganismen gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisiert werden, können Adjuvanzien, die Zytokine sind, als unreine Zubereitungen (z.B. Isolate aus Zellen, die ein Zytokingen exprimieren, entweder endogen oder exogen zu der Zelle) bereitgestellt werden, aber sie werden bevorzugt in gereinigter Form bereitgestellt. Gereinigte Zubereitungen sind bevorzugt mindestens etwa 90% rein, stärker bevorzugt mindestens etwa 95% rein und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 99% rein. Alternativ können Gene, die die Zytokine oder die Immunität induzierenden Mittel codieren, bereitgestellt werden, so dass eine Genexpression in der Produktion von Zytokinen oder Immunität induzierenden Mitteln resultiert, entweder im behandelten Individuum oder in einem anderen Expressionssystem (z.B. einem in vitro-Transkriptions-/Translations-System oder einer Wirtzelle), von welchem exprimiertes Zytokin oder Immunität induzierendes Mittel zur Verabreichung an das Individuum erhalten werden kann. Man erkennt, dass Mikroorganismen, die zur Synthese und zur Bereitstellung von allergenen und/oder Immunmodulationsproteinen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, als ein Adjuvans wirken können, und dass bevorzugte Mikroorganismen Immunstimulierungsadjuvanzien sind.
Der Fachmann wird erkennen, dass die erfindungsgemäße Verabreichung von Mikroorganismen, die Zytokine und/oder Allergene exprimieren, gegebenenfalls mit der Verabreichung von jedwedem anderen gewünschten Immunsystemmodulationsfaktor wie zum Beispiel einem Adjuvans oder einer anderen Immunmodulationsverbindung kombiniert werden kann.
VERABREICHUNGSVERFAHREN
Formulierungen können bei einem Patienten über jedweden verfügbaren Weg bereitgestellt werden, einschließlich zum Beispiel über enterale, parenterale, topische (einschließlich nasale, pulmonale oder über einen anderen Weg über die Schleimhaut), orale oder lokale Verabreichung. Die Zusammensetzungen werden bevorzugt in einer Menge verabreicht, die zum Hervorrufen von zellulärer Immunität und zur Produktion von Th1-verwandtem IgG wirksam ist, während IgE-vermittelte Reaktionen minimiert werden. Auch bevorzugt sind Zusammensetzungen, die in einer wirksamen Menge für eine aktive T-Zellen-Reaktion, bevorzugt Reaktionen vom Th1-Typ, verabreicht werden. Für Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die Bakterien enthalten, wird die Verabreichung bevorzugt parenteral bereitgestellt.
PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN
sPharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten oder Träger einschließen. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „pharmazeutisch annehmbarer Träger" einen nicht toxischen, inerten festen, halbfesten oder flüssigen Füllstoff, Verdünnungsmittel, Verkapselungsmaterial oder Formulierungshilfsmittel jedweden Typs. Einige Beispiele von Materialien, die als pharmazeutisch annehmbare Träger dienen können, sind Zucker wie Laktose, Glucose und Saccharose; Stärken wie Maisstärke und Kartoffelstärke; Cellulose und ihre Derivate wie Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat; pulverisiertes Tragant; Malz; Gelatine; Talk; Exzipienten wie Kakaobutter und Zäpfchenwachse; Öle wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl; Safloröl; Sesamöl; Olivenöl; Maisöl und Sojabohnenöl; Glycole; wie Propylenglycol; Ester wie Ethyloleat und Ethyllaurat; Agar; Puffer wie Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; Alginsäure; Pyrogen-freies Wasser; isotonische Salzlösung; Ringer-Lösung; Ethylalkohol und Phosphatpufferlösungen, sowie andere nicht toxische kompatible Gleitmittel wie Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat, sowie farbgebende Mittel, Trennmittel, Überzugsmittel, Süßungsmittel, Geschmackstoffe und Duftstoffe, Konservierungsstoffe und Antioxidationsmittel können auch gemäß dem Urteil des Formulierungsfachmanns in der Zusammensetzung vorhanden sein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung können an Menschen und/oder andere Tiere oral, rektal, parenteral, intrazisternal, intravaginal, intraperitoneal, topisch (wie durch Pulver, Salben oder Tropfen), bukkal oder als ein orales oder nasales Spray verabreicht werden.
Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung schließen pharmazeutisch annehmbare Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere ein. Zusätzlich zu den Wirkstoffen können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel, die im Allgemeinen auf dem Fachgebiet verwendet werden, enthalten, wie zum Beispiel Wasser oder andere Lösungsmittel, löslichmachende Mittel und Emulgiermittel wie Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol, Dimethylformamid, Öle (insbesondere Baumwollsamen-, Erdnuss-, Mais-, Keim-, Oliven-, Castor- und Sesamöle), Glycerol, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglycole und Fettsäureester von Sorbitan und Gemische davon. Neben den inerten Verdünnungsmitteln können die oralen Zusammensetzungen auch Mittel wie Benetzungsmittel, Emulgier- und Suspendiermittel, Süßungsmittel, Geschmackstoffe und Duftstoffe einschließen.
Injizierbare Zubereitungen, zum Beispiel sterile injizierbare wässrige oder ölartige Suspensionen, können gemäß dem Stand der Technik unter Verwendung von geeigneten Dispergier- oder Benetzungsmitteln und Suspendiermitteln formuliert werden. Die sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile injizierbare Lösung, Suspension oder Emulsion in einem nicht toxischen, parenteral annehmbaren Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel, zum Beispiel als eine Lösung in 1,3-Butandiol, sein. Unter den annehmbaren Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, sind Wasser, Ringer-Lösung, U.S.P. und isotonische Natriumchlorid-Lösung. Zusätzlich werden sterile nicht-flüssige Öle herkömmlicherweise als ein Lösungsmittel oder Suspendiermedium verwendet. Für diesen Zweck kann jedwedes milde nicht-flüssige Öl verwendet werden, einschließlich synthetische Mono- oder Diglyceride. Zusätzlich werden Fettsäuren wie Ölsäure bei der Herstellung von injizierbaren Zubereitungen verwendet.
Um die Wirkung eines Mittels zu verlängern, ist es oft wünschenswert, die Absorption des Arzneistoffes aus subkutaner oder intramuskulärer Injektion zu verlangsamen. Die kann durch die Verwendung einer flüssigen Suspension von kristallinem oder amorphem Material mit schlechter Wasserlöslichkeit erreicht werden. Die Absorptionsgeschwindigkeit des Mittels hängt dann von seiner Lösungsgeschwindigkeit ab, welche ihrerseits von der Kristallgröße und Kristallform abhängt. Alternativ wird eine verzögerte Absorption einer parenteral verabreichten Arzneistoffform durch Lösen oder Suspendieren des Arzneistoffes in einem Ölvehikel erreicht. Injizierbare Depotformen werden durch Bilden von Mikrokapselmatrizes des Arzneistoffes in bioabbaubaren Polymeren wie Polylactid-Polyglycolid hergestellt. Abhängig vom Verhältnis des Mittels zum Polymer und der Natur des verwendeten besonderen Polymers kann die Freisetzungsgeschwindigkeit des Mittels kontrolliert werden. Beispiele von anderen bioabbaubaren Polymeren schließen Poly(orthoester) und Poly(anhydride) ein. Injizierbare Depotformulierungen werden auch durch Einschließen des Arzneistoffes in Liposomen oder Mikroemulsionen, die mit Körpergeweben kompatibel sind, hergestellt.
Zusammensetzungen für rektale oder vaginale Verabreichung sind bevorzugt Zäpfchen, die durch Mischen der Verbindungen dieser Erfindung mit geeigneten nicht irritierenden Exzipienten oder Trägern wie Kakaobutter, Polyethylenglycol oder einem Zäpfchenwachs, die bei Umgebungstemperatur fest, aber bei Körpertemperatur flüssig sind und deshalb im Rektum oder der Vagina schmelzen und den Wirkstoff freisetzen, hergestellt werden können.
Feste Dosierungsformen für orale Verabreichung schließen Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granula ein. In solchen festen Dosierungsformen wird der Wirkstoff mit mindestens einem inerten, pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten oder Träger wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat und/oder a) Füllstoffen oder Streckmitteln wie Stärken, Laktose, Saccharose, Glucose, Mannitol und Kieselsäure, b) Bindemitteln wie zum Beispiel Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidinon, Saccharose und Gummiarabikum, c) Netzmitteln wie Glycerol, d) Sprengmitteln wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, bestimmten Silikaten und Natriumcarbonat, e) Lösungsverzögerungsmitteln wie Paraffin, f) Absorptionbeschleunigenden Mitteln wie quartären Ammoniumverbindungen, g) Benetzungsmitteln wie zum Beispiel Cetylalkohol und Glycerolmonostearat, h) Absorbenzien wie Kaolin oder Bentonitton, und i) Gleitmitteln wie Talk, Calciumstearat, Magnesiumstearat, festen Polyethylenglycolen, Natriumlaurylsulfat und Gemischen davon gemischt. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen kann die Dosierungsform auch Puffer umfassen.
Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs können auch als Füllstoffe in gefüllten weichen und harten Gelatinekapseln unter Verwendung von solchen Exzipienten wie Laktose oder Milchzucker sowie Polyethylenglycolen mit hohem Molekulargewicht und dergleichen verwendet werden.
Die festen Dosierungsformen Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granula können mit Überzügen und Einhüllungen wie magensaftresistenten Überzügen und anderen Überzügen, die auf dem pharmazeutischen Formulierungsfachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. Sie können gegebenenfalls Deckfähigkeit-aufweisende Mittel enthalten und können auch aus einer Zusammensetzung bestehen, so dass sie den Wirkstoffe) nur oder vorzugsweise in einem bestimmten Teil des Intestinaltrakts, gegebenenfalls in einer verzögerten Weise, freisetzen. Beispiele von Einbettungszusammensetzungen, die verwendet werden können, schließen Polymersubstanzen und Wachse ein.
Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs können auch als Füllstoffe in gefüllten weichen und harten Gelatinekapseln unter Verwendung von solchen Exzipienten wie Laktose oder Milchzucker sowie Polyethylenglycolen mit hohem Molekulargewicht und dergleichen verwendet werden.
Die Verbindungen können auch in mikroverkapselter Form mit einem oder mehreren Exzipienten, wie vorstehend angemerkt, vorliegen. Die festen Dosierungsformen Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granula können mit Überzügen und Einhüllungen wie magensaftresistenten Überzügen, Freisetzung-kontrollierenden Überzügen und anderen Überzügen, die auf dem pharmazeutischen Formulierungsfachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. In solchen festen Dosierungsformen kann der Wirkstoff mit mindestens einem inerten Verdünnungsmittel wie Saccharose, Laktose oder Stärke gemischt werden. Solche Dosierungsformen können auch, wie in der normalen Praxis, zusätzliche Substanzen, die von inerten Verdünnungsmitteln verschieden sind, z.B. Tablettierungsgleitmittel und andere Tablettierungshilfsmittel wie Magnesiumstearat und mikrokristalline Cellulose, umfassen. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen auch Puffer umfassen. Sie können gegebenenfalls Deckfähigkeit-aufweisende Mittel enthalten und können auch aus einer Zusammensetzung bestehen, so dass sie den Wirkstoff(e) nur oder vorzugsweise in einem bestimmten Teil des Intestinaltrakts, gegebenenfalls in einer verzögerten Weise, freisetzen. Beispiele von Einbettungszusammensetzungen, die verwendet werden können, schließen Polymersubstanzen und Wachse ein.
Dosierungsformen für topische oder transdermale Verabreichung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung schließen Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gele, Pulver, Lösungen, Sprays, Inhalationsmittel oder Pflaster ein. Der Wirkstoff wird unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und jedweden benötigten Konservierungsstoffen oder Puffern, die erforderlich sein können, gemischt. Eine ophthalmische Formulierung, Ohrentropfen, Augentropfen werden auch als innerhalb des Umfangs dieser Erfindung betrachtet.
Die Salben, Pasten, Cremes und Gele können zusätzlich zu einem Wirkstoff dieser Erfindung Exzipienten wie Tier- und Pflanzenfette, Öle, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglycole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talk und Zinkoxid oder Gemische davon enthalten.
Pulver und Sprays können zusätzlich zu den Verbindungen dieser Erfindung Exzipienten wie Laktose, Talk, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilicate und Polyamidpulver oder Gemische dieser Substanzen enthalten. Sprays können zusätzlich herkömmliche Treibmittel wie Chlorfluorkohlenwasserstoffe enthalten.
Transdermale Pflaster weisen den zusätzlichen Vorteil der Bereitstellung einer kontrollierten Abgabe einer Verbindung an den Körper auf. Solche Dosierungsformen können durch Lösen oder Verteilen der Verbindung in einem geeigneten Medium hergestellt werden. Absorptionsteigernde Mittel können auch zur Erhöhung des Flusses der Verbindung durch die Haut verwendet werden. Die Geschwindigkeit kann entweder durch Bereitstellen einer Geschwindigkeit-kontrollierenden Membran oder durch Dispergieren der Verbindung in einer Polymermatrix oder einem Gel kontrolliert werden.
VERKAPSELUNG
In einer bevorzugten Ausführungsform werden erfindungsgemäße Zusammensetzungen, die lebende Mikroorganismen umfassen, in Zusammenhang mit einer Verkapselungsvorrichtung bereitgestellt (siehe zum Beispiel U.S.S.N. 60/169,330 mit dem Titel „Controlled Delivery of Antigens", eingereicht am 06. Dez. 1999). Bevorzugte Verkapselungsvorrichtungen sind biokompatibel, sind im Körper stabil, so dass die Mikroorganismen nicht freigesetzt werden, bis nachdem die Verkapselungsvorrichtung ihren beabsichtigten Zielort (z.B. Schleimhautschicht des Darms, Endozytose durch Antigen-präsentierende Zellen (APC)) erreicht hat. Zum Beispiel sind bevorzugte Verkapselungssysteme bei physiologischem pH-Wert stabil und werden bei Levels von sauren pH-Werten, die mit jenen vergleichbar sind, die im Verdauungstrakt oder in den Endosomen von APCs gefunden werden, abgebaut. Besonders bevorzugte Verkapselungszusammensetzungen schließen welche ein, die Liposome, Polylactidcoglycolid (PLGA), Chitosan, synthetische bioabbaubare Polymere, durch die Umgebung ansprechbare Hydrogele und Gelatine-PLGA-Nanopartikel enthalten, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen können in Kombination mit einem oder mehreren Adjuvanzien, zielgerichteten Einheiten oder anderen Mitteln, einschließlich zum Beispiel pharmazeutischen Trägern, Verdünnungsmitteln, Exzipienten, Ölen, usw., verkapselt werden. Alternativ oder zusätzlich kann die Verkapselungsvorrichtung selbst mit einer zielgerichteten Einheit und/oder einem Adjuvans assoziiert werden.
Verfahren zum Verkapseln von lebenden Zellen sind bekannt und können auch gemäß der vorliegenden Erfindung zur Bereitstellung von Antigen-sekretierenden Mikroorganismen bei Individuen verwendet werden. Die folgenden Bezugnahmen werden als Beispiele einer Verkapselung von lebenden Zellen bereitgestellt. Jedoch kann jedwedes Verfahren zum Verkapseln von lebenden Zellen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. US Patent 5,084,350; US Patent 4,680,174 und US Patent 4,352,883 beschreiben die Verkapselung einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle oder Zellkultur in Mikrokapseln. In Kürze, US Patent 5,084,350; 4,680,174 und 4,352,883 offenbaren, dass eine Gewebeprobe, Zelle oder Zellkultur, die verkapselt wird, zuerst in fein verteilter Form gemäß bekannten Techniken hergestellt und in einem wässrigen Medium, welches zur Erhaltung und zum Unterstützen der fortschreitenden metabolischen Vorgänge der besonderen einbezogenen Zellen geeignet ist, suspendiert wird. Medien, die für diesen Zweck geeignet sind, sind im Allgemeinen kommerziell verfügbar. Danach wird eine wasserlösliche Substanz, die mit den Zellen physiologisch kompatibel ist und die wasserunlöslich gemacht werden kann, um eine Form-erhaltende kohärente kugelförmige Masse oder eine andere Form zu bilden, zu dem Medium gegeben. Die Lösung wird dann zu Tropfen, die Zellen zusammen mit ihrem Erhaltungs- oder Wachstumsmedium enthalten, geformt und wird sofort wasserunlöslich gemacht und geliert, um Form-erhaltende, typischerweise sphäroide kohärente Massen, zu bilden.
Das Material, das zur Induzierung der Gelierung des Kulturmediums verwendet wird, kann jedwedes nicht toxische wasserlösliche Material sein, welches durch eine Veränderung bei der Umgebungstemperatur, beim pH-Wert, bei der ionischen Umgebung oder bei der Konzentration in Form-erhaltende Massen umgewandelt werden kann. Bevorzugt ist das Material auch eines, das mehrfache, einfach ionisierte Reste, z.B. Carboxyl- oder Aminogruppen, umfasst, die durch Salzbildung mit Polymeren, die mehrfache Reste enthalten, die ionisieren, wobei Spezies der Gegenladung gebildet werden, umgesetzt werden können. Die Verwendung dieses Typs von Material ermöglicht die Abscheidung einer Membran mit einem ausgewählten Porositätsbereich ohne Schaden an den labilen Zellen. Die momentan bevorzugten Materialien zur Bildung der gelierten Massen sind wasserlösliche natürliche oder synthetische Polysaccharide. Viele solche kommerziell verfügbaren Materialien werden typischerweise aus pflanzlichem Material extrahiert und werden oft als Additive in verschiedenen Nahrungsmitteln verwendet. Natriumalginat ist das momentan bevorzugte wasserlösliche Polysaccharid. Andere verwendbare Materialien schließen saure Fraktionen von Guar Gum, Gummiarabikum, Carrageen, Pektin, Tragant-Gummi oder Xanthan-Gumme ein. Diese Materialien können geliert werden, wenn das saure Wasserstoff- oder Alkalimetallion, die normalerweise mit den Carboxylgruppen assoziiert sind, durch mehrwertige Ionen ausgetauscht werden.
VERWENDUNGEN
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung oder Vorbeugung von allergischen Reaktionen bei einem Subjekt verwendet werden. Subjekte sind Tiere und Menschen als Patienten, die einen Bedarf für eine Behandlung gegen Allergien haben. Bevorzugt ist das Tier ein domestizierter Säuger (z.B. ein Hund, eine Katze, ein Pferd, ein Schaf, ein Schwein, eine Ziege, eine Kuh, usw.). Tiere schließen auch Labortiere wie Mäuse, Ratten, Hamster, Affen und Kaninchen ein. Jedwedes Individuum, das an einer Allergie leidet oder das für eine Allergie empfänglich ist, kann behandelt werden. Man wird erkennen, dass ein Individuum als für eine Allergie empfänglich betrachtet werden kann, ohne an einer allergischen Reaktion gegen ein in Frage kommendes besonderes Antigen gelitten zu haben. Wenn zum Beispiel das Individuum an einer allergischen Reaktion gegen ein verwandtes Antigen (z.B. eines der selben Quelle oder eines, für welches gemeinsame Allergien gewöhnlich sind) gelitten hat, wird dieses Individuum als für eine Allergie gegen das relevante Antigen empfänglich betrachtet. Wenn Mitglieder einer Familie eines Individuums gegen ein besonderes Antigen allergisch sind, kann in einer ähnlichen Weise das Individuum als für eine Allergie gegen dieses Antigen empfänglich betrachtet werden. Stärker bevorzugt kann jedwedes Individuum, das für einen anaphylaktischen Schock durch Einwirken von Nahrungsmittelallergenen, Giftallergenen oder Gummiallergenen empfänglich ist, gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zur Bereitstellung über jedweden Weg formuliert werden. Bevorzugt werden die Zusammensetzungen zur Injektion, Ingestion oder Inhalation formuliert.
Es ist beabsichtigt, dass hier beschriebene Modifizierungen und Variationen der Verfahren und Zusammensetzungen innerhalb des Umfangs der folgenden Ansprüche liegen.
Beispiele
Materialien und Verfahren.
Für allgemeine Verfahren, die zur Expression von Proteinen in Mikroorganismen verwendet werden, siehe Ausubel et al. (vorstehend) und Sambrook et al. (vorstehend). Zusätzlich sind Expressionsvektoren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung häufig von kommerziellen Quellen verfügbar (siehe zum Beispiel Clontech, Palo Alto, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega Corporation, Madison, WI; New England Biolabs, Beverly, MA).
Die folgenden Experimente beschreiben die Verkapselung von Allergenen in Bakterien zur Verwendung als ein Bereitstellungsvehikel und/oder Adjuvans bei Immuntherapie gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung. Rekombinante Erdnussproteine als Allergene (Ara h 1, Ara h 2 und Ara h 3; Burks et al. J Allergy Clin Immunol. 88(2): 172-9, 1991; Burks et al. J Allergy Clin Immunol. 90(6 Pt 1): 962-9, 1992; Rabjohn et al. J Clin Invest. 103(4): 535-42, 1999) wurden in E. coli BL21-Zellen durch Transformieren der Bakterienzellen mit cDNA-Klonen, die die Proteine codierten (siehe Anhang B; Sequenzen, die in pET24, Novagen, Madison, WI kloniert sind), hergestellt. Die transformierten Zellen wurden dann in C3H/HEJ-Mäuse injiziert, um zu bestimmen, ob die Allergen-exprimierenden E. coli eine Immunreaktion hervorrufen.
Beispiel 1. Verfahren zum Töten von Allergen-produzierenden E. coli.
Mehrere Verfahren zum Töten von Allergen-produzierenden E. coli wurden getestet. Bevorzugt denaturiert oder proteolysiert das Verfahren zum Töten der Bakterien das rekombinante Allergen(e), das durch die Bakterien hergestellt wird, nicht. Als nicht einschränkende Beispiele wurden E. coli durch Hitze (bei Temperaturen im Bereich von 37°C bis 95°C), durch die Verwendung von Ethanol (0,1% bis 10%) und durch die Verwendung von Lösungen, die Iod enthielten (0,1% bis 10%), getötet. Das Überleben wurde durch Aufbringen von 100 μl der Zellen auf die passenden Agarplatten und darauf folgendes Zählen der resultierenden Kolonien bestimmt. Das am besten reproduzierbare Verfahren war Töten durch Hitze. Deshalb ist das bevorzugte Verfahren zum Töten von Allergen-produzierenden E. coli die Zellen bei 60°C für 20 Minuten zu inkubieren, was in einer Todesrate von 100% resultiert (d.h. es wurden keine Kolonien gebildet; siehe Figur Nr.).
Beispiel 2. Wachstum der Bakterien.
Das folgende Protokoll wurde für die Herstellung von Allergen-produzierenden E. coli-Zellen zur Impfung von Mäusen entwickelt.
TAG 1
Fünf Milliliter (ml) von flüssigen Kulturen von LB (Luria-Bertani-Nährlösung), die Kanamycin (30 Mikrogramm/ml pro jeder verwendeten Zelllinie) enthielten, wurden in sterilen Röhrchen oder Kolben mit 50 ml hergestellt. Die Kulturen wurden mit ungefähr 10 Mikroliter einer gefrorenen Vorratszubereitung der gewünschten Bakterienzelllinie, die die gewünschten Expressionsvektoren enthielt, angeimpft. Die angeimpften Kulturen wurden mit Schütteln über Nacht bei 37°C inkubiert.
TAG 2
Am darauf folgenden Morgen wurden 100 ml der flüssigen LB (500 ml-Erlenmeyerkolben), die Kanamycin (30 Mikrogramm/ml) enthielt, unter Verwendung eines 1 ml-Aliquots der 5 ml-Kultur, die seit dem vorherigen Tag wuchs, angeimpft. (Die verbleibenden 4 ml der Kultur wurden eingefroren. Gegebenenfalls können die verbleibenden 4 Milliliter der Kultur bei 4°C für mehrere Wochen zum Animpfen von anschließenden Kulturen gelagert werden). Die angeimpften Kulturen wurden mit Schütteln bei 37°C inkubiert, bis die optische Dichte der Lösung, die bei 600 nm (OD₆₀₀) gemessen wurde, ungefähr 0,6 bis 0,9 erreicht hatte.
TAG 3
Zur Induzierung der Produktion von rekombinanten Proteinen wurden die Kulturen vom vorherigen Tag durch die Zugabe von Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) aus einer 1 M Vorratszubereitung in einer Endkonzentration von 1 mM (100 Mikroliter 1 M IPTG pro 100 ml Kultur) induziert, als die OD₆₀₀ der Kultur ungefähr 0,6 bis 0,9 erreicht hatte. Die induzierten Kulturen wurden über Nacht inkubiert.
TAG 4
1,4 ml der Kultur vom vorherigen Tag wurden in Aliquote in jeweils fünf 1,5 ml-Mikrofuge-Röhrchen für jede Kultur aufgeteilt und durch Hitze bei 60°C in einem Wasserbad für 20 Minuten getötet. Die Röhrchen wurden bei 16.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Die Pellets wurden mit 1 X Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) gewaschen und bei 16.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Wieder wurde der Überstand verworfen und die Pellets wurden wieder in 250 Milliliter 1 X PBS suspendiert. Die wieder suspendierten Pellets der selben ursprünglichen Proben wurden kombiniert. Die OD₆₀₀ wurde für jede Probe bestimmt und es wurde unter Verwendung von 1 X PBS auf die gewünschte OD₆₀₀ verdünnt.
Beispiel 3. Produktion und Freisetzung des Allergens.
Freisetzung des Allergens durch Bakterien, die durch Hitze getötet wurden.
Um zu bestimmen, ob die Zellen nach dem Töten durch Hitze intakt geblieben sind, haben wir die Menge des Allergens gemessen, die in die Medien freigesetzt wurde. Ein Dot-Blot-Test wurde entwickelt, der als Kontrollen gereinigte rekombinante Allergene, die auf einen Filter in bekannten Konzentrationen aufgebracht wurden, und Serum-IgE von gegen Erdnüsse empfindlichen Patienten verwendete. Der Test wies die Menge an Allergen, die in 100 Mikroliter Überstand nach dem Pelletieren der durch Hitze getöteten Bakterien vorhanden war, nach und quantifizierte diese. Der Level an freigesetztem Allergen variierte und war vom Expressionsvektor und dem getesteten Protein abhängig. Im Allgemeinen wurde mehr Ara h 2 freigesetzt als Ara h 1 und Ara h 3 (Ara h 2 >> Ara h 1 > Ara h 3).
Produktion des Allergens.
Um die Mengen des Allergens in E. coli zu messen, entwickelten wir einen Immunoblot-Test, der eine sechs-Histidin-Markierung (HIS-Markierung), die auf allen von unseren gereinigten rekombinanten Allergenen vorhanden ist, und einen HIS-Markierungs-Antikörper verwendete, um eine Standardkurve zu erstellen, die dann zur Abschätzung der Mengen an produziertem Allergen verwendet werden konnte. Die Menge an Allergen, die auf einer Basis pro Zelle produziert wurde, variierte abhängig davon, welcher Klon getestet wurde. Im Allgemeinen wurde mehr Ara h 3 produziert als Ara h 2 und Ara h 1 (Ara h 3 > Ara h 2 >> Ara h 1).
Unsere besten Abschätzungen für Mengen an Allergen, die in 100 μl einer Impfkultur von E. coli mit einer O.D. von 2,0 bereitgestellt wurden, variierten von etwa 1 μg Ara h 1 bis etwa 20 μg Ara h 3.
2 ist ein Beispiel einer Standardkurve, die für Ara h 2 erzeugt wurde. Die optische Dichte (O.D.) des HIS-markierten Ara h 2-Allergens wurde dann aus einem Immunoblot, wobei unterschiedliche Konzentrationen von E. coli-Extrakt an SDS-PAGE-Gelen elektrophoretisiert worden waren, bestimmt. Die O.D. des Allergens wurde dann zur Abschätzung der Menge des durch diesen Extrakt produzierten Proteins verwendet.
Beispiel 4. Immunreaktion von Mäusen.
Das folgende Protokoll wurde zur Bestimmung der Immunreaktion von Mäusen verwendet, in welche Allergen-produzierende Bakterien gespritzt wurden. Blut wurde aus der Schwanzvene von jeder verwendeten Maus vor der ersten Injektion abgenommen. Genügend Blut wurde für den Antikörper-ELISA für jedes Allergen und für E. coli-Proteine abgenommen. Am Tag null wurden in jede Maus 100 Mikroliter der getöteten E. coli-Proben subkutan in die linke hintere Flanke injiziert. In die Mäuse wurde ein zweites Mal am Tag 14 unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie am Tag null injiziert. Am Tag 21 wurde eine zweite Blutprobe von jeder Maus abgenommen. Die Blutproben vom Tag 0 und Tag 21 wurden auf IgG1- und IgG2a-Antikörper gegen entweder Ara h 1, Ara h 2 oder Ara h 3 durch einen ELISA-Test getestet.
Mäuse, in welche E. coli injiziert wurden, die Ara h 1 produzieren, ergaben keine nachweisbaren Levels von jedwedem Immunglobulin gegen das Ara h 1-Allergen und deshalb sind diese Daten nicht gezeigt. Ohne Einschränkung auf eine Theorie vermuten wir, dass dies aufgrund der relativ kleinen Mengen von Ara h 1, die durch diese Zellen produziert werden, sein kann (siehe vorstehende Erörterung). Mäuse, in welche E. coli injiziert wurden, die Ara h 2 produzieren, enthielten relativ hohe Levels an IgG1 und IgG2a. Wieder ohne Einschränkung auf die Ursache vermuten wir, dass dies aufgrund der Menge an Ara h 2, die von diesen Zellen freigesetzt wird, sein kann (siehe vorstehende Erörterung). Mäuse, in welche E. coli injiziert wurden, die Ara h 3 produzieren, enthielten relativ hohe Levels an IgG2a (was auf eine Reaktion vom Th1-Typ hinweist) und riefen relativ niedrige Levels an IgG1 hervor (was auf eine Reaktion vom Th2-Typ hinweist).
Interpretation der Ergebnisse.
Die vorliegenden Daten sollten vorsichtig interpretiert werden. Die Daten in den Figuren stellen nur O.D.-Levels dar und stellen keine absoluten Mengen an Immunglobulin dar. Deshalb sollte man bei Vergleichen zwischen Gruppen in Betracht ziehen, dass die Daten als O.D. dargestellt sind. Jedoch weist der allgemeine Trend daraufhin, dass zum Beispiel mehr Mäuse eine IgG2a-Reaktion auf Ara h 3 zeigten, als Mäuse eine IgG1-Reaktion auf Ara h 3 zeigten. Anhang A

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Claims

harmazeutische Zusammensetzung, umfassend tote E. coli Mikroorganismen, die ein Protein als Allergen produziert haben, und des Weiteren umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, worin die pharmazeutische Zusammensetzung die allergischen Immunreaktionen in Subjekten reduziert, die gegen das Protein als Allergen allergisch sind, worin das Protein als Allergen in den Mikroorganismen verkapselt ist und worin die Mikroorganismen unter Verwendung von Hitze oder Chemikalien getötet worden sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Protein als Allergen ein anaphylaktisches Allergen ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, worin sich das Protein als Allergen in Nahrungsmitteln, Insektengiften oder Gummi findet.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, worin sich das Protein als Allergen in einem Nahrungsmittel findet, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Erdnüssen, Milch, Eiern, Meeresfrüchten, Nüssen, Milchprodukten und Früchten.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, worin sich das Protein als Allergen in Bienengift findet.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, worin das Protein als Allergen Ara h 1, Ara h 2, oder Ara h 3 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, worin das Protein als Allergen so modifiziert ist, dass es eine reduzierte Fähigkeit aufweist, IgE-Antikörper zu binden oder zu vernetzen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin das modifizierte Protein als Allergen eine reduzierte Zahl an IgE-Bindungsstellen aufweist, im Vergleich zum unmodifizierten Protein als Allergen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin das Protein als Allergen modifiziert ist, um die IgE Bindungsstellen zu reduzieren oder zu eleminieren.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, worin das Protein als Allergen nicht sekretiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, worin das Protein als Allergen in das Periplasma sekretiert ist.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend tote E. Coli Mikroorganismen, die ein Protein als Allergen produziert haben, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Allergie in einem Subjekt, empfänglich für das Protein als Allergen, worin das Protein als Allergen in die Mikroorganismen verkapselt ist und worin die Mikroorganismen unter Verwendung von Hitze oder Chemikalien getötet worden sind.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend tote E. Coli Mikroorganismen, die ein Protein als Allergen produziert haben, und des Weiteren umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, worin das Protein als Allergen so modifiziert ist, dass es eine reduzierte Fähigkeit aufweist, IgE Antikörper zu binden oder zu vernetzen, worin das Protein als Allergen innerhalb der Mikroorganismen verkapselt ist und worin die Mikroorganismen unter Verwendung von Hitze oder Chemikalien getötet worden sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin das Protein als Allergen ein anaphylaktisches Allergen ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 13 bis 14, worin sich das Protein als Allergen in Nahrungsmitteln, Insektengiften oder Gummi findet.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, worin sich das Protein als Allergen in Nahrungsmitteln findet, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Erdnüssen, Milch, Eiern, Meeresfrüchten, Nüssen, Milchprodukten und Früchten.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 16, worin sich das Protein als Allergen in Bienengift findet.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 16, worin das Protein als Allergen Ara h 1, Ara h 2, oder Ara h 3 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 18, worin das modifizierte Protein als Allergen eine reduzierte Anzahl an IgE Bindungsstellen aufweist, im Vergleich zum unmodifizierten Protein als Allergen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 19, worin das Protein als Allergen modifiziert ist, um die IgE Bindungsstellen zu reduzieren oder zu eliminieren.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 20, worin das Protein als Allergen nicht sekretiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 20, worin das Protein als Allergen in ein Periplasma sekretiert ist.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend tote E. Coli Mikroorganismen, die ein Protein als Allergen produzieren oder produziert haben, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Allergie in einem Subjekt, das für das Protein als Allergen empfänglich ist, worin das Protein als Allergen so modifiziert ist, dass es eine reduzierte Fähigkeit aufzuweist, IgE Antikörper zu binden oder zu vernetzen, worin das Protein als Allergen in Mikroorganismen verkapselt ist und worin die Mikroorganismen unter Verwendung von Hitze oder Chemikalien getötet worden sind.