DE60008111T2

DE60008111T2 - Verwendung von beta-naphtaquinon derivaten zur herstellung eines arzneimittels mit einem hemmenden effekt auf die glutamatfreisetzung durch das gehirn

Info

Publication number: DE60008111T2
Application number: DE60008111T
Authority: DE
Inventors: Maurice Israel; Jordi Molgo; Christian Bloy; Cesar Mattei
Original assignee: MATTEI CAESAR; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: MATTEI CAESAR; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1999-07-21
Filing date: 2000-07-21
Publication date: 2004-12-02
Anticipated expiration: 2020-07-22
Also published as: DE60008111D1; DK1196176T3; ES2215716T3; US20070225237A1; US20020115617A1; DK1196176T5; US20070225236A1; WO2001005404A1; EP1196176B1; CA2368850A1; US20070225235A1; CA2368850C; PT1196176E; FR2796552A1; EP1196176A1; ATE268599T1; US7572774B2

Description

Neue Verwendung von Beta-Naphthochinon-Derivaten und deren Salzen zur Herstellung von Arzneimitteln mit einer Hemmwirkung auf die Glutamatfreisetzung im Gehirn.
Die Erfindung hat zum Gegenstand eine neue Verwendung von Beta-Naphthochinon-Derivaten und ihren Salzen zur Herstellung von Arzneimitteln, die eine Hemmwirkung auf die Glutamatfreisetzung im Gehirn haben.
Das Glutamat ist der hauptsächliche Neurotransmitter im Zentralnervensystem von Säugetieren.
Jedoch ist seine übermäßige Ansammlung im Extrazellularraum des Gehirns für die Neuronen toxisch, was zu der Annahme geführt hat, daß es einen kausalen Faktor einer großen Anzahl von neurologischen Krankheiten darstellt, wie Epilepsie, Huntington-Krankheit und in verschiedenen Beeinträchtigungen, die mit den schädlichen Effekten zusammenhängen, die ihren Grund in einem Überschuß von Glutamat haben, das in Folge von zerebralen Unfällen aus vaskularem, traumatischen oder anderem Ursprung freigesetzt wird.
Die Erfinder haben bestimmte Beta-Naphthochinon-Verbindungen, die als Vasoprotektor-Arzneimittel bekannt sind, untersucht und dabei gezeigt, daß diese in unerwarteter Weise Inhibitorwirkungen auf die Freisetzung von Glutamat zeigen.
Die Erfindung sieht daher eine neue Verwendung von Beta-Naphthochinon-Derivaten zur Herstellung von Arzneimitteln mit Inhibitorwirkung auf die Glutamatfreisetzung durch das Gehirn vor, wobei diese Derivate der Formel (I) entsprechen:
worin R eine Gruppe -NH-CO-NH₂, -NH-CO-CH₃ oder -OH bedeutet, und deren Glucuronid-Derivate, wobei die entsprechenden Verbindungen der Formel (II) entsprechen:
sowie deren Additionssalzen mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren.
Die Erfindung sieht ganz besonders die Verwendung des 2-Semicarbazons des 1,2-Naphthochinons vor, das mit seinem internationalen Freinamen als Naftazon bezeichnet wird, sowie dessen entsprechendes Glucuronid-Derivat, die 1-(1-Hydroxy-2-naphthyl)semicarbazid-1-β-O-glucopyranosiduron-Säure mit den jeweiligen Formeln (III) und (IV):
Zu den Additionssalzen dieser Verbindungen mit Säuren gehören die mit Mineralsäuren oder organischen Säuren gebildeten Salze.
Als Beispiel seien erwähnt Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder auch Ameisensäure, Benzoesäure, Maleinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Oxalsäure, Asparaginsäure und Alcansulfonsäuren.
Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen ist in der Literatur weitgehend beschrieben, beispielsweise in BSM 924 M oder dem Patent FR 2103 504.
Die hiernach in den Beispielen aufgeführten inhibirenden Eigenschaften dieser Verbindungen machen sie besonders geeignet zur Behandlung von neurologischen Krankheiten und Beeinträchtigungen, die mit den nachteiligen Wirkungen des im Überschuß freigesetzten Glutamats zusammenhängen.
Als Beispiel sei erwähnt die Behandlung von Epilepsie, der Huntington-Krankheit, der nachteiligen Effekte, welche die Folge von Glutamatüberschuß sind, der in Folge von zerebralen Unfällen von vaskularen, traumatischen oder anderen Ursprung freigesetzt wird.
Diese Arzneimittel werden besonders oral und durch Injektion verabreicht. Sie liegen vorteilhafterweise in Form von Tabletten, Dragees, Gelatinekapseln, Kapseln, Granulat für die orale Verabreichung öder von Lösungen oder Suspensionen für die Verabreichung durch Injektion vor.
Die Dosis wird jeweils auf den Patienten und den zu behandelnden pathologischen Zustand abgestimmt und beträgt beispielsweise 1 mg bis 100 mg/Tag.
Die Erfindung wird mit weiteren Eigenschaften und Vorteilen erläutert in den folgenden Beispielen, worin auf die 1 und 2 Bezug genommen wird, welche jeweils darstellen:
1 das Schema zur Erläuterung des Protokolls der Messungen der Chemolumineszenz und
2 die spontane Glutamatfreisetzung und die in Funktion der Konzentration an Naftazon (2a) oder seinem Glucuronid-Derivat bewirkte Freisetzung.
Beispiel 1: Untersuchung der Inhibitoreffekte des Naftazons und seines Glucuronid-Derivats auf das Glutamat
A: Untersuchung der Wirkung einer kontinuierlichen Behandlung mit Naftazon während 15 Tagen auf die Glutamatwerte im CSF von normalen Ratten
Man verwendet Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 200 bis 220 g und Swiss-Webster-Mäuse der zwei Geschlechter von 4 bis 8 Wochen.
Man hält die Tiere in den Käfigen in einem gut belüfteten Raum bei 23 bis 24°C während eines Licht-/Dunkelheit-Zyklus von 12 Stunden.
Um die Glutamatwerte im CSF bei den Vergleichstieren oder nach Behandlung mit dem Naftazon zu untersuchen, teilt man die männlichen Ratten in drei Gruppen auf:

– die Gruppe I (n = 8) wird als Vergleich verwendet. Die Ratten dieser Gruppe werden per os während 15 Tagen mit dem gleichen Vehikel versorgt, das zum Löslichmachen des Naftazons verwendet wird, nämlich 1% Methylzellulose, Sigma,
– die Tiere der Gruppen II (n = 5) und III (n = 5) werden per os während 15 Tagen mit jeweils 10 und 100 mg Naftazon pro kg pro Tag versorgt, die in Form eines einzigen Bolus gegeben werden.

Man sammelt das CSF der mit 6% Pentobarbital (i. p.) anästhesierten Ratten, indem man nach den üblichen Protokollen operiert.
Die Tiere werden anschließend enthauptet. Die CSF-Proben werden mit 6000 g während 10 Minuten bei 10°C zentrifugiert.
Man extrahiert den Überstand und trennt den Bodensatz ab, der die Abscheidungen von Blut enthält.
Die Proben werden in 2,5% Trichloressigsäure gehalten und bei –80°C aufbewahrt.
Man verwendet Ether, um die Trichloressigsäure aus den Proben durch Waschen zu entfernen.
Um die Glutamatwerte im CSF zu bestimmen, wurden Messungen der Chemolumineszenz nach dem Protokoll vorgenommen, das in dem in 1 angegebenen Schema beschrieben ist. Die Reaktion beruht auf der Oxidation des Glutamats zu 2-Oxoglutarat unter der Wirkung der Glutamatdeshydrogenase, welche NaDH2 liefert, das unter Verwendung der Chemolumineszenzreaktion von Photobakterium bestimmt wurde.
Die CSF-Proben wurden untersucht, indem man ein bekanntes Volumen der Probe dem Reaktionsmilieu zusetzte, das 250 μl Sucrose (120 mM) im Tris-Puffer (120 mM, pH 7,2), 50 μl des Enzymgemischs NAD, FMN NADH-FMN-Oxydoreductase, Luciferase und GDH und 5 μl n-Decylaldehyd enthielt.
Das Licht, das von der Lumineszenzreaktion ausgesandt wird, die auf die Oxidation des L-Glutamats und die Produktion von NADH folgt, wird durch eine Photomultiplier-Einheit nachgewiesen, registriert und kalibriert durch Vergleich mit dem von einem Standardglutamat ausgesandten Licht.
Die statistische Analyse der Daten wird durchgeführt, indem man den Student-t-Test für die nicht paarweise zusammengestellten Proben verwendet. Die Werte sind ausgedrückt als Mittelwert +/– SEM. n = Anzahl der Tiere oder der vorgenommenen Untersuchungen. Die Daten werden als signifikant unterschiedlich gegenüber den Vergleichen angesehen bei P < 0,05.
Die Vergleichsratten (Gruppe I), welche das Vehikel Methylzellulose während 15 Tagen erhielten, haben einen Glutamatgehalt im CSF von 16 bis 34 nMol ml^–1 mit einem Mittelwert von 22,1 +/– 6,3 nMol ml^–1 (n = 8).
Die tägliche Behandlung der Ratten (Gruppen II und III) während 15 Tagen mit einer Dosis von 10 oder 100 mg/kg Naftazon zeigt, daß der Glutamatgehalt im CSF der zwei Gruppen von Ratten jeweils 8,1 ± 1,8 (n = 5) und 10,8 ± 3,3 nMol ml^–1 (n = 5) ist.
Diese Ergebnisse zeigen, daß der Glutamatgehalt im CSF der mit den zwei Dosen Naftazon behandelten Ratten signifikant verringert ist (P = 0,001 bzw. P = 0,004) mit Bezug auf die Vergleiche. Außerdem beobachtet man keinen signifikanten Unterschied im Glutamatgehalt in dem CSF zwischen den zwei Gruppen von Ratten, die mit dem Naftazon behandelt wurden, was zeigt, daß der Effekt des Arzneimittels nicht dosisabhängig ist.
B: Untersuchung der Wirkungen des Naftazons und seines Glucuronid-Derivats auf die Glutamatfreisetzung aus Synaptosomen von Mäusegehirnen
Um die Synaptosomen von moosigen Fasern (fibres moussues) zu gewinnen, enthauptet man Swiss-Webster-Mäuse und entnimmt rasch das Kleinhirn. Man wäscht kleine Stücke des Gewebes (1 bis 2 mm³) in 100 ml einer physiologischen Standardlösung für Säugetiere, die enthält (mM): NaCl 136; KCl 5,6; MgCl₂ 1,2; CaCl₂ 2,2; Glucose 5,5; NaHCO₃ 7,5; Puffer NaHPO₄/Na₂HPO₄ 1,2.
Während 10 Minuten leitet man einen Sauerstoffstrom hindurch. Um die Stücke zu zerteilen, saugt man hin und her an mit einer 1 ml-Pipette.
Man verdünnt das erhaltene Homogenisat in 2 ml einer Krebs-Lösung für Säugetiere und filtriert durch ein Nylon^®-Gewebe (50 μm Maschenweite).
Man fängt das Filtrat auf und läßt während 30 bis 45 Minuten durch Schwerkraft absetzen.
Die von moosigen glutamatergischen Fasern herkommenden Synaptosomen setzen sich wegen ihres großen Umfangs mit der Nuklearfraktion ab. Der Überstand wird verworfen und der Bodensatz wird in 1 ml einer Standardlösung wieder suspendiert.
Man weist die Glutamatfreisetzung der Synaptosomen mit der zur Bewertung im CSF verwendeten Methode nach.
Die 2A und 2B zeigen jeweils die Wirkungen des Naftazons (bei Konzentrationen von 0,5 bis 50 μM) und seines Glucuronid-Derivats auf die spontane Freisetzung von Glutamat (Kurve -o-) und auf jene, die durch Depolarisation bewirkt wird (Kurve
).
Jeder Punkt in A und B gibt den Mittelwert I.S.E.M. von 3 Messungen an, die dreifach durchgeführt wurden. In A wird das spontan freigesetzte Glutamat kontinuierlich während 1 Stunden Exposition mit dem untersuchten Arzneimittel und mit den Vergleichsproben verglichen. Die Freisetzung des Glutamats durch Depolarisation wird bestimmt nach einer Exposition von 1 Stunde mit dem untersuchten Arzneimittel und verglichen mit den Vergleichsproben. Vor den Messungen werden die Arzneimittel eine Stunde lang mit Synaptosomen-Aliquots inkubiert.
Die Glutamatfreisetzung als Antwort auf die Depolarisation, welche durch ein Milieu mit hohem Gehalt an K⁺ (30 mM) mit einem Gehalt an Ca²⁺ (5 mM) induziert wird, wird durch das Naftazon bei den untersuchten Konzentrationen nicht signifikant beeinflußt.
Dagegen verringert, wie 2A zeigt, das Naftazon die spontane Freisetzung von Glutamat aus Synaptosomen. Man beobachtet bereits die Inhibitorwirkung des Naftazons auf die spontane Freisetzung von Glutamat bei der geringsten Konzentration an dem verwendeten Arzneimittel (0,5 μm). Diese Wirkung ist maximal bei der Konzentration 25 μM.
Es scheint, daß höhere Konzentrationen den Inhibitoreffekt nicht mehr erhöhen. Wenn man die Wirkung des Glucuronid-Derivats auf die spontane Freisetzung und auf diejenige von K⁺ Hervorgerufene bewertet, stellt man fest, daß das Arzneimittel die spontane Freisetzung von Glutamat in dem Intervall der verwendeten Konzentrationen nicht verringert.
Dagegen verringert, wie 2B zeigt, das Glucuronid-Derivat in dosis-abhängiger Weise die von einem Milieu mit hohem K⁺-Gehalt (30 mM) und einem Gehalt an Ca²⁺ (5 mM) induzierte Freisetzung.
Die maximale Verringerung (etwa 60%) wird bei der höchsten Konzentration an geprüftem Arzneimittel (32 μm) beobachtet.
Beispiel 2: Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen
Man arbeitet nach den klassischen Methoden und stellt so Tabletten her, welche enthalten:

– Naftazon: 10 mg
– Exzipienz qsp für 100 mg oder injizierbare Lösungen, welche enthalten:
– Naftazon: 5 mg
- steriles Wasser qsp: 2 ml

Claims

Verwendung von Beta-Naphthochinon-Derivaten zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von neurologischen Krankheiten und Beeinträchtigungen, die mit den nachteiligen Wirkungen von überschüssig freigesetztem Glutamat zusammenhängen, wobei diese Verbindungen sind: (i) entweder Verbindungen entsprechend der Formel (I)
worin R eine Gruppe NH-CO-NH₂, -NH-CO-CH₃, oder -OH bedeutet, (ii) oder Glucuronid-Derivate entsprechend der Formel (II)
(iii) oder deren jeweilige Additionssalze mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen das 2-Semicarbazon von 1,2-Naphthochinon, dessen entsprechendes Glucuronid-Derivat, die 1-(1-Hydroxy-2-naphthyl)-semicarbazid-1-β-O-glucopyranosiduron-Säure mit den Formeln (III) bzw. (IV)
oder deren jeweilige Additionssalze mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren sind.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Salze mit Mineralsäuren oder organischen Säuren gebildet sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Epilepsie, Huntington-Krankheit, nachteiligen Wirkungen in Folge eines Überschusses von Glutamat, das in Folge von zerebralen Zwischenfällen von vaskulärem oder traumatischem Ursprung freigesetzt ist.
Verwendusng nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Arzneimittel oral oder durch Injektion verabreicht werden.