DE4331570A1

DE4331570A1 - Method and device for optically exciting an energy state in a sample at a sample point with high positional resolution

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Publication number: DE4331570A1
Application number: DE4331570A
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-08-17
Filing date: 1993-09-16
Publication date: 1995-03-02
Anticipated expiration: 2013-09-17
Also published as: DE4331570C2

Abstract

The invention relates to a device for optically exciting an energy state in a sample 4 at a sample point 3 having high positional resolution, having a punctiform light source 1, an objective 2 which focusses the excitation light, which comes from the punctiform light source 1, in order to excite the energy state, onto the sample point 3 to be measured, as well as a corresponding method. The lateral resolution is improved in that the excitation is performed by interaction of at least two light components of different light properties, and the beam axes of the light components are arranged mutually offset such that the focal intensity distributions of the light components at the sample point 3 are mutually laterally shifted and overlap at their main maxima.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum optischen Anregen eines Energiezustandes einer Probe in einem Probenpunkt mit hoher Ortsauflösung, bei dem das Anregungslicht einer Punktlichtquelle auf den zu messenden Probenpunkt fokussiert wird und dort den Energiezustand anregt.The invention relates to a method for optically exciting a Energy state of a sample in a sample point with high Spatial resolution at which the excitation light of a point light source is focused on the sample point to be measured and there the Stimulates energy state.

Ferner betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum optischen Anregen eines Energiezustandes einer Probe in einem Probenpunkt mit hoher Ortsauflösung, mit einer Punktlichtquelle, mit einem Objektiv, das das von der Punktlichtquelle kommende Anregungslicht zum Anregen des Energiezustandes auf den zu messenden Probenpunkt einer im Fokalbereich des Objektives anordenbaren Probe fokussiert.The invention further relates to a device for optical Excitation of an energy state of a sample in a sample point with high spatial resolution, with a point light source, with a Lens that comes from the point light source Excitation light to excite the state of energy towards the measuring sample point in the focal area of the objective orderable sample focused.

Ein solches Verfahren und eine solche Vorrichtung sind aus der Praxis bekannt. Sie finden ihre Anwendung zum Beispiel bei Mikroskopen, insbesondere aber bei Rastermikroskopen, da dort einzelne Probenpunkte abgetastet und gemessen werden. Mit einem solchen Rastermikroskop kann die Probe dreidimensional vermessen werden. Verwendet werden fluoreszierende oder phosphoreszierende Proben. Ferner können ein solches Verfahren und eine solche Vorrichtung zur Definition von Punkten in optischen bzw. elektronischen Speichermedien verwendet werden.Such a method and such a device are known from the Known practice. You can find their application for example at Microscopes, but especially with scanning microscopes, because there individual sample points can be scanned and measured. With a Such a scanning microscope can measure the sample three-dimensionally become. Fluorescent or phosphorescent are used Rehearse. Furthermore, such a method and such Device for defining points in optical or electronic storage media are used.

Nachteilig an einer solchen Vorrichtung und einem solchen Verfahren gemäß dem Stand der Technik ist, daß die laterale Auflösung begrenzt ist, so daß eine feinere Unterteilung der Rasterung nicht sinnvoll ist.A disadvantage of such a device and such The method according to the prior art is that the lateral Resolution is limited, so that a finer division of the Grid is not useful.

Es ist bekannt, daß bei Rastermikroskopen die Auflösung dadurch verbessert werden kann, daß das von der Probe emittierte Licht punktförmig auf den Detektor abgebildet wird. Dies kommt dadurch zustande, daß in diesem Fall zwei Punktabbildungsfunktionen die Abbildung im Rastermikroskop bestimmen: die Anregungspunkt- Abbildungsfunktion, welche die Intensitätsverteilung des Anregungslichtes im Fokalbereich des Objektives angibt und aus quantenmechanischer Sicht die Wahrscheinlichkeit quantifiziert, mit der ein Beleuchtungsphoton in einem bestimmten Punkt des Fokalbereiches anzutreffen ist, und die Detektions- Abbildungsfunktion, welche die Abbildung des Probenlichtes in den Punktdetektor angibt und aus quantenmechanischer Sicht die Wahrscheinlichkeit quantifiziert, mit der ein aus dem Fokalbereich emittiertes Photon in den Punktdetektor gelangt. Da sowohl Beleuchtung und Detektion stattfinden müssen, ist die Punktabbildungsfunktion eines konfokalen Fluoreszenz- Rastermikroskopes das Produkt aus beiden Wahrscheinlichkeitsverteilungen, d. h. aus der Anregungspunkt- Abbildungsfunktion und der Detektionspunkt-Abbildungsfunktion. Die Produktbildung führt zu einem etwa 40% schmaleren Hauptmaximum der konfokalen Punktabbildungsfunktion, verglichen mit einem nicht konfokal angeordneten Mikroskop. Dies entspricht einer höheren Auflösung des konfokalen Mikroskops und bewirkt die Diskriminierung aller Punkte, die sich nicht in der unmittelbaren Umgebung des Fokus befinden. Letzteres ist Voraussetzung für die Erstellung dreidimensionaler Bilder im Rasterverfahren.It is known that the resolution of scanning microscopes can be improved that the light emitted by the sample is mapped onto the detector at a point. This is because of it state that in this case two point mapping functions Determine the image in the scanning microscope: the excitation point Mapping function, which the intensity distribution of the Indicates excitation light in the focal area of the lens and off quantum mechanical view quantifies the probability with which a lighting photon in a certain point of the Focal area and the detection Imaging function which shows the imaging of the sample light in indicates the point detector and from a quantum mechanical point of view the Quantifies probability with which one from the Focal area emitted photon reaches the point detector. There Both lighting and detection must take place Point mapping function of a confocal fluorescence Scanning microscope the product of both Probability distributions, d. H. from the excitation point Mapping function and the detection point mapping function. The product formation leads to an approximately 40% narrower Main maximum of the confocal point mapping function, compared with a non-confocal microscope. This matches with a higher resolution of the confocal microscope and causes the discrimination of all points that are not in the immediate vicinity of the focus. The latter is Prerequisite for the creation of three-dimensional images in the Screening process.

Im Hinblick auf diesen Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, das gattungsgemäße Verfahren und die gattungsgemäße Vorrichtung derart zu verbessern, daß eine bessere laterale Auflösung erzielt wird.In view of this prior art, the invention Task based on the generic method and Generic device to improve such that a better lateral resolution is achieved.

Hinsichtlich des Verfahrens wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der Energiezustand der Probe in dem Probenpunkt durch Zusammenwirken von wenigstens zwei in dem Anregungslicht enthaltenen Lichtanteilen angeregt wird, die sich durch wenigstens eine Lichteigenschaft voneinander unterscheiden, und daß die Lichtstrahlachsen der Lichtanteile derart gegeneinander versetzt werden, daß die fokalen Intensitätsverteilungen der Lichtanteile im Probenpunkt in ihren Hauptmaxima überlappend, lateral gegeneinander verschoben werden. With regard to the method, this object is achieved according to the invention solved in that the energy state of the sample in the Sample point by interaction of at least two in the The light contained in the excitation light is excited by at least one property of light from each other differ, and that the light beam axes of the light components are offset against each other in such a way that the focal Intensity distributions of the light components in the sample point in their Main maxima overlapping, laterally shifted against each other become.

Hinsichtlich der Vorrichtung wird die Aufgabe dadurch erfindungsgemäß gelöst, daß das Anregungslicht der Punktlichtquelle wenigstens zwei Lichtanteile umfaßt, die sich durch wenigstens eine Lichteigenschaft voneinander unterscheiden und die dazu geeignet sind, durch gemeinsames Wirken den Energiezustand der Probe anzuregen, und daß die Strahlachsen der Lichtanteile derart gegeneinander versetzt angeordnet sind, daß die fokalen Intensitätsverteilungen der Lichtanteile im Probenpunkt in ihren Hauptmaxima überlappend, lateral gegeneinander verschoben sind.With regard to the device, the task becomes solved according to the invention that the excitation light Point light source comprises at least two light components, which are differ from each other by at least one light property and which are suitable, by working together To excite the energy state of the sample and that the beam axes of the Parts of the light are arranged offset from one another in such a way that the focal intensity distributions of the light components in the Sample point overlapping in their main maxima, laterally are shifted against each other.

Der Begriff Lichteigenschaft ist in dieser Anmeldung im weiten Sinne zu verstehen. Es ist damit jede das Licht charakterisierende Eigenschaft gemeint, beispielsweise Wellenlänge, Polarisation, Zeitpunkt des Verweilens eines Lichtpulses an einem bestimmten Punkt.The term light property is broad in this application To understand the senses. It is each the light characteristic characteristic meant, for example Wavelength, polarization, time of dwelling Light pulse at a certain point.

Zum Versetzen der Strahlachsen der Lichtanteile kann erfindungsgemäß ein Versetzungselement vorgesehen sein. Ein solches Versetzungselement kann variabel sein, so daß die Versetzung variiert und damit die Auflösung verbessert werden kann. Als Versetzungselement kann ein Mikrometertisch verwendet werden.Can be used to offset the beam axes of the light components According to the invention, a displacement element can be provided. A such displacement element can be variable, so that the Dislocation varies and thus the resolution can be improved can. A micrometer table can be used as the displacement element become.

Durch die erfindungsgemäße Anordnung der Punktlichtquelle mit wenigstens zwei Lichtanteilen, die sich durch wenigstens eine Lichteigenschaft voneinander unterscheiden und die den Energiezustand der Probe, dessen Fluoreszenz oder Phosphoreszenzübergang gemessen werden soll, durch gemeinsames Wirken anregen, wird erreicht, daß an dem zu messenden Probenpunkt die Wahrscheinlichkeit der Anregung des Energiezustandes des Probenpunktes durch das Produkt der Intensität der Lichtanteile verschiedener Lichteigenschaften gegeben ist. Die Punktabbildungsfunktion eines solchen Mikroskops ist durch das Produkt der fokalen Intensitätsverteilungen gegeben, die zu den Lichtanteilen unterschiedlicher Lichteigenschaften gehören. Durch die Produktbildung werden Probenpunkte, die sich nicht in unmittelbarer Umgebung des Fokus befinden, diskriminiert, was eine dreidimensionale Rasterung allein mit Hilfe des Anregungslichtes ermöglicht. Da die Lichtstrahlachsen der Lichtanteile mittels der Versetzungsanordnung derart gegeneinander versetzt werden, daß die fokalen Intensitätsverteilungen der Lichtanteile im Probenpunkt in ihren Hauptmaxima überlappend, lateral gegeneinander verschoben werden, ergibt sich die Anregungspunktabbildungsfunktion aus dem Produkt der lateral verschobenen Intensitätsverteilungen mit unterschiedlichen Lichteigenschaften. Durch diese Produktbildung wird das Hauptmaximum der Anregungspunktabbildungsfunktion in lateraler Richtung verschmälert und zwar entlang der Achse des Versatzes. Somit wird eine bessere laterale Auflösung erzielt.Due to the arrangement of the point light source according to the invention at least two light components, which are divided by at least one Differentiate light properties from each other and that Energy state of the sample, its fluorescence or Phosphorescence transition to be measured by common To stimulate action, it is achieved that on the thing to be measured Sample point the probability of excitation of the Energy state of the sample point through the product of the Intensity of the light components of different light properties given is. The point mapping function of such Microscope is the product of the focal Given intensity distributions that contribute to the light components belong to different light properties. Through the Product formation will be sample points that are not in immediate area of focus are discriminated against what a three-dimensional grid using only the Excitation light enables. Since the light beam axes of the Light components by means of the displacement arrangement in this way offset against each other that the focal Intensity distributions of the light components in the sample point in their Main maxima overlapping, laterally shifted against each other the excitation point mapping function results from the Product of the laterally shifted intensity distributions with different light properties. Through this product formation becomes the main maximum of the excitation point mapping function in lateral direction narrowed along the axis of the Offset. A better lateral resolution is thus achieved.

Die Anregung des Energiezustandes der Probe durch Zusammenwirken von mindestens zwei Lichtanteilen mit unterschiedlichen Lichteigenschaften kann sowohl über einen Zwischenzustand, als auch in direkter Anregung (resonante oder nicht resonante Zweiphotonenabsorption) des Endzustandes erzielt werden. Gängige Fluoreszenzfarbstoffe zur Markierung biologischer Proben oder auch Phosphoreszenzfarbstoffe lassen sich in diesem Zweiphotonenmodus anregen.The excitation of the energy state of the sample through interaction of at least two light components with different Light properties can be both about an intermediate state, as well also in direct excitation (resonant or non-resonant Two-photon absorption) of the final state can be achieved. Common Fluorescent dyes for labeling biological samples or Phosphorescent dyes can also be used in this Excite two-photon mode.

Bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Unteransprüchen offenbart.Preferred embodiments of the invention are in the Subclaims disclosed.

Vorteilhafterweise kann eine Lichteigenschaft, in der sich die Lichtanteile des Anregungslichtes voneinander unterscheiden, die Wellenlänge sein. Dabei ist es günstig, wenn der Unterschied in den Wellenlängen der Lichtanteile wenigstens 1 nm beträgt.Advantageously, a light property in which the Differentiate light components of the excitation light from each other Wavelength. It is beneficial if the difference in the wavelengths of the light components is at least 1 nm.

Auch kann eine Lichteigenschaft, in der sich die Lichtanteile des Anregungslichtes voneinander unterscheiden, die Polarisation sein. Die Lichtanteile sind dann vorzugsweise orthogonal oder nahezu orthogonal zueinander polarisiert. Ein Unterschied in der Polarisation der Lichtanteile führt dann zu der gewünschten Verbesserung in der lateralen Auflösung, wenn die Übergangsmatrixelemente, die die Übergänge zwischen den Energiezuständen der Probe beschreiben, polarisationsabhängig sind. Dabei können die Wellenlängen der Lichtanteile des Anregungslichtes, je nachdem, welche Probe verwendet wird, gleich oder voneinander verschieden sein.Can also be a light property in which the light components of the excitation light differ from each other, the polarization his. The light components are then preferably orthogonal or polarized almost orthogonally to each other. A difference in the Polarization of the light components then leads to the desired one Improvement in lateral resolution when the Transition matrix elements that represent the transitions between the Describe the energy states of the sample, depending on the polarization are. The wavelengths of the light components of the Excitation light, depending on which sample is used, be the same or different from each other.

Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist zwischen der Punktlichtquelle und dem Objektiv ein Filterelement angeordnet, welches einen für wenigstens den Lichtanteil des Anregungslichtes mit der einen Lichteigenschaft undurchlässigen Mittenbereich und einen für die Lichtanteile des Anregungslichtes durchlässigen Außenbereich aufweist. Hierdurch wird die laterale Auflösung nochmals erheblich verbessert. Dies kommt dadurch zustande, daß ein solches Filterelement Licht aus dem Hauptmaximum in die Beugungsnebenmaxima verlagert. Somit wird eine deutliche Verschmälerung der jeweiligen sich überlagernden Hauptmaxima erzielt, was zu einer weiteren Verschmälerung der Anregungsabbildungsfunktion führt. Die Intensitätszunahme in den Nebenmaxima ist in diesem Fall nicht störend, da die fokalen Intensitätsverteilungen zueinander lateral versetzt sind. Somit sind die störenden Nebenmaxima gegeneinander verschoben, wodurch die Nebenmaxima unterdrückt werden, da sie sich in ihrer Wirkung nicht ergänzen. Insgesamt kann eine Verbesserung in der lateralen Auflösung um einen Faktor 2.5 erzielt werden.According to an advantageous development of the invention a filter element between the point light source and the lens arranged, which one for at least the light portion of the Excitation light with the one light property impermeable Center area and one for the light components of the Has excitation light permeable outdoor area. Hereby the lateral resolution is significantly improved again. This is due to the fact that such a filter element emits light shifted from the main maximum to the secondary diffraction maxima. Consequently there will be a significant narrowing of each superimposed main maxima, which leads to another Narrowing of the excitation mapping function leads. The Intensity in the secondary maxima is not in this case disruptive because the focal intensity distributions to each other are laterally offset. Thus, the disturbing secondary maxima shifted against each other, which suppresses the secondary maxima because they do not complement each other in their effect. All in all can improve the lateral resolution by one Factor 2.5 can be achieved.

Eine weitere Verschmälerung des Hauptmaximums ohne Entstehen von Nebenmaxima kann dadurch erzielt werden, daß der Mittenbereich des Filterelementes für zwei in der Lichteigenschaft verschiedene Lichtanteile des Anregungslichtes undurchlässig ist. Die oben beschriebene Wirkung des Filterelementes kann hier für zwei Lichtanteile verschiedener Lichteigenschaften ausgenutzt werden. Bei Verwendung des Filterelementes kann die laterale Verschiebung der Intensitätsverteilungen der Lichtanteile des Anregungslichtes etwa 50 bis 200 nm, ohne Verwendung eines Filterelementes etwa 100 bis 300 nm betragen. A further narrowing of the main maximum without the emergence of Secondary maxima can be achieved in that the middle area of the filter element for two in the light property different light components of the excitation light are opaque is. The effect of the filter element described above can be here for two light components with different light properties be exploited. When using the filter element, the lateral shift of the intensity distributions of the Light components of the excitation light about 50 to 200 nm, without Using a filter element amount to about 100 to 300 nm.

Auch kann die Vorrichtung ein Separationselement zum Abtrennen des von der Probe abgestrahlten Emissionslichtes von dem Anregungslicht und einem Detektor zum Nachweis des Emissionslichtes aufweisen. Bei dem Emissionslicht handelt es sich um das Emissionslicht, welches aufgrund des angeregten Energiezustandes emittiert wird, der durch das Zusammenwirken der Lichtanteile angeregt wurde. In dieser Anordnung wird die Vorrichtung vorteilhafterweise als Mikroskop verwendet. Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Definition von Punkten in Speichermedien kann eine entsprechende Detektoranordnung zum Auslesen der Punkte verwendet werden, d. h. als Leseeinheit. Der übrige Teil der Vorrichtung, nämlich der gemäß Anspruch 9, bildet die Schreibeinheit für solche Speichermedien. Gemäß der Erfindung werden die Punkte, die die Bits darstellen, verkleinert. Dies ist selbstverständlich bereits beim Schreibvorgang mit der Vorrichtung gemäß Anspruch 9 oder dem Verfahren gemäß Anspruch 1 der Fall.The device can also be a separation element for separation the emission light emitted by the sample from the Excitation light and a detector to detect the Have emission light. It is the emission light the emission light, which is due to the excited Energy state is emitted by the interaction the light component was excited. In this arrangement the Device advantageously used as a microscope. In the Use of the device according to the invention for the definition of Points in storage media can be corresponding Detector arrangement for reading the points can be used, i. H. as a reading unit. The rest of the device, namely the according to claim 9, forms the writing unit for such Storage media. According to the invention, the points that the Represent bits, scaled down. This goes without saying already during the writing process with the device according to claim 9 or the method according to claim 1 the case.

Vorteilhafterweise ist das Filterelement in der Nähe der Eintrittspupille des Objektives angeordnet. Durch diese Anordnung wird erreicht, daß eine Strahlbegrenzung vermieden wird, so daß eine gleich hohe Lichtintensität beim Bewegen des Strahls in der Fokalebene gewährleistet ist. Dieser Vorteil kann erfindungsgemäß auch dadurch erreicht werden, daß das Filterelement am Ort oder in der Nähe einer zu der Eintrittspupille des Objektives optisch konjugierten Ebene angeordnet ist.The filter element is advantageously in the vicinity of the Entry pupil of the lens arranged. Through this Arrangement is achieved that a beam limitation is avoided is, so that an equally high light intensity when moving the Beam is guaranteed in the focal plane. This advantage can According to the invention can also be achieved in that the Filter element in place or close to one of the Entry pupil of the lens optically conjugate plane is arranged.

Ferner ist es vorteilhaft, wenn der Mittenbereich des Filterelementes die Form einer Kreisscheibe hat, an welche sich der Außenbereich anschließt. Hierbei wird die Symmetrie des Abbildungslichtes am gleichförmigsten ausgenutzt. Auch ist es günstig, wenn das Filterelement derart angeordnet ist, daß die Strahlachse der Teilstrahlen des Anregungslichtes etwa durch den Mittelpunkt der Kreisscheibe verläuft und die Kreisscheibe unter einem Winkel von etwas weniger als 90° schneidet. Dabei werden störende Reflexionen an dem Filterelement in den Strahlengang vermieden. It is also advantageous if the central region of the Filter element has the shape of a circular disc to which the outside area connects. Here, the symmetry of the Image light most uniformly exploited. It is too favorable if the filter element is arranged such that the Beam axis of the partial beams of the excitation light approximately through the The center of the circular disk runs and the circular disk below cuts at an angle of a little less than 90 °. In doing so disturbing reflections on the filter element in the beam path avoided.

Vorteilhafterweise kann der Mittenbereich durch eine auf das Filterelement aufgebrachte dielektrische Schicht gebildet werden. Dies macht die Filterherstellung in der Praxis besonders einfach. Das Filter kann durch Aufdampfen eines dielektrischen Materiales erzeugt werden. Auch kann das Filterelement günstigerweise durch ein Farbglas optischer Güte gebildet werden. Ein solches Filterelement dient zum Herausfiltern eines Lichtanteiles einer oder mehrerer bestimmter Wellenlängen in dem Mittenbereich. Soll der Lichtanteil einer bestimmten Polarisation in dem Mittenbereich herausgefiltert werden, kann das Filterelement in dem Mittenbereich aus einem Polarisationsfilter bestehen, das den Lichtanteil mit der einen Polarisation blockiert. Sollen zwei Lichtanteile mit zwei Polarisationen aus dem Mittenbereich herausgefiltert werden, wird der Mittenbereich des Filters derart gewählt, daß er für die Wellenlängen der entsprechenden Lichtanteile undurchlässig ist, so daß der gesamte Lichtanteil blockiert wird.Advantageously, the central area can be closed by a Filter element applied dielectric layer formed become. This makes filter production special in practice simple. The filter can be made by evaporating a dielectric Material are generated. The filter element can also conveniently formed by a colored glass of optical quality become. Such a filter element is used to filter out a Light component of one or more specific wavelengths in the Middle area. Should the light portion of a certain Polarization can be filtered out in the central area the filter element in the middle area from a There are polarization filters, which share the light with one Polarization blocked. Shall two light parts with two Polarizations are filtered out of the central area, the center area of the filter is selected so that it is for the wavelengths of the corresponding light components are opaque is so that the entire light portion is blocked.

Ferner kann es vorteilhaft sein, wenn das Filterelement für das von der Probe abgestrahlte Emissionslicht durchlässig ist. Dann kann die erfindungsgemäße Vorrichtung im vorteilhaften Aufbau verwendet werden, bei dem das von der Probe abgestrahlte Emissionslicht mit dem Objektiv gesammelt wird (im folgenden Rückstrahlaufbau genannt). Dabei wird verhindert, daß eine Verringerung der Intensität des Emissionslichtes aufgrund der Wirkung des Filterelementes auftritt.Furthermore, it can be advantageous if the filter element for the emission light emitted by the sample is transparent. Then can the inventive device in an advantageous structure can be used in which the radiated from the sample Emission light is collected with the lens (hereinafter Called reflective structure). This prevents a Reduction of the intensity of the emission light due to the Effect of the filter element occurs.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsart der Erfindung kann die Punktlichtquelle mindestens zwei Laser umfassen, die Licht unterschiedlicher Wellenlängen als Teilstrahlen emittieren. Dabei kann die Punktlichtquelle ein Verbindungselement zum Zusammenführen des Lichtes zweier Laser aufweisen, so daß die Strahlen der beiden Laser zuverlässig auf den gleichen Probenpunkt fokussiert werden.According to an advantageous embodiment of the invention, the Point light source include at least two lasers that emit light emit different wavelengths as partial beams. The point light source can be a connecting element for Merge the light of two lasers, so that the Beams of the two lasers reliably on the same Sample point to be focused.

Als Verbindungselement der Anregungslichtstrahlen kann günstigerweise ein dichroitischer Spiegel verwendet werden, der das Licht des einen Lasers reflektiert und das Licht des anderen Lasers passieren läßt. Auch kann die Verwendung eines dichroitischen Würfels vorteilhaft sein.Can be used as a connecting element for the excitation light rays conveniently a dichroic mirror can be used which the light from one laser reflects and the light from the other Lets lasers happen. The use of a dichroic cube can be beneficial.

Auch ist es vorteilhaft, wenn zwischen dem Verbindungselement und jedem Laser jeweils ein Blendenelement und ein Fokussierungselement zum Fokussieren des jeweiligen Lichtstrahles der Lichtanteile auf das entsprechende Blendenelement vorgesehen sind. Üblicherweise werden als Blendenelemente Lochblenden verwendet. Als Fokussierungselemente werden typischerweise Linsen verwendet.It is also advantageous if between the connecting element and one aperture element and one for each laser Focusing element for focusing the respective Light beam of the light components on the corresponding Aperture element are provided. Usually as Aperture elements pinhole panels used. As focusing elements lenses are typically used.

Gemäß einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung kann die Punktlichtquelle einen Laser umfassen, wobei hinter dem Laser ein Strahlteiler zum Aufspalten des Anregungslichtstrahles in zwei Teilstrahlen und ein Verbindungselement zum Vereinigen der Teilstrahlen vorgesehen ist. Dieser Aufbau ist dann günstig, wenn der Laser Licht verschiedener Wellenlängen gleichzeitig emittiert. Dann können die beiden Lichtanteile unterschiedlicher Wellenlängen gegeneinander versetzt werden. Auch ist dieser Aufbau ist dann vorteilhaft, wenn die beiden Lichtanteile eine gleiche Wellenlänge, aber unterschiedliche Polarisation aufweisen. Günstigerweise sind polarisationsoptische Elemente vorgesehen, die die Teilstrahlen zueinander in ihrer Polarisation orthogonalisieren. Dies kann zum einen dadurch verwirklicht werden, daß in jedem Teilstrahl ein Polarisator vorgesehen ist. Zum anderen kann zwischen dem Laser und dem Strahlteiler ein Polarisator vorgesehen sein oder ein Laser verwendet werden, der polarisiertes Licht emittiert und in einem der Teilstrahlen ein L/2-Plättchen angeordnet sein.According to another embodiment of the invention, the Point light source include a laser, behind the laser a beam splitter for splitting the excitation light beam into two partial beams and a connecting element to unite the Partial beams is provided. This setup is cheap, when the laser light of different wavelengths at the same time emitted. Then the two light components can be different Wavelengths are offset against each other. This too is Construction is advantageous if the two light components have one same wavelength but different polarization exhibit. Polarization-optical elements are favorable provided that the partial beams to each other in their Orthogonalize polarization. On the one hand, this can be done be realized that a polarizer in each sub-beam is provided. Secondly, between the laser and the Beam splitter can be provided a polarizer or a laser be used which emits polarized light and in one an L / 2 plate is arranged in the partial beams.

Auch ist es vorteilhaft, wenn wenigstens ein gepulster Laser verwendet wird. Hierdurch wird eine besonders hohe Intensität in den Probenpunkten erzielt. Es ist darauf zu achten, daß die beiden Teilstrahlen keine Laufzeitunterschiede aufweisen. Wird nur ein Laser verwendet, wobei der Laserstrahl in zwei Teilstrahlen aufgespalten wird, so wird bei der Verwendung eines gepulsten Lasers der Puls in zwei Teilpulse aufgespalten. Wenn die Strahlen wiedervereinigt werden, muß darauf geachtet werden, daß sich auch die jeweiligen Pulse nach Durchlaufen der Teilstrahlen, die jetzt eine unterschiedliche Polarisation aufweisen, überlappen. Hierzu werden die Teilwege, die die Lichtanteile zurücklegen, vermessen, und es wird ein feines Translationselement eingefügt, mit dem die Länge eines der von den Lichtanteilen zurückzulegenden Wege verändern kann. Ein solches Translationselement ist beispielsweise ein Umlenkspiegel, der mit einem Piezoelement verschoben wird. Werden zwei gepulste Laser mit unterschiedlicher Wellenlänge verwendet, so treten die gleichen Probleme auf. Hier müssen die beiden Laser zusätzlich mit der gleichen Frequenz pulsen. Die letztere Schwierigkeit kann dadurch vermieden werden, daß ein gepulster Laser und ein kontinuierlich arbeitenden Laser in der Lichtquelle 1 verwendet wird.It is also advantageous if at least one pulsed laser is used. This results in a particularly high intensity in the sample points. It must be ensured that the two partial beams do not have any runtime differences. If only one laser is used, the laser beam being split into two partial beams, the pulse is split into two partial pulses when using a pulsed laser. If the beams are reunited, care must be taken to ensure that the respective pulses also overlap after passing through the partial beams, which now have a different polarization. For this purpose, the partial paths that cover the light components are measured, and a fine translation element is inserted with which the length of one of the paths covered by the light components can be changed. Such a translation element is, for example, a deflecting mirror which is displaced with a piezo element. If two pulsed lasers with different wavelengths are used, the same problems arise. Here the two lasers must also pulse at the same frequency. The latter difficulty can be avoided by using a pulsed laser and a continuously operating laser in the light source 1 .

Ferner ist es vorteilhaft, wenn das Separationselement ein dichroitischer Spiegel ist. Dann kann die Anordnung in dem platzsparenden Rückstrahlaufbau verwendet werden. Es kann auch vorteilhaft sein, wenn das Separationselement mindestens ein Filter umfaßt; dies ist für einen einfachen Transmissionsaufbau der Vorrichtung günstig. Ferner kann das Separationselement eine Kombination von Farbfiltern und dielektrischen Filtern enthalten. Auch kann das Separatinselement Glimmerplättchen aufweisen.It is also advantageous if the separation element is a dichroic mirror is. Then the arrangement in the space-saving reflector assembly can be used. It can also be advantageous if the separation element is at least one Filter includes; this is for a simple transmission setup the device cheap. Furthermore, the separation element can be a Combination of color filters and dielectric filters contain. The separate element can also have mica platelets exhibit.

Auch kann der Detektor in kurzer Entfernung hinter der Probe angeordnet sein. Das ist dann besonders vorteilhaft, wenn das nachzuweisende Fluoreszenzlicht im UV-Bereich liegt, da in diesem Fall eine Strahlfokussierung sehr schwierig ist. Die Entfernung ist so bestimmt, daß wenigstens ein Separationselement, jedoch kein abbildendes optisches Element zwischen der Probe und dem Detektor angeordnet werden kann.The detector can also be located a short distance behind the sample be arranged. This is particularly advantageous if that Fluorescence light to be detected is in the UV range, because in beam focusing is very difficult in this case. The Distance is determined so that at least one Separation element, but not an imaging optical element can be arranged between the sample and the detector.

Ebenfalls kann es günstig sein, wenn der Detektor ein Punktdetektor ist. Dann kann vorteilhafterweise vor dem Detektor ein Fokussierungselement, z. B. eine weitere Linse oder ein weiteres Objektiv, angeordnet sein, welches das Emissionslicht auf eine dem Detektor vorgeschaltete Detektorblende, für welche beispielsweise eine Lochblende verwendet wird, in den Detektor fokussiert. Der Durchmesser der Blende ist vorzugsweise so groß, daß deren Bild im Probenbereich in der Größenordnung des Airyscheibchens ist, das man bei der Wellenlänge des zu detektierenden Lichtes hat. In diesem Fall ergibt sich die im Detektor registrierte Intensität aus dem Produkt der Intensitätsverteilungen der Anteile des Beleuchtungslichtes unterschiedlicher Wellenlängen, die gemeinsam zum Anregen des Energiezustandes beitragen, und der Detektorpunkt- Abbildungsfunktion für das zu detektierende Emissionslicht. Somit wird eine zusätzliche Verschmälerung des Hauptmaximums und damit eine weitere Verbesserung der lateralen Auflösung erzielt. Zusätzlich werden Nebenmaxima, die aufgrund der Strahlversetzung in der zu der lateralen Richtung orthogonalen Richtung reduziert.It can also be beneficial if the detector is on Is point detector. Then advantageously in front of the detector a focusing element, e.g. B. another lens or a another lens, which is the emission light on a detector aperture upstream of the detector, for which For example, a pinhole is used in the detector focused. The diameter of the screen is preferably so large that their image in the sample area is of the order of magnitude Airy disk is the one at the wavelength of the has detecting light. In this case the results in Intensity recorded from the product of the detector Intensity distributions of the parts of the illuminating light different wavelengths that together to excite the Energy state, and the detector point Mapping function for the emission light to be detected. Thus an additional narrowing of the main maximum and thus further improving the lateral resolution. In addition, secondary maxima are caused by the beam dislocation in the direction orthogonal to the lateral direction reduced.

Günstigerweise kann zwischen der Punktlichtquelle und der Probe eine Strahlrastereinrichtung (Strahlscanningeinrichtung) zum gesteuerten Abrastern der Probe mit dem Anregungslicht vorgesehen sein. Die Strahlrastereinrichtung bewirkt, daß der Anregungslichtstrahl eine Richtungsänderung erfährt, die so erfolgt, daß der Drehpunkt in der Eintrittspupille eines auf die Probe gerichteten Objektives ruht, und der fokussierte Anregungslichtstrahl im Probenbereich eine Bewegung in der Fokalebene durchführt. In einer bevorzugten Ausführung umfaßt die Strahlrastereinheit darüberhinaus auch eine mechanische Translationseinheit, welche am beleuchtenden Objektiv angebracht ist und zur axialen Bewegung desselben dient. Damit ist ein Abrastern der gesamten Probe möglich. Die erfindungsgemäßen Vorteile können in einem typischen Rastermikroskop ausgenutzt werden. Im Rückstrahlaufbau befindet sich die Strahlrastereinrichtung günstigerweise zwischen dem Separationselement und dem Filterelement.Conveniently there can be between the point light source and the sample a beam scanning device (beam scanning device) for controlled scanning of the sample with the excitation light be provided. The beam grid device causes the Excitation light beam undergoes a change in direction, so takes place that the fulcrum in the entrance pupil one on the The sample-oriented lens rests, and the focused one Excitation light beam in the sample area a movement in the Focal plane. Included in a preferred embodiment the beam grid unit also a mechanical one Translation unit attached to the illuminating lens is and serves for the axial movement of the same. So that's a Scanning of the entire sample is possible. The invention Advantages can be exploited in a typical scanning microscope become. The is in the rear beam assembly Beam grid device conveniently between the Separation element and the filter element.

Erfindungsgemäß kann die Probe auf einem Positioniertisch angeordnet sein, der eine mechanische Rasterbewegung zumindest in Richtung der optischen Achse durchführt. Auch kann das Objektiv derart angeordnet sein, daß es eine Bewegung in Richtung der optischen Achse durchführt.According to the invention, the sample can be placed on a positioning table be arranged, the mechanical grid movement at least performs in the direction of the optical axis. It can also Lens arranged so that there is movement in Performs direction of the optical axis.

Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel kann die Punktlichtquelle derart ausgebildet sein, daß sie gepulstes Anregungslicht emittiert, wobei einer der Lichtanteile, der erste, dazu geeignet ist, einen Zwischenenergiezustand der Probe anzuregen, ein anderer, der zweite, der Lichtanteile dazu geeignet ist, von dem Zwischenenergiezustand aus, den Energiezustand der Probe anzuregen und wobei die Lichteigenschaft, in der sich die Lichtanteile unterscheiden, der Zeitpunkt des Verweilens des jeweiligen Lichtpulses an dem Probenpunkt ist. Bei diesem Ausführungsbeispiel wird die Verbesserung der lateralen Auflösung in dem Probenpunkt dadurch erzielt, daß an dem Probenpunkt die Wahrscheinlichkeit der Anregung des Energiezustandes der Probe durch das Produkt der Intensität des ersten Lichtanteiles, der den Zwischenenergiezustand zu einem bestimmten ersten Zeitpunkt anregt und der Intensität des zweiten Lichtanteiles, der von dem Zwischenenergiezustand aus den Energiezustand der Probe zu einem etwas späteren zweiten Zeitpunkt anregt, gegeben ist. Durch die Verwendung von gepulstem Anregungslicht wird erreicht, daß die erforderliche Zweiphotonenanregung des Energiezustandes der Probe nicht durch Photonen eines der Lichtanteile alleine, sondern durch Zusammenwirken des ersten und des zweiten Lichtanteiles erfolgt. Dies ist insbesondere dann von Interesse, wenn die Anordnung von dem Energiezustand und dem Zwischenenergiezustand derart ist, daß deren Anregung mit Licht der gleichen Wellenlängen erfolgen kann. Es ist selbstverständlich, daß dieses Ausführungsbeispiel auch in Kombination mit allen oben bereits erwähnten vorteilhaften Weiterbildungen der Erfindung verwendet und ausgestattet werden kann. Auch hier ist wesentlich, daß die Detektion des Emissionslichtes derart erfolgt, daß das Emissionslicht des Energiezustandes gemessen wird, welcher durch Zusammenwirken der beiden Lichtanteile angeregt wurde.According to a further exemplary embodiment according to the invention the point light source can be designed such that it is pulsed Excitation light is emitted, one of the light components, the first, is an intermediate energy state of the sample to stimulate another, the second, the light components to do so is suitable from the intermediate energy state that To stimulate the energy state of the sample and being the Light property in which the light components differ, the time of the respective light pulse on the Sample point is. In this embodiment, the This improves the lateral resolution in the sample point achieved that at the sample point the probability of Excitation of the energy state of the sample by the product of Intensity of the first part of the light that the Intermediate energy state at a certain first time stimulates and the intensity of the second part of the light from the Intermediate energy state from the energy state of the sample to one a little later at the second point in time is given. Through the Using pulsed excitation light ensures that the required two-photon excitation of the energy state of the Sample not by photons of one of the light components alone, but by the interaction of the first and the second Light portion takes place. This is of particular interest if the arrangement of the energy state and the Intermediate energy state is such that their excitation with light the same wavelengths can be done. It is of course, that this embodiment also in Combination with all advantageous mentioned above Developments of the invention are used and equipped can. It is also essential here that the detection of the Emission light takes place in such a way that the emission light of the Energy state is measured, which by interaction of the both light components was excited.

Vorteilhafterweise umfaßt die Lichtquelle einen gepulsten Laser, einen ersten Strahlteiler zum Aufspalten des von dem Laser kommenden Anregungslichts in den ersten und in den zweiten Lichtanteil, und einen zweiten Strahlteiler zum Vereinigen der beiden Lichtanteile, wobei in dem Strahlengang des zweiten Lichtanteiles eine Verzögerungsvorrichtung zum Verzögern der Pulse des zweiten Lichtanteiles, der zweiten Lichtpulse, vorgesehen ist. Dies ist eine besonders einfache und wirtschaftlich rentable Vorrichtung, da nur ein Laser verwendet werden muß. Die Verzögerungseinrichtung kann dabei zwei Spiegel umfassen. Die Spiegel können gleichzeitig als das Versetzungselement zum Versetzen der Strahlachsen der Lichtanteile in lateraler Richtung dienen. Dies ist insbesondere dann günstig, wenn die Verzögerung größer als 0,1 mm ist, da in diesem Fall diese Anordnung ohne großen technischen Aufwand verwendet werden kann und sehr einfach ist.The light source advantageously comprises a pulsed laser, a first beam splitter for splitting the laser coming excitation light in the first and in the second Light component, and a second beam splitter to combine the two light components, being in the beam path of the second Light component a delay device for delaying the Pulses of the second light component, the second light pulses, is provided. This is a particularly simple and Economically viable device because only one laser is used must become. The delay device can have two mirrors include. The mirrors can act as that at the same time Displacement element for displacing the beam axes of the Serve light portions in the lateral direction. This is particularly so cheap if the delay is greater than 0.1 mm, because in this case, this arrangement without great technical effort can be used and is very simple.

Ferner ist es vorteilhaft, wenn die Verzögerungseinrichtung derart ausgebildet ist, daß die Zeitverzögerung zwischen dem Lichtpuls des ersten Lichtanteiles, dem ersten Lichtpuls, und dem zweiten Lichtpuls weniger als 1 ns, vorzugsweise etwa 0,1 ns, beziehungsweise etwa 30 mm im optischen Wegunterschied beträgt. Die Lichtquelle emittiert günstigerweise kurze Pulse, vorzugsweise Pulse von 0,1 ns und kürzer. Hierzu kann ein Femto- oder ein Pikosekunden-Laser verwendet werden, z. B. ein Titan- Saphir-Laser oder ein Farbstofflaser. Die Pulse derartiger Laser können im Femtosekundenbereich liegen, so daß die erforderliche gewünschte kurze Pulslänge erzielt werden kann. Derartige Laser sind kommerziell erhältlich. Als Probe kann beispielsweise der Farbstoff Rhodamin B verwendet werden. Durch die gewählte zeitlich Verzögerung zwischen dem ersten Puls und dem zweiten Puls und der Pulslänge wird erreicht, daß der erste, der früher ankommende Puls, den Zwischenenergiezustand anregt und dann die Probe wieder verläßt. Innerhalb der Lebensdauer des Zwischenenergiezustandes erfolgt die zweite Anregung in den Energiezustand aufgrund des zweiten Lichtpulses. Bei den gewählten Bedingungen ist der Zwischenenergiezustand noch nahezu voll besetzt und der erste Puls hat die Probe bereits so weit verlassen, daß die Anregung in den Energiezustand nur aufgrund des zweiten Pulses erfolgt. Somit ist gewährleistet, daß die Gesamtanregung des Energiezustandes der Probe durch das Zusammenwirken des ersten und des zweiten Pulses, die zudem auch lateral versetzt sind, erfolgt.It is also advantageous if the delay device is designed such that the time delay between the Light pulse of the first light component, the first light pulse, and the second light pulse less than 1 ns, preferably about 0.1 ns, or about 30 mm in optical path difference. The light source conveniently emits short pulses, preferably pulses of 0.1 ns and shorter. A femto- or a picosecond laser can be used, e.g. B. a titanium Sapphire laser or a dye laser. The pulses of such lasers can be in the femtosecond range, so that the required desired short pulse length can be achieved. Such lasers are commercially available. For example, the Rhodamine B dye can be used. By the chosen one time delay between the first pulse and the second Pulse and pulse length is achieved that the first one earlier incoming pulse that stimulates the intermediate energy state and then the Sample leaves again. Within the lifespan of the The second excitation occurs in the intermediate energy state Energy state due to the second light pulse. Both selected conditions, the intermediate energy state is still almost fully occupied and the first pulse already has the sample so far leave that excitation due to the energy state only of the second pulse. This ensures that the Overall excitation of the energy state of the sample by the Interaction of the first and the second pulse, which also are laterally offset.

Dadurch daß die Pulse zeitlich steil sind, wird erreicht, daß die Pulse deutlich kürzer sind, im obigen Beispiel etwa einem Zehntel der Lebensdauer des Zwischenenergiezustandes entsprechen. Somit ist gewährleistet, daß der erste Puls die Probe zu dem Zeitpunkt verlassen hat, zu dem der zweite Puls in dem Probenpunkt verweilt.The fact that the pulses are steep in time ensures that the pulses are significantly shorter, about one in the example above Tenth of the life of the intermediate energy state correspond. This ensures that the first pulse Has left the sample at the time when the second pulse in lingers at the sample point.

Auch können in dem Lichtweg des jeweiligen Lichtanteiles Elemente zur Intensitätsregulierung des Lichtanteiles vorgesehen sein. Hierzu können beispielsweise Graufilter verwendet werden. Bei der Verwendung des Farbstoffes Rhodamin B ist es günstig, wenn die Intensität des zweiten Lichtpulses etwa 10mal stärker ist als die Intensität des ersten Lichtpulses. Dies rührt daher, daß die Übergangswahrscheinlichkeit von dem Zwischenenergiezustand in den Energiezustand etwa 10mal niedriger ist als der Übergang von dem Grundzustand in den Zwischenenergiezustand, der aufgrund des ersten Pulses angeregt werden soll. Bei anderen Proben wird entsprechend der Übergangswahrscheinlichkeiten des durch den ersten Lichtpuls und den zweiten Lichtpuls anzuregenden Zwischenenergiezustands und Energiezustands die Intensitätsregulierung entsprechend gewählt.Also in the light path of the respective light component Elements for regulating the intensity of the light portion are provided his. For example, gray filters can be used for this. When using the dye rhodamine B, it is advantageous when the intensity of the second light pulse is about 10 times stronger is the intensity of the first light pulse. This is because that the transition probability from that Intermediate energy state in the energy state about 10 times is lower than the transition from the basic state to the Intermediate energy state that is excited due to the first pulse shall be. For other samples, the Transition probabilities of by the first light pulse and the intermediate energy state to be excited and The intensity regulation selected accordingly.

Auch kann hinter dem Laser eine nicht lineare optische Einheit zur Veränderung der Lichtwellenlänge, z. B. eine Frequenzverdopplungseinheit, wie ein Frequenzverdopplungskristall, vorgesehen sein. Dies ermöglicht insbesondere bei der Verwendung eines Titan-Saphir-Lasers einen einfachen Aufbau. Dies führt zu einer typischen Pulsdauer von 100fsec und einer typischen Wellenlänge von 350-500 nm.A non-linear optical unit can also be behind the laser to change the light wavelength, e.g. Legs Frequency doubling unit, like a Frequency doubling crystal can be provided. this makes possible especially when using a titanium sapphire laser simple construction. This leads to a typical pulse duration of 100fsec and a typical wavelength of 350-500 nm.

Im folgenden ist die Erfindung anhand der Zeichnung näher beschrieben. Es zeigt In the following the invention is closer with reference to the drawing described. It shows

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung, Fig. 1 is a schematic representation of an embodiment of the device according to the invention,

Fig. 2 die lateral verschobenen Intensitätsverteilungen zweier Lichtanteile mit verschiedener Lichteigenschaft des Anregungslichtes am Probenpunkt, Fig. 2, the laterally displaced intensity distributions of two light portions with different light property of the excitation light on the sample point,

Fig. 3 die Anregungspunkt-Abbildungsfunktion des Anregungslichtes am Probenpunkt gemäß der Erfindung (Produkt der Intensitätsverteilungen der Lichtanteile aus Fig. 2), und Fig. 3, the excitation point mapping function of the excitation light on the sample point according to the invention (product of the intensity distributions of the light components of Fig. 2), and

Fig. 4 eine schematische Darstellung eines weiteren Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Fig. 4 is a schematic representation of a further embodiment of the device according to the invention.

Fig. 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Das Ausführungsbeispiel bezieht sich auf ein Rastermikroskop. Durch dieses Ausführungsbeispiel soll die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens als normales Mikroskop und insbesondere die Anwendung zur Definition von Punkten in Speichermedien, die Bits darstellen, nicht ausgeschlossen werden
Das Licht einer Punktlichtquelle 1 wird mittels eines Objektives 2 auf einem Probenpunkt 3 einer Probe 4 abgebildet. In dem hier gezeigten Rückstrahlaufbau wird das von der Probe 4 emittierte Emissionslicht, das durch das Anregungslicht erzeugte Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht, über ein Separationselement 5 auf einen Detektor 6 abgebildet. Als Separationselement 5 wird typischerweise ein dichroitischer Spiegel verwendet. Die Lichtquelle 1 umfaßt zwei Laser 7 und 8, von welchen der Laser 7 Licht der Wellenlänge L₁ und/oder Licht der Polarisation P₁ und der Laser 8 Licht der Wellenlänge L₂ und/oder Licht der Polarisation P₂ emittiert. Dabei ist L₁ ungleich L₂ und/oder P₁ ungleich P₂. Ungleich in der Polarisation bedeutet, daß die Polarisationen P₁, P₂ der Lichtanteile orthogonal oder nahezu orthogonal zueinander sind. Das Licht der beiden Laser 7 und 8 wird mittels eines Verbindungselementes 9, beispielsweise eines dichroitischen Spiegels, zusammengeführt und über das Separationselement 5 auf den Probenpunkt 3 der Probe 4 gelenkt. Zwischen dem Verbindungselement 9 und jedem Laser 7, 8 ist jeweils ein Blendenelement 10, 11 und eine Fokussierungselement 12, 13 zum Fokussieren des jeweiligen Lichtstrahles der Lichtanteile auf das entsprechende Blendenelement vorgesehen. Als Fokussierungselemente 12, 13 werden typischerweise Linsen, als Blendenelemente 10, 11 Lochblenden verwendet. Durch diese Anordnung wirken die Laser 7 und 8 als Punktlichtquellen. Der Ausgang der Punktlichtquelle 1 wird durch Vereinigung der beiden Laserstrahlen auf dem Verbindungselement 9 erreicht. Fig. 1 shows an embodiment of the device according to the invention. The exemplary embodiment relates to a scanning microscope. This exemplary embodiment is not intended to rule out the use of the device and the method according to the invention as a normal microscope, and in particular the use for defining points in storage media which represent bits
The light from a point light source 1 is imaged on a sample point 3 of a sample 4 by means of an objective 2 . In the retroreflective structure shown here, the emission light emitted by the sample 4 , the fluorescent or phosphorescent light generated by the excitation light, is imaged onto a detector 6 via a separation element 5 . A dichroic mirror is typically used as the separation element 5 . The light source 1 comprises two lasers 7 and 8 , of which the laser 7 emits light of the wavelength L 1 and / or light of the polarization P 1 and the laser 8 light of the wavelength L 2 and / or light of the polarization P 2. L₁ is not equal to L₂ and / or P₁ is not equal to P₂. Unequal in polarization means that the polarizations P₁, P₂ of the light components are orthogonal or almost orthogonal to each other. The light from the two lasers 7 and 8 is brought together by means of a connecting element 9 , for example a dichroic mirror, and directed onto the sample point 3 of the sample 4 via the separation element 5 . A diaphragm element 10 , 11 and a focusing element 12 , 13 are provided between the connecting element 9 and each laser 7 , 8 for focusing the respective light beam of the light components onto the corresponding diaphragm element. Lenses are typically used as focusing elements 12 , 13 and pinhole diaphragms as aperture elements 10 , 11 . With this arrangement, the lasers 7 and 8 act as point light sources. The output of the point light source 1 is achieved by combining the two laser beams on the connecting element 9 .

Die Strahlachsen der Lichtanteile L₁, L₂ sind gegenüber der in der Figur dargestellten Symmetrieachsen, gemäß denen die Hauptmaxima der Intensitätsverteilungen der Lichtanteile zusammenfallen würden, versetzt angeordnet und zwar so, daß die fokalen Intensitätsverteilungen der Lichtanteile im Probenpunkt 3 in ihren Hauptmaxima überlappen, lateral gegeneinander verschoben sind. Gemäß der Fig. 1 sind die Strahlen der Lichtanteile dadurch versetzt, daß die Laser seitlich der optischen Achse angeordnet sind. Es kann aber auch ein Versetzungselement vorgesehen sein, mit dem die Versetzung variiert werden kann. Hierzu kann z. B. ein Mikrometertisch verwendet werden. Durch die Änderung der Versetzung kann jeweils die optimale Auflösungsverbesserung erzielt werden.The beam axes of the light components L 1, L 2 are offset with respect to the axes of symmetry shown in the figure, according to which the main maxima of the intensity distributions of the light components would coincide, in such a way that the focal intensity distributions of the light components overlap in sample point 3 in their main maxima, laterally displaced from one another are. According to FIG. 1, the beams of the light components are thereby enabled that the lasers are arranged laterally of the optical axis. However, a displacement element can also be provided, with which the displacement can be varied. For this, e.g. B. a micrometer table can be used. By changing the offset, the optimal resolution improvement can be achieved in each case.

Fig. 2 zeigt die Intensitätsverteilung der von den Lasern 7, 8 auf den Probenpunkt 3 fokussierten Lichtanteile mit unterschiedlicher Wellenlänge L₁, L₂ oder mit unterschiedlicher Polarisation P₁, P₂, die lateral in ihren Hauptmaxima überlappend gegeneinander verschoben sind. Die Anregungspunktabbildungsfunktion in der Fokalebene der erfindungsgemäßen Anordnung ist in Fig. 3 gezeigt. Die Anregungspunktabbildungsfunktion ergibt sich aus dem Produkt der in Fig. 2 dargestellten, gegeneinander versetzten Intensitätsverteilungen mit unterschiedlichen Wellenlängen L₁, L₂ oder unterschiedlichen Polarisationen P₁, P₂. Bei der Überlagerung der beiden Intensitätsverteilungen entsteht in der Gesamtfunktion der Fig. 3 ein schmaleres Hauptmaximum und somit eine bessere laterale Auflösung der Vorrichtung. Der Energiezustand der Probe 4 in dem Probenpunkt 3 wird durch Zusammenwirken von Photonen der beiden Lichtanteile, deren Intensitätsverteilungen in ihren Hauptmaxima überlappend lateral gegeneinander verschoben sind und die unterschiedliche Wellenlängen L₁, L₂ oder unterschiedliche Polarisationen P₁, P₂ aufweisen, angeregt. Durch das Zusammenwirken der Photonen der verschiedenen Lichtanteile erfolgt die Anregung in dem Energiezustand der Probe 4 gemäß der Anregungspunktabbildungsfunktion entsprechend Fig. 3. Der effektive Fokus eines Rastermikroskopes ist in der Fokalebene schmal, so daß durch Detektion des Emissionslichtes der Probe 4 im Detektor 6 eine höher auflösende Abbildung der Probe 4 erzielt wird. Fig. 2 shows the intensity distribution of the focused by the lasers 7 , 8 on the sample point 3 light components with different wavelengths L₁, L₂ or with different polarization P₁, P₂, which are laterally shifted in their main maxima overlapping against each other. The excitation point mapping function in the focal plane of the arrangement according to the invention is shown in FIG. 3. The excitation point mapping function results from the product of the intensity distributions with different wavelengths L 1, L 2 or different polarizations P 1, P 2 shown in FIG . When the two intensity distributions are superimposed, the overall function of FIG. 3 results in a narrower main maximum and thus a better lateral resolution of the device. The energy state of the sample 4 in the sample point 3 is excited by the interaction of photons of the two light components, the intensity distributions in their main maxima are laterally displaced overlapping one another and have different wavelengths L 1, L 2 or different polarizations P 1, P 2. The interaction of the photons of the different light components results in the excitation in the energy state of sample 4 according to the excitation point mapping function according to FIG. 3. The effective focus of a scanning microscope is narrow in the focal plane, so that detection of the emission light of sample 4 in detector 6 results in a higher one high-resolution image of sample 4 is achieved.

Um eine weitere Verbesserung in der lateralen Auflösung zu erzielen, durchläuft das aus der Punktlichtquelle 1 austretende Laserlicht, nachdem es durch das Separationselement 5 umgelenkt wird, und bevor es von dem Objektiv 2 auf den Probenpunkt 3 abgebildet wird, ein Filterelement 14. Das Filterelement 14 weist einen Mittenbereich 15 auf, der für die Lichtanteile einer oder beider Wellenlängen L₁, L₂ oder einer oder beider Polarisationen P₁, P₂ undurchlässig ist. Ferner weist das Filterelement 14 einen Außenbereich 16 auf, der für die beiden Lichtanteile durchlässig ist. Das Filterelement 14 ist in der Nähe der Eintrittspupille des Objektives 2 angeordnet. Als Filterelement 14 wird ein Filter verwendet, auf das der Mittenbereich 15 durch Aufdampfen einer dielektrischen Schicht erzeugt wird oder ein Farbglas optischer Güte ist, oder dessen Mittenbereich 15 ein Polarisationsfilter aufweist, das den Lichtanteil mit der einen Polarisation P₁ blockiert. Ferner ist der Mittenbereich 15 und der Außenbereich 16 des Filterelementes 14 für das von der Probe 4 abgestrahlte Emissionslicht durchlässig. Die Lichtstrahlachse verläuft durch den Kreismittelpunkt und das Filterelement 14 weist hinsichtlich der Strahlachse einen Neigungswinkel von ein paar Grad auf, um störende Reflexionen zu vermeiden. Vor dem Detektor 6 ist ein Filter 17 zum Abblocken des restlichen Anregungslichtes vorgesehen.In order to achieve a further improvement in the lateral resolution, the laser light emerging from the point light source 1 passes through a filter element 14 after it has been deflected by the separation element 5 and before it is imaged by the objective 2 onto the sample point 3 . The filter element 14 has a central region 15 which is opaque to the light components of one or both wavelengths L₁, L₂ or one or both polarizations P₁, P₂. Furthermore, the filter element 14 has an outer region 16 which is transparent to the two light components. The filter element 14 is arranged in the vicinity of the entrance pupil of the objective 2 . A filter is used as a filter element 14 , on which the central region 15 is produced by vapor deposition of a dielectric layer or a colored glass of optical quality, or the central region 15 of which has a polarization filter which blocks the light component with a polarization P 1. Furthermore, the central region 15 and the outer region 16 of the filter element 14 are transparent to the emission light emitted by the sample 4 . The light beam axis runs through the center of the circle and the filter element 14 has an angle of inclination of a few degrees with respect to the beam axis in order to avoid disturbing reflections. A filter 17 for blocking the remaining excitation light is provided in front of the detector 6 .

Ferner ist zwischen dem Separationselement 5 und dem Filterelement 14 eine Strahlrastereinrichtung 18 vorgesehen, mit der die Probenpunkte 3 der Probe 4 abgerastert werden können. Zwischen dem Separationselement 5 und der Strahlrastereinrichtung 18 ist eine weitere Linse 19 angeordnet, durch deren Wirkung der von der Punktlichtquelle 1 und dem Separationselement 5 kommende Lichtstrahl parallelisiert wird. Dabei entspricht die Summe des Abstandes der Linse 19 zu dem Separationselement 5 und des Abstandes des Separationselements 5 zu den Lochblenden 10, 11 der Brennweite der Linse 19.Furthermore, a beam grid device 18 is provided between the separation element 5 and the filter element 14 , with which the sample points 3 of the sample 4 can be scanned. A further lens 19 is arranged between the separation element 5 and the beam grid device 18 , through the action of which the light beam coming from the point light source 1 and the separation element 5 is parallelized. The sum of the distance between the lens 19 and the separation element 5 and the distance between the separation element 5 and the pinhole diaphragms 10 , 11 corresponds to the focal length of the lens 19 .

Zur weiteren Verbesserung der Auflösung ist vor dem Detektor 6 eine in der Figur nicht dargestellte Blende im Abstand der Brennweite der Linse 19 angeordnet. Üblicherweise wird als Detektorblende eine Lochblende verwendet, oder die Öffnung des Detektors dient als Blende, wobei der Durchmesser der Blende so groß ist, daß ihr Bild im Probenbereich in der Größenordnung des ersten Hauptmaximums der Punktabbildungsfunktion des Fokussierungselementes zur Fokussierung des Emissionslichtes ist. Als Detektor 6 wird ein Fotomultiplier oder ein Halbleiterdetektor verwendet. Aufgrund der Punktabbildung des Probenpunktes 3 auf den Detektor 6 wird der Intensitätsverteilung aus Fig. 3 eine Detektionspunktabbildungsfunktion überlagert, welche zu einer weiteren Verschmälerung des Hauptmaximums führt. Zudem werden Nebenmaxima, die aufgrund der Strahlversetzung in der zu der lateralen Richtung orthogonalen Richtung in der Anregungspunktabbildungsfunktion entstanden sind, reduziert.To further improve the resolution, an aperture, not shown in the figure, is arranged in front of the detector 6 at a distance from the focal length of the lens 19 . A pinhole is usually used as the detector aperture, or the opening of the detector serves as the aperture, the diameter of the aperture being so large that its image in the sample area is of the order of the first main maximum of the point imaging function of the focusing element for focusing the emission light. A photomultiplier or a semiconductor detector is used as the detector 6 . Due to the point mapping of the sample point 3 onto the detector 6 , a detection point mapping function is superimposed on the intensity distribution from FIG. 3, which leads to a further narrowing of the main maximum. In addition, secondary maxima that have arisen in the excitation point mapping function due to the beam displacement in the direction orthogonal to the lateral direction are reduced.

Es sei darauf hingewiesen, daß das in der Fig. 1 dargestellte Ausführungsbeispiel, nämlich ein Rastermikroskop mit erheblicher Verbesserung in der lateralen Auflösung, keine Einschränkung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist. Beispielsweise ist es möglich, anstelle der beiden Laser 7 und 8 nur einen Laser 7 zu verwenden, wobei hinter dem Laser 7 ein Strahlteiler zum Aufspalten des Anregungslichtes in zwei Teilstrahlen vorgesehen sind, die wieder mittels des Verbindungselements 9 vereinigt werden. Soll die Anregung des Energiezustandes in diesem Fall mit Lichtanteilen unterschiedlicher Polarisation erfolgen, so sind polarisationsoptische Elemente vorgesehen, die die Teilstrahlen zueinander in ihrer Polarisation orthogonalisieren. Dies kann dadurch realisiert werden, daß in den beiden Teilstrahlen jeweils ein Polarisator vorgesehen ist, wobei die Polarisatoren zueinander orthogonale oder nahezu orthogonale Polarisationsebenen aufweisen. Ferner kann dies dadurch realisiert werden, daß zwischen dem Laser 7 und dem Strahlteiler ein Polarisator vorgesehen ist, oder statt dessen ein Laser 7 verwendet wird, der polarisiertes Licht emittiert, und daß in dem Strahlengang eines der Teilstrahlen ein L₁/2 Plättchen vorgesehen ist.It should be pointed out that the exemplary embodiment shown in FIG. 1, namely a scanning microscope with a significant improvement in the lateral resolution, is not a limitation of the device according to the invention. For example, it is possible to use only one laser 7 instead of the two lasers 7 and 8 , with a beam splitter behind the laser 7 for splitting the excitation light into two partial beams, which are combined again by means of the connecting element 9 . If the excitation of the energy state is to take place in this case with light components of different polarization, polarization-optical elements are provided which orthogonalize the partial beams to one another in terms of their polarization. This can be realized in that a polarizer is provided in each of the two partial beams, the polarizers having mutually orthogonal or almost orthogonal polarization planes. Furthermore, this can be realized in that a polarizer is provided between the laser 7 and the beam splitter, or instead a laser 7 is used which emits polarized light, and in that an L 1/2 plate is provided in the beam path of one of the partial beams.

Ferner kann statt dem Rückstrahlaufbau eine Transmissionsanordnung verwendet werden, bei welcher das Separationselement 5 durch ein Filter realisiert wird, welches hinter der Probe 4 angeordnet ist, wobei der Detektor 6 hinter dem Filter anzuordnen ist. Im letzteren Fall kann der Detektor 6 direkt hinter der Probe angeordnet werden. Dies ist dann vorteilhaft, wenn das Fluoreszenzlicht der Probe 4 im UV-Bereich liegt, da dann eine Strahlfokussierung schwierig ist. Bei der Transmissionsvorrichtung ist es zudem nicht erforderlich, daß das Filterelement 14 für das Emissionslicht der Probe 4 durchlässig ist.′
Auch kann die Vorrichtung Glasfaser umfassen. Wenn zwei Laser verwendet werden, sind die Fasern derart angeordnet, daß das Licht eines jeden Lasers jeweils in eine Faser eingekoppelt wird. Dabei wirken die Faserenden als Lochblenden 10, 11. Die Faserenden können lateral versetzt angeordnet werden. Dabei können die Fasern sehr einfach mit Hilfe von Mikrometertischen verschoben werden. Bei Verwendung eines Lasers wird jeweils ein Lichtanteil in eine Faser eingekoppelt, wobei die Faserausgänge ebenfalls als Lochblenden wirken. Die Lichtanteile unterschiedlicher Lichteigenschaften können vor dem Einkoppeln mittels eines dichroitischen Spiegels (bei unterschiedlichen Wellenlängen) oder mittels eines Polarisationsstrahlteilerwürfels (bei unterschiedlicher Polarisation) aus dem Strahl getrennt werden.Furthermore, a transmission arrangement can be used instead of the retroreflective structure, in which the separation element 5 is realized by a filter which is arranged behind the sample 4 , the detector 6 being arranged behind the filter. In the latter case, the detector 6 can be arranged directly behind the sample. This is advantageous if the fluorescent light of sample 4 is in the UV range, since beam focusing is then difficult. In the transmission device, it is also not necessary that the filter element 14 is transparent to the emission light of the sample 4. '
The device can also comprise glass fiber. If two lasers are used, the fibers are arranged such that the light of each laser is coupled into one fiber. The fiber ends act as pinholes 10 , 11 . The fiber ends can be laterally offset. The fibers can be moved very easily with the help of micrometer tables. When using a laser, a portion of the light is coupled into a fiber, the fiber outputs also acting as pinholes. The light components of different light properties can be separated from the beam before coupling by means of a dichroic mirror (at different wavelengths) or by means of a polarization beam splitter cube (at different polarization).

Die Probe 4 ist auf einem Scantisch 21 befestigt, der vorzugsweise eine Mikroskoppositionierung der Probe 4 in axialer Richtung und damit ein axiales Rastern erlaubt. Aufbau und Justierung des Rastermikroskopes erfolgt, soweit nicht explizit beschrieben, auf dem Fachmann bekannte Art und Weise.The sample 4 is fastened on a scanning table 21 , which preferably allows microscope positioning of the sample 4 in the axial direction and thus axial scanning. Unless explicitly described, the scanning microscope is constructed and adjusted in a manner known to those skilled in the art.

Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung einer Anordnung gemäß einem anderen erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel. Sich entsprechende Elemente sind mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet, wie in den vorhergehenden Ausführungsbeispielen. Selbstverständlich ist die Erfindung nicht auf die im folgenden gezeigte Anordnung eingeschränkt, sondern es sind auch alle oben beschriebenen Variationen mit diesem Ausführungsbeispiel kombinierbar. Fig. 4 shows a schematic representation of an arrangement according to another embodiment of the invention. Corresponding elements are identified by the same reference numerals as in the previous exemplary embodiments. Of course, the invention is not restricted to the arrangement shown below, but all the variations described above can also be combined with this exemplary embodiment.

Es wird im folgenden insbesondere auf die Komponenten eingegangen, die sich von den vorherigen Ausführungsbeispielen unterscheiden. Das Licht des gepulsten Lasers 7, welcher ein Titan-Saphir-Laser sein kann, wird von einem Frequenzverdopplungselement 22 in seiner Frequenz verdoppelt und von einem ersten Strahlteiler 23 in zwei Lichtanteile aufgespalten. Der erste Lichtanteil a durchläuft den direkten Teilweg bis zu einem zweiten Strahlteiler 24, wohingegen der zweite Lichtanteil b einen längeren Weg über eine Verzögerungsanordnung 25, 26 durchläuft und dann hinsichtlich des ersten Teilstrahles zu einem späteren Zeitpunkt und lateral versetzt auf den zweiten Strahlteiler 24 trifft. Für Verzögerungen in der Größenordnung von 0,1 nsec können für die Verzögerungsanordnung, wie in Fig. 4 dargestellt, Spiegel 25, 26 verwendet werden. Die Lichtanteile a und b fallen zu entsprechend zueinander verzögerten Zeitpunkten und mit einer lateralen Versetzung auf des Separationselement 5, von welchem sie mittels des Objektives 2 auf den Probenpunkt 3 der Probe 4 fokussiert werden. Dort regt der zuerst ankommende Puls des Lichtanteiles a den Zwischenenergiezustand der Probe 4 an. Innerhalb der Lebensdauer des Zwischenenergiezustandes und wenn der erste Puls des ersten Lichtanteiles die Probe 4 bereits verlassen hat, erfolgt die Anregung des Zwischenenergiezustandes in den Energiezustand der Probe 4 mittels des zweiten, zu dem ersten verzögerten und lateral versetzten Puls b. Das Emissionslicht der Probe 4, das von dem durch das Zusammenwirken des ersten und des zweiten Lichtpulses aus dem ersten und dem zweiten Lichtanteil angeregten Energiezustandes der Probe emittiert wird, wird in dem Detektor 6 nachgewiesen. In den Teilwegen der Lichtanteile sind Elemente zur Intensitätsregulierung der Lichtpulse in den Teilstrahlen, beispielsweise Graufilter 27, 28, vorgesehen. Das Absorptionsvermögen dieser Elemente ist derart gewählt, daß unterschiedliche Übergangswahrscheinlichkeiten von dem Übergang von dem Grundzustand zu dem Zwischenenergiezustand und von dem Zwischenenergiezustand in den Energiezustand der Probe kompensiert werden können. Bei der Verwendung des Farbstoffes Rhodamin B beispielsweise ist die Übergangswahrscheinlichkeit von dem Zwischenenergiezustand in den Endenergiezustand 10mal niedriger als die Übergangswahrscheinlichkeit von dem Grundzustand in den Zwischenenergiezustand der Probe. Daher werden in diesem Fall die Elemente zur Regulierung der Intensität der Teilpulse derart gewählt, daß der Lichtpuls des Lichtanteiles b 10mal stärker ist als die Intensität des Lichtpulses des Lichtanteiles a.The components that differ from the previous exemplary embodiments are discussed in particular below. The frequency of the light from the pulsed laser 7 , which can be a titanium-sapphire laser, is doubled by a frequency doubling element 22 and split into two light components by a first beam splitter 23 . The first light component a runs through the direct partial path up to a second beam splitter 24 , whereas the second light component b runs through a longer path via a delay arrangement 25 , 26 and then hits the second beam splitter 24 laterally and laterally offset with respect to the first partial beam. For delays of the order of 0.1 nsec, mirrors 25 , 26 can be used for the delay arrangement, as shown in FIG. 4. The light components a and b fall at correspondingly delayed times and with a lateral offset on the separation element 5 , from which they are focused on the sample point 3 of the sample 4 by means of the objective 2 . There the first arriving pulse of the light component a stimulates the intermediate energy state of the sample 4 . Within the lifetime of the intermediate energy state and when the first pulse of the first light component has already left the sample 4 , the intermediate energy state is excited into the energy state of the sample 4 by means of the second pulse b delayed and laterally offset from the first. The emission light of the sample 4 , which is emitted by the energy state of the sample excited by the interaction of the first and the second light pulse from the first and the second light component, is detected in the detector 6 . Elements for regulating the intensity of the light pulses in the partial beams, for example gray filters 27 , 28 , are provided in the partial paths of the light components. The absorption capacity of these elements is chosen such that different transition probabilities from the transition from the ground state to the intermediate energy state and from the intermediate energy state to the energy state of the sample can be compensated for. For example, when using the dye rhodamine B, the transition probability from the intermediate energy state to the final energy state is 10 times lower than the transition probability from the ground state to the intermediate energy state of the sample. Therefore, in this case the elements for regulating the intensity of the partial pulses are chosen such that the light pulse of the light component b is 10 times stronger than the intensity of the light pulse of the light component a.

Im übrigen kann eine weitere Verbesserung der lateralen Auflösung von Vorrichtung und Verfahren gemäß der Erfindung dadurch erreicht werden, daß mindestens einem Teilstrahl ein Koma zugefügt wird. Dadurch wird die Intensitätsverteilung des Teilstrahls am Probenpunkt auf einer Seite steiler, auf der gegenüberliegenden Seite flacher. Das Koma wird derart dem Teilstrahl zugefügt, daß der steilere Teil der Intensitätsverteilung im Überlappungsbereich der Hauptmaxima der Lichtanteile liegt. Das Koma kann auch beiden Teilstrahlen zugefügt werden. Das Koma kann etwa durch Einführen eines Keiles, z. B. aus Glas, in den jeweiligen Teilstrahl realisiert werden.Otherwise, a further improvement in the lateral Dissolution of device and method according to the invention can be achieved in that at least one partial beam Coma is inflicted. As a result, the intensity distribution of the Partial beam steeper at the sample point on one side, on the opposite side flatter. The coma becomes that Partial beam added that the steeper part of the Intensity distribution in the overlap area of the main maxima Light components. The coma can also have two partial beams be added. The coma can be done by introducing a Wedges, e.g. B. made of glass in the respective beam become.

Im folgenden wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung anhand des ersten Ausführungsbeispieles des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben. Die Probe 4 und die Laser 7 und 8 werden so ausgewählt, daß Photonen aus beiden Lasern 7 und 8 und damit Photonen unterschiedlicher Wellenlänge und/oder Polarisation, zusammenwirken, um einen Zustand der Probe 4 energetisch anregen zu können. Bei Verwendung zweier Wellenlängen ist die Summe der Energien von einem Photon aus dem einen Laser 7 und einem Photon aus dem anderen Laser 8 gleich der Anregungsenergie und in etwa gleich der Differenz zwischen dem Energiezustand vor der Anregung und im angeregten Zustand der Probe. Die Lichtstrahlachsen der Lichtanteile, die durch die Laser 7, 8, die Fokussierungselemente 12, 13 und die Blendenelemente 10, 11 gebildet werden, werden derart gegeneinander versetzt, daß die fokalen Intensitätsverteilungen der Lichtanteile im Probenpunkt in ihren Hauptmaxima überlappend, lateral gegeneinander verschoben werden. Die Probe 4 wird im Fokalbereich des Objektives 2 der erfindungsgemäßen Vorrichtung positioniert. Zwischen der Strahlrastereinrichtung 18 und dem Objektiv 2 wird das Filterelement 14 angeordnet. Der Strahlengang wird so ausgerichtet, daß das von der Lichtquelle 1 und somit von dem Verbindungselement 9 kommende Anregungslicht von dem Separationselement 5 umgelenkt wird, von der Linse 19 in die Strahlrastereinrichtung 18 abgebildet wird, danach das Filterelement 14 durchläuft und von dem Objektiv 2 auf den Probenpunkt 3 abgebildet wird. Das infolge der Anregung emittierte Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht der Probe 4 in dem Probenpunkt 3 durchläuft die Anordnung rückwärts bis zu dem Separationselement 5, von welchem es durch das Filter 17 in den Detektor 6 geleitet wird. Dabei wird der Probenpunkt 3 mit einer sehr hohen lateralen Auflösung gemessen. Mittels der Strahlrastereinrichtung 18 wird der Anregungslichtstrahl automatisch zu einem weiteren Probenpunkt 3′ gelenkt, dessen Emissionslicht ebenfalls in dem Detektor 6 gemessen wird. Entsprechend werden durch Steuern der Strahlrastereinheit die übrigen gewünschten Probenpunkte gemessen, so daß die gesamte Probe 4 mit einer sehr hohen lateralen Auflösung vermessen wird.The use of the device according to the invention is described below with reference to the first exemplary embodiment of the method according to the invention. The sample 4 and the lasers 7 and 8 are selected so that photons from both lasers 7 and 8, and thus photons of different wavelengths and / or polarization, interact to energetically excite a state of the sample 4 . When using two wavelengths, the sum of the energies of a photon from one laser 7 and a photon from the other laser 8 is equal to the excitation energy and approximately equal to the difference between the energy state before the excitation and in the excited state of the sample. The light beam axes of the light components, which are formed by the lasers 7 , 8 , the focusing elements 12 , 13 and the diaphragm elements 10 , 11 , are offset from one another in such a way that the focal intensity distributions of the light components in the sample point overlap in their main maxima, laterally offset from one another. The sample 4 is positioned in the focal area of the objective 2 of the device according to the invention. The filter element 14 is arranged between the beam grid device 18 and the objective 2 . The beam path is aligned so that the excitation light coming from the light source 1 and thus from the connecting element 9 is deflected by the separation element 5 , is imaged by the lens 19 in the beam raster device 18 , then passes through the filter element 14 and from the lens 2 to the Sample point 3 is shown. The fluorescent or phosphorescent light of the sample 4 emitted as a result of the excitation in the sample point 3 passes through the arrangement backwards to the separation element 5 , from which it is passed through the filter 17 into the detector 6 . Sample point 3 is measured with a very high lateral resolution. By means of the beam grid device 18 , the excitation light beam is automatically directed to a further sample point 3 ', the emission light of which is also measured in the detector 6 . Accordingly, the remaining desired sample points are measured by controlling the beam grid unit, so that the entire sample 4 is measured with a very high lateral resolution.

Claims

1. A method for the optical excitation of an energy state of a sample in a sample point with high spatial resolution, in which the excitation light of a point light source is focused on the sample point to be measured and excites the energy state there, characterized in that the energy state of the sample ( 4 ) in the sample point ( 3 ) is excited by the interaction of at least two light components contained in the excitation light, which differ from one another by at least one light property, and that the light beam axes of the light components are offset from one another in such a way that the focal intensity distributions of the light components in the sample point ( 3 ) have their main maxima overlapping, laterally shifted against each other.

2. The method according to claim 1, characterized, that a light property in which the light components of the Differentiate excitation light, the wavelength is.

3. The method according to claim 2, characterized, that the difference in the wavelengths (L₁, L₂) of Light components is at least 1 nm.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized, that a light property in which the light components of the Differentiate excitation light from each other, the polarization is.

5. The method according to claim 4, characterized, that the light components are orthogonal or almost orthogonal are polarized to each other.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that at least the light portion of the excitation light with the one light property is filtered out from a central region of the excitation light beam before the excitation light is focused on the sample ( 3 ).

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that two different light components of the excitation light in the light property are filtered out from the central region of the excitation light beam before the excitation light is focused on the sample ( 3 ).

8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the emission light emitted by the sample ( 4 ) in the sample point ( 3 ) due to the excitation is separated from the excitation light and detected in a detector ( 6 ).

9.Device for the optical excitation of an energy state of a sample in a sample point with a high spatial resolution, with a point light source and with an objective which focuses the excitation light coming from the point light source to excite the energy state on the sample point to be measured of a sample which can be arranged in the focal region of the objective, characterized in that the excitation light of the point light source ( 1 ) comprises at least two light components which differ from one another in at least one light property and which are suitable for stimulating the energy state of the sample ( 3 ) by acting together, and in that the beam axes of the light components counteract one another are staggered so that the focal intensity distributions of the light components in the sample point ( 3 ) overlap in their main maxima, are laterally shifted from each other.

10. The device according to claim 9, characterized, that a displacement element for displacing the beam axes the light component is provided.

11. The device according to claim 9 or 10, characterized in that a filter element ( 14 ) is arranged between the point light source ( 1 ) and the lens ( 2 ), which has a central region ( 15 ) impermeable to at least the light component of the excitation light with the one light property. and has an outer region ( 16 ) which is permeable to the light components of the excitation light.

12. The apparatus according to claim 11, characterized in that the central region ( 15 ) of the filter element ( 14 ) is opaque for two different light components of the excitation light in the light property.

13. Device according to one of claims 9 to 12, characterized in that a separation element ( 5 ) for separating the emission light emitted by the sample ( 4 ) from the excitation light and a detector ( 6 ) is provided for detecting the emission light.

14. Device according to one of claims 11 to 13, characterized in that the filter element ( 14 ) is arranged at the location or in the vicinity of the entrance pupil of the objective ( 2 ).

15. Device according to one of claims 11 to 13, characterized in that the filter element ( 14 ) is arranged at the location or in the vicinity of an optically conjugate plane to the entrance pupil of the objective ( 2 ).

16. The device according to one of claims 11 to 15, characterized in that the central region ( 15 ) of the filter element ( 14 ) has the shape of a circular disc, to which the outer region ( 16 ) connects.

17. The apparatus according to claim 16, characterized in that the filter element ( 14 ) is arranged such that the beam axis of the partial beams of the excitation light extends approximately through the center of the circular disc and the circular disc intersects at an angle which is slightly less than 90 ° .

18. Device according to one of claims 11 to 17, characterized in that the central region ( 15 ) is formed by a dielectric layer applied to the filter element ( 14 ) or by a colored glass of optical quality.

19. Device according to one of claims 11 to 18, characterized in that the central region ( 15 ) and the outer region ( 16 ) of the filter element ( 14 ) are transparent to the emission light emitted by the sample ( 4 ).

20. Device according to one of claims 9 to 19, characterized in that the point light source ( 1 ) comprises at least two lasers ( 7, 8 ), the light of different wavelengths (L₁, L₂) and / or different polarization (P₁, P₂) than Emit partial beams.

21. The apparatus according to claim 20, characterized in that the point light source ( 1 ) has a connecting element ( 9 ) for bringing together the partial beams of the lasers ( 7, 8 ).

22. The apparatus according to claim 21, characterized in that the connecting element ( 9 ) is a dichroic mirror.

23. Device according to one of claims 20 to 22, characterized in that between the connecting element ( 9 ) and each laser ( 7, 8 ) each have an aperture element ( 10 , 11 ) and a focusing element ( 12 , 13 ) for focusing the respective light beam the light components are provided on the corresponding diaphragm element ( 10 , 11 ).

24. Device according to one of claims 9 to 19, characterized in that the point light source ( 1 ) comprises a laser ( 7 ), behind the laser ( 7 ) a beam splitter for splitting the excitation light beam into two partial beams and a connecting element ( 9 ) for Unification of the partial beams is provided.

25. The device according to one of claims 20 to 24, characterized, that polarization-optical elements are provided which the Partial beams to each other in their polarization orthogonalize.

26. Device according to one of claims 20 to 25, characterized in that at least one pulsed laser ( 7 , 8 ) is used.

27. The device according to one of claims 9 to 26, characterized in that the separation element ( 5 ) is a dichroic mirror.

29. Device according to one of claims 9 to 28, characterized in that the separation element ( 5 ) contains a combination of color filters and dielectric filters.

28. Device according to one of claims 9 to 26, characterized in that the separation element ( 5 ) has at least one color filter.

30. Device according to one of claims 9 to 29, characterized in that the detector ( 6 ) is arranged at a short distance behind the sample ( 4 ).

31. Device according to one of claims 9 to 29, characterized in that the detector ( 6 ) is a point detector.

32. Device according to one of claims 9 to 31, characterized in that a focusing element is arranged in front of the detector ( 6 ), which focuses the emission light into the detector ( 6 ).

33. Device according to one of claims 9 to 32, characterized in that between the light source ( 1 ) and the lens ( 4 ) a beam raster device ( 18 ) for controlled scanning of the sample ( 4 ) is provided with the excitation light.

34. Device according to one of claims 9 to 33, characterized in that the sample ( 4 ) is arranged on a positioning table ( 21 ) which is suitable for performing a mechanical grid movement at least in the direction of the optical axis.

35. Device according to one of claims 9 to 34, characterized in that the point light source ( 1 ) is designed such that it emits pulsed excitation light, one of the light components, the first, being suitable for exciting an intermediate energy state of the sample ( 4 ) , another, the second one, which is suitable for stimulating the energy state of the sample ( 4 ) from the intermediate energy state and the light property, in which the light parts differ, the point in time of the respective light pulse at the sample point ( 3 ) is.

36. Apparatus according to claim 35, characterized in that the light source ( 1 ) has a pulsed laser ( 7 ), a first beam splitter for splitting the excitation light coming from the laser ( 7 ) into the first and second light components and a second beam splitter Combining the two light components comprises a delay device ( 25 , 26 ) for delaying the light pulses of the second light component, the second light pulses, being provided in the beam path of the second light component.

37. Apparatus according to claim 36, characterized in that the delay device comprises two mirrors ( 25, 26 ).

38. Apparatus according to claim 37, characterized in that the mirrors ( 25 , 26 ) serve simultaneously as the displacement element for displacing the beam axes of the light components.

39. Device according to claim 37 or 38, characterized, that the delay device is designed such that the time delay between the light pulse of the first Light component, the first light pulse, and the second Light pulse less than 1 ns, preferably about 0.1 ns or less, or about 30 mm or less in optical path difference.

40. The method according to any one of claims 36 to 39, characterized in that the light source ( 1 ) emits short pulses, preferably pulses that are shorter than 0.1 ns.

41. Device according to one of claims 36 to 40, characterized in that elements for intensity regulation ( 27 , 28 ) of the light portion are provided in the light path of the respective light portion.

42. Apparatus according to claim 35 or 36, characterized in that a non-linear optical unit ( 22 ) is provided behind the laser ( 7 ) for changing the light wavelength.

43. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the point light source ( 1 ) emits pulsed excitation light, that the excitation of the energy state of the sample ( 4 ) takes place in such a way that a first light pulse of a first light portion an intermediate energy state of the sample ( 4th ) from which the excitation into the energy state of the sample ( 4 ) takes place with the second light pulse of the second light component, and that a light property in which the light components differ, the time of the respective light pulse at the sample point ( 3 ) is.

44. The method according to claim 43, characterized in that the difference between the first point in time of the first light pulse and the second point in time of the second light pulse at the sample point ( 3 ) is less than the life of the intermediate state and preferably a tenth of the life of the intermediate state.

45. The method according to claim 44, characterized in that the difference between the first and the second time is selected so that the first light pulse has already left the sample ( 4 ) at the second time.

46. The method according to any one of claims 43 to 45, characterized, that the difference between the first and the second Time is 1 ns, preferably 0.1 ns or less.

47. The method according to any one of claims 43 to 46, characterized, that the light pulses are steep in time, a length of time of about a tenth of the life of the Intermediate state, preferably 0.1 nsec or less.