DE4323129C2 - Inverses Mikroskop - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein inverses Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruches 1. Ein derartiges inverses Mikroskop ist aus der DE 26 40 974 A1 bekannt. Eine Laserbeleuchtung ist bei diesem bekannten inversen Mikroskop nicht vorgesehen.

Aus der DE 35 27 322 C2 ist ein Mikroskop bekannt, bei dem Laserlicht in den Auflichtstrahlengang für die konventionelle Beleuchtung eingekoppelt wird. Hier dient das Laserlicht jedoch nicht zur Ausleuchtung des Objektes an sich. Mit Hilfe des Laserlichtes wird vielmehr ein Autofokussignal erzeugt. Die Laser sind daher sehr leistungsschwach ausgelegt, so daß ihre Strahlung nicht augenschädigend wirkt.

Aus der US 5 032 720 und der WO 92/02839 A1 sind Laserscanaufsätze für konventionelle Mikroskope bekannt, bei denen ein Laserstrahl für die Objektbeleuchtung bei der konfokalen Mikroskopie verwendet wird. Die Einkoppelung des Laserstrahls erfolgt hier jedoch von oben in den Photoausgang des Mikroskops. Abgesehen davon, daß dadurch ein sehr hoher und leicht instabiler Aufbau entsteht, haben derartige Zusatzsysteme den Nachteil, daß der Photoausgang für konventionelle Anwendungen nicht mehr zur Verfügung steht.

Aus dem Aufsatz "Laser-Scan-Mikroskop - Aufbau und Anwendungen" in GIT Fachz. Lab. 28, (1984) ist ein Laser-Scan-Mikroskop bekannt, bei dem der Laserstrahl über den konventionellen Auflichtstrahlengang in das Mikroskop eingekoppelt wird. Zur Vermeidung von Augenschäden ist bei Laser-Scan-Bettieb der visuelle Beobachtungsstrahlengang abgeblockt. Durch welche Mittel der visuelle Beobachtungsstrahlengang abgeblockt wird, und ob oder wie eine eventuelle Fehlbedienung dergestalt, daß der Beobachtungsstrahlengang trotz Laser-Scan-Betriebs frei gegeben ist, vermieden ist, ist dem Aufsatz nicht entnehmbar.

Aus der EP 0 101 572 B1 ist ein Mikroskop mit einem Laser- Mikromanipulator bekannt. Der Manipulationsstrahl wird über den konventionellen Auflichtstrahlengang in das Mikroskop eingekoppelt. Zwischen dem Laser und dem Auflichtreflektor ist noch ein Shutter angeordnet, dessen Funktionsweise jedoch nicht näher beschrieben ist. Der Auflichtreflektor ist als Teilspiegel ausgebildet. Dadurch wird stets das am Objekt gestreute oder reflektierte Laserlicht in die Okulare gespiegelt. Bei Fokussierung auf stark reflektierende Objektstrukturen besteht daher eine erhebliche Gefahr für Augenschädigungen des in die Okulare einblickenden Beobachters.

Die vorliegende Erfindung soll ein inverses Mikroskop mit einer Laserbeleuchtung bzw. einer anderen augenschädigenden Beleuchtungsstrahlung schaffen, bei dem Augenschädigungen des Benutzers durch die Laserstrahlung sowohl beim Einblick in das Okular als auch beim Hantieren am Objekt vorgebeugt ist.

Dieses Ziel wird durch ein inverses Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruches 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der abhängigen Ansprüche.

Das erfindungsgemäße Mikroskop weist ein inverses Stativ mit einem an seiner Vorderseite angeordneten Beobachtungstubus auf. An einem Schieber oder Revolver sind mehrere Strahlteiler oder Spiegel zur Umlenkung der augenschädigenden Strahlung, beispielsweise Laserstrahlung, in Richtung auf ein Objektiv vorgesehen. Die Einkopplung der Laserstrahlung erfolgt von der der Vorderseite gegenüberliegenden Rückseite in den für konventionelle Auflichtbeleuchtung vorgesehenen Strahlengang.

Der Schieber oder Revolver des Auflichtreflektors enthält in einer Schaltposition einen Vollspiegel. Der Vollspiegel lenkt dann das gesamte Laserlicht zum Objektiv um, und das an der Probe reflektierte Licht in den Auflichtstrahlengang zurück.

Dadurch wird der Einfall von Laserlicht in den Beobachtungstubus vermieden.

Des weiteren ist ein Sensor zur Erkennung der Schaltposition, in der der Vollspiegel in den Strahlengang eingeschaltet ist, vorgesehen. Durch eine Kopplung dieses Sensors mit einem zwischen dem Laser und dem Vollspiegel angeordneten Shutter wird dann sichergestellt, daß nur dann Laserstrahlung in das Mikroskop eingekoppelt wird, wenn der Vollspiegel in den Strahlengang eingeschaltet ist. In einer anderen Schaltposition des Schiebers, in der ein Strahlteiler für die visuelle Beobachtung in den Strahlengang eingeschaltet ist, ist dann die Laserbeleuchtung abgeschaltet. Dadurch ist sichergestellt, daß der Strahlengang zum Auge immer gesperrt ist, wenn der Laserstrahl freigegeben ist.

Weiterhin ist oberhalb der Objektebene eine Durchlichtbeleuchtungseinheit vorhanden. Die Gehäusewandung dieser Einheit stellt eine Abschirmung dar. Für eine gute Zugänglichkeit des Objektraumes ist die Durchlichtbeleuchtungseinrichtung über einen Arm schwenkbar am Stativ angeordnet. An dem Schwenkgelenk des Armes sind wiederum Sensoren vorgesehen, die mit dem Shutter zur Unterbrechung des Laserstrahls gekoppelt sind. Bei vom Objekt weggeschwenkten Arm wird dann der Laser ebenfalls unterbrochen. Die Sensoren am Schwenkgelenk und am Auflichtreflektorschieber sind über eine logische UND-Schaltung mit der Shuttersteuerung gekoppelt, so daß der Laserstrahl nur dann freigegeben ist, wenn der Sensor des Reflektorschiebers und der Sensor des Schwenkgelenkes gleichzeitig ein Signal erzeugen.

Das inverse Mikroskop ist vorzugsweise als Laser-Scan-Mikroskop ausgebildet. Zwischen dem Laser und dem Strahlteiler oder Spiegel ist eine Strahlablenkeinheit, die den Laserstrahl in zwei zueinander senkrechten Richtungen ablenkt, vorgesehen.

Damit keine Eingriffe an dem Mikroskopstativ erforderlich sind, ist die Strahlablenkeinheit vorzugsweise in einem separaten, hinter dem Mikroskopstativ angeordneten Gehäuseteil angeordnet.

Da die Laserstrahlung auch in den konventionellen Auflichtstrahlengang eingekoppelt wird, bestehen hinsichtlich der Anwendungsmöglichkeiten des Mikroskops keinerlei Einschränkungen. Die Einkopplung der Laserbeleuchtung von der Rückseite des Stativs bewirkt darüber hinaus, daß die Zugänglichkeit des Mikroskoptisches in keiner Weise eingeschränkt wird. Der Raum seitlich des Mikroskopstativs steht voll für die Positionierung von Mikromanipulatoren etc. zur Verfügung. Da für den Auflichtstrahlengang am Mikroskopstativ üblicherweise ohnehin eine Schnittstelle zur Ankopplung der Auflichtbeleuchtung vorgesehen ist, sind keine baulichen Veränderungen am Stativ erforderlich.

Für visuelle Auflichtuntersuchungen sollte darüberhinaus zwischen dem Strahlteiler oder Spiegel und der Ablenkeinrichtung eine konventionelle Beleuchtungseinrichtung, beispielsweise das Licht einer Halogenlampe in den Auflichtstrahlengang einkoppelbar sein. Dies kann beispielsweise über einen Klappspiegel erfolgen.

Für die Mikroskopie mit der konventionellen Beleuchtung kann anstelle des Vollspiegels einer der Strahlteiler in den Strahlengang geschaltet werden. Das Objekt ist dann auch durch die Okulare beobachtbar.

Im folgenden werden Einzelheiten der Erfindung anhand der in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispiele näher erläutert.

Im einzelnen zeigen:

Fig. 1 ein Laserscan-Mikroskop inverser Bauart nach der Erfindung in einem die optische Achse des Objektivs enthaltenden Schnitt und

Fig. 2 eine Prinzipskizze des Strahlengangs in dem Mikroskop nach Fig. 1.

Das in der Fig. 1 dargestellte inverse Mikroskop hat ein Stativ (1), an dessen Vorderseite (2) ein Binokulartubus (3) angeordnet ist. Unter dem Objekttisch (6) sind mehrere Objektive (5) an einem Objektivrevolver (4) aufgenommen. Der entlang der optischen Achse (7) des Objektivs (5) verlaufende Beobachtungsstrahlengang wird über einen unterhalb des Objektivs angeordneten Spiegel schräg nach oben zum Okulartubus (3) gelenkt. Zwischen dem Objektiv (5) und dem Spiegel (8) ist der Auflichtreflektorschieber (9) angeordnet. Der bisher beschriebene Aufbau entspricht dem aus der DE 39 38 412 A1 bekannten inversen Mikroskop. Hinsichtlich der weiteren im Beobachtungsstrahlengang angeordneten Komponenten sowie der Ausspiegelung in den Phototubus sei daher ausdrücklich auf diese Offenlegungsschrift verwiesen.

Der Auflichtreflektorschieber (9) hat mindestens drei Schaltstellungen. Eine dieser drei Schaltstellungen ist frei und dient der visuellen Durchlichtmikroskopie. In der zweiten Schaltstellung ist ein 50%-Strahlteiler für die visuelle Auflichtmikroskopie und in der dritten Schaltstellung ein Vollspiegel (10) für die konfokale Mikroskopie vorgesehen. In einer anderen Ausführung für Fluoreszenzanwendungen hat der Reflektor vier Schaltpositionen, von denen eine mit dem Vollspiegel für die konfokale Mikroskopie und zwei weitere mit Fluoreszenz-Filtersätzen bestückt sind. Die vierte Position ist für die visuelle Durchlichtmikroskopie unbestückt oder mit einem weiteren Fluoreszenzfiltersatz ausgerüstet.

Auf der dem Okulartubus (3) abgewandten Rückseite (11) des Mikroskopstatives ist ein Scanmodul (12) angeordnet. Das Laserscanmodul (12), das ein eigenes Gehäuse hat, besteht im 1 wesentlichen aus einer Scaneinheit, z. B. zwei Galvanometerscannern, die den senkrecht zur Zeichenebene einfallenden Laserstrahl in zwei zueinander senkrechten Richtungen ablenkt. Eine hinter der Scaneinheit angeordnete Linse (15) bildet zusammen mit der im Mikroskopstativ angeordneten Tubuslinse (17) ein Relaislinsensystem, das die beiden Scanspiegel (13, 14) in die beleuchtungsseitige Pupille des Objektivs (5) abbildet.

Die Einkopplung des Laserstrahls in das Stativ (1) erfolgt über einen Spiegel (16) durch den im Mikroskopstativ ohnehin vorhandenen Auflichtstrahlengang (18). Da ein solcher Auflichtstrahlengang (18) in der Regel bei sämtlichen Mikroskopstativen ohnehin vorhanden ist, läßt sich damit das Scanmodul (12) leicht an die unterschiedlichsten Mikroskopstative adaptieren.

Zwischen dem Umlenkspiegel (16) und der Einkopplung des Laserstrahls in das Mikroskopstativ (1) ist noch ein Klappspiegel (19) vorgesehen, über den eine hier nicht dargestellte konventionelle Mikroskopleuchte anstelle des Laserstrahls zur visuellen Auflichtmikroskopie in den Auflichtstrahlengang einkoppelbar ist.

Am Reflektorschieber (9) ist die Position des Vollspiegels (10) durch einen Sensor markiert. Dieser Sensor besteht hier speziell aus zwei Magneten (21), die in zwei kleinen Bohrungen im Reflektorschieber (9) aufgenommen sind, und zwei diesen gegenüberstehenden, an der Führung des Reflektorschiebers aufgenommenen Sonden. Stehen sich die Magneten (21) und die Sonden (20) gegenüber, so triggert das dabei entstehende Signal einen hier nicht dargestellten Shutter im Strahlengang des Laserlichts und gibt den Strahlengang frei. Da nur die Schaltstellung des Vollspiegels (10) durch Magnete (21) markiert ist, wird der Laserstrahlengang für jede andere Schaltstellung des Reflektorschiebers (9) oder bei Nichtvorhandensein dieses Schiebers unterbrochen. Eine Schädigung der Augen beim Einblick in den Okulartubus (3) ist dadurch ausgeschlossen. Die Ausführung der Sicherheitseinrichtung mit zwei Magneten erlaubt dabei, den Ausfall eines Sensors festzustellen, so daß auch bei einer Fehlfunktion eines Sensors die Laserstrahlung unterbrochen wird.

Oberhalb des Objekttisches (6) ist an einem um eine horizontale Achse (23) schwenkbaren Arm (22) ein Durchlichtkondensor (24) und darüber ein Klappspiegel (25) angeordnet. Über den Klappspiegel (25) kann wahlweise das Licht einer hier nicht dargestellten, oberhalb der Zeichenebene liegenden konventionellen Durchlichtbeleuchtung eingespiegelt oder für die Scanmikroskopie auf einen unterhalb der Zeichenebene liegenden Detektor ausgespiegelt werden. Das Gehäuse, in dem der Durchlichtkondensor (24) und der Klappspiegel (25) sowie der Detektor und die Durchlichtbeleuchtungseinrichtung angeordnet sind, dient gleichzeitig zum Schutz vor einem unbeabsichtigten Einblick in das aus dem Objektiv (5) austretende Laserlicht. Damit beim Wegklappen des Armes (22) ein solcher unbeabsichtigter Einblick vermieden ist, ist auch hier ein Sensor (26, 27) vorgesehen. Die Signale dieses aus Magneten (26) und Sonden (27) bestehenden Sensors steuern ebenfalls den Shutter im Laserstrahlengang. Die Signale der Sensoren (20, 21) und (26, 27) werden dazu im Sinne einer logischen UND-Schaltung miteinander verknüpft, so daß der Laserstrahlengang nur dann freigegeben ist, wenn beide Sensoren den sicheren Zustand anzeigen.

Wie aus der Fig. 2 hervorgeht, ist das inverse Laserscan- Mikroskop modular aufgebaut. Es besteht aus drei Standardblöcken (A, B und C) sowie im Prinzip beliebig vielen zusätzlichen Lasermodulen (D und E). Das Modul (A) stellt dabei das Mikroskopstativ und das Modul (B) das Scanmodul dar. Die einzelnen optischen Komponenten sind in der Fig. 2 mit denselben Bezugszeichen versehen wie in der Fig. 1. Sämtliche Komponenten sind in der Fig. 2 zur Vereinfachung in einer Ebene dargestellt, obwohl sie im tatsächlich realisierten Mikroskop in unterschiedlichen Ebenen liegen.

Da auf die Komponenten der Module (A und B) bereits im Zusammenhang mit der Fig. 1 eingegangen worden ist, wird auf eine nochmalige Beschreibung dieser Komponenten verzichtet.

An das Scanning-Modul (B) ist das Detektor-Modul (C) angeschlossen. Dieses Detektor-Modul enthält einen Laser (31) mit einem vorgeschalteten Shutter (32). Der Shutter (32) ist über einen Elektromagneten angetrieben. Ein Farbteiler (33) lenkt den aus dem Laser (31) austretenden Laserstrahl auf eine Strahlaufweitung (34, 35). Ein weiterer Farbteiler (36) lenkt den aus der Strahlaufweitung (34, 35) austretenden kollimierten Laserstrahl zur Ablenkeinheit (13, 14). Für die Auflichtmikroskopie kann hier auch ein Neutralteiler oder ein Polarisationsteiler verwendet werden.

Nach Durchlauf der Scaneinrichtung (13, 14) wird der kollimierte Laserstrahl vom Vollspiegel (10) zum Objektiv (5) umgelenkt und von diesem auf das hier nicht dargestellte Präparat fokussiert.

Das durch das Laserlicht im Präparat angeregte Fluoreszenzlicht bzw. das reflektierte Licht durchläuft zwischen dem Objektiv und dem Teiler (36) denselben Strahlengang in entgegengesetzter Richtung. Da sich das Fluoreszenzlicht hinichtlich der Wellenlänge von dem Laserlicht unterscheidet, transmittiert das Fluoreszenzlicht den Farbteiler (36). Über zwei weitere Farbteiler (37, 38) mit unterschiedlichen spektralen Transmissionseigenschaften und einem Vollspiegel (39) wird das Fluoreszenzlicht drei parallelen konfokalen Detektionskanälen zugeführt. Jeder dieser konfokalen Detektionskanäle enthält ein Objektiv (40, 41, 42), eine Konfokalblende (46, 44, 45) sowie einen Photodetektor (47, 48, 49) zur Umwandlung optischer Strahlung in elektrische Signale. Die Konfokalblenden (46, 44, 45) sind dabei jeweils in einer zur Fokusebene des Objektivs (5) konjugierten Ebene angeordnet. Jede dieser Konfokalblenden ist unabhängig von der anderen über entsprechende von außen zugängliche Justierschrauben (nicht dargestellt) zentrierbar sowie bezüglich ihres Öffnungsdurchmessers variierbar. Dadurch ist die Tiefenauflösung der mikroskopischen Abbildung für jede Fluoreszenzwellenlänge separat einstellbar.

Der Teiler (36), der den Beleuchtungsstrahlengang vom Meßstrahlengang trennt sowie die Farbteiler (37, 38) zur Aufteilung des Meßlichtes in die unterschiedlichen Detektionskanäle sind jeweils in hier nichtdargestellten Reflektorschiebern aufgenommen. Durch die unterschiedlichen Kombinationen der Reflektorschieber sind daher die unterschiedlichsten Wellenlängenkombinationen einstellbar und simultan zu registrieren. Die Reflektorschieber, in denen die Farbteiler (37, 38) aufgenommen sind, haben dabei eine leere Schaltstellung. Dadurch ist es möglich, bei Messung sehr schwacher Fluoreszenzen einen Reflektorschieber auf vollen Durchgang zu schalten, so daß keine zusätzliche Abschwächung des ohnehin schon schwachen Fluoreszenzlichtes erfolgt.

Wie des weiteren durch die Module (D und E) angedeutet ist, sind für Anwendungen mit mehreren Anregungswellenlängen im Prinzip beliebig viele zusätzliche externe Laser-Module an das Detektor- Modul (C) ankoppelbar. Jedes dieser zusätzlichen Laser-Module (D und E) besteht im wesentlichen aus einem Laser (61, 51), einem eigenen Shutter (62, 52), gegebenenfalls Filter zur Linienselektion (hier nicht dargestellt) bei Multiline-Lasern und justierbaren Einkoppeloptiken (63, 53). Jede dieser justierbaren Einkoppeloptiken (63, 53) besteht aus zwei justierbaren Spiegeln, von denen hier jedoch lediglich einer dargestellt ist.

Anhand der Figuren ist ein besonders vorteilhaftes Ausführungsbeispiel der Erfindung beschrieben. Es sind jedoch auch zahlreiche Variationsmöglichkeiten möglich. Insbesondere können für die Erzeugung der Shuttersignale andere Sensortypen verwendet werden, beispielsweise Mikroschalter oder einfache elektrische Kontakte. Außerdem können auch im Detektormodul (C) mehrere Laser oder mehr als drei parallele Detektionskanäle vorgesehen sein.

Für die Erfindung ist es wesentlich, daß der Vollspiegel (10) kein Laserlicht transmittiert. Es ist daher nicht zwingend erforderlich, daß der Vollspiegel (10) jegliche Wellenlänge vollständig reflektiert. Es ist vielmehr völlig ausreichend, wenn der Vollspiegel (10) Licht der Laserwellenlänge, oder im Falle mehrerer Laser unterschiedlicher Wellenlängen das Licht aller Laserwellenlängen, vollständig reflektiert.

Claims (4)

1. Inverses Mikroskop, mit
einem Stativ (1),
einem an der Vorderseite (2) des Stativs (1) angeordneten Okulartubus (3),
einem Objektivrevolver (4) mit daran aufgenommenen Objektiv (5),
einem zwischen dem Objektiv (5) und dem Okulartubus (3) in den Strahlengang eingefügten Auflichtreflektor zur Umlenkung eines von der Rückseite des inversen Mikroskopes her einfallenden Beleuchtungsstrahlenganges (18) in Richtung auf das Objektiv (5),
und mit einer Durchlichtbeleuchtungseinrichtung (24, 28), die aus ihrer Wirkstellung herausschwenkbar ist,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein Laser (31, 51, 61) für den Beleuchtungsstrahlengang vorgesehen ist,
daß der Auflichtreflektor einen in den Beleuchtungsstrahlengang einbringbaren Vollspiegel (10) aufweist, der den Laserstrahl in Objektrichtung umlenkt,
daß ein die Stellung des Vollspiegels (10) registrierender Sensor (20, 21) vorgesehen ist, der einen am Laserausgang angeordneten Shutter (32, 52, 62) ansteuert und den Laserstrahl nur dann frei schaltet, wenn der Vollspiegel (10) in den Strahlengang eingebracht ist,
und daß die Durchlichtbeleuchtungseinrichtung (24, 28) mit einem weiteren, ebenfalls den Shutter (32, 52, 62) ansteuernden Sensor (26, 27) verbunden ist, der den Laserstrahl vermittels des Shutters nur dann frei schaltet, wenn die Durchlichtbeleuchtungsvorrichtung (24, 28) in Wirkstellung ist.

2. Inverses Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Scanneinrichtung (13, 14) zum Scannen des zu untersuchenden Objektes vorgesehen ist.

3. Inverses Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlablenkeinheit (13, 14) der Scanneinrichtung in einem hinter dem Mikroskopstativ (1) angeordneter, separaten Gehäuseteil (12) angeordnet ist.

4. Inverses Mikroskop nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß eine konventionelle Beleuchtungseinrichtung vorgesehen ist und daß der Vollspiegel (10) gegen einen teildurchlässigen Strahlteiler austauschbar ist.