DD300382A7

DD300382A7 - Verfahren zur aktivierung von polystyren-festkoerperoberflaechen

Info

Publication number: DD300382A7
Application number: DD28864786A
Authority: DD
Inventors: Werner Schoessler; Dieter Ilchmann
Original assignee: Imtec Immundiagnostika Gmbh I.G.,De
Priority date: 1986-04-02
Filing date: 1986-04-02
Publication date: 1992-06-11

Abstract

Verfahren zur Aktivierung von Polystyren-Festkoerperoberflaechen. Die Erfindung bezieht sich auf Polystyrenoberflaechen, die nach der Aktivierung zur Bindung von Biomakromolekuelen, biologischen Materialen und niedermolekularen Verbindungen eingesetzt werden. Anwendungsgebiete sind die pharmazeutische Industrie, die Biowissenschaften, die Biotechnologie sowie die Medizin. Die Aktivierung der Oberflaeche erfolgt erfindungsgemaesz mit Organosilanen der allgemeinen Formel{Aktivierung; Oberflaeche; Polystyren; Bindung; Biomakromolekuele; biologische Materialien; niedermolekulare Verbindungen; Organosilan; Nachweis; Immobilisierung}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aktivierung von Festkörperoberflächen aus Polystyren zur nachfolgenden Bindung von Proteinen, Nukleinsäuren, niedermolekularen Liganden, Mikroorganismen, Zellen und anderen biologischen Materialien. Das Verfahren findet Anwendung in der pharmazeutischen Industrie, den Biowissenschaften, in der Biotechnologie sowie in der Medizin.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Spezifische und empfindliche immunologische Methoden zur quantitativen Bestimmung von Antigenen, Antikörpern, Haptenen, Viren, Mikroorganismen etc. erlangten in den letzten Jahren eine herausragende Bedeutung in der medizinischen und biowissenschaftlichen Forschung sowie in der klinischen Praxis. Insbesondere die als Immunoassays bezeichneten Methoden iur Bestimmung von Antigenen, Antikörpern, Haptenen etc. haben eine weite Verbreitung gefunden, da sie die Vorteile der hohen Spezifität immunologischer Reaktionen mit der extrem hohen Sensivität des Detektionssystems (Radioimmunoassay, Enzymimmunoassay, Fluoroimmunoassay etc.) in sich vereinigen.

Unter den zahlreichen beschriebenen Varianten hat die sogenannte Festphasentechnik („solid phase"-Technik), bei der einer der immunologischen Reaktionspartner an eine feste Phase gebunden wird und somit eine leichte Trennung der gebildeten Antigen-Antikörper Komplexe von den freien, ungebundenen Reaktionspartnern ermöglicht, eine weite Verbreitung gefunden. Gegenwärtig wird fast ausschließlich das auf K. J.Catt und G. W.Tregear (Science 15 [1967] 1570) zurückgehende Verfahren der adsorptiven Biodung von Proteinen an fest Kunststoffphasen, vorzugsweise Polystyren, angewandt (Übersicht: J.E.Herrmann: Methode in Enzyinol. 73 [1981] 239). Allerdings ist dieses Verfahren mit einigen Nachteilen verbunden:

- Die Beladungsdichte an Plastematerialien und damit die Empfindlichkeit des Immunoassays werden durch das jeweilige Kunststoffmaterial, die zur Verfügung stehende Oberfläche sowie die Größe des Proteins limitiert.

- Während der einzelnen Inkubations- und Waschvorgänge im Immunoassay werden erhebliche Proteinmengen (68% bei Virusantigenen: J. E. Herrmann, R. M. Hendry, M. F. Collins: J. Clin.Microbiol. 10 [1979] 210; 50% bei Antikörpern: W. Schößler, G. Wegner: Z. med. Labordiagn. 24 [1983] 177) desorbiert. Derartige Desorptionen beeinflussen wiederum die Empfindlichkeit ungünstig und bestimmen entscheidend den Fehler der Methode.

- Die mit Proteinen beladenen Plastematerialien können nach Ablauf der Immunreaktion nur einmal verwendet werden, so dafs sehr wertvolle und nur aufwendig zu präparierende Proteine verlorengehen.

- Die Verwendung dieser Plastematerialien als Einweggefäße stellt bei größeren Probenzahlen in der klinischen Routine einen nicht unerheblichen ökonomischen Faktor dar.

- Die Möglichkeiten einer Standardisierung sind bei diesem Verfahren begrenzt.

Um diese Schwierigkeiten zu umgehen, beschrieben verschiedene Autoren den Einsatz von chemisch modifizierten Trägern zur kovalenten Kopplung von Proteinen im Immunoassay (Übersicht: J.E.Herrmann: Methode in Enzymol. 73 [1981] 239). Von derartigen Materialien haben insbesondere Zellulose (DD-WP 225795 EP 0134025), Dextrane, Agar und dessen Derivate [Übersicht: S. Fuchs, M.SeIa, in: Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, ed.) Blackwell Scientific Publications, Oxford 1978) neben Polyacrylsäure-Derivaten oder Polyamiden (R.M. Hendry, J. E. Herrmann: J. immunol. methods 35 [1980] 285) als Matrix Anwendung gefunden. Alle diese Materialien haben sich jedoch nicht in dem gewünschten Umfang durchsetzen können, einmal, da die chemischen Modifizierungen häufig mit oinem erheblichen Aufwand verbunden sind, und zum anderen, da diese Materialien Proteine unspezifisch binden, thermisch und chemisch relativ instabil sind oder mikrobiell leicht angegriffen werden.

In den Patentschriften DD-WP 214659 und DD-WP 218189 wird die kovalente Bindung an Glas als feste Phase im Immunoassay beschrieben. Dieses Verfahren, das sich durch eine Reihe von Vorteilen auszeichnet und auch Anwendung in der Praxis gefunden hat (W. Schößler, F. Hiepe, T. Montag, H. E. Schmidt: Hiomed. Biochim. Acta 44 (1985] 1247), läßt sich nur relativ schwer an die kommerzielle Gerätetechnik, die unter Nutzung von Mikrotitrationsplatten mit 96 Vertiefungen eine halb- oder vollautomatische Durchführung von Enzymimmunoassays ermöglicht, adaptieren.

Andererseits hat es nicht an Versuchen gefehlt, Polystyren chemisch zu modifizieren, um an derartig aktivierte Polystyrenoberflächen Proteine und andere biologisch aktive Verbindungen kovalentzu binden. Das Verfahren der Aktivierung von Polystyren-Festkörperoberflächen mit Salpetersäure und anschließender Reduzierung der eingeführten Nitro-Gruppen zu Amino-Gruppen, die nunmehr zur Umsetzung mit Glutaraldehyd (Übersicht: G.H. Parsons: Methods in Enzymol. 73 (19811 224) oder zur Diazotierung (H. Filippusson, W. E. Hornby: Biochem. J. 120 [1970] 215) zur Verfügung stehen, führt zu einer Einfärbung des Polystyrene während der Nitrierung, die die Auswertung dor im Enzymimmunoassay eingesetzten Mikrotitrationsplatten durch vertikale Photometric erheblich beeinträchtigt.

Boehnisch (in: Prot. biol. Fluids. Proc. 24th Cofl. Bruges 1976 [H. Peters, ed.], Pergamon Press, Oxford 1976, S. 743) beschrieb ein Verfahren der Aktivierung von Polystyrenoberflächen mittels Glutardialdehyd. Leider führte dieses Verfahren nicht zu den gewünschten Ergebnissen, da sich auf diese Art und Weise keine Empfindlichkeitssteigerung im Enzymimmunoassay nachweisen ließ (M.Steiner, J. L. Stratt. C'in. Chem. 24 [1978] 339; E. Nugel, B. Porstmann, T. Porstmann, R. Seifert, H. Schmechta: Z. med. Labor.-Diagn. 22 [1981] 202; eigene Ergebnisse).

In der US-Patentschrift 4001583 wird ein Verfahren der kovalenten Bindung von Proteinen mittels Glutaraldehyds an zuvor mit diphatischen Aminen benetzten Polystyrenoberflächen beschrieben. Allerdings kann die relativ schwache, auf vorzugsweise hydrophoben Wechselwirkungen basierende Bindung zwischen dem Polystyren und den diphalischen Aminen durch Detergenzien, die in den Inkubations- und Waschmedien von z. B. Immunoassays Anwendung finden, gestört werden, so daß es zu nicht unbeträchtlichen Desorptionen während der Ausführung des Immunoassays kommen kann. Deshalb wird bisher fast ausschließlich das eingangs erwähnte Verfahren der adsorptiven Bindung an Polystyren genutzt.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, Polystyrenoberflächen kostengünstig mit geringem technologischen Aufwand zu aktivieren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch chemische Oberflächenmodifizi srung eine hohe Bindungsfähigkeit und Bindungskapazität von Polystyrenoberflächen zu erreichen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe mit einem Verfahren gelöst, bei dem Polystyrenfestkörperoberflächen mit Organosilanen der allgemeinen Formel

(XRi)_n SiR₄__n (I)

behandelt werden, wobei X eine Amino-, Carbonyl-, Carboxy-, lsocyano-, Diazo-, lsothiocyano-, Nitroso-, Sulfhydryl- oder Halocarbonyl-Gruppe und R' eine Alkyl-, Alkylphenyl- oder Phenyl-Gruppe sind, während R für eine Alkoxy-, Phenoxy- oder Halogen-Gruppe steht und n' den Wert zwischen 0 und 20 und η den Wert zwischen 1 bis 3 haben können. Gebräuchliche Organosilane können durch folgende Formel dargestellt werden:

Y_nSiR₄-H (ID

wo Y eine Amino-, Carbonyl-, Carboxy- oder Sulfhydryl-Gruppe darstellt und R für eine Alkoxy-, Phenoxy-Halogen-Gruppe steht und η den Wert zwischen 1-3 annehmen kann. In der Praxis weit verbreitet und oft genutzte Organosilane besitzen die allgemeinen Zusammensetzung

XCH₂CH₂CH₂-Si (OR)₃ · (III)

wo X die reaktive organische Gruppe entsprechend Formel I ist und R für eine Methyl- oder Ethyl-Gruppe steht. Der Umsatz wird auch mit mindestens zwei Organosilanen der Formel I im Gemisch oder nacheinander durchgeführt. Bevorzugtes Milieu für die Organosilane ist die flüssige oder die gasförmige Phase, wobei die Aktivierung in v/äßrigen Systemen, Wasser-Lösungsmittelgemischen oder organischen Lösungsmitteln erfolgen kann. Anschließend erfolgt gegebenenfalls eine weitere Behandlung der modifizierten Polystyren-Festkörperoberflächen mit homo- oder heterobifunktionellen Reagenzien. Es ist seit einiger Zeit bekannt, daß die Hydroxyl-Gruppen auf SiO₂-Oberflächen, vorzugsweise Glas, aber auch auf anderen Festkörperoberflächen als Angriffspunkte für Organosilane zur Verfügung stehen. Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, daß Organosilane in geeigneter Zusammensetzung und Konzentration mit Polystyren-Festkörperoberflächen reagieren, die über keine freien OH-Gruppen verfugen sollten. Diese Bindung kann durch starke Nebenvalenzkräfte erfolgen, denkbar sind jedoch auch kovalente Bindungen mit Verunreinigungen und/oder Beiprodukten des Polystyrens. Dadurch steht die organofunktionelle Gruppe den üblichen chemischen Reaktionen unter Verwendung von Amino-, Carbonyl-, Carboxy-, lsocyano-, Diazo-, lsothiocyano-, Sulfhydryl-, Nitroso- oder Halocarbonyl-Gruppen zur Verfugung, so daß diese Verbindungen als Brücke zwischen der Festkörperoberfläche und der organischen/biologischen Verbindung fungieren. Die so aktivierten Polystyren-Festkörperoberflächen können nunmehr im folgenden direkt über die entsprechenden funktioneilen Gruppen oder aber unter Vermittlung von homo- oder heterobifunktionelien Reagenzien auf an sich bekannte Art und Weise mit den zu bindenden Proteinen, Nukleinsäuren, niedermolekularen Liganden, Zellen, Mikroorganismen und anderen biologischen Materialien umgesetzt werden.

Das erfolgt beispielsweise so, daß die Polystyren-Festkörperoberflächen mit Gemischen aus Organosilanen, die sich aus Aminopropyltriethoxysilan und Glycidoxypropyltriethoxysilan zusammensetzen, aktiviert werden und die nunmehr an der Festkörperoberfläche befindlichen Amino- und Epoxy-Gruppen mit Proteinen direkt oder unter Vermittlung von Glutardialdehyd reagieren. Wichtig hierbei ist, daß die Umsetzung mit den Organosilanen, die nicht toxisch sind und großtechnisch in beträchtlichem Umfang produziert werden, durch einfaches Inkontaktbringon odor Tauchen erfolgt, oder aber auch in der Gasphase ausgeführt werden kann. Von großer Bedeutung hierbei ist, daß die Umsetzung mit Organosilanen infl'jssiger Phase mit organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Toluol, Dioxan, Methanol, Ethanol u.a., Lösungsmittelgemischen, wie Methanol/ Ethanol, sowie in wäßrigem Milieu oder Wasser-Lösungsmittel-Gemischen, wie Ethanol/Wasser und Methanol/Wasser, erfolgen kann, so daß der technologische Aufwand gering ist. Besonders vorteilhaft sollte sich die Aktivierung in gasförmiger Phase durch Anwendung von Aerosolen oder durch Unterdruck gestalten lassen.

Vorteilhaft ist weiterhin, daß durch Wahl unterschiedlicher Organosilane und gegebenenfalls bifunktioneller Kopplungsreagenzien praktisch alle in Frage kommenden Reaktionsmöglichkeiten realisiert werden können, da unter Nutzung des zugrundeliegenden und erfindungsgemäßen Prinzips Polystyren-Festkörperoberflächen mit den unterschiedlichsten funktioneilen Gruppen (X in der Formel I) erha ten werden können. Hinzu kommt, daß - bedingt durch den Spacereffekt der Organosilane (R' = 0-20) und/oder der bifunkt onellen Kopplungsreagenzien (so z. B. Glutaraldehyd) - die gebundenen biologischen Materialien fast ausnahmslos ihr« biologische Aktivität behalter.. Besonders vorteilhaft gestaltet sich der Einsatz von Gemischen an Organosilanen, da sogenannte Silanhaftmittel allein kaum zu einer Aktivierung von Polystyren-Festkörperoberflächen führen. Hinzu kommt, daß derartige Gemisch an Organosilanen über unterschiedliche funktioneile Gruppen verfügen und somit biologische Materialien über unterschiedliche Bindungsmechanismen in hoher Ausbeute gebunden werden können. So erweisen sich Gemische aus Aminopropyltriethoxysilan und Glycidoxypropyltriethoxysilan als besonders geeignet, da die Bindung der Liganden über Aldehyd- und Epoxy-Gruppen realisiert wird. Die sich durch Bindung von Organosilanen an Polystyren-Festkörperoberflächen ergebenden chemischen Modifizierungen sind sehr stabil, so daß so aktivierte Polystyren-Oberflächen im trockenen oder feuchten Zustand über lange Zeiträume ohne Aktivitätsverlust gelagert werden können und daß gebundene biologisch aktive Liganden über lange Zeit auch unter extremen Bedingungen stabil gebunden bleiben. Die unspezifischen Bindungen an so aktivierte Polystyrenoberflächen sind gering. Organosilane zeichnen sich durch eine gute Biokompatibilität aus. An die so aktivierten Polystyren-Festkörperoberflächen werden im folgenden Proteine, wie Antigene und Antikörper, Nukleinsäuren, niedermolekulare Liganden, Mikroorganismen, Zellen und andere biologisch aktive Materialien gebunden und zur Trennung und Isolierung entsprechender Wechselwirkungspartner oder vor allem zum qualitativen und quantitativen Nachweis von spezifischen Wechsslwirkungspartnern im Festphasen-Immunoassay eingesetzt

Die Erfindung weist folgende Vorteile auf:

- Durch Verwendung vorgefertigter Formkörper aus Polystyren ist die gezielte Aktivierung nur der Flächen möglich, an die die nachfolgende Bindung erfolgen soll.

- Der technologische Ablauf dor Aktivierung ist einfach und kostengünstig.

- Die aktiven Oberflächen besitzen eine hohe Bindungskapazität.

- Die optischen Eigenschaften der Formkörper sind nach der Aktivierung nicht verändert.

Ausführungsbelsplele

Im folgenden wird die Erfindung an einigen Beispielen erläutert, wobei diese keinen Anspruch auf Vollständigkeit erheben.

Beispiel 1

Polystyrenröhrchen (4ml, Durchmesser 9mm, Höhe 40mm, VEB Polyplast Halberstadt, DDR) werden mit einem Gemisch aus Aminopropyltriethoxysilan und Glycidoxypropyltriethoxysilan (Haftvermittler 6130, VEB Chemiewerk Nünchritz, DDR) durch Füllen in Kontakt gebracht und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Absaugen des Haftvermittlers und Trocknen im Vakuum werden die Röhrchen dreimal mit 0,1 m Phosphat-Puffer, pH 6,8, gewaschen und mit 200 μΙ ¹²⁵J-IgG (gerichtet gegen das Enzym alkalische Phosphatase) in einer Konzentration von 10pg/ml (0,1 m Phosphat-Puffer, pH 6,8) versetzt und 4h bei 37⁰C inkubiert. Nach Absaugen der überflüssigen Proteinmenge und nachfolgendem intensiven dreimaligen Waschen mit jeweils 2ml PBS-Puffer, der 0,05% Tween 20 und 0,22% NaN₃ enthält, wird die gebundene Proteinmenge durch Messung der Radioaktivität unter Mitführung der eingesetzten Proteinlösung als Standard bestimmt. Danach werden die Polystyrolröhrchen wiederum zehnmal mit o.g. PBS-Puffer gewaschen und erneut die gebundene Proteinmenge durch Bestimmung der Radioaktivität bestimmt. Die so mit '²⁶J-IgG beladenen Röhrchen werden anschließend mehrfach im Enzymimmunoassay (s. Beispiel 4) eingesetzt. Nach einem Zeitraum von vier Wochen wird die gebundene Proteinmenge wiederum durch Bestimmung der Radioaktivität ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tab. 1 zusammengefaßt.

Beispiel 2

Polystyrenröhrchep (4mi, VEB Polyplast Halberstadt, DDR) werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Haftvermittler 6130 aktiviert und anschließend mit 3% Glutardialdehyd versetzt und 2h bai 37°C inkubiert. Nach Absaugen des überschüssigen Reagenz und nachfolgendem dreimaligen Waschen werden die Röhrchen mit je 200μΙ '²⁶J-IgG (gerichtet gegen das Enzym alkalische Phosphatase) in den Konzentrationen von lOpg/ml und 50pg/ml versetzt und 4 h bei 37"C inkubiert. Nach Absaugen der überschüssigen Proteinmenge und nachfolgendem Waschen wird die gebundene Proteinmenge, wie in Beispiel 1 beschrieben, durch Messung der Radioaktivität bestimmt. Auch hier erfolgt eine mehrmalige Bestimmung der gebundenen Proteinmenge nach weiteren Waschzyklen sowie Einsatz der Röhrchen im Enzymimmunoassay. Die Ergebnisse sind auch in Tab. 1 dargestellt.

Betspiel 3

Polystyrenkugeln (6mm Durchmesser, Northumbrte England) werden wie in Beispiel 2 beschrieben, mit Haftvermittler 6130 und Glutaraldehyd aktiviert und nachfolgend mit ¹²⁵J-IgG in der Konzentration von 1upg/ml gebunden. Die weitere Behandlung erfolgt ebenfalls wie in Beispiel 2 angeführt. Auch diese Ergebnisse sind aus Tab. 1 ersichtlich.

Tabelle 1: Bestimmung der Bindung von '²⁶J-IgG an Polystyren (alle Werte repräsentieren Zehnfachbestimmungen, zur Vergleichbarkeit wurde die gebundene Proteinmenge auf gleiche Flächeneinheiten bezogen; als Referenz erfolgte die Bindung von '²⁶J-IgG durch Adsorption mit einem Carbonat-Bicarbonat-Puffer, pH 9,6)

Proteinbindung	I.Messung	2. Messung	3. Messung
	(dreiWasch-	(weitere zehn	(nach mehrmaligem
	zyklen)	Waschzyklen)	Eins. i. EIA)
adsorptiv:
Polystyrenröhrchen
10pg/ml	760ng/cm²	700ng/cm²	488ng/cm²
50Mg/ml	1 598ng/cm²	1464ng/cm²	1110iig/cm²
Polystyrenkugeln
lOpg/ml	1150ng/cm²	1 026ng/cm²	522ng/cm²
chemisch aktiviert
entsprechend Beispiel 1:
Polystyrenröhrchen
10pg/ml	669ng/cm²	598ng/cm²	488ng/cm²
chemisch aktiviert
entsprechend Beispiel 2:
Polystyrenröhrchen
10pg/ml	1 149ng/cm²	1 023ng/cm²	1 047ng/cm²
50pg/ml	2283ng/cm²	2047ng/cm²	2047ng/cm²
chemisch aktiviert
entsprechend Beispiel 3:
Polystyrenkugeln
10Mg/ml	1 404ng/cm²	1327ng/cm²	1 327ng/cm²

Beispiel 4

Die entsprechend den Beispielen 1 bis 3 aktivierten und mit '²⁶J-IgG (gerichtet gegen das Enzym alkalische Phosphatase) beladenen Polystyrenträger werden, wie in den Beispielen 1 bis 3 angeführt, zunächst dreimal (1. Messung) und anschließend weitere zehnmal (2. Messung) mit einem PBS-Puffer, pH 7,4, der 0,05% Tween 20 und 0,02% NaN₃ enthält, gewaschen und nachfolgend mit 1 m Ethanolamin für 2 h bei 37°C behandelt. Dadurch werden eventuell noch freie reaktive Gruppen auf der Festkörperoberfläche blockiert. Nach erneutem Waschen mit o.g. Puffer werden die Polystyrenträger mit dem Enzym alkalische Phosphatase (Boehringer-Mannheim, BRD) in einer Konzentration von 1,5IU/mg in o.g. PBS-Puffer versetzt und 20h bei 4⁰C inkubiert. Nach Entfernung des nicht gebundenen, überschüssigen Enzyms durch viermaliges Waschen mit angegebenem PBS-Puffer wird die Enzymaktivität an der festen Phase durch Hydrolyse von 4-Nitrophenylphosphat in 1 m Diethanolamin-Puffer, pH 9,8, und photometrische Bestimmung des Reaktionsproduktes bei405nm nach vorherigem Stoppen mit 2n NaOH bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tab. 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2: Vergleich der Antikörperreaktivität an Polystyren durch Messung der Enzymaktivität (Zehnfachbestimmungen)

Proteinbindung PS-Röhrchen PS-Röhrchen PS-Kugeln

(Beisp.1) (Beisp.2) (8eisp.3)

Enzymaktivität

A_405nH₁ 1,504 0,469 0,861

0,689

Beispiel 5

Kommerzielle Polystyrenröhrchen (VEB Polyplast Halberstadt, DDR) werden, wie in Beispiel 2 beschrieben, aktiviert und mit je 200 μΙ humanem IgG in einer Konzentration von 37 pg/ml versetzt und 2 h bei Raumtemperatur und anschließend über Nacht bei 4⁰C inkubiert. Nach Entfernen des überschüssigen Proteins durch Waschen, wie in Beispiel 4, werden eventuell noch freie reaktive Gruppen mit 1 m Ethanolamin (2h, 37°C) geblockt. Nnch erneutem Waschen werden die Polystyrenröhrchen mit einem Konjugat, bestehend aus einem Kaninchen-anti-human-lgG-Antikörper und dem Enzym alkalische Phosphatase, für4h bei 37⁰C inkubiert. Nach wiederholtem Waschen mit angegebenen PBS-Puffer wird die Enzymaktivität durch photometrische Messung, wie in Beispiel 4 angeführt, bestimmt. Unabhängig davon werden Polystyrenröhrchen auf bekannte Art und Weise durch adsorptive Bindung in einem 0,1 m Carbon? -Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, mit humanem IgG in dergleichen Konzentration beladen und parallel mit o.g. Konjugat unter identischen Bedingungen bestimmt. Die Ergebnisse des Vergleiches sind in T?b.3 dargestellt.

Tabelle 3: Vergleich der immunologischen Reaktivität von humanem IgG in Abhängigkeit von dem Bindungsverfahren (Zehnfachbestimmungen)

adsorptive Bindung chemische Bindung

Enzymaktivität

A_40611n, 0253 1^050

Beispiel 6

Eine kommerzielle Mikrotitrationsplatte aus Polystyren (VEB Polyplast Halberstadt, DDR) mit 96 Vertiefungen wird, wie in Beispiel 2 beschrieben, aktiviert und anschließend mit je 200μΙ humanem ImmunglobuHn G in einer Konzentration von 20μg/ml in einem 0,1 m Phosphat-Puffer, pH 6,8, versetzt und über Nacht bei 4⁰C inkubiert. Nachfolgend werden die nunmehr mit humanem IgG beladenen Vertiefungen mit einem Konjugat, bestehend aus einem Kaninchen-anti-human-fgG-Antikörper und dem Enzym alkalische Phosphatase-wie in Beispiel 5 angeführt-inkubiert und die Enzymaktivität, wie in Beispiel 4 beschrieben, unter Einsatz eines vertikal messenden Photometers (MTF 10, VDE Berlin-Buch der AdW der DDR) bestimmt, wobei die Enzymreaktion durch 0,2m EDTA gestoppt wurde. Unabhängig davon wurde eine Mikrotitrationsplatte, analog Beispiel 5, idsorptiv mit humanem IgG in gleicher Konzentration beladen und unter ansonsten identischen Bedingungen behandelt. Die Ergebnisse sind in Tab. 4 dargestellt. Nnch Ablauf der Immunreaktion und Beendigung des Entzymimmunoassays werden die gebundenen Immunreaktanden durch Inkubation der Mikrotitrationsplatte mit 3m KSCN (30min, 39°C) und anschließend 1 m NaCI (30 min, 37⁰C) abgespalten, so daß die mit humanem IgG beladene Platte für einen erneuten Einsatz zur Verfugung steht. Diese wird nun wiederum mit angegebenem Konjugat versetzt und die Enzymaktivität bestimmt. Die Ergebnisse eines dreimaligen Einsatzes einer solchen Mikrotitrationsplatte sind ebenfalls aus Tab.4 ersichtlich.

Tabelle 4: Vergleich der Immunreaktivität von humanem IgG unter mehrfachem Einsatz

Proteinbindung adsorptive Bindung* chemische Bindung

I.Messung 2. Messung 3. Messung

EnzymaKtivität

Atosnm 0,280 1,173 0,878 0,890

' Da bei adsorptiver Bindung während der im Enzymimmunoassay erforderlichen Wasch- und Inkubationsschritte erhebliche Proteinmenfjon desorbiert werden (s. Tab. 1), wurde diese Mikrolitrationsplatte nur einmal eingesetzt.

Beispiel 7

Eine kommerzielle Mikrotitrationsplatte (VEB Polyplast Halberstadt, DDR) wird, wie in Beispiel 2 beschrieben, aktiviert und anschließend im trockenen Zustand mit einem vertikal messenden Photometer (MTF, VED AdW der DDR) gegen eine nicht aktivierte Mikrotitrationsplatte gemessen. Die gemessenen Extinktionen lagen in allen Fällen unter 0,01 Extinktionseinheiten.

Beispiel 8

Polystyrenröhrchen (VEB Polyplast Halberstadt, DDR) werden, wie in Beispiel 1 unti 2 beschrieben, aktiviert und nachfolgend an diese gereinigter humaner Faktor VIII in einer Konzentration von 3,3pg/ml in einem 0,1 m Phosphat-Puffer, pH 6,8, gebunden. Nach Entfernung der nicht gebundenen, überschüssigen Faktor Vlll-Moleküle durch Waschen in bekannter Art und Weise wird im folgenden der Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Faktor Vlll-Antigen (W. Schößler, M. Stepanauskas, C.Dittrich, H.Heine: Acta biol. med. germ. 41 [I982] 263; W.Schößler, M.Stepanauskas, C.Dittrich: Acta biol. med. germ. 41 [1932) 695) in der beschriebenen Art und Weise ausgeführt. Hierzu werden die Röhrchen mit einem Inkubationsgemisch, bestehend aus dem zu bestimmenden Plasma und einem im Überschuß vorhandenen Kaninchen-anti-human-Faktor-VIII-Antikörper versetzt und 6h bei 37⁰C inkubiert. Nach erneutem Waschen werden 200μΙ eines Konjugates, bestehend aus einem Ziege-anti-Kaninchen-lgG-Antikörper und dem Enzym alkalische Phosphatase, zugegeben und nach mehrstündiger Inkubation und nachfolgendem Auswaschen die Enzymaktivität, wie in Beispiel 4 und 6 beschrieben, bestimmt. Nach Ablauf des Enzymimmunoassays werden die Polysty. enröhrchen mit je 0,5 ml 0,2 m HCI-Glycin-Puffer, pH 2,8, für 30 Minuten bei Raumtemperatur versetzt, so daß die gebundenen Immunreaktanden vollständig abgespalten werden und die mit humanem Faktor VIII beladenen Röhrchen erneut im Enzymimmunoassay-analog Beispiel 6 —eingesetzt werden können.

Beispiel 9

Kommerzielle Polystyrenröhrchen werden, wie in Beispiel 1, 2 und 8 angeführt, mit humanem Faktor VIII beladen und im folgenden in der beschriebenen Art und Weise zur Bestimmung des Faktor-Vlll-Antigens im Enzymimmunoassay eingesetzt. Der Nachweis des gebundenen Antikörpers erfolgt allerdings mit einem Konjugat, bestehend aus einem Schaf-anti-Kaninchen-lgG-Antikörper und dem Enzym Meerrettichperoxidase. Nach Entfernung der nicht gebundenen Konjugatmoleküle durch dreimaliges Waschen wird die Enzymaktivität mit 2,2'-Azino-di-(3-ethyl)-benzthiazolin-sulfonat (6) (ABTS) (Boehringer-Mannheim, BRD) und H₂Oj und photometrisrher Messung bei 418nm bestimmt. Nach Ausführung des Enzymimmunoassays worden die Röhrchen zweimal mit je 0,5 ml PBS-Puffer gewaschen und nachfolgend mit einem der folgenden Dissoziationsreagenzien für i h bei Raumtemperatur versetzt: 1) PBS-Puffer, 2m NaCI und 5% Dioxan enthaltend, 2) 1m KSCN, 3) 3m KSCN, 4) 4,5m MgCI₂,5) 1m NaJ, 6) HCI-Glycin-Puffer, pH 2,8,7) HCI Glycin-Puffer, pH 2,2. Durch alle diese Agenzien werden die gebundenen Antigen-/ .ntikörper-Komplexe gespalten, so daß die mit humanem Faktor VIII beladenen Röhrchen erneut reproduzierbar im Enzymimmunoassay eingesetzt werden können.

Claims

1. Verfahren zur Aktivierung von Polystyren-Festkörperoberflächen, gekennzeichnet dadurch, daß die Polystyren-Festkörperoberflächen mit Organosilanen der Formel

(XFU₁ SiR₄-H (D

umgesetzt werden, wo X eine Amino-, Carbonyl-, Carboxy-, lsocyano-, Diazo-, lsothiocyano-, Nitroso-, Sulfhydryl- oder Halocarbonyl-Gruppe und R' eine Alkyl-, Alkylphenyl- oder Phenyl-Gruppe sind, während R für eine Alkoxy-, Phenoxy- oder Halogen-Gruppe steht, wobei η' den Wert zwischen 0-20 und η den Wert zwischen 1-3 besitzen, oder daß die Umsetzung mit mindestens zwei Organosilanen der Formel I im Gemisch oder nacheinander in flüssiger oder gasförmiger Phase erkJgt und daß anschließend gegebenenfalls eine weitere Behandlung mit homo- odor heterofunktionellen Reagenzien durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß die Umsetzung der Polystyren-Festkörperoberflächen mit Verbindungen nach Formel I in organischen Lösungsmitteln, Lösungsmittelgemischen oder Gemischen aus Wasser und organischen Lösungsmitteln erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Umsetzung der Polystyren-Festkörperoi 'ächen in der Gasphase mit einem Aerosol oder bei einem Druck unterhalb des Atmosphärendrucks erfolgt.