DE4035756A1

DE4035756A1 - Neue plasmide zur herstellung von im habitus und ertrag veraenderten transgenen pflanzen

Info

Publication number: DE4035756A1
Application number: DE4035756A
Authority: DE
Inventors: Lothar Prof Dr Willmitzer; Uwe Dr Sonnewald
Original assignee: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 1990-11-08
Filing date: 1990-11-08
Publication date: 1992-05-14
Also published as: KR920009983A; IE913884A1; IE20020633A1; EP1114866A2; EP1114866A3; CA2055150A1; HU215255B; JP3431177B2; DE69132758T2; AU8702191A; ES2164636T3; HUT60774A; EP0485044B1; ATE206761T1; JPH05236971A; AU655209B2; EP0485044A2; EP0485044A3; IL99828A0; DK0485044T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Plasmide, die eine DNA-Sequenz ent halten, die für ein die Biosynthese löslicher Zucker modifizierendes Protein kodiert und Pflanzenzellen, enthaltend diese Plasemide zur Her stellung von in Habitus und Ertrag veränderten transgenen Pflanzen, wobei die Pflanzen durch den Transfer und die Expression von in den Zuckermeta bolismus oder die Zuckerpartitionierung innerhalb einer Pflanze ein greifenden Genen verändert sind.

Das Wachstum, die Entwicklung und der Ertrag einer Nutzpflanze oder einer Zierpflanze hängt von der Energie ab, die diese Pflanze durch die Fixierung von CO₂ in Kohlehydrate während der Photosynthese gewinnt. Die primären Orte für die Photosynthese sind das Blatt und zu einem geringeren Ausmaß das Stammgewebe, wohingegen andere Organe von Pflanzen, wie Wurzeln, Samen oder Knollen nicht wesentlich zur Bildung von Photoassimilaten beitragen, sondern im Gegenteil in ihrem Wachstum von der Versorgung durch photosyn thetisch aktive Organe abhängig sind. Dieses bedeutet, daß es einen Fluß von photosynthetisch gewonnener Energie von photosynthetisch aktiven Gewe ben zu photosynthetisch inaktiven Teilen einer Pflanze gibt.

Die photosynthetisch aktiven Gewebe werden als Quellen oder "sources" be zeichnet. Sie werden als Nettoexporteure des fixierten Kohlendioxids defi niert. Die photosynthetisch inaktiven Teile einer Pflanze werden als Senken oder "sinks" bezeichnet. Sie werden als Nettoimporteure des photosynthe tisch fixierten Kohlendioxids definiert.

Es ist anzunehmen, daß sowohl die effiziente Nutzung von Photosynthesepro dukten als auch ihre Verteilung innerhalb einer Pflanze diese in mehrerer Hinsicht stark beeinflußt. Als Beispiel seien genannt der Habitus von Pflanzen. Sich neu entwickelnde Organe wie sehr junge Blätter oder auch an dere Bereiche wie Wurzel und Samen sind völlig von der Photosyntheselei stung der "sources" abhängig. Das bedeutet, daß die Entwicklung solcher Or gane abhängig ist von der Verteilung der in den "sources" gebildeten Photo assimilate innerhalb der Pflanze. Die Möglichkeit der Ausbildung von jungen Blättern oder auch der Ausbildung von Wurzeln könnte drastische Auswirkun gen auf den Habitus einer Pflanze wie z. B. die Größe einer Pflanze, den In ternodienabstand, die Größe und Form eines Blattes, das Aussehen eines Blattes und die Menge und Form der gebildeten Wurzel haben. Weiterhin soll te die Verteilung von Photoassimilaten von ganz entscheidender Bedeutung für den Ertrag einer Pflanze sein. So hat sich die Gesamtphotosyntheselei stung des Weizens in den letzten Jahrzehnten nicht wesentlich verändert, während der für den Menschen erntebare Ertrag der Weizenpflanzen angestie gen ist. Dies ist im wesentlichen darauf zurückzuführen, daß das Verhältnis zwischen konkurrierenden "sinks" dahingehend geändert wurde, daß die für den Ertrag wichtigen "sinks" wie Samen wesentlich mehr Photoassimilat auf nahmen als andere, für den Ertrag unbedeutende Bereiche der Pflanze, wie z. B. der Stengel. Durch eine in diesem Fall Verkürzung des Halmes konnte somit ein für den Menschen sehr viel günstigeres "sink"-zu "source"- Verhältnis bei Weizen erzielt werden. Dieses unterstreicht die Wichtigkeit der Verteilung von in den primären "sources" gebildeten Photoassimilaten in höheren Pflanzen in bezug auf sowohl Habitus als auch Ertrag von Pflanzen.

Die Veränderungen des Habitus, der Resistenz gegen Trockenheit und/oder Frost und insbesondere die Veränderung des Ertrages der Pflanzen stellen wesentliche Verbesserungen gegenüber bekannten Pflanzen dar.

Neue biotechnologische Verfahren zur genetischen Veränderung dikotyler und monokotyler Pflanzen sind bekannt (Gasser und Fraley, 1989, Science 244 1293-1299).

Es ist unbekannt, durch welche biochemischen Mechanismen das Verhältnis von "sink" und "source" reguliert wird.

Bei den meisten Pflanzen werden Photoassimilate innerhalb einer Pflanze in Form von Zuckern, und zwar präferentiell in der Form von Saccharose ver teilt. Dadurch, daß Saccharose die wichtigste Transportform für Kohlen hydrate von " source" nach "sinks" darstellt, könnte eine andere wesentliche Determinante für die Stärke einer "source", und damit die effiziente Ver sorgung von "sinks", die Verfügbarkeit und der Gehalt an löslichen Zuckern (verschiedene Mono-, Di- und Trisaccharide, wie z. B. Fruktose, Glukose und Saccharose), in den Blättern sein. So sollte z. B. ein höherer Gehalt an Saccharose in den "source" -Blättern zu einer verstärkten Versorgung der "sinks" führen und damit auch zu einem erhöhten Anteil an Photoassimilaten in den erntebaren Organen. Dies würde zu einer Ertragssteigerung führen.

Für die Partitionierung von Kohlehydraten zwischen "sink"- und "source"- Teilen einer Pflanze sollte das Verhältnis zwischen löslichen Zuckern und Stärke in den "source"-Blättern von entscheidender Bedeutung sein. Eine effizientere Versorgung von "sinks" mit Saccharose aus den "source"- Blättern sollte zu einer Veränderung des Habitus der Pflanze, insbesondere aber zu einer Erhöhung des Ertrages führen, der in den meisten Fällen durch den "sink"-Speicher, wie Samen und Knolle oder Wurzel, festgelegt wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, in ihrem Habitus wie Größe, Blattform, Internodienabstand, Zellwandaufbau, Samen-, Knollen- und Wurzelausbildung, sowie insbesondere in ihrem Ernteertrag veränderte Pflanzen bereitzustellen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß in Pflanzen gezielt Gene, die in den Zuckermetabolismus oder in die Zuckerpartionierung ein greifen, eingeführt und in transgenen Pflanzen exprimiert werden, was zu einer Erhöhung des Anteils von in Form von löslichen Zuckern in den "source" -Blättern vorliegenden Photoassimilaten in diesen transgenen Pflanzen führt.

Hierzu werden Plasmide bereitgestellt, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für ein die Biosynthese löslicher Zucker-modifizierendes Protein kodiert, wobei diese Plasmide in Pflanzenzellen eingeführt werden und diese Zellen zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die von der DNA-Sequenz kodierten Produkte greifen in den Phosphat/Pyrophosphat-Metabolismus ein, wobei die DNA-Sequenz eine DNA-Sequenz eines anorganischen Pyrphosphatase-Gens ist.

Einer der wesentlichen Kontrollpunkte bei der Saccharosebiosynthese ist die Konversion des Fructose-1,6-bisphosphates (Fru-1,6-P2) in Fructose-6 phosphat (Fru-6-P). Eines der an diesem Schritt beteiligten Enzyme ist die Pyrophosphat : Fruktose-6-Phosphat-1-Phosphotransferase (PFP). Dieses Enzym kann auf der einen Seite Fru-1,6-P2 in Fru-6-P, unter Freisetzung an organischen Pyrophosphats überführen, auf der anderen Seite Fru-6-P in Fru-1,6-P2, unter Verbrauch anorganischen Pyrophosphats, aufphosphory lieren. Die Richtung der Reaktion, die durch PFP katalysiert wird, wird durch den relativen Gehalt an anorganischen Pyrophosphat und anorganischen Phosphat gesteuert.

Eine fortwährende Entfernung des anorganischen Pyrophosphats durch eine an organische Pyrophosphatase sollte eine Verschiebung des obigen Gleichge wichtes in Richtung Fru-6-P und damit eine verstärkte Bildung von löslichen Zuckern, wie z. B. Hexosen und/oder Saccharose, bewirken. Eine Verschiebung der Partitionierung der Photoassimilate durch Entfernung des Pyrophosphats durch eine anorganische Pyrophosphatase sollte auch bewirken, daß die von der UDP-Glucose-Pyrophosphorylase katalysierte Reaktion

Glukose-1-Phosphat + UTP → UDP-Glukose + PPi

in Richtung UDP-Glukose verschoben wird. Die dadurch erfolgte vermehrte Be reitstellung von UDP-Glukose führt zu weiteren veränderten Eigenschaften der Pflanze, wie z. B. dickeren Zellwänden. Dies geschieht durch erhöhte Bereitstellung der Precursor für die Zellwandbiosynthese. Die Verdickung der Zellwände führt zu einer Erhöhung der Trockenresistenz in diesen Pflan zen, bedingt durch eine verringerte Transpirationsrate.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssystem in E. coli und einen Marker, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt, beinhalten. Die Vektoren beinhalten z. B. pBR 332 pUC-Serien, M13 mp-Serien, pACY 184 usw. Dementsprechend kann die Sequenz an einer passen den Restriktionsstelle in den Vektor eingefügt werden. Das erhaltene Plas mid wird für die Transformation in E. coli verwendet. Die E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethoden werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse, Elektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz gespalten und mit der nächsten DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Plasmid-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig je doch die rechte und die linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA, als Flankenbereich der einzuführenden Gene, verbunden werden.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 1 20 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerÿ Kanters B.V. , Alblasserdam, 1985, Chapter V; Fraley, et al. , Crit. Rev, Plant Sci., 4: 1-46 und An et al. EMBO J. (1985) 4: 277-287 beschrieben worden.

Ist die eingeführte DNA erst einmal im Genom integriert, so ist sie dort auch relativ stabil und springt in der Regel nicht mehr heraus. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzel len Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Chloramphenicol u. a. vermittelt. Der in dividuell verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zel len gegenüber Zellen, denen die eingefügte DNA fehlt, gestatten.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Viel zahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transforma tion mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobac terium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion, die Injektion oder die Elektroporation sowie weitere Möglichkeiten. Werden für die Transforma tion Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plas mide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Se quenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekom bination in das Ti- oder Ri-Plasmid integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige Vir-Region. Intermediäre Vektoren können sich nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Hel ferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation), Binäre Vektoren können sich sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektions marker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agro bakterien transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. (1978), 163: 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine Vir-Region trägt, enthalten. Die Vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann enthalten sein. Das so transformierte Bakterium wird zur Transformation von Pflanzen zellen benutzt. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflan zen-Explantate zweckmäßiger Weise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agro bacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmate rial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Zellen) können dann in einem geeigneten Me dium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Bei der Injektion und Elektroporation sind keine speziellen Anforderungen an die Plasmide ge stellt. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet wer den.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen in der üblichen Weise. Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, ge kreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die ent sprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Begriffe und Abkürzungen

Am 20.08.1990 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgendes Plasmid hinterlegt (Hinterlegungsnummer):

Plasmid p 35 S-Ω-ppase (DSM 6141)

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt die Struktur des 4,0 kb großen Plasmids p35S-Ω-ppase. Das Plasmid enthält folgende Fragmente:

A = Fragment A (529 bp): Beinhaltet den 35S Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV.

B = Fragment B (73 bp): Enthält 61 Nukleotide der Sequenz: TTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTA, den am 5′-Ende befindlichen Asp 718 Linker der Sequenz GGTACC und den am 3′-Ende befindlichen NcoI-Linker der Sequenz CCATGG.

C = Fragment C (554 bp): Enthält die proteinkodierende Region der anorganischen Pyrophosphatase (ppa) aus E. coli (Nukleotide Position +39 bis +565 der Sequenz nach Lahti et al.).

D = Fragment D (192 bp): Enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5.

Es werden ferner die im Ausführungsbeispiel beschriebenen Schnittstellen gezeigt.

Fig. 2 zeigt den Nachweis der vom Pyrophosphatase-Gen kodierten RNA in transgenen Kartoffel- und Tabakpflanzen mittels Northern-Blot-Analyse.

Positionen 1-19: Proben der aus Blättern gewonnenen Gesamt-RNA von Kartoffelpflanzen, die mit dem Plasmid p35S-Ω-ppase transformiert und regeneriert wurden.
Positionen 20-28: Proben der aus Blättern gewonnenen Gesamt-RNA von Tabakpflanzen, die mit dem Plasmid p35S-Ω-ppase transformiert und regeneriert wurden.
Position A: Probe einer nicht-transformierten Kartoffelpflanze.
Position B: Probe einer nicht-transformierten Tabakpflanze.

Die schwarzen Flecken zeigen die von der Pyrophosphatase kodierte RNA.

Fig. 3 zeigt den Nachweis des Auftretens einer neuen Pyrophosphataseaktivität in Proteinextrakten aus Blättern der mit dem p35S-Ω-ppase Plasmid trans formierten transgenen Kartoffel- und Tabakpflanzen in einem SDS-Polyacryl amid-Gel.

Positionen 1-7: Proteinextrakt aus Blättern transformierter Kartoffelpflanzen.
Positionen 8-9: Proteinextrakt aus Blättern transformierter Tabakpflanzen.
Position A: Proteinextrakt aus Blättern nicht-transformierter Tabakpflanzen.
Positionen B-C: Proteinextrakt aus Blättern nicht-transformierter Kartoffelpflanzen.
Positionen X und Y: Proteinextrakt aus E.coli.

Fig. 4 zeigt den Vergleich des Gehalts an Glukose, Fruktose, Saccharose und Stärke in mmol/m² in einer das 35S-Ω-ppase Gen exprimierten Tabakpflanze () und einer nicht transformierten Tabakpflanze () in Blättern verschie denen Alters.

In der Abbildung bedeuten:

1 = sehr junge Blätter
2-4 = ausgereifte Blätter
5-6 = alte Blätter

Fig. 5 zeigt den Einfluß der Expression des 35S-Ω-ppase Gens in transgenen Kartoffelpflanzen (Positionen 1-12) auf das Saccharose/Stärke-Verhältnis in den Blättern transformierter Pflanzen.

C = nicht-transformierte Kartoffelpflanze.

Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausfüh rungsbeispiele wird vorab eine Aufstellung aller für diese Versuche notwen digen und an sich bekannten Verfahren gegeben:

1. Klonierungsverfahren
Zur Klonierung wurden die Vektoren pUC18 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985), 33, 103-119) benutzt.
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor BIN19 (Bevan, Nucl, Acids Res. (1984), 12, 8711-8720) kloniert.
2. Bakterienstämme
Für die pUC-Vektoren wurden die E. coli-Stämme BMH71-18 (Messing et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA (1977), 24, 6342-6346) oder TB1 benutzt. TB1 ist ein Rekombinations-negatives, Tetracyclin-resistentes Derivat des Stammes JM101 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985), 33, 103-119). Der Genotyp des TB1-Stammes ist (Bart Barrel, pers. Mitteilung): F (traD36, proAB, lacI, lacZΔM15), Δ(lac, pro), SupE, thiS, recA, Sr1: :Tn10(TcR).
Die Pflanzentransformation wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefa ciens-Stammes LBA4404 (Bevan, M., Nucl, Acids Res. 12, 8711-8721, (1984); B1N19 Derivat) durchgeführt.
3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens Bei Bin19-Derivaten erfolgt die Einführung der DNA in die Agrobakterien durch direkte Transformation nach der Methode von Holsters et al., (Mol. Gen. Genet, (1978), 163, 181-187). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim und Doly (Nucl. Acids Res, (1979), 7, 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktions spaltung gelelektrophoretisch aufgetrennt.
4. Pflanzentransformation
- A) Tabak: 10 ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens wurden abzentrifugiert, der Überstand verwor fen, und die Bakterien im gleichen Volumen Antibiotika-freien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steriler Pflanzen (ca. 1 cm²), denen die Mittelrippe entfernt wurde, in dieser Bakteriensuspension gebadet. Anschließend wurden die Blattschei ben in Petrischalen, die MS-Medium (nach Murashige und Skoog, Physiolo gia Plantarum (1962), 15, 473-497) mit 2% Saccharose und 0,8% Bacto Agar enthalten, dicht ausgelegt. Nach 2-tägiger Inkubation bei 25°C im Dunkeln wurden sie auf MS-Medium übertragen, welches 100 mg/l Kanamycin, 500 mg/l Claforan, 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2 mg/l Naphthyl essigsäure (NAA) und 0,8% Bacto-Agar enthielt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit 250 mg/l Claforan überführt.
- B) Kartoffel: 10 kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose ge legt, welches 30-50 µl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln wurden die Petrischalen bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Nach 2 Tagen wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l Zea tinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8 l Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurde die Claforankonzen tration im Medium um die Hälfte reduziert. Die weitere Kultivierung er folgte wie von Rocha-Sosa et al. in EMBO Journal 8, 29 (1989) beschrieben,

5. Analyse genomischer DNA aus transgenen Pflanzen

Die Isolierung genomischer Pflanzen-DNA erfolgte nach Rogers und Bendich (Plant Mol, Biol. (1985), 5, 69-76.

Für die DNA-Analyse wurden 10-20 µg DNA nach geeigneter Restriktions spaltung mit Hilfe von "Southern Blots" auf Integration der zu untersu chenden DNA-Sequenzen analysiert.

6. Analyse der Gesamt-RNA aus transgenen Pflanzen

Die Isolierung pflanzlicher Gesamt-RNA erfolgte nach Logemann et al. (Analytical Biochem. (1987), 163, 16-20).

Für die Analyse wurden je 50 µg Gesamt-RNA mit Hilfe von "Northern Blots" auf die Anwesenheit der gesuchten Transkripte untersucht.

7. Proteinextraktion

Zur Extraktion von Gesamtprotein aus Pflanzengewebe wurden Gewebestücke in Proteinextraktionspuffer (25 mM Natriumphosphat pH 7,0, 2 mM Natrium bisulfit, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)), unter Zusatz von 0,1% (w/v) unlöslichem Polyvinylpyrrolidon (PVP) homogenisiert.

Nach Filtrieren durch Zellstoff wurden Zelltrümmer für 20 Minuten bei 10000 Umdrehungen pro Minute abzentrifugiert und die Proteinkonzentra tion des Überstandes nach der Methode von Bradford (Anal. Biochem. (1976)/72, 248-254) bestimmt.

8. Nachweis der anorganischen Pyrophosphatase-Aktivität (modifiziert nach Baykov et al. Analytical Biochemistry 171, 271-276 (1988))

Das Gesamtprotein wurde aus Pflanzen, wie unter Punkt 7 beschrieben, extrahiert und mit nativem SB-Puffer (125 mM Tris/HCl pH 6,8, 1091 2-Mercaptoethanol, 20 , Glycol, 0,004% Bromphenolblau) versetzt und auf 10%ige SDS-Polyacrylamid-Gele gegeben. Die Ansätze wurden vor Auf trennung in den SDS-Polyacrylamidgelen nicht durch Erhitzen denaturiert. Nach elektrophoretischer Trennung wurden die Gele kurz in Wasser gespült und für 1 Stunde bei 37°C in Pyrophosphat-Puffer (0,05 M Tris-HCl pH 9,0; 0,03 mM anorganisches Pyrophosphat (Na₄P₂O₇) 5 mM MgCl₂) inku biert. Zu dieser Lösung wurde anschließend 17% Volumen Färbepuffer (140 mg Ammoniummolybdat, 11,5 mg Malachitgrün in 10 ml 2,5 M H₂SO₄) addiert. Die Bildung eines türkisfarbenen Präzipitates zeigte die Pyro phosphataseaktivität an.

9. Bestimmung von Saccharose, Glucose, Fructose und Stärke a) Extraktion

In flüssigem Stickstoff gefrorene Blattscheibchen (Durchmesser 10 mm) wurden in 0,5 ml Puffer (80% (v/v) Ethanol; 10 mM HEPES pH 7,5) für 30 Minuten bei 80°C im Wasserbad extrahiert. Der Überstand mit den löslichen Komponenten wurde abgeschüttet und das Volumen bestimmt. Der Überstand wurde zur Bestimmung der löslichen Zucker eingesetzt.

Das verbliebene unlösliche Material wurde mit Wasser gespült und fein gemörsert. Anschließend wurde der Extrakt 1 Stunde bei 95°C in 0,2 M Kaliumhydroxyd-Lösung gekocht, mit 70 µl 1N Essigsäure neutralisiert und anschließend zentrifugiert. Aliquots der so erhaltenen Stärkelösung wurden zur Stärkebestimmung eingesetzt.

b) Quantitative Bestimmung löslicher Glukose, Fruktose und Saccharose

Die quantitative Bestimmung löslicher Glukose, Fruktose und Saccharose erfolgte in folgendem Testansatz:

100,0 mM Imidazol-HCl, pH 6,9
1,5 mM MgCl₂
0,5 mM NADP⁺
1,3 mM ATP
10-50,0 µl Probe
1,0 U Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase aus Hefe.

Dieser Ansatz wurde für fünf Minuten inkubiert. Der Nachweis der Zucker wurde anschließend durch sukzessive Zugabe von

1,0 U Hexokinase aus Hefe (für die Bestimmung von Glukose)
1,0 U Phosphorglukose-Isomerase aus Hefe (für die Bestimmung von Fruktose)
20,0 U Invertase aus Hefe (für die Bestimmung von Saccharose)

photometrisch bestimmt.

c) Stärkebestimmung

Die nach der ethanolischen Extraktion unter a) erhaltene Stärkelösung wurde bei 55°C mit hydrolytischen Enzymen versetzt und für zwölf Stunden in folgendem Ansatz inkubiert:

50,0 mM Na-Acetat, pH 4,8
1,4 U Amiloglukosidase aus Aspergillus niger
2,0 α-Amylase aus Schweinepankreas

Nach der Inkubation wurden die unlöslichen Bestandteile durch 4 minütige Zentrifugation bei 16000 g entfernt. Im Überstand wurde an schließend die entstandene Glukose, wie unter b) beschrieben, enzymatisch bestimmt.

Ausführungsbeispiel Herstellung von Plasmid p35S-Ω-ppase und Einführung des Plasmids in das pflanzliche Genom

Eine DNA-Sequenz aus E. coli K12, welche für die anorganische Pyrophosphatase kodiert, wurde mit einem eine konstitutive Expression bewirkenden Promotor der 35 s RNA des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV), einem als Translationsverstärker dienenden DNA-Segment aus dem Tabak- Mosaik-Virus und einem pflanzlichen Terminationssignal versehen. Das pflanzliche Terminationssignal beinhaltet das 3′-Ende der Poly-A Seite des Octopin-Synthase Gens. Dabei wurde die Umgebung des Translations initiationscodons ATG der Sequenz für die anorganische Pyrophosphatase einer gerichteten Mutagenese unterzogen, um eine optimale Expression in eukaryontischen Zellen zu erreichen. Das Plasmid p35S-Ω-ppase besteht aus den vier Fragmenten A, B, C und D, die in die Schnittstellen des Poly linkers von pUC 18 kloniert worden sind (Fig. 1).

Das Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Cauliflower-Mosaik- Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al,, Cell 21, 285-294). Es wurde als Eco RI-Kpn I Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., Nucleic Acids Research 14, 5857-5868) isoliert und zwischen die Eco RI-Kpn I Schnittstellen des Polylinkers des Plasmids pUC 18 kloniert.

Das Fragment B enthält ein Segment, das aus 61 Nukleotiden der Sequenz

TTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTA

besteht, die homolog zu einem Teil des als Translationsverstärker dienenden DNA-Segmentes aus dem Tabak-Mosaik-Virus-Stamm U sind (Gallie et al., Nucleic Acids Res. 15, 3257-3273). Dieses Segment, das durch DNA- Synthese hergestellt worden ist, wurde am 5′-Ende mit einem Asp 718 Linker der Sequenz

GGTTACC

sowie am 3′-Ende mit einem Nco I-Linker mit der Sequenz

CCATGG

versehen.

Das Fragment 8 wurde zwischen die Kpn I und Sma I Schnittstelle des Poly linkers von pUC 18 kloniert.

Das Fragment C umfaßt die proteinkodierende Region der anorganischen Pyro phosphatase (ppa) aus E.coli. Es sind die Nukleotide, Position +39 bis +565, der Sequenz nach Lahti et al., (J. Bacteriology 170, 5901-5907).

Das Fragment C wurde zwischen die Nco I Stelle des Fragments B und die Sal I Stelle des Polylinkers von pUC 18 kloniert.

Fragment D (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835-846), Nukleotide 11749-11939) welches als Pvu II-Hind III Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303, 209-213) isoliert worden ist und nach Addition von Sph I Linkern an die Pvu II Schnittstelle zwischen die Sph I-Hind III Schnittstellen des Polylinkers von pUC 18 kloniert worden war, Die Größe des Plasmids p35S-stppase beträgt 4,0 kb.

Das Plasmid p35S-Ω-ppase wurde in binäre Vektoren eingeführt und mit Hilfe des Agrobacteriensystems in Tabak- und Kartoffelpflanzen eingeführt. Aus transformierten Zellen wurden intakte und fertile Pflanzen regeniert.

Die Analyse der transformierten Pflanzen mittels "Southern-Blot"-Analyse zeigte das Vorhandensein des intakten chimären Pyrophosphatasegens in den transgenen Pflanzen.

Für den Nachweis der vom Pyrophosphatase-Gen kodierten RNA in transgenen Kartoffel- und Tabakpflanzen wurden 30 µg Gesamt-RNA aus den Blättern der transformierten und regenerierten Kartoffel- und Tabakpflanzen sowie aus nicht transformierten Kartoffel- und Tabakpflanzen isoliert. Diese RNA wurde mittels Northern-Blot-Analyse untersucht. Die Analyse der regene rierten Pflanzen (Kartoffel: Positionen 1, 2, 8, 11, 12, 15 und 18; und Tabak:
Positionen 21-26) zeigte in den Geweben RNA, die spezifisch mit der kodierenden Sequenz der anorganischen Pyrophosphatase hybridisiert und die in nicht-transformierten Pflanzen (Kartoffelpflanze, Position A, Tabak pflanze, Position B) abwesend ist (Fig. 2).

Der Nachweis der neuen Pyrophosphataseaktivität in Proteinextrakten aus Blättern der mit dem p35S-Ω-ppase Plasmid transformierten transgenen Kartoffel- und Tabakpflanzen wurde in partiell denaturierten Gelen, wie unter Punkt 8 beschrieben, durchgeführt.

Die Proteinextrakte transformierter Pflanzen, die eine spezifisch mit der kodierenden Sequenz der anorganischen Pyrophosphatase hybridisierende RNA enthalten, wiesen eine anorganische Pyrophosphataseaktivität auf (Kartoffelpflanzen: Positionen 1-7 und Tabakpflanzen: Positionen 8 und 9), die in nicht-transformierten Pflanzen, Positionen A-C, fehlten (s. Fig. 3), Es wurden somit transgene Tabak- und Kartoffelpflanzen hergestellt, die eine neue anorganische Pyrophosphataseaktivität enthalten, die von dem in diese Pflanzen eingeführten E.coli Gen stammt (s. Fig. 3), Die regenerierten Tabak- und Kartoffelpflanzen wiesen eine Reihe von Unter schieden in bezug auf phänotypische als auch biochemische Parameter auf.

a) Transgene Tabakpflanzen
Transgene Tabakpflanzen, die eine hohe Expression des Pyrophosphatase- Gens aufwiesen, zeigten eine deutliche Reduktion in der Pflanzengröße, während Tabakpflanzen mit einer mittleren Expression des Pyro phosphatasegens nur eine geringe Reduktion der Größe aufwiesen. Die Stauchung ist dabei nicht auf eine Verringerung der Blattzahl zurückzu führen, sondern auf eine Verringerung des Internodienabstandes.

Die jungen Blätter der Pyrophosphatase-exprimierenden Tabakpflanzen wiesen keine deutlichen phänotypischen Unterschiede im Vergleich zu nicht-transformierten Kontrollpflanzen auf. Die älteren Blätter der Pyrophosphatase-exprimierenden Blätter hingegen zeigten eine deutliche Verdickung des Blattes. Bei Pflanzen, die das Pyrophosphatasegen sehr hoch exprimieren, war eine Ausbleichung der älteren Blätter zu sehen.

Neben diesen phänotypischen Unterschieden wiesen die das Pyrophosphatae gen exprimierenden Tabakpflanzen eine deutliche Veränderung der Zusammensetzung der Kohlenhydrate in Blättern verschiedenen Alters auf (s. Fig. 4). So waren die Mengen an löslichen Zuckern, insbesondere Glukose, Fruktose und Saccharose in allen Blättern gegenüber Blättern nicht-transformierter Pflanzen deutlich erhöht, wobei in den älteren Blättern eine Erhöhung um einen Faktor bis zu 20-50 festgestellt wurde. Gleichzeitig fand zumindest in den älteren Blättern eine Steigerung der Menge an gebildeter Stärke statt, die jedoch nicht so groß war, wie die Steigerung des Anteils an löslichen Zuckern, so daß insgesamt einerseits eine deutliche Erhöhung des Gesamtgehaltes an Stärke und löslichen Zuckern als Folge der Expression der Pyrophosphatase festgestellt wurde und andererseits eine deutliche Verschiebung der Partitionierung der Photophassimilate zwischen Stärke und löslichen Zuckern in Richtung lös licher Zucker auftrat.

b) Transgene Kartoffelpflanzen
Transgene Kartoffelpflanzen, die das Pyrophosphatasegen exprimieren, zeigten als erste wesentliche phänotypische Veränderung eine deutlich gestauchte Größe. Diese Stauchung geht mit einer verstärkten Verzweigung der Pflanzen aufgrund der verstärkten Ausbildung von Achselsprossen ein her. Es ist offensichtlich, daß dieser gedrungene Wuchs viele Vorteile bezüglich Standfestigkeit und Windanfälligkeit hat.

Die das Pyrophosphatasegen exprimierenden Kartoffelpflanzen wiesen weiterhin drastische Veränderungen in bezug auf die Zusammensetzung der Kohlenhydrate im Blatt auf (s. Fig. 5), So haben diese Kartoffelpflanzen ein erhöhtes Saccharose/Stärke-Verhältnis. Die Erhöhung dieses Verhält nisses kann bis Faktor 20 gehen. Im Unterschied zu den Tabakpflanzen wiesen die transgenen Kartoffelpflanzen keine drastische Erhöhung der Hexosen (Glukose und Fruktose) auf.

Durch die Expression des eine anorganische Phyrophosphatase kodierenden Gens in transgenen Kartoffelpflanzen ist es somit gelungen, eine Ver änderung der Saccharose/Stärke-Verhältnisse zu erreichen und damit die Kapazität des "source"-Blattes zu verändern.

Claims

1. Ein Plasmid, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für ein die Biosynthese löslicher Zucker modifizierendes Protein kodiert.

2. Eine Pflanzenzelle, enthaltend ein Plasmid gemäß Anspruch 1, mit einer DNA-Sequenz, die für ein die Biosynthese löslicher Zucker modifizieren des Protein kodiert.

3. Eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein Produkt kodiert, das in den Phosphat/Pyrophosphat- Metabolismus eingreift.

4. Eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz die DNA-Sequenz eines anorganischen Pyrophosphatase-Gens ist.

5. Plasmid p35S-Ω-ppase (DSM 6141).

6. Ein Plasmid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es das Plasmid p35S-Ω-ppase (DSM 6141) ist.

7. Eine Pflanzenzelle, enthaltend die auf dem Plasmid p35S-Ω-ppase (DSM 6141) enthaltene DNA-Sequenz.

8. Eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz des anorganischen Pyrophosphatase-Gens die DNA-Sequenz des Pyrophosphatase-Gens aus E. coli ist.

9. Eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz des anorganischen Pyrophosphatase-Gens an die regula torischen Regionen anderer Gene, die eine Expression des Pyro phosphatase-Gens in pflanzlichen Zellen und Pflanzen sicherstellen, fusioniert ist.

10. Eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorischen Regionen Promotoren und Terminationssignale von pflanz lichen Genen sind.

11. Eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der Promotor der 35S RNA des Cauliflower-Mosaik-Virus ist.

12. Eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Terminationssignal das 3′-Ende der Poly-A-Seite des Octopin-Synthase- Gens enthält.

13. Verwendung des Plasmids p35S-Ω-ppase (DSM 6141) zur Herstellung von im Habitus, Trockenresistenz, Frostresistenz und/oder Ertrag ver änderten transgenen Pflanzen.

14. Eine Pflanze, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für ein die Biosynthese löslicher Zucker modifizierendes Protein kodiert.

15. Eine Pflanze, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für ein Produkt kodiert, das in den Phosphat/Pyrophosphat-Metabolismus der Pflanze eingreift.

16. Eine Pflanze gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA- Sequenz die DNA-Sequenz eines anorganischen Pyrophosphatase-Gens ist.

17. Eine Pflanze gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz des anorganischen Pyrophosphatase-Gens die DNA-Sequenz des anorganischen Pyrophosphatase-Gens aus E. coli ist.

18. Eine Pflanze gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA- Sequenz des anorganischen Pyrophosphatase-Gens an die regulatorischen Regionen anderer Gene, die eine Expression des Pyrophosphatase-Gens in pflanzlichen Zellen und Pflanzen sicherstellen, fusioniert ist.

19. Eine Pflanze gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die regula torischen Regionen Promotoren und Terminationssignale von pflanzlichen Genen sind.

20. Eine Pflanze gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der Promotor der 35S RNA des Cauliflower-Mosaik-Virus ist.

21. Eine Pflanze gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Terminationssignal das 3′-Ende der Poly-A-Seite des Octopin-Synthase- Gens enthält.

22. Eine Pflanze, enthaltend die auf dem Plasmid p35S-Ω-ppase (DSM 6141) enthaltene DNA-Sequenz.

23. Eine Pflanze gemäß Ansprüchen 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Tabak- oder Kartoffelpflanze ist.